DE69535251T2 - Wirksames und schnelles Regenerieren von transgenischen Pflanzen - Google Patents

Wirksames und schnelles Regenerieren von transgenischen Pflanzen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft gentechnisch veränderte Pflanzen. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zum Regenieren von Pflanzenzellen, welche transformiert worden sind.
  • HINTERGRUND
  • Während des vergangenen Jahrzehnts ist es möglich geworden, Gene aus einer großen Vielzahl von Organismen in Feldfrüchtepflanzen durch rekombinante DNA-Technologie zu überführen. Dieser Fortschritt hat enorme Möglichkeiten zur Verbesserung der Pflanzenresistenz gegen Schädlinge, Krankheiten und Herbizide sowie zum Modifizieren von biosynthetischen Verfahren zur Änderung der Qualität von Pflanzenprodukten eröffnet (Knutson et al., PNAS, USA 89, 2624–2628 (1992); Piorier et al., Science, 256, 520–523, (1992); Vasil et al., Bio/Technology, 10, 667–674 (1992)). Allerdings ist die Verfügbarkeit eines effizienten Transformationsverfahrens zum Einführen von Fremd-DNA ein wesentliches Hindernis für die meisten einkeimblättrigen Spezies, einschließlich Mais, Reis, Hafer, Gerste und insbesondere Weizen.
  • Zwei alternative Transformationsverfahren werden derzeitig für einkeimblättrige Spezies verwendet: direkter DNA-Transfer in isolierte Protoplasten und Mikroprojektil-vermittelte DNA-Zuführung (Shimamoto et al., Nature, 338, 274–276 (1989); Fromm et al., Bio/Technology, 8, 833–839 (1990)).
  • Die Protoplastenverfahren sind in breitem Umfang bei Reis angewandt worden, wobei DNA den Protoplasten durch Liposomen, PEG und Elektroporation zugeführt wird. Obgleich eine große Anzahl transgener Pflanzen in mehreren Laboratorien gewonnen worden ist (Shimamoto et al., (1989); Datta et al., Bio/Technology, 8, 736–740 (1990)), erfordern die Protoplastenverfahren die Einrichtung von langfristigen embryogenen Suspensionskulturen. Manche Regeneranten aus Protoplasten sind unfruchtbar und phänotypisch abnormal aufgrund der langfristigen Suspensionskultur (Davey et al., J. of Exp. Botany, 42, 1129–1169 (1991); Rhodes et al., Science, 240, 204–207 (1988)).
  • Das Mikroprojektil-vermittelte DNA-Zuführungsverfahren kann unreife Embryonen oder unreife embryo-abgeleitete Calli als Zielgewebe verwenden. Transgene Pflanzen sind aus dem Mikroprojektil-Beschussverfahren in Mais, Hafer, Gerste und Weizen gewonnen worden (Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2, 603–618 (1990); Somers et al., Bio/Technology, 10, 1589–1594 (1992); Wan et al., Plant Physiol., 104, 37–48 (1994); Vasil et al. (1992)).
  • Das Mikroprojektil-Beschussverfahren braucht im Allgemeinen 10 bis 15 Monate, damit man transgene Pflanzen erhält (Gordon-Kamm et al., (1990); Vasil et al. (1992)). Selbst mit den jüngeren Verbesserungen bei Transformationsverfahren unter Verwendung von unreifen Embryonen als Zielgeweben, benötigt es immer noch 4 bis 6 Monate, um transgene Pflanzen zu gewinnen (Weeks et al., Plant Physiol., 102, 1077–1084 (1993); Vasil et al. (1992); Vasil et al., Bio/Technology, 11, 1153–1158 (1993); Becker et al., Plant J., 5, 299–307 (1994)). Darüber hinaus leiden diese Verfahren häufig unter einem Verlust an Fruchtbarkeit in den gewonnenen Pflanzen (Vasil et al. (1993); Becker et al. (1994)). Weiterhin ist die Transformationsfrequenz bzw. -häufigkeit durch diese Verfahren, mit etwa einem Ereignis aus jeden tausend beschossenen Embryonen, sehr niedrig. Diese Transformationseffizienz ist für genetische Untersuchungen und für kommerzielle Anwendungen zu niedrig.
  • Daher besteht ein Bedarf nicht nur für schnellere Verfahren zum Regenerieren von transformierten Pflanzengewebe, sondern es besteht auch ein Bedarf nach einem Verfahren, welches die Fruchtbarkeit in den resultierenden Pflanzen aufrechterhält und eine höhere Transformationseffizienz erzeugt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein schnelles und effizientes Transformations- und Regenerationssystem vor. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich bei der Transformation und Regeneration von Weizenpflanzen. Pflanzen, welche aus diesem System regeneriert werden, sind phänotypisch normal und vollständig fruchtbar. Die Transgene werden auf Mendelsche Weise an die R1-Nachkommenschaft weitergegeben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein rasches und effizientes Regenerationssystem für die Transformation von einkeimblättrigen Getreidepflanzen unter Verwendung von proliferierten unreifen Embryonen als Zielgeweben bereit. Das neue System braucht weniger als zwei Monate, um transgene Pflanzen zu erhalten. Die Transformationsfrequenzen bei dem neuen System sind 5- bis 100-fach höher als bei den derzeit in anderen Laboratorien angewandten Verfahren. Dieses neue System kann mit einer Vielzahl von selektierbaren Marker-Systemen, einschließlich Selektion unter Verwendung von Herbiziden wie Glyphosat und Bialaphos, sowie Antibiotika, wie Kanamycin, verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zum Regenerieren einer transformierten einkeimblättrigen Pflanze, so dass sie Fremd-DNA enthält, vor, umfassend die Schritte:
    • a) Isolieren von regenerierbarem Gewebe aus der Pflanze;
    • b) Einfügen der Fremd-DNA in das regenerierbare Gewebe, wobei die Fremd-DNA eine selektierbare DNA-Sequenz umfasst, wobei die Sequenz in einem regenerierbaren Gewebe als ein Selektionsmarker fungieren kann, und Halten des regenerierbaren Gewebes während eines Tages auf einem Medium, das keine Selektionsverbindung enthält;
    • c) Platzieren des regenerierbaren Gewebes aus Schritt b) in einem Medium, das Triebe aus dem Gewebe erzeugen kann, wobei das Medium weiterhin eine Verbindung enthält, die verwendet wird, um regenerierbares Gewebe, das die selektierbaren DNA-Sequenzen enthält, zu selektieren; und
    • d) nachdem sich wenigstens ein Trieb aus Schritt c) gebildet hat, Überführen des Triebs auf ein zweites Medium, das Wurzeln aus dem Trieb erzeugen kann.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung kann mit jedweder Pflanzenspezies angewandt werden. Sie ist besonders nützlich für einkeimblättrige Spezies. Im Genaueren, ist sie nützlich in Pflanzenspezies, welche nicht während langer Zeitdauern in einem Callus-Zustand bleiben können, ohne das Vermögen zur Regeneration zu verlieren. Eine besonders nützliche Spezies in der vorliegenden Erfindung ist Weizen.
  • Die vorliegende Erfindung besitzt, wenn sie auf Weizen angewandt wird, den Vorteil, Genotyp-unabhängig zu sein. Das heißt, sie kann mit jedwedem Typ von Weizen-Varietät verwendet werden, wobei sowohl Winter- als auch Sommerweizen eingeschlossen sind. Sie kann verwendet werden, um transgene Weizenpflanzen aus Sommer-Kultivaren, wie beispielsweise Bobwhite und Marshall, sowie Winter-Kultivaren, wie beispielsweise Neeley, zu produzieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird verwendet, um Fremd-DNA in regenerierbares Pflanzengewebe einzuführen. Jeglicher Typ von Fremd-DNA kann in die Pflanzenspezies unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung inseriert werden. Im Allgemeinen kann "Fremd-DNA" so definiert werden, dass jedweder Typ von DNA eingeschlossen ist, welcher in eine Pflanzenzelle von dem Äußeren der Pflanzenzelle her eingeführt wird. Verfahren zum Inserieren von DNA in Pflanzenzellen sind im Allgemeinen gut bekannt, wie etwa ein Beschuss unter Anwendung einer Vorrichtung, welche im U.S.-Patent Nr. 5 179 022 beschrieben wird.
  • Der Typ von DNA, der in der Fremd-DNA eingeschlossen ist, kann DNA, welche bereits in der Pflanzenzelle vorhanden ist, DNA aus einer anderen Pflanze, DNA aus einem unterschiedlichen Organismus, oder eine extern erzeugte DNA, wie eine DNA-Sequenz, die eine Antisense-Botschaft eines Pflanzengens enthält, oder eine DNA-Sequenz, die eine synthetische Version eines Gens codiert, bei der die Nukleotidsequenz modifiziert worden ist, einschließen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Fremd-DNA eine DNA-Sequenz, welche in einem regenerierbaren Pflanzengewebe als ein selektierbarer Marker wirken kann. Eine derartige DNA kann ein Gen einschließen, welches in einem regenerierbaren Pflanzengewebe so fungieren würde, eine Verbindung zu produzieren, welche dem Pflanzengewebe Resistenz gegen eine ansonsten toxische Verbindung verleihen würde. Diese Gene sind im Fachgebiet gut bekannt und können Resistenz gegen Verbindungen, wie Antibiotika, wie Kanamycin (Dekeyser et al., Plant Physiol., 90, 217–223 (1989)) und Herbizide, wie Glyphosat (Della-Cioppa et al., Bio/Technology, 5, 579–584 (1987)) und Bialaphos (Vasil et al. (1992)) verleihen. Andere selektierbare Marker können innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Der erste Schritt in der vorliegenden Erfindung besteht darin, regenerierbares Gewebe aus einer Pflanze zu isolieren. Jedwedes regenerierbare Pflanzengewebe kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Regenerierbares Pflanzengewebe bezieht sich im Allgemeinen auf Gewebe, welches nach Insertion von Fremd-DNA zu einer differenzierten Pflanze regeneriert werden kann. Zum Beispiel können derartige Gewebe Calli und/oder Embryoide aus Antheren bzw. Staubbeuteln (Zhou und Konzak, Crop Sci., 29, 817–821 (1989)), Mikrosporen (Ziauddin et al., Plant Cell Rep., 11, 489–493 (1992)), Infloreszenzen (Barcelo et al., Plant Journal, 5, 583–592 (1994)) und Blattgeweben (Conger et al., Plant Cell Reports, 6, 345–347 (1987)) einschließen.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein unreifer Embryo aus einer Pflanze als ein Ausgangsmaterial verwendet. Unreife Embryonen können unter Verwendung von bekannten Verfahren, welche im Fachgebiet beschrieben sind, produziert werden. Zum Beispiel wird die Herstellung von unreifen Weizenembryonen von Weeks et al., (1993) und Vasil et al. (1993) beschrieben.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den regenerierbaren Pflanzengeweben um Calli. Die bevorzugten Calli sind embryogene Calli. Embryogene Calli werden aus unreifen Embryonen hergestellt. Diese Calli können durch Isolieren und Kultivieren von unreifen Embryonen auf einem Nährstoffmedium mit Kohlenhydrat und Pflanzenwachstumsregulatoren produziert werden. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, wenn embryogene Calli aus Weizen produziert werden, die Eliminierung der Embryo-Achse, wie beschrieben von Nehra et al., Plant J., 5, 285–297 (1994), nicht notwendig.
  • Callus produzierende Medien sind im Fachgebiet gut bekannt, und jedwedes Kulturmedium oder Präparationsverfahren kann verwendet werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird, wenn Weizen-Calli hergestellt werden, ein unreifer Weizenembryo 1 Tag bis zu einem Monat lang, vorzugsweise 4 bis 7 Tage lang, auf einem modifizierten MS-Medium kultiviert, welches 40 g/l Maltose und 2 mg/l 2,4-D umfasst. In einer anderen Ausführungsform kann das 2,4-D ersetzt werden durch eine Kombination von 0,5 mg/l 2,4-D und 2,2 mg/l Picloram. Das Medium wird durch 2 g/l GELRITE® oder 4 g/l niedrigschmelzende Agarose verfestigt.
  • Sobald das regenerierbare Pflanzengewebe isoliert ist, besteht der zweite Schritt des Verfahrens in der Einbringung der Fremd-DNA in das Pflanzengewebe. Dieses Verfahren wird hierin auch als "Transformation" bezeichnet. Jedwedes Verfahren kann angewandt werden, um die Fremd-DNA in das regenerierbare Pflanzengewebe einzuführen. Derartige Verfahren schließen Beschuss (Weeks et al. (1993); Vasil et al. (1992)), Agrobacterium-Transformation (Chan et al., Plant Molecular Biology, 22, 491–506 (1993)), Elektroporation von regenerierbaren Geweben (Shillito et al., Bio-Technology, 3, 1099–1103 (1985)) und Protoplasten-erleichterte Gen-Zuführung (Shimamoto et al. (1989); Datta et al. (1990)) ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das regenerierbare Gewebe unter Anwendung des Beschuss-Verfahrens transformiert. In dieser Ausführungsform wird es ebenfalls bevorzugt, dass ein Callusgewebe, am stärksten bevorzugt ein embryogener Callus, verwendet wird. Nach dem Beschuss kann dieser Callus während einer kurzen Zeitdauer vor der Regeneration oder Selektion wachsen gelassen werden, oder kann, gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, unverzüglich sowohl Regenerations- als auch Selektionsbedingungen unterzogen werden. Mit anderen Transformationsverfahren kann diese Zeitdauer wünschenswert sein, oder nicht, abhängig von der angewandten Selektionsmethode.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird das regenerierbare Gewebe während einer kurzen Zeitdauer nach dem Beschuss wachsen gelassen. Das für diese Wachstumsperiode verwendete Medium enthält vorzugsweise keinerlei Selektionseinrichtung oder Medium, das zur Herstellung von Trieben in der Lage ist. Die Anwendung einer Wachstumsperiode hängt von der verwendeten Selektionseinrichtung ab. Einige Selektionseinrichtungen nutzen die Verwendung von größerem oder älterem Callusgewebe, bevor eine Selektion ausgeübt wird. Diese Wachstumsdauer beläuft sich auf etwa 1 Tag.
  • Nach der Transformation wird das regenerierbare Pflanzengewebe in einem Medium, das zur Herstellung von Trieben aus dem regenerierbaren Gewebe in der Lage ist, platziert, wobei das Medium ferner eine Verbindung enthält, die zum Selektieren von regenerierbarem Gewebe, welches die selektierbaren DNA-Sequenzen enthalten, verwendet wird. Dies steht im Gegensatz zum Stand der Technik, worin regenerierbares Pflanzengewebe im Allgemeinen zuerst einer ausgedehnten Selektionsperiode vor Exposition des regenerierbaren Gewebes an ein zur Erzeugung von Trieben fähiges Medium unterzogen wird.
  • Das in diesem Schritt verwendete Medium kann jedwedes Medium sein, welches die Bildung von Trieben aus dem regenerierbaren Gewebe erlaubt. In einer Ausführungsform wird eine Triebe erzeugende Verbindung dem Medium zuge setzt. Diese Triebe erzeugenden Verbindungen sind im Fachgebiet gut bekannt (Murashige und Skoog, Physiol. Plant, 15, 473–497 (1962); Kasha et al., Gene Manipulation in Plant Improvement II, 213–239 (1990)). Solche Verbindungen schließen schwache Pflanzenwachstumsregulatoren ein und schließen IAA, IBA und BA bei niedrigen Konzentrationen ein (Becker et al. (1994); Vasil et al. (1992)). In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein von einem Pflanzenwachstumsregulator freies Medium verwendet werden, um die Triebbildung zu induzieren (Weeks et al. (1993)).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, worin ein embryogener Weizen-Callus regeneriert werden soll, umfasst das Medium ein modifiziertes MS-Medium mit 0,2 mg/l 2,4-D (Murashige und Skoog (1962); Wan und Lemaux (1994)).
  • Das regenerierbare Pflanzengewebe wird in der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen in diesem Medium so rasch wie möglich nach der Transformation platziert. Dies kann im Allgemeinen im Bereich von 1 Tag bis drei Wochen, aber bevorzugt von 1 Tag bis zwei Wochen erfolgen. Am stärksten bevorzugt wird das Gewebe auf dieses Medium eine Woche bis zwei Wochen nach der Transformation überführt. In den meisten Fällen wird die Überführung zwischen 5 und 11 Tagen stattfinden.
  • Die zum Selektieren von regenerierbarem Gewebe, das die selektierbaren DNA-Sequenzen umfasst, verwendete Verbindung kann jedwede einer Vielzahl von gut bekannten Selektionsverbindungen, wie Antibiotika und Herbiziden, sein. Bevorzugte Verbindungen können Kanamycin (Dekeyser et al. (1989)), Glyphosat (Della-Coppa et al. (1987)) und Bialaphos (Vasil et al. (1992); Weeks et al. (1993)) einschließen.
  • Die Verfügbarkeit von alternativen Selektionsmitteln ist eine wichtige Anforderung für die kommerzielle Anwendung von Landwirtschafts-Biotechnologie. Die Verwendung von Kanamycin ist für Getreidenutzpflanzen wegen des hohen endogenen Niveaus an Toleranz weniger erfolgreich gewesen (Dekeyser et al. (1989)). Bialaphos ist im breiten Umfang als ein Selektionsmittel in der Getrei denutzpflanzen-Transformation verwendet worden (Weeks et al. (1993); Vasil et al. (1993); Becker et al. (1994); Nehra et al. (1994); Wan und Lemaux (1993)). Allerdings könnte es potenziell ein Desaster sein, ausschließlich Bialaphos-Resistenz codierende Gene als einen selektierbaren Marker in allen Transformationsexperimenten zu verwenden. Andere selektierbare Marker werden benötigt, und unsere Ergebnisse zeigen, dass das hierin beschriebene rasche Regenerations-System gut mit verschiedenen Selektionsmitteln arbeitet.
  • Nachdem Triebe gebildet worden sind, werden die Triebe auf ein zweites Medium überführt, das fähig zur Erzeugung von Wurzeln aus den Trieben ist. Dieses Medium kann ferner eine Verbindung enthalten, die verwendet wird, um regenerierbares Gewebe, das die selektierbaren DNA-Sequenzen enthält, zu selektieren. Das Überführen auf dieses Medium findet statt, wenn sich ausreichend Triebe entwickelt haben, wie es allgemein im Fachgebiet bekannt ist. Dies findet für Weizen innerhalb von 25 bis 40 Tagen nach der Transformation statt.
  • Das zur Erzeugung von Wurzeln fähige Medium kann jedwedes wurzelerzeugende Medium sein. Diese Medien sind im Fachgebiet gut bekannt (Weeks et al. (1993); Vasil et al. (1992)). Ein bevorzugtes wurzelerzeugendes Medium ist ein modifiziertes MS-Medium ohne irgendeinen Pflanzenwachstumsregulator (Murashige und Skoog (1962); Zhou et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture, 30, 78–83, (1992)).
  • Sobald sich Wurzeln gebildet haben, können die Pflanzen dann in Erdboden überführt und unter Befolgung von im Fachgebiet bekannten Verfahren wachsen gelassen werden, um Samen zu produzieren.
  • Ein Vorteil des oben beschriebenen Transformations- und Regenerationsverfahrens ist, dass aus diesem Verfahren erhaltene Pflanzen im Allgemeinen fruchtbar sind. Der Verlust der Fruchtbarkeit bei transgenen Pflanzen unter Anwendung von Verfahren des Stands der Technik ist angenommenermaßen auf die Langfrist-Kulturen vor und nach den Transformationsbehandlungen zurückzuführen und nicht auf den Vorgang der Transformation per se.
  • Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die derzeitigen Biolistik-Beschussverfahren 4 bis 6 Monate erfordern, um transgene Pflanzen zu erhalten (Becker et al. (1994); Vasil et al. (1992), (1993); Weeks et al. (1993)). Die beschossenen regenerierbaren Gewebe von diesen Verfahren des Stands der Technik wurden auf Selektionsmedien während 2 bis 3 Monaten oder länger subkultiviert, um eine Callus-Proliferation zu gestatten. Durch Verringern der Zeit der Callus-Proliferations-Kultur erfordert das hier beschriebene rasche Regenerationsverfahren weniger als 2 Monate, um transgene Pflanzen zu erhalten.
  • Die Anwendung des vorliegenden Verfahrens verursachte auch, dass transformierte Gewebe sich viel schneller regenerieren. Die Regeneranten waren auch kräftiger und gesünder, sowohl in Kultur als auch in Erdboden.
  • Das hierin beschriebene rasche Regenerationssystem erzeugt des weiteren üblicherweise gleichmäßige, nicht-chimäre Transformanten. Bei dem raschen Regenerationsverfahren sind embryogene Callus-Sektoren beim Stadium der Regeneration üblicherweise klein. Deshalb wird nur ein einziger Trieb aus jedem Callus-Sektor regeneriert. Die histochemische Analyse hinsichtlich stabiler GUS-Aktivität zeigte, dass Blattsegmente aus unterschiedlichen Teilen der transgenen Pflanzen im Allgemeinen bezüglich der GUS-Expression gleichförmig waren. Eine Nachkommenschafts-Analyse zeigt auch, dass die meisten der transgenen Pflanzen bei 3:1-Verhältnissen zwischen toleranten und sensitiven Pflanzen, wie ein einzelnes dominantes Gen, segregierten.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben spezifische Ausführungsformen der Erfindung. Die verwendeten Medien werden in der Tabelle 9 beschrieben. Die Beispiele sind angegeben, um die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung besser aufzuklären und sollten nicht in irgendeiner Weise interpretiert werden, um den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
  • BEISPIEL 1: Transformation unter Verwendung von CP4 und GOX als selektierbare Marker
    • 1. Unreife Embryo-Kultur Ein Sommerweizen Triticum aestivum cv. Bobwhite wurde durchweg in dieser Studie verwendet. Vorrats-Pflanzen wurden in einer umweltmäßig regulierten Wachstumskammer bei einer Lichtdauer von 16 h bei 800 μmol m–2s–1, vorgesehen durch Hochintensitäts-Entladungs(HID)-Sylvania-Leuchten (GTE Products Corp., Manchester, NH. 03103) wachsen gelassen. Die Tages/Nacht-Temperaturen beliefen sich auf 18/16°C. Unreife Caryopsen wurden von den Pflanzen 14 Tage nach der Anthese abgesammelt. Unreife Embryonen ("UE") wurden zerschnitten und auf einem modifizierten MS-Medium (Murashige und Skoog-Salze, Gibco BRL) kultiviert, das mit 40 g/l Maltose, 0,5 mg/l 2,4-D und 2,2 mg/l Picloram ergänzt war (CM4). Die unreifen Embryonen wurden bei 26°C im Dunklen kultiviert.
    • 2. DNA-Zuführung Fünf Tage nach dem Beginn der Kultur wurden unreife Embryonen in ein Osmoticum-Behandlungsmedium 4 h vor dem Beschuss überführt. Das Osmoticum-Medium war das gleiche CM4 mit 0,35 M Mannitol. Dreißig bis 40 Embryonen wurden in die Mitte von jeder Platte platziert, und die Embryonen wurden mit einer Mischung von pMON19305 und pMON19328 bei einem Verhältnis von 1:1 beschossen. pMON19305 enthält das uidA-Gen, wohingegen pMCN19328 die CP4- und GOX-Glyphosattoleranz-Gene trägt. CP4 ist ein Gen für bakterielle 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), welches ein Enzym exprimiert, das gegenüber Glyphosat in hohem Maße resistent ist. Die Glyphosatoxidoreduktase (GOX) ist ein bakterielles Gen, welches Glyphosat zu Aminomethylphosphonsäure abbaut. Alle Gene wurde von dem Mais-Ubiquitin-Ubi1-Promotor (Christensen et al. (1992)) angetrieben. Jede Platte wurde zweimal mit einer PDS 1000-Pulverkanone beschossen. Hohe Niveaus an transienter GUS-Expression wurden für jeden Beschuss in jedem Experiment beobachtet, was anzeigt, dass das DNA-Zuführungsverfahren sehr effizient war.
    • 3. Regeneration von Glyphosat-toleranten Pflanzen Nach einer 16-h-Nachbeschuss-Behandlung auf dem 0,35 M Mannitol-Medium wurden die beschossenen Embryonen für eine einwöchige Verzögerung der Selektion auf CM4-Medium (Tabelle 1) überführt. Bei diesem Schritt wurden zwei Embryonen von jeder beschossenen Platte für transiente GUS-Assays als Proben entnommen. Nach einer Verzögerung von einer oder zwei Wochen wurden die Embryonen auf ein CM4-Medium, welches 4 mM Glyphosat enthielt, überführt. Nach einer bis zwei Wochen Callus-Proliferations-Kultur auf diesem Selektionsmedium wurden die Embryonen auf Regenerationsmedien überführt, welche 0,1 mM Glyphosat enthielten (Protokoll 1). In manchen Fällen wurden die beschossenen Embryonen direkt auf das Regenerationsmedium ein bis zwei Wochen nach dem Beschießen überführt (Protokoll 2). Aus den Regenerationsmedien erhaltene Triebe wurden in ein Bewurzelungsmedium, welches 0,02 mM Glyphosat enthielt, überführt. Tolerante Pflanzen wurden in Erdboden überführt und in einer umweltmäßig regulierten Wachstumskammer, wie beschrieben, wachsen gelassen. Zwei Wochen später wurden die Pflanzen mit 56 mg/m2 (8 oz/a) ROUNDUP® (Wirkstoff Glyphosat, Monsanto) besprüht.
  • Protokoll 1: Die rasche Transformations-Regenerations-Methode für Glyphosatselektion – reduzierte Callusproliferations-Kultur.
    Figure 00120001
  • Protokoll 2: Die rasche Transformations-Regenerations-Methode für Glyphosatselektion – eliminierte Callusproliferations-Kultur.
    Figure 00130001
  • Auf Callus-Proliferationsmedien bestand kein sichtbarer Unterschied bei der Embryogenese zwischen den mit und ohne Plasmid-DNA beschossenen Geweben. Bei Überführung auf Regenerationsmedium wurden jedoch grüne Triebe aus den transformierten Embryonen regeneriert, wohingegen keine Triebe aus ohne Plasmid-DNA beschossenen Kontrollen gewonnen wurden. Wir waren in der Lage, Glyphosat-tolerante Triebe aus den meisten Experimenten zu gewinnen. Durchschnittlich erzeugten etwa 1–2% der beschossenen Embryonen Glyphosat-tolerante Pflanzen (siehe Tabelle 1). Unter unseren experimentellen Bedingungen war die Transformationseffizienz mit dem alten Verfahren sehr niedrig. Etwa 0,05% der beschossenen Embryonen erzeugten Glyphosat-tolerante Pflanzen (Tabelle 2). Die Transformationseffizienz aus dem raschen Verfahren war 25fach höher als jene aus dem alten Verfahren. Die Transformationsfrequenz aus dem alten Verfahren war gleichwertig zu denjenigen der Bialaphos-Selektion, welche früher von anderen Arbeitsgruppen berichtet wurde (Vasil et al. 1992, 1993; Weeks et al. 1993; Nehra et al. 1994). Tabelle 1. Glyphosat-tolerante Pflanzen, gewonnen aus unterschiedlichen Selektions-Regenerations-Schemen durch das rasche Regenerationsverfahren.
    Figure 00130002
    Figure 00140001
    • Exp.: Experiment; Beh.: Behandlung; UE: Unreife Embryonen; GUS: β-Glucuronidase.
    Tabelle 2. Zusammenfassung von Glyphosat-toleranten Pflanzen, produziert von dem alten und dem raschen Regenerationsverfahren
    Figure 00140002
    • Exp.: Experiment; Beh.: Behandlung; UE: Unreife Embryonen; Freq.: Frequenz
    • 4. Enzym-Assay von CP4- und GOX-transformierten Pflanzen Rohproteine wurden aus frischen Blättern von transgenen Pflanzen unter Befolgung eines BioRad-Verfahrens extrahiert. CP4- und GOX-Proteine wurden durch Antikörper sondiert und als Prozentsätze von Gesamtproteinen berechnet. Die transgenen Pflanzen enthielten 0,007–0,160% und 0,004–0,062% GOX, was äquivalent zu einer früher bestätigten transgenen Pflanze war (Tabelle 3). Fünf transgene Pflanzen wiesen keine CP4-Expression auf. Die Glyphosat-Toleranz dieser Pflanzen wurde wahrscheinlich von dem GOX-Gen vermittelt. Tabelle 3. Stabile GUS-Expression und prozentuale CP4- und GOX-Protein-Gehalte von Glyphosat-toleranten Pflanzen.
      Figure 00140003
      Figure 00150001
    • 5. Nachkommenschafts-Analyse von Glyphosat-toleranten Pflanzen Unreife Embryonen aus den Glyphosat-toleranten Pflanzen wurden 20 Tage nach der Anthese isoliert und auf einem Keimungsmedium (MMS-Medium ohne Pflanzenwachstumsregulator) mit 0,02 mM Glyphosat kultiviert. Gekeimte und nicht-gekeimte Embryonen wurden 10 Tage nach der Kultur separiert und aufgezeichnet, und die Daten wurden durch den X2-Test für eine 3:1-Segregation analysiert (Tabelle 4). Der X2-Test zeigte, dass das Transgen bei einem 3:1 Verhältnis segregierte, wie erwartet. Die toleranten Pflanzen wurden dann in Erdboden umgepflanzt und mit 56 mg/m2 (8 oz/a) ROUNDUP® besprüht. Individuen, welche auf den Selektionsmedien keimten, waren ebenfalls tolerant gegenüber der Besprühung.
  • Tabelle 4. Keimungstest von Embryonen aus Glyphosat-toleranten R0-Pflanzen.
    Figure 00160001
  • BEISPIEL 2: Transformation unter Verwendung des bar-Gens als einem selektierbaren Marker
    • 1. Transformation und Selektion Das Transformationsverfahren für das bar-Gen war im Wesentlichen das gleiche wie für die CP4- und GOX-Gene. Unreife Embryonen wurden mit dem pAHC25 beschossen, welches das bar- und das uidA-Gen trägt. Beide Gene wurden von dem Ubiq1-Promotor gesteuert. Das bar-Gen kodiert Phosphinothricinacetyltransferase (PAT), welche Phosphinothricin, den Wirkstoff des nicht-selektiven Herbizids Basta® (Hoechst AG), acetyliert. Die beschossenen Embryonen wurden einen Tag nach dem Beschuss auf das MMS2-Medium mit 4 mg/l Bialaphos überführt (Protokoll 3). Protokoll 3: Das rasche Regenerations-System zur bar-Gen-Transformation.
      Figure 00160002
      Figure 00170001
    • 2. Regeneration von Bialaphos toleranten Pflanzen Im Anschluß an eine bis zwei Wochen dauernde Callusproliferation auf dem MMS2-Medium wurden die Embryonen zu einem MMS0-Regenerationsmedium mit 4 mg/l Bialaphos überführt. Triebe und Pflanzen aus dem Regenerationsmedium wurden in Eisbecher mit dem gleichem Medium zur Bewurzelung überführt. Bialaphos-tolerante Pflanzen wurden gewonnen und innerhalb von zwei Monaten auf Erdboden überführt. Aus einer Gesamtheit von 828 beschossenen Embryonen in den drei Experimenten erzeugten 566 Embryonen Bialaphos-tolerante Pflanzen (Tabelle 5). Etwa 15% der Embryonen produzierten eine Einzelpflanze, 20% von ihnen 2 Pflanzen, 40% 3 Pflanzen und 25% 4 oder mehr Pflanzen. Jeder Embryo wurde als ein einzelnes Transformationsereignis gezählt, ungeachtet der Anzahl gewonnener Pflanzen. Ein Drittel (190 von 566) der Transformationsereignisse waren GUS-positiv. Die GUS-Aktivität variierte häufig unter individuellen Ereignissen, von vollständig dunkelblau bis zu blauen Streifen in vaskulären Geweben oder blauen Punkten, welche statistisch auf den Blättern verstreut waren. Die Transformationsfrequenz mit Bialaphos-Selektion war viel höher als mit Glyphosat, unter unseren experimentellen Bedingungen, und 10- bis 100fach höher als jene, welche früher für Weizen und Gerste berichtet wurden (Vasil et al., 1992, 1993; Weeks et al., 1993; Nehra et al., 1994; Wan und Lemaux, 1993). Tabelle 5. Bialaphos-tolerante Pflanzen, gewonnen durch das rasche Regenerationssystem.
      Figure 00180001
      • Exp.: Experiment; Beh.: Behandlung; GUS: β-Glucuronidase.
    • 3. Besprühen mit Basta® Eine Probe von 20 Bialaphos-toleranten Pflanzen wurde in Erdboden überführt und mit 1% Basta® (200 g/l Glufosinat, Hoechst AG) besprüht. Kontrollpflanzen zeigten Nekrose und Bräunung 3 Tage nach dem Besprühen. Die beschädigten Blätter wurden gelb und trockneten später. Zehn der 20 Bialaphos-toleranten Pflanzen zeigten keinerlei nekrotische Schädigungen nach dem Besprühen.
    • 4. PAT-Assay Die Basta®-toleranten Pflanzen wurden hinsichtlich PAT-Aktivität unter Befolgung des Verfahrens von De Block et al. (EMBO J., 6, 2513–2518, 1987) analysiert. Alle Basta®-toleranten Pflanzen waren PAT-positiv, wohingegen keine PAT-Aktivität in Bobwhite-Kontrollpflanzen beobachtet wurde (Tabelle 6).
    • 5. Keimungs-Test und Nachkommenschafts-Analyse Die Basta®-toleranten Pflanzen wuchsen normal und bildeten Samen. Unreife Embryonen von den Pflanzen wurden auf einem Keimungsmedium mit 2 mg/l Bialaphos kultiviert. Unreife Embryonen aus Bobwhite-Kontrollpflanzen konnten auf dem Bialaphos-Selektionsmedium nicht keimen, wohingegen Embryonen von den Basta®-toleranten Pflanzen zu toleranten und sensitiven [Pflanzen] segregierten. Zwei der zehn Pflanzen zeigten 3:1-Segregationsverhältnisse, wie erwartet. Fünf wiesen eine geringere Segregation als 3:1 auf, wohingegen die anderen drei keine toleranten Embryonen produzierten (Tabelle 6). Zu diesem Zeitpunkt ist es unbekannt, was die unerwartete Segregation verursacht hat. Sie könnte auf die geringe Größe von Proben oder auf Gen-Stille zurückzuführen sein. Nichtsdestotrotz demonstrierte die Erzeugung von Bialaphos-toleranten Pflanzen, dass das rasche Regenerationssystem von selektierbaren Markern oder jeglichem Gen von Interesse unabhängig ist.
  • Tabelle 6. Keimungstest für Bialaphos-tolerante R0-Pflanzen, welche aus dem raschen Regenerationssystem gewonnen wurden.
    Figure 00190001
    • GUS: β-Glucuronidase; PAT: Phosphinothricinacetyltransferase.
  • BEISIPIEL 3: Transformation unter Verwendung des nptII-Gens als einem selektierbaren Marker
  • Das rasche Transformations-Regenerations-System wurde auch mit Paromomycin-Selektion für das nptII-Gen verdeutlicht.
    • 1. Unreife Embryo-Kultur Ein Sommerweizen Triticum aestivum cv. Bobwhite wurde durchweg in dieser Studie verwendet. Zucht-Pflanzen wurden in einer umweltmäßig regulierten Wachstumskammer bei einer Lichtdauer von 16 h bei 800 μmol m–2s–1, vorgesehen durch Hochintensitäts-Entladungs(HID)-Sylvania-Leuchten (GTE Corp.), wachsen gelassen. Die Tages/Nacht-Temperaturen beliefen sich auf 18/16°C. Unreife Caryopsen wurden von den Pflanzen 13 oder 14 Tage nach der Anthese abgesammelt und auf einem modifizierten MS-Medium (Murashige und Skoog-Salze, Gibco BRL) kultiviert, das mit 40 g/l Maltose, 0,5 mg/l 2,4-D und 2,2 mg/l Picloram ergänzt war (CM4). Die unreifen Embryonen wurden bei 26°C im Dunklen kultiviert.
    • 2. DNA-Zuführung Fünf Tage nach dem Beginn der Kultur wurden unreife Embryonen zu einem Osmoticum-Behandlungsmedium 4 Stunden vor dem Beschuss überführt. Das Osmoticum-Medium war das gleiche CM4 mit 0,35 M Mannitol oder 0,125 M Mannitol und 0,125 M Raffinose. Ungefähr 40 Embryonen wurden in die Mitte jeder Platte gesetzt, und die Embryonen wurden mit einer Mischung von pMON19476 und pMON19468 bei einem Verhältnis von 1:1 beschossen. pMON19476 enthält den Enhancer-verstärkten 35S-Promotor aus CaMV (Odell et al., 1985, Kay et al., 1987), das NPTII-Gen (Fraley et al., 1983) und den NOS-Terminator aus dem Nopalinsynthase-Gen (Fraley et al., 1983). pMON19468 trägt den uidA (welches Beta-Glucuronidase (GUS) kodiert) von Escherichia coli (Jefferson et al., 1986) und den NOS-Terminator. Sowohl das nptII- als auch das GUS-Gen wurden von dem 35S-Promotor (Odell et al., 1985, Kay et al., 1987) gesteuert. Jede Platte wurde zweimal mit einer PDS 1000-Pulverkanone beschossen, wie ausführlich beschrieben von Klein et al., 1987. Hohe Niveaus an transienter GUS-Expression (ein Durchschnitt von 84 Flecken pro Embryo) wurden beobachtet, was anzeigt, dass das DNA-Zuführungsverfahren sehr effizient war.
    • 3. Regeneration von Paromomycin-toleranten Pflanzen Nach einer 18stündigen Nachbeschuss-Behandlung auf dem 0,35 M Mannitol-Medium, oder einer Kombination von 0,125 M Mannitol- und 0,125 M Raffinose-Medium, wurden die beschossenen Embryonen auf das CM4-Medium überführt (Tabelle 9) für eine 6- oder 7-tägige Verzögerung der Selektion. In diesem Stadium wurden zwei Embryonen aus jeder beschossenen Platte für transiente GUS-Assays als Probe entnommen. Nach einer Verzögerung von 6 oder 7 Tagen wurden die Embryonen auf ein CM4-Medium, das 100, 200 oder 300 mg/l Paromomycin enthielt, für die Callusproliferation überführt. Ein anderer Satz von Embryonen wurde direkt auf Regenerationsmedium überführt, welches 100 oder 200 mg/l Paromomycin enthielt (Protokoll 4). In einigen Fällen wurden die beschossenen Embryonen direkt auf das Regenerationsmedium ein bis zwei Wochen nach dem Beschuss überführt (Protokoll 5). Aus den Regenerationsmedien erhaltene Triebe wurden auf ein Bewurzelungsmedium, welches kein selektives Mittel enthielt, überführt (Tabelle 9). Pflanzen wurden hinsichtlich GUS durch histochemische Analyse bewertet. Positive Pflanzen und einige negative Pflanzen (Kontrollen) wurden in Erdboden überführt und in einer umweltmäßig regulierten Wachstumskammer wie beschrieben wachsen gelassen.
    • 4. Nachkommenschafts-Analyse von Paromomycin-toleranten Pflanzen. Unreife Embryonen aus den Paromomycin-toleranten Pflanzen wurden 20 Tage nach der Anthese isoliert und auf einem Keimungsmedium (MMS0-Medium ohne Pflanzenwachstumsregulator) mit 100 mg/l Paromomycin kultiviert. Gekeimte und nicht-gekeimte Embryonen wurden 10 Tage nach der Kultur separiert und aufgezeichnet, und die Daten wurden durch den X2-Test bzgl. der 3:1-Segregation analysiert (Tabelle 8). Der X2-Test zeigte, dass das Transgen nicht bei einem 3:1-Verhältnis, wie erwartet, segregierte.
  • Protokoll 4: Das rasche Regenerationssystem für Paromomycin-Selektion-reduzierte Callusproliferations-Kultur.
    Figure 00220001
  • Protokoll 5: Das rasche Regenerationssystem für Paromomycin-Selektion-eliminierte Callusproliferations-Kultur.
    Figure 00220002
  • Auf Callus-Proliferationsmedien wurde etwas von dem Callus weiß und hörte auf zu proliferieren, während einige Teile des Callus gelb blieben und proliferierten. Sowohl die gelben, als auch die weißen Callusgewebe erschienen kompakt und embryogen. Die ohne Plasmid-DNA beschossenen Gewebe proliferierten nicht und wurden bleich. Bei Überführung auf Regenerationsmedium wurden grüne Triebe aus den transformierten Embryonen regeneriert, wohingegen keine Triebe aus ohne Plasmid-DNA beschossenen Kontrollen gewonnen wurden. Wir waren in der Lage, Paromomycin-tolerante Triebe aus allen Experimenten zu gewinnen.
  • Durchschnittlich erzeugten etwa 0,3–4% beschossene Embryonen GUS-positive Paromomycin-tolerante Pflanzen (Tabelle 7). Das Protokoll 4 erzeugte 2 und 4% GUS-positive Pflanzen, wohingegen das Protokoll 5 0,3 bis 1% GUS-positive Pflanzen produzierte. Beide Protokolle produzierten höhere Transformationsfrequenzen als diejenigen von Bialaphos-Selektion, welche früher von anderen Gruppen berichtet wurden (Vasil et al., 1992, 1993; Weeks et al., 1993). Tabelle 7. Paromomycin-selektierte Pflanzen, gewonnen aus verschiedenen Selektions-Regenerations-Schemen durch das rasche Regenerations-Verfahren.
    Figure 00230001
    Tabelle 8. Paromomycin-Keimungs-Assay an R1-Nachkommenschaft aus Pflanzen, welche mit dem nptII-Gen transformiert waren.
    Figure 00240001
    • * Pflanzen, transformiert mit entweder: pMON19476 (E35S/HSP70/NPTII) + pMON19468 (E35S/HSP70/GUS) oder pMON19476 (E35S/HSP70/NPTII) + BC17 (Anthocyanin).
    Tabelle 9. Gewebekulturmedien, verwendet für Weizencallus-Entwicklung und Regeneration von Pflanzenzellen.
    Figure 00250001
    • * Basales MS-Medium, beschrieben in (Zhou et al., 1993) 2 g/l Gelrite werden für alle Medien verwendet, außer Paromomycin-Selektionsmedium, welches 4 g/l Agarose enthält.

Claims (8)

  1. Verfahren zum Regenerieren von transformierten Einkeimblättrigen Pflanzen, so dass sie Fremd-DNA enthalten, umfassend die Schritte: a) Isolieren von regenerierbarem Gewebe aus den Pflanzen; b) Einfügen der Fremd-DNA in das regenerierbare Gewebe, wobei die Fremd-DNA eine selektierbare DNA-Sequenz umfasst, wobei die Sequenz in einem regenerierbaren Gewebe als Selektionsmarker fungieren kann, und Halten des regenerierbaren Gewebes während eines Tages auf einem Medium, das keine Selektionsverbindung enthält; c) Platzieren des regenerierbaren Gewebes aus Schritt b) in einem Medium, das Triebe aus dem Gewebe erzeugen kann, wobei das Medium weiterhin eine Verbindung enthält, die verwendet wird, um regenerierbares Gewebe, das die selektierbaren DNA-Sequenzen umfasst, zu selektieren; und d) nachdem sich wenigstens ein Trieb aus Schritt c) gebildet hat, Überführen des Triebs auf ein zweites Medium, das Wurzeln aus dem Trieb erzeugen kann.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt c) einen Zeitrahmen von einem Tag bis zwei Wochen hat.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt c) einen Zeitrahmen von fünf Tagen bis elf Tagen hat.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die selektierbare DNA-Sequenz ein Enzym exprimiert, das der Pflanzenzelle Resistenz gegen wenigstens einen Wirkstoff aus der Gruppe verleiht, die aus Kanamycin und Paromomycin besteht.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die selektierbare DNA-Sequenz ein Enzym exprimiert, das der Pflanzenzelle Resistenz gegen Glyphosat verleiht.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die selektierbare DNA-Sequenz ein Enzym exprimiert, das der Pflanzenzelle Resistenz gegen Bialaphos verleiht.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Einkeimblättrigen Pflanzen Weizenpflanzen sind.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Einkeimblättrigen Pflanzen Weizenpflanzen sind, Schritt a) das Isolieren von embryonalen Kalli aus den Pflanzen umfasst und Schritt b) das Einfügen von Fremd-DNA in die Kalli umfasst.
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Families Citing this family (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR199800294T1 (xx) * 1996-06-21 1999-10-21 Monsanto Company Sabit transforme edilen verimli bu�day �retim y�ntemleri.
KR20000053140A (ko) * 1996-11-07 2000-08-25 돈 리사 로얄 제초제에 견디는 식물
US6369298B1 (en) 1997-04-30 2002-04-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Agrobacterium mediated transformation of sorghum
AU7968098A (en) 1997-06-11 1998-12-30 United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture, The Transformation of wheat with the cyanamide hydratase gene
AU1558099A (en) 1997-10-31 1999-05-24 Novartis Ag Glyphosate resistant transgenic plants
IL122270A0 (en) * 1997-11-20 1998-04-05 Yeda Res & Dev DNA molecules conferring to plants resistance to a herbicide and plants transformed thereby
JPH11174541A (ja) * 1997-12-08 1999-07-02 Canon Inc 電子閃光装置
US5914451A (en) * 1998-04-06 1999-06-22 Monsanto Company Efficiency soybean transformation protocol
PL346650A1 (en) 1998-08-19 2002-02-25 Monsanto Co Plant expression vectors
ES2638112T3 (es) 1999-12-16 2017-10-18 Monsanto Technology, Llc Nuevas construcciones de expresión en plantas
WO2001082685A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Basf Aktiengesellschaft Use of the maize x112 mutant ahas 2 gene and imidazolinone herbicides for selection of transgenic monocots, maize, rice and wheat plants resistant to the imidazolinone herbicides
US6552250B1 (en) 2000-06-14 2003-04-22 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Diacylglycerol O-acyltransferase
US6995016B2 (en) 2000-08-17 2006-02-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Process for inducing direct somatic embryogenesis in immature scutella cells of pooideae, and rapidly regenerating fertile plants
EP1197550A3 (de) * 2000-08-25 2002-11-20 Pfizer Products Inc. Methoden und Zusammensetzungen zur Diagnose unde Behandlung von Krankheiten an denen Angiogenese beteiligt ist
US6635451B2 (en) * 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
WO2002063024A2 (en) * 2001-02-05 2002-08-15 The University Of South Carolina Research Foundation Sustained totipotent culture of selected monocot genera
AU2002308633A1 (en) 2001-05-09 2002-11-18 Monsanto Technology Llc Metabolite transporters
EP1950305A1 (de) 2001-05-09 2008-07-30 Monsanto Technology, LLC Tyr-A-Gene und ihre Verwendung
NZ529597A (en) * 2001-05-30 2005-12-23 Chromos Molecular Systems Inc Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
EP1925672A1 (de) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Auf abiotischen Stress ansprechende Polynukleotide und Polypeptide
US7294759B2 (en) * 2001-06-29 2007-11-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alteration of oil traits in plants
EP1404850B1 (de) 2001-07-06 2011-10-26 Monsanto Technology LLC Verfahren zur förderung der aufspaltung von transgenen bei pflanzen und zusammensetzungen dafür
WO2003007698A2 (en) 2001-07-19 2003-01-30 Monsanto Technology Llc A novel method for the production of transgenic plants
US7211656B2 (en) * 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
NZ571718A (en) 2002-02-20 2010-09-30 Simplot Co J R Precise breeding by modification of an R1, phosphorylase-L and polyphenol oxidase genes in a plant
US7534934B2 (en) 2002-02-20 2009-05-19 J.R. Simplot Company Precise breeding
EP1551966B1 (de) 2002-07-18 2013-06-05 Monsanto Technology LLC Verfahren zur verwendung künstlicher polynukleotide und zusammensetzungen davon zur verringerung des transgen-silencing
US7057087B2 (en) 2002-07-26 2006-06-06 Board Of Control Of Michigan Technological University Application of aspen MADS-box genes to alter reproduction and development in trees
RU2377303C2 (ru) 2003-06-30 2009-12-27 Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн Пшеница с модифицированной активностью ветвящего фермента, а также полученные из нее крахмал и крахмалсодержащие продукты
EP2333051A1 (de) 2003-12-16 2011-06-15 Pioneer Hi-Bred International Inc. Gensuppression durch dominante Transgene und Methoden zur Verwendung
US20070169227A1 (en) 2003-12-16 2007-07-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same
WO2005072186A2 (en) * 2004-01-21 2005-08-11 Omega Genetics, Llc Glyphosate tolerant plants and methods of making and using the same
AR047598A1 (es) 2004-02-10 2006-01-25 Monsanto Technology Llc Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos
BRPI0508542B1 (pt) 2004-03-10 2014-09-16 Monsanto Technology Llc Composições de concentrado herbicida compreendendo glifosato e herbicida auxina
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
EP2402441A1 (de) 2004-04-09 2012-01-04 Monsanto Technology, LLC Zusammensetzungen und Verfahren zur Kontrolle von Insektenbefall bei Pflanzen
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
US7456270B2 (en) * 2004-09-01 2008-11-25 Abbott Laboratories Δ6-desaturase genes and uses thereof
US8314290B2 (en) 2004-12-21 2012-11-20 Monsanto Technology Llc Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs
EP3078749B1 (de) 2004-12-21 2019-10-09 Monsanto Technology LLC Transgene pflanzen mit erweiterten agronomischen merkmalen
WO2006073727A2 (en) 2004-12-21 2006-07-13 Monsanto Technology, Llc Recombinant dna constructs and methods for controlling gene expression
EP1827078B1 (de) 2004-12-21 2014-02-26 Monsanto Technology LLC Transgene Pflanzen mit verbesserten agronomischen Merkmalen
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP2489726A3 (de) 2005-01-12 2012-11-28 Monsanto Technology LLC Gene und ihre Verwendung zur Pflanzenverbesserung
EP1882392A4 (de) 2005-05-10 2009-07-01 Monsanto Technology Llc Gene und ihre verwendung zur pflanzenverbesserung
EP1896594B1 (de) 2005-06-23 2011-01-12 BASF Plant Science GmbH Verbesserte verfahren zur herstellung stabil transformierter und fruchtbarer buntmais-pflanzen
BRPI0617224B1 (pt) 2005-10-13 2024-04-30 Monsanto Technology Llc Constructos de dna recombinantes
WO2007078280A2 (en) 2005-12-21 2007-07-12 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
WO2008021543A2 (en) 2006-08-17 2008-02-21 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
WO2008027592A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Monsanto Technology, Llc Phased small rnas
WO2008133643A2 (en) 2006-10-12 2008-11-06 Monsanto Technology, Llc Plant micrornas and methods of use thereof
WO2008103643A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Monsanto Technology, Llc Invertebrate micrornas
EP2150100B1 (de) 2007-05-07 2012-07-11 University of South Carolina Verfahren zur Mikropropagation von Monokotyledonen auf Grundlage von dauerhaften totipotenten Zellkulturen
EP2730656A1 (de) 2007-05-24 2014-05-14 E. I. du Pont de Nemours and Company Sojabohnenmehl aus Bohnen mit DGAT-Gene aus Yarrowia lipolytica für erhöhte Samenfettproduktion sowie veränderte Fettsäureprofile in Sojabohnen
EP2543735A1 (de) 2007-06-06 2013-01-09 Monsanto Technology LLC Gene und deren Verwendung zur Pflanzenverbesserung
WO2009009142A2 (en) 2007-07-10 2009-01-15 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
WO2009029739A2 (en) 2007-08-29 2009-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods involving genes encoding nucleoside diphosphatase kinase (ndk) polypeptides and homologs thereof for modifying the plant's root architecture
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US20090130685A1 (en) 2007-11-20 2009-05-21 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plants With Altered Root Architecture, Related Constructs and Methods Involving Genes Encoding Leucine Rich Repeat Kinase (LLRK) Polypeptides and Homologs Thereof
WO2009111587A2 (en) * 2008-03-04 2009-09-11 Washington State University Compositions and methods for differential regulation of fatty acid unsaturation in membrane lipids and seed oil
SI2262896T1 (sl) 2008-04-07 2014-05-30 Monsanto Technology Llc Rastlinski regulatorni elementi in njihove uporabe
EP2271760A2 (de) 2008-04-29 2011-01-12 Monsanto Technology LLC Gene und ihre verwendung zur pflanzenverbesserung
BRPI0908642A2 (pt) 2008-05-23 2020-06-23 E.I. Du Pont De Mours And Company Polinucleotídeo recombinante, construção de dna recombinante, método para aumentar o teor total de ácido graxo de uma semente, produto ou subproduto, método para produzir uma semente de oleaginosa com um teor total de ácidos graxos aumentado e método para produzir um produto a partir de uma semente de oleaginosa
AU2009248931A1 (en) 2008-05-23 2009-11-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Novel DGAT genes for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in oilseed plants
WO2010002984A1 (en) 2008-07-01 2010-01-07 Monsanto Technology, Llc Recombinant dna constructs and methods for modulating expression of a target gene
EP2300617B1 (de) 2008-07-16 2016-03-23 Monsanto Technology LLC Verfahren und vektoren zur herstellung transgener pflanzen
JP5723281B2 (ja) 2008-10-06 2015-05-27 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ デルタ−８デサチュラーゼ遺伝子、それによってコードされる酵素およびそれらの使用
WO2010075143A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Monsanto Technology Llc Genes and uses for plant enhancement
US7868688B2 (en) * 2008-12-30 2011-01-11 Cosmic Circuits Private Limited Leakage independent very low bandwith current filter
WO2010088426A1 (en) 2009-01-31 2010-08-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineering lipids in vegetative tissues of plants
WO2010099431A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Monsanto Technology Llc Hydroponic apparatus and methods of use
US8334426B1 (en) 2009-06-04 2012-12-18 Pioneer Hi Bred International Inc Method for obtaining transformed maize plants
WO2010144276A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding fatty acid desaturase family polypeptides
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
US20120142532A1 (en) 2009-08-10 2012-06-07 Monsanto Technology Llc Low volatility auxin herbicide formulations
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
AU2010333827A1 (en) 2009-12-24 2012-06-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant membrane bound O-acyl transferase (MBOAT) family protein sequences and their uses for altering fatty acid compositions
CA2786697C (en) 2010-01-14 2018-10-30 Stanislaw Flasinski Plant regulatory elements and uses thereof
EP2531603A2 (de) 2010-02-02 2012-12-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company Pflanzen mit veränderter wurzelarchitektur, entsprechende konstrukte und verfahren mit für lectinproteinkinase (lpk)-polypeptide kodierenden genen und homologen davon
EP2545182B1 (de) 2010-03-08 2017-05-03 Monsanto Technology LLC Polynukleotidmoleküle zur genregulierung in pflanzen
US8816153B2 (en) 2010-08-27 2014-08-26 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA constructs employing site-specific recombination
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
MX362812B (es) 2011-09-13 2019-02-13 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
AU2012308694B2 (en) 2011-09-13 2018-06-14 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
MX342856B (es) 2011-09-13 2016-10-13 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
UY39627A (es) 2011-10-26 2022-03-31 Monsanto Technology Llc Sales de herbicidas de ácido carboxílico
WO2013096562A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Use of the soybean sucrose synthase promoter to increase plant seed lipid content
CN104364259A (zh) 2012-03-26 2015-02-18 普罗努塔利亚公司 营养性片段、蛋白质和方法
US10240161B2 (en) 2012-05-24 2019-03-26 A.B. Seeds Ltd. Compositions and methods for silencing gene expression
AR091268A1 (es) 2012-06-04 2015-01-21 Monsanto Technology Llc Composiciones herbicidas concentradas acuosas que contienen sales de glifosato y sales de dicamba
CA2888264A1 (en) 2012-10-18 2014-04-24 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US20150307894A1 (en) 2012-11-28 2015-10-29 Monsanto Technology Llc Transgenic Plants With Enhanced Traits
US10253325B2 (en) 2012-12-19 2019-04-09 Boston Medical Center Corporation Methods for elevating fat/oil content in plants
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
TR201815726T4 (tr) 2013-02-27 2018-11-21 Monsanto Technology Llc Geliştirilmiş bir uçuculuğa sahip glifosat ve dikamba tank karışımlar.
MX364458B (es) 2013-03-13 2019-04-26 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
AR095233A1 (es) 2013-03-13 2015-09-30 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
WO2015010026A2 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
WO2015054106A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced traits
NZ719544A (en) 2013-11-04 2022-09-30 Beeologics Inc Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
BR112016016337A2 (pt) 2014-01-15 2017-10-03 Monsanto Technology Llc Composição e métodos para controlar crescimento, desenvolvimento ou a capacidade de reprodução de uma planta, e para sensibilizar uma planta para um herbicida inibidor de epsps
CN106413390B (zh) 2014-04-01 2019-09-27 孟山都技术公司 用于控制虫害的组合物和方法
AU2015280252A1 (en) 2014-06-23 2017-01-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference
WO2015200539A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US10378012B2 (en) 2014-07-29 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
JP6942632B2 (ja) 2015-01-22 2021-09-29 モンサント テクノロジー エルエルシー Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ防除用組成物及びその方法
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
EP3302030A4 (de) 2015-06-03 2019-04-24 Monsanto Technology LLC Verfahren und zusammensetzungen zum einführen von nukleinsäuren in pflanzen
WO2016207219A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Carbon-neutral and carbon-positive photorespiration bypass routes supporting higher photosynthetic rate and yield
ES2842501T5 (es) 2015-09-21 2023-04-13 Modern Meadow Inc Materiales compuestos de tejido reforzados con fibras
EP3356537B1 (de) 2015-10-02 2022-08-17 Monsanto Technology LLC Rekombinante mais-b-chromosomensequenz und verwendungen davon
CN108368517B (zh) 2015-10-30 2022-08-02 先锋国际良种公司 用于快速植物转化的方法和组合物
JP6971040B2 (ja) 2016-02-15 2021-11-24 モダン メドウ，インコーポレイテッド 複合バイオファブリケーテッド材料
WO2018005491A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for use in genome modification in plants
UY37369A (es) 2016-08-17 2018-03-23 Monsanto Technology Llc MÉTODOS, COMPOSICIONES y PLANTAS MEDIANTE LA MANIPULACIÓN DEL METABOLISMO DE GIBERELINA PARA AUMENTAR EL RENDIMIENTO COSECHABLE
CA3008850A1 (en) 2017-06-29 2018-12-29 Modern Meadow, Inc. Yeast strains and methods for producing collagen
US11578334B2 (en) 2017-10-25 2023-02-14 Monsanto Technology Llc Targeted endonuclease activity of the RNA-guided endonuclease CasX in eukaryotes
AU2018253595A1 (en) 2017-11-13 2019-05-30 Modern Meadow, Inc. Biofabricated leather articles having zonal properties
CN111836895A (zh) 2018-02-15 2020-10-27 孟山都技术公司 通过性状堆叠提高作物产量的组合物和方法
UY38095A (es) 2018-02-15 2019-10-01 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para mejorar los rendimientos de cultivos mediante el apilamiento de rasgos
WO2019227030A1 (en) 2018-05-24 2019-11-28 Monsanto Technology Llc Genome editing in plants
MX2021008462A (es) 2019-01-17 2021-08-19 Modern Meadow Inc Materiales de colageno estratificados y metodos para fabricarlos.
CA3130789A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
WO2020243276A1 (en) 2019-05-29 2020-12-03 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having reduced or eliminated suckers
WO2021072248A2 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Altria Client Services Llc Pale yellow locus and its applications in tobacco
US11326176B2 (en) 2019-11-22 2022-05-10 Mozza Foods, Inc. Recombinant micelle and method of in vivo assembly
EP4210475A1 (de) 2020-09-10 2023-07-19 Monsanto Technology LLC Erhöhung von geneditierungs- und ortsspezifischen integrationsereignissen unter verwendung von meiotischen und keimbahnpromotoren
JP2024505755A (ja) 2021-02-03 2024-02-07 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 植物におけるテルペン産生方法
WO2023230433A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco field
US20240132901A1 (en) 2022-08-05 2024-04-25 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5569597A (en) * 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5004863B2 (en) * 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
ES2097746T3 (es) * 1988-03-08 1997-04-16 Ciba Geigy Ag Regeneracion de plantas gramineas de la subfamilia pooideae partiendo de protoplastos.
US5990387A (en) * 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5484956A (en) * 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5767367A (en) * 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
JPH04111998A (ja) * 1990-08-29 1992-04-13 Komatsu Ltd 油圧プレスのスライド駆動方法
ATE191931T1 (de) * 1990-11-23 2000-05-15 Plant Genetic Systems Nv Verfahren zur transformation monokotyler pflanzen
WO1993004178A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-04 University Of Florida A novel method for the production of transgenic plants
UA48104C2 (uk) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5610042A (en) * 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
EP0604662B1 (de) * 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze

Also Published As

Publication number Publication date
ATE341634T1 (de) 2006-10-15
CA2161387C (en) 2007-03-13
US6153812A (en) 2000-11-28
EP0709462B1 (de) 2006-10-04
PT709462E (pt) 2007-01-31
DE69535251D1 (de) 2006-11-16
US5631152A (en) 1997-05-20
EP0709462A3 (de) 1997-01-02
CA2161387A1 (en) 1996-04-27
EP0709462A2 (de) 1996-05-01
ES2274515T3 (es) 2007-05-16

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