ES2274515T3 - Generacion rapida y eficaz de pantas transgenicas. - Google Patents

Generacion rapida y eficaz de pantas transgenicas. Download PDF

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Abstract

SE PRESENTA UN SISTEMA RAPIDO DE REGENERACION DE TRANSFORMACION. CON EL SISTEMA PASAN DOS O TRES MESES ANTES DE QUE SE OBTENGAN PLANTAS TRANSGENICAS. LOS RENDIMIENTOS DE TRANSFORMACION SON MUY ALTOS. ESTE SISTEMA TAMBIEN SE HA DEMOSTRADO CON MUCHOS SISTEMAS DE SELECCION DIFERENTES Y ES PARTICULARMENTE UTIL PARA LA TRANSFORMACION DE TRIGO.

Description

Regeneración rápida y eficaz de plantas transgénicas.
La presente invención está relacionada con plantas modificadas genéticamente. En particular, está relacionada con un procedimiento para regenerar células de plantas que han sido transformadas.
Antecedentes
Durante la pasada década, se ha hecho posible la transferencia de genes de una amplia gama de organismos a plantas de cultivo mediante la tecnología de ADN recombinante. Este avance ha proporcionado grandes oportunidades para mejorar la resistencia de las plantas a plagas, enfermedades y herbicidas, y para modificar los procesos biosintéticos para cambiar la calidad de productos derivados de las plantas (Knutson et al., PNAS, USA 89: 2624-2628, 1992; Piorier et al., Science, 256: 520-523, 1992; Vasil et al., Bio/Technology, 10: 667-674, 1992). Sin embargo, la disponibilidad de un procedimiento eficiente de transformación para introducir el ADN extraño ha constituido una barrera sustancial para la mayoría de las especies monocotiledóneas, que incluyen el maíz, arroz, avena, cebada y particularmente trigo.
Actualmente, se utilizan dos procedimientos de transformación alternativos para especies monocotiledóneas: transferencia directa de ADN en protoplastos aislados y liberación mediada por microproyectiles (Shimamoto et al., Nature, 338: 274-276, 1989; Fromm et al., Bio/Technology, 8: 833-839, 1990).
Los procedimientos de protoplasto han sido ampliamente utilizados en arroz, donde el ADN se libera a los protoplastos mediante liposomas, PEG y electroporación. Mientras que se han obtenido un gran número de plantas trasgénicas en diversos laboratorios (Shimamoto et al., 1989; Datta et al., Bio/Technology, 8: 736-740, 1990), los procedimientos de protoplasto requieren el establecimiento de cultivos embriogénicos en suspensión de larga duración. Algunas plantas regeneradas a partir de protoplastos no son fértiles y son anormales fenotípicamente debido a la larga duración del cultivo en suspensión (Davey et al., J. of Exp. Botany, 42: 1129-1169, 1991; Rhodes et al., Sience, 240: 204-207, 1988).
La liberación de ADN mediada por el procedimiento de microproyectiles puede utilizar embriones inmaduros o embriones inmaduros derivados de callos como tejidos diana. Se han obtenido plantas transgénicas por el procedimiento de bombardeo con microproyectiles en maíz, avena, cebada y trigo (Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2: 603-618. 1990; Somers et al., Bio/Technology, 10: 1589-1594, 1992; Wan et al., Plant Physiol., 104: 37-48, 1994; Vasil et al., 1992).
El procedimiento de bombardeo con microproyectiles requiere generalmente de 10 a 15 meses para obtener plantas trasgénicas (Gordon-Kamm (1990); Vasil et al. (1992). Incluso con mejoras más recientes en los procedimientos de transformación utilizando embriones inmaduros como tejido diana, todavía se requiere de 4 a 6 meses para recuperar plantas transgénicas (Weeks et al., Plant Physiol., 102: 1077-1084, 1993; Vasil et al., 1992; Vasil et al., Bio/Technology, 11: 1153-1158, 1993; Becket et al., Plant J., 5: 299-307, 1994). Además, estos procedimientos adolecen frecuentemente de una perdida de fertilidad de las plantas recuperadas (Vasil et al., 1993; Becket et al., 1994. Adicionalmente, la frecuencia de transformación por estos procedimientos es muy baja, aproximadamente un evento de cada mil embriones bombardeados. Esta eficiencia de transformación es muy baja para estudios genéticos y para aplicaciones comerciales.
Así, existe una necesidad no sólo de un procedimiento más rápido de regeneración del tejido de la planta transformada, sino también hay necesidad de un procedimiento para retener la fertilidad en las plantas resultantes y producir una eficiencia de transformación mayor.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un sistema rápido y eficiente de transformación y regeneración. La presente invención es particularmente útil para la trasformación y regeneración de plantas de trigo. Las plantas regeneradas por este sistema son fenotípicamente normales y totalmente fértiles. Los transgenes se transmiten a la progenie R_{1} de una forma Mendeliana.
En una forma de realización preferida, la presente invención proporciona un sistema rápido de regeneración y eficiente para la transformación de un cultivo de monocotiledóneas utilizando embriones inmaduros proliferados como tejido diana. Con el nuevo sistema se obtienen plantas transgénicas en menos de dos meses. Las frecuencias de transformación por este nuevo sistema son de 5 a 100 veces mayores que con los procedimientos actuales utilizados en otros laboratorios. Este nuevo sistema se puede utilizar con una variedad de sistemas de marcadores de selección, que incluyen selección utilizando herbicidas, tales como el glifosato y el bialafos, así como antibióticos tales como la kanamicina.
La presente invención proporciona un procedimiento para la regeneración de una planta monocotiledónea, transformada para que contenga un ADN extraño, que incluye las siguientes etapas:
a)
aislamiento de un tejido regenerable de la planta;
b)
inserción del mencionado ADN extraño en dicho tejido regenerable, en el que dicho ADN extraño incluye una secuencia de ADN para la selección, en el que dicha secuencia funciona como marcador de selección en un tejido regenerable y mantenimiento de dicho tejido regenerable durante un día en un medio que no contiene ningún compuesto de selección;
c)
colocación de dicho tejido regenerable obtenido en la etapa b) en un medio adecuado para que se produzcan brotes a partir de dicho tejido, en el que dicho medio contiene adicionalmente un compuesto adecuado para seleccionar el tejido regenerable que contiene las secuencias de ADN de selección y
d)
transferencia del brote, después de que se haya formado al menos un brote en la etapa c), a un segundo medio adecuado para que se produzcan raíces a partir del brote.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se puede utilizar con plantas de cualquier especie. Es especialmente útil para especies de plantas monocotiledóneas. Más particularmente, es útil en especies de plantas que no permanecen en un estado calloso durante largos periodos de tiempo sin perder su capacidad de regeneración. Una especie particularmente adecuada en la presente invención es el trigo.
La presente invención, cuando se aplica al trigo, tiene la ventaja de ser independiente del genotipo. Esto es, se puede utilizar con cualquier tipo de variedad de trigo, incluyendo tanto el trigo de invierno como el de primavera. Se puede utilizar para producir plantas de trigo transgénico a partir de cultivares de primavera tales como, por ejemplo, Bobwhite y Marshall, así como de cultivares de invierno, tales como por ejemplo, Neeley.
La presente invención se utiliza para introducir ADN extraño en un tejido regenerable de la planta. Se puede insertar cualquier tipo de ADN extraño en especies de plantas utilizando el procedimiento de la presente invención. Generalmente, la definición de "ADN extraño" puede incluir cualquier tipo de ADN que proviene de fuera de la célula vegetal que se inserta en una célula de la planta. Los procedimientos de inserción de ADN en células vegetales son generalmente bien conocidos, como es el bombardeo que utiliza el dispositivo descrito en la Patente de EE.UU. No. 5.179.022.
El tipo de ADN incluido en el ADN extraño puede incluir ADN que está ya presente en la célula de esa planta, ADN de otra planta, ADN de un organismo diferente, o un ADN generado externamente, tal como una secuencia de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen de la planta, o una secuencia de ADN que codifica una versión sintética de un gen en el que se ha modificado la secuencia de nucleótidos.
En una forma de realización preferida, el ADN extraño contiene una secuencia de ADN que puede funcionar en un tejido regenerable de la planta como un marcador de selección. Tal ADN puede incluir un gen que funcionaría en un tejido regenerable de la planta para producir un compuesto que conferiría resistencia al tejido de la planta frente a un compuesto de otro modo tóxico. Estos genes son bien conocidos en el campo y confieren resistencia a compuestos tales como antibióticos como la kanamicina (Dekeyser et al., Plant Physiol., 90: 217-223, 1989), y herbicidas como el glifosato (Della-Cioppa et al., Bio/Technology, 5: 579-584, 1987 y el bialafos (Vasil et al., 1992). Se pueden utilizar otros marcadores de selección en el ámbito de la presente invención.
La primera etapa en la presente invención es el aislamiento del tejido regenerable de una planta. Se puede utilizar cualquier tejido de la planta de acuerdo con la presente invención. Los tejidos regenerables de la planta se refieren a tejidos que después de la inserción de un ADN extraño se pueden regenerar en una planta diferenciada. Por ejemplo tales tejidos pueden incluir callos y/o embrioides de anteras (Zhou and Konzak, Crop Sci., 29: 817-821, 1989), microsporas (Ziauddin et al., Plant Cell Rep., 11: 489-493, 1992), inflorescencias (Barcelo et al., Plant Journal, 5: 583-592, 1994) y en tejido de hojas (Conger et al., Plant Cell Reports, 6: 345-347, 1987).
En una forma de realización de la presente invención, se utiliza un embrión inmaduro de una planta como material de partida. Se pueden producir embriones inmaduros utilizando procedimientos conocidos descritos en el campo. Por ejemplo, en Weeks et al., 1993 y Vasil et al., 1993 se describe la producción de embriones inmaduros de trigo.
En otra forma de realización preferida de la presente invención, los tejidos regenerables de la planta son callos. Los callos preferidos son los callos embriogénicos. Los callos embriogénicos se producen a partir de embriones inmaduros. Estos callos se pueden producir por aislamiento y cultivo de embriones inmaduros sobre un medio nutriente con carbohidratos y reguladores del crecimiento de la planta. En la forma de realización preferida de la presente invención, cuando se producen callos embriogénicos de trigo, la eliminación del eje del embrión, como describe Nehra et al., Plant J., 5: 285-297, 1994, no es necesaria.
Los medios para producir callos son bien conocidos en el campo y se puede utilizar cualquier medio o procedimiento de preparación. En la forma de realización preferida, cuando se preparan callos de trigo, el embrión inmaduro de trigo se cultiva de un día a un mes, preferiblemente de 4 a 7 días, sobre un medio MS modificado que incluye 40 g/l de maltosa y 2 mg/l de 2,4-D. En otra forma de realización el 2,4-D se puede reemplazar por una combinación de 0,5 mg/l de 2,4-D y 2,2 mg/l de picloram. El medio se solidifica por 2 g/l de GELRITE® ó 4 g/l de agarosa de bajo punto de fusión.
Una vez que se aísla el tejido regenerable de la planta, la segunda etapa del procedimiento es introducir el ADN extraño en el tejido de la planta. Este proceso se refiere también aquí como "transformación". Se puede utilizar cualquier procedimiento para insertar el ADN extraño en el tejido regenerable de la planta. Tales procedimientos incluyen bombardeo (Weeks et al., 1993; Vasil et al., 1992), transformación por Agrobacterium (Chan et al., Plant Molecular Biology, 22: 491-506, 1993, electroporación de tejidos regenerables (Shillito et al., Bio-Technology, 3: 1099-1103, 1985) y liberación de genes facilitada por protoplastos (Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990).
En una forma de realización preferida, el tejido regenerable se transforma utilizando el procedimiento de bombardeo. En esta forma de realización, se prefiere también la utilización de un tejido calloso, más preferiblemente un callo embriogénico. Después del bombardeo, este callo se puede cultivar durante un corto periodo de tiempo antes de la regeneración o selección o, de acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, se puede someter inmediatamente a condiciones tanto de regeneración como de selección. Con otros procedimientos de transformación, este periodo puede o puede no ser deseable, dependiendo del procedimiento de selección utilizado.
En una forma de realización de la invención, el tejido regenerable se cultiva durante un corto periodo después del bombardeo. El medio utilizado para este periodo de crecimiento no contiene preferiblemente ningún mecanismo de selección o ningún medio capaz de producir brotes. La utilización de un periodo de crecimiento depende del mecanismo de selección utilizado. Algunos mecanismos de selección se benefician de la utilización de un tejido calloso más grande o de mayor edad antes de aplicar la selección. Este periodo de crecimiento es aproximadamente un día.
Después de la transformación, el tejido regenerable de la planta se coloca en un medio capaz de producir brotes a partir del tejido regenerable, en el que el medio contiene adicionalmente un compuesto utilizado para seleccionar el tejido regenerable que contiene las secuencias de ADN de selección. Esto contrasta con técnicas anteriores en el campo en las que el tejido regenerable de la planta se sometía en primer lugar a un periodo prolongado de selección antes de exponer el tejido regenerable a un medio capaz de producir brotes.
El medio utilizado en esta etapa puede ser cualquier medio que permita la formación de brotes a partir de un tejido regenerable. En una forma de realización, el compuesto productor de brotes se añade al medio. Estos compuestos productores de brotes son bien conocidos en el campo (Murashige y Skoog, Physiol. Plant., 15: 473-497, 1962; Kasha et al., Gene Manipulation in Plant Improvement II, 213-239, 1990). Tales compuestos incluyen reguladores del crecimiento de la planta débiles e incluyen IAA, IBA y BA a bajas concentraciones (Becker et al., 1994; Vasil et al., 1992). En otra forma de realización de la invención, se puede utilizar un medio libre de un regulador del crecimiento celular para inducir la formación de brotes (Weeks et al., 1993).
En una forma de realización preferida en la que se va a regenerar un callo embriogénico de trigo, el medio incluye un medio MS modificado con 0.2 mg/l de 2,4-D (Murashige y Skoog, 1962; Wan y Lemaux, 1994).
En la presente invención, el tejido regenerable de la planta se coloca generalmente en este medio lo más rápidamente posible después de la transformación. Generalmente, esto puede variar de un día a tres semanas, pero es preferible de un día a dos semanas. Más preferiblemente el tejido se transfiere a este medio entre una semana a dos semanas después de la transformación. En la mayoría de los casos, la transferencia ocurrirá entre cinco y once días.
El compuesto utilizado para seleccionar el tejido regenerable que contiene las secuencias de DNA de selección puede ser cualquiera de la variedad de los compuestos de selección bien conocidos, tales como antibióticos y herbicidas. Los compuestos preferidos pueden incluir kanamicina (Dekeyser et al., 1989), glifosato (Della-Coppa et al., 1987) y bialafos (Vasil et al., 1992; Weeks et al., 1993).
La disponibilidad de agentes de selección alternativos es un requerimiento importante para la aplicación comercial de la agricultura biotecnológica. La utilización de kanamicina ha tenido menos éxito para cultivos de cereales debido al alto nivel de tolerancia endógeno (Dekeyser et al., 1989). El bialafos ha sido ampliamente utilizado como agente de selección en la transformación de cultivos de cereales (Weeks et al., 1993; Vasil et al. 1993; Becker et al., 1994; Nehra et al., 1994; Wan y Lemaux, 1993). Sin embargo, podría ser potencialmente un desastre utilizar exclusivamente genes que codifican resistencia a bialafos como marcador de selección en todos los experimentos de transformación. Son necesarios otros marcadores de selección y nuestros resultados demuestran que el sistema rápido de regeneración descrito aquí funciona bien con diferentes agentes de selección.
Después de la formación de brotes, éstos se transfieren a un segundo medio adecuado para la generación de raíces a partir de dichos brotes. Este medio puede contener adicionalmente un compuesto utilizado para seleccionar el tejido regenerable que contiene las secuencias de ADN de selección. La transferencia a este medio tiene lugar cuando se han desarrollado suficientes brotes, como es generalmente conocido en el campo. Esto ocurre, para el trigo, entre 25 a 40 días después de la transformación.
El medio adecuado para la producción de raíces puede ser cualquier medio productor de raíces. Estos medios son bien conocidos en el campo (Weeks et al., 1993; Vasil et al. 1992). Un medio para la producción de raíces preferido es un medio MS modificado sin ningún regulador del crecimiento de la planta (Murashige y Skoog, 1962; Zhou et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture, 30: 78-83, 1992).
Una vez que se han formado las raíces, las plantas se pueden transferir a tierra y cultivarse siguiendo los procedimientos conocidos en el campo para producir semillas.
Una ventaja del procedimiento de transformación y regeneración descrito anteriormente es que las plantas obtenidas mediante este proceso son generalmente fértiles. La pérdida de fertilidad entre plantas transgénicas, utilizando procedimientos anteriores en el campo, se cree que son atribuibles a largos periodos de cultivo antes y después de los tratamientos de transformación más que al hecho de trasformación por sí mismo.
Otra ventaja de la presente invención es que los procedimientos de bombardeo por biobalística actuales requieren de 4 a 6 meses para obtener plantas transgénicas (Becker et al., 1994; Vasil et al., 1992, 1993; Weeks et al., 1993). Los tejidos regenerables bombardeados de estos procedimientos anteriores en el campo se cultivaban en medio de selección de 2 a 3 meses o más para permitir la proliferación del callo. Mediante la reducción del tiempo de cultivo para la proliferación del callo, el procedimiento rápido de regeneración descrito aquí requiere menos de 2 meses para obtener plantas transgénicas.
La utilización del presente procedimiento provocaba también una regeneración mucho más rápida de los tejidos transformados. Los regenerantes eran también más vigorosos y saludables tanto en cultivo como en el suelo.
El sistema rápido de regeneración descrito aquí produce también, generalmente, transformantes uniformes no quiméricos. Con el procedimiento rápido de regeneración, los segmentos de callo embriogénico son generalmente pequeños en la etapa de regeneración. Por tanto, un único brote se regenera de cada segmento de callo. Los análisis histoquímicos de actividad GUS estable mostraban que los segmentos de hoja de diferentes partes de las plantas transgénicas eran generalmente uniformes en la expresión de GUS. Los análisis de la progenie también indican que la mayoría de las plantas transgénicas segregaban a relaciones 3:1 entre las plantas tolerantes y sensibles como un único gen dominante.
Los ejemplos siguientes describen formas de realización específicas de la invención. Los medios utilizados se describen en la Tabla 9. Los ejemplos se proporcionan para un mejor entendimiento de la práctica de la presente invención y no deberían interpretarse de forma alguna que limite el ámbito de la presente invención.
Ejemplo 1 Transformación utilizando CP4 y GOX como marcadores de selección 1. Cultivo de embriones inmaduros
Se utilizó un trigo de primavera Triticum aestivum cv. Bobwhite a lo largo de este estudio. Las plantas se cultivaron en una cámara con condiciones ambientales controladas con un fotoperiodo de 16 h a 800 \mumol m^{-2}s^{-1} proporcionado por luces Sylvania de alta intensidad de descarga (HID) (GTE Products Corp., Manchester, NH. 03103). Las temperaturas día/noche fueron de 18/16ºC. Los cariopses inmaduros se recogieron de las plantas de 1-4 días después de la antesis. Los embriones inmaduros ("EI") se desecaron y se cultivaron sobre un medio MS modificado (sales de Murashige y Skoog, Gibco BRL) suplementado con 40 g/l de maltosa, 0,5 mg/l de 2,4-D y 2,2 mg/l de picloram (CM4). Los embriones inmaduros se cultivaron a 26ºC en la oscuridad.
2. Liberación del ADN
Cinco días después de la iniciación del cultivo, los embriones inmaduros se transfirieron a un medio de tratamiento osmótico 4 h antes del bombardeo. El medio osmótico fue el mismo CM4 con 0,35 M manitol. Treinta de los cuarenta embriones se colocaron en el centro de cada placa, y los embriones se bombardearon con una mezcla de pMON19305 y pMON19328 a una relación 1:1. pMON19305 contiene el gen uidA mientras que pMON19328 lleva los genes de tolerancia a glifosato CP4 y GOX. CP4 es el gen bacteriano de la 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que codifica una enzima altamente resistente a glifosato. El gen bacteriano de la glifosato oxidoreductasa (GOX) codifica una enzima que degrada glifosato a ácido aminometilfosfónico. Todos los genes estaban controlados por el promotor Ubi1 de la ubiquitina (Christensen et al., 1992). Cada placa se bombardeo dos veces con una pistola de pólvora PDS 1000. Se observaron altos niveles de expresión transitoria de GUS por cada bombardeo en cada experimento, lo que indicaba que el procedimiento de liberación del ADN era muy eficiente.
3. Regeneración de las plantas tolerantes a glifosato
Después de un tratamiento de 16 h posterior al bombardeo sobre medio con 0,35 M manitol, los embriones bombardeados se transfirieron a medio CM4 (Tabla 1) para un periodo de selección de una semana. En esta etapa, dos embriones de cada placa bombardeada se analizaron en ensayos de expresión transitoria de GUS. Después de un periodo de una o dos semanas, los embriones se transfirieron a un medio CM4 que contenía 4 mM glifosato. Tras cultivo de proliferación del callo de una a dos semanas en este medio de selección, los embriones se transfirieron a un medio de regeneración que contenía 0,1 mM de glifosato (Protocolo 1). En algunos casos, los embriones bombardeados se transfirieron directamente al medio de regeneración de una a dos semanas después del bombardeo (Protocolo 2). Los brotes obtenidos de cada medio de regeneración se transfirieron a un medio de crecimiento de raíces que contenía 0,02 mM de glifosato. Las plantas tolerantes se transfirieron a tierra y crecieron en una cámara de crecimiento con ambiente controlado como se describió. Dos semanas después, las plantas se pulverizaron con 56 mg/m^{2} (8 oz/a) de ROUNDUP® (ingrediente activo glifosato, Monsanto).
Protocolo 1
Procedimiento rápido de transformación y regeneración mediante selección por glifosato y cultivo de proliferación reducido del callo
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo 2
Procedimiento rápido de transformación y regeneración mediante selección por glifosato eliminando el cultivo de proliferación del callo
2
No hay diferencias visuales en la embriogénesis entre los tejidos bombardeados con y sin ADN del plásmido en el medio de proliferación del callo. Sin embargo, cuando se transfieren al medio de regeneración, los brotes verdes se regeneraron a partir de los embriones transformados mientras que no se recuperaron brotes en los controles bombardeados sin ADN del plásmido. Fuimos capaces de recuperar brotes tolerantes a glifosato en la mayoría de los experimentos. Como media, aproximadamente 1-2% de los embriones bombardeados produjeron plantas tolerantes a glifosato (ver Tabla 1). Bajo nuestras condiciones experimentales, la eficiencia de transformación con el procedimiento antiguo fue muy baja. Aproximadamente 0,05% de los embriones bombardeados produjeron plantas tolerantes a glifosato (Tabla 2). La eficiencia de transformación del procedimiento rápido fue 25 veces más alta que la del procedimiento antiguo. La frecuencia de transformación del procedimiento antiguo fue equivalente a aquellas selecciones por bialafos previamente descrita por otros grupos (Vasil et al., 1992, 1993; Weeks et al., 1993; Nehra et al., 1994).
TABLA 1 Plantas tolerantes a glifosato recuperadas con diferentes regímenes de selección y regeneración por el procedimiento rápido de regeneración
3
Expt: experimento; Trt: tratamiento; E.I.: embriones inmaduros; GUS: \beta-glucuronidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Resumen de las plantas tolerantes a glifosato producidas mediante los procedimientos de regeneración antiguo y rápido
4
Expt: experimento; Trt: tratamiento; E.I.: embriones inmaduros; Frec.: frecuencia
4. Ensayo enzimático en plantas transformadas con CP4 y GOX
Las proteínas crudas se extrajeron de hojas frescas de plantas transgénicas siguiendo el procedimiento de BioRad. Las proteínas CP4 y GOX se analizaron mediante anticuerpos y se calcularon como porcentajes de las proteínas totales. Las plantas transgénicas contenían de 0,007-0,160% y de 0,004-0,062% de GOX, que eran equivalentes a los obtenidos con una planta transgénica previamente confirmada (Tabla 3). Cinco plantas transgénicas no tenían expresión de CP4. Probablemente el gen GOX confería la tolerancia a glifosato en estas plantas.
TABLA 3 Expresión estable de GUS y porcentaje del contenido de proteínas CP4 y GOX de las plantas tolerantes a glifosato
5
5. Análisis de la progenie de plantas tolerantes a glifosato
Los embriones inmaduros de las plantas tolerantes a glifosato se aislaron 20 días después de la antesis y se cultivaron en un medio de germinación (medio MMS sin un regulador del crecimiento de la planta) con 0,02 mM de glifosato. Los embriones germinados y no germinados se separaron y se analizaron 10 días después del cultivo y los datos se analizaron por un análisis de X^{2} para la segregación 3:1 (Tabla 4). El análisis de X^{2} indicó que el transgen segregaba a una relación 3:1 como se esperaba. Las plantas tolerantes se transplantaron a tierra y se pulverizaron con 56 mg/m^{2} (8 oz/a) de ROUNDUP®. Los individuos que germinaron en el medio de selección también eran tolerantes a la pulverización.
TABLA 4 Análisis de germinación de los embriones de la R_{0} de plantas tolerantes a glifosato
6
Ejemplo 2 Transformación utilizando el gen bar como marcador de selección 1. Transformación y selección
El procedimiento de transformación para el gen bar fue esencialmente el mismo que para los genes CP4 y GOX. Los embriones inmaduros se bombardearon con pAHC25, que lleva los genes bar y uidA. Ambos genes están dirigidos por el promotor Ubiq1. El gen bar codifica fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) que acetila fosfinotricina, ingrediente activo del herbicida no selectivo Basta® (Hoechst AG). Los embriones bombardeados se transfirieron a medio MMS2 con 4 mg/l de bialafos un día después del bombardeo (Protocolo 3).
Protocolo 3
Sistema rápido de regeneración para la transformación del gen bar
7
2. Regeneración de las plantas tolerantes a bialafos
Después de una a dos semanas de proliferación del callo en medio MMS2, los embriones se transfirieron a medio de regeneración MMSO con 4 mg/l de bialafos. Los brotes y plantas del medio de regeneración se transfirieron a recipientes de poliespán con el mismo medio para la formación de raíces. En dos meses, las plantas tolerantes a bialafos se recuperaron y se transfirieron a tierra. De un total de 828 embriones bombardeados en los tres experimentos, 566 embriones produjeron plantas tolerantes a bialafos (Tabla 5). Aproximadamente el 15% de los embriones produjeron una única planta, 20% de ellos 2 plantas, 40% 3 plantas y 25% cuatro o más plantas. Cada embrión se contó como un único evento de transformación independientemente del número de plantas recuperado. Un tercio (190 de 566) de los eventos de transformación fueron positivos para GUS. A menudo variaba la actividad GUS entre los eventos individuales, desde completamente azul oscuro a bandas azules en los tejidos vasculares o manchas azules repartidas al azar sobre las hojas. La frecuencia de transformación con selección con bialafos fue mucho más alta que con glifosato bajo nuestras condiciones experimentales, y de 10 a 100 veces más alta que las descritas previamente para trigo y cebada (Vasil et al., 1992, 1993; Weeks et al., 1993; Nehra et al., 1994; Wan and Lemaux,
1993).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Plantas resistentes a bialafos recuperadas mediante el sistema rápido de regeneración
8
Expt: experimento; Trt: tratamiento, GUS: \beta-glucuronidasa.
3. Pulverización con Basta®
Una muestra de 20 plantas tolerantes a bialafos se transfirieron a tierra y se pulverizaron con 1% de Basta® (200 g/l de glufosinato, Hoechst AG). Las plantas control mostraron necrosis y se pusieron marrones 3 días después de la pulverización. Las hojas dañadas se volvieron amarillas y se secaron a continuación. Diez de las 20 plantas tolerantes a bialafos no mostramos ninguna lesión necrótica después de la pulverización.
4. Ensayo de PAT
Las plantas tolerantes a Basta® se analizaron para actividad PAT siguiendo el procedimiento de De Block et al., Embo J., 6: 2513-2518, 1987. Todas las plantas tolerantes a Basta® fueron positivas para PAT, mientras que no se observó actividad PAT en las plantas control Bobwhite (Tabla 6).
5. Análisis de germinación y de progenie
Las plantas tolerantes a Basta® crecieron normalmente y generaron semillas. Los embriones inmaduros de las plantas se cultivaron en un medio de germinación con 2 mg/l de bialafos. Los embriones inmaduros de las plantas control Bobwhite no pudieron germinar en el medio de selección con bialafos, mientras que los embriones de las plantas tolerantes a Basta® segregaron en plantas tolerantes y sensibles. Dos de las diez plantas mostraron relaciones de segregación de 3:1 como se esperaba. Cinco tuvieron una segregación menor de 3:1 mientras que otras tres no produjeron embriones tolerantes (Tabla 6). No se sabe en este momento que provocó la segregación inesperada. Podría ser debida al tamaño pequeño de las muestras o a silenciamiento de un gen. No obstante, la producción de plantas tolerantes a bialafos demostró que el sistema rápido de regeneración es independiente de los marcadores de selección o de cualquier gen de interés.
TABLA 6 Análisis de germinación en la R_{0} de plantas tolerantes a bialafos recuperadas con el sistema rápido de regeneración
9
GUS: \beta-glucuronidasa; PAT: fosfinotricin-acetil transferasa
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Transformación utilizando el gen nptII como marcador de selección
El sistema rápido de transformación y regeneración se demostró también con el gen nptII que confiere selección a paromomicina.
1. Cultivo de embriones inmaduros
A lo largo de este estudio se utilizó el trigo de primavera Triticum aestivum cv. Bobwhite. Las plantas se crecieron en una cámara de crecimiento con ambiente controlado con un fotoperiodo de 16 h a 800 \mumol m^{-2}s^{-1} proporcionado por una descarga de alta intensidad (HID) Sylvania (GTE Corp.). Las temperaturas día/noche fueron 18/16ºC. Los cariopses inmaduros se recogieron 13 a 14 días después de la antesis y se cultivaron en medio MS modificado (sales de Murashige y Skoog, Gibco BRL) suplementado con 40 g/l de maltosa, 0,5 mg/l de 2,4-D y 2,2 mg/l de picloram (CM4). Los embriones inmaduros se cultivaron a 26ºC en la oscuridad.
2. Liberación del ADN
Cinco días después de la iniciación del cultivo, los embriones inmaduros se transfirieron a un medio de tratamiento osmótico 4 h antes del bombardeo. El medio osmótico fue el mismo CM4 con 0,35 M manitol ó 0,125 M manitol y 0,125 M rafinosa. Aproximadamente cuarenta embriones se colocaron en el centro de cada placa y se bombardearon con una mezcla de pMON19476 y pMON19468 a una relación 1:1. pMON19476 contiene el enhancer del promotor 35S de CaMV (Odell et al, 1985), Kay et al., 1987), el gen NPTII (Fraley et al., 1983) y el terminador NOS del gen de la nopalina sintasa (Fraley et al., 1983). pMON19468 lleva el gen uidA (que codifica la \beta-glucuronidasa (GUS) de Escherichia coli (Jefferson et al., 1986) y el terminador de NOS. Tanto el gen nptII como el GUS estaban dirigidos por el promotor 35S (Odell et al, 1985), Kay et al., 1987). Cada placa se bombardeo dos veces con una pistola de pólvora PDS 1000 como describió en detalle en Klein et al. 1987. Se observaron altos niveles de expresión transitoria de GUS (un media de 84 puntos por embrión), lo que indicaba que el procedimiento de liberación del ADN fue muy
eficiente.
3. Regeneración de las plantas tolerantes a paromomicina
Después de un tratamiento posterior al bombardeo de 18 h en medio con 0,35 M manitol o con una combinación de 0,125 M manitol y 0,125 M rafinosa, los embriones bombardeados se transfirieron a medio CM4 (Tabla 9) durante un tiempo de 6 ó 7 días antes de la selección. En esta etapa, dos embriones de cada placa bombardeada se analizaron en ensayos para detectar expresión transitoria de GUS. Después de una demora de 6 a 7 días, los embriones se transfirieron a medio CM4, que contenía 100, 200 ó 300 mg/l de paromomicina, para la proliferación de callos. Otro grupo de embriones se transfirió directamente a medio de regeneración que contenía 100 ó 200 mg/ml de paromomicina (Protocolo 4). En algunos casos, los embriones bombardeados se transfirieron directamente al medio de regeneración de una a dos semanas después del bombardeo (Protocolo 5). Los brotes obtenidos en cada medio de regeneración se transfirieron a medio de crecimiento de raíces que no contenía agente de selección (Tabla 9). Las plantas se analizaron para GUS mediante análisis histoquímicos. Las plantas positivas y algunas plantas negativas (controles) se transfirieron a tierra y crecieron en una cámara de ambiente controlado como se
describió.
4. Análisis de la progenie de plantas tolerantes a paromomicina
Los embriones inmaduros de las plantas tolerantes a paromomicina se aislaron 20 días después de la antesis y se cultivaron en medio de germinación (medio MMSO sin un regulador del crecimiento de la planta) con 100 mg/l de paromomicina. Los embriones germinados y no germinados se separaron y se analizaron 10 días después del cultivo y los datos se analizaron mediante un análisis de X^{2} para la segregación 3:1 (Tabla 8). El análisis de X^{2} indicó que el transgen no segregaba a una relación de 3:1 como se esperaba.
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo 4
Sistema rápido de transformación y regeneración mediante selección por paromomicina y cultivo de proliferación del callo reducido
10 
\newpage
Protocolo 5
Sistema rápido de regeneración mediante selección por paromomicina eliminando el cultivo de proliferación del callo
11
Algunos callos se volvían blancos y dejaban de proliferar en el medio de proliferación, mientras que algunas partes del callo permanecían amarillas y proliferaban. Tanto los tejidos amarillos como los blancos de los callos parecían compactos y embriogénicos. Los tejidos bombardeados sin ADN del plásmido no proliferaban y se decoloraron. Cuando se transferían al medio de regeneración, se regeneraron brotes verdes de los embriones transformados, mientras que no se recuperaron brotes de los controles bombardeados sin ADN del plásmido. Fuimos capaces de recuperar brotes tolerantes a paromomicina de todos de los experimentos. Como media, aproximadamente 0,3-4% de los embriones bombardeados produjeron plantas tolerantes a paromomicina positivas para GUS (Tabla 7). El protocolo 4 produjo 2 y 4% de plantas positivas para GUS mientras que el protocolo 5 produjo de 0,3 a 1% de plantas positivas para GUS. Ambos protocolos produjeron frecuencias de transformación más altas que aquellos de selección con bialafos descritos previamente por otros grupos (Vasil et al. 1992, 1993; Weeks et al., 1993).
TABLA 7 Plantas seleccionadas con paromomicina recuperadas de diferentes regímenes de selección y regeneración por el procedimiento rápido de regeneración
12
TABLA 8 Ensayo de germinación de paromomicina en la progenie R_{1} de plantas transformadas con el gen nptII
13
*Plantas transformadas con:
\hskip0,3cm pMON19476 (E35S/HSP70/NPTII) + pMON19468 (E35S/HSP70/GUS)
\hskip0,3cm o pMON19476 (E35S/HSP70/NPTII) + BC17 antocianina) 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 9 Medio de cultivo de tejidos utilizado para el desarrollo del callo de trigo, y regeneración de las células de las plantas
14
* medio MS basal descrito en (Zhou et al. 1993)
\; \begin{minipage}[t]{150mm} se utiliza 2 g/l de gelrite en todos los medios excepto en el medio de selección de paromomicina que contiene 4 g/l de agarosa. \end{minipage}

Claims (8)

1. Un procedimiento para la regeneración de plantas monocotiledóneas, trasformadas para que contengan un ADN extraño, que incluye las etapas de:
a) aislamiento de tejido regenerable de dichas plantas;
b) inserción en dicho tejido regenerable de dicho ADN extraño, en el que dicho ADN extraño incluye una secuencia de ADN de selección, en el que dicha secuencia funciona en un tejido regenerable como marcador de selección y mantenimiento de dicho tejido regenerable durante un día en un medio que no contiene ningún compuesto de selección;
c) colocación de dicho tejido regenerable de la etapa b) en un medio capaz de producir brotes a partir de dicho tejido en el que dicho medio contiene adicionalmente un compuesto utilizado para seleccionar un tejido regenerable que contiene dicha secuencia de ADN de selección; y
d) después de que se haya formado al menos un brote en la etapa c), transferencia de dicho brote a un segundo medio capaz de producir raíces a partir de dicho brote.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa c) tiene un tiempo de duración de un día a dos semanas.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa c) tiene un tiempo de duración de cinco a once días.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN de selección expresa una enzima que conferirá a dicha célula de la planta resistencia a al menos uno del grupo constituido por kanamicina y paromomicina.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN de selección expresa una enzima que conferirá a dicha célula de la planta resistencia a glifosato.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN de selección expresa una enzima que conferirá a dicha célula de la planta resistencia a bialafos.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las plantas monocotiledóneas son plantas de trigo.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las plantas monocotiledóneas son plantas de trigo, etapa a) incluye aislamiento de callos embriogénicos de dichas plantas; y etapa b) incluye la inserción de dicho ADN extraño en dichos callos.
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