CN114350701B - 卵细胞特异表达基因ecs制备被子植物单倍体的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用调控卵细胞特异表达基因制备植物单倍体的方法，及该方法在制备被子植物单倍体制备中的应用。卵细胞特异表达的天冬氨酸蛋白酶ecs1 ecs2双突变体能够产生供育种使用的单倍体植株。本发明克服了传统的父本表达的单倍体诱导基因缺失对花粉和育性影响，为天冬氨酸蛋白酶在单倍体产生过程中所起的生物学作用提供了新思路，本方法可提高作物单倍体育种效率。
Description
发明所属领域：
本发明属于生物育种技术领域，具体地说，本发明涉及卵细胞特异表达基因ECS及其同源基因在被子植物单倍体制备中的应用。
背景技术：
单倍体植物在遗传研究中有重要优势，在作物育种中也极为重要——它们可用来快速生成纯合子二倍体，从而避免多代自交制备近等基因系所造成的人力、物力和时间的浪费。与传统育种方式如配子体培养法、远缘杂交、无融合生殖等相比较，单倍体育种能够显著提高育种效率，极大缩短育种时间。然而，在作物中直接克隆单倍体诱导基因工作量巨大，且技术难度高，近年来，众多研究人员通过鉴定模式植物拟南芥单倍体诱导基因，在不同作物中利用基因编辑技术敲除同源基因获得单倍体后代，建立一种快速、高效、多物种应用的单倍体育种模式。例如，将模式植物拟南芥的父本单倍体诱导基因DMP和PLD成功运用到水稻、玉米、小麦和番茄等作物单倍体育种；拟南芥CENH3(Centromeric Histone H3)基因诱导单倍体，拓展应用到小麦、玉米、棉花和水稻等单倍体制备中。
目前，已报道的父本单倍体诱导基因如AtDMP8/9，ZmPLA1/MTL/NLD，ZmPLD3等都是来自父本(花粉)表达基因。例如，专利申请“孤雌生殖单倍体诱导基因DMP及其应用”公开了精细胞特异表达的DMP在拟南芥和番茄中具备诱导单倍体的能力；专利申请“小麦单倍体诱导基因及其应用”公开了PLA突变后的小麦材料具有能够诱导产生小麦母本单倍体的功能；专利申请“诱导玉米母本单倍体产生的基因ZmPLD3及应用”公开了玉米的磷脂酶PLD3的突变能够导致玉米母本单倍体的产生。此外，非父本特异表达的CENH3基因编辑亦能制备单倍体。例如，专利“创制植物单倍体诱导系的方法及其应用”公布了利用CRISPR/Cas9系统编辑水稻OsCENH3基因，从而产生水稻单倍体诱导系。在玉米、棉花、小麦中利用RNAi或者基因编辑等方式下调/突变CENH3基因，也能获得单倍体(Wang,et al.Haploid induction by amaize cenh3 null mutant.Science Advances,2021,7,eabe2299；Gao,etal.Haploidbio-induction in plant through mock sexual reproduction,iScience,2020,23:101279；Lv,et al.Generation of paternal haploids in wheat by genomeediting of the centromeric histone CENH3.Nature Biotechnology,2020,38:1397–1401)。
虽然上述基因能诱导单倍体，但仍有问题亟待解决：其一，上述基因突变通常会导致花粉发育、萌发或者受精作用异常，影响结实率，从而降低单倍体诱导效率；其二，通过检测植株雄性不育是快速鉴定单倍体的重要方法，但上述基因突变导致的雄性不育表型极大增加了筛选难度；其三，只能通过雄性诱导系与各种作物品系杂交获得单倍体植株，难以确保作物原有的优良性状或难以避免某些品种间杂交障碍；其四，目前的单倍体诱导率偏低(Liu,C.et al.A 4-bp insertion atZmPLA1 encoding aputative phospholipase Agenerates haploid induction in maize.Mol.Plant,2017,10,520–522；Gilles,L.M.etal.Loss of pollen-specific phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis inmaize.EMBO J.,2017,36,707–717.Yao,L.et al.OsMATL mutation induces haploidseed formation in indica rice.Nat.Plants,20184,530–533；Liu,C.et al.Extensionof the in vivo haploid induction system from diploid maize to hexaploidwheat.Plant Biotechnol.J.,2020,8,316-318；Zhong,Y.et al.Mutation ofZmDMPenhances haploid induction in maize.Nat.Plants,2019,5,575-580；Zhong,Y.et al.ADMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in the dicotyledonousArabidopsis.Nat.Plants,2020,6,466-472；Li,Y.,Lin,Z.,Yue,Y.et al.Loss-of-function alleles of ZmPLD3 cause haploid induction in maize.Nat.Plants 2021,https://doi.org/10.1038/s41477-021-01037-2)。因此，倘若能发现一个母本表达、父本不表达且不影响受精作用的单倍体诱导基因，则能极大提高农作物单倍体育种的效率、降低筛选成本。
发明内容：
本发明的目的是提供一种通过调控卵细胞特异表达基因ECS制备被子植物单倍体自交系的方法。
本发明再一个目的是卵细胞特异表达基因ECS制备被子植物单倍体的方法在制备拟南芥单倍体中的应用。
本发明公开了一种通过卵细胞特异表达基因ECS调控制备被子植物单倍体的方法，该方法包括下列步骤：(1)突变/沉默卵细胞特异表达ECS基因的表达，包括但不限于以下基因工程方式获取ECS表达下调低于50％的纯合种子：T-DNA插入突变、CRISPR/Cas9敲除、RNAi干扰、锌指核酸酶(FZN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)等；(2)ECS突变/沉默植株自花授粉获得纯合的种子；(3)通过植株表型观察，流式细胞仪检测倍性及减数分裂时期染色体展示鉴定染色体数目筛选获得母本的被子植物单倍体诱导系。
本发明进一步公开了卵细胞特异表达基因ECS制备拟南芥单倍体的方法，该方法包括下列步骤：(1)拟南芥卵细胞特异表达基因型ecs1和ecs2基因型突变体为T-DNA插入突变，通过杂交和PCR测序鉴定获取基因型ecs1 ecs2双突变种子；(2)拟南芥基因型ecs1ecs2双突变体自花授粉，获得候选种子；(3)通过植株表型观察、流式细胞仪检测倍性及减数分裂时期染色体展示鉴定染色体数目筛选获得母本的被子植物单倍体诱导系。
在本发明中，公开的植物单倍体诱导系的制备方法包括如下步骤：
(1)突变/沉默卵细胞特异表达ECS基因的表达，包括但不限于以下基因工程方式获取ECS表达下调低于50％的纯合种子：T-DNA插入突变、RNA干扰和CRISPR/Cas9敲除、锌指核酸酶(FZN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)等基因编辑方法；
(2)ECS突变/沉默植株自花授粉获得纯合的种子；
(3)通过植株表型观察，流式细胞仪检测倍性及减数分裂时期染色体展示鉴定染色体数目筛选获得母本的被子植物单倍体诱导系。染色体数目鉴别单倍体诱导系中的单倍体株系；
本发明还详细公开了筛选单倍体的三种方法，
(1)植株表型观察
若待测植株具有植株矮小，叶片较窄，雄性不育等特征，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株具有植株高大，叶片宽大，育性正常等特征，则该植株为或候选为二倍体。
(2)流式细胞仪检测倍性
提取待测植株莲座叶的细胞核，以野生型叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为50。若待测植株细胞核信号峰出现在25，则该植株为候选单倍体；若待测植株的信号峰出现在50，其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，则该植株候选为二倍体。
(3)减数分裂时期染色体展示鉴定染色体数目
固定小孢子母细胞减数分裂时期材料，通过DAPI染色，利用荧光显微镜观察小孢子母细胞以第一次减数分裂后期的染色体数目。野生型中，该时期10条染色体均等地分布在细胞两极。若待测植株染色体为5条，不均等地分布在细胞两极，则该植株为候选单倍体；若待测植株染色体为10条，均等地分布在细胞两极，则该植株为候选二倍体。
通过上述3种方法鉴定的植株为单倍体株系。
本发明还公开了卵细胞特异表达基因ECS的同源基因制备被子植物单倍体的方法在制备被子植物单倍体中的应用。
本发明还公开了卵细胞特异表达基因ECS制备被子植物单倍体的方法在制备拟南芥单倍体中的应用。
在本发明中，“ECS”是指Egg cell specific endopeptidase，即卵细胞特异肽链内切酶，具体编码天冬氨酸内切酶。
本文使用的术语“T-DNA插入突变”是指将含有已知DNA序列的T-DNA载体通过转化插入到受体基因组中，使插入位点基因的功能缺失或获得从而造成突变,并在被诱捕序列启动子的控制下表达插入的报告基因,以鉴定可见或非可见的突变。
本文使用的术语“基因编辑(gene editing)”，是一种较精确的能对生物体基因组靶基因进行修饰的一种新兴基因工程技术。该技术能够对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向定点突变。
本文使用的术语“CRISPR/Cas9”是指使用sgRNA引导链靶向内切核酸酶切割位点的内切核酸酶。参见，Jinek等人，Science 337:816-821(2013)；Cong等人，Science(2013年1月3日)；和Mali等人，Science(2013年1月3日)。
本文使用的术语“TALEN”是指一类通过使TAL转录激活子样效应器核苷酶DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制内切核酸酶。
本文使用的术语“锌指核酸酶(ZFN)”是指由锌指蛋白(ZFP)结构域和Fok I核酸内切酶的切割结构域人工融合而成,是近年来发展起来的一种可用于基因组定点改造的分子工具。
本文使用的术语“RNA干扰”或“RNAi”是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。
本文定义被子植物ECS同源基因是指具备以下特征的基因：
(1)NCBI(National Center for Biotechnology Information)蛋白注释为天冬氨酸蛋白酶(aspartyl protease)或者可能的天冬氨酸蛋白酶(probable/putativeaspartic protease)；
(2)与AtECS1或者AtECS2的蛋白质序列相似度达到33％以上。
(3)编码的蛋白N端具有信号肽；
(4)编码的蛋白具有分泌性；
(5)在卵细胞表达，花粉不表达；
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一个普通的研究材料，众研究者发表了诸多文章，也可从商业公司购买得到，拟南芥卵细胞特异表达基因ECS种子从Salk公司(http://signal.salk.edu/)购买货号salk021086和salk090795获得
本发明的优点：
采用卵细胞特异表达基因ECS制备植物单倍体与已报道的单倍体诱导方式相比，本发明的优点主要体现在以下几个方面：
(1)ECS是卵细胞特异表达的基因，突变体不影响花粉发育和萌发，母本单倍体诱导系可进一步提高诱导率。对提高作物单倍体育种效率方面具有重要的指导意义。
(2)可通过自交制备单倍体，完整保留作物优良性状。
(3)AtECS1/2是第1个植物领域中卵细胞基因突变能诱导产生单倍体的基因，为研究卵细胞特异基因在单倍体产生过程中生物学机理开辟了新的研究领域。
(4)对于揭示天冬氨酸蛋白酶在单倍体产生过程中所起的生物学作用提供了新思路。
附图说明
图1是单倍体典型对植物育性的影响，左表示二倍体拟南芥，右表示单倍体拟南芥。
图2是单倍体典型花器官较小，花粉败育，左表示二倍体拟南芥，右表示单倍体拟南芥。
图3是流式细胞仪检测单倍体图，上表示二倍体拟南芥，下表示单倍体拟南芥。
图4是小孢子母细胞的第一次减数分裂后期观察染色体数目显示图，上表示二倍体拟南芥，下表示单倍体拟南芥
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
实施例1：卵细胞特异表达基因ECS制备被子植物单倍体的方法
(1)鉴定被子植物ECS基因
通过NCBI同源比对AtECS1或者AtECS2蛋白质序列，分析被子植物中ECS的同源蛋白，通过生物信息学分析，至少具备以下几个特征：
1.在NCBI(National Center for Biotechnology Information)蛋白注释为天冬氨酸蛋白酶(aspartyl protease)或者可能的天冬氨酸蛋白酶(probable/putativeaspartic protease)；
2.与AtECS1或者AtECS2的蛋白质序列相似度达到33％以上；
3.利用SignalP-3.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-3.0)分析蛋白质是否具有信号肽，候选蛋白质N端具有信号肽序列；
4.通过TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM- 2.0)分析其跨膜结构，候选蛋白必须具备分泌性；
5.通过已报道的物种精卵细胞转录组数据库；或者提取精、卵细胞RNA(若无数据库)，逆转录获得cDNA，进行qRT-PCR(实时荧光定量PCR)检测。候选ECS基因应该在卵细胞表达，精细胞中不表达。
(2)突变/沉默ECS基因的表达
利用T-DNA插入、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(FZN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)或者RNAi等基因工程方法突变该基因，获得稳定的纯合突变体；或者通过RNA干扰等基因工程方式下调ECS基因表达，通过qRT-PCR鉴定其在卵细胞中表达量降低至50％以下。
(3)ECS突变体或者表达下调株系自交获得候选种子
获得上述种子后，根据不同植物的种植方法培养，待开花期时，通过人工授粉(适应于异花授粉物种，如玉米等)或者自然授粉(适应于自花授粉物种，如拟南芥、水稻等)获取后代种子。
(4)单倍体鉴定
1.植株表型鉴定单倍体
上述种子播种于土中，正常培养，观察后代表型，主要观察植株育性和花的大小，单倍体典型的雄性不育特征导致无法结实。因为ECS突变/沉默不影响花粉育性，所以雄性育性缺陷推测是单倍体所致。此方法不需要借助任何实验仪器，方便快筛选单倍体。
2.流式细胞仪检测叶片倍性
将上述步骤1鉴定获得的表型为单倍体性状植株利用流式细胞仪进行基因组倍性检测。取100mg幼嫩叶片置于培养皿中，加100μl核提取液于叶片(Partec CyStain UVPrecise-Kit)，利用刀片快速将叶片均匀切碎，再加400ul核提取液用移液器轻轻吹打，室温静置5分钟，加1ml染液(Partec CyStain UVPrecise-Kit)混匀后室温孵育1分钟。将混合液通过带40μM尼龙滤网的流式管(FALCON,352235),样本利用Beckmann CytoFlex流式细胞仪进行单倍体鉴定。首先检测野生型的样本作为参考值，检测二倍体细胞核信号，并将二倍体初始峰值信号为N，单倍体的初始峰值为1/2N。流式细胞仪测定的误差较小，因此测定后能够将待测植物较准确区分单倍体和二倍体。
3.染色体展示鉴定单倍体
对上述步骤中检测的单倍体利用染色体展示进行染色体鉴定。取花序置于卡诺固定液中(乙醇：乙酸＝3:1)真空负压固定1小时，用10mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)漂洗两次，再用酶液(0.3％纤维素酶和0.3％果胶酶)室温酶解样品1小时。用柠檬酸缓冲液漂洗两次后，加DAPI-柠檬酸缓冲溶液(10μg/ml DAPI)避光染色5分钟，制备临时玻片后用橡皮棒轻轻按压样品，使小孢子母细胞从花药中充分释放出来，通过荧光共聚焦显微镜，在63x油镜下观察小孢子母细胞第一次减数分裂后期的染色体数目。在野生型中，该时期的染色体数目为2n条(n为该物种单倍染色体条数)，均等分布在细胞两极；而单倍体小孢子母细胞则只有n条染色体，随机分布在细胞两极。
通过上述方法即可获取被子植物单倍体。
实施例2：卵细胞特异表达基因ECS制备被子植物单倍体的方法在制备拟南芥单倍体中的应用
(1)获取拟南芥ecs1 ecs2纯合突变体
1.获取ecs1和ecs2突变体种子
从SALK突变体库(http://signal.salk.edu/)购买了salk021086(ecs1)和salk090795(ecs2)突变体种子。拟南芥(Arabidopsis thaliana)Colombia生态型为突变体背景和野生型材料。拟南芥种子利用15％次氯酸钠溶液进行消毒5分钟，无菌水漂洗5次后，均匀地点在1/2MS培养基上，春化处理2天后，置于22℃光照培养箱中培养7天(16小时光照/8小时黑暗)，转移至土中，置于22℃±1℃人工温室培养(16小时光照/8小时黑暗)设计鉴定突变体的引物，包括T-DNA上的引物LB，插入片段两端的正反向引物LP和RP。引物序列(5’-3’)如下：
ECS1-LP：TTCACAACCAAAACCGATCTC
ECS1-RP：AAAACGCTAGCTCTTAACGGC
ECS2-LP：TCGAAGGTACCACCGTTATTG
ECS2-RP：CGGCCAAAAGTACTCTCAGTG
T-DNA-LB：ATTTTGCCGATTTCGGAAC
2.提取突变体基因组
将约80mg植物样品在液氮中研磨；加入1ml预热好的CTAB提取液，65℃孵育15min，每5min上下颠倒混匀；加入700ul氯仿：异戊醇(体积比为24:1)，室温12000rpm离心15min；将上清液转移至1.5ml离心管中，加入700ul异丙醇混匀，然后室温7500rpm离心5min，弃上清；加入1ml 70％乙醇，室温12000rpm离心1min，弃上清，再重复洗涤一次；室温晾干或风干后加入50μl ddH2O进行溶解。
3.鉴定有效突变
以基因组为模板，进行PCR扩增，分别用LB和RP扩增插入条带(小带)，LP和RP扩增野生型条带(大带)。通过PCR产物测序，分析T-DNA插入位点。结果显示，该突变体均为有效突变体，并且插入位点都在外显子区域，ecs1插入位点是865bp，ecs2插入位点是152bp。
4.获取纯合双突变体
通过杂交获得ecs1 ecs2双纯合突变体。具体地，提取杂交后代基因组，利用上述方法进行PCR检测纯合与杂合。判断标准：只有大带，即为野生型；只有小带，即为纯合插入突变体；大小带均有，即为杂合插入突变体。
(2)筛选ecs1ecs2诱导的拟南芥单倍体
1.植株表型鉴定单倍体
上述杂交种子播种于土中，观察后代表型，主要观察植株育性和花的大小，单倍体典型的雄性不育特征导致无法结实如图1所示，并且花明显较小如图2所示。
2.流式细胞仪检测叶片倍性
将上述步骤1鉴定获得的表型为单倍体性状植株利用流式细胞仪进行基因组倍性检测。取1-2片莲座叶置于培养皿中，加100μl核提取液(Partec CyStain UVPrecise-Kit)于叶片，利用刀片快速将叶片均匀切碎，再加400ul核提取液用移液器轻轻吹打，室温静置5分钟，加1ml染液(Partec CyStain UVPrecise-Kit)混匀后室温孵育1分钟。将混合液通过带40μM尼龙滤网的流式管(FALCON,352235),样本利用Beckmann CytoFlex流式细胞仪进行单倍体鉴定。首先检测野生型的样本作为参考值，检测二倍体细胞核信号，并将二倍体初始峰值信号为50(附图1)，单倍体的初始峰值为25(附图1)。流式细胞仪测定的误差较小，因此测定后能够将待测植物较准确区分单倍体和二倍体。结果表明，利用表型鉴定的单倍体植株通过流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体。
3.染色体展示鉴定单倍体
对上述步骤中检测的单倍体利用染色体展示进行染色体鉴定。取拟南芥花序置于卡诺固定液中(乙醇：乙酸＝3:1)真空负压固定1小时，用10mM柠檬酸缓冲液(pH 4.5)漂洗两次，再用酶液(0.3％纤维素酶和0.3％果胶酶)室温酶解样品1小时。用柠檬酸缓冲液漂洗两次后，加DAPI-柠檬酸缓冲溶液(10μg/ml DAPI)避光染色5分钟，制备临时玻片后用橡皮棒轻轻按压样品，使小孢子母细胞从花药中充分释放出来，通过荧光共聚焦显微镜，在63x油镜下观察小孢子母细胞第一次减数分裂后期的染色体数目。在野生型中，该时期的染色体数目为10条，均等分布在细胞两极(附图4)；而单倍体小孢子母细胞则只有5条染色体，随机分布在细胞两极(附图4)。
Claims (2)
1.卵细胞特异表达基因ECS制备拟南芥单倍体的方法，该方法包括下列步骤：(1)卵细胞特异表达基因型ecs1和ecs2基因型突变体为T-DNA插入突变，获取基因型ecs1 ecs2双突变种子，所述ecs1基因型突变体种子商品货号为salk021086，所述ecs2基因型突变体种子商品货号为salk090795；(2)基因型ecs1 ecs2自花授粉获得纯合的双突变种子；(3)通过植株表型观察，流式细胞仪检测倍性及减数分裂时期染色体展示鉴定染色体数目筛选获得母本的拟南芥单倍体诱导系。
2.根据权利要求1中所述的方法在制备拟南芥单倍体中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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