KR20010006474A - 선택 마커 - Google Patents

선택 마커 Download PDF

Info

Publication number
KR20010006474A
KR20010006474A KR1019997009564A KR19997009564A KR20010006474A KR 20010006474 A KR20010006474 A KR 20010006474A KR 1019997009564 A KR1019997009564 A KR 1019997009564A KR 19997009564 A KR19997009564 A KR 19997009564A KR 20010006474 A KR20010006474 A KR 20010006474A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cyanamide
plant
cells
medium
selection
Prior art date
Application number
KR1019997009564A
Other languages
English (en)
Inventor
브리지트 담
Original Assignee
레오 씨어드 멜커스
모겐 인터내셔날 나암로제 베노오트하프
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 레오 씨어드 멜커스, 모겐 인터내셔날 나암로제 베노오트하프 filed Critical 레오 씨어드 멜커스
Publication of KR20010006474A publication Critical patent/KR20010006474A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

본 발명은 식물 형질전환에서 선택 마커로서의 시안아미드 수화효소의 용도에 관한 것이다. 시안아미드는 제초제로서 작용하고 시안아미드 수화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식물은 시안아미드를 시안아미드 압력 하에서 생존함으로써 형질전환된 식물의 선택을 가능하게 하는 우레아로 전환시킬 수 있다.

Description

선택 마커{Selection Marker}
시안아미드(H2N-C≡N)는 다른 니트릴 유도체와 같이 식물 성장 자극 및 식물 보호를 위해 농업에 사용되는 니트릴 유도체이다. 수용액 중의 또는 그의 칼슘염 형태의 시안아미드는 물질대사에 의해 전환되면 토양에 암모니아를 제공하는 비료로서 사용된다. 그러나, 시안아미드는 제초제로서 작용한다는 이점이 더 있다. 그것을 비료로서 사용하기 위해서는 파종 전에 사용해야 한다.
시안아미드는 화학적으로 보면 니트릴류에 속한다. 니트릴기가 있는 화합물의 특성상 상대적으로 거의 일어나지 않는 일이긴 하지만, 이 기를 수화시키는 효소가 세균 및 식물에서 발견되었다(예를 들면, Nagasawa T., et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155 1008-1016; Endo T. and Watanabe I. (1989) FEBS Lett. 243 61-64). 또한, 진균류 미로테슘 베루카리아(Myrothecium verrucaria)에서도 우레아를 생성시키면서 시안아미드의 니트릴기를 수화시키는, 니트릴 수화효소가 발견되었다(Stransky H. and Amberger A. (1973) Z. Pflanzenphysiol. 70 74-87).
H2N-C≡N + HOH ⇒ H2N-CO-NH2
마이어-그라이너(Maier-Greiner) 등은 효소를 분리하고 그것을 코딩하는 유전자를 클로닝했다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4260-4264, 1991). 그들은 시안아미드와 화학적으로 근친관계에 있는 화합물도 기질로서 인식되지 않을 만큼 이 효소가 극히 협소한 기질 특이성을 나타냄을 입증하였다.
선택가능한 마커는 형질전환된 세포에 우성 표현형을 부여하여야 하며, 이것이 선택 기준으로 사용될 수 있다. 이것은 두 부류에 속한다: 선택 제제의 존재하에 세포 생육성 또는 치사율을 부여하는 유전자의 한 부류 및 세포 생존에 대해 효과가 거의 없지만 약간 구별되는 물리적 특성을 갖는 형질전환된 세포를 부여하는 유전자의 한 부류.
식물 형질전환에서, 신규 DNA를 포함하는 세포의 비율은 일반적으로 적으므로, 가장 안정한 형질전환 계획은 선택 제제의 존재하에 형질전환된 세포의 생존을 보장하는 마커를 사용한다.
이 첫번째 군의 많은 선택 마커가 알려져 있으며 수년 동안 식물 형질전환 실험에 사용되어 왔다. 카나마이신, 파로모마이신, 제네티신 및 네오마이신을 포함한 항생물질 군에 내성을 부여하는 효소 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(npt), 이미다졸리논, 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 및 피리미딜옥시벤조에이트에 내성을 부여하는 효소 아세토락테이트 합성효소(als)의 돌연변이 형태 및 하이그로마이신에 내성을 부여하는 효소 하이그로마이신 3'-O-포스포트랜스퍼라아제(hpt)가 포함된다. 또한, 클로람페니콜을 무독화하는 클로람페니콜 전이효소(cat) 및 메토트렉세이트의 독성 효과를 중화시키는 디히드로폴레이트 환원효소(dhfr)가 시판된다. 제초제 바이알라포스에 내성을 부여하기 위한 바아 유전자를 사용할 수도 있다(WO 97/05829).
이미 많은 선택 마커가 시판되고 있긴 하지만, 여전히 또다른 마커가 요구된다. 이것은 다음의 몇가지 이유 때문이다:
- 유전자도입 식물이 새로운 작제물에 의해 다시 형질전환되고 있을 때, 제2 선택 마커의 도움으로 새롭게 형성된 형질전환체를 선택할 필요가 있다.
- 상기 선택 마커가 모든 식물 종에서 이용될 수는 없다.
- 선택을 가능하게 하기 위하여 첨가되어야 하는 몇몇 화합물은 항생물질이다. 항생물질 또는 제초제에 내성을 부여하는 유전자의 전파는 병원체에 내성을 부여할 위험을 피하기 위해 가능한한 많이 최소화되어야 한다.
- 선택을 가능하게 하기 위하여 첨가되어야 하는 몇몇 화합물은 비교적 고가이다. 더 저렴한 선택 마커를 필요로 한다.
＜발명의 요약＞
본 발명은 시안아미드 수화효소(CAH)를 코딩하는 유전자의 새로운 선택 마커로서의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 이것은 식물의 형질전환에 사용될 수 있다. 이 유전자는 서열 1의 뉴클레오티드 서열 또는 시안아미드 수화효소 기능을 갖는 그의 뮤테인을 포함한다.
본 발명은 또한 CAH에 대한 코딩 서열 및 관심있는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하고, 그 벡터로 식물 또는 식물 일부 또는 식물 세포 또는 유합 조직을 형질전환하고, 형성된 형질전환체를 시안아미드 함유 배지에서 증식시키는 것을 포함하는 형질전환된 식물의 선택 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 CAH를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식물의 선택에 있어서의 시안아미드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 부분은 시안아미드 수화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 관심있는 유전자를 포함하는 발현 카세트이다. 본 발명의 또다른 부분은 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 그러한 벡터를 포함하는, 아그로박테리움속을 비롯한 숙주이다. 또한, 그러한 벡터 및(또는) 그러한 아그로박테리움속으로 형질전환된 식물은 본 발명의 일부를 형성한다.
본 출원은 신규 선택 마커, 특히 형질전환 실험에서, 더욱 구체적으로는 식물 형질전환 실험에서 선택 마커로서의 시안아미드 수화효소의 용도에 관한 것이다.
도 1은 pMOG874내의 T-DNA의 개략도이다.
도 2는 pMOG1156내의 T-DNA의 개략도이다.
도 3은 pMOG22내의 T-DNA의 개략도이다.
도 4는 pMOG1005내의 T-DNA의 개략도이다.
도 5는 pMOG1278내의 T-DNA의 개략도이다.
도 6은 pMOG1295내의 T-DNA의 개략도이다.
도 7은 pMOG1253내의 T-DNA의 개략도이다.
도 8은 pMOG873내의 발현 카세트의 개략도이다.
도 9는 pMOG617내의 발현 카세트의 개략도이다.
도 10은 둘다 시안아미드 50 ㎎/l에서 선택된 a) pMOG1156 또는 b) pMOG410으로 형질전환된 아라비돕시스(arabidopsis) 체외배양체를 나타낸다.
본 발명은 시안아미드 수화효소를 코딩하는 유전자의 선택 마커로서의 용도에 관한 것이다.
효소 시안아미드 수화효소(CAH)는 제초 활성을 갖는 화합물인 시안아미드에 내성을 부여한다. 현재, 유전자의 이러한 특성은 비형질전환된 식물과 형질전환된 식물을 구별하는 것을 돕기 위하여 형질전환 기술에 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 제초 활성 만으로는 선택 마커로서 유용한 유전자를 제조하기가 충분하지 않다. 이를 위하여, 유전자가 선택 조건에 따르는 세포에서 발현될 필요가 있다. 이것은 구성적 발현 또는 유합조직, 종자, 배형성 조직 및 분열 조직과 같은 특이 조직에서의 발현에 의한 것일 수 있다. 또한, 유전자는 독성 화합물에 대한 식물의 감수성을 임의의 잔류 독성 활성 없이 내독성으로 전환시킬 필요가 있다. 또한, 선택에 필요한 독성 화합물의 농도와 선택 유전자의 존재하에서 여전히 증식이 관찰될 수 있는 농도 사이의 아주 충분한 "영역"의 존재가 선택 마커 유전자의 사용에 중요하다. 또한, 그 시스템은 잡종 조직(즉, 모자이크식의 형질전환 및 비형질전환된 세포를 갖는 조직)에서 비형질전환된 세포가 이웃의 형질전환된 세포에 의해 보호되지 않고, 따라서 선택에서 생존하도록 충분히 세포 자발적으로 작용하여야 한다. 놀랍게도, CAH를 코딩하는 배합 유전자 및 시안아미드의 독성 특성은 선택 마커 시스템으로서의 그들의 용도에 적격이다.
본 발명은 시안아미드에 대한 그의 내성을 기준으로 형질전환체를 선택할 수 있음을 나타낸다.
추가의 이점은 시안아미드가 NH3및 CO2중에서 각종 식물에서 전환되는 우레아로 전환된다는 것이다. NH3은 식물에 의해 질소원으로서 사용될 수 있다. 이것은 내성과 선택 사이의 "영역"을 증가시키기 위한 추가의 선택 가능성이다. 통상적으로, 배지는 암모니아 및 질산염(무라쉬지 및 스쿠그(Murashige and Skoog) 배지에 함유됨, 표 2 및 4a 참조)을 함유한다. 그것이 제외되거나 또는 그의 농도가 감소된 경우, CAH 유전자를 함유하는 형질전환된 식물은 배지 중에 선택 제제로서 존재하는 시안아미드를 우레아로 전환시키고 또한 질소원으로서 사용될 수 있는 암모니아로 다시 전환시킬 것이다. 비형질전환된 식물은 그렇게 할 수가 없으므로, 그것은 또한 시안아미드의 제초제 효과 이외에 질소 흡수 면에서 길항적인 단점을 가질 것이다.
CAH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열 1로 표시된 서열이다. 또한, 이 서열의 뮤테인은 발명의 일부로서 간주될 수 있다. 뮤테인은 그의 뉴클레오티드 서열에서는 변화되지만, 서열 1로 표시된 서열과 유사한 기능적 및 면역학적 특성을 갖는 뉴클레오티드 서열이다. 이 뮤테인은 기능적 변이체로서 불리우기도 한다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 특별하게는 본 발명의 유전자 서열과 실질적으로 동일하고(아래에 기재된 바와 같이 확인됨) 본 발명의 단백질의 기능적 활성을 유지하는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 CAH 유전자의 경우에, 상기 용어는 본 명세서에 기재된 서열과 실질적인 동일성을 가지며, 여전히 시안아미드 변성 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 변이 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 동일성의 %"는 두개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 그 %는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.
"실질적인 동일성" 또는 "실질적인 유사성"이란 용어는 폴리펩티드가 엄격한 조건하에서 표적 폴리펩티드와 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 엄격한 조건은 2 * SSC의 용액 및 65 ℃의 온도를 의미한다.
"실질적으로 유사한" 폴리펩티드는 동일하지 않은 잔기 위치가 보존적 아미노산 변화에 의해 상이할 수 있는 것을 제외하고는 상기 서열을 공유한다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 의미한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 이소로이신이며, 지방족 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이며, 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이며, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며, 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다.
폴리뉴클레오티드 서열의 실질적인 동일성은 폴리뉴클레오티드가 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또다른 의미는 두 분자가 엄격한 조건하에서 서로에게 특이적으로 혼성화되는 경우 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 것이다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 다른 상황에서는 상이할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 10 ℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 정합된 프로브에 혼성화되는 온도(정해진 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 프로브의 길이 및 염기 조성 둘다의 함수인, 혼성체의 Tm은 문헌(Sambrook, T. et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (second edition), Volume 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring) 내의 정보를 이용하여 계산될 수 있다. 전형적으로, 서던 블롯 절차에 대한 엄격한 조건은 0.2 X SSC로 65 ℃에서의 세척을 포함한다. 바람직한 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에, 세척 조건은 전형적으로 6 X SSC에서 약 42 ℃이다.
본 발명은 시안아미드 수화효소 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 잡종 DNA 서열을 제공한다. 잡종 DNA 서열이란 용어는 본질적으로 천연적으로 발견되지 않는 DNA 서열을 포함하는 임의의 DNA 서열을 포함하는 것을 의미할 것이다. 예를 들면, 잡종 DNA는, 식물 게놈이 통상적으로 그의 천연 염색체 위치에서 상기 오픈 리딩 프레임의 카피를 함유한다 하더라도, 그 식물 게놈의 비천연 위치에서 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA를 포함하는 것을 의미할 것이다. 마찬가지로, 상기 오픈 리딩 프레임은 천연적으로 발견되지 않는 식물 게놈에, 또는 세균 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은, 천연적으로 발견되지 않는 레플리콘 또는 벡터에 포함될 수 있다. 잡종 DNA는 숙주에서 복제될 수 있는 DNA 분자에 제한되지 않을 것이지만, 또한 예를 들면 특정 어댑터 서열에 의해 본 발명에 따른 오픈 리딩 프레임에 물리적으로 연결된 레플리콘에 결합될 수 있는 DNA를 포함하는 것을 의미할 것이다. 오픈 리딩 프레임은 그의 천연 업스트림 및 다운스트림 조절 인자에 연결될 수 있거나 또는 연결되지 않을 수 있다.
오픈 리딩 프레임은 게놈 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 후자에서, 그것은 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 구성하는 엑손과 분리된 하나 이상의 인트론을 함유할 것이다. 오픈 리딩 프레임은 또한 하나의 비절단된 엑손에 의해, 또는 cDNA에 의해 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 mRNA로 코딩될 수도 있다. 본 발명에 따른 오픈 리딩 프레임은 또한 하나 이상의 인트론이 인공적으로 제거되거나 또는 첨가된 것을 포함한다. 이 변이체의 각각은 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 오픈 리딩 프레임은 토양 진균류 미로테슘 베루카리아에서 유래된다(Maier-Greiner, U.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4260-4264, 1991 참조).
발현된 단백질이 독성 선택 제제에 내성을 부여할 수 있는 식으로 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 본 발명에 따른 잡종 DNA는 일반적으로 그것이 숙주의 생화학적 기계류에 의해 인지되는 것을 가능하게 하고 오픈 리딩 프레임이 숙주 세포내에 전사 및 해독되도록 하는 조절 인자를 갖는 발현 카세트로 제공될 것이다. 그것은 일반적으로 선택 숙주 세포내에 발현될 수 있는 임의의 유전자로부터 적당하게 유래될 수 있는 전사 개시 영역 뿐만 아니라 리보좀 인식 및 부착을 위한 전사 개시 영역을 포함할 것이다. 진핵 식물 세포에서, 발현 카세트는 일반적으로 전사가 종결되고 일차 전사체의 폴리아데닐화가 일어나도록 하는, 상기 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 위치된 전사 종결 영역을 추가로 포함한다. 또한, 코돈 사용량은 선택 숙주의 허용된 코돈 사용량에 적합할 수 있다. 선택된 숙주 세포에서 잡종 DNA 작제물의 발현을 좌우하는 원리는 일반적으로 당 업계의 통상의 숙련인에 의해 이해되며 발현할 수 있는 잡종 DNA 작제물의 작제는 이제는 원핵 또는 진핵 생물인 임의 종류의 숙주 세포에 대해 일반적이다.
오픈 리딩 프레임이 숙주 세포내에 유지되도록 하기 위하여, 그것은 일반적으로 선택된 숙주 세포에 의해 인지되고 복제되는 DNA에 연결된 본 발명에 따른 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 레플리콘 형태로 제공될 것이다. 따라서, 레플리콘의 선택은 선택 숙주 세포에 의해 많이 좌우된다. 선택된 특별한 숙주에 적합한 레플리콘의 선택을 좌우하는 원리는 당 업계의 통상의 숙련인의 범위내에 든다.
레플리콘의 특별한 유형은 그 자체 또는 그의 일부를 식물 세포와 같은 다른 숙주 세포로 전이시킬 수 있는 것이며, 그에 의해서 본 발명에 따른 오픈 리딩 프레임을 상기 식물 세포로 동시 전이시킬 수 있다. 그러한 가능성을 가진 레플리콘은 본 명세서에서 벡터로서 칭해진다. 그러한 벡터의 예로는 아그로박테리움 투메파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti- 플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 그러한 것은 목질 종, 특히 나무 및 덩굴식물에 의한 경우일 수 있다.
"본 발명에 따른 잡종 DNA 서열을 그의 게놈내에 삽입시키는 숙주 세포"란 표현은 상기 잡종 DNA를 그의 게놈으로 적당하게 삽입시킴으로써 잡종 DNA를 유지하고 바람직하게는 그러한 잡종 DNA의 카피를 유사분열 또는 감수분열을 통해 형성되는 후대 세포로 유전시키는 세포, 및 그러한 세포를 포함하는 또는 그러한 세포를 본질적으로 함유하는 다세포 생물을 포함하는 것을 의미한다. 그러한 숙주 세포는 세균과 같은 원핵 생물 뿐만 아니라 효모와 같은 진핵 생물일 수 있다. 또한, 식물 또는 포유 동물과 같은 동물의 세포 배양액과 같은, 조직 배양액 내의 진핵 생물의 세포는 잡종 DNA를 적당하게 삽입시키는 것으로 예상될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 따라서, 상기 잡종 DNA의 하나 이상의 카피를 그의 게놈으로 삽입시키는 세포를 본질적으로 포함하고, 카피(들)을 바람직하게는 멘델 방식으로 그의 후대로 유전시킬 수 있는 식물이 제공된다. CAH를 생산하는 세포는 본 발명에 따른 잡종 DNA의 전사 및 해독에 의해 시안아미드에 대한 증가된 내성을 나타낼 것이다. 식물 세포내의 DNA의 전사를 지배하는 원리가 항상 이해되는 것은 아니지만, 시안아미드에 의해 선택되는 조직, 예를 들면 유합조직, 종자, 배태유전 조직 또는 분열조직에서 발현될 수 있는, 또는 구성적 발현될 수 있는 잡종 DNA의 형성은 이제는 일반적이다. 구성적 방식의 형질전환된 폴리뉴클레오티드의 발현에 일반적으로 사용되는 전사 개시 영역은 꽃양배추 모자이크 바이러스로부터 얻어질 수 있는 프로모터, 그중에서도 특히 아그로박테리움 투메파시엔스의 35S RNA 및 19S RNA 전사 프로모터 및 소위 T-DNA 프로모터이다. 특별히 언급되는 것은 노팔린 합성효소 프로모터, 옥토핀 합성효소 프로모터(EP 0 122 791 B1호에 기재됨) 및 만노핀 합성효소 프로모터이다. 또한, 벼 악틴 유전자 프로모터와 같은, 실질적으로 구성성일 수 있는 식물 프로모터가 이용될 수 있다. 고도의 구성 프로모터는 선택이 일어나는 조직내의 발현을 나타내야 함이 분명하긴 하지만, 프로모터의 선택이 필수적인 것은 아니다. 또한, 특정 인자, 소위 인핸서의 중복은 그의 관리하에 DNA의 발현 수준을 상당히 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(참조: Kay R. et al. (1987), Science 236, 1299-1302: CaMV 35S 프로모터의 -343 및 -90 사이의 서열의 중복은 그 프로모터의 활성을 증가시킨다). 35S 프로모터 이외에, 단독으로 또는 이중으로 증가된, 고도의 프로모터의 예는 가볍게 유도할 수 있는 리불로오스 비스포스페이트 카르복실라아제 소 서브유니트(rbcSSU) 프로모터 및 클로로필 a/b 결합 단백질(Cab) 프로모터이다. 또한, 본 발명에 의해 예상되는 것은 물리적으로 연결된 다른 프로모터 영역의 인자를 포함하는 혼성체 프로모터이다. 그의 잘 알려진 예는 CaMV 인핸서에 연결된 만노핀 합성효소 프로모터의 인자를 포함하는, 소위 CaMV 증가된 만노핀 합성효소 프로모터이다(미국 특허 제5,106,739호).
특별하게는 단자엽 식물 형질전환의 경우에, 프로모터 및 선택 마커 유전자 사이의 인트론의 사용은 발현을 증가시킨다.
따라서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 인지 및 결합 RNA 폴리머라아제 및 다른 단백질에 포함된다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.
구성 프로모터는 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
이러한 면에서 적절한 구성 프로모터의 선택은 동일한 형질전환 과정에서의 다른 프로모터의 사용에 중요하다. 프로모터의 중복은 상기 프로모터의 조절하의 유전자의 발현에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 관심있는 유전자에 의해 동시에 형질전환되는 식물의 선택에만 사용되는 것이 선택 마커의 발현의 목표이기 때문에, 선택 마커 유전자에 대한 동일한 프로모터를 이용할 때, 관심있는 유전자가 문제를 일으킬 수 있음을 명심해야 한다.
전사 종결 영역의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 그의 사용은 본 발명의 내용에서 아주 바람직하다.
다른 종의 식물에서의 본 발명의 이용성에 관해서는, 본 발명의 하나의 특별한 실시태양이 유전자도입 토마토, 감자, 벼 및 아라비돕시스 식물로 단지 예시되는 것이며, 실제의 이용성이 사실상 이들 식물 종에 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
예를 들면, 일부 식물 종이 아직 유전적 형질전환에 대해 저항성이 있어서 본 발명의 실시태양의 일부가 현재 실시될 수 없긴 하지만, 그 자체로 유전적 형질전환을 실시하는 것은 본 발명의 기본 실시태양에 적절하지 않기 때문에 그러한 식물 종에서의 본 발명의 실시는 단지 시간 문제일 뿐 원리의 문제가 아니다.
"식물의 형질전환"은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다.
식물 종의 형질전환은 이제는 모노코틸레도니애(Monocotyledoneae) 뿐만 아니라 디코틸레도니애(Dicotyledoneae) 둘다를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
토마토 형질전환은 본질적으로 문헌(Van Roekel, J.S.C., et al. Plant Cell Rep. 12, 644-647)에 기재된 바와 같이 실시되는 것이 바람직하다. 감자 형질전환은 본질적으로 문헌(Hoekema, A., et al. 7, 273-278, 1989)에 기재된 바와 같이 실시되는 것이 바람직하다.
유전적 형질전환에 대해 어느 정도 더 저항성이 있는 것으로 고려되긴 하지만, 단자엽 식물은 형질전환에 따를 수 있고 생식 유전자도입 식물은 형질전환된 세포 또는 배, 또는 다른 식물 요소로부터 재생될 수 있다. 현재, 단자엽 식물의 바람직한 형질전환 방법은 배, 체외배양체 또는 현탁 세포의 현미경적영사 충격법, 및 직접 DNA 흡수 또는 (조직) 전기천공법이다(Shimamoto, et al., Nature 338, 274-276, 1989). 유전자도입 옥수수 식물은 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 (제초제 포스피노트리신을 불활성화시키는 효소)를 코딩하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 바아-유전자를 현미경적영사 충격법에 의해 옥수수 현탁 배양액의 배형성 세포로 도입함으로써 형성되었다(Gordon-Kamm, Plant Cell, 2, 603-618, 1990). 밀 식물은 배형성 현탁 배양액의 형성을 위해 배형성의 유합조직을 선택함으로써 배형성 현탁 배양으로부터 재생되었다(Vasil, Bio/Technol. 8, 429-434, 1990). 이 작물에 대한 형질전환 시스템과의 혼합은 단자엽 식물에 대한 본 발명의 이용을 가능하게 한다.
벼 및 옥수수와 같은 상업적으로 중요한 작물을 포함한 단자엽 식물은 또한 마그로박테리움속 균주에 의한 DNA 전이에 적응할 수 있다(WO 94/00977; EP 0 159 418 B1; Gould J, Michael D, Hasegawa O, Ulian EC, Peterson G, Smith RH, Plant. Physiol. 95, 426-434, 1991 참조).
하나를 초과하는 잡종 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자도입 식물을 얻기 위하여, 다음과 같은 방법을 포함한 많은 별법이 이용될 수 있다:
A. 제2 선택가능한 마커 유전자에 물리적으로 결합된 다수의 변형 유전자를 갖는 DNA, 예를 들면 이원 플라스미드 상의 T-DNA의 사용. 이 방법의 이점은 잡종 유전자가 물리적으로 결합되고 따라서 단일 멘델 위치로서 이동하는 것이다. 본 발명은 이러한 면에서 특히 유용한데, 그 이유는 그것이 이미 존재하는 복합적인 선택가능한 마커 유전자에 이어서 제2의 선택가능한 마커가 도입될 수 있도록 하기 때문이다. 따라서, 형질전환체의 선택은 제1 선택가능한 마커의 특성과 무관하게 수행될 수 있다.
B. 다른 선택가능한 마커에 결합된 하나 이상의 잡종 유전자를 함유하는 유전자도입 식물로부터 얻은 화분에 의한, 바람직하게는 하나의 선택가능한 마커 유전자에 결합된 하나 이상의 잡종 유전자를 각각 이미 발현시킬 수 있는 유전자도입 식물의 교차 수분작용. 그후에, 이 교잡에 의해 얻어지는 종자는 두개의 선택가능한 마커의 존재를 기초로 또는 잡종 유전자 자체의 존재를 기초로 선택될 수 있다. 선택된 종자로부터 얻어지는 식물은 추가의 교잡을 위해 이후에 사용될 수 있다. 원리적으로, 잡종 유전자는 단일 위치 상에 있지 않으므로 그 유전자는 독립 위치로서 분리될 수 있다. 또한, 여기서 두 선택가능한 마커에 대한 선택권은 본 발명의 이점 중의 하나이다.
C. 각각 하나 이상의 잡종 유전자 및 하나의 선택가능한 마커를 갖는 다수의 잡종 DNA 분자, 예를 들면 플라스미드의 사용. 동시 형질전환의 빈도수가 많으면, 하나 만의 마커를 기초로 한 선택이 충분하다. 다른 경우에는, 하나를 초과하는 마커를 기초로 한 선택이 바람직하다.
D. 임의로 선택가능한 마커 유전자를 포함하는 새로운 잡종 DNA에 의한, 이미 제1, 제2 (등)의 잡종 유전자를 함유하는 유전자도입 식물의 연속적인 형질전환. 방법 B에서와 같이, 잡종 유전자는 원리적으로 단일 위치 상에 있지 않으므로 잡종 유전자는 독립 위치로서 분리될 수 있다.
E. 상기 방법들의 혼합법.
실제적인 방법은 어버이 계통의 목적과 같은 쉽게 결정될 수 있는 몇가지 사항(직접적인 성장, 육종 프로그램에서의 사용, 혼성체를 생산하기 위해 사용)에 좌우될 수 있지만, 설명된 발명 내용에 있어서 중대한 것은 아니다.
본 발명에 필수적인 것은 아니지만, 실제적으로 모든 식물은 배양된 세포 또는 조직으로부터 재생될 수 있는 것으로 알려져 있다. 재생 방법은 식물의 종에 따라 다르지만, 일반적으로 형질전환된 원형질체의 현탁액 또는 형질전환된 체외배양체를 함유하는 페트리 평판이 처음에 제공된다. 발아는 직접적으로, 또는 기관형성 또는 배형성을 통해 (유합조직으로부터) 간접적으로 유도되고 이어서 뿌리내려진다. 선택 화합물에 이어서, 배지는 일반적으로 각종 아미노산 및 호르몬, 예를 들면 오옥신 및 사이토킨을 함유할 것이다. 효율적인 재생은 배지, 유전자형 및 배양액의 처리에 좌우될 것이다. 이 세가지 변수가 조절된다면, 재생은 일반적으로 재현가능하고 반복가능하다.
형질전환된 유전자 서열을 유전자도입 식물에 안정하게 삽입시킨 후에, 그들에 의해 부여되는 특성은 유성 교잡에 의해 다른 식물로 전달될 수 있다. 교잡될 종에 따라 임의의 많은 표준 육종 기술이 이용될 수 있다.
실시예 1
이종조직 발현 카세트에서의 시안아미드 수화효소(CAH)를 코딩하는 진균류 유전자의 클로닝
a. 쌍자엽 식물에 대한 형질전환을 위한 작제물
작제물 pMOG874는 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 터미네이터에 작동적으로 연결된, 토양 진균류 미로테슘 베루카리아로부터 얻은 시안아미드 수화효소 유전자로부터의 코딩 영역을 포함한다. 이 잡종 유전자를 β-글루쿠로니다아제 코딩 영역 및 노팔린 합성효소 터미네이터를 대체하는 이원 벡터 pBI101에서 클로닝시켰다(Jefferson et al. EMBO J. 6, 3901, 1987).
그 작제물은 pRT101의 35S 프로모터 및 35S 종결 시그날 사이에 삽입된 폴리링커에 속하는 두 위치인, 식물 발현 벡터 pRT101의 부위 XhoI 및 SstI 사이에 프라이머 p1: 5'ACCGAGCTCGAATTCGGCACGAGGTTGACATGATACCTTCCTG3' 및 p2: 5'GACCTCGAGAATTCGGCACGAGGTACGATCCTACTTCCTCGC3'을 이용하는 PCR에 의해(Topfer et al. 1987, Nucl. Acids Res. 15: 5890), CAH의 899 bp cDNA 단편(Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4260-4264에 의해 공개된 서열의 위치 235-1197)의 5' 말단에 XhoI 부위를, 3' 말단에 SstI 부위를 첨가하여 얻었다.
그후에, 잡종 유전자를 PstI로 분해하여 돌출된 말단을 T4 DNA 폴리머라아제로 제거하고 단편을 pBIN19의 SmaI 부위에서 평체 클로닝시켰다(Bevan, M. Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721, 1984 참조).
작제물 pMOG1156에서는, 35S 프로모터 및 35S 터미네이터에 작동적으로 연결된 추가의 β-글루쿠로니다제 유전자를 pMOG874의 SalI 부위에 XhoI/SalI 단편으로서 삽입하였다.
두 작제물은 모두 신규 CAH 선택 마커 이외에 그것이 pBIN19 내에 있을 때 노팔린 합성효소 프로모터 및 노팔린 합성효소 터미네이터에 연결된 통상의 NPTII 선택 마커를 포함한다.
b. 단자엽 식물에 대한 형질전환을 위한 작제물
pMOG874와 동일한 제조 방식으로 발현 카세트를 고도의 카피 벡터로 클로닝시켜(pRT101, Topfer, R. et al., Nucl. Acids Res. 15, 5890, 1987) pMOG873을 형성하였다(도 8).
EcoR I 및 Sma I 부위 사이의 pMOG22의 폴리링커 내에 Kpn I 제한 부위를 도입하여 pMOG22(도 3, 1990년 1월 29일에 Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands에 번호 CBS 101.90으로 기탁됨)의 유도체를 제조하였다. 폴리링커의 배향도 또한 역전된다. pMOG1005로 명명된 이 플라스미드는 좌측 및 우측 T-DNA 경계 사이에 하이그로마이신 내성 유전자를 함유한다(도 4). 35S 프로모터 및 35S 터미네이터의 조절하에 cah 유전자를 포함하는 1.7 kb 발현 카세트는 Hind III 및 BamH I 제한 부위 사이에 클로닝된다. 이 플라스미드는 pMOG1278로 칭해진다(도 5). 이원 벡터 pMOG1295(도 6)는 pMOG1278의 유도체이며 문헌(Vancanneyt, G. et al., Mol. Gen. Genet., 220, 245-250, 1990)에 기재된 바와 같이 SalI 제한 부위내에 GUS-발현 카세트를 함유한다.
pMOG1253은 발현 카세트내에 EcoR I - Hind III 단편으로서 이중의 증가된 35S 프로모터, AlMV RNA4 리더 서열, GUS-유전자 및 nos-터미네이터 함유하는 pMOG18(Sijmons, P.C. et al., Bio/Technol. 8, 217-221, 1990)과 다르게 제조된다. 플라스미드 p35S GUS INT(Vancanneyt, 1990)는 SnaB I 및 Msc I로 분해되며; GUS 유전자 및 ST-LS1 인트론에 대한 코딩 영역의 일부를 포함하는, 형성된 426 bp 단편이 분리되고 SnaB I 및 Msc I로 선형화된 pMOG18로 클로닝된다. 형성된 플라스미드로부터, 3189 bp EcoR I - Hind III 단편이 분리되고 pMOG22로 클로닝되어 pMOG1253이 형성된다(도 7). pMOG617(도 9)은 고도의 카피 벡터 pMOG18의 Hind III 부위에서 pMOG22로부터의 하이그로마이신 발현 카세트를 클로닝시킴으로써 제조된다.
실시예 2
감자 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한 감자(Solanum tuberosum) 일반명 카르달(kardal)의 줄기 단편의 형질전환에 사용된 방법이 다음에 설명되어 있다. 시험관내 증식된 감자 식물로부터의 마디 체외배양체를 전이시킨 지 3 내지 8주 후에 사용하였다. 식물을 24 ℃에서 16시간 조명 (1700 lux) 및 21 ℃에서 8시간 암실 주기로 증식 배지(MUM)에서 증식시켰다(각종 배지는 표 2에 기재되어 있음). 약 5 ㎜의 줄기 단편을 세척 배지(WAM)로 침지된 멸균 여과지 상에서 절단하여 세척 배지를 함유하는 플라스크에 모았다. 약 300개의 체외배양체의 경우, 세척 배지를 전 배양 배지(PRM)로 대체하였다. 플라스크를 상기한 바와 동일한 배양 조건하에서 약 24시간 동안 80 rpm으로 배양시켰다. 이 연구에 사용된 모든 이원 벡터는 식물의 선택가능한 마커로서 nptII 유전자를 또한 세균의 선택가능한 마커로서 nptIII을 함유하였다. 플라스미드 pMOG410은 인트론을 함유하는 잡종 gus 유전자를 추가로 포함하였다(Vancanneyt et al. Mol. Gen. Genet., 220, 245-250, 1990). 플라스미드 pMOG1156은 gus 유전자 및 시안아미드 수화효소를 코딩하는 잡종 cah 유전자를 추가로 포함하였다. 플라스미드 pMOG874는 cah 유전자를 추가로 포함하였다. 플라스미드는 카나마이신 선택하에 이. 콜리 및 아그로박테리움 투메파시엔스에서 유지되었다.
이 연구에 사용된 아그로박테리움 균주는 C58 염색체 배경에 리팜피신 선택 마커를 포함하였다. 헬퍼 균주 EHA105의 작제는 문헌(Hood et al. (1993), Transg. Res. 2, 208-218)에 기재되어 있다.
아그로박테리아를 항생물질(리팜피신 20 ㎎/l, 카나마이신 100 ㎎/l)을 함유하는 LB 배지에서 철야로 생장시켰다. 철야 배양액을 OD600= 0.1로 희석하고 약 2시간 내에 항생물질 없이 LB에서 OD600= 0.3으로 증식시켰다. 세균 현탁액을 실온에서 1600 x g로 15분 동안 원심분리시켰다. 세균을 세척 배지에서 재현탁시키고, 동시 배양 실험에 사용하였다. 전 배양 배지를 플라스크로부터 제거하고 아그로박테리움 현탁액으로 대체하였다. 체외배양체를 세척 배지로 2회 헹군 후에 플라스크를 20분 동안 인큐베이션시켰다. 체외배양체를 멸균 여과지 상에서 건조시키고 동시 배양 배지(COM)를 함유하는 평판 상에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 그후에, 체외배양체를 후 배양 배지(POM)로 도입하고 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 체외배양체를 여러 농도의 시안아미드 또는 카나마이신을 함유하는 발아 유도 배지(SIM)로 도입하였다. 2주 후에, 체외배양체를 동일한 배지 상에서 계대 배양시키고, 약 3주 후에 체외배양체를 상기한 바와 같이 시안아미드 또는 카나마이신을 함유하는 발아 연장 배지(SEM) 상에 두었다. 새싹이 절단하기에 충분히 컸을 때, 그것을 뿌리내림 유도 배지(RIM)에 도입하였다. 그후에, 뿌리내릴 수 있는 새싹들을 시안아미드 50 ㎎/l 또는 카나마이신 30 ㎎/l을 함유하는 뿌리내림 유도 배지로 도입하였다. 동시에, 새싹의 유전자도입 특성은 뿌리내린 새싹의 작은 잎사귀를 조직화학적 gus 분석을 이용하여 GUS 유전자의 발현에 대해 시험함으로써 확인하였다. pMOG1156의 경우에는 시안아미드 함유 배지 상에서의 유전자도입 새싹의 뿌리내림이 gus 유전자의 발현과 서로 완전히 관계있는 것으로 나타났다.
감자 줄기 단편의 형질전환 빈도수 : pMOG1156 (cah-gus-nptII)
재생 동안의 선택(㎎/l) 접종된체외배양체의 수 절개된새싹의 수 뿌리내리는새싹의 수 gus +새싹의 수
시안아미드 40 48 15 2 2
시안아미드 30 48 50 12 12
시안아미드 20 48 56 6 6
카나마이신 50 48 26 16 16
pMOG410 (gus-nptII)
재생 동안의 선택(㎎/l) 접종된체외배양체의 수 절개된새싹의 수 뿌리내리는새싹의 수 gus +새싹의 수
시안아미드 40 62 0 0 0
시안아미드 30 62 10 0 0
시안아미드 20 62 48 0 0
카나마이신 50 58 24 13 12
pMOG874 (cah-nptII)
재생 동안의 선택(㎎/l) 접종된체외배양체의 수 절개된새싹의 수 뿌리내리는새싹의 수 gus +새싹의 수
시안아미드 40 58 10 1 n.d.
시안아미드 30 58 40 8 n.d.
시안아미드 20 58 81 2 n.d.
카나마이신 50 58 34 26 n.d.
n.d.: 측정되지 않음
각종 배지의 조성
배지 WAM PRM COM POM SIM SEM RIM MUM
거대 염 1x MS 1x MS 1x MS 1x MS 1x MS 1x MS 1/2x MS 1/2x MS
비타민 B5 B5 B5 B5 B5 B5 1/2R3 1/2R3
수크로오스 3% 3% 3% 3% 3% 3% 1% 1%
한천 - 0.8% 0.8% 0.8% 0.8% 0.8% 0.8% 0.8%
MES(gr/l) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8
제아틴 리보사이드(㎎/l) - 0.5 0.5 3.0 3.0 0.3 - -
2,4-D - 1.0 1.0 - - - - -
IBA - - - - - - 0.1 -
세포탁심 - - - 200 200 200 100 -
반코마이신 - - - 100 100 100 50 -
MS: Murashige and Skoog (Physiol. 15, 473-479, 1962)B5: Gamborg B5 (Gamborg, Orl et al., Exp. Cell Res. 50, 151-158, 1986)
실시예 3
토마토 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한 토마토(Lycopersicon esculentum) 일반명 멍키 메이커(Monkey Maker)의 자엽의 형질전환에 사용된 방법이 다음에 설명되어 있다. 이 형질전환 방법에 대한 이원 벡터 및 아그로박테리아 균주는 상기한 바와 동일하다.
토마토 발아종자는 24 ℃에서 16시간 조명 (1700 lux) 및 21 ℃에서 8시간 암실 주기로 발아 배지(GEM) 상에서 발아시켰다(각종 배지의 함량은 표 4a에 기재되어 있음). 5 내지 7일 된 발아종자의 자엽 체외배양체를 세척 배지(WAM)로 침지된 멸균 여과지 상에서 절단하여 동시 배양 배지(COM)를 함유하는 평판 상에 두었다. 각각 약 50개의 체외배양체를 함유하는 평판을 상기한 바와 동일한 조건하에서 철야로 인큐베이션시켰다.
예비 인큐베이션된 체외배양체를 아그로박테리움 접종물에 20분 동안 조심스럽게 침수시켰다.
체외배양체를 멸균 여과지 상에서 블롯 건조시키고 두번째 세트의 동시 배양 평판 상에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 그후에, 체외배양체를 후 배양 배지(POM)을 함유하는 평판 상에서 72시간 동안 인큐베이션시키고, 체외배양체를 여러 농도의 시안아미드 또는 카나마이신을 함유하는 발아 유도 배지(SIM)로 도입하였다. 모두 3주 후에, 체외배양체를 동일한 배지 상에서 계대 배양시켰다. 약 8-12주 후에 새싹을 절개하고 뿌리내림 유도 배지(RIM) 상에 두었다. 뿌리내릴 수 있는 새싹들을 시안아미드 50 ㎎/l 또는 카나마이신 30 ㎎/l을 함유하는 뿌리내림 유도 배지로 도입하였다. 동시에, 뿌리내린 새싹의 작은 잎사귀를 조직화학적 GUS 분석으로 gus 유전자의 발현에 대해 시험하였다.
토마토 자엽 체외배양체의 형질전환 결과 : pMOG1156 (gus-nptII-cah)
재생 동안의 선택(㎎/l) 접종된체외배양체의 수 절개된새싹의 수 뿌리내리는새싹의 수 gus +새싹의 수
시안아미드 40 30 5 3 3
시안아미드 30 30 5 0 0
시안아미드 20 30 0 0 0
카나마이신 100 30 5 3 4
pMOG410 (gus-nptII)
재생 동안의 선택(㎎/l) 접종된체외배양체의 수 절개된새싹의 수 뿌리내리는새싹의 수 gus +새싹의 수
시안아미드 40 30 0 0 0
시안아미드 30 30 3 0 0
시안아미드 20 30 0 0 0
카나마이신 100 30 4 3 3
pMOG874 (cah-nptII)
재생 동안의 선택(㎎/l) 접종된체외배양체의 수 절개된새싹의 수 뿌리내리는새싹의 수 gus +새싹의 수
시안아미드 40 35 1 1 n.d.
시안아미드 30 35 0 0 n.d.
시안아미드 20 35 2 0 n.d.
카나마이신 100 35 4 1 n.d.
n.d.: 측정되지 않음
각종 배지의 조성
배지 WAM COM POM SIM RIM GEM
MS 거대 염 1x 1x 1x 1x 1x 1/2x
비타민 B5 B5 B5 B5 B5 B5
수크로오스 3% 3% 3% - 1% 1%
글루코오스 - - - 1% - -
한천 - 0.8% 0.8% 0.8% 0.8% 0.8%
MES(gr/l) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8
제아틴 리보사이드(㎎/l) - 2.0 2.0 2.0 - -
IAA - 0.1 0.1 0.1 - -
2,4-D - 0.05 - - - -
IBA - - - - 0.25 -
카르베니실린 - - - 500 -
세포탁심 - - 200 - 300 -
반코마이신 - - 50 - - -
아세토시린곤(mM) - 0.2 - - - -
실시예 4
아라비돕시스 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 일반명 C24의 뿌리 단편의 형질전환에 사용된 방법이 다음에 설명되어 있다. 이 형질전환 방법에 대한 이원 벡터는 상기한 바와 동일하다.
아라비돕시스 종자 6 ㎎을 24 ℃에서 16시간 조명 (1700 lux) 및 21 ℃에서 8시간 암실 주기로 80 rpm에서 액상 발아 배지(GM)를 함유하는 플라스크내에서 발아시켰다(각종 배지의 함량은 표 4b에 기재되어 있음). 9일된 발아종자의 뿌리를 멸균 페트리 디쉬에 분리하고 소량의 발아 배지(GM)에 모았다. 뿌리를 약 3-5 ㎜의 단편으로 절단하고 약 100개의 체외배양체를 유합조직 유도 배지(CIM)를 함유하는 평판 상에 둔 나일론 막(O 8 ㎝)에 골고루 펼쳐 뿌렸다. 그 평판을 상기한 바와 동일한 조건하에서 3일 동안 인큐베이션시켰다.
이 연구에 사용된 아그로박테리움 균주는 C58 염색체 배경에 리팜피신 선택 마커를 포함하였다. 헬퍼 균주 MOG101의 작제는 문헌(Hood et al. (1993))에 기재되어 있다. 아그로박테리아를 항생물질(리팜피신 20 ㎎/l, 카나마이신 100 ㎎/l)을 함유하는 LB 배지에서 철야로 증식시켰다. 철야 배양액을 항생물질 없이 LB에서 1:10으로 희석하고 3시간 동안 증식시켰다. 세균 현탁액을 실온에서 1600 x g에서 15분 동안 원심분리시켰다. 세균을 GM에서 재현탁시키고, OD600= 0.1로 조정하고 동시 배양 실험에 사용하였다.
약 100개의 체외배양체를 함유하는 막을 아그로박테리움 현탁액과 함께 2분 동안 인큐베이션시키고 멸균 여과지 상에서 건조시켜 과량의 세균을 제거하였다. 체외배양체를 가진 막을 CIM 평판 상에서 48시간 동안 배양시켰다. 막 및 체외배양체를 액상 GM으로 헹군 후에, 이것을 여러 농도의 시안아미드 또는 카나마이신을 함유하는 발아 유도 배지(SIM) 상에서 인큐베이션시켰다. 5일 후에, 체외배양체를 가진 막을 계대 배양을 위해 동일한 배지(SIM)에 도입하였다. 제2 계대 배양은 2주 후에 이루어졌다. 동시 배양한지 약 4주 후에, 시안아미드 농도 당 60개의 새싹을 절개하고 시안아미드 30 ㎎/l을 함유하는 발아 연장 배지(SEM)를 가진 평판 상에 두었다. 그후에, 조직화학적 GUS 분석을 이용하여 작은 잎사귀 및 꽃을 gus 유전자의 발현에 대해 시험함으로써 뿌리내릴 수 있는 새싹의 유전자도입 특성dmf 확인하였다.
3가지 실험을 실시하였다. 실험 98-8 및 98-11로부터 얻은 새싹을 시안아미드 30 ㎎/l을 함유하는 뿌리내림 배지(SEM)에 도입하였다. 실험 98-13으로부터 얻은 새싹을 선택 배지(SIM)와 동일한 농도를 함유하는 뿌리내림 배지에 도입하고, 결과를 표 4c에 나타내었다. 카나마이신 선택(50 ㎎/l)으로부터 얻은 새싹을 카나마이신 25 ㎎/l을 함유하는 뿌리내림 배지에 도입하였다.
아라비돕시스 탈리아나 C24 뿌리 형질전환에 필요한 배지
배지 성분 배지 GM CIM SIM SEM
성분 거대 원소미세 원소비타민수크로오스(g/l)글루코오스(g/l)다이친 한천(g/l) B5B5B520 B5B5B52010 B5B5B52010 B5B5B51010
호르몬 2,4-D키네틴2-ipIAA 0.50.05 50.15
항생물질 반코마이신카르베니실린세포탁심 100500 50100
pMOG410으로 형질전환된 뿌리 체외배양체는 시안아미드 함유 배지 상에서 재생될 수가 없었다. 시안아미드는 20 ㎎/l의 농도에서도 cah 유전자 없이 작제물로 형질전환된 체외배양체의 재생을 충분히 방지한다. 20 내지 40 ㎎/l의 시안아미드 농도에서는, 일부 유합조직 발생이 관찰되었지만, 50 ㎎/l 이상에서는 체외배양체가 생육될 수 없었고 완전히 갈색으로 변하였다.
한편, cah 유전자(pMOG 1156)로 형질전환된 체외배양체는 모든 시안아미드 농도에서, 80 ㎎/l에서도 재생될 수 있었다. 더 낮은 농도에서, 새싹의 재생은 카나마이신에 의한 것 보다 더 빨랐다.
더 많은 새싹이 이용가능하긴 하지만, 60-65 새싹을 처리시 마다 수확하여 뿌리내림 배지 상에 두었다. 더 낮은 시안아미드 농도에서, 카나마이신 선택에 의한 것과 동일한 양의 새싹이 증식되었다(페트리 디쉬 당 약 70-100).
pMOG 1156으로 형질전환된 뿌리 체외배양체에 의한 시안아미드 선택에 대한 GUS 발현과 유합조직 발생 사이에는 분명한 상호 관계가 있다(표 4d). 시안아미드 0 ㎎/l(NS)에 대해서 얻어진 새싹의 GUS 분석 결과는 염색되지 않았으며, 그것은 시안아미드가 유전자도입 새싹을 얻는데 필요하다는 것을 나타낸다.
pMOG 1156에 의한 아라비돕시스 형질전환 결과
실험 98-8 실험 98-11 실험 98-13
시안아미드의농도 (㎎/l) 식물의 수1뿌리내리는2새싹 % 식물의 수 뿌리내리는새싹 % 식물의 수 뿌리내리는새싹 %
C20C30C40C50C60C80K50 0 04 6.35 8.2nd. nd.5 8.29 13.829 46.8 1 1.72 3.23 4.55 8.1nd. nd.10 15.619 47.5 3 4.89 14.51 1.60 04 6.08 11.414 20.6
(1): 시안아미드 함유 배지 상에서 식물로 발육되고 뿌리내릴 수 있는 새싹을포함하는 식물의 총수(2): 뿌리내리는 새싹 % = 식물의 수/새싹의 총수 * 100%(3): 식물의 수에 비해 청색으로 염색된 식물의 %
시안아미드 또는 카나마이신 선택을 통해 얻어진 GUS 발현 아라비돕시스 식물의 %
pMOG 410 pMOG 1156
처리 C3305C305처리한 것과동일한 농도5
C20C30C40C50C60C80 nd 010nd 75-100 78nd 40-100 100nd 80 nd.nd 80 100nd 67-90 100
K450 100282-92 100
(1): 청색 염색된 식물의 %(2): 모든 pMOG410 새싹은 카나마이신 25 ㎎/l 상에서 뿌리내림(3): C = 시안아미드(㎎/l)(4): K = 카나마이신(㎎/l)(5): 뿌리내림 배지 중의 농도
실시예 5
벼 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA1119-pMOG1295(cah-유전자 함유) 및 균주 LBA1119-pMOG1253(대조군)을 이용한 벼(Oryza sativa) 일반명 타이페이(Taipei) 309의 성숙 배(胚)의 배반(胚盤)으로부터 유래된 유합조직의 형질전환에 사용된 방법이 다음에 설명되어 있다. 멸균 탈곡된 벼씨를 28 ℃에서 어둠 속에서 유합조직 유도 배지(CIM)를 함유하는 평판 상에 발아시켰다(각종 배지의 함량은 표 5에 기재되어 있음). 3주 후에, 배반으로부터 유래된 배형성의 유합조직을 분리하고 동일한 조건하에서 동일한 배지 상에서 계대 배양시켰다. 2-3주 후에, 배형성의 유합조직을 약 2-3 ㎜의 단편으로 절단하고 CIM을 함유하는 평판 상에서 4일 동안 배양시켰다. 이 연구에 사용된 아그로박테리움 균주는 C58 염색체 배경에 리팜피신 선택 마커를 포함하였다. 헬퍼 균주 EHA105의 작제는 문헌(Hood et al. (1993))에 기재되어 있다. 아그로박테리아를 항생물질(리팜피신 20 ㎎/l, 카나마이신 100 ㎎/l)을 갖는 AB 배지를 함유하는 평판 상에서 4일 동안 증식시켰다. 아그로박테리아를 LIM에 모으고 OD600을 1.0-1.5까지 조정하였다. 이 현탁액을 동시 배양 실험에 사용하였다. 유합조직을 아그로박테리움 현탁액과 함께 10분 동안 인큐베이션시키고 멸균 여과지 상에서 건조시켜 과량의 세균을 제거하였다. 유합조직을 어둠 속에서 25 ℃에서 동시 배양 배지(COM) 평판 상에서 48시간 동안 배양시켰다. 50 pMOG1295 유합조직 및 20 pMOG1253 유합조직을 시안아미드 농도 마다 배양시켰다. 다음 농도의 시안아미드를 사용하였다: 0, 15, 30, 60, 100, 150, 200, 300 및 500 ㎎/l. 하이그로마이신을 50 ㎎/l의 농도로 이용하였다. 유합조직을 어둠 속에서 28 ℃에서 여러 농도의 시안아미드 또는 하이그로마이신을 함유하는 제1 선택 배지(FSM) 평판 상에서 인큐베이션시켰다. 3주 후에, 유합조직을 동일한 농도의 시안아미드 또는 하이그로마이신을 함유하는 배 유도 배지 I(EIM I)로 도입하였다. 다시 3주 후에, 유합조직을 동일한 농도의 시안아미드 또는 증가된 농도의 하이그로마이신(75 ㎎/l)을 함유하는 배 유도 배지 II(EIM II) 상에서 계대 배양시켰다. 유합조직을 FSM, EIM I, EIM II 동안과 동일한 농도의 시안아미드를 함유하는 발아 유도 배지(SIM)로 도입하고 28 ℃에서 12시간 조명 (2600 lux) 및 12시간 암실 주기로 배양시켰다. 유합조직을 SIM으로 전달한 지 약 3주 후에, 새싹은 재생되고 있었고 그것을 절개하여 예비 온실 배지(PGM)를 함유하는 단지에 두었다. 100 ㎎/l 이상의 시안아미드 농도에서는 유합조직이 형성되지 않았다. 15 ㎎/l의 시안아미드 농도에서, 두 작제물로부터의 유합조직의 재생 빈도수는 동일하였다(pMOG1253은 16개의 유합조직 중에서 7개가 재생될 수 있었고, pMOG1295는 44개의 유합조직 중에서 17개가 재생될 수 있었음). 30 ㎎/l의 시안아미드 농도에서는, pMOG1295의 11개의 유합조직 만이 미숙한 유합조직 발육을 나타내었고 6개는 재생될 수 있었다.
오리자 사티바 타이페이 309 형질전환에 필요한 배지
배지 성분 배지 CIM COM LIM FSM EIM I EIM II SIM PGM
성분(g/l) 거대 원소미량 원소비타민수크로오스글루코오스아가로오스 타입 I피타겔pH N6B5B5302.55.8 R2R2R21075.2 R2R2R2105.2 R2R2R23076.0 LSLSLS375.8 LSLSLS375.8 LSLSLS4075.8 1/2 MS1/2 MS1/2 MS102.55.8
호르몬(㎎/l) 2,4-DIAABAPNAA 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 0.50.3 0.05
첨가제 프롤린(㎎/l)글루타민(㎎/l)카제인 효소가수분해물(㎎/l)아세토시린곤(μM)코코스넛워터(㎖) 500500300 100 100 100 100
항생물질(㎎/l) 반코마이신세포탁심 100400 100100 100100 100100
실시예 6
입자 총에 의한 벼 형질전환
문헌(Finer et al., Plant Cell Rep. 11, 323-328, 1992)에 따라 입자 유입 총(PIG)를 이용한 벼(Oryza sativa) 일반명 IR 52의 비형태발생 세포 현탁액의 형질전환에 사용된 방법이 다음에 설명되어 있다.
벼(Oryza sativa) 일반명 IR 52의 장기간의 비형태발생 현탁 배양액을 액상 LS-4(Linsmaier and Skoog, Physiol. Plant. 18, 100-127, 1962) 배지내에서 주 1회 간격으로 계대 배양시키고 어둠 속에서 28 ℃에서 회전 진탕기(110 rpm) 상에 유지시켰다(LS-4 배지의 함량은 표 6에 기재되어 있음). 최종 계대 배양한 지 3-4일 후에, 이 세포 현탁액 1.5 ㎖(약 1.5 x 106세포)를 여과지(와트만 4번) 상에 골고루 펼쳐 뿌리고, 이어서 고상화된 LS-4 배지 상에 두고, 어둠 속에서 28 ℃에서 24시간 동안 배양시키고 이후의 충격법에 직접 사용하였다. 현미경적영사 충격법을 위해, 파이너 등(Finer et al. (1992))에 따른 미국산의 입자 유입 총(PIG)을 사용하였다. pMOG 617(35S-gus 및 35S-hyg) 또는 pMOG 873(35S-cah)로 코팅된 300 ㎍의 텅스텐 입자를 입자 지지체 상에 가하였다. 입자는 2.5 바아 헬륨 펄스로 가속되었고, 입자 지지체 2 ㎝ 아래에 놓여진 500 ㎛ 금속 정지 스크린을 통과해야 했다. 현탁 세포를 입자 지지체 15 ㎝ 아래에 놓았다. 충격 전에 PIG를 30 mbar로 배기시켰다. 충격 후에, 세포를 어둠 속에서 28 ℃에서 3일 동안 배양시켰다. 그후에, 그 세포를 가진 여과기를 여러 농도의 시안아미드 또는 50 ㎎/l의 하이그로마이신 B를 함유하는 고상 LS-4 배지에 도입하였다(표 6 참조). 9일 마다 계대 배양을 반복하였다. 4-6주 후에 보일 수 있는 저항성 미소유합조직을 각각의 선택 제제를 함유하는 신선한 LS-4 배지에 전달하였다. 2가지 실험으로부터, pMOG617에 의해 형질전환된 7 + 41 유합조직은 하이그로마이신에 내성인 것으로 밝혀졌지만, pMOG873에 의한 형질전환의 경우에는 첫번째 실험에서 7개의 유합조직이 20 ㎎/l의 시안아미드 상에서 생존되었으며(두번째 실험의 결과는 아직 이용가능하지 않음) 40 ㎎/l의 시안아미드 상에서는 0 + 4 유합조직이 생존되어 남아있었다. 50 ㎎/l 이상의 시안아미드 농도에서는 유합조직이 형성되지 않았다. 발생 유합조직의 일부를 pMOG873으로 형질전환된 유합조직에서의 DNA의 존재에 대해 시험함으로써 유전자도입 특성을 확인하였다. 시안아미드 40 ㎎/l 상의 4개의 생존 유합조직 중의 하나는 cah-유전자에 대한 PCR 실험에서 양성을 나타내었다.
오리자 사티바 일반명 IR 52 형질전환에 필요한 배지
액상 LS-4 고상 LS-4
거대 원소 LS LS
미세 원소 LS LS
비타민 LS LS
수크로오스(g/l) 30 30
아가로오스 타입 I(g/l) - 7
pH 5.8 5.8
2,4-D(㎎/l) 4 4
pMOG617
선택 제제 (㎎/l) 평판의 수 저항 클론 gus 양성
시안아미드 20 4
시안아미드 30 2
시안아미드 40 4
시안아미드 50 2
시안아미드 60 2
시안아미드 70 2
시안아미드 80 2
하이그로마이신 50 8
pMOG873
선택 제제 (㎎/l) 평판의 수 저항 클론 gus 양성
시안아미드 0 4
시안아미드 20 6
시안아미드 30 8
시안아미드 40 8
시안아미드 50 7
시안아미드 60 4
시안아미드 70 4
시안아미드 80 2
하이그로마이신 50 4
실시예 7
옥수수 사멸 커브 평가
시안아미드의 원료 용액을 물 중에서 10 및 100 ㎎/㎖로 제조하고 멸균 여과시켰다. 부분표본을 -20 ℃에서 저장하였다. MS 배지(4.4 g), 수크로오스(20 g), 2,4-D(2.0 ㎎) 및 한천(8 g)을 물 1ℓ에 첨가하여 배지를 제조하였다. 압열 멸균시킨 후에, 적절한 양의 시안아미드(0, 10, 30, 50, 100, 150 ㎎/l)를 첨가하고 배지를 9 ㎝ 페트리 디쉬에 부었다. BMS 액체를 상기 마이너스 한천으로서 제조하였다.
BMS 세포를 3가지 방식으로 시안아미드 함유 배지에 첨가하였다.
a. BMS 세포 현탁액을 매부리형 튜브에 첨가하고 액체를 제거하였다. 그후에, BMS 세포를 농도 당 3개의 평판으로, 평판 당 약 5 ㎜ 직경의 5개의 응집체로, 각 페트리 디쉬의 기초 배지 상에 각 응집체의 윤곽을 표시하며 한천 표면 상에 배열시켰다;
b. 약 0.5 ㎖ 팩 세포 용적 + 1.5 ㎖ BMS 액체를 한천 표면에 첨가하고 그 세포를 한천의 표면 상에 미세하게 펼쳐 뿌렸다. 처리 당 3개의 평판을 구성하였다.
c. 약 0.5 ㎖ 팩 세포 용적 + 1.5 ㎖ BMS 액체를 한천 위에 깔려진 여과지에 첨가하였다. 세포를 여과지 표면 상에 골고루 펼쳐 뿌렸다. 처리 당 1개의 평판을 구성하였다.
평판을 미공 테이프로 밀폐시키고 어둠 속에서 25 ℃에서 인큐베이션시켰다. 그 세포의 증식을 7일 및 14일 후에 관찰하였다.
결과
8일
시안아미드 상에서의 BMS 세포의 증식을 8일 후에 평가하였다. 대조 배지 표면 상에 배열된 BMS 세포의 응집체의 크기는 증가하였고 그들의 원래 윤곽은 증식하였다. 시안아미드 10 ㎎/l 상의 세포는 그들의 윤곽을 증식시키지 않았지만 응집체의 높이는 증가하여 울퉁불퉁한 표면을 형성하였다. 시안아미드 농도의 증가에 따른 증식의 약간의 감소는 시안아미드 50 ㎎/l에서 관찰된 증식에 대한 최대 효과로 분명해졌다.
대조 배지 표면 상에 펼쳐 뿌려진 세포는 잘 증식하였고 배지 A의 표면을 조밀하게 뒤덮었다. 시안아미드의 최저 농도(10 ㎎/l) 상에서 증식의 상당한 감소가 관찰되었지만, 증가된 세포 밀도는 분명하게 보였다. 세포 밀도의 약간의 증가는 시안아미드 30 ㎎/l 상에서 분명하였지만, 더 높은 농도에서는 다른 증식 속도를 구별하기가 어려웠다.
세포는 시안아미드의 모든 농도 상에서 우유빛 백색으로 남아있었으며, 세포의 갈변화는 관찰되지 않았다.
15일(표 9)
시안아미드 10 ㎎/l 상의 BMS 세포의 증식의 감소는 15일 후에 여전히 매우 분명했지만, 응집체로 배열된 세포는 그의 원래 윤곽을 증식시켰다. 한천 표면 상에 직접 펼쳐 뿌려진 세포는 30 ㎎/l 플러스 상에서 증식이 두드러지게 감소되는 것으로 관찰된 응집체로 배열된 것과 유사한 반응을 나타내었다. 50 ㎎/l 플러스 상의 세포는 증식 신호를 나타내지 않았고 응집체의 표면은 매우 편평하게 남아있었지만 세포는 여전히 우유빛 백색이었다. 여과지 상에 펼쳐 뿌려진 세포로 유사한 반응이 관찰되었다. 그러나, 모든 여과지 상의 표면은 약간 부풀려진 것이 관찰되었지만, 이것은 콜로니로 더 이상 발달되지는 않았고 BMS 현탁액에서 전형적인 크기의 혼합 집단으로부터의 더 큰 세포 집성체로 분명하게 구성되었다.
광학 현미경으로 관찰하기 위해 모든 시안아미드 농도에 대한 세포 응집체로부터 샘플을 취하였다. 시안아미드의 농도가 증가함에 따라, 세포 성분이 세포 벽으로부터 소멸된 사멸 세포의 수가 증가하였고, 어두운 전분 결정 상태의 수가 증가하였다. 세포를 물에 재현탁시키고 UV광 하에서 FDA 염색하여 관찰하였다.
시안아미드농도 (㎎/l) 관찰 내용
0 가끔씩 사멸 세포가 있는 정상적인 건강한 세포
10 스트레스의 신호. 건강한 세포 중에서 사멸 세포의 특별한 응집체. 약 5% 사멸됨.
30 대조용 세포와의 현저한 차이. 전분 조직의 축적. 세포 성분이 세포벽으로부터 소멸된 사멸 세포. 약 15-20% 사멸됨.
50 30과 아주 다름. 사멸 세포의 수의 증가 및 전분 조직의 축적
100 세포의 대부분이 사멸됨. 세포내의 오일 방울 축적을 가능하게 하는 작은 분명한 구형 물체. 세포 크기 감소됨. 약 90% 사멸됨.
150 세포의 대부분이 사멸됨. 전분 조직 및 페놀의 축적으로 인해 세포의 색이 어두어짐. 사멸 세포의 응집체에서 보이는 특별한 생존 세포. 약 95-98% 사멸됨.
0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100 ㎎/l의 시안아미드 농도로 실험을 반복하였다. 결과는 상기한 바와, 즉 10 ㎎/l에서 약간의 증식 감소가 관찰되는 응집체로 집성된 세포에 대한 것과 유사하였다. 20 ㎎/l의 시안아미드 농도에서부터는 세포 응집체가 그들의 원래 윤곽으로부터의 증식을 나타내지 않았지만, 더 낮은 농도(＜ 50 ㎎/l)에서는 세포 응집체가 높이 증가를 나타내었다(더 높은 농도일 경우 감소됨). 50 ㎎/l 이상에서, 응집체는 약간의 오렌지 색조를 나타내었다.
한천 표면 상에 또는 여과지 상에 펼쳐 뿌려진 세포에 의한 결과는 약간의 증식(원래 세포 수의 약 2배)을 나타낸 10 ㎎/l의 농도에서의 것과 유사하였지만, 20 ㎎/l 이상의 농도에서는 제한된 증식 신호를 나타내었다.
실시예 8
바나나(Musa)에서의 사멸 커브 평가
바나나에서의 형질전환을 위한 선택 제제로서의 시안아미드의 능력을 시험하기 위해, 그랜드 네인(Grand nain) 6일된 배형성 현탁(Ed6b) 배양의 재생가능한 배형성 현탁액으로 2개의 사멸 커브를 구성하고, pH 5.3에서 4.32 g/l MS 염, 45 g/l 수크로오스, 표준 1x 농도의 MS 비타민, 100 ㎎/l 글루타민, 100 ㎎/l 미오-이노시톨, 100 ㎎/l 바이오틴, 100 ㎎/l 맥아 추출물을 함유하는, M2 2,4D 액체에 침지시키고, 압열 멸균시킨 후에, 1.2 ㎎/l 2,4-D 및 0.8 ㎎/l 피클로람을 첨가하였다.
배양액을 체질(＞250 μ, ＜710 μ)하고, 액체 300 ㎕ 용적 중의 체질된 배양액 약 50 ㎕의 부분표본을 하기하는 바와 같은 2개의 사멸 커브 배지 상에 피펫팅하였다(평판 당 3 reps). 배양 증식 및 생존을 3주에 걸쳐 모니터하고 FDA 염색을 통해 21일 후에 세포 생존을 평가하였다.
사멸 커브 배지 A: M2/MS/1.0 2,4-D(1.0 ㎎/l의 2,4-D가 있고, 피클로람은 없고 2.25 g/l의 젤라이트가 첨가된 것을 제외하고는 M2/MS/2,4-D임): 이 배지는 배형성의 유합조직의 신속한 분화 및 증식을 촉진시키지만, 배는 그렇게 하지 못했다.
사멸 커브 배지 B: M2/SH/0.5 Pic, 0.5 2,4-D(0.5 ㎎/l의 2,4-D 및 0.5 ㎎/l의 피콜람이 있고, MS 대신 SH 염(4.32 g/l)이 있고, 2.25 g/l의 젤라이트가 더 첨가된 것을 제외하고는 M2/MS/2,4-D임): 이 배지는 다른 배지로의 전달에 의해 성숙되고 발아될 수 있는 배의 초기 발달을 촉진시켰다.
압열 멸균시킨 후에, 시안아미드를 두 배지 유형 모두에 0, 20, 30, 50, 75, 100, 150 ㎎/l의 농도로 첨가하였다.
결과를 표 10에 나타내었으며, 세포 증식에 대한 수치는 유합조직 용적의 정확한 평가가 아니라 대략의 가시적인 평가이다. ＞75 ㎎/l의 농도까지 배양액의 상당한 가시적인 갈변화 및 페놀계 수지의 방출이 없었다. 일반적으로, 배양액은 세포 분화가 폭넓게 억제됨에 따라 증식을 바로 멈추었다. 시안아미드는 상당한 가시적인 손상 없이 20 ㎎/l의 낮은 농도에서도 배형성의 유합조직의 증식을 40-50% 억제시켰다. 배형성은 여기서 시험된 최저 농도에서 완전히 억제되었다.
바나나 세포 배양액에 대한 시안아미드 농도의 결과
배지 시안아미드농도 FDA가 평가한세포 생존율% 형성된 배(평균) 유합조직증식%
M2/MS/2,4-D 0 95% N/A +100%
M2/MS/2,4-D 20 60% N/A +30%
M2/MS/2,4-D 30 50% N/A +20%
M2/MS/2,4-D 50 20% N/A 0
M2/MS/2,4-D 75 10% N/A 0
M2/MS/2,4-D 100 10% N/A 0
M2/MS/2,4-D 150 0 N/A 0
M2/SH/0.5Pic+0.5 2,4-D 0 95% 51 N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2,4-D 20 50% 0 N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2,4-D 30 40% 0 N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2,4-D 50 30% 0 N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2,4-D 75 20% 0 N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2,4-D 100 10% 0 N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2,4-D 150 0 0 N/A

Claims (13)

  1. 선택 마커로서의 시안아미드 수화효소의 용도.
  2. 식물 형질전환 실험에서 선택 마커로서의 시안아미드 수화효소의 용도.
  3. 제2항에 있어서, 식물이 시안아미드 수화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제3항에 있어서, 서열 1로 표시된 뉴클레오티드 서열이 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. a. 시안아미드 수화효소를 코딩하는 서열 및 관심있는 유전자를 포함하는 벡터를 작제하고,
    b. 상기 벡터로 식물 또는 식물 일부 또는 식물 세포를 형질전환하고,
    c. 상기 형질전환체를 시안아미드 함유 배지에서 증식시키는 것
    을 포함하는 형질전환된 식물의 선택 방법.
  6. 제5항에 있어서, 서열 1의 뉴클레오티드 서열이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 시안아미드 수화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 식물의 선택에 있어서의 시안아미드의 용도.
  8. 시안아미드 수화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 관심있는 유전자를 포함하는 발현 카세트.
  9. 제8항에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 아그로박테리움속이라는 것에 따른 숙주 세포.
  12. 제9항에 따른 벡터로 형질전환된 식물.
  13. 제11항에 따른 숙주의 세포벽을 이용하여 형질전환한 식물.
KR1019997009564A 1997-04-18 1998-04-17 선택 마커 KR20010006474A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97201140.7 1997-04-18
EP97201140 1997-04-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010006474A true KR20010006474A (ko) 2001-01-26

Family

ID=8228216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019997009564A KR20010006474A (ko) 1997-04-18 1998-04-17 선택 마커

Country Status (29)

Country Link
US (1) US6660910B1 (ko)
EP (1) EP0975770A1 (ko)
JP (1) JP2001521397A (ko)
KR (1) KR20010006474A (ko)
CN (1) CN1146663C (ko)
AR (1) AR012477A1 (ko)
AU (1) AU736069B2 (ko)
BG (1) BG103883A (ko)
BR (1) BR9809091A (ko)
CA (1) CA2288077A1 (ko)
CO (1) CO4810249A1 (ko)
CR (1) CR5757A (ko)
EA (1) EA199900950A1 (ko)
EG (1) EG21976A (ko)
HU (1) HUP0002061A3 (ko)
ID (1) ID24707A (ko)
IL (1) IL132257A0 (ko)
JO (1) JO2018B1 (ko)
MA (1) MA24795A1 (ko)
NO (1) NO995064L (ko)
NZ (1) NZ500180A (ko)
PE (1) PE104999A1 (ko)
PL (1) PL336297A1 (ko)
SK (1) SK143999A3 (ko)
TN (1) TNSN98051A1 (ko)
TR (1) TR199902576T2 (ko)
UY (1) UY24959A1 (ko)
WO (1) WO1998048023A1 (ko)
ZA (1) ZA983297B (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998056238A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformation of wheat with the cyanamide hydratase gene
NL1010517C2 (nl) * 1998-11-10 2000-05-11 Stichting Phytogen Werkwijze voor het selecteren op de aanwezigheid van een DNA-volgorde in een genetisch gemanipuleerd organisme, een genconstruct, een verbinding en de toepassing daarvan.
EP2287322A1 (en) 2002-02-26 2011-02-23 Syngenta Limited A method of selectively producing male or female sterile plants
AU2003230693B2 (en) * 2002-03-20 2010-09-30 J.R. Simplot Company Refined plant transformation
WO2004031228A1 (de) * 2002-09-26 2004-04-15 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Protein aus penicillium olsonii, das resistenz gegen 2-deoxyglucose verleiht
US7578598B2 (en) * 2006-11-13 2009-08-25 Black & Decker Inc. Battery charging work light
US20070220627A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and Compositions for the Selection of a Transgenic Plant
MX2008014615A (es) 2006-05-17 2009-01-15 Pioneer Hi Bred Int Minicromosomas artificiales de plantas.
JP5322308B2 (ja) * 2006-09-22 2013-10-23 ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン トリコデルマ・レセイ（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＲｅｓｓｅｉ）由来のアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）選択マーカー
AU2014203893B2 (en) * 2013-01-04 2017-11-02 Ginkgo Bioworks, Inc. Microorganisms engineered to use unconventional sources of nitrogen
CN105907694A (zh) * 2016-05-23 2016-08-31 广西大学 一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096947A (en) * 1997-01-14 2000-08-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving transformation efficiency

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0002061A2 (hu) 2000-10-28
CA2288077A1 (en) 1998-10-29
EG21976A (en) 2002-05-31
TR199902576T2 (xx) 2000-03-21
BG103883A (bg) 2000-06-30
SK143999A3 (en) 2000-07-11
CN1258318A (zh) 2000-06-28
IL132257A0 (en) 2001-03-19
JP2001521397A (ja) 2001-11-06
AU7766898A (en) 1998-11-13
MA24795A1 (fr) 1999-12-31
BR9809091A (pt) 2000-08-01
WO1998048023A1 (en) 1998-10-29
NO995064L (no) 1999-12-14
CR5757A (es) 1999-10-25
JO2018B1 (en) 1999-05-15
CN1146663C (zh) 2004-04-21
AR012477A1 (es) 2000-10-18
HUP0002061A3 (en) 2002-08-28
NZ500180A (en) 2000-12-22
EA199900950A1 (ru) 2000-04-24
CO4810249A1 (es) 1999-06-30
ID24707A (id) 2000-08-03
US6660910B1 (en) 2003-12-09
TNSN98051A1 (fr) 2000-12-29
PL336297A1 (en) 2000-06-19
EP0975770A1 (en) 2000-02-02
UY24959A1 (es) 1998-10-14
ZA983297B (en) 1999-01-22
AU736069B2 (en) 2001-07-26
NO995064D0 (no) 1999-10-15
PE104999A1 (es) 1999-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU738153C (en) Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation and compositions derived therefrom
WO1999067357A2 (en) Transformation of monocots by co-cultivating an inflorescence with agrobacterium
JP2000083680A (ja) 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
EP4222165A2 (en) Rapid transformation of monocot leaf explants
KR20010006474A (ko) 선택 마커
AU728015C (en) Methods for producing parthenocarpic or female sterile transgenic plants
Park et al. Generation of chlorsulfuron-resistant transgenic garlic plants (Allium sativum L.) by particle bombardment
US20090023212A1 (en) Method for transforming soybean (Glycine max)
US7238862B2 (en) Efficiency Agrobacterium-mediated wheat transformation method
Kim et al. Agrobacterium-medlated high-efficiency transformation of creeping bentgrass with herbicide resistance
US7045357B2 (en) Efficiency agrobacterium-mediated plant transformation method
MXPA99009488A (en) Selection marker
KR100363122B1 (ko) 유전자 조작을 통한 마늘 식물체의 형질전환 방법 및 형질전환 마늘
CZ363999A3 (cs) Použití kyanamidhydratázy jako selekčního markéru a způsob selekce transformovaných rostlin
Jiang Development of efficient rice DNA transformation methods and rapid evaluation of transgenic lines
MXPA01005858A (en) An improved efficiency agrobacterium

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid