JPH06339384A - プラスミド、植物及び植物の製造法 - Google Patents
プラスミド、植物及び植物の製造法Info
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- JPH06339384A JPH06339384A JP4018239A JP1823992A JPH06339384A JP H06339384 A JPH06339384 A JP H06339384A JP 4018239 A JP4018239 A JP 4018239A JP 1823992 A JP1823992 A JP 1823992A JP H06339384 A JPH06339384 A JP H06339384A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 植物中の表現をコントロールするためのプラ
スミド、このプラスミドのＤＮＡ配列を有する植物 【構成】 植物中の異種産物の時間及び場所に関してコ
ントロールされた表現を許容するＤＮＡ配列を有するプ
ラスミド。この表現は、インデューサーが添加されるま
では達成されない。このＤＮＡ配列は、植物表現配列及
びバクテリア表現コントロール配列の機能的組み合せを
包含する。インデューサーとしてテトラサイクリンを使
用する。 【効果】 前記プラスミドのＤＮＡ配列を有する植物が
得られる。
スミド、このプラスミドのＤＮＡ配列を有する植物 【構成】 植物中の異種産物の時間及び場所に関してコ
ントロールされた表現を許容するＤＮＡ配列を有するプ
ラスミド。この表現は、インデューサーが添加されるま
では達成されない。このＤＮＡ配列は、植物表現配列及
びバクテリア表現コントロール配列の機能的組み合せを
包含する。インデューサーとしてテトラサイクリンを使
用する。 【効果】 前記プラスミドのＤＮＡ配列を有する植物が
得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物中での遺伝子表現
のコントロールを可能にするＤＮＡ配列を有するプラス
ミドに関する。
のコントロールを可能にするＤＮＡ配列を有するプラス
ミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】植物の特性は、その植物細胞核中に新し
い遺伝子情報を挿入することにより改良することができ
る。
い遺伝子情報を挿入することにより改良することができ
る。
【０００３】遺伝子情報は、植物中に挿入される際にそ
の植物中に異種産物を生じるＤＮＡ配列中に含有されて
いる。
の植物中に異種産物を生じるＤＮＡ配列中に含有されて
いる。
【０００４】ＤＮＡ配列により表現される異種産物は、
例えば物質例えば疫病及び化学品に対する抵抗を与える
蛋白質、この植物の代謝に介在する酵素、診断剤及び医
薬中で使用される蛋白質又は内発的産物の表現を阻止す
るリボ核酸でありうる。
例えば物質例えば疫病及び化学品に対する抵抗を与える
蛋白質、この植物の代謝に介在する酵素、診断剤及び医
薬中で使用される蛋白質又は内発的産物の表現を阻止す
るリボ核酸でありうる。
【０００５】これら又は他の遺伝子産物の表現は、適当
なコントロール配列の使用によりコントロールできる。
このコントロール配列は、植物そのもののゲノムから単
離することができる。その活性が次のパラメータ：光
〔Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ等のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８７），３８，２２１−２
５７〕、温度〔Ａｉｎｌｅｙ及びＫｅｙ，Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０），１４，９４９−９６
６〕、嫌気生活〔Ｆｒｅｅｌｉｎｇ及びＢｅｎｎｅｔ
ｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５），１
９，２９７−３３２〕、損傷〔Ｋｅｉｌ等のＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８９），８，１３２３−１３３０〕、植物ホ
ルモン〔Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，ＣＲＣ（１９８５），２
４７−２７６〕及びサリチル酸〔Ｍｏｌ等欧州特許第３
３７５３２号〕によりコントロールされるか又は次の特
定の組織：例えば葉〔ｓｔｏｃｋｈａｕｓ等のＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８９），８，２４４５−２４５１〕、花
〔Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４
０，１４６０−１４６７〕又は根〔Ｌａｍ等のＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８
９），８６，７８９０−７８９４〕中でのみ活性である
コントロール配列は公知である。
なコントロール配列の使用によりコントロールできる。
このコントロール配列は、植物そのもののゲノムから単
離することができる。その活性が次のパラメータ：光
〔Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ等のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８７），３８，２２１−２
５７〕、温度〔Ａｉｎｌｅｙ及びＫｅｙ，Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０），１４，９４９−９６
６〕、嫌気生活〔Ｆｒｅｅｌｉｎｇ及びＢｅｎｎｅｔ
ｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５），１
９，２９７−３３２〕、損傷〔Ｋｅｉｌ等のＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８９），８，１３２３−１３３０〕、植物ホ
ルモン〔Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，ＣＲＣ（１９８５），２
４７−２７６〕及びサリチル酸〔Ｍｏｌ等欧州特許第３
３７５３２号〕によりコントロールされるか又は次の特
定の組織：例えば葉〔ｓｔｏｃｋｈａｕｓ等のＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８９），８，２４４５−２４５１〕、花
〔Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４
０，１４６０−１４６７〕又は根〔Ｌａｍ等のＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８
９），８６，７８９０−７８９４〕中でのみ活性である
コントロール配列は公知である。
【０００６】
【発明の構成】本発明は、植物中でのＤＮＡ配列の表現
の時期及び場所に関するコントロールの手段を有するプ
ラスミドを提供する。このＤＮＡ配列は、一般に異種産
物に関してコード化する配列であるが、所望の場合に
は、この配列は、選択された植物宿主中に自然に存在す
る産物に関してコード化することもできる。
の時期及び場所に関するコントロールの手段を有するプ
ラスミドを提供する。このＤＮＡ配列は、一般に異種産
物に関してコード化する配列であるが、所望の場合に
は、この配列は、選択された植物宿主中に自然に存在す
る産物に関してコード化することもできる。
【０００７】本発明のプラスミド中で、コントロール手
段は、一般に、ＤＮＡ配列の表現がインデューサーの存
在でのみ有効化され、従って、一般にオペレータ１個及
びリプレッサーに関する遺伝子１個より成る。有利なコ
ントロール手段は、インデューサーと特異的に反応する
ものであり、即ち、このインデューサーは新たに構成れ
れたコントロール系とのみ反応し、実質的に、コントロ
ール手段が挿入されるべき植物のゲノム中の他のコント
ロール系には作用しない。
段は、一般に、ＤＮＡ配列の表現がインデューサーの存
在でのみ有効化され、従って、一般にオペレータ１個及
びリプレッサーに関する遺伝子１個より成る。有利なコ
ントロール手段は、インデューサーと特異的に反応する
ものであり、即ち、このインデューサーは新たに構成れ
れたコントロール系とのみ反応し、実質的に、コントロ
ール手段が挿入されるべき植物のゲノム中の他のコント
ロール系には作用しない。
【０００８】本発明は、例えば、異種産物の時期及び場
所に関してコントロールされた表現が、インデューサー
（このインデューサーは、新たに構成されたコントロー
ル系とのみ反応し、ゲノム中に存在する他のコントロー
ル配列上には認めうる程度の作用をしない）のコントロ
ールされた添加により達成できるように、植物表現コン
トロール配列とバクテリアコントロール配列とが機能的
に組み合わされて含有するプラスミドを提供する。
所に関してコントロールされた表現が、インデューサー
（このインデューサーは、新たに構成されたコントロー
ル系とのみ反応し、ゲノム中に存在する他のコントロー
ル配列上には認めうる程度の作用をしない）のコントロ
ールされた添加により達成できるように、植物表現コン
トロール配列とバクテリアコントロール配列とが機能的
に組み合わされて含有するプラスミドを提供する。
【０００９】バクテリアコントロール配列と真核組織か
らの遺伝子表現のためのコントロールエレメントとのこ
のタイプの組み合せは、他の任意の組織例えばマウス、
ヒトセルライン、蝿及び酵母中でも達成できる。
らの遺伝子表現のためのコントロールエレメントとのこ
のタイプの組み合せは、他の任意の組織例えばマウス、
ヒトセルライン、蝿及び酵母中でも達成できる。
【００１０】本発明は、本発明のプラスミドのＤＮＡ配
列を有する植物をも提供する。
列を有する植物をも提供する。
【００１１】自然に生じる調節可能な植物コントロール
配列の公知組み合せとは対照的に、本発明によるプラス
ミドは、植物表現コントロール配列１個及び１個以上の
バクテリアコントロールエレメント例えばリプレッサー
オペレータ−インデューサー系の機能的組み合せを有し
ていてよい。このような系において、リプレッサー蛋白
質は、特異的オペレータ配列に対する高度の親和性と結
合する。このオペレータ配列が遺伝子のプロモータ領域
内に存在する場合には、この遺伝子の表現は妨げられて
いる。リプレッサー蛋白質は、特異的インデューサー分
子（これはリプレッサー蛋白質をＤＮＡから離脱させ、
この際、遺伝子活性を誘発する）と反応する。この目的
のために、バクテリアコントロール系が入手され、その
活性は、次のような活性物質でコントロールされる：例
えば抗生物質〔Ｈｉｌｌｅｎ等のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．（１９８３），１７２，１８５−〕、糖誘導体又は
アミノ酸誘導体〔Ｐａｂｏ及びＳａｕｅｒによるＡｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４），５３，２
９３−３２１〕又は芳香族化合物〔Ｎｅｒｍｏｄ等によ
るＪ．Ｂａｃｔ．（１９８６），１６７，４４７−４５
４〕。
配列の公知組み合せとは対照的に、本発明によるプラス
ミドは、植物表現コントロール配列１個及び１個以上の
バクテリアコントロールエレメント例えばリプレッサー
オペレータ−インデューサー系の機能的組み合せを有し
ていてよい。このような系において、リプレッサー蛋白
質は、特異的オペレータ配列に対する高度の親和性と結
合する。このオペレータ配列が遺伝子のプロモータ領域
内に存在する場合には、この遺伝子の表現は妨げられて
いる。リプレッサー蛋白質は、特異的インデューサー分
子（これはリプレッサー蛋白質をＤＮＡから離脱させ、
この際、遺伝子活性を誘発する）と反応する。この目的
のために、バクテリアコントロール系が入手され、その
活性は、次のような活性物質でコントロールされる：例
えば抗生物質〔Ｈｉｌｌｅｎ等のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．（１９８３），１７２，１８５−〕、糖誘導体又は
アミノ酸誘導体〔Ｐａｂｏ及びＳａｕｅｒによるＡｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４），５３，２
９３−３２１〕又は芳香族化合物〔Ｎｅｒｍｏｄ等によ
るＪ．Ｂａｃｔ．（１９８６），１６７，４４７−４５
４〕。
【００１２】本発明は、植物表現コントロール配列１個
及び例えばバクテリアコントロール配列のオペレータ配
列１個以上を有するプラスミドを提供する。本発明のプ
ラスミドは、１個以上のオペレータ配列が挿入されてい
る植物プロモータを有していてよい。この植物プロモー
タ、オペレータ及び所望産物に関してコード化するＤＮ
Ａの配置は、このＤＮＡ配列がリプレッサーに関するイ
ンデューサーの存在においてのみ表現されるようである
べきである。
及び例えばバクテリアコントロール配列のオペレータ配
列１個以上を有するプラスミドを提供する。本発明のプ
ラスミドは、１個以上のオペレータ配列が挿入されてい
る植物プロモータを有していてよい。この植物プロモー
タ、オペレータ及び所望産物に関してコード化するＤＮ
Ａの配置は、このＤＮＡ配列がリプレッサーに関するイ
ンデューサーの存在においてのみ表現されるようである
べきである。
【００１３】植物表現配列例えばプロモータ及びバクテ
リアコントロールエレメント又は本発明に依る他のオペ
レータの組み合せにより、次の必要条件：即ちインデュ
ーサーが植物中に生ぜす、良好に吸着され、代謝されず
又は他の変性も失活化もされず、内発的植物蛋白質上へ
の認識可能な作用を有しない条件が満足される場合に、
特に高度な特異的及び良好なコントロール可能性を生じ
る。形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物中のバクテ
リアコントロールエレメントと反応するインデューサー
は、植物コントロールエレメントと反応する物質よりも
優れた利点を有し、即ち新たに結合された産物の表現の
みが悪影響され、植物のゲノム中な自然に存在している
遺伝子産物系の表現には悪影響を及ぼさない。
リアコントロールエレメント又は本発明に依る他のオペ
レータの組み合せにより、次の必要条件：即ちインデュ
ーサーが植物中に生ぜす、良好に吸着され、代謝されず
又は他の変性も失活化もされず、内発的植物蛋白質上へ
の認識可能な作用を有しない条件が満足される場合に、
特に高度な特異的及び良好なコントロール可能性を生じ
る。形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物中のバクテ
リアコントロールエレメントと反応するインデューサー
は、植物コントロールエレメントと反応する物質よりも
優れた利点を有し、即ち新たに結合された産物の表現の
みが悪影響され、植物のゲノム中な自然に存在している
遺伝子産物系の表現には悪影響を及ぼさない。
【００１４】本発明の当初手段を用いると、リプレッサ
ーの存在での所望産物の表現は、この植物にインデュー
サーが供給されている間は起こらず、この表現はインデ
ューサーで処理される組織中でのみ起こる。
ーの存在での所望産物の表現は、この植物にインデュー
サーが供給されている間は起こらず、この表現はインデ
ューサーで処理される組織中でのみ起こる。
【００１５】前記のように、形質変換植物中での異種産
物の表現は、植物プロモータ中へのオペレータ配列の挿
入により、コントロール可能になり、リプレッサー蛋白
質はそのオペレータ配列に結合し、それにより、表現を
妨げ、このリプレッサー蛋白質は、インデューサー（こ
れがその結果として、異種産物の表現をもたらす）の付
加の結果として、オペレータ配列へのその結合能力を失
なう。従って、このオペレータ配列は、原核又は真核オ
リジンのものであってよい。
物の表現は、植物プロモータ中へのオペレータ配列の挿
入により、コントロール可能になり、リプレッサー蛋白
質はそのオペレータ配列に結合し、それにより、表現を
妨げ、このリプレッサー蛋白質は、インデューサー（こ
れがその結果として、異種産物の表現をもたらす）の付
加の結果として、オペレータ配列へのその結合能力を失
なう。従って、このオペレータ配列は、原核又は真核オ
リジンのものであってよい。
【００１６】バクテリアオペレータ配列と植物プロモー
タとの組み合せは、２個のオペレータ配列が植物プロモ
ータのＴＡＴＡエレメントの３′位に配置されている場
合に特に有効であることも判明した。
タとの組み合せは、２個のオペレータ配列が植物プロモ
ータのＴＡＴＡエレメントの３′位に配置されている場
合に特に有効であることも判明した。
【００１７】この植物プロモータの後に、有利にポリリ
ンカー（これは種々の遺伝子配列の挿入を許容する）及
び終端領域も存在する。
ンカー（これは種々の遺伝子配列の挿入を許容する）及
び終端領域も存在する。
【００１８】テトラサイクリン耐性オペロン例えばトラ
ンスポゾンＴｎ１０の調節エレメントは、植物プロモー
タの活性をコントロールするために好適であることも判
明した。
ンスポゾンＴｎ１０の調節エレメントは、植物プロモー
タの活性をコントロールするために好適であることも判
明した。
【００１９】従って、リプレッサー蛋白質は、高度の親
和性（ｋｅｑ＝１０-11Ｍ生理食塩水条件下）で１９ｂ
ｐオペレータ配列に結合するポリペプチド２０７アミノ
酸長である〔ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ等のＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８），２７，１０９４−１１０
４〕。
和性（ｋｅｑ＝１０-11Ｍ生理食塩水条件下）で１９ｂ
ｐオペレータ配列に結合するポリペプチド２０７アミノ
酸長である〔ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ等のＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８），２７，１０９４−１１０
４〕。
【００２０】このリプレッサーテトラサイクリンコンプ
レックスの１０-9Ｍの高平衡定数は、非常に低いテトラ
サイクリン濃度でもＤＮＡからのリプレッサーの有効分
離を許容する〔Ｔａｋａｈａｓｈｉ等のＪ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．（１９８６），１８７，３４１−３４８〕。
レックスの１０-9Ｍの高平衡定数は、非常に低いテトラ
サイクリン濃度でもＤＮＡからのリプレッサーの有効分
離を許容する〔Ｔａｋａｈａｓｈｉ等のＪ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．（１９８６），１８７，３４１−３４８〕。
【００２１】テトラサイクリン、テトラサイクリンの誘
導体又は他の化合物（これは、ｔｅｔリプレッサーへの
結合により後者ＤＮＡ結合能に変化をもたらすことがで
きる）がこのような系に対するインデューサーとして使
用できる。
導体又は他の化合物（これは、ｔｅｔリプレッサーへの
結合により後者ＤＮＡ結合能に変化をもたらすことがで
きる）がこのような系に対するインデューサーとして使
用できる。
【００２２】テトラサイクリンそのものは、殊に有効な
インデューサーであることが立証された。それというの
も大抵の抗生物質と同様に、膜を通って拡散しやすく、
従って植物細胞により吸収されるからである。植物中に
は、最初からリプレッサーを不活性化するテトラサイク
リン様作用物質は存在しない。
インデューサーであることが立証された。それというの
も大抵の抗生物質と同様に、膜を通って拡散しやすく、
従って植物細胞により吸収されるからである。植物中に
は、最初からリプレッサーを不活性化するテトラサイク
リン様作用物質は存在しない。
【００２３】殊に植物プロモータのＴＡＴＡエレメント
の３′に配置された２個のｔｅｔオペレータを提供する
ことが特に有利であることが判明した。この２個のオペ
レータ下流に加えて、ＴＡＴＡボックスの１個のオペレ
ータ上流を配置することもより有利である。
の３′に配置された２個のｔｅｔオペレータを提供する
ことが特に有利であることが判明した。この２個のオペ
レータ下流に加えて、ＴＡＴＡボックスの１個のオペレ
ータ上流を配置することもより有利である。
【００２４】本発明のコントロール手段において、強力
なプロモータ例えばカリフラワーモザイクウィルスプロ
モータを使用するのが好ましい。１個のプロモータは、
エンハンサーエレメントを有していてよく、例えばカリ
フラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモー
タは、構成的表現を引き起こすＣａＭＶ３５Ｓプロモー
タエンハンサーエレメント又は、異なる表現パターンを
与える他のエンハンサーエレメントを有していてよい。
なプロモータ例えばカリフラワーモザイクウィルスプロ
モータを使用するのが好ましい。１個のプロモータは、
エンハンサーエレメントを有していてよく、例えばカリ
フラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモー
タは、構成的表現を引き起こすＣａＭＶ３５Ｓプロモー
タエンハンサーエレメント又は、異なる表現パターンを
与える他のエンハンサーエレメントを有していてよい。
【００２５】本発明によるコントロール手段の例は、エ
ンハンサーエレメント、ＴＡＴＡボックス１個、オペレ
ータ２個又は３個及び異種産物に関してコード化するＤ
ＮＡ配列１個を有するカリフラワーモザイクウィルス３
５Ｓプロモータフラグメントより成る。
ンハンサーエレメント、ＴＡＴＡボックス１個、オペレ
ータ２個又は３個及び異種産物に関してコード化するＤ
ＮＡ配列１個を有するカリフラワーモザイクウィルス３
５Ｓプロモータフラグメントより成る。
【００２６】エンハンサーエレメント例えばＣａＭＶ３
５Ｓプロモータエンハンサーエレメントを有するカリフ
ラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータフラグメント
は、例えば３３４ｂｐフラグメントであり、ＴＡＴＡボ
ックス及び２個のｔｅｔオペレータは、例えば次の配列
を有する９９ｂｐオリゴーＤＮＡフラグメント中で連結
ＣＣＣフラグメントと共に存在する：
５Ｓプロモータエンハンサーエレメントを有するカリフ
ラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータフラグメント
は、例えば３３４ｂｐフラグメントであり、ＴＡＴＡボ
ックス及び２個のｔｅｔオペレータは、例えば次の配列
を有する９９ｂｐオリゴーＤＮＡフラグメント中で連結
ＣＣＣフラグメントと共に存在する：
【００２７】
【化３】 カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータフラグ
メントは、ＴＡＴＡボックスの付近にこのオペレータ部
位を有し、ＴＡＴＡボックスの５′位の１個のオペレー
タ及びＴＡＴＡボックスの３′位の２個のオペレータを
次の配列を有する８３ｂｐＤＮＡフラグメントと共に有
する：
メントは、ＴＡＴＡボックスの付近にこのオペレータ部
位を有し、ＴＡＴＡボックスの５′位の１個のオペレー
タ及びＴＡＴＡボックスの３′位の２個のオペレータを
次の配列を有する８３ｂｐＤＮＡフラグメントと共に有
する：
【００２８】
【化４】 コントロール系は、１個以上の更なるエレメント例えば
次の任意のものの１個以上を有していてよい：ポリリン
カー配列、ポリアデニル化信号例えばノパリンシンター
ゼ遺伝子の２０３ｂｐポリアデニル化信号及び選択マー
カー遺伝子例えば抗生物質耐性遺伝子例えば１６５０ｂ
ｐハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子。
次の任意のものの１個以上を有していてよい：ポリリン
カー配列、ポリアデニル化信号例えばノパリンシンター
ゼ遺伝子の２０３ｂｐポリアデニル化信号及び選択マー
カー遺伝子例えば抗生物質耐性遺伝子例えば１６５０ｂ
ｐハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子。
【００２９】例えば、コントロール系は、ポリリンカー
配列１個、エンハンサーエレメント例えばＣａＭＶ３５
Ｓプロモータエンハンサーエレメントを有する３３４ｂ
ｐカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータフラ
グメント１個、１個のＴＡＴＡボックス及び２個のｔｅ
ｔプロモータを有する９９ｂｐオリゴーＤＮＡフラグメ
ント１個、異種産物に関してコード化するＤＮＡ配列１
個、ノパリンシンダーゼ遺伝子の２０３ｂｐポリアデニ
ル化信号１個及び１６５０ｂｐハイグロマイシンホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子１個を有していてよく、９９
ｂｐオリゴーＤＮＡフラグメントは有利に前記の配列を
有する。
配列１個、エンハンサーエレメント例えばＣａＭＶ３５
Ｓプロモータエンハンサーエレメントを有する３３４ｂ
ｐカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータフラ
グメント１個、１個のＴＡＴＡボックス及び２個のｔｅ
ｔプロモータを有する９９ｂｐオリゴーＤＮＡフラグメ
ント１個、異種産物に関してコード化するＤＮＡ配列１
個、ノパリンシンダーゼ遺伝子の２０３ｂｐポリアデニ
ル化信号１個及び１６５０ｂｐハイグロマイシンホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子１個を有していてよく、９９
ｂｐオリゴーＤＮＡフラグメントは有利に前記の配列を
有する。
【００３０】Ｅ．コリー中の複製系及び形質転換された
細胞の選択を許容するマーカーを有する多くのクローニ
ングベクターは、高等植物内に異種遺伝子を挿入するた
めの準備に利用できる。このベクターは、例えばｐＢＲ
３２２，ｐＵＣ系、Ｍ１３系、ｐＡＣＹＣ１８４等より
成る。従って、所望の配列を好適な制限部位でベクター
内に挿入すことができる。生じるプラスミドは、Ｅ．コ
リー内へ形質転換のために使用される。このＥ．コリー
細胞を適当な栄養培地中で培養し、次いで収穫し、溶解
させる。プラスミドを回収する。配列分析、制限分析、
電気泳動及び他の生化学−分子生物学的方法を分析法と
して一般的に実施する。各々の操作の後に、使用ＤＮＡ
配列を切断することができかつ結合して次のＤＮＡ配列
にすることができる。各々のプラスミド配列は、同じ又
は他のプラスミド内でクローニングすることがてきる。
所望の遺伝子を植物中に挿入する方法に応じて、他のＤ
ＮＡ配列も必要になりうる。例えば植物細胞の形質転換
のために、Ｔｉ又はＲｉプラスミドが使用される場合に
は、Ｔｉ又はＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右
端又は屡々右及び左端は、挿入されるべき遺伝子の側面
領域として結合されているべきである。
細胞の選択を許容するマーカーを有する多くのクローニ
ングベクターは、高等植物内に異種遺伝子を挿入するた
めの準備に利用できる。このベクターは、例えばｐＢＲ
３２２，ｐＵＣ系、Ｍ１３系、ｐＡＣＹＣ１８４等より
成る。従って、所望の配列を好適な制限部位でベクター
内に挿入すことができる。生じるプラスミドは、Ｅ．コ
リー内へ形質転換のために使用される。このＥ．コリー
細胞を適当な栄養培地中で培養し、次いで収穫し、溶解
させる。プラスミドを回収する。配列分析、制限分析、
電気泳動及び他の生化学−分子生物学的方法を分析法と
して一般的に実施する。各々の操作の後に、使用ＤＮＡ
配列を切断することができかつ結合して次のＤＮＡ配列
にすることができる。各々のプラスミド配列は、同じ又
は他のプラスミド内でクローニングすることがてきる。
所望の遺伝子を植物中に挿入する方法に応じて、他のＤ
ＮＡ配列も必要になりうる。例えば植物細胞の形質転換
のために、Ｔｉ又はＲｉプラスミドが使用される場合に
は、Ｔｉ又はＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右
端又は屡々右及び左端は、挿入されるべき遺伝子の側面
領域として結合されているべきである。
【００３１】植物細胞の形質転換のためにＴ−ＤＮＡを
使用することが研究されており、例えば、欧州特許第１
２０５１６号明細書、ＨｏｅｋｅｍａのＴｈｅ Ｂｉｎ
ａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ
Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ
Ｂ．Ｖ．，Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ．１９８５，Ｃｈ
ａｐｔｅｒ Ｖ．Ｆｒａｌｅｙ等のＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４，１−４６及びＡｎ等のＥＭＢ
Ｏ Ｊ．（１９８５）、４：２７７−２８７に記載され
ている。
使用することが研究されており、例えば、欧州特許第１
２０５１６号明細書、ＨｏｅｋｅｍａのＴｈｅ Ｂｉｎ
ａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｓｙｓｔｅｍ
Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ
Ｂ．Ｖ．，Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ．１９８５，Ｃｈ
ａｐｔｅｒ Ｖ．Ｆｒａｌｅｙ等のＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４，１−４６及びＡｎ等のＥＭＢ
Ｏ Ｊ．（１９８５）、４：２７７−２８７に記載され
ている。
【００３２】挿入されたＤＮＡがゲノム中で一旦融合さ
れたら、これは比較的安定であり、原則として再び出て
こない。これは、通常、形質転換された植物細胞上に殺
菌剤又は抗生物質例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレ
オマイシン、ハイグロマイシン又は特にクロラムフェニ
コールに対して耐性を与える選択マーカーを有する。従
って、使用される個々のマーカーは、挿入ＤＮＡを含有
しない細胞よりも形質転換された細胞の選択を許容すべ
きである。
れたら、これは比較的安定であり、原則として再び出て
こない。これは、通常、形質転換された植物細胞上に殺
菌剤又は抗生物質例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレ
オマイシン、ハイグロマイシン又は特にクロラムフェニ
コールに対して耐性を与える選択マーカーを有する。従
って、使用される個々のマーカーは、挿入ＤＮＡを含有
しない細胞よりも形質転換された細胞の選択を許容すべ
きである。
【００３３】植物宿主細胞中にＤＮＡを挿入するために
多くの技術が使用されている。これらの技術には、アグ
ロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバク
テリウム リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を形質転換剤として用いるＴ−
ＤＮＡでの形質転換、融合、注入又はエレクトロポレー
ション（ｅｌｅｃｔｒｏｏｒａｔｉｏｎ）並びに他の可
能な方法が包含される。この形質転換のためにアグロバ
クテリアを使用する場合には、挿入されるべきＤＮＡ
を、特定のプラスミド中即ち中間ベクター内にもバイナ
リーベクター内にもクローニング導入すべきである。こ
の中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同である配
列に依存する相同組換えによりＴｉ又はＲｉプラスミド
中に組み込むことができる。Ｔｉ又はＲｉプラスミド
は、Ｔ−ＤＮＡの転移のために必要であるｖｉｒ領域を
も有する。中間ベクターそのものは、アグロバクテリア
中で複製できない。この中間ベクターは、ヘルパープラ
スミドの使用によりアグロバクテリア ツメファシェン
ス中に転移することができる（接合）。バイナリーベク
ターそのものは、Ｅ．コリー中でもアグロバクテリア中
でも複製できる。これらは、選択マーカー遺伝子及びリ
ンカー又は右及び左のＴ−ＤＮＡ端領域で枠付けされて
いるポリリンカーを有する。こられは、直接アグロバク
テリア中に転移することができる〔Ｈｏｌｓｔｅｒ等の
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７８），１６３：
１８１−１８７〕。宿主細胞として使用されるアグロバ
クテリウムは、ｖｉｒ領域を有するプラスミドを有すべ
きである。このｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞中
に転移するために必要である。付加的なＴ−ＤＮＡも含
有されうる。このように形質転換されたバクテリアを植
物細胞の形質転換のために使用する。このＤＮＡを植物
細胞中に転移するために、植物外植片をアグロバクテリ
ウム ツメファシェンス又はアグロバクテリウム リソ
ゲネスと共に培養することができる。次いで、植物全体
を、選択のための抗生物質又は殺菌剤を含有していてよ
い適当な媒体中で感染植物材料（例えば葉、茎、根又は
プロトプラスト又は懸濁培養細胞）から再生させること
ができる。このようにして得られた植物は、挿入ＤＮＡ
の存在を試験するために使用できる。インジェクション
及びエレクトロポレーションの場合に、特別なプラスミ
ドの要求はない。通常のプラスミド例えばｐＵＣ誘導体
を使用することができる。
多くの技術が使用されている。これらの技術には、アグ
ロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバク
テリウム リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を形質転換剤として用いるＴ−
ＤＮＡでの形質転換、融合、注入又はエレクトロポレー
ション（ｅｌｅｃｔｒｏｏｒａｔｉｏｎ）並びに他の可
能な方法が包含される。この形質転換のためにアグロバ
クテリアを使用する場合には、挿入されるべきＤＮＡ
を、特定のプラスミド中即ち中間ベクター内にもバイナ
リーベクター内にもクローニング導入すべきである。こ
の中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同である配
列に依存する相同組換えによりＴｉ又はＲｉプラスミド
中に組み込むことができる。Ｔｉ又はＲｉプラスミド
は、Ｔ−ＤＮＡの転移のために必要であるｖｉｒ領域を
も有する。中間ベクターそのものは、アグロバクテリア
中で複製できない。この中間ベクターは、ヘルパープラ
スミドの使用によりアグロバクテリア ツメファシェン
ス中に転移することができる（接合）。バイナリーベク
ターそのものは、Ｅ．コリー中でもアグロバクテリア中
でも複製できる。これらは、選択マーカー遺伝子及びリ
ンカー又は右及び左のＴ−ＤＮＡ端領域で枠付けされて
いるポリリンカーを有する。こられは、直接アグロバク
テリア中に転移することができる〔Ｈｏｌｓｔｅｒ等の
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７８），１６３：
１８１−１８７〕。宿主細胞として使用されるアグロバ
クテリウムは、ｖｉｒ領域を有するプラスミドを有すべ
きである。このｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞中
に転移するために必要である。付加的なＴ−ＤＮＡも含
有されうる。このように形質転換されたバクテリアを植
物細胞の形質転換のために使用する。このＤＮＡを植物
細胞中に転移するために、植物外植片をアグロバクテリ
ウム ツメファシェンス又はアグロバクテリウム リソ
ゲネスと共に培養することができる。次いで、植物全体
を、選択のための抗生物質又は殺菌剤を含有していてよ
い適当な媒体中で感染植物材料（例えば葉、茎、根又は
プロトプラスト又は懸濁培養細胞）から再生させること
ができる。このようにして得られた植物は、挿入ＤＮＡ
の存在を試験するために使用できる。インジェクション
及びエレクトロポレーションの場合に、特別なプラスミ
ドの要求はない。通常のプラスミド例えばｐＵＣ誘導体
を使用することができる。
【００３４】形質転換された細胞は、植物内で通常の方
法で生長する。植物は通常法で生長させ、同じ形質転換
された遺伝因子又は他の遺伝因子を有する植物と交配さ
せることができる。生じるハイブリド個体は相応する形
質特性を有する。
法で生長する。植物は通常法で生長させ、同じ形質転換
された遺伝因子又は他の遺伝因子を有する植物と交配さ
せることができる。生じるハイブリド個体は相応する形
質特性を有する。
【００３５】本発明のコントロール系は、適当なリプレ
ッサー蛋白質が存在する場合にのみ植物中で機能するこ
とが認められ、例えばコントロール手段がｔｅｔオペレ
ータより成る場合には、ｔｅｔリプレッサーが提供され
るべきである。従って、宿主植物が適当なリプレッサー
を産生しない場合には、このリプレッサーを産生する手
段、即ちリプレッサーに関してコード化するＤＮＡを有
する植物を提供することが必要である。
ッサー蛋白質が存在する場合にのみ植物中で機能するこ
とが認められ、例えばコントロール手段がｔｅｔオペレ
ータより成る場合には、ｔｅｔリプレッサーが提供され
るべきである。従って、宿主植物が適当なリプレッサー
を産生しない場合には、このリプレッサーを産生する手
段、即ちリプレッサーに関してコード化するＤＮＡを有
する植物を提供することが必要である。
【００３６】一般に、これは、適当なベクター中のリプ
レッサーを得るための遺伝子又は適当な遺伝子フラグメ
ントのクローニング及びこの遺伝子の植物中への挿入に
より達成することができる。好適なベクターの構成中
で、宿主植物中でのリプレッサーの表現を確保するため
に、適当な植物表現コントロールエレメントが提供され
るべきである。例えば強力な例えば構成的植物プロモー
タを使用するのが有利である。
レッサーを得るための遺伝子又は適当な遺伝子フラグメ
ントのクローニング及びこの遺伝子の植物中への挿入に
より達成することができる。好適なベクターの構成中
で、宿主植物中でのリプレッサーの表現を確保するため
に、適当な植物表現コントロールエレメントが提供され
るべきである。例えば強力な例えば構成的植物プロモー
タを使用するのが有利である。
【００３７】植物宿主細胞中にＤＮＡを挿入するために
好適な技術は、前に記載されている。
好適な技術は、前に記載されている。
【００３８】本発明は、リプレッサー例えばｔｅｔリプ
レッサーに関してコード化するＤＮＡを有するプラスミ
ドを提供し、かつ本発明のコントロール手段及び適当な
リプレッサーに関してコード化するＤＮＡを有する植物
を提供する。
レッサーに関してコード化するＤＮＡを有するプラスミ
ドを提供し、かつ本発明のコントロール手段及び適当な
リプレッサーに関してコード化するＤＮＡを有する植物
を提供する。
【００３９】更に、本発明は、本発明のコントロール手
段（これはオペレータを包含する）を有するプラスミド
の使用及び一般的に、適当なリプレッサーに関してコー
ド化するＤＮＡを有するプラスミドを、ＤＮＡ配列の表
現が時期及び場所でコントロール可能である植物の生産
に使用することを提供する。
段（これはオペレータを包含する）を有するプラスミド
の使用及び一般的に、適当なリプレッサーに関してコー
ド化するＤＮＡを有するプラスミドを、ＤＮＡ配列の表
現が時期及び場所でコントロール可能である植物の生産
に使用することを提供する。
【００４０】本発明の形質転換植物中での所望の産物の
表現の時期及び場所に関するコントロールは、この植物
中に挿入されているコントロール系を得るためのインデ
ューサーの添加により達成され、表現は、このインデュ
ーサーが存在する場合にのみ起こり、インデューサーが
存在する場所のみで起こる。
表現の時期及び場所に関するコントロールは、この植物
中に挿入されているコントロール系を得るためのインデ
ューサーの添加により達成され、表現は、このインデュ
ーサーが存在する場合にのみ起こり、インデューサーが
存在する場所のみで起こる。
【００４１】時期に関するコントロールは、例えばイン
デューサーの適用のタイミング、頻度及び数により達成
できる。
デューサーの適用のタイミング、頻度及び数により達成
できる。
【００４２】本発明の形質転換植物と共に使用するため
に、インデューサーは、リプレッサーに達することが可
能であるべきであり、即ち、この形質転換植物は、イン
デューサーを吸収できるべきであり、この植物内に入っ
たら、このインデューサーはリプレッサーに到達可能で
あるべきであることは明らかである。更にこのインデュ
ーサーは植物に対して毒性であってはならない。
に、インデューサーは、リプレッサーに達することが可
能であるべきであり、即ち、この形質転換植物は、イン
デューサーを吸収できるべきであり、この植物内に入っ
たら、このインデューサーはリプレッサーに到達可能で
あるべきであることは明らかである。更にこのインデュ
ーサーは植物に対して毒性であってはならない。
【００４３】前記のように、テトラサイクリンは、前記
の基準を満たす。他の好適なインデューサーには、リプ
レッサーに結合し、そのＤＮＡ結合能を廃するテトラサ
イクリン誘導体も包含される。選択インデューサーを得
るために適当なオペレータ／リプレッサー系を、ここに
記載のように、例えばテトラサイクリンオペレータ／リ
プレッサー系と同様に植物中に導入することができる。
の基準を満たす。他の好適なインデューサーには、リプ
レッサーに結合し、そのＤＮＡ結合能を廃するテトラサ
イクリン誘導体も包含される。選択インデューサーを得
るために適当なオペレータ／リプレッサー系を、ここに
記載のように、例えばテトラサイクリンオペレータ／リ
プレッサー系と同様に植物中に導入することができる。
【００４４】用語及び略語は次の意味を有する： ｂｐ，ｋｂ＝塩基対、キロ塩基、 ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸、遺伝子情報のキャリァ ＰＮＡ＝リボ核酸 ＨＥＰＥＳ＝Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタン−スルホン酸 ｋＤａ＝キロダルトン ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム トリス＝トリス（２−アミノエチル）アミン ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸 ｍモル＝ミリモル ｆモル＝フェムトモル 次のプラスミドを、ドイツ国ブルンスウィック（Ｂｒｕ
ｎｓｗｉｃｋ）在のドイッチェ・ザンムルング・フォン
・ミクロオルガニスメン（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌ
ｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ：Ｄ
ＳＭ）に１９９０年１２月２３日に寄託した。
Ｎ′−２−エタン−スルホン酸 ｋＤａ＝キロダルトン ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム トリス＝トリス（２−アミノエチル）アミン ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸 ｍモル＝ミリモル ｆモル＝フェムトモル 次のプラスミドを、ドイツ国ブルンスウィック（Ｂｒｕ
ｎｓｗｉｃｋ）在のドイッチェ・ザンムルング・フォン
・ミクロオルガニスメン（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌ
ｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ：Ｄ
ＳＭ）に１９９０年１２月２３日に寄託した。
【００４５】プラスミドｐＴＥＴ１（ＤＳＭ６２８１） プラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４（ＤＳＭ６２８０）。
【００４６】図面の説明 図１は、１０．７ｋｂプラスミドｐＴＥＴ１の制限地図
である。略字は次のものを意味する： ＬＢ＝Ｔ−ＤＮＡの左端配列 ＲＢ＝Ｔ−ＤＮＡの右端配列 ＣａＭＶ３５Ｓ＝カリフラワーモザイクウイルスのプロ
モータ（５２６ｂｐ） ｔｅｔＲ＝テトラサイクリンリプレッサーの構造遺伝子
（６９５ｂｐ） ｏｃｓ＝オクトピンシンターゼ遺伝子（１８０ｂｐ）の
ポリアデニル化信号 ｎｐｔＩＩ＝ノパリンシンターゼプロモータ(１２００
ｂｐ)のコントロール下における、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼのキメラ遺伝子 例１に記載の切断部位も示されている。
である。略字は次のものを意味する： ＬＢ＝Ｔ−ＤＮＡの左端配列 ＲＢ＝Ｔ−ＤＮＡの右端配列 ＣａＭＶ３５Ｓ＝カリフラワーモザイクウイルスのプロ
モータ（５２６ｂｐ） ｔｅｔＲ＝テトラサイクリンリプレッサーの構造遺伝子
（６９５ｂｐ） ｏｃｓ＝オクトピンシンターゼ遺伝子（１８０ｂｐ）の
ポリアデニル化信号 ｎｐｔＩＩ＝ノパリンシンターゼプロモータ(１２００
ｂｐ)のコントロール下における、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼのキメラ遺伝子 例１に記載の切断部位も示されている。
【００４７】図２は、形質転換タバコ植物中の機能的ｔ
ｅｔリプレッサーを検査するための電気泳動のオートラ
ジオグラムである。１〜１０の位置に、32Ｐ−ラベルさ
れたオペレータフラグメント（３６０ｂｐ）６ｆモル
を、かつ１１〜２０の位置に２０ｆモルを導入した。１
〜４の位置では、ｔｅｔリプレッサー（エシエリキア・
コリーから精製）０（対照）、２０、６０及び１２０ｆ
モルの存在で結合反応を実施した。５〜１０の位置で
は、プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する形質転
換植物の葉からの蛋白質抽出物０（対照）、１、２、
４、６及び８μｇの存在で結合反応を実施し、１１〜１
４の位置では、ｔｅｔリプレッサー（エシエリキア・コ
リーから精製）０（対照）、１０、１００及び２００ｆ
モルの存在でこの結合反応を実施し、１５〜２０の位置
では、プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する形質
転換植物のプロトプラストからの蛋白質抽出物０（対
照）、１、２、４、８及び１６μｇの存在で結合反応を
実施した。
ｅｔリプレッサーを検査するための電気泳動のオートラ
ジオグラムである。１〜１０の位置に、32Ｐ−ラベルさ
れたオペレータフラグメント（３６０ｂｐ）６ｆモル
を、かつ１１〜２０の位置に２０ｆモルを導入した。１
〜４の位置では、ｔｅｔリプレッサー（エシエリキア・
コリーから精製）０（対照）、２０、６０及び１２０ｆ
モルの存在で結合反応を実施した。５〜１０の位置で
は、プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する形質転
換植物の葉からの蛋白質抽出物０（対照）、１、２、
４、６及び８μｇの存在で結合反応を実施し、１１〜１
４の位置では、ｔｅｔリプレッサー（エシエリキア・コ
リーから精製）０（対照）、１０、１００及び２００ｆ
モルの存在でこの結合反応を実施し、１５〜２０の位置
では、プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する形質
転換植物のプロトプラストからの蛋白質抽出物０（対
照）、１、２、４、８及び１６μｇの存在で結合反応を
実施した。
【００４８】略字は次の意味を有する： Ｒ＝ｔｅｔリプレッサーＤＮＡコンプレックス Ｆ＝非コンプレックスＤＮＡ 図３は、１５ｋｂプラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４の制
限地図である。略字は次の意味を有する： ＬＢ＝Ｔ−ＤＮＡの左端配列 ＲＢ＝Ｔ−ＤＮＡの右端配列 ＣａＭＶ３５Ｓ＝２個のｔｅｔオペレータを有するカリ
フラワーモザイクウイルスのプロモータ（エンハンサ
ー）（３３４ｂｐ） ｏｌｉｇｏ＝ＴＡＴＡボックス、２個のｔｅｔリプレッ
サー及び切断部位ＳｐｅＩ、ＳｎａｂＩ、ＢｇＬＩＩ、
ＨｐａＩ及びＸｂａＩを有するＤＮＡフラグメント（９
９ｂｐ） ｇｕｓ＝エシエリキア・コリーからのβ−グルクロニダ
ーゼの構造遺伝子（１８００ｂｐ） ｎｏｓ＝ノパリンシンターゼ遺伝子（２０３ｂｐ）のポ
リアデニル化信号 ｈｐｔＩ＝ノパリンシンターゼプロモータのコントロー
ル下における、ハイグロマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ（１６５０ｂｐ）のキメラ遺伝子 ｎｐｔＩＩ＝ノパリンシンターゼプロモータ（１２００
ｂｐ）のコントロールＦにおける、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼのキメラ遺伝子 例２に記載の切断部位も示されている。図４は、プラス
ミドｐＴＥＴ１及びプラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４の
Ｔ−ＤＮＡを有する６個の形質転換植物の葉からの抽出
物（位置１〜６）中のｇｕｓ遺伝子のテトラサイクリン
依存表現を検査するためのノーザンブロット分析のオー
トラジオグラムである。
限地図である。略字は次の意味を有する： ＬＢ＝Ｔ−ＤＮＡの左端配列 ＲＢ＝Ｔ−ＤＮＡの右端配列 ＣａＭＶ３５Ｓ＝２個のｔｅｔオペレータを有するカリ
フラワーモザイクウイルスのプロモータ（エンハンサ
ー）（３３４ｂｐ） ｏｌｉｇｏ＝ＴＡＴＡボックス、２個のｔｅｔリプレッ
サー及び切断部位ＳｐｅＩ、ＳｎａｂＩ、ＢｇＬＩＩ、
ＨｐａＩ及びＸｂａＩを有するＤＮＡフラグメント（９
９ｂｐ） ｇｕｓ＝エシエリキア・コリーからのβ−グルクロニダ
ーゼの構造遺伝子（１８００ｂｐ） ｎｏｓ＝ノパリンシンターゼ遺伝子（２０３ｂｐ）のポ
リアデニル化信号 ｈｐｔＩ＝ノパリンシンターゼプロモータのコントロー
ル下における、ハイグロマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ（１６５０ｂｐ）のキメラ遺伝子 ｎｐｔＩＩ＝ノパリンシンターゼプロモータ（１２００
ｂｐ）のコントロールＦにおける、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼのキメラ遺伝子 例２に記載の切断部位も示されている。図４は、プラス
ミドｐＴＥＴ１及びプラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４の
Ｔ−ＤＮＡを有する６個の形質転換植物の葉からの抽出
物（位置１〜６）中のｇｕｓ遺伝子のテトラサイクリン
依存表現を検査するためのノーザンブロット分析のオー
トラジオグラムである。
【００４９】＋＝テトラサイクリンでの浸透の後の形質
転換植物の葉からのＲＮＡ −＝テトラサイクリンで浸透しなかった形質転換植物の
葉からのＲＮＡ 図５は、種々の濃度のテトラサイクリン（Ｔｃ ０．
１、０．５、１及び１０ｍｇ／ｌ）で浸透後の、及び対
照（Ｔｃ ０ｍｇ／ｌ）の形質転換された植物の葉から
の抽出物（位置１〜５）中のテトラサイクリン誘導の濃
度依存性を特徴付けるためのノーザンブロット分析のオ
ートラジオグラムである。
転換植物の葉からのＲＮＡ −＝テトラサイクリンで浸透しなかった形質転換植物の
葉からのＲＮＡ 図５は、種々の濃度のテトラサイクリン（Ｔｃ ０．
１、０．５、１及び１０ｍｇ／ｌ）で浸透後の、及び対
照（Ｔｃ ０ｍｇ／ｌ）の形質転換された植物の葉から
の抽出物（位置１〜５）中のテトラサイクリン誘導の濃
度依存性を特徴付けるためのノーザンブロット分析のオ
ートラジオグラムである。
【００５０】略字は次の意味を有する： Ｔｃ＝テトラサイクリン ｇｕｓ＝エシエリキア・コリーからのβ−ガラクトシダ
ーゼのｍＲＮＡ ｔｅｔＲ＝ｔｅｔリプレッサーのｍＲＮＡ 図６は、形質転換植物（位置１〜６）の葉からの抽出物
中のテトラサイクリン誘導の時間における展開を特徴付
けるためのノーザンブロット分析のゲルを示している。
試料は、０（対照）、０．５、１、３、６及び２２時間
（ｈ）後に採った。
ーゼのｍＲＮＡ ｔｅｔＲ＝ｔｅｔリプレッサーのｍＲＮＡ 図６は、形質転換植物（位置１〜６）の葉からの抽出物
中のテトラサイクリン誘導の時間における展開を特徴付
けるためのノーザンブロット分析のゲルを示している。
試料は、０（対照）、０．５、１、３、６及び２２時間
（ｈ）後に採った。
【００５１】略字は次の意味を有する： ｇｕｓ＝エシエリキア・コリーからのβ−グルクロニダ
ーゼのｍＲＮＡ ｔｅｔＲ＝ｔｅｔリプレッサーのｍＲＮＡ 図７は、形質転換植物の葉中のｇｕｓ−表現の場所的誘
導を示す、葉の写真。
ーゼのｍＲＮＡ ｔｅｔＲ＝ｔｅｔリプレッサーのｍＲＮＡ 図７は、形質転換植物の葉中のｇｕｓ−表現の場所的誘
導を示す、葉の写真。
【００５２】本発明の基礎となる実施例を理解するため
に、前記試験に必要とされかつ自体公知である全ての方
法をまず第１に以下記載する： １．クローン化方法 ベクターｐＵＣ１８／１９（Yanisch-Perron他，Gene
（１９８５），３３，１０３〜１１９）をクローン化に
使用した。
に、前記試験に必要とされかつ自体公知である全ての方
法をまず第１に以下記載する： １．クローン化方法 ベクターｐＵＣ１８／１９（Yanisch-Perron他，Gene
（１９８５），３３，１０３〜１１９）をクローン化に
使用した。
【００５３】植物の形質転換のために、遺伝子構造をバ
イナリーベクターＢＩＮ１９中にクローン化した（Beva
n, Nucl. Acids Res.（１９８４），１２，８７１１〜
８７２０）。標準法を公知方法により実施した（Molecu
lar Cloning, Maniatis他，（１９８２），Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.
Y.）。
イナリーベクターＢＩＮ１９中にクローン化した（Beva
n, Nucl. Acids Res.（１９８４），１２，８７１１〜
８７２０）。標準法を公知方法により実施した（Molecu
lar Cloning, Maniatis他，（１９８２），Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.
Y.）。
【００５４】２．細菌の菌株 遺伝子型Ｆ-、末端Ａｌ、ｈｓｄＲ１７、（ｒk -，
ｍk -）、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−Ｉ、Ｒ-、ｒｅｃＡ
ｌ、ｇｙｒＡ９６，ｒｄＡｌ、φ ８０ｄ ｌａｃｚΔ
Ｍ１５のＥ．コリ菌株ＤＨ５αをｐＵＣベクターに使用
した。
ｍk -）、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−Ｉ、Ｒ-、ｒｅｃＡ
ｌ、ｇｙｒＡ９６，ｒｄＡｌ、φ ８０ｄ ｌａｃｚΔ
Ｍ１５のＥ．コリ菌株ＤＨ５αをｐＵＣベクターに使用
した。
【００５５】植物の形質転換をアグロバクテリウム・ト
ゥメファシエンス（Agrobacteriumtumefaciens）菌株Ｇ
Ｖ２２６０、Deblaere他、Nucl. Acids Res. １３、４
７７７〜４７８８、（１９８５）により実施した。
ゥメファシエンス（Agrobacteriumtumefaciens）菌株Ｇ
Ｖ２２６０、Deblaere他、Nucl. Acids Res. １３、４
７７７〜４７８８、（１９８５）により実施した。
【００５６】３．アグロバクテリウム・トゥメファシエ
ンスの形質転換 アグロバクテリア中へのＤＮＡの挿入を、ホルスターズ
（Holsters）他（Mol.Gen. Genet.（１９７８）、１６
３、１８１〜１８７）によって開発された方法により直
接形質転換することによって行なった。形質転換された
アグロバクテリアのプラスミドＤＮＡをビルンボイム
（Birnboim）およびドーリー（Doly）（Nucl. Acids Re
s.（１９７９）、７、１５１３〜１５２３）によって開
発された方法により単離し、かつ適当な制限切断の後に
ゲル電気泳動によって分離した。
ンスの形質転換 アグロバクテリア中へのＤＮＡの挿入を、ホルスターズ
（Holsters）他（Mol.Gen. Genet.（１９７８）、１６
３、１８１〜１８７）によって開発された方法により直
接形質転換することによって行なった。形質転換された
アグロバクテリアのプラスミドＤＮＡをビルンボイム
（Birnboim）およびドーリー（Doly）（Nucl. Acids Re
s.（１９７９）、７、１５１３〜１５２３）によって開
発された方法により単離し、かつ適当な制限切断の後に
ゲル電気泳動によって分離した。
【００５７】４．植物の形質転換 牛抽出液０．５％、イースト抽出液０．１％、ペプトン
０．５％、スクロース０．５％および２ｍＭの硫酸マグ
ネシウムからなるＹＥＢ培地中のアグロバクテリウム・
トゥメファシエンスの１晩置いた培養液１０ｍｌを遠心
分離し、上澄み液を廃棄し、細菌を同量の抗生物質不含
の媒体中に再懸濁させた。滅菌されたペトリ皿中で、葉
脈を取除いた滅菌された植物の葉（約１ｃｍ2）を細菌
の懸濁液中に浸漬した。次に、この葉を、スクロース２
％およびバクトアガル０．８％を有するＭＳ培地（Mura
shigeおよびSkoog,Physiologia Plantarum（１９６
２），１５，４７３〜４９７）を含有するペトリ皿中に
密集させて置いた。２５℃で暗中で２日間のインキュベ
ーション後に、葉を、カナマイシンまたはハイグロマイ
シン１００ｍｇ／ｌ、クラホラン５００ｍｇ／ｌ、ベン
ジルアミノプリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸
（ＮＡＡ）０．２ｍｇ／ｌおよびバクトアガル０．８％
を含有するＭＳ培地上に移した。成長している苗条を、
クラホラン２５０ｍｇ／ｌおよびカナマイシンまたはハ
イグロマイシン５０ｍｇ／ｌを有するホルモン不含のＭ
Ｓ培地上に移した。
０．５％、スクロース０．５％および２ｍＭの硫酸マグ
ネシウムからなるＹＥＢ培地中のアグロバクテリウム・
トゥメファシエンスの１晩置いた培養液１０ｍｌを遠心
分離し、上澄み液を廃棄し、細菌を同量の抗生物質不含
の媒体中に再懸濁させた。滅菌されたペトリ皿中で、葉
脈を取除いた滅菌された植物の葉（約１ｃｍ2）を細菌
の懸濁液中に浸漬した。次に、この葉を、スクロース２
％およびバクトアガル０．８％を有するＭＳ培地（Mura
shigeおよびSkoog,Physiologia Plantarum（１９６
２），１５，４７３〜４９７）を含有するペトリ皿中に
密集させて置いた。２５℃で暗中で２日間のインキュベ
ーション後に、葉を、カナマイシンまたはハイグロマイ
シン１００ｍｇ／ｌ、クラホラン５００ｍｇ／ｌ、ベン
ジルアミノプリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／ｌ、ナフチル酢酸
（ＮＡＡ）０．２ｍｇ／ｌおよびバクトアガル０．８％
を含有するＭＳ培地上に移した。成長している苗条を、
クラホラン２５０ｍｇ／ｌおよびカナマイシンまたはハ
イグロマイシン５０ｍｇ／ｌを有するホルモン不含のＭ
Ｓ培地上に移した。
【００５８】培地上に根を形成した苗条を研究すべきＤ
ＮＡ配列の組込みについてノーザンブロット分析法およ
びサザンブロット分析法によって試験した。
ＮＡ配列の組込みについてノーザンブロット分析法およ
びサザンブロット分析法によって試験した。
【００５９】５．形質転換した植物のゲノムＤＮＡの分
析 ゲノム植物ＤＮＡの単離をロジャース（Rogers）および
ベンディック（Bendich）（Plant Mol. Biol. （１９８
５），５，６９〜７６）により行なった。
析 ゲノム植物ＤＮＡの単離をロジャース（Rogers）および
ベンディック（Bendich）（Plant Mol. Biol. （１９８
５），５，６９〜７６）により行なった。
【００６０】ＤＮＡ分析のために、適当な制限切断の後
にＤＮＡ２０μｇを、研究すべきＤＮＡ配列の組込みに
ついてサザンブロット法により分析した。
にＤＮＡ２０μｇを、研究すべきＤＮＡ配列の組込みに
ついてサザンブロット法により分析した。
【００６１】塩化ナトリウム３モルおよびクエン酸ナト
リウム０．３モルを含有するＳＳＣ緩衝液中のＤＮＡを
膜上に吸い取った。ハイブリッド化を、ポリエチレング
リコール１０％を含有するアマシノ（Amasino）（Anal.
Biochem.（１９８６），１５２，３０４〜３０７）に
よるハイブリッド化緩衝液中で行なった。組込まれたＤ
ＮＡ配列を検出するために、ＤＮＡ断片を放射能標識化
した。
リウム０．３モルを含有するＳＳＣ緩衝液中のＤＮＡを
膜上に吸い取った。ハイブリッド化を、ポリエチレング
リコール１０％を含有するアマシノ（Amasino）（Anal.
Biochem.（１９８６），１５２，３０４〜３０７）に
よるハイブリッド化緩衝液中で行なった。組込まれたＤ
ＮＡ配列を検出するために、ＤＮＡ断片を放射能標識化
した。
【００６２】６．形質転換した植物からの全ＲＮＡの分
析 植物の全ＲＮＡの単離をロウジマン（Logemann）他（An
alytical Biochem.（１９８７），１６３，１６〜２
０）の方法により実施した。
析 植物の全ＲＮＡの単離をロウジマン（Logemann）他（An
alytical Biochem.（１９８７），１６３，１６〜２
０）の方法により実施した。
【００６３】分析のために、全ＲＮＡの一部３０μｇを
転写ソート（sought）の存在についてノーザンブロット
法により研究した。ブロットおよびハイブリッド化をサ
ザンブロット分析法の記載と同様の方法により実施し
た。
転写ソート（sought）の存在についてノーザンブロット
法により研究した。ブロットおよびハイブリッド化をサ
ザンブロット分析法の記載と同様の方法により実施し
た。
【００６４】８．形質転換した植物中のｔｅｔリプレッ
サ−の検出 プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する植物からの
葉物質１００ｍｇを、凍結することなしに、抽出緩衝液
２００μｌ（燐酸二水素ナトリウム／燐酸水素ジナトリ
ウム５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ１ｍＭ、４−
（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール
０．１％、β−メルカプトエタノール１０ｍＭ、亜硫酸
水素ナトリウム２ｍＭ、フェニルメチルスルホニルフル
オリド２ｍＭ、アンチパイン１μｇ／ｍｌ、アプロチニ
ン１μｇ／ｍｌ、キモスタチン１μｇ／ｍｌ、ロイペプ
チン１μｇ／ｍｌ、ペプスタチン１μｇ／ｍｌおよびポ
リビニルピロリドン０．１ｇ／葉物質１ｇ）中で均質化
した。
サ−の検出 プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する植物からの
葉物質１００ｍｇを、凍結することなしに、抽出緩衝液
２００μｌ（燐酸二水素ナトリウム／燐酸水素ジナトリ
ウム５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ１ｍＭ、４−
（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール
０．１％、β−メルカプトエタノール１０ｍＭ、亜硫酸
水素ナトリウム２ｍＭ、フェニルメチルスルホニルフル
オリド２ｍＭ、アンチパイン１μｇ／ｍｌ、アプロチニ
ン１μｇ／ｍｌ、キモスタチン１μｇ／ｍｌ、ロイペプ
チン１μｇ／ｍｌ、ペプスタチン１μｇ／ｍｌおよびポ
リビニルピロリドン０．１ｇ／葉物質１ｇ）中で均質化
した。
【００６５】結合反応をトリス緩衝液４０μｌ（塩化ナ
トリウム５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭおよびト
リス／ＨＣｌ １０ｍＭ、ｐＨ７．５）中で実施し、こ
の場合緩衝液には０．６Ｃｉ 32Ｐ／ミリモルの特異的
活性を有する32Ｐ−末端標識化オペレーター５〜２０ｆ
モルおよびヘリング精子ＤＮＡ８０μｇが添加された。
次に、葉抽出液０．５〜１０μｌを結合反応混合物に添
加した。室温で１５分間のインキュベーション後に、十
分なグルセロールを添加し、溶液２５％を得た。この溶
液をポリアクリルアミドゲル５％に添加し、かつゲル電
気泳動によって分離した。電気泳動を２．５Ｖ／ｃｍで
１２時間トリス緩衝液ｐＨ８．０（トリス６０ｍＭ／塩
基、硼酸６０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭおよびグリセロール
１０％）中で実施した。次に、ゲルを乾燥した。生じた
放射能バンドは、オートラジオグラフィーによって目に
見えるようになった。
トリウム５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭおよびト
リス／ＨＣｌ １０ｍＭ、ｐＨ７．５）中で実施し、こ
の場合緩衝液には０．６Ｃｉ 32Ｐ／ミリモルの特異的
活性を有する32Ｐ−末端標識化オペレーター５〜２０ｆ
モルおよびヘリング精子ＤＮＡ８０μｇが添加された。
次に、葉抽出液０．５〜１０μｌを結合反応混合物に添
加した。室温で１５分間のインキュベーション後に、十
分なグルセロールを添加し、溶液２５％を得た。この溶
液をポリアクリルアミドゲル５％に添加し、かつゲル電
気泳動によって分離した。電気泳動を２．５Ｖ／ｃｍで
１２時間トリス緩衝液ｐＨ８．０（トリス６０ｍＭ／塩
基、硼酸６０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭおよびグリセロール
１０％）中で実施した。次に、ゲルを乾燥した。生じた
放射能バンドは、オートラジオグラフィーによって目に
見えるようになった。
【００６６】９．原形質体の製造 プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する無菌植物の
葉からの原形質体をダム（Damm）およびウィルミッツァ
ー（Willmitzer）（Mol. Gen. Genet.（１９８８）），
２１３，１５〜２０）によって開発された方法により得
た。原形質体の数を数え、この原形質体を遠心分離によ
って濃縮し、かつ抽出緩衝液１００μｌ中に入れ、この
場合には、緩衝液１００μｌ中に原形質体３０００００
個が含有されていた。原形質体はこの緩衝液中で溶解し
た。次に、細胞の屑を遠心分離した。
葉からの原形質体をダム（Damm）およびウィルミッツァ
ー（Willmitzer）（Mol. Gen. Genet.（１９８８）），
２１３，１５〜２０）によって開発された方法により得
た。原形質体の数を数え、この原形質体を遠心分離によ
って濃縮し、かつ抽出緩衝液１００μｌ中に入れ、この
場合には、緩衝液１００μｌ中に原形質体３０００００
個が含有されていた。原形質体はこの緩衝液中で溶解し
た。次に、細胞の屑を遠心分離した。
【００６７】１０．グス（Ｇｕｓ）活性の検定 蛍光測定によるグス検定のために、外植片を均質化し、
基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄグルクロニド
と一緒に３７℃でインキュベートした。蛍光の定量化を
ジェファーソン（Jefferson）（Plant Mol. Biol. Rep.
５，３８７〜４０５，１９８７）の方法により実施し
た。蛋白質濃度をブラッドフォード（Bradford）（１９
７９）の方法により測定した。生体内染色のために、無
菌の植物物質にＩｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロム−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄグルコン酸シクロヘ
キシルアンモニウム）を真空浸透させ、かつ１晩中３７
℃でインキュベートした。
基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄグルクロニド
と一緒に３７℃でインキュベートした。蛍光の定量化を
ジェファーソン（Jefferson）（Plant Mol. Biol. Rep.
５，３８７〜４０５，１９８７）の方法により実施し
た。蛋白質濃度をブラッドフォード（Bradford）（１９
７９）の方法により測定した。生体内染色のために、無
菌の植物物質にＩｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロム−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄグルコン酸シクロヘ
キシルアンモニウム）を真空浸透させ、かつ１晩中３７
℃でインキュベートした。
【００６８】実施例 例１ プラスミドｐＴＥＴ１の製造およびタバコの植物ゲノム
中へのプラスミドのＴ−ＤＮＡの挿入 ２個のプラスミドＢＩＮＡＲ（Hoefgen and Willmitze
r, Plant Science（１９９０），６６，２２１〜２３
０）およびｐＷＨ３０５（Ohemichen他，EMBO J.（１９
８４），３，５３９〜５４３）をプラスミドｐＴＥＴ１
の製造に使用した。ＢＩＮＡＲプラスミドは、バイナリ
ーベクターＢＩＮ１９の誘導体であり（Bevan,Nucl. Ac
ids Res. （１９８４），１２，８７１１〜８７２
０）、この誘導体は、ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位
と、ＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にカリフラワーモザイク
病ウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡのプロモータ
ーを含有し、このプロモーターは、構成表現をもたら
し、ならびにオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニ
ル化信号をもたらす。プロモーターと、ポリアデニル化
信号との間に位置しているのは、次の切断部位である：
ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａＩ
Ｉ、ＰｓｔＩ。ｐＷＨ３０５からの６９５ ｂｐ Ｈｐ
ａＩ断片をＳｍａＩ切断部位中に挿入した。ＨｐａＩ断
片は、５´−非翻訳リーダーの１８ ｂｐ、構造遺伝子
の６２４ ｂｐおよびｔｅｔＲ遺伝子の３´−領域を含
有する。ＳｍａＩ切断部位は、クローニング化プロセス
の間に失われた。プラスミドｐＴＥＴ１は、１０．７ｋ
ｂの全体寸法を有し、これは次のものから構成されてい
る：ＥｃｏＲＩ部位と、ＫｐｎＩ部位との間には、Ｃａ
ＭＶ ３５Ｓウィルスの５２６ ｂｐプロモーター断片
が存在し（Covey and Hull （１９８５）Advance in C
auliflower Mosaic Virus Research, Oxford Surveys o
f Plant Molecular and Cell Biology，２，３３９〜３
４６）；ＫｐｎＩ部位と、ＢａｍＨＩ部位との間には、
ｔｅｔＲ遺伝子の６９５ ｂｐ断片が存在し；ＢａｍＨ
Ｉ部位と、ＳｐｈＩ部位との間には、上記の切断部位を
有するポリリンカー配列が存在し；ＳｐｈＩ部位と、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位との間には、オクトピンシンターゼ遺
伝子の１８０ ｂｐポリアデニル化信号が存在する。前
記プラスミドが植物ゲノム中に組込まれた場合には、直
ちにこのプラスミドの一部は、全組織中のｔｅｔリプレ
ッサ−蛋白質の合成をもたらす。ＥｃｏＲＩ部位および
ＨｉｎｄＩＩＩ部位の外側の配列は、ベクターＢＩＮ１
９の配列である。前記外側の配列は、エシェリキア・コ
リ（Escherichia coli）およびアグロバクテリウム・ト
ゥメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の場
合のプラスミドの複製および選択、ならびに植物中への
Ｔ−ＤＮＡの転移およびカナマイシン上での形質転換さ
れた植物細胞を選択するためのポテンシャルのための全
機能を有する。耐性は、ｎｐｔＩＩ遺伝子によって与え
られる。前記プラスミドをアグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンス中に入れて形質転換した。次に、タバコ植
物中へのＤＮＡ転移をタバコ植物からの葉の小片を用い
てアグロバクテリアの共培養によって実施した。選択を
カナマイシン上で実施した。無菌の稔性の植物を形質転
換した細胞から再生した。
中へのプラスミドのＴ−ＤＮＡの挿入 ２個のプラスミドＢＩＮＡＲ（Hoefgen and Willmitze
r, Plant Science（１９９０），６６，２２１〜２３
０）およびｐＷＨ３０５（Ohemichen他，EMBO J.（１９
８４），３，５３９〜５４３）をプラスミドｐＴＥＴ１
の製造に使用した。ＢＩＮＡＲプラスミドは、バイナリ
ーベクターＢＩＮ１９の誘導体であり（Bevan,Nucl. Ac
ids Res. （１９８４），１２，８７１１〜８７２
０）、この誘導体は、ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位
と、ＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にカリフラワーモザイク
病ウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡのプロモータ
ーを含有し、このプロモーターは、構成表現をもたら
し、ならびにオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニ
ル化信号をもたらす。プロモーターと、ポリアデニル化
信号との間に位置しているのは、次の切断部位である：
ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａＩ
Ｉ、ＰｓｔＩ。ｐＷＨ３０５からの６９５ ｂｐ Ｈｐ
ａＩ断片をＳｍａＩ切断部位中に挿入した。ＨｐａＩ断
片は、５´−非翻訳リーダーの１８ ｂｐ、構造遺伝子
の６２４ ｂｐおよびｔｅｔＲ遺伝子の３´−領域を含
有する。ＳｍａＩ切断部位は、クローニング化プロセス
の間に失われた。プラスミドｐＴＥＴ１は、１０．７ｋ
ｂの全体寸法を有し、これは次のものから構成されてい
る：ＥｃｏＲＩ部位と、ＫｐｎＩ部位との間には、Ｃａ
ＭＶ ３５Ｓウィルスの５２６ ｂｐプロモーター断片
が存在し（Covey and Hull （１９８５）Advance in C
auliflower Mosaic Virus Research, Oxford Surveys o
f Plant Molecular and Cell Biology，２，３３９〜３
４６）；ＫｐｎＩ部位と、ＢａｍＨＩ部位との間には、
ｔｅｔＲ遺伝子の６９５ ｂｐ断片が存在し；ＢａｍＨ
Ｉ部位と、ＳｐｈＩ部位との間には、上記の切断部位を
有するポリリンカー配列が存在し；ＳｐｈＩ部位と、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位との間には、オクトピンシンターゼ遺
伝子の１８０ ｂｐポリアデニル化信号が存在する。前
記プラスミドが植物ゲノム中に組込まれた場合には、直
ちにこのプラスミドの一部は、全組織中のｔｅｔリプレ
ッサ−蛋白質の合成をもたらす。ＥｃｏＲＩ部位および
ＨｉｎｄＩＩＩ部位の外側の配列は、ベクターＢＩＮ１
９の配列である。前記外側の配列は、エシェリキア・コ
リ（Escherichia coli）およびアグロバクテリウム・ト
ゥメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の場
合のプラスミドの複製および選択、ならびに植物中への
Ｔ−ＤＮＡの転移およびカナマイシン上での形質転換さ
れた植物細胞を選択するためのポテンシャルのための全
機能を有する。耐性は、ｎｐｔＩＩ遺伝子によって与え
られる。前記プラスミドをアグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンス中に入れて形質転換した。次に、タバコ植
物中へのＤＮＡ転移をタバコ植物からの葉の小片を用い
てアグロバクテリアの共培養によって実施した。選択を
カナマイシン上で実施した。無菌の稔性の植物を形質転
換した細胞から再生した。
【００６９】独立に形質転換した植物をノーザンブロッ
ト分析法によってｔｅｔリプレッサ−に対するｍＲＮＡ
の合成について試験した。
ト分析法によってｔｅｔリプレッサ−に対するｍＲＮＡ
の合成について試験した。
【００７０】既に知られているように、独立の形質転換
した植物中のｍＲＮＡの量は、著しく変動する（Sander
s他， Nucl. Acids Res. （１９８７），１５，１５４
３〜１５５８）。合成されたｍＲＮＡの最高の週率を有
する植物を全ての他の分析のために使用した。
した植物中のｍＲＮＡの量は、著しく変動する（Sander
s他， Nucl. Acids Res. （１９８７），１５，１５４
３〜１５５８）。合成されたｍＲＮＡの最高の週率を有
する植物を全ての他の分析のために使用した。
【００７１】前記植物中の機能的ｔｅｔリプレッサ−蛋
白質の量を定量化するために、ゲル遅延分析をフライド
（Fried）およびクローサーズ（Crothers）（Nucl. Aci
ds Res.（１９８１），９，６５０５〜６５２５）の方
法により実施した（図２、参照）前記方法は、蛋白質Ｄ
ＮＡ複合体が非結合ＤＮＡの場合（図２中のバンドＦ参
照）よりもポリアクリルアミドゲル５％上での電気泳動
の間にいっそう遅速になる（図２中のバンドＲ参照）と
いう事実を利用している。ｔｅｔリプレッサ−の合成の
ための転写を合成する、１つの植物の葉からの粗製抽出
液の蛋白質１〜８μｇを、精製された「３２Ｐ−末端標
識化されたオペレーター断片６ｆモルと一緒にインキュ
ベートし、かつあポリアクリルアミドゲル５％上で電気
泳動を行なった。図２に示したように、位置５〜１０中
の断片の移動度を位置２〜４の場合と同程度に遅延さ
せ、この場合にはＥ．コリから精製されたリプレッサ−
蛋白質を結合反応に使用した。この蛋白質は、オーエミ
ッヘン（Ohemichen）他（EMBO J. （１９８４），３，
５３９〜５４３）による精製法により得られた。前記位
置は、植物抽出液中で生じるオペレーター結合蛋白質が
ｔｅｔリプレッサ−と同じ電気泳動移動度を有するとい
うことを示すための対照として役立つ。従って、ｔｅｔ
Ｒ転写を含有する植物は、機能的ｔｅｔリプレッサ−を
合成するものと推測することができる。形質転換されて
いないタバコ植物からの抽出液を用いた場合には、遅延
は全く観察されなかった。結合反応の場合のオペレータ
ー断片の濃度は、０．２５×１０-9Ｍである。本明細書
中で使用される塩溶液条件下（塩化ナトリウム５０ｍ
Ｍ、塩化マグネシウム１０ｍＭ）でオペレーターＤＮＡ
に対するリプレッサ−の結合定数は、＞０．５×１０
-11Ｍである（Kleinschmidt他，Biochemistry（１９８
８），２７，１０９４〜１１０４）。従って、リプレッ
サ−の量を計算するために、定量的結合は前記条件下で
起こることを推測することができる。それぞれ２４ｋＤ
ａの分子量を有する４個の単量体の結合は、断片の完全
な遅延を生じるので、トラック８に対して、ｔｅｔリプ
レッサ−２４ｆモルの量が蛋白質の全体量の０．０１％
を構成する蛋白質抽出液４μｇ中に含有されることが計
算された。細胞１個当たりのｔｅｔリプレッサ−の数を
確認するために、同じタバコ植物の原形質体を得た。図
２中の位置１５〜２０は、５０００、１００００、２０
０００、４００００および８００００個の原形質体の抽
出液が使用された滴定試験を示す。ＤＮＡ断片２０ｆモ
ルを試験に使用した。約１８ｆモルが位置２０で遅延さ
れ、これは８００００個の原形質体中のリプレッサ−７
２ｆモルを示す。リプレッサ−７２ｆモルは４．５×１
０10のリプレッサ−分子と当量であるので、分析された
植物の場合に細胞１個当たり５０００００個のリプレッ
サ−分子の合成速度が存在するものと推測することがで
きる。
白質の量を定量化するために、ゲル遅延分析をフライド
（Fried）およびクローサーズ（Crothers）（Nucl. Aci
ds Res.（１９８１），９，６５０５〜６５２５）の方
法により実施した（図２、参照）前記方法は、蛋白質Ｄ
ＮＡ複合体が非結合ＤＮＡの場合（図２中のバンドＦ参
照）よりもポリアクリルアミドゲル５％上での電気泳動
の間にいっそう遅速になる（図２中のバンドＲ参照）と
いう事実を利用している。ｔｅｔリプレッサ−の合成の
ための転写を合成する、１つの植物の葉からの粗製抽出
液の蛋白質１〜８μｇを、精製された「３２Ｐ−末端標
識化されたオペレーター断片６ｆモルと一緒にインキュ
ベートし、かつあポリアクリルアミドゲル５％上で電気
泳動を行なった。図２に示したように、位置５〜１０中
の断片の移動度を位置２〜４の場合と同程度に遅延さ
せ、この場合にはＥ．コリから精製されたリプレッサ−
蛋白質を結合反応に使用した。この蛋白質は、オーエミ
ッヘン（Ohemichen）他（EMBO J. （１９８４），３，
５３９〜５４３）による精製法により得られた。前記位
置は、植物抽出液中で生じるオペレーター結合蛋白質が
ｔｅｔリプレッサ−と同じ電気泳動移動度を有するとい
うことを示すための対照として役立つ。従って、ｔｅｔ
Ｒ転写を含有する植物は、機能的ｔｅｔリプレッサ−を
合成するものと推測することができる。形質転換されて
いないタバコ植物からの抽出液を用いた場合には、遅延
は全く観察されなかった。結合反応の場合のオペレータ
ー断片の濃度は、０．２５×１０-9Ｍである。本明細書
中で使用される塩溶液条件下（塩化ナトリウム５０ｍ
Ｍ、塩化マグネシウム１０ｍＭ）でオペレーターＤＮＡ
に対するリプレッサ−の結合定数は、＞０．５×１０
-11Ｍである（Kleinschmidt他，Biochemistry（１９８
８），２７，１０９４〜１１０４）。従って、リプレッ
サ−の量を計算するために、定量的結合は前記条件下で
起こることを推測することができる。それぞれ２４ｋＤ
ａの分子量を有する４個の単量体の結合は、断片の完全
な遅延を生じるので、トラック８に対して、ｔｅｔリプ
レッサ−２４ｆモルの量が蛋白質の全体量の０．０１％
を構成する蛋白質抽出液４μｇ中に含有されることが計
算された。細胞１個当たりのｔｅｔリプレッサ−の数を
確認するために、同じタバコ植物の原形質体を得た。図
２中の位置１５〜２０は、５０００、１００００、２０
０００、４００００および８００００個の原形質体の抽
出液が使用された滴定試験を示す。ＤＮＡ断片２０ｆモ
ルを試験に使用した。約１８ｆモルが位置２０で遅延さ
れ、これは８００００個の原形質体中のリプレッサ−７
２ｆモルを示す。リプレッサ−７２ｆモルは４．５×１
０10のリプレッサ−分子と当量であるので、分析された
植物の場合に細胞１個当たり５０００００個のリプレッ
サ−分子の合成速度が存在するものと推測することがで
きる。
【００７２】例２ プラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４の製造およびｔｅｔリ
プレッサ−を合成するタバコ植物中へのオペレーター含
有ＣａＭＶ ３５Ｓの安定な組込み ｔｅｔリプレッサ−が結合する２個のｔｅｔオペレータ
ー配列を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと組合わせるた
めに、次のクローニング工程を目的とする。ポリメラー
ゼＩＩによって確認される最も多数の他の真核生物プロ
モーターのように、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターはＴ
ＡＴＡボックスを有し、このボックスの付近で一般に転
写ファクターは活性であり、かつ付加的に５´位のエン
ハンサーは、ＣａＭＶ ３５Ｓの場合に植物の全組織中
で強力な構成表現に適応している。オペレーター配列を
ＴＡＴＡボックスの直ぐ近くに位置させ、したがってこ
れとのｔｅｔリプレッサ−結合は、この領域中で活性の
一般の転写ファクターに干渉する。この方法は、新たに
形成されたＤＮＡ配列、即ちＴＡＴＡボックスと組合わ
されたオペレーター配列を、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモー
ターのエンハンサーによって与えられる異なる表現パタ
ーンを与える他のエンハンサーと組合わせることができ
るという利点を有する。
プレッサ−を合成するタバコ植物中へのオペレーター含
有ＣａＭＶ ３５Ｓの安定な組込み ｔｅｔリプレッサ−が結合する２個のｔｅｔオペレータ
ー配列を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと組合わせるた
めに、次のクローニング工程を目的とする。ポリメラー
ゼＩＩによって確認される最も多数の他の真核生物プロ
モーターのように、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターはＴ
ＡＴＡボックスを有し、このボックスの付近で一般に転
写ファクターは活性であり、かつ付加的に５´位のエン
ハンサーは、ＣａＭＶ ３５Ｓの場合に植物の全組織中
で強力な構成表現に適応している。オペレーター配列を
ＴＡＴＡボックスの直ぐ近くに位置させ、したがってこ
れとのｔｅｔリプレッサ−結合は、この領域中で活性の
一般の転写ファクターに干渉する。この方法は、新たに
形成されたＤＮＡ配列、即ちＴＡＴＡボックスと組合わ
されたオペレーター配列を、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモー
ターのエンハンサーによって与えられる異なる表現パタ
ーンを与える他のエンハンサーと組合わせることができ
るという利点を有する。
【００７３】プロモーターの野生型の場合には、付加的
なＤＮＡ断片の挿入のための適当な切断部位は存在しな
いので、一対の塩基−５６〜＋７（＋１は転写出発部位
に相当する）からの配列は、次のように変えられた：既
に記載したクローニング法（Gatz and Quail, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA （１９８８），８５，１３９４〜
１３９７）と同様にして、−５６〜＋７の範囲内のプロ
モーターの野生型の配列を次の一次構造を有する合成Ｄ
ＮＡ断片によって代替した：
なＤＮＡ断片の挿入のための適当な切断部位は存在しな
いので、一対の塩基−５６〜＋７（＋１は転写出発部位
に相当する）からの配列は、次のように変えられた：既
に記載したクローニング法（Gatz and Quail, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA （１９８８），８５，１３９４〜
１３９７）と同様にして、−５６〜＋７の範囲内のプロ
モーターの野生型の配列を次の一次構造を有する合成Ｄ
ＮＡ断片によって代替した：
【００７４】
【化５】 この合成ＤＮＡ断片は、次の切断部位を有する： ＳｐｅＩ： 位置−５３〜−４８からのＡＣＴＡＧＴ ＳｎａｂＩ： 位置−３２〜−２７からのＴＡＣＧＴＡ ＳｔｕＩ： 位置−２２〜−１７からのＡＧＧＣＣＴ ＸＢＡＩ： 位置−１５〜−１０からのＴＣＴＡＧＡ ＸｈｏＩ： 位置＋３〜−３からのＣＴＣＧＡＧ ＢｇｌＩＩ： 位置＋２〜＋７からのＡＧＡＴＣＴ および位置−３１〜−２４からの、プロモーター活性に
とって重要である配列ＴＡＴＡＴＡＡ。
とって重要である配列ＴＡＴＡＴＡＡ。
【００７５】前記クローン化の結果として、ＣａＭＶ
３５Ｓプロモーターは、ＤＮＡ断片を本明細書中に記載
された切断部位中に挿入することができるような程度に
変化された。この変化は、プロモーター活性に影響を及
ぼさなかった。このプロモーターを以下ＣａＭＶ（Ｒｅ
ｓ．）と呼称する。
３５Ｓプロモーターは、ＤＮＡ断片を本明細書中に記載
された切断部位中に挿入することができるような程度に
変化された。この変化は、プロモーター活性に影響を及
ぼさなかった。このプロモーターを以下ＣａＭＶ（Ｒｅ
ｓ．）と呼称する。
【００７６】５５ｂｐ合成配列を、ＳｔｕＩ部位中に挿
入した。この合成ＤＮＡの一次構造は、次の通りであ
る：
入した。この合成ＤＮＡの一次構造は、次の通りであ
る：
【００７７】
【化６】 ＳｔｕＩ部位は、クローン化の間に失われた。
【００７８】クローン化工程後に、位置−５６〜＋６１
からのオペレーター含有ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの
配列は、次の通りである：
からのオペレーター含有ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの
配列は、次の通りである：
【００７９】
【化７】 この配列は、次の構造的特徴を有する： ＳｐｅＩ： 位置４〜９からのＡＣＴＡＧＴ ＳｎａｂＩ： 位置２５〜３０からのＴＡＣＧＴ
Ａ ＴＡＴＡボックス： 位置２９〜３５からのＴＡＴＡＴ
ＡＡ ＢｇｌＩＩ： 位置３８〜４３からのＡＧＡＴＣ
Ｔ ｔｅｔオペレーター：位置４１〜５９からのＴＣＴＣＴ
ＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡ ＨｐａＩ： 位置６２〜６７からのＧＴＴＡＡ
Ｃ ｔｅｔオペレーター：位置７１〜８９からのＡＣＴＣＴ
ＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＧＴ ＸｂａＩ： 位置９７〜１０２からのＴＣＴＡ
ＧＡ ＸｈｏＩ： 位置１０９〜１１４からのＣＴＣ
ＧＡＧ ＢｇｌＩＩ： 位置１１３〜１１８からのＡＧＡ
ＴＣＴ 前記配列を植物エンハンサーと組合わせた結果として、
ｔｅｔリプレッサ−の存在下に植物に読み取られないプ
ロモーターが形成される。しかし、テトラシクリン誘発
物質の存在下で、プロモーターは活性である。
Ａ ＴＡＴＡボックス： 位置２９〜３５からのＴＡＴＡＴ
ＡＡ ＢｇｌＩＩ： 位置３８〜４３からのＡＧＡＴＣ
Ｔ ｔｅｔオペレーター：位置４１〜５９からのＴＣＴＣＴ
ＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡ ＨｐａＩ： 位置６２〜６７からのＧＴＴＡＡ
Ｃ ｔｅｔオペレーター：位置７１〜８９からのＡＣＴＣＴ
ＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＧＴ ＸｂａＩ： 位置９７〜１０２からのＴＣＴＡ
ＧＡ ＸｈｏＩ： 位置１０９〜１１４からのＣＴＣ
ＧＡＧ ＢｇｌＩＩ： 位置１１３〜１１８からのＡＧＡ
ＴＣＴ 前記配列を植物エンハンサーと組合わせた結果として、
ｔｅｔリプレッサ−の存在下に植物に読み取られないプ
ロモーターが形成される。しかし、テトラシクリン誘発
物質の存在下で、プロモーターは活性である。
【００８０】本明細書中で示した例中で、１１８ｂｐ
ＤＮＡ断片は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのエンハ
ンサーとの組合せ物で存在する（クローン化法に関連し
て上記参照）。
ＤＮＡ断片は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのエンハ
ンサーとの組合せ物で存在する（クローン化法に関連し
て上記参照）。
【００８１】野生型ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの一
対の塩基−３９０〜−５６ならびにＸｂａＩ部位を包含
する合成配列（位置９７〜１０２）を含有する、全体で
長さ４７１ｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片の
形でベクターｐＧＵＳ（ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切
断した）中にクローン化した。このベクターｐＧＵＳ
は、細菌のβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）（Jefferso
n他，EMBO J. （１９８７），６，３９０１〜３９０
７）のための構造遺伝子の配列を有し、その前面には、
ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨ
ＩおよびＸｂａＩのための切断部位を有するポリリンカ
ーが位置している。ノパリンシンターゼ遺伝子のポリア
デニル化信号は、３’末端に位置している。このキメラ
遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形で切断
し、かつＢＩＮ１９のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
の間でクローン化した（Bevan, Nucl. Acids Res. （１
９８４）１２，８７１１〜８７２０）。次に、キメラハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をノパ
リンシンターゼプロモーターの制御下にＢＩＮ１９誘導
体のＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化し、したがって
プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する既にカナマ
イシン耐性の植物の場合に形質転換結果を選択すること
ができた。また、ハイグロマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子の代わりに、別の耐性遺伝子を使用するこ
ともでき、この場合唯一の例外は、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子である。組換え体ＤＮＡ ｐ
ＡＴ２ＨｙＳｔｕ４の制限地図は、図３に示されてい
る。この図は、１５ｋｂプラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ
４が次の断片から構成されていることを説明することを
意図したものである：切断部位ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
との間には、ポリリンカーの配列が存在し；ＢａｍＨＩ
とＳｐｅＩとの間には、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター
のエンハンサーならびに配列ＣＣＣを有する３３４ｂｐ
ＤＮＡ断片が存在し；ＳｐｅＩとＸｂａＩとの間に
は、ＴＡＴＡボックスおよび２個のｔｅｔオペレーター
を有する合成オリゴＤＮＡ断片が存在する。
対の塩基−３９０〜−５６ならびにＸｂａＩ部位を包含
する合成配列（位置９７〜１０２）を含有する、全体で
長さ４７１ｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片の
形でベクターｐＧＵＳ（ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切
断した）中にクローン化した。このベクターｐＧＵＳ
は、細菌のβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）（Jefferso
n他，EMBO J. （１９８７），６，３９０１〜３９０
７）のための構造遺伝子の配列を有し、その前面には、
ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨ
ＩおよびＸｂａＩのための切断部位を有するポリリンカ
ーが位置している。ノパリンシンターゼ遺伝子のポリア
デニル化信号は、３’末端に位置している。このキメラ
遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形で切断
し、かつＢＩＮ１９のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
の間でクローン化した（Bevan, Nucl. Acids Res. （１
９８４）１２，８７１１〜８７２０）。次に、キメラハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をノパ
リンシンターゼプロモーターの制御下にＢＩＮ１９誘導
体のＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化し、したがって
プラスミドｐＴＥＴ１のＴ−ＤＮＡを有する既にカナマ
イシン耐性の植物の場合に形質転換結果を選択すること
ができた。また、ハイグロマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子の代わりに、別の耐性遺伝子を使用するこ
ともでき、この場合唯一の例外は、ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子である。組換え体ＤＮＡ ｐ
ＡＴ２ＨｙＳｔｕ４の制限地図は、図３に示されてい
る。この図は、１５ｋｂプラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ
４が次の断片から構成されていることを説明することを
意図したものである：切断部位ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
との間には、ポリリンカーの配列が存在し；ＢａｍＨＩ
とＳｐｅＩとの間には、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター
のエンハンサーならびに配列ＣＣＣを有する３３４ｂｐ
ＤＮＡ断片が存在し；ＳｐｅＩとＸｂａＩとの間に
は、ＴＡＴＡボックスおよび２個のｔｅｔオペレーター
を有する合成オリゴＤＮＡ断片が存在する。
【００８２】９９ｂｐ合成オリゴＤＮＡ断片およびＣＣ
Ｃ配列の塩基配列は、次の通りである：
Ｃ配列の塩基配列は、次の通りである：
【００８３】
【化８】 ＸｂａＩとＳａｃＩとの間には、β−グルクロニダーゼ
の構造遺伝子（１８００ｂｐ）が存在し；ＳａｃＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩとの間には、ネオパリンシンターゼ遺伝子
（２０３ｂｐ）のポリアデニル化信号が存在し；２個の
ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間には、ネオパリンシンターゼプ
ロモーター（１６５０ｂｐ）の制御下でハイグロマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が存在する。Ｅｃｏ
ＲＩ部位および第２のＨｉｎｄＩＩＩ部位の内部の配列
は、β−グルクロニダーゼ合成の為の情報ならびにハイ
グロマイシン耐性を表現するための情報を有する。Ｅｃ
ｏＲＩ部位および第２のＨｉｎｄＩＩＩ部位の外部の配
列は、ベクターびＮ１９の配列である。これらの配列
は、エシェリキア・コリおよびアグロバクテリウム・ト
ゥメファシエンスの場合にプラスミドの複製および選
択、ならびに植物中へのＴ−ＤＮＡの転移およびカナマ
イシン上で形質転換した植物細胞を選択するためのポテ
ンシャルに対する全機能を有する。耐性は、ｎｐｔＩＩ
遺伝子またはｈｐｔＩ遺伝子によって与えられる。
の構造遺伝子（１８００ｂｐ）が存在し；ＳａｃＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩとの間には、ネオパリンシンターゼ遺伝子
（２０３ｂｐ）のポリアデニル化信号が存在し；２個の
ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間には、ネオパリンシンターゼプ
ロモーター（１６５０ｂｐ）の制御下でハイグロマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が存在する。Ｅｃｏ
ＲＩ部位および第２のＨｉｎｄＩＩＩ部位の内部の配列
は、β−グルクロニダーゼ合成の為の情報ならびにハイ
グロマイシン耐性を表現するための情報を有する。Ｅｃ
ｏＲＩ部位および第２のＨｉｎｄＩＩＩ部位の外部の配
列は、ベクターびＮ１９の配列である。これらの配列
は、エシェリキア・コリおよびアグロバクテリウム・ト
ゥメファシエンスの場合にプラスミドの複製および選
択、ならびに植物中へのＴ−ＤＮＡの転移およびカナマ
イシン上で形質転換した植物細胞を選択するためのポテ
ンシャルに対する全機能を有する。耐性は、ｎｐｔＩＩ
遺伝子またはｈｐｔＩ遺伝子によって与えられる。
【００８４】前記プラスミドをアグロバクテリウム・ト
ゥメファシエンス中に形質転換した。次に、タバコ植物
中へのＤＮＡ転移を、アグロバクテリアと、タバコ植物
からの葉の小片との共培養によって実施した。プラスミ
ドｐＴＥＴ１を有し、それ故ｔｅｔリプレッサ−を合成
するタバコ植物を形質転換に使用した。テトラシクリン
の添加に依存するβ−グルクロニダーゼの合成をｔｅｔ
リプレッサ−の存在下でのみ行なう。選択をハイグロマ
イシン上で実施した。無菌の稔性植物を形質転換した細
胞から再生した。
ゥメファシエンス中に形質転換した。次に、タバコ植物
中へのＤＮＡ転移を、アグロバクテリアと、タバコ植物
からの葉の小片との共培養によって実施した。プラスミ
ドｐＴＥＴ１を有し、それ故ｔｅｔリプレッサ−を合成
するタバコ植物を形質転換に使用した。テトラシクリン
の添加に依存するβ−グルクロニダーゼの合成をｔｅｔ
リプレッサ−の存在下でのみ行なう。選択をハイグロマ
イシン上で実施した。無菌の稔性植物を形質転換した細
胞から再生した。
【００８５】例３ ｔｅｔリプレッサ−を合成する形質転換したタバコ植物
の葉におけるｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４からのβ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子のテトラシクリン依存性表現の検出 全細胞の場合にテトラシクリン誘発物質の均質な吸収を
もたらすために、個々の葉にテトラシクリン含有緩衝液
を浸透させることによって抗生物質を細胞間隙中に導入
した。この目的のために、６個の独立の形質転換した植
物の個々の葉を、テトラシクリン１０ｍｇ／ｌを含有す
るクエン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭを有するビーカー
中に入れた。このビーカーをデシケーター中に置き、か
つ真空下に３分間維持した。真空の結果として、空気が
細胞間隙から逃出した。この空気をデシケーターからの
ガス抜きの間に緩衝液によって代替した。浸透後、この
葉をテトラシクリン１０ｍｇ／ｌを有するＭＳ培地上で
１６時間インキュベートした。対照の葉を実際に同じ方
法で処理したが、しかしテトラシクリンは添加しなかっ
た。次に、葉のＲＮＡを得、アガロースゲル１％に添加
し、かつノーザンブロット分析法を行ない、この場合ｇ
ｕｓ ｍＲＮＡの転写は、β−グルクロニダーゼの構造
遺伝子からの放射能標識化された断片を用いてのハイブ
リッド化によって目で見ることができた。図４に示した
ＲＮＡ分析により、β−グルクロニダーゼのために遺伝
子配列を有するｍＲＮＡは、葉がテトラシクリンで前処
理された場合にのみプラスミドｐＴＥＴ１およびｐＡＴ
２ＨｙＳｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する植物中に形成され
ることが証明される。
の葉におけるｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４からのβ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子のテトラシクリン依存性表現の検出 全細胞の場合にテトラシクリン誘発物質の均質な吸収を
もたらすために、個々の葉にテトラシクリン含有緩衝液
を浸透させることによって抗生物質を細胞間隙中に導入
した。この目的のために、６個の独立の形質転換した植
物の個々の葉を、テトラシクリン１０ｍｇ／ｌを含有す
るクエン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭを有するビーカー
中に入れた。このビーカーをデシケーター中に置き、か
つ真空下に３分間維持した。真空の結果として、空気が
細胞間隙から逃出した。この空気をデシケーターからの
ガス抜きの間に緩衝液によって代替した。浸透後、この
葉をテトラシクリン１０ｍｇ／ｌを有するＭＳ培地上で
１６時間インキュベートした。対照の葉を実際に同じ方
法で処理したが、しかしテトラシクリンは添加しなかっ
た。次に、葉のＲＮＡを得、アガロースゲル１％に添加
し、かつノーザンブロット分析法を行ない、この場合ｇ
ｕｓ ｍＲＮＡの転写は、β−グルクロニダーゼの構造
遺伝子からの放射能標識化された断片を用いてのハイブ
リッド化によって目で見ることができた。図４に示した
ＲＮＡ分析により、β−グルクロニダーゼのために遺伝
子配列を有するｍＲＮＡは、葉がテトラシクリンで前処
理された場合にのみプラスミドｐＴＥＴ１およびｐＡＴ
２ＨｙＳｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する植物中に形成され
ることが証明される。
【００８６】誘発に必要とされるテトラシクリンの最小
量を測定するために、プラスミドｐＴＥＴ１およびｐＡ
Ｔ２ＨｙＳｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する植物の葉に種々
の濃度のテトラシクリンを含有するクエン酸ナトリウム
緩衝液５０ｍＭを浸透させた。
量を測定するために、プラスミドｐＴＥＴ１およびｐＡ
Ｔ２ＨｙＳｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する植物の葉に種々
の濃度のテトラシクリンを含有するクエン酸ナトリウム
緩衝液５０ｍＭを浸透させた。
【００８７】葉にクエン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ中
のテトラシクリンをそれぞれ０（対、照）、０．５、
１．０および１０．０ｍｇ／ｌを浸透させ、そのつど等
量のテトラシクリン濃度を有するＭＳ培地上に置いた。
ノーザンブロット分析法により、テトラシクリン０．１
ｍｇ／ｌでさえ最大の誘発に十分であることが示された
（図５、位置２参照）。
のテトラシクリンをそれぞれ０（対、照）、０．５、
１．０および１０．０ｍｇ／ｌを浸透させ、そのつど等
量のテトラシクリン濃度を有するＭＳ培地上に置いた。
ノーザンブロット分析法により、テトラシクリン０．１
ｍｇ／ｌでさえ最大の誘発に十分であることが示された
（図５、位置２参照）。
【００８８】ｇｕｓ ｍＲＮＡ誘発の時間依存性を研究
するために、プラスミドｐＴＥＴ１およびｐＡＴ２Ｈｙ
Ｓｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する植物の葉に、テトラシク
リン１０ｍｇ／ｌを含有するクエン酸ナトリウム緩衝液
５０ｍＭを浸透させ、それぞれ０、０．５、１、３、６
および２２時間ＭＳ培地上に置いた。テトラシクリン１
０ｍｇ／ｌの添加により、ほんの３０分後にｇｕｓ ｍ
ＲＮＡの完全な誘発が生じた（図６、位置２）。
するために、プラスミドｐＴＥＴ１およびｐＡＴ２Ｈｙ
Ｓｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する植物の葉に、テトラシク
リン１０ｍｇ／ｌを含有するクエン酸ナトリウム緩衝液
５０ｍＭを浸透させ、それぞれ０、０．５、１、３、６
および２２時間ＭＳ培地上に置いた。テトラシクリン１
０ｍｇ／ｌの添加により、ほんの３０分後にｇｕｓ ｍ
ＲＮＡの完全な誘発が生じた（図６、位置２）。
【００８９】図５および図６は、同時に、ＲＮＡ試料が
ｔｅｔレプレッサーの遺伝子のためのｍＲＮＡを含有す
ることを示す。ｍＲＮＡは、その表現が構成的に起こる
ので、それぞれの図中で位置１で既に目で見ることがで
きる。
ｔｅｔレプレッサーの遺伝子のためのｍＲＮＡを含有す
ることを示す。ｍＲＮＡは、その表現が構成的に起こる
ので、それぞれの図中で位置１で既に目で見ることがで
きる。
【００９０】任意の望ましい遺伝子は、例２に記載のク
ローン化法によりクローン化することができ、例えば任
意の望ましい遺伝子は、例２に記載の方法でβ−グルク
ロニダーゼ遺伝子に関して置換することができる。アグ
ロバクテリウム・トゥメファシエンス中の形質転換およ
びｔｅｔリプレッサ−を生産することができる植物への
転移の後、望ましい生産物は、テトラシクリンの存在下
でのみ生産することができる。
ローン化法によりクローン化することができ、例えば任
意の望ましい遺伝子は、例２に記載の方法でβ−グルク
ロニダーゼ遺伝子に関して置換することができる。アグ
ロバクテリウム・トゥメファシエンス中の形質転換およ
びｔｅｔリプレッサ−を生産することができる植物への
転移の後、望ましい生産物は、テトラシクリンの存在下
でのみ生産することができる。
【００９１】例５ プラスミドｐＡＴ２Ｈｙトリプル−Ｘの製造 上記の調整系の抑制効率を改善することは、以下のクロ
ーン化工程の目的であった。それぞれコピーそれ自体が
抑制に貢献する場合には、抑制効率がプロモーター内で
オペレーターの数とともに増大することは、リン（Li
n）およびリッグス（Riggs）（Cell ４， １０７〜１
１１，１９７５）によって提案された。それ故、ＴＡＴ
Ａボックスに隣接して３個のオペレーター部位を含有す
る別のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター断片が構成され、
この場合１個のオペレーターは、ＴＡＴＡボックスの５
´に位置し、ＴＡＴＡボックスの２個のオペレーター
は、ＴＡＴＡボックスの３´に位置していた。
ーン化工程の目的であった。それぞれコピーそれ自体が
抑制に貢献する場合には、抑制効率がプロモーター内で
オペレーターの数とともに増大することは、リン（Li
n）およびリッグス（Riggs）（Cell ４， １０７〜１
１１，１９７５）によって提案された。それ故、ＴＡＴ
Ａボックスに隣接して３個のオペレーター部位を含有す
る別のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター断片が構成され、
この場合１個のオペレーターは、ＴＡＴＡボックスの５
´に位置し、ＴＡＴＡボックスの２個のオペレーター
は、ＴＡＴＡボックスの３´に位置していた。
【００９２】このことは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ
ー誘導体ＣａＭＶ ３５Ｓ（Ｒｅｓ．）を含有する、上
記のプラスミド中に８３ｂｐ 合成配列を挿入すること
によって達成された。ＳｐｅｌとＸｈｏｌ（位置は、上
記に記載されている）との間の５６ｂｐ 断片を、次の
配列を含有する８３ｂｐ ＤＮＡ断片によって交換し
ー誘導体ＣａＭＶ ３５Ｓ（Ｒｅｓ．）を含有する、上
記のプラスミド中に８３ｂｐ 合成配列を挿入すること
によって達成された。ＳｐｅｌとＸｈｏｌ（位置は、上
記に記載されている）との間の５６ｂｐ 断片を、次の
配列を含有する８３ｂｐ ＤＮＡ断片によって交換し
【００９３】た：
【化９】 この配列は、次の構造的特徴を有する： ＴＡＴＡボックス： 位置２５〜３１からのＴＡＴＡ
ＴＡＡ ｔｅｔオペレーター１：位置５〜２３からのＡＣＴＣＴ
ＡＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＴ ｔｅｔオペレーター２：位置３３〜５１からの ｔｅｔオペレーター３：位置５３〜７１からの ＨｐａＩ： 位置７１〜７６からのＧＴＴＡ
ＡＣ Ｋｐｎｌ： 位置７７〜８２からのＧＧＴＳ
ＣＣ 生じる変化されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター誘導体
を以下ＣａＭＶ ３５Ｓ（トリプルＸ）と呼称する。
ＴＡＡ ｔｅｔオペレーター１：位置５〜２３からのＡＣＴＣＴ
ＡＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＴ ｔｅｔオペレーター２：位置３３〜５１からの ｔｅｔオペレーター３：位置５３〜７１からの ＨｐａＩ： 位置７１〜７６からのＧＴＴＡ
ＡＣ Ｋｐｎｌ： 位置７７〜８２からのＧＧＴＳ
ＣＣ 生じる変化されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター誘導体
を以下ＣａＭＶ ３５Ｓ（トリプルＸ）と呼称する。
【００９４】ベクターｐＧｕｓ中へのＥｃｏＲＩ／Ｘｂ
ａＩ断片としてのＣａＭＶ ３５ＳトリプルＸプロモー
ターのクローン化、およびその後のリプレッサ−蛋白質
を合成する形質転換した植物中への前記伝子の導入を、
上記のように行なった。
ａＩ断片としてのＣａＭＶ ３５ＳトリプルＸプロモー
ターのクローン化、およびその後のリプレッサ−蛋白質
を合成する形質転換した植物中への前記伝子の導入を、
上記のように行なった。
【００９５】例５ ｔｅｔリプレッサ−を合成する形質転換したタバコ植物
の葉におけるｐＡＴ２ＨｙトリプルＸからのβ−グルク
ロニダーゼ遺伝子のテトラシクリン依存性表現の検出 ｔｅｔリプレッサ−と、β−グルクロニダーゼ遺伝子の
表現を調整するＣａＭＶ ３５Ｓ（トリプルＸ）プロモ
ーターとの合成のための情報をコード化するＤＮＡ配列
を含有する植物をテトラシクリン依存性遺伝子表現に関
して分析した。テトラシクリンは、根を通じて有効に引
取られ、これはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含有す
る３個のオペレーターの制御下に遺伝子の均質な表現を
導く。酵素活性のレベルに対して、誘発物質の不在下で
の活性は、誘発物質の存在下での場合よりも５００分の
１低かった。レポーター遺伝子β−グルクロニダーゼの
遺伝子生産物は、テトラシクリンで処理された植物にお
いてのみ表現された。また、局部的な誘発は、葉上に直
接にテトラシクリンを塗布することによって達成するこ
とができる。このことは、図７に証明されている。
の葉におけるｐＡＴ２ＨｙトリプルＸからのβ−グルク
ロニダーゼ遺伝子のテトラシクリン依存性表現の検出 ｔｅｔリプレッサ−と、β−グルクロニダーゼ遺伝子の
表現を調整するＣａＭＶ ３５Ｓ（トリプルＸ）プロモ
ーターとの合成のための情報をコード化するＤＮＡ配列
を含有する植物をテトラシクリン依存性遺伝子表現に関
して分析した。テトラシクリンは、根を通じて有効に引
取られ、これはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含有す
る３個のオペレーターの制御下に遺伝子の均質な表現を
導く。酵素活性のレベルに対して、誘発物質の不在下で
の活性は、誘発物質の存在下での場合よりも５００分の
１低かった。レポーター遺伝子β−グルクロニダーゼの
遺伝子生産物は、テトラシクリンで処理された植物にお
いてのみ表現された。また、局部的な誘発は、葉上に直
接にテトラシクリンを塗布することによって達成するこ
とができる。このことは、図７に証明されている。
【図１】１０．７ｋｂプラスミドｐＴＥＴ１の制限地
図。
図。
【図２】形質転換されたタバコ植物中の機能的ｔｅｔリ
プレッサーを検査するための電気泳動のオートラジオグ
ラム。
プレッサーを検査するための電気泳動のオートラジオグ
ラム。
【図３】１５ｋｂプラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４の制
限地図。
限地図。
【図４】プラスミドｐＴＥＴ１及びプラスミドｐＡＴ２
ＨｙＳｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する形質転換植物の葉か
らの抽出物中のｇｕｓ遺伝子のテトラサイクリン依存表
現を検査するためのノーザンブロット分析のオートラジ
オグラム。
ＨｙＳｔｕ４のＴ−ＤＮＡを有する形質転換植物の葉か
らの抽出物中のｇｕｓ遺伝子のテトラサイクリン依存表
現を検査するためのノーザンブロット分析のオートラジ
オグラム。
【図５】種々の濃度のテトラサイクリンで浸透後の形質
転換された植物の葉からの抽出物中のテトラサイクリン
誘導と濃度との関係を示すノーザンブロット分析のオー
トラジオグラム。
転換された植物の葉からの抽出物中のテトラサイクリン
誘導と濃度との関係を示すノーザンブロット分析のオー
トラジオグラム。
【図６】形質転換植物の葉からの抽出物中のテトラサイ
クリン誘導と時間との関係を示すノーザンブロット分析
のオートラジオグラム。
クリン誘導と時間との関係を示すノーザンブロット分析
のオートラジオグラム。
【図７】形質転換植物の葉中のｇｕｓ−表現の場所的誘
導を示す、葉の組織を示す写真。
導を示す、葉の組織を示す写真。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年４月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】プラスミドｐＴＥＴ１（ＤＳＭ６２８１） プラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４（ＤＳＭ６２８０） プラスミドｐＡＴ２Ｈｙトリプル−Ｘ（ＤＳＭ６８６
５）（１９７２年１月７日寄託）。
５）（１９７２年１月７日寄託）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８９】図５および図６は、同時に、ＲＮＡ試料が
ｔｅｔリプレッサーの遺伝子のためのｍＲＮＡを含有す
ることを示す。ｍＲＮＡは、その表現が構成的に起こる
ので、それぞれの図中で位置１で既に目で見ることがで
きる。
ｔｅｔリプレッサーの遺伝子のためのｍＲＮＡを含有す
ることを示す。ｍＲＮＡは、その表現が構成的に起こる
ので、それぞれの図中で位置１で既に目で見ることがで
きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10 (72)発明者 クラウス フローベルク ドイツ連邦共和国 ベルリン 45 モルト ケシュトラーセ 31アー (72)発明者 アストリート カイザー ドイツ連邦共和国 ベルリン 45 カデテ ンヴェーク11
Claims (30)
- 【請求項１】 植物中のＤＮＡ配列の表現の時期及び場
所をコントロールするための手段を有するプラスミド。 - 【請求項２】 そのＤＮＡ配列は、異種産物に関してコ
ード化する、請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項３】 コントロール手段は、ＤＮＡ配列の表現
をインデューサーの存在においてのみ有効化するような
ものである、請求項１又は２記載のプラスミド。 - 【請求項４】 コントロール手段は、植物コントロール
配列１個とオペレータ１個以上との機能組み合せより成
る、請求項１から３のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項５】 コントロール手段は、オペレータ配列１
個以上、リプレッサーに関する遺伝子１個以上が挿入さ
れている植物プロモータを有し、この植物プロモータ、
オペレータ及びＤＮＡ配列がこのＤＮＡ配列がリプレッ
サーに関するインデューサーの存在でのみ表現されるよ
うに配置されている、請求項４に記載のプラスミド。 - 【請求項６】 各オペレータ配列は、原核又は真核性オ
リジンを有する、請求項４又は５に記載のプラスミド。 - 【請求項７】 各オペレータは、テトラサイクリン耐性
オペロンの調節エレメントを有する、請求項３から６の
いずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項８】 オペレータは、トランスポゾンＴａ１０
のテトラサイクリン耐性オペロンの調節エレメントを有
する、請求項７に記載のプラスミド。 - 【請求項９】 ２個のオペレータ配列が、植物プロモー
タのＴＡＴＡエレメントの３′に配置されている、請求
項３から８のいずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項１０】 次のもの；ポリリンカー配列、ポリア
デニル化信号及び選択可能なマーカーに関してコード化
するＤＮＡ配列の１以上をも有する、請求項１から９の
いずれかに記載のプラスミド。 - 【請求項１１】 エンハンサーエレメントを有するカリ
フラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータ１個、ＴＡ
ＴＡボックス１個、ｔｅｔオペレータ２個又は３個及び
異種産物に関してコード化するＤＮＡ配列１個を有す
る、請求項９又は１０に記載のプラスミド。 - 【請求項１２】 ポリリンカー配列１個、エンハンサー
エレメントを有する３３４ｂｐカリフラワーモザイクウ
ィルス３５Ｓプロモータフラグメント１個、１個のＴＡ
ＴＡボックス及び２個のｔｅｔオペレータを有する９９
ｂｐオリゴーＤＮＡフラグメント１個、異種産物に関し
てコード化するＤＮＡ配列１個、ノパリンシンターゼ遺
伝子の２０３ｂｐポリアデニル化信号１個及び１６５０
ｂｐハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
１個を有する、請求項１１記載のプラスミド。 - 【請求項１３】 ＴＡＴＡボックス及び２個のｔｅｔオ
ペレータが連結ＣＣＣフラグメントと共に、次の配列： 【化１】 を有する９９ｂｐオリゴＤＮＡフラグメント中に存在す
る、請求項１１又は１２に記載のプラスミド。 - 【請求項１４】 ＴＡＴＡボックス及び３個のオペレー
タが次の配列： 【化２】 を有する８３ｂｐＤＮＡフラグメントと共に存在する、
請求項１１に記載のプラスミド。 - 【請求項１５】 プラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４(Ｄ
ＳＭ６２８０)。 - 【請求項１６】 プラスミドｐＡＴ２ＨｙＴｒｉｐｌｅ
−Ｘ(ＤＳＭ)。 - 【請求項１７】 ５２６ｂｐカリフラワーモザイクウィ
ルス３５Ｓプロモータフラグメント１個、６９５ｂｐ
ｔｅｔリプレッサーフラグメント１個及びオクトピンシ
ンターゼ遺伝子の１８０ｂｐポリアデニル化信号１個を
有する、プラスミド。 - 【請求項１８】 プラスミドｐＴＥＴ１（ＤＳＭ６２８
１）。 - 【請求項１９】 ＤＮＡ配列の表現の時期及び場所をコ
ントロールする手段を有する、植物。 - 【請求項２０】 そのＤＮＡ配列は、異種産物に関して
コード化する、請求項１９に記載の植物。 - 【請求項２１】 コントロール手段は、請求項３から１
０のいずれかに記載のものを有するか又は請求項１１か
ら１３のいずれかに記載のコントロールエレメントを有
する、請求項１９又は２０に記載の植物。 - 【請求項２２】 請求項１から１５のいずれかに記載の
プラスミドを有する、請求項１９から２１のいずれかに
記載の植物。 - 【請求項２３】 存在オペレータに関するリプレッサー
に関してコード化するＤＮＡ配列をも有する、請求項１
９から２２のいずれかに記載の植物。 - 【請求項２４】 オペレータはｔｅｔオペレータであ
り、リプレッサーはｔｅｔリプレッサー蛋白質である、
請求項１９から２３のいずれかに記載の植物。 - 【請求項２５】 請求項１７又は１８に記載のプラスミ
ドを有する、請求項２４に記載の植物。 - 【請求項２６】 プラスミドｐＴＥＴ１（ＤＳＭ６２８
１）、プラスミドｐＡＴ２ＨｙＳｔｕ４（ＤＳＭ６２８
０）又はプラスミドｐＡＴ２ＨｙＴｒｉｐｌｅ−Ｘ（Ｄ
ＳＭ）を有する、植物。 - 【請求項２７】 タバコ植物である、請求項１９から２
６のいずれかに記載の植物。 - 【請求項２８】 請求項１から１４のいずれかに記載の
プラスミドを使用する、特異的ＤＮＡ配列の表現の時期
及び場所をコントロールできる植物の製造。 - 【請求項２９】 請求項１から１４のいずれかに記載の
プラスミド及び相応するリプレッサーに関してコード化
するプラスミドを使用する、特異的ＤＮＡ配列の表現の
時期及び場所をコントロールできる植物の製造。 - 【請求項３０】 プラスミドｐＴＥＴ１、ｐＡＴ２Ｈｙ
Ｓｔｕ４及びｐＡＴ２ＨｙＴｒｉｐｌｅ−Ｘを使用す
る、特異的ＤＮＡ配列の表現の時期及び場所をコントロ
ールできる植物の製造。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4100594.5 | 1991-01-08 | ||
| DE4100594A DE4100594A1 (de) | 1991-01-08 | 1991-01-08 | Neue plasmide zur zeitlichen und oertlichen kontrollierten expression eines heterologen produktes in pflanzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06339384A true JPH06339384A (ja) | 1994-12-13 |
Family
ID=6422810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4018239A Pending JPH06339384A (ja) | 1991-01-08 | 1992-01-07 | プラスミド、植物及び植物の製造法 |
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| JP (1) | JPH06339384A (ja) |
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| CA (1) | CA2058900A1 (ja) |
| DE (1) | DE4100594A1 (ja) |
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| IE (1) | IE920047A1 (ja) |
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| US5789156A (en) * | 1993-06-14 | 1998-08-04 | Basf Ag | Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors |
| US5859310A (en) | 1993-06-14 | 1999-01-12 | Basf Aktiengesellschaft | Mice transgenic for a tetracycline-controlled transcriptional activator |
| US5814618A (en) * | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
| US5888981A (en) * | 1993-06-14 | 1999-03-30 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
| JPH09500526A (ja) * | 1993-06-14 | 1997-01-21 | ベーアーエスエフ アクツィエンゲゼルシャフト | テトラサイクリン反応性プロモーターによる真核細胞の遺伝子発現の厳密な制御 |
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| US5866755A (en) * | 1993-06-14 | 1999-02-02 | Basf Aktiengellschaft | Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor |
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| RU2002106730A (ru) * | 2000-06-15 | 2004-03-10 | Канека Корпорейшн (Jp) | Способ индуцирования экспрессии гена в растениях и растение, обработанное по этому способу |
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-
1992
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- 1992-01-07 JP JP4018239A patent/JPH06339384A/ja active Pending
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