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Die
vorliegende Erfindung betrifft gentechnisch veränderte Pflanzen. Sie betrifft
insbesondere ein Verfahren zum Regenieren von Pflanzenzellen, welche
transformiert worden sind.
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HINTERGRUND
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Während des
vergangenen Jahrzehnts ist es möglich
geworden, Gene aus einer großen
Vielzahl von Organismen in Feldfrüchtepflanzen durch rekombinante
DNA-Technologie zu überführen. Dieser
Fortschritt hat enorme Möglichkeiten
zur Verbesserung der Pflanzenresistenz gegen Schädlinge, Krankheiten und Herbizide
sowie zum Modifizieren von biosynthetischen Verfahren zur Änderung
der Qualität
von Pflanzenprodukten eröffnet
(Knutson et al., PNAS, USA 89, 2624–2628 (1992); Piorier et al.,
Science, 256, 520–523,
(1992); Vasil et al., Bio/Technology, 10, 667–674 (1992)). Allerdings ist
die Verfügbarkeit
eines effizienten Transformationsverfahrens zum Einführen von
Fremd-DNA ein wesentliches Hindernis für die meisten einkeimblättrigen
Spezies, einschließlich
Mais, Reis, Hafer, Gerste und insbesondere Weizen.
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Zwei
alternative Transformationsverfahren werden derzeitig für einkeimblättrige Spezies
verwendet: direkter DNA-Transfer in isolierte Protoplasten und Mikroprojektil-vermittelte
DNA-Zuführung
(Shimamoto et al., Nature, 338, 274–276 (1989); Fromm et al.,
Bio/Technology, 8, 833–839
(1990)).
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Die
Protoplastenverfahren sind in breitem Umfang bei Reis angewandt
worden, wobei DNA den Protoplasten durch Liposomen, PEG und Elektroporation
zugeführt
wird. Obgleich eine große
Anzahl transgener Pflanzen in mehreren Laboratorien gewonnen worden
ist (Shimamoto et al., (1989); Datta et al., Bio/Technology, 8,
736–740
(1990)), erfordern die Protoplastenverfahren die Einrichtung von
langfristigen embryogenen Suspensionskulturen. Manche Regeneranten
aus Protoplasten sind unfruchtbar und phänotypisch abnormal aufgrund
der langfristigen Suspensionskultur (Davey et al., J. of Exp. Botany,
42, 1129–1169
(1991); Rhodes et al., Science, 240, 204–207 (1988)).
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Das
Mikroprojektil-vermittelte DNA-Zuführungsverfahren kann unreife
Embryonen oder unreife embryo-abgeleitete Calli als Zielgewebe verwenden.
Transgene Pflanzen sind aus dem Mikroprojektil-Beschussverfahren
in Mais, Hafer, Gerste und Weizen gewonnen worden (Gordon-Kamm et
al., Plant Cell, 2, 603–618 (1990);
Somers et al., Bio/Technology, 10, 1589–1594 (1992); Wan et al., Plant
Physiol., 104, 37–48
(1994); Vasil et al. (1992)).
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Das
Mikroprojektil-Beschussverfahren braucht im Allgemeinen 10 bis 15
Monate, damit man transgene Pflanzen erhält (Gordon-Kamm et al., (1990);
Vasil et al. (1992)). Selbst mit den jüngeren Verbesserungen bei Transformationsverfahren
unter Verwendung von unreifen Embryonen als Zielgeweben, benötigt es
immer noch 4 bis 6 Monate, um transgene Pflanzen zu gewinnen (Weeks
et al., Plant Physiol., 102, 1077–1084 (1993); Vasil et al.
(1992); Vasil et al., Bio/Technology, 11, 1153–1158 (1993); Becker et al.,
Plant J., 5, 299–307 (1994)).
Darüber
hinaus leiden diese Verfahren häufig
unter einem Verlust an Fruchtbarkeit in den gewonnenen Pflanzen
(Vasil et al. (1993); Becker et al. (1994)). Weiterhin ist die Transformationsfrequenz
bzw. -häufigkeit
durch diese Verfahren, mit etwa einem Ereignis aus jeden tausend
beschossenen Embryonen, sehr niedrig. Diese Transformationseffizienz
ist für
genetische Untersuchungen und für
kommerzielle Anwendungen zu niedrig.
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Daher
besteht ein Bedarf nicht nur für
schnellere Verfahren zum Regenerieren von transformierten Pflanzengewebe,
sondern es besteht auch ein Bedarf nach einem Verfahren, welches
die Fruchtbarkeit in den resultierenden Pflanzen aufrechterhält und eine
höhere
Transformationseffizienz erzeugt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung sieht ein schnelles und effizientes Transformations- und Regenerationssystem
vor. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich bei der Transformation
und Regeneration von Weizenpflanzen. Pflanzen, welche aus diesem
System regeneriert werden, sind phänotypisch normal und vollständig fruchtbar.
Die Transgene werden auf Mendelsche Weise an die R1-Nachkommenschaft
weitergegeben.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein rasches und effizientes Regenerationssystem
für die
Transformation von einkeimblättrigen
Getreidepflanzen unter Verwendung von proliferierten unreifen Embryonen
als Zielgeweben bereit. Das neue System braucht weniger als zwei
Monate, um transgene Pflanzen zu erhalten. Die Transformationsfrequenzen
bei dem neuen System sind 5- bis 100-fach höher als bei den derzeit in
anderen Laboratorien angewandten Verfahren. Dieses neue System kann
mit einer Vielzahl von selektierbaren Marker-Systemen, einschließlich Selektion
unter Verwendung von Herbiziden wie Glyphosat und Bialaphos, sowie
Antibiotika, wie Kanamycin, verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zum Regenerieren einer
transformierten einkeimblättrigen
Pflanze, so dass sie Fremd-DNA enthält, vor, umfassend die Schritte:
- a) Isolieren von regenerierbarem Gewebe aus
der Pflanze;
- b) Einfügen
der Fremd-DNA in das regenerierbare Gewebe, wobei die Fremd-DNA
eine selektierbare DNA-Sequenz umfasst, wobei die Sequenz in einem
regenerierbaren Gewebe als ein Selektionsmarker fungieren kann,
und Halten des regenerierbaren Gewebes während eines Tages auf einem
Medium, das keine Selektionsverbindung enthält;
- c) Platzieren des regenerierbaren Gewebes aus Schritt b) in
einem Medium, das Triebe aus dem Gewebe erzeugen kann, wobei das
Medium weiterhin eine Verbindung enthält, die verwendet wird, um regenerierbares
Gewebe, das die selektierbaren DNA-Sequenzen enthält, zu selektieren;
und
- d) nachdem sich wenigstens ein Trieb aus Schritt c) gebildet
hat, Überführen des
Triebs auf ein zweites Medium, das Wurzeln aus dem Trieb erzeugen
kann.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung kann mit jedweder Pflanzenspezies angewandt
werden. Sie ist besonders nützlich
für einkeimblättrige Spezies.
Im Genaueren, ist sie nützlich
in Pflanzenspezies, welche nicht während langer Zeitdauern in
einem Callus-Zustand bleiben können,
ohne das Vermögen
zur Regeneration zu verlieren. Eine besonders nützliche Spezies in der vorliegenden
Erfindung ist Weizen.
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Die
vorliegende Erfindung besitzt, wenn sie auf Weizen angewandt wird,
den Vorteil, Genotyp-unabhängig
zu sein. Das heißt,
sie kann mit jedwedem Typ von Weizen-Varietät verwendet werden, wobei sowohl Winter-
als auch Sommerweizen eingeschlossen sind. Sie kann verwendet werden,
um transgene Weizenpflanzen aus Sommer-Kultivaren, wie beispielsweise
Bobwhite und Marshall, sowie Winter-Kultivaren, wie beispielsweise
Neeley, zu produzieren.
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Die
vorliegende Erfindung wird verwendet, um Fremd-DNA in regenerierbares
Pflanzengewebe einzuführen.
Jeglicher Typ von Fremd-DNA kann in die Pflanzenspezies unter Anwendung
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung inseriert werden. Im Allgemeinen
kann "Fremd-DNA" so definiert werden,
dass jedweder Typ von DNA eingeschlossen ist, welcher in eine Pflanzenzelle
von dem Äußeren der
Pflanzenzelle her eingeführt
wird. Verfahren zum Inserieren von DNA in Pflanzenzellen sind im
Allgemeinen gut bekannt, wie etwa ein Beschuss unter Anwendung einer
Vorrichtung, welche im U.S.-Patent Nr. 5 179 022 beschrieben wird.
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Der
Typ von DNA, der in der Fremd-DNA eingeschlossen ist, kann DNA,
welche bereits in der Pflanzenzelle vorhanden ist, DNA aus einer
anderen Pflanze, DNA aus einem unterschiedlichen Organismus, oder eine
extern erzeugte DNA, wie eine DNA-Sequenz, die eine Antisense-Botschaft
eines Pflanzengens enthält, oder
eine DNA-Sequenz, die eine synthetische Version eines Gens codiert,
bei der die Nukleotidsequenz modifiziert worden ist, einschließen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
die Fremd-DNA eine DNA-Sequenz,
welche in einem regenerierbaren Pflanzengewebe als ein selektierbarer
Marker wirken kann. Eine derartige DNA kann ein Gen einschließen, welches
in einem regenerierbaren Pflanzengewebe so fungieren würde, eine
Verbindung zu produzieren, welche dem Pflanzengewebe Resistenz gegen
eine ansonsten toxische Verbindung verleihen würde. Diese Gene sind im Fachgebiet
gut bekannt und können
Resistenz gegen Verbindungen, wie Antibiotika, wie Kanamycin (Dekeyser
et al., Plant Physiol., 90, 217–223
(1989)) und Herbizide, wie Glyphosat (Della-Cioppa et al., Bio/Technology,
5, 579–584
(1987)) und Bialaphos (Vasil et al. (1992)) verleihen. Andere selektierbare
Marker können
innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Der
erste Schritt in der vorliegenden Erfindung besteht darin, regenerierbares
Gewebe aus einer Pflanze zu isolieren. Jedwedes regenerierbare Pflanzengewebe
kann gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Regenerierbares Pflanzengewebe bezieht
sich im Allgemeinen auf Gewebe, welches nach Insertion von Fremd-DNA
zu einer differenzierten Pflanze regeneriert werden kann. Zum Beispiel
können
derartige Gewebe Calli und/oder Embryoide aus Antheren bzw. Staubbeuteln
(Zhou und Konzak, Crop Sci., 29, 817–821 (1989)), Mikrosporen (Ziauddin
et al., Plant Cell Rep., 11, 489–493 (1992)), Infloreszenzen
(Barcelo et al., Plant Journal, 5, 583–592 (1994)) und Blattgeweben
(Conger et al., Plant Cell Reports, 6, 345–347 (1987)) einschließen.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein unreifer Embryo aus einer Pflanze
als ein Ausgangsmaterial verwendet. Unreife Embryonen können unter
Verwendung von bekannten Verfahren, welche im Fachgebiet beschrieben
sind, produziert werden. Zum Beispiel wird die Herstellung von unreifen Weizenembryonen
von Weeks et al., (1993) und Vasil et al. (1993) beschrieben.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den regenerierbaren
Pflanzengeweben um Calli. Die bevorzugten Calli sind embryogene
Calli. Embryogene Calli werden aus unreifen Embryonen hergestellt.
Diese Calli können
durch Isolieren und Kultivieren von unreifen Embryonen auf einem
Nährstoffmedium
mit Kohlenhydrat und Pflanzenwachstumsregulatoren produziert werden.
In der bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, wenn embryogene Calli aus Weizen produziert
werden, die Eliminierung der Embryo-Achse, wie beschrieben von Nehra
et al., Plant J., 5, 285–297 (1994),
nicht notwendig.
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Callus
produzierende Medien sind im Fachgebiet gut bekannt, und jedwedes
Kulturmedium oder Präparationsverfahren
kann verwendet werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird, wenn Weizen-Calli hergestellt
werden, ein unreifer Weizenembryo 1 Tag bis zu einem Monat lang,
vorzugsweise 4 bis 7 Tage lang, auf einem modifizierten MS-Medium
kultiviert, welches 40 g/l Maltose und 2 mg/l 2,4-D umfasst. In
einer anderen Ausführungsform
kann das 2,4-D ersetzt werden durch eine Kombination von 0,5 mg/l
2,4-D und 2,2 mg/l Picloram. Das Medium wird durch 2 g/l GELRITE® oder
4 g/l niedrigschmelzende Agarose verfestigt.
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Sobald
das regenerierbare Pflanzengewebe isoliert ist, besteht der zweite
Schritt des Verfahrens in der Einbringung der Fremd-DNA in das Pflanzengewebe.
Dieses Verfahren wird hierin auch als "Transformation" bezeichnet. Jedwedes Verfahren kann
angewandt werden, um die Fremd-DNA in das regenerierbare Pflanzengewebe
einzuführen.
Derartige Verfahren schließen
Beschuss (Weeks et al. (1993); Vasil et al. (1992)), Agrobacterium-Transformation
(Chan et al., Plant Molecular Biology, 22, 491–506 (1993)), Elektroporation
von regenerierbaren Geweben (Shillito et al., Bio-Technology, 3,
1099–1103
(1985)) und Protoplasten-erleichterte Gen-Zuführung (Shimamoto et al. (1989);
Datta et al. (1990)) ein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das regenerierbare Gewebe unter Anwendung des Beschuss-Verfahrens
transformiert. In dieser Ausführungsform
wird es ebenfalls bevorzugt, dass ein Callusgewebe, am stärksten bevorzugt
ein embryogener Callus, verwendet wird. Nach dem Beschuss kann dieser
Callus während
einer kurzen Zeitdauer vor der Regeneration oder Selektion wachsen
gelassen werden, oder kann, gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung, unverzüglich
sowohl Regenerations- als auch Selektionsbedingungen unterzogen
werden. Mit anderen Transformationsverfahren kann diese Zeitdauer
wünschenswert
sein, oder nicht, abhängig
von der angewandten Selektionsmethode.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird das regenerierbare Gewebe während einer kurzen Zeitdauer
nach dem Beschuss wachsen gelassen. Das für diese Wachstumsperiode verwendete
Medium enthält vorzugsweise
keinerlei Selektionseinrichtung oder Medium, das zur Herstellung
von Trieben in der Lage ist. Die Anwendung einer Wachstumsperiode
hängt von
der verwendeten Selektionseinrichtung ab. Einige Selektionseinrichtungen
nutzen die Verwendung von größerem oder älterem Callusgewebe,
bevor eine Selektion ausgeübt
wird. Diese Wachstumsdauer beläuft
sich auf etwa 1 Tag.
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Nach
der Transformation wird das regenerierbare Pflanzengewebe in einem
Medium, das zur Herstellung von Trieben aus dem regenerierbaren
Gewebe in der Lage ist, platziert, wobei das Medium ferner eine Verbindung
enthält,
die zum Selektieren von regenerierbarem Gewebe, welches die selektierbaren
DNA-Sequenzen enthalten,
verwendet wird. Dies steht im Gegensatz zum Stand der Technik, worin
regenerierbares Pflanzengewebe im Allgemeinen zuerst einer ausgedehnten
Selektionsperiode vor Exposition des regenerierbaren Gewebes an
ein zur Erzeugung von Trieben fähiges
Medium unterzogen wird.
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Das
in diesem Schritt verwendete Medium kann jedwedes Medium sein, welches
die Bildung von Trieben aus dem regenerierbaren Gewebe erlaubt.
In einer Ausführungsform
wird eine Triebe erzeugende Verbindung dem Medium zuge setzt. Diese
Triebe erzeugenden Verbindungen sind im Fachgebiet gut bekannt (Murashige
und Skoog, Physiol. Plant, 15, 473–497 (1962); Kasha et al.,
Gene Manipulation in Plant Improvement II, 213–239 (1990)). Solche Verbindungen
schließen
schwache Pflanzenwachstumsregulatoren ein und schließen IAA,
IBA und BA bei niedrigen Konzentrationen ein (Becker et al. (1994);
Vasil et al. (1992)). In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann
ein von einem Pflanzenwachstumsregulator freies Medium verwendet
werden, um die Triebbildung zu induzieren (Weeks et al. (1993)).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform,
worin ein embryogener Weizen-Callus regeneriert werden soll, umfasst
das Medium ein modifiziertes MS-Medium mit 0,2 mg/l 2,4-D (Murashige
und Skoog (1962); Wan und Lemaux (1994)).
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Das
regenerierbare Pflanzengewebe wird in der vorliegenden Erfindung
im Allgemeinen in diesem Medium so rasch wie möglich nach der Transformation
platziert. Dies kann im Allgemeinen im Bereich von 1 Tag bis drei
Wochen, aber bevorzugt von 1 Tag bis zwei Wochen erfolgen. Am stärksten bevorzugt
wird das Gewebe auf dieses Medium eine Woche bis zwei Wochen nach
der Transformation überführt. In
den meisten Fällen
wird die Überführung zwischen
5 und 11 Tagen stattfinden.
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Die
zum Selektieren von regenerierbarem Gewebe, das die selektierbaren
DNA-Sequenzen umfasst, verwendete
Verbindung kann jedwede einer Vielzahl von gut bekannten Selektionsverbindungen,
wie Antibiotika und Herbiziden, sein. Bevorzugte Verbindungen können Kanamycin
(Dekeyser et al. (1989)), Glyphosat (Della-Coppa et al. (1987))
und Bialaphos (Vasil et al. (1992); Weeks et al. (1993)) einschließen.
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Die
Verfügbarkeit
von alternativen Selektionsmitteln ist eine wichtige Anforderung
für die
kommerzielle Anwendung von Landwirtschafts-Biotechnologie. Die Verwendung
von Kanamycin ist für
Getreidenutzpflanzen wegen des hohen endogenen Niveaus an Toleranz
weniger erfolgreich gewesen (Dekeyser et al. (1989)). Bialaphos
ist im breiten Umfang als ein Selektionsmittel in der Getrei denutzpflanzen-Transformation
verwendet worden (Weeks et al. (1993); Vasil et al. (1993); Becker
et al. (1994); Nehra et al. (1994); Wan und Lemaux (1993)). Allerdings
könnte
es potenziell ein Desaster sein, ausschließlich Bialaphos-Resistenz codierende Gene
als einen selektierbaren Marker in allen Transformationsexperimenten
zu verwenden. Andere selektierbare Marker werden benötigt, und
unsere Ergebnisse zeigen, dass das hierin beschriebene rasche Regenerations-System
gut mit verschiedenen Selektionsmitteln arbeitet.
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Nachdem
Triebe gebildet worden sind, werden die Triebe auf ein zweites Medium überführt, das
fähig zur
Erzeugung von Wurzeln aus den Trieben ist. Dieses Medium kann ferner
eine Verbindung enthalten, die verwendet wird, um regenerierbares
Gewebe, das die selektierbaren DNA-Sequenzen enthält, zu selektieren. Das Überführen auf
dieses Medium findet statt, wenn sich ausreichend Triebe entwickelt
haben, wie es allgemein im Fachgebiet bekannt ist. Dies findet für Weizen
innerhalb von 25 bis 40 Tagen nach der Transformation statt.
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Das
zur Erzeugung von Wurzeln fähige
Medium kann jedwedes wurzelerzeugende Medium sein. Diese Medien
sind im Fachgebiet gut bekannt (Weeks et al. (1993); Vasil et al.
(1992)). Ein bevorzugtes wurzelerzeugendes Medium ist ein modifiziertes
MS-Medium ohne irgendeinen Pflanzenwachstumsregulator (Murashige
und Skoog (1962); Zhou et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture,
30, 78–83,
(1992)).
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Sobald
sich Wurzeln gebildet haben, können
die Pflanzen dann in Erdboden überführt und
unter Befolgung von im Fachgebiet bekannten Verfahren wachsen gelassen
werden, um Samen zu produzieren.
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Ein
Vorteil des oben beschriebenen Transformations- und Regenerationsverfahrens
ist, dass aus diesem Verfahren erhaltene Pflanzen im Allgemeinen
fruchtbar sind. Der Verlust der Fruchtbarkeit bei transgenen Pflanzen
unter Anwendung von Verfahren des Stands der Technik ist angenommenermaßen auf
die Langfrist-Kulturen vor und nach den Transformationsbehandlungen
zurückzuführen und
nicht auf den Vorgang der Transformation per se.
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Ein
anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die
derzeitigen Biolistik-Beschussverfahren 4 bis 6 Monate erfordern,
um transgene Pflanzen zu erhalten (Becker et al. (1994); Vasil et
al. (1992), (1993); Weeks et al. (1993)). Die beschossenen regenerierbaren
Gewebe von diesen Verfahren des Stands der Technik wurden auf Selektionsmedien
während
2 bis 3 Monaten oder länger
subkultiviert, um eine Callus-Proliferation zu gestatten. Durch
Verringern der Zeit der Callus-Proliferations-Kultur erfordert das
hier beschriebene rasche Regenerationsverfahren weniger als 2 Monate,
um transgene Pflanzen zu erhalten.
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Die
Anwendung des vorliegenden Verfahrens verursachte auch, dass transformierte
Gewebe sich viel schneller regenerieren. Die Regeneranten waren
auch kräftiger
und gesünder,
sowohl in Kultur als auch in Erdboden.
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Das
hierin beschriebene rasche Regenerationssystem erzeugt des weiteren üblicherweise
gleichmäßige, nicht-chimäre Transformanten.
Bei dem raschen Regenerationsverfahren sind embryogene Callus-Sektoren
beim Stadium der Regeneration üblicherweise
klein. Deshalb wird nur ein einziger Trieb aus jedem Callus-Sektor
regeneriert. Die histochemische Analyse hinsichtlich stabiler GUS-Aktivität zeigte,
dass Blattsegmente aus unterschiedlichen Teilen der transgenen Pflanzen
im Allgemeinen bezüglich
der GUS-Expression gleichförmig
waren. Eine Nachkommenschafts-Analyse zeigt auch, dass die meisten
der transgenen Pflanzen bei 3:1-Verhältnissen zwischen toleranten
und sensitiven Pflanzen, wie ein einzelnes dominantes Gen, segregierten.
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Die
folgenden Beispiele beschreiben spezifische Ausführungsformen der Erfindung.
Die verwendeten Medien werden in der Tabelle 9 beschrieben. Die
Beispiele sind angegeben, um die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung
besser aufzuklären
und sollten nicht in irgendeiner Weise interpretiert werden, um
den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
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BEISPIEL 1: Transformation
unter Verwendung von CP4 und GOX als selektierbare Marker
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- 1. Unreife Embryo-Kultur Ein Sommerweizen Triticum
aestivum cv. Bobwhite wurde durchweg in dieser Studie verwendet.
Vorrats-Pflanzen wurden in einer umweltmäßig regulierten Wachstumskammer
bei einer Lichtdauer von 16 h bei 800 μmol m–2s–1,
vorgesehen durch Hochintensitäts-Entladungs(HID)-Sylvania-Leuchten (GTE Products
Corp., Manchester, NH. 03103) wachsen gelassen. Die Tages/Nacht-Temperaturen
beliefen sich auf 18/16°C.
Unreife Caryopsen wurden von den Pflanzen 14 Tage nach der Anthese abgesammelt.
Unreife Embryonen ("UE") wurden zerschnitten
und auf einem modifizierten MS-Medium (Murashige und Skoog-Salze,
Gibco BRL) kultiviert, das mit 40 g/l Maltose, 0,5 mg/l 2,4-D und
2,2 mg/l Picloram ergänzt
war (CM4). Die unreifen Embryonen wurden bei 26°C im Dunklen kultiviert.
- 2. DNA-Zuführung
Fünf Tage
nach dem Beginn der Kultur wurden unreife Embryonen in ein Osmoticum-Behandlungsmedium
4 h vor dem Beschuss überführt. Das
Osmoticum-Medium war das gleiche CM4 mit 0,35 M Mannitol. Dreißig bis
40 Embryonen wurden in die Mitte von jeder Platte platziert, und
die Embryonen wurden mit einer Mischung von pMON19305 und pMON19328
bei einem Verhältnis
von 1:1 beschossen. pMON19305 enthält das uidA-Gen, wohingegen
pMCN19328 die CP4- und GOX-Glyphosattoleranz-Gene trägt. CP4
ist ein Gen für
bakterielle 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), welches
ein Enzym exprimiert, das gegenüber
Glyphosat in hohem Maße
resistent ist. Die Glyphosatoxidoreduktase (GOX) ist ein bakterielles
Gen, welches Glyphosat zu Aminomethylphosphonsäure abbaut. Alle Gene wurde
von dem Mais-Ubiquitin-Ubi1-Promotor (Christensen et al. (1992))
angetrieben. Jede Platte wurde zweimal mit einer PDS 1000-Pulverkanone
beschossen. Hohe Niveaus an transienter GUS-Expression wurden für jeden
Beschuss in jedem Experiment beobachtet, was anzeigt, dass das DNA-Zuführungsverfahren sehr
effizient war.
- 3. Regeneration von Glyphosat-toleranten Pflanzen Nach einer
16-h-Nachbeschuss-Behandlung
auf dem 0,35 M Mannitol-Medium wurden die beschossenen Embryonen
für eine
einwöchige
Verzögerung
der Selektion auf CM4-Medium (Tabelle 1) überführt. Bei diesem Schritt wurden
zwei Embryonen von jeder beschossenen Platte für transiente GUS-Assays als
Proben entnommen. Nach einer Verzögerung von einer oder zwei
Wochen wurden die Embryonen auf ein CM4-Medium, welches 4 mM Glyphosat
enthielt, überführt. Nach
einer bis zwei Wochen Callus-Proliferations-Kultur auf diesem Selektionsmedium
wurden die Embryonen auf Regenerationsmedien überführt, welche 0,1 mM Glyphosat
enthielten (Protokoll 1). In manchen Fällen wurden die beschossenen
Embryonen direkt auf das Regenerationsmedium ein bis zwei Wochen
nach dem Beschießen überführt (Protokoll
2). Aus den Regenerationsmedien erhaltene Triebe wurden in ein Bewurzelungsmedium,
welches 0,02 mM Glyphosat enthielt, überführt. Tolerante Pflanzen wurden
in Erdboden überführt und
in einer umweltmäßig regulierten
Wachstumskammer, wie beschrieben, wachsen gelassen. Zwei Wochen
später
wurden die Pflanzen mit 56 mg/m2 (8 oz/a)
ROUNDUP® (Wirkstoff Glyphosat,
Monsanto) besprüht.
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Protokoll
1: Die rasche Transformations-Regenerations-Methode für Glyphosatselektion – reduzierte
Callusproliferations-Kultur.
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Protokoll
2: Die rasche Transformations-Regenerations-Methode für Glyphosatselektion – eliminierte
Callusproliferations-Kultur.
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Auf
Callus-Proliferationsmedien bestand kein sichtbarer Unterschied
bei der Embryogenese zwischen den mit und ohne Plasmid-DNA beschossenen
Geweben. Bei Überführung auf
Regenerationsmedium wurden jedoch grüne Triebe aus den transformierten
Embryonen regeneriert, wohingegen keine Triebe aus ohne Plasmid-DNA
beschossenen Kontrollen gewonnen wurden. Wir waren in der Lage,
Glyphosat-tolerante Triebe aus den meisten Experimenten zu gewinnen.
Durchschnittlich erzeugten etwa 1–2% der beschossenen Embryonen
Glyphosat-tolerante Pflanzen (siehe Tabelle 1). Unter unseren experimentellen
Bedingungen war die Transformationseffizienz mit dem alten Verfahren
sehr niedrig. Etwa 0,05% der beschossenen Embryonen erzeugten Glyphosat-tolerante
Pflanzen (Tabelle 2). Die Transformationseffizienz aus dem raschen
Verfahren war 25fach höher
als jene aus dem alten Verfahren. Die Transformationsfrequenz aus
dem alten Verfahren war gleichwertig zu denjenigen der Bialaphos-Selektion, welche
früher
von anderen Arbeitsgruppen berichtet wurde (Vasil et al. 1992, 1993;
Weeks et al. 1993; Nehra et al. 1994). Tabelle
1. Glyphosat-tolerante Pflanzen, gewonnen aus unterschiedlichen
Selektions-Regenerations-Schemen durch das rasche Regenerationsverfahren.
![Figure 00130002](https://patentimages.storage.googleapis.com/75/9c/6f/6bd3f3914216d7/00130002.png)
![Figure 00140001](https://patentimages.storage.googleapis.com/1a/ba/e0/0c45ad9021652c/00140001.png)
- Exp.:
Experiment; Beh.: Behandlung; UE: Unreife Embryonen; GUS: β-Glucuronidase.
Tabelle
2. Zusammenfassung von Glyphosat-toleranten Pflanzen, produziert
von dem alten und dem raschen Regenerationsverfahren - Exp.: Experiment; Beh.: Behandlung; UE:
Unreife Embryonen; Freq.: Frequenz
- 4.
Enzym-Assay von CP4- und GOX-transformierten Pflanzen Rohproteine
wurden aus frischen Blättern von
transgenen Pflanzen unter Befolgung eines BioRad-Verfahrens extrahiert.
CP4- und GOX-Proteine wurden durch Antikörper sondiert und als Prozentsätze von
Gesamtproteinen berechnet. Die transgenen Pflanzen enthielten 0,007–0,160%
und 0,004–0,062%
GOX, was äquivalent
zu einer früher
bestätigten transgenen
Pflanze war (Tabelle 3). Fünf
transgene Pflanzen wiesen keine CP4-Expression auf. Die Glyphosat-Toleranz
dieser Pflanzen wurde wahrscheinlich von dem GOX-Gen vermittelt. Tabelle
3. Stabile GUS-Expression und prozentuale CP4- und GOX-Protein-Gehalte von Glyphosat-toleranten
Pflanzen.
- 5. Nachkommenschafts-Analyse von Glyphosat-toleranten Pflanzen
Unreife Embryonen aus den Glyphosat-toleranten Pflanzen wurden 20
Tage nach der Anthese isoliert und auf einem Keimungsmedium (MMS-Medium
ohne Pflanzenwachstumsregulator) mit 0,02 mM Glyphosat kultiviert.
Gekeimte und nicht-gekeimte
Embryonen wurden 10 Tage nach der Kultur separiert und aufgezeichnet,
und die Daten wurden durch den X2-Test für eine 3:1-Segregation
analysiert (Tabelle 4). Der X2-Test zeigte,
dass das Transgen bei einem 3:1 Verhältnis segregierte, wie erwartet.
Die toleranten Pflanzen wurden dann in Erdboden umgepflanzt und
mit 56 mg/m2 (8 oz/a) ROUNDUP® besprüht. Individuen,
welche auf den Selektionsmedien keimten, waren ebenfalls tolerant
gegenüber
der Besprühung.
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Tabelle
4. Keimungstest von Embryonen aus Glyphosat-toleranten R
0-Pflanzen.
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BEISPIEL 2: Transformation
unter Verwendung des bar-Gens als einem selektierbaren Marker
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- 1. Transformation und Selektion Das Transformationsverfahren
für das
bar-Gen war im Wesentlichen
das gleiche wie für
die CP4- und GOX-Gene. Unreife Embryonen wurden mit dem pAHC25 beschossen,
welches das bar- und das uidA-Gen trägt. Beide Gene wurden von dem
Ubiq1-Promotor gesteuert. Das bar-Gen kodiert Phosphinothricinacetyltransferase
(PAT), welche Phosphinothricin, den Wirkstoff des nicht-selektiven
Herbizids Basta® (Hoechst
AG), acetyliert. Die beschossenen Embryonen wurden einen Tag nach
dem Beschuss auf das MMS2-Medium mit 4 mg/l Bialaphos überführt (Protokoll
3). Protokoll
3: Das rasche Regenerations-System zur bar-Gen-Transformation.
- 2. Regeneration von Bialaphos toleranten Pflanzen Im Anschluß an eine
bis zwei Wochen dauernde Callusproliferation auf dem MMS2-Medium
wurden die Embryonen zu einem MMS0-Regenerationsmedium mit 4 mg/l
Bialaphos überführt. Triebe
und Pflanzen aus dem Regenerationsmedium wurden in Eisbecher mit
dem gleichem Medium zur Bewurzelung überführt. Bialaphos-tolerante Pflanzen
wurden gewonnen und innerhalb von zwei Monaten auf Erdboden überführt. Aus
einer Gesamtheit von 828 beschossenen Embryonen in den drei Experimenten
erzeugten 566 Embryonen Bialaphos-tolerante Pflanzen (Tabelle 5).
Etwa 15% der Embryonen produzierten eine Einzelpflanze, 20% von
ihnen 2 Pflanzen, 40% 3 Pflanzen und 25% 4 oder mehr Pflanzen. Jeder
Embryo wurde als ein einzelnes Transformationsereignis gezählt, ungeachtet der
Anzahl gewonnener Pflanzen. Ein Drittel (190 von 566) der Transformationsereignisse
waren GUS-positiv. Die GUS-Aktivität variierte häufig unter
individuellen Ereignissen, von vollständig dunkelblau bis zu blauen
Streifen in vaskulären
Geweben oder blauen Punkten, welche statistisch auf den Blättern verstreut waren.
Die Transformationsfrequenz mit Bialaphos-Selektion war viel höher als
mit Glyphosat, unter unseren experimentellen Bedingungen, und 10-
bis 100fach höher
als jene, welche früher
für Weizen
und Gerste berichtet wurden (Vasil et al., 1992, 1993; Weeks et
al., 1993; Nehra et al., 1994; Wan und Lemaux, 1993). Tabelle
5. Bialaphos-tolerante Pflanzen, gewonnen durch das rasche Regenerationssystem.
- Exp.: Experiment; Beh.: Behandlung; GUS: β-Glucuronidase.
- 3. Besprühen
mit Basta® Eine
Probe von 20 Bialaphos-toleranten Pflanzen wurde in Erdboden überführt und
mit 1% Basta® (200
g/l Glufosinat, Hoechst AG) besprüht. Kontrollpflanzen zeigten
Nekrose und Bräunung
3 Tage nach dem Besprühen.
Die beschädigten
Blätter
wurden gelb und trockneten später.
Zehn der 20 Bialaphos-toleranten Pflanzen zeigten keinerlei nekrotische
Schädigungen
nach dem Besprühen.
- 4. PAT-Assay Die Basta®-toleranten Pflanzen wurden
hinsichtlich PAT-Aktivität
unter Befolgung des Verfahrens von De Block et al. (EMBO J., 6,
2513–2518,
1987) analysiert. Alle Basta®-toleranten Pflanzen waren PAT-positiv,
wohingegen keine PAT-Aktivität
in Bobwhite-Kontrollpflanzen beobachtet wurde (Tabelle 6).
- 5. Keimungs-Test und Nachkommenschafts-Analyse Die Basta®-toleranten
Pflanzen wuchsen normal und bildeten Samen. Unreife Embryonen von
den Pflanzen wurden auf einem Keimungsmedium mit 2 mg/l Bialaphos
kultiviert. Unreife Embryonen aus Bobwhite-Kontrollpflanzen konnten
auf dem Bialaphos-Selektionsmedium
nicht keimen, wohingegen Embryonen von den Basta®-toleranten Pflanzen
zu toleranten und sensitiven [Pflanzen] segregierten. Zwei der zehn
Pflanzen zeigten 3:1-Segregationsverhältnisse, wie erwartet. Fünf wiesen
eine geringere Segregation als 3:1 auf, wohingegen die anderen drei
keine toleranten Embryonen produzierten (Tabelle 6). Zu diesem Zeitpunkt
ist es unbekannt, was die unerwartete Segregation verursacht hat.
Sie könnte
auf die geringe Größe von Proben
oder auf Gen-Stille zurückzuführen sein. Nichtsdestotrotz
demonstrierte die Erzeugung von Bialaphos-toleranten Pflanzen, dass
das rasche Regenerationssystem von selektierbaren Markern oder jeglichem
Gen von Interesse unabhängig
ist.
-
Tabelle
6. Keimungstest für
Bialaphos-tolerante R
0-Pflanzen, welche
aus dem raschen Regenerationssystem gewonnen wurden.
-
- GUS: β-Glucuronidase;
PAT: Phosphinothricinacetyltransferase.
-
BEISIPIEL 3: Transformation
unter Verwendung des nptII-Gens als einem selektierbaren Marker
-
Das
rasche Transformations-Regenerations-System wurde auch mit Paromomycin-Selektion
für das nptII-Gen
verdeutlicht.
- 1. Unreife Embryo-Kultur Ein
Sommerweizen Triticum aestivum cv. Bobwhite wurde durchweg in dieser
Studie verwendet. Zucht-Pflanzen wurden in einer umweltmäßig regulierten
Wachstumskammer bei einer Lichtdauer von 16 h bei 800 μmol m–2s–1,
vorgesehen durch Hochintensitäts-Entladungs(HID)-Sylvania-Leuchten (GTE Corp.),
wachsen gelassen. Die Tages/Nacht-Temperaturen beliefen sich auf
18/16°C. Unreife
Caryopsen wurden von den Pflanzen 13 oder 14 Tage nach der Anthese
abgesammelt und auf einem modifizierten MS-Medium (Murashige und Skoog-Salze, Gibco
BRL) kultiviert, das mit 40 g/l Maltose, 0,5 mg/l 2,4-D und 2,2
mg/l Picloram ergänzt
war (CM4). Die unreifen Embryonen wurden bei 26°C im Dunklen kultiviert.
- 2. DNA-Zuführung
Fünf Tage
nach dem Beginn der Kultur wurden unreife Embryonen zu einem Osmoticum-Behandlungsmedium
4 Stunden vor dem Beschuss überführt. Das
Osmoticum-Medium war das gleiche CM4 mit 0,35 M Mannitol oder 0,125
M Mannitol und 0,125 M Raffinose. Ungefähr 40 Embryonen wurden in die
Mitte jeder Platte gesetzt, und die Embryonen wurden mit einer Mischung
von pMON19476 und pMON19468 bei einem Verhältnis von 1:1 beschossen. pMON19476
enthält
den Enhancer-verstärkten 35S-Promotor
aus CaMV (Odell et al., 1985, Kay et al., 1987), das NPTII-Gen (Fraley
et al., 1983) und den NOS-Terminator aus dem Nopalinsynthase-Gen
(Fraley et al., 1983). pMON19468 trägt den uidA (welches Beta-Glucuronidase
(GUS) kodiert) von Escherichia coli (Jefferson et al., 1986) und
den NOS-Terminator. Sowohl das nptII- als auch das GUS-Gen wurden
von dem 35S-Promotor (Odell et al., 1985, Kay et al., 1987) gesteuert.
Jede Platte wurde zweimal mit einer PDS 1000-Pulverkanone beschossen, wie ausführlich beschrieben
von Klein et al., 1987. Hohe Niveaus an transienter GUS-Expression
(ein Durchschnitt von 84 Flecken pro Embryo) wurden beobachtet,
was anzeigt, dass das DNA-Zuführungsverfahren
sehr effizient war.
- 3. Regeneration von Paromomycin-toleranten Pflanzen Nach einer
18stündigen
Nachbeschuss-Behandlung auf dem 0,35 M Mannitol-Medium, oder einer
Kombination von 0,125 M Mannitol- und 0,125 M Raffinose-Medium,
wurden die beschossenen Embryonen auf das CM4-Medium überführt (Tabelle
9) für
eine 6- oder 7-tägige Verzögerung der
Selektion. In diesem Stadium wurden zwei Embryonen aus jeder beschossenen
Platte für
transiente GUS-Assays als Probe entnommen. Nach einer Verzögerung von
6 oder 7 Tagen wurden die Embryonen auf ein CM4-Medium, das 100,
200 oder 300 mg/l Paromomycin enthielt, für die Callusproliferation überführt. Ein
anderer Satz von Embryonen wurde direkt auf Regenerationsmedium überführt, welches
100 oder 200 mg/l Paromomycin enthielt (Protokoll 4). In einigen
Fällen
wurden die beschossenen Embryonen direkt auf das Regenerationsmedium
ein bis zwei Wochen nach dem Beschuss überführt (Protokoll 5). Aus den
Regenerationsmedien erhaltene Triebe wurden auf ein Bewurzelungsmedium,
welches kein selektives Mittel enthielt, überführt (Tabelle 9). Pflanzen wurden
hinsichtlich GUS durch histochemische Analyse bewertet. Positive
Pflanzen und einige negative Pflanzen (Kontrollen) wurden in Erdboden überführt und
in einer umweltmäßig regulierten
Wachstumskammer wie beschrieben wachsen gelassen.
- 4. Nachkommenschafts-Analyse von Paromomycin-toleranten Pflanzen.
Unreife Embryonen aus den Paromomycin-toleranten Pflanzen wurden
20 Tage nach der Anthese isoliert und auf einem Keimungsmedium (MMS0-Medium
ohne Pflanzenwachstumsregulator) mit 100 mg/l Paromomycin kultiviert.
Gekeimte und nicht-gekeimte Embryonen wurden 10 Tage nach der Kultur
separiert und aufgezeichnet, und die Daten wurden durch den X2-Test bzgl. der 3:1-Segregation analysiert (Tabelle 8).
Der X2-Test zeigte, dass das Transgen nicht
bei einem 3:1-Verhältnis,
wie erwartet, segregierte.
-
Protokoll
4: Das rasche Regenerationssystem für Paromomycin-Selektion-reduzierte Callusproliferations-Kultur.
-
Protokoll
5: Das rasche Regenerationssystem für Paromomycin-Selektion-eliminierte Callusproliferations-Kultur.
-
Auf
Callus-Proliferationsmedien wurde etwas von dem Callus weiß und hörte auf
zu proliferieren, während
einige Teile des Callus gelb blieben und proliferierten. Sowohl
die gelben, als auch die weißen
Callusgewebe erschienen kompakt und embryogen. Die ohne Plasmid-DNA
beschossenen Gewebe proliferierten nicht und wurden bleich. Bei Überführung auf
Regenerationsmedium wurden grüne
Triebe aus den transformierten Embryonen regeneriert, wohingegen
keine Triebe aus ohne Plasmid-DNA beschossenen Kontrollen gewonnen
wurden. Wir waren in der Lage, Paromomycin-tolerante Triebe aus
allen Experimenten zu gewinnen.
-
Durchschnittlich
erzeugten etwa 0,3–4%
beschossene Embryonen GUS-positive
Paromomycin-tolerante Pflanzen (Tabelle 7). Das Protokoll 4 erzeugte
2 und 4% GUS-positive Pflanzen, wohingegen das Protokoll 5 0,3 bis
1% GUS-positive
Pflanzen produzierte. Beide Protokolle produzierten höhere Transformationsfrequenzen
als diejenigen von Bialaphos-Selektion, welche früher von
anderen Gruppen berichtet wurden (Vasil et al., 1992, 1993; Weeks
et al., 1993). Tabelle
7. Paromomycin-selektierte Pflanzen, gewonnen aus verschiedenen
Selektions-Regenerations-Schemen durch das rasche Regenerations-Verfahren.
Tabelle
8. Paromomycin-Keimungs-Assay an R
1-Nachkommenschaft
aus Pflanzen, welche mit dem nptII-Gen transformiert waren.
- * Pflanzen, transformiert
mit entweder:
pMON19476 (E35S/HSP70/NPTII) + pMON19468 (E35S/HSP70/GUS)
oder
pMON19476 (E35S/HSP70/NPTII) + BC17 (Anthocyanin).
Tabelle
9. Gewebekulturmedien, verwendet für Weizencallus-Entwicklung
und Regeneration von Pflanzenzellen. - * Basales MS-Medium, beschrieben
in (Zhou et al., 1993)
2 g/l Gelrite werden für alle Medien
verwendet, außer
Paromomycin-Selektionsmedium, welches 4 g/l Agarose enthält.