CN109554387A - 一种诱导产生水稻母本单倍体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导产生母本水稻母本单倍体的方法。本包括如下步骤：沉默或抑制目的水稻基因组中OsPLA基因的表达或敲除OsPLA基因，得到转基因植株或其后代；所述转基因植株或其后代在自交或作为父本与其他材料杂交的过程中即可得到水稻母本单倍体。本发明的实验证明，OsPLA的突变能够导致水稻母本单倍体的产生，能够加速育种进程，简化育种流程，提高育种效率。本发明对未来水稻育种具有重要的意义。

Description

一种诱导产生水稻母本单倍体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种诱导产生水稻母本单倍体的方法。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，在我国种植广泛。稳步提高水稻产量，对维护我国粮食安全具有重要的意义。而水稻产量的提升依赖种植模式的优化和水稻种质的持续改良。生产水稻分为普通水稻和杂交水稻两种，目前无论是普通水稻还是杂交水稻的育种过程都需要连续自交选择，获得优异种质材料。水稻的多代自交的育种方法耗时费力，单倍体育种方法可以通过配子体培养等方式获得单倍体植株，再经过加倍后获得纯合的株系，该方法省去了多代自交的过程，因此能够大大缩短育种进程，提高育种效率。然而水稻中获得单倍体的方法依赖花药培养，该方法的效率受材料遗传背景影响较大，且操作繁琐，不适于大规模应用。
1959年Coe等在玉米上报道了体内诱导获得单倍体的方法，该方法不依赖于材料遗传背景差异，通过诱导系授粉后，能够获得稳定频率的单倍体。近年来孤雌生殖诱导系通过孤雌生殖而产生母本单倍体的方法获得了广泛的应用。鉴于该单倍体育种技术的巨大优势，水稻单倍体育种过程将大大简化，效率提高，应用前景十分广阔。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种水稻母本单倍体诱导系的制备方法。
本发明提供的水稻母本单倍体诱导系的制备方法包括如下步骤：沉默或抑制目的水稻基因组中OsPLA基因的表达和/或活性或敲除OsPLA基因，得到转基因水稻，即为水稻母本单倍体诱导系。所述OsPLA基因的序列为序列1。
上述方法中，所述沉默或抑制目的水稻基因组中OsPLA基因的表达和/或活性或敲除OsPLA基因为突变目的水稻基因组中OsPLA基因使目的水稻基因组中OsPLA基因表达量降低或使目的水稻基因组中OsPLA基因发生缺失突变或发生插入突变。
上述方法中，所述使目的水稻基因组中OsPLA基因发生缺失突变或发生插入突变为使目的水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变。所述OsPLA基因第一外显子的序列为序列2。
上述方法中，所述使目的水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变的方式可为CRISPR/Cas9或TELLEN或T-DNA插入或EMS诱变。所述使目的水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变的方式具体为CRISPR/Cas9。进一步的，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列3，也即为序列2所示的第一外显子中第179-199位碱基；所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列为序列4。
上述方法中，所述使目的水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变的方法包括如下步骤：将表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体导入目的水稻中，得到转基因水稻。
上述方法中，所述水稻品种具体为明恢63。
上述方法中，所述水稻母本单倍体诱导系为能诱导生产水稻母本单倍体的水稻。
本发明的另一个目的是提供一种水稻母本单倍体的制备方法。
本发明提供的水稻母本单倍体的制备方法包括如下步骤：将上述方法制备的水稻母本单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他水稻材料杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述水稻母本单倍体。
进一步的，所述方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定、叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为水稻母本单倍体。
更进一步的，所述单倍体性状鉴定方法可按照如下方法进行：若待测植株具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株具有植株高大，叶片宽大，披散，育性正常等特征，则该植株为或候选为二倍体。
所述叶片倍性鉴定方法可按照如下方法进行：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体水稻叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的信号峰出现在100附近，其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，则该植株为或候选为二倍体。
所述分子标记鉴定可按照如下方法进行：采用父本(母本单倍体诱导系)和母本间多态性引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测植株为单倍体还是二倍体：若待测植株的扩增产物仅具有母本的带型，不存在父本的带型，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的扩增产物具有父本和母本的杂合带型，则该植株为或候选为二倍体。
本发明的最后一个目的是提供如下1)-3)任一种应用：
1)上述方法制备的水稻母本单倍体诱导系在制备水稻母本单倍体中的应用；
2)沉默或抑制目的水稻基因组中OsPLA基因的表达和/或活性或敲除OsPLA基因的物质在制备水稻母本单倍体诱导系或水稻母本单倍体中的应用；
3)上述方法制备的水稻母本单倍体诱导系或上述方法制备的水稻母本单倍体在水稻杂交种选育或水稻单倍体育种中的应用。
本发明的技术方案如下：通过同源克隆的方法，在水稻基因组中找到了与玉米诱导基因ZmPLA的同源基因OsPLA，所述OsPLA基因通过CRISPR/Cas9定点突变技术和转基因试验，成功获得了OsPLA基因的突变体材料，在杂合基因型突变体和纯合基因型突变体自交后代以及与其他材料的杂交后代中检测单倍体植株，验证了OsPLA突变后的材料作为父本能够诱导产生母本单倍体的功能。
本发明的基本原理如下：针对候选基因OsPLA第一个外显子上设计靶位点序列，通过CRISPR/Cas9定点突变的方法，将OsPLA基因的第一个外显子进行突变筛选，获得OsPLA基因功能缺失的转基因突变体。将成功突变的单株进行自交或者作为父本与其他水稻材料(野生型明恢63)杂交，得到自交后代或杂交后代，根据后代单株田间的长势及流式细胞倍性鉴定等方法验证其中是否出现母本单倍体。本发明的实验证明，OsPLA的突变能够导致水稻母本单倍体的产生，本发明对水稻单倍体育种提供了新的途径。对于提高水稻育种的效率，节省育种成本具有重要意义。
附图说明
图1为OsPLA基因结构示意图及利用CRISPR/Cas9技术的靶位点的设定。
图2为利用PCR和Sanger测序检测CRISPR介导的OsPLA基因定点突变及测序结果。
图3为田间单倍体叶片倍性鉴定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、诱导产生水稻母本单倍体的方法
一、水稻OsPLA基因的获得
在验证玉米中控制单倍体诱导的主效基因ZmPLA后，利用玉米中的序列检索了水稻中的同源序列，找到了水稻中的同源基因OsPLA。通过查询该基因在水稻中的组织特异表达情况，发现其表达规律与玉米的ZmPLA基因一致，因此该基因突变可能诱导水稻后代中出现单倍体植株，并应用于水稻育种。
二、OsPLA基因敲除的水稻突变体的获得及其单倍体诱导能力鉴定
1、CRISPR/Cas9系统敲除水稻OsPLA基因
1)sgRNA序列的选择
图1为基因结构及靶位点示意图。
水稻OsPLA基因的基因组序列如序列表中序列1所示。水稻OsPLA基因的第一外显子的序列如序列表中序列2所示(序列2为序列1第78-443位)。
在水稻OsPLA基因的第一外显子序列上设计靶位点序列，长度为21bp，位于第一外显子的第179-199位。
靶位点序列为CCAGGCTGCAGGAGCTGGATGGC(序列3)。
靶位点设计sgRNA序列为CCAGGCUGCAGGAGCUGGAUGGC(序列4)，该sgRNA的编码DNA分子为序列3。
2)CRISPR/Cas9载体的构建
CRISPR/Cas9载体为将序列表中序列3所示的sgRNA的编码DNA分子插入pBUN411载体(pBUN411载体记载在如下文献中：Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC plant biology,2014,14(1):1.，公众可从申请人处获得)后得到的载体。
3)转基因水稻的获得
将CRISPR/Cas9载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞EHA105(农杆菌EHA105感受态细胞购自华越洋生物科技有限公司，公众可通过购买获得)，得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9。
再将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9采用农杆菌侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，扩繁后的菌液用于水稻愈伤组织侵染)转化野生型水稻明恢63幼胚，经过筛选、分化和生根后获得T0代转基因水稻植株。
4)转基因水稻的鉴定
采集T0代转基因水稻植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用如下引物进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。
OsPLA突变序列检测引物序列如下：
OsPLA_F：ATCTCATCTTCCTTCGTCTC；
OsPLA_R：GAATTCGAGGTGATCAGTTAC。
将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果与野生型水稻OsPLA基因的第一外显子(序列2)进行比对，鉴定T0代转基因水稻不同株系中OsPLA基因是否发生突变。
结果如下：12株T0代转基因水稻植株中，11株中的OsPLA基因发生突变，具体突变形式如下，部分如图2所示：
OsPLA突变基因OsHIR1-1为在序列1所示的OsPLA基因的第182-183位之间插入A碱基后得到的DNA分子；
OsPLA突变基因OsHIR1-2为将序列1所示的OsPLA基因的第183位的1个碱基T缺失后得到的DNA分子。
将OsPLA基因发生突变的植株记做阳性T0代转基因水稻。
5)T1代OsPLA基因发生突变的转基因水稻的基因型鉴定
将上述得到的阳性T0代转基因水稻自交，收获种子后再播种，得到T1代转基因水稻。鉴定T1代转基因水稻的OsPLA基因是否为突变的基因型，具体如下：以T1代转基因水稻的基因组DNA作为模板，利用OsPLA突变序列检测引物：OsPLA_F：ATCTCATCTTCCTTCGTCTC和OsPLA_R：GAATTCGAGGTGATCAGTTAC进行扩增，将PCR产物进行Sanger测序，根据测序结果对T1代转基因的基因型进行分类。
自靶位点序列起具有双峰特征的序列，则该株系的基因型为杂合基因型(2条同源染色体中的1条染色体上的OsPLA基因突变，且另1条染色体上的OsPLA基因未突变)，该株系为T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系；
自靶位点序列起具有特异单峰特征的序列，与野生型水稻明恢63的OsPLA基因序列对比，若一样，则该株系的基因型为野生型，即OsPLA基因序列没有发生突变，下面分析不考虑；若有突变，则该株系的基因型为纯合基因型(2条同源染色体上的OsPLA基因均发生突变)，该株系为T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系。
测序结果表明：
T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系有R-7和R-2-1，且各个株系的突变类型如下：
T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-7中的两条同源染色体中的1条同源染色体含有OsPLA突变基因OsHIR1-1，另一条同源染色体含有野生型OsPLA基因。
T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-2-1中的两条同源染色体中的1条同源染色体含有OsPLA突变基因OsHIR1-2，另一条同源染色体含有野生型OsPLA基因。
T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-7中的两条同源染色体均含有OsPLA突变基因OsHIR1-1。
T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-2-1中的两条同源染色体均含有OsPLA突变基因OsHIR1-2。
2、CRISPR/Cas9系统敲除水稻OsPLA基因所获得突变体的单倍体诱导能力的鉴定
1)T1代杂合基因型转基因水稻OsPLA基因突变单株单倍体诱导能力鉴定
(1)田间表型鉴定
将T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-7、R-2-1分别隔离自交，获得自交后代；将上述所得后代播种于田间，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常。
统计结果如表1所示：T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-7的自交后代中，在80个后代中检测到2个表现为单倍体的单株，拟定为单倍体单株。
T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-2-1的自交后代中，在50个后代中检测到1个表现为单倍体的单株，拟定为单倍体单株。
(2)流式细胞检测叶片倍性
将上述T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-7和R-2-1自交后代中鉴定获得的共3个表现为单倍体性状植株进行流式细胞检测，方法如下：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体水稻叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)；若待测植株的信号峰出现在100附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，该待测植株为二倍体。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则认为该待测植株为单倍体植株。每个株系检测数量如表1所示。
结果如图3所示，左图为野生型水稻流式细胞检测结果，右图为T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系后代拟单倍体的流式细胞检测结果。结果如下：T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-7自交后代中的2个经表型鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体。T1代转基因水稻杂合型OsPLA基因突变株系R-2-1自交后代中的1个经表型鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性为单倍体。
因此，杂合转基因株系自交后代单株中，若按照上述2种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为水稻母本单倍体；若上述2种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为水稻母本单倍体。
统计上述鉴定结果如表1所示，诱导率(％)＝(母本单倍体株数/总株数)×100，可以看出，OsPLA基因突变后自交，在自交后代中可获得水稻母本单倍体，说明OsPLA基因突变后能够显著提高单倍体的诱导能力。
表1、杂合突变株系测验后代中单倍体植株的出现频率
株系 测验材料 测验单株株数 母本单倍体数 诱导率
R-7 明恢63 80 2 2.50
R-2-1 明恢63 50 1 2.00
对照 明恢63 290 0 0
注：对照是用野生型明恢63材料自交后获得的后代。
2)T1代纯合基因型转基因水稻OsPLA基因突变单株单倍体诱导能力鉴定
(1)田间表型鉴定
将T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-7与野生型水稻材料明恢63进行杂交，获得杂交后代；将T1代转基因水稻OsPLA基因纯合突变株系R-2-1与野生型水稻材料明恢63进行杂交，获得杂交后代。将上述所得后代播种于田间，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常。
统计结果如下：
T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-7的杂交后代中，在139个杂交后代中有3个表现为单倍体性状的单株，拟定为单倍体植株。
T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-2-1的杂交后代中，在243个杂交后代中有7个表现为单倍体性状的单株，拟定为单倍体植株。
(2)流式细胞检测叶片倍性
将T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-7杂交后代中的3个拟单倍体，以及T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-2-1杂交后代中的7个拟单倍体单株进行流式细胞检测，方法同上。每个株系检测数量如表2所示。
结果如下：T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-7杂交后代中出现的3个拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体。T1代转基因水稻纯合型OsPLA基因突变株系R-2-1杂交后代中出现的7个拟单倍体植株经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体。
因此，纯合转基因株系杂交后代单株中，若按照上述2种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为水稻母本单倍体；若上述2种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为水稻母本单倍体。
统计上述鉴定结果如表2所示，诱导率(％)＝(母本单倍体株数/总株数)×100，可以看出，OsPLA基因突变后杂交，在杂交后代中可获得水稻母本单倍体，说明OsPLA基因突变后能够显著提高单倍体的诱导能力。
表2、纯合突变株系的杂交后代中单倍体植株的出现频率
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种诱导产生水稻母本单倍体的方法
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1823
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
acagtgacta gtgacaaacg atcgatcgat ccctccatcc acaaaccctc ctcgatctca 60
tcttccttcg tctcgtcaat ggcggcgagc tactcgtgcc ggcggacatg cgaggcgtgc 120
agcacgaggg cgatggccgg gtgcgtggtg ggcgagccgg cgtcggcgcc ggggcagcgg 180
gtgacgttgc tggcgatcga cggcggcggc atcaggggcc tcatcccggg caccatcctc 240
gccttcctcg aggccaggct gcaggagctg gatggccccg acgcgcgcct cgccgattac 300
ttcgactgca tcgccgggac cagcaccggc ggcctcatca ccgccatgct cgccgcgccc 360
ggcgaccacg gccgcccgct cttcgccgcc agcgacatca accgcttcta cctcgacaac 420
ggcccactca tcttcccaca aaagtaactg atcacctcga attcgatctc ctctcttcga 480
tctctgcatt atttgatttg attggggatt gtgggcggcg tggcgtggcg tccaggaggt 540
gcggcatggc ggcggccatg gcggcgctga cgaggccgag gtacaacggc aagtacctgc 600
aggggaagat caggaagatg ctgggcgaga cgagggtgcg cgacacgctg acgaacgtcg 660
tcatccccac gttcgacgtc aggctgctcc agccaaccat cttctccaca tacgacgtgc 720
gtgcgttgat tccatccgca ttggcgttgg aatcagctga ttgtttgatt gatcgaacaa 780
ttgatcggtt aaaattttgc aggcgaagag catgccgctc aagaacgcgc tcctctccga 840
catctgcatc agcacatccg cggcgccgac ctacctcccc gcgcactgct tccagaccac 900
cgacgacgcc accggcaagg tccgcgagtt cgacctcatc gacggcggcg tcgccgccaa 960
caacccggta actaatcaat caagcaatcc atcaaacgaa gatccacatg tgcattcctg 1020
tggtacaaat gctgatcgat cgatggatgg atcgattttc gcgagaacgt acagacgatg 1080
gtggccatga cgcagatcac caagaagata atggtgaagg acaaggagga gctgtacccg 1140
gtaaagccgt cggactgcgg taagttcctg gtgctgtccg tgggcaccgg gtcgacgtcg 1200
gaccagggga tgtacacggc gaggcagtgc tcgcggtggg ggatcgtccg gtggctgcgc 1260
aacaagggga tggcgcccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctccga cctcgtcgac 1320
atccacgccg ccgtcatgtt ccagtcgctg cacagcgacg gcgactacct ccgcatccag 1380
gacaacacgc tccacggcga cgccgccacg gtggacgccg ccaccaggga caacatgcgg 1440
gcgctcgtcg ggatcggcga gcggatgctg gcgcagcggg tgtcgagggt caacgtcgag 1500
accggcaggt acgtcgaggt gcccggcgcc ggcagcaacg ccgacgcgct gaggggcttc 1560
gccaggcagc tctccgagga gaggagggcg aggctaggtc ggcgaaacgc ctgcggcggc 1620
ggcggcgaag gagagcccag cggcgtggcg tgcaagcgtt agtaactgta cacgcatcat 1680
gctgacgcga tcttttttat ttttcttttt ttttttttac ctttctagcg gacatgggga 1740
ataacaagac gtgacagtag tgcaatcggt ttgtaacgtg cgtataccaa cattgatcca 1800
tttcttcatc acagtttcag ttc 1823
<210>2
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
atggcggcga gctactcgtg ccggcggaca tgcgaggcgt gcagcacgag ggcgatggcc 60
gggtgcgtgg tgggcgagcc ggcgtcggcg ccggggcagc gggtgacgtt gctggcgatc 120
gacggcggcg gcatcagggg cctcatcccg ggcaccatcc tcgccttcct cgaggccagg 180
ctgcaggagc tggatggccc cgacgcgcgc ctcgccgatt acttcgactg catcgccggg 240
accagcaccg gcggcctcat caccgccatg ctcgccgcgc ccggcgacca cggccgcccg 300
ctcttcgccg ccagcgacat caaccgcttc tacctcgaca acggcccact catcttccca 360
caaaag 366
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
ccaggctgca ggagctggat ggc 23
<210>4
<211>23
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
ccaggcugca ggagcuggau ggc 23

Claims (10)

1.一种水稻母本单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：沉默或抑制目的水稻基因组中OsPLA基因的表达和/或活性或敲除OsPLA基因，得到转基因水稻，即为水稻母本单倍体诱导系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述沉默或抑制目的水稻基因组中OsPLA基因的表达和/或活性或敲除OsPLA基因为突变目的水稻基因组中OsPLA基因使目的水稻基因组中OsPLA基因表达量降低或使目的水稻基因组中OsPLA基因发生缺失突变或发生插入突变。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述使目的水稻基因组中OsPLA基因发生缺失突变或发生插入突变为使目的水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述使目的水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变的方式为CRISPR/Cas9。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列3。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列为序列4。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述使目的水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变的方法包括如下步骤：将表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体导入目的水稻中，得到转基因水稻。
8.一种水稻母本单倍体的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-7中任一所述的方法制备的水稻母本单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他水稻材料杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述水稻母本单倍体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定、叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为水稻母本单倍体。
10.如下1)-3)任一种应用：
1)由权利要求1-7任一所述的方法制备的水稻母本单倍体诱导系在制备水稻母本单倍体中的应用；
2)沉默或抑制目的水稻基因组中OsPLA基因的表达和/或活性或敲除OsPLA基因的物质在制备水稻母本单倍体诱导系或水稻母本单倍体中的应用；
3)由权利要求1-7任一所述的方法制备的水稻母本单倍体诱导系或由权利要求8或9所述的方法制备的水稻母本单倍体在水稻杂交种选育或水稻单倍体育种中的应用。
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