BG103883A

BG103883A - Селекционен маркер

Info

Publication number: BG103883A
Application number: BG103883A
Authority: BG
Inventors: Brigitte Damm
Original assignee: Synegenta Mogen B.V.
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1999-11-15
Publication date: 2000-06-30
Also published as: AR012477A1; CR5757A; EA199900950A1; US6660910B1; SK143999A3; TR199902576T2; UY24959A1; CO4810249A1; ZA983297B; AU7766898A; CN1258318A; HUP0002061A2; TNSN98051A1; MA24795A1; JO2018B1; NZ500180A; CA2288077A1; PL336297A1; JP2001521397A; PE104999A1

Abstract

Изобретението се отнася до приложението на цианамид хидратаза като селекционен маркер при трансформация на растения. Цианамидът действа като хербициди растенията, трансформирани с ген, кодиращ цианамид хидратаза, са способни да превръщат цианамида в урея, с което става възможна селекцията на трансформирани растения чрез преживяване под действиетона цианамид.

Description

(54) СЕЛЕКЦИОНЕН МАРКЕР (57) Изобретението се отнася до приложението на цианамид хидратаза като селекционен маркер при трансформация на растения. Цианамидът действа като хербицид и растенията, трансформирани с ген, кодиращ цианамид хидратаза, са способни да превръщат цианамида в урея, с което става възможна селекцията на трансформирани растения чрез преживяване под действието на цианамид.

претенции, 10 фигури

СЕЛЕКЦИОНЕН МАРКЕР

Поръчка 1305/99-РС

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящата заявка се отнася за нов селектируем маркер, поспециално като се използува цианамид хидратаза като селекционен маркер в експерименти с трансформация, по-точно в експерименти с растителна трансформация.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Цианамид (H₂N-C=N) е нитрилов дериват, който подобно на други нитрилови деривати, се използува в земеделието за стимулиране растежа и за растителна защита. Цианамидът във воден разтвор или във формата на неговата калциева сол се използува като изкуствен тор, който при метаболитно превръщане снабдява почвата с амоняк. Той има и допълнително предимство действувайки като хербицид. За да се използува като изкуствен тор, той трябва да се прилага преди сеитба.

Химически, цианамидът принадлежи към класа на нитрилите. Въпреки относително рядкото разпространение в природата на съединения съдържащи нитрилна група, ензими, които хидрират тази група са открити в бактерии и растения ( напр. Nagasawa Т., et al. (1988) Biochem. Biophys.Res.Commun. 155, 1008-1016; Endo T. and Wantanabe I. (1989) FEBS Lett. 243 61-64). В гъбата Myrothecium Verrucaria е открит нитрил хидриращ ензим (Stransky Н. and Amberger

A. (1973)Z.Pflanzenphysiol. 70 74-87), който хидрира нитрилната група на цианамида с образуване на урея.

H_}N-CsN + НОН => H₂N-CO-NH₂

Maier-Greiner et al. са изолирали ензима и са клонирали гена, който го кодира (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88, 4260-4264, 1991). Те са показали, че този ензим проявява изключително тясна субстратна специфичност, като химически сродни съединения на цианамида не се разпознават като субстрати.

Селекгируемите маркери трябва да дадат един доминантен фенотип на трансформирани клетки, който може да бъде използуван като критерий за селекция. Те попадат в два класа: един клас гени, които в присъствие на селективен агент допринасят за жизнеността или леталитета на клетката и един клас гени, които имат незначителни ефекти върху клетъчната преживяемост, но които снабдяват трансформираните клетки с някои отличителни физични характеристики.

При трансформация на растения, фракцията от клетки включваща нова ДНК общо взето е малка, така повечето схеми за стабилна трансформация използуват маркери, които обезпечават преживяемост на трансформираните клетки в присъствието на селективен агент.

Известен брой селекционни маркери от тази първа група са известни от няколко години и са използувани в експерименти за растителна трансформация. Към тях се включват: ензимът неомицинфосфотрансфераза (npt), който придава резистентност към една група антибиотици включваща канамицин, паромомицин, генетицин и неомицин, мутантни форми на ензима ацетолактатсинтаза (als), който определя резистентност към имидазолинони, сулфонилуреи, тиазолпиримидини и пиримидилоксибензоати; и ензимът хигромицин 3’-фосфотрансфераза (hpt), който допринася за резистетност към хигромицин. На разположение са също хлорамфеникол трансфераза (cat), която детоксикира хлорамфеникола и дихидрофолат редуктаза (dhfr), която неутрализира токсичните ефекти на метотрексата. Друга

възможност за използуване на bar гени за резистентност към хербицида биалафос (WO 97/05829).

Въпреки че има вече известен брой селектируеми маркери, все още е налице необходимост от друг маркер. Това се дължи на следните основания:

- когато трансгенни растения биват трансформирани за втори път с нов конструкт, необходимо е новоформираните трансформанти да се селекционират с помощта на втори селекционен маркер.

- гореспоменатите селекционни маркери не са приложими при всички растителни видове.

- някои от съединенията, които трябва да бъдат добавени за да бъде възможна селекцията, са антибиотици. Разпространението на гени, които придават резистентност към антибиотици или хербициди трябва да бъде намалено колкото е възможно повече, за да се избегне риска от придобиване на резистентност спрямо патогени.

- някои от съединенията, които трябва да бъдат добавени за да се осъществи селекцията са относително скъпи. Има нужда от по-евтини селекционни агенти.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението предоставя приложението на ген кодиращ цианамид хидратаза (САН) като нов селекционен маркер. Предпочитателно той може да бъде използуван за трансформация на растения. Генът включва нуклеотидната последователност от SEQIDNO: 1 или негови мутеини, които притежават цианамид хидратазна функция.

• · · · * «!· ··· .··· ··· ·· ··

По-нататък изобретението включва метод за селекция на трансформирани растения, който обхваща конструиране на вектор носещ кодираща последователност за САН и интересуващия ни ген, трансформирайки с вектора растения или части от растения или растителни клетки или калус и развъждайки получените трансформанти в среда, която съдържа цианамид.

Изобретението е насочено също към приложението на цианамид за селекция на растения трансформирани с ген кодиращ САН.

Следваща част на изобретението са експресионни касети, включващи нуклеотидна последователност за цианамид дехидратаза и един интересуващ ни ген. Също част от изобретението са вектори с тази експресионна касета и гостоприемници, включително Agrobacterium, съдържащ такъв вектор. Освен това, растения трансформирани с такъв вектор и/или такъв Agrobacterium съставляват част от изобретението.

ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фиг.1 Схематично изображение на T-ДНК в pMOG874

Фиг.2 Схематично изображение на Т-ДНК в pMOG1156

Фиг.З Схематично изображение на Т-ДНК в pMOG22

Фиг.4 Схематично изображение на Т-ДНК в pMOG1005

Фиг.5 Схематично изображение на Т-ДНК в pMOG1278

Фиг.6 Схематично изображение на Т-ДНК в pMOG1295

Фиг.7 Схематично изображение на Т-ДНК в pMOG1253

Фиг.8 Схематично изображение на експресионната касета в

PMOG873

Фиг.9 Схематично изображение на експресионната касета в

PMOG617

1' МИМИЙ

Фиг.10 Експланти от Arabidopsis трансформирани с a) pMOG1156 или б) pMOG410 селекционирани и двата на SOmg/l цианамид.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението е насочено към приложението на ген кодиращ цианамид хидратаза като селекционен маркер.

Ензимът цианамид хидратаза (САН) придава резистетност към цианамид, който е съединение с хербицидна активност. Понастоящем е установено, че това свойство на гена може да бъде използувано в трансформационната технология за да помогне за разграничаване на трансформирани от нетрансформирани растения. Само хербицидната активност обаче не е достатъчна да направи гена приложим като селективен маркер. Необходимо е също генът да се експресира в тези клетки, които са подложени на условия за селекция. Това може да бъде или чрез конститутивна експресия или експресия в специфични тъкани като калус, семена ембриогенни тъкани и меристемни тъкани. По-нататък необходимо е генът да превръща чувствителността на едно растение към токсично съединение в толеранс без всякаква остатъчна токсична активност. Наличието на достатъчно широк “прозорец” между концентрацията на токсичното съединение необходимо за селекция и концентрацията, която в присъствието на селекционен ген може да отбележи някакъв растеж, е също от значение за използуването на селекционния маркерен ген. В допълнение, системата трябва преимуществено да функционира достатъчно автономно в клетките, така че в една химерна тъкан (т.е. тъкан с мозайка от трансформирани и нетрансформирани клетки), нетрансформираните клетки не са протектирани от съседните трансформирани клетки и поради това преживяват селекцията. Очудващо, комбинацията от гена кодиращ САН и токсичните свойства ··· ♦·· ··· ··· 6 ··· ··· ·· *· на цианамид ги квалифицира за употребата им като селекционна маркерна система.

Настоящето изобретение показва, че е възможно да се подберат трансформанти въз основа на техния толеранс към цианамид.

Допълнително предимство е фактът, че цианамидът се превръща в урея, която в различни растения се превръща в NH₃ и СО₂. NH₃ може да бъде използуван от растението като източник на азот. Това е допълнителна селекционна възможност за увеличаване “прозореца” между толеранс и селекция. Обикновено средата за култивиране съдържа амоняк и нитрат ( съдържат се в средата на Murashige and Skoog, вж. Таблица 2 и 4). Ако те не са включени или тяхната концентрация е намалена, трансформираните растения съдържащи САН гена ще превърнат наличния в средата цианамид като селекционен агент в урея и след това в амоняк, който може да се използува като източник на азот. Нетрансформираните растения не са в състояние да извършат това, така в допълнение на хербицидния ефект на цианамида те ще страдат от конкурентен недостатък по отношение поглъщането на азот.

Нукпеотидната последователност кодираща САН преимуществено е последователността представена в SEQIDNO.1. Също мутеини на тази последователност могат да бъдат разглеждани като част от изобретението. Мутеините са нуклеотидни последователности, които се различават по отношение нукпеотидната последователност, но въпреки това имат подобни функционални и имунологични характеристики както последователността представена в SEQIDNO:

1. Тези мутеини се наричат също функционални варианти. В допълнение, полинуклеотидите на изобретението включат специфично онези последователности, които са по същество идентични (определени както е описано по-долу) с генните последователности на изобретението и кодират белтъци, които запазват функционалната активност на белтъците на изобретението.

· · · · · Л· ··· 7··» ··· ·· **

В случая на представения тук САН ген, горният термин включва вариантни полинуклеотидни последователности, които имат съществена идентичност с представените тук последователности и кодират белтъци, които имат разграждаща цианамид активност.

“Процент идентичност на последователността” за полинуклеотиди и полипептиди се определя чрез сравняване на две оптимално подредени последователности върху прозорец за сравнение. Частта от полинуклеотидната или полипегггидната последователност в прозореца за сравнение може да включва допълнения или делеции (т.е. празнини, цепки) в сравнение с референтната последователност (която не съдържа допълнения и делеции) за оптимално изравняване на двете последователности. Процентът е изчислен чрез определяне броя на местата, на които се появяват идентична база на нуклеинова киселина или аминокиселинен остатък в двете последователности, за да се получи броя на съвпадащите позиции. Броят на съвпадащите позиции се разделя на общия брой позиции в прозореца и умножавайки резултата по 100 се получава процента идентичност на последователността. Оптимално подреждане на последователностите за сравнение може да бъде проведено чрез компютеризирано изпълнение на известни алгоритми (напр. GAP, BESTFIT, FASTA и TFAST в Wisconsin Genetics Software Package , Genetic Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison.WI, или BlastN и BlastX предоставени от National Center for Biotechnology Information) или чрез директно сравнение.

Терминът “съществена идентичност” или “съществено сходство” означава, че един полипептид включва последователност, която може да хибридизира с прицелен полипептид при строги условия. При строги условия се има предвид разтвор от 2* SSC и температура 65°С.

Полипептиди, които са “съществено подобни” споделят последователности, както е отбелязано по-горе, с изключение на това, че позициите, в които остатъците не са идентични, се различават с консервативни аминокиселинни замествания. Консервативни аминокиселинни замествания се отнасят до взаимозаменяемостта на остатъците, притежаващи сходни странични вериги. Например, групата от аминокиселини притежаващи алифатни странични вериги включва глицин, аланин, валии, левцин и изолевцин: група от аминокиселини притежаващи алифатно-хидроксилни странични вериги е серин и треонин: група от аминокиселини притежаващи амидсъдържащи странични вериги е аспаргин и глутамин: група от аминокиселин притежаващи ароматни странични вериги е фенилаланин, тирозин и триптофан: група от аминокиселини притежаваща базични странични вериги е лизин, аргинин и хистидин: група от аминокиселини притежаващи сяра-съдържащи странични вериги е цистеин и метионин.

Съществена идентичност на полинуклеотидните последователности означава, че полинуклеотидът обхваща последователност, която има най-малко 70% идентичност на последователността, с която се сравнява, за предпочитане най-малко 80%, по- предпочитателно наймалко 90% и най-предпочитателно поне 95%. Друга индикация, че нуклеотидните последователности са съществено идентични, е ако две молекули специфично хибридизират помежду си при строги условия. Строгите условия са зависими от последователността и се различават при различни условия. Общо, строгите условия са подбрани да бъдат около 10°С по-ниски от температурната точка на топене (Тт ) за специфичната последователност при определена йонна сила и pH. Тт е температурата (при определена йонна сила и pH), при която 50% от изследваната последователност хибридизира с една напълно комплементарна сонда. Тт на един хибрид, който е функция от дължината и от базовия състав на сондата и може да бъде изчислена като се използува информация от Sambrook, Т. et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (second edition) , Volume 1-3, • ···· ·· · • ··· • · · • · ··· ···

•	• ··	• ·
• ·	··	• е	• ·
•		• ·	• ·
•		• ··♦	• · ·
•		•	•
···	···	··	··

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring. Обикновено строги условия за един Southern blot протокол включват измиване при 65°С с 0.2 X SSC. За предпочитани олигонуклеотидни сонди, условията на измиване обикнвено са 42°С в 6х SSC.

Настоящето изобретение предоставя една химерна ДНК последователност, която включва отворена рамка за четене и може да кодира белтък притежаващ цианамид хидратазна активност. Терминът химерна ДНК последователност следва да се отнася до която и да е ДНК последователност, която включва ДНК последователности, които не се срещат в природата. Например, химерна ДНК ще означава да съдържа ДНК включваща споменатата отворена рамка за четене в локализация, която не се среща естествено в растителния геном, дори ако споменатият геном може да съдържа нормално едно копие на споменатата отворена рамка за четене в нейната естествена хромозомна локализация. Подобно на това, споменатата отворена рамка за четене може да бъде включена в растителния геном, на място където естествено тя не се открива или в един репликон или вектор, където естествено тя не се открива, като например бактериален плазмид или вирусен вектор. Химерната ДНК не следва да се ограничава до молекули ДНК, които са реплицируеми в гостоприемник, но означава също да включва ДНК способна да бъде лигирана в един репликон, например по силата на специфични адапторни последователности, физически свързани с отворената рамка за четене съгласно изобретението. Отворената рамка за четене може да бъде или да не бъде свързана с нейните естествени разположени пред нея и след нея регулаторни елементи.

Отворената рамка за четене може да произхожда от една геномна библиотека. В последната тя може да съдържа един или повече интрони, разделящи екзоните изграждащи отворената рамка за четене, която кодира белтък съгласно изобретението. Отворената ··· ·· · · ···· ···· · · ···· • ·· · · · ······ • · · · · · ··· ··· ю*** ··· ·· ·· рамка за четене може също да бъде кодирана от един непрекъснат екзон или от една кДНК за мРНК кодираща белтък, съгласно изобретението. Отворените рамки съгласно изобретението включват също онези, в които един или повече ингрони са отстранени или са добавени изкуствено. Всеки от тези варианти е обхванат от настоящето изобретение.

За предпочитане отворената рамка за четене произхожда от почвените гъби Myrothecium verruucaria (както е описано от MaierGreiner, U.H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88^4260-4264,1991).

За да бъде способна да бъде експресирана в клетка гостоприемник по начин такъв че експресираният белтък да допринася за резистетност към токсичен селекционен агент, една химерна ДНК, съгласно изобретението, обикновено ще бъде предоставяна в експресионна касета с регулаторни елементи, които правят възможно да бъде разпозната от биохимичната машинерия на гостоприемника и позволяват отворената рамка за четене да бъде презаписана и транслирана в гостоприемника. Обикновено тя ще включва една инициираща транскрипцията област, която може подходящо да произхожда от всеки ген способен да бъде експресиран в клетката Ф приемник по избор, както и инициираща транслация област за разпознаване и за прикачване към рибозомата. В еукариотните растителни клетки, една експресионна касета обикновено включва като допълнение една завършваща транскрипцията област разположена след споменатата отворена рамка за четене, позволяваща завършване на транскрипцията и появата на полиаденилиране на първичния транскрипт. В допълнение, използуването на кодоните може да бъде адаптирано към предочитателно използуваните на кодони от избрания гостоприемник. Принципите обслужващи експресията на един химерен ДНК конструкг в подбрана клетка гостоприемник се познават от • ···· · · ·· ·· ··· ·· ·· · · · · • ··· · · · · · · • ·· · · · ······ • · · ♦ · · ······ ] |·· ··· ·· ·· специалистите в тази област и конструирането на експресионни химерни ДНК конструкти е понастоящем рутинно за всякакъв вид клетки приемници, било прокариотни или еукариотни.

За да бъде подържана една отворена рамка за четене в клетка гостоприемник, обикновено тя трябва да бъде предоставена във формата на репликон, включващ споменатата отворена рамка за четене, съгласно изобретението, свързана с ДНК, която се разпознава и реплицира от избраната клетка приемник. Съгласно с това, подборът на репликон се определя главно от избраната клетка приемник. Принципите осигуряващи селекцията на подходящи репликони за точно избран гостоприемник, са в обсега на познанията на специалиста в тази област.

Специален тип репликон е този, който е способен да се прехвърля или част от него, в друга клетка приемник, като растителна клетка, при което се пренася отворената рамка за четене, съгласно изобретението, върху споменатата растителна клетка. Репликони с такава способност се означават тук като вектори. Пример за такъв вектор е един Ti-плазмид вектор, който когато е налице в подходящ гостоприемник, като Agrobacterium tumefaciens, е способен да пренесе част от самия себе си, т.нар. Т-област, върху една растителна клетка. Различни видове Τί-плазмидни вектори (вж.: ЕР 0 116 718 BI) понастоящем рутинно се използуват за пренасяне на химерни ДНК последователности в растителни клетки, или протопласти, от които могат да бъдат създадени нови растения, които включват стабилно споменатите химерни ДНК в техните геноми. Една особено предпочитана форма на Ti-плазмидни вектори са така наречените бинарни вектори, както са претендирани в (ЕР 0 120 516 BI и US 4,940,838). Други подходящи вектори, които могат да бъдат използувани за въвеждане на ДНК, съгласно изобретението в един растителен приемник, могат да бъдат подбрани от вирусни вектори, напр. не-интегриращите се растителни вирусни вектори, произхождащи от двойноверижните растителни вируси (напр. CaMV) и едноверижни вируси, вируси близнаци и подобни. Използуването на такива вируси може да бъде с предимства, особено когато е трудно стабилно да се трансформира растителният приемник. Такъв може да бъде случая с дървесните видове, по-специално дървета и лози.

Изразът “клетки приемници включващи една химерна ДНК последователност в техния геном съгласно изобретението” ще означава клетки, както и многокпетъчни организми съдържащи такива клетки, или състоящи се главно от такива клетки, които стабилно включват споменатите химерни ДНК в техния геном, като по този начин запазват химерната ДНК и предпочитателно предават копие от такава химерна ДНК на клетките предшественици, било чрез митоза или мейоза. Такива клетки приемници могат да бъдат прокариотни организми като бактерии, но също и еукариотни организми като дрожди. Също клетки от еукариоти в клетъчни култури, като клетъчни култури от растения или от животни като бозайници, могат да бъдат предвидени да включват стабилно химерна ДНК. Съгласно едно предпочитано изпълнение на изобретението, се предлагат растения, които по същество се състоят от клетки, включващи едно или повече копия от споменатите химерни ДНК в техния геном и които са способни да прехвърлят едно копие или копия на техните предшественици, за предпочитане по Менделов тип. Въз основа на транскрипция и транслация на химерни ДНК, съгласно изобретението, онези клетки, които продуцират САН ще прояват повишена резистетност към цианамид. Въпреки, че принципите, които определят транскрипцията на ДНК в растителни клетки не винаги са изяснени, създаването на химерни ДНК, способни да бъдат експресирани в тъкани, които са обект на селекция чрез цианамид, като калус, семена, ембриогенни тъкани или меристемни тъкани, или конститутивна експресия, понастоящем е рутинна практика. Области

за инициация на транскрипцията, които рутинно се използуват за експресия на трансформирани полинуклеотиди по конститутивен начин, са промотори, които се получават от мозаечния вирус на цветното зеле, по-точно транскрипт на 35S РНК и 19S РНК и т. нар. Т-ДНК промотори на Agrobacterium tumefaciens. По-специално следва да се отбележи нопалин синтазния промотор, октопин синтазния промотор (както е представено в ЕР 0 122 791 BI) и манопин синтазния промотор. В допълнение могат да бъдат използувани растителните промотори, които могат да бъдат съществено конститутивни, какъвто е генният промотор на оризовия актин. Изборът на промотор Ф не е съществен, въпреки че трябва да бъде ясно, че силни конститутивни промотори ще проявяват експресия в тъкани, където се провежда селекция. По-нататък известно е, че удвояването на някои елементи, т.нар. усилватели, може значително да повиши нивото на експресия на ДНК под тяхно въздействие (вж. напр.: Key R. et al., (1987), Science 236, 1299-1302: удвояването на последователността между -343 и -90 на CaMV 35S промотора повишава активността на този промотор). В допълнение към 35S промотора, единично или двойно усилен, примери за силни промотори са светлинно индуцируемия промотор на малката субединица на рибулозо бифосфат карбоксилазата (rbcSSU) и промоторът на ф хлорофил а/b свързващия белтък (Cab). В настоящето изобретение са предвидени също хибридни промотори, които съдържат физически свързани елементи от различни промоторни области. Един добре известен техен пример е т.нар. CaMV-усилен промотор на манопин синтазата (US Patent 5,106,739), който включва елементи от промотора на манопин синтазата свързани с CaMV усилвателя.

Специфично за трансформацията на едносемеделни е, че използуването на интрони между промотора и селектируемия маркерен ген повишава експресията.

• ·

Терминът “промотор “ се отнася за област в ДНК преди структурния ген участвуваща в разпознаването и свързването на РНК полимераза и други белтъци за иницииране на транскрипцията. “Растителен промотор” е промотор способен да инициира транскрипция в растителни клетки. “Конститутивен промотор” е промотор, който е активен в повечето заобикалящи го условия и състояния на развитие или клетъчна диференцировка.

Конститутивен промотор е предпочитан в това изобретение, тъй като селекцията за трансформанти може да бъде извършвана на различни етапи и с различни тъкани. Така един конститутивен промотор не ограничава възможностите за селекция.

Изборът на подходящ конститутивен промотор в това отношение е от значение за приложението на други промотори в същия процес на трансформация. Известно е, че удвояването на промотори е повлияващо върху експресията на гените под контрола на споменатите промотори. Тъй като целта на експресия на селекционен маркер е, да бъде използувана само за селекция на растения, които едновременно с това са трансформирани с даден ген от интерес, трябва да се има предвид, че употребата на същия промотор за селектируемия маркерен ген и генът от интерес може да създаде проблеми.

По отношение необходимостта от завършваща транскрипцията област, общо се счита, че такава област повишава надеждността, както и ефикасността на транскрипцията в растителни клетки. Употребата на такава област следователно е силно предпочитана в контекста на настоящето изобретение.

По отношение приложимостта на изобретението за различни растителни видове трябва да се отбележи, че едно особено изпълнение на изобретението просто е илюстрирано с трансгенни домати, картофи, ориз и растения Arabidopsis като пример, действителната приложимост бидейки в действителност неограничена до тези растителни видове.

Въпреки че някои от изпълненията на изобретението могат да не бъдат понастоящем приложими в практиката, напр. тъй като някои растителни видове са все още неподатливи на генетична трансформация, практикуването на изобретението с такива растителни видове е просто въпрос на време, а не принципен въпрос, тъй като податливостта на генетична трансформация като такава не е в съответствие с по-долу стоящото изпълнение на изобретението.

Под “трансформация на растения” се има предвид всеки метод, с който ДНК е въведена в растението. Такъв процес на трансформация не трябва обезателно да включва период на регенерация и/или тъканно култивиране.

Трансформацията на растителни видове понастоящем е рутинна практика за един внушителен брой растителни видове, включително както Dictyiedoneae така и Monocotyledoneae. По принцип всеки метод за трансформация може да бъде използуван за вмъкване на химерна ДНК в подходяща клетка-предшественик съгласно изобретението. Методите могат да бъдат подходящо подбрани от калций/ полиетиленгликоловия метод за протопласти (Krens, F.A. etal., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol.Biol. 8^363373), електропорация на протопласти (ShilNto R.D. et al., 1985, Bio/ Technol. 1099-1102), микроинжектиране в растителния материал (Crossway A. et al., 1986, Mol.Gen.Genet 202, 179-185). ДНК или PHKпокрити микропрожектили) бомбардиране c микропрожектили на различен растителен материал (Klein Т.М. et al., 1987, Nature 327, 70),

МММК • ···· ······ ··· ·· ·· ···· • ··· · · · ·· · • ·· · · · ······ • · · · · · ··· *·· 10·· ··· ·· ·· инфектиране с (неинтегративни) вируси, Agrobacterium tumefaciens медииран генен пренос в растения чрез инфилтриране на растенията или трансформация на зрелите полени или микроспори (ЕР 0 301 316) и подобни. Един предпочитан метод съгласно изобретението включва медииран с Agrobacterium ДНК пренос . Особено предпочитана е употребата на така наречената бинарна векторна технология както е представено в ЕР А 120 516 и U.S.Patent 4, 940,838).

Трансформацията на домати предпочитано е провеждана както е описано от Van Roekel et al. (Van Roekel, J.S.C. et al. Plant Cell Rep. 12, > 644-647). Трансформацията на картофи е провеждана предпочитано както е описано от Hoekema et al. (Hoekema, A., et al. L 273-2781989).

Въпреки че са разглеждани като в известна степен неподатливи на генетична трансформация, едносемеделните растенията са възприемчиви към трансформация и могат да бъдат регенерирани плодовити трансгенни растения от трансформирани клетки или ембриони, или друг растителен материал. Понастоящем предпочитани методи за транформация на едносемеделни са бомбардирането с микропрожектили на ембриони, експланти или суспендирани клетки, директното поглъщане на ДНК или чрез тъканна 0 електропорация (Shimamoto, et al., Nature 338, 274-276, 1989). Трансгенни царевични растения са получени чрез въвеждане на Streptomyces hygroscopicus bar-ген, който кодира фосфинотрицин ацетилтрансфераза (един ензим, който инактивира хербицида фосфоинотрицин), в ембриогенни клетки на царевична суспенсионна култура чрез микропрожектилно бомбардиране (Gordon-Kamm, Plant Cell, 2,603-618, 1990). Житни растения са регенерирани от култура на | ембриогенна суспензия чрез селекция на ембриогенен калус за ] получаване на ембриогенни суспенсионни култури (Vasil Bio/Technol.

• 8,429-434,1990). Комбинацията с трансформационни системи за тези култури прави възможно приложението на настоящето изобретение за едносемеделни.

Едносемеделните растенията, включително търговски важни култури като ориз и царевица също са податливи на пренос на ДНК чрез щамове Agrobacterium (вж. WO 94/00977; ЕР 0 159 418 В1; Gould J, Michael D, Hasegawa O, Ulian EC, Peterson G, Smith RH, Plant Physiol. 95, 426-434, 1994).

За получаване на трансгенни растения способни да експресират повече от един химерен ген има на разположение известен брой алтернативи, включително следните:

A. Използването на ДНК, напр. Т-ДНК на един бинарен плазмид, с известен брой модифицирани гени, физически свързани с втори подлежащ на селекция маркерен ген. Предимството на този метод е, че химерните гени са физически свързани и следователно се предават като един единичен Менделов локус. Изобретението е особено полезно в това отношение, тъй като то прави възможно втори селектируем маркер да бъде въвеждан след един вече съществуващ селектируем ген -маркер в комбинация, която представлява интерес. Така селекцията за ретрансформанти може да бъде направена без да се взима предвид природата на първия селектируем маркер.

B. Кръстосано опрашване на трансгенни растения, всяко от което е вече способно да експресира един или повече химерни гени, за предпочитане свързани с един селектируем мркерен ген, с полен от едно трансгенно растение, което съдържа един или повече химерни гени свързани с друг селектируем маркер. След това семето, което е получено от това кръстосване може да бъде селекционирано въз основа наличието на двата селектируеми маркери или на базата на наличието на самите химерни гени. Растенията получени от • ···· · · ·· ·· ··· ·· · · ···· • ··· · · · · · · • ·· · · · ······ • · 18 · · · · ··· ··· ··· ··· ♦ · ·· селекционираните семена могат след това да бъдат използувани за следващо кръстосване. По принцип химерните гени не са на разположение в един единичен локус и следователно гените могат да сегрегират като независими локуси. Следователно тук възможността да се селекционират двата селектируеми маркери е едно от предимствата на настоящето изобретение.

C. Използуване на известен брой от множество химерни ДНК молекули, например плазмиди, всеки един притежаващ един или повече химерни гени и един селектируем маркер. Ако честотата на ко-трансформация е висока, тогава селекцията на базата на само един маркер е достатъчна. В други случаи, селекцията на базата на повече от един маркер е предпочитана.

D. Последователна трансформация на трансгенни растения съдържащи един пръв, втори и т.н. химерен ген с нова химерна ДНК, включва по избор един селектируем маркерен ген. Както в метод В, химерните гени по принцип не са в един единичен локус и химерните гени могат поради това да сегрегират като независими локуси.

E. Комбинации от гореспоменатите стратегии.

Настоящата стратегия може да зависи от различни условия, които биха могли лесно да се определят по отношение на родителските линии ( директно развитие, нарастване, използуване в програма за развъждане, употреба за получаване на хибриди), но не е критична по отношение на описаното изобретение.

Въпреки че за настоящето изобретение не е необходимо, известно е, че почти всички растения могат да бъдат регенерирани от култивирани клетки или тъкани. Значението за регенерацията варира за различните видове растения, но общо една суспензия от • ···· · · ·· ·· ··· ···· ···· • ··· · · · ·· · • · · · · · ··· ···

19.:. .:.

трансформирани протопласти или едно петриево съдче съдържащо трансформирани експланти е предоставено за пръв път. Пускането на пъпки може да бъде пряко индуцирано или индиректно ( от калус) чрез органогенеза или ембриогенеза и последващо вкореняване. Освен селективното съединение, средата за култивиране общо трябва да съдържа различни аминокиселини и хормони, като ауксин и цитокини. Ефективната регенерация ще зависи от средата, от генотипа и от историята на културата. Ако тези три променливи са контролирани, регенерацията обикновено е репродуцируема и повторяема.

След стабилно включване на трансформираните генни последователности в трансгенни растения, характрните черти от тях могат да бъдат пренесени на други растения чрез полово кръстосване. Може да бъде използувана всяка една от стандартните техники за развъждане, в зависимост от видовете, които ще бъдат кръстосвани.

ПРИМЕР 1

Кпониране на гъбен ген кодираш цианамид хидратаза (САН) в една хетероложна експресионна касета

а.Конструкти за трансформация на двусемеделни

Конструктът pMOG874 съдържа кодиращата област от цианамид хидратазния ген на почвената гъба Myrothecium verrucaria, която е свързана оперативно с CaMV 35S промотора и CaMV 35S терминатора. Този химерен ген е клониран в бинарния вектор рВ11О1 (Jefferson et al. EMBO J. 6,3901, 1987) като се замества β-глюкуронидазната кодираща област и нопалин синтазния терминатор.

···· • ··

Конструктът е получен чрез добавяне на едно Xhol място на 5’ края и едно Sstl място на 3’-края на един 899 Ьр кДНК фрагмент на САН (позиция 235-1197 на последователност публикувана от MaierGreiner et al. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4260-4264) с PCR като са използувани праймерите р1:

5’ACCGAGCTCGAATTCGGCACGAGGTTGACATGATACCTTCCTG 3’ и р2: 5OACCTCGAGAATTCGGCACGAGGTACGATCCTACTTCCTCGC 3’ между местата Xhol и Sstl на растителния експресионен вектор pRT101, двете места принадлежат на полилинкера, който е вмъкнат между 35S промотора и 35S завършващия сигнал на pRT101 (Topfer et al. 1987, Nucl.Acids Res. 15:5890).

След това химерният ген е срязан с Pstl, стърчащите краища са изгладени с Т4 ДНК полимераза и запълненият фрагмент е клониран в Smal мястото на pBIN19 (Bevan, М. Nucl.Acids Res. 12.8711-872. 1984).

В конструкта pMOG1156 един допълнителен β-глюкуронидазен ген оперативно свързан с 35S промотора и 35S терминатора е вмъкнат като Xhol/Sall фрагмент в Sall място на pMOG874.

Двата конструкта съдържат като допълнение към новия САН селекционен маркер конвенциалният NPTII селекционен маркер, свързан с нопалин синтазния промотор и нопалин синтазния терминатор както е в pBIN19.

Ь. Конструкти за трансформация в едносемеделни

По същия начин както е направен pMOG874, експресионната касета е клонирана във високо копиен вектор (pRT101, Topfer, R. et al.,

Nucleic Acids Res. 15, 5890, 1987), което води до създаване на pMOG873 (фиг.8).

Едно производно на pMOG22 (фиг. 3, преставено на Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands на 29 януари 1990, под No CBS 101.90) е изготвено чрез въвеждане на едно Κρη I рестрикционно място в полилинкера на pMOG22 между EoR I и Sma I място. Ориентацията на полилинкера също е обърната. Този плазмид, преименуван pMG1005, съдържа един резистентен на хигромицин ген между левия и десния Т-ДНК край (фиг.4). Експресионната касета

1.5 kb включваща cah гена под контрола на 35S промотора и 35S терминатора е клонирана между H/nd III и Вап?Н I рестрикционните места. Този плазмид е преименуван pMOG1278 (фиг.5). Бинарният вектор pMOG1295 (фиг.6) е дериват на pMOG1278 и съдържа на Sal I рестрикционно място една GUS- експресионна касета както е описано от Vancanneyt, G. et al. (Mol. Fen.Genet., 220.245-250,1990).

pMOG1253 е получен като се изхожда от pMOG18 (Sijmons, Р.С. et al., Bionechnol. 8* 217-222, 1990), който съдържа двойно повишения 35S промотор, AIMV 4 РНК лидерната последователност, GUS-генът и nos-терминатора в една експресионна касета като един EcoR I Hind III фрагмент. Плазмидът p35S GUS INT (Vancanneyt, 1990) e хидролизиран със SnaB I и Msc I; полученият 426 bp фрагмент, съдържащ част от кодиращата област за GUS гена и ST-LS1 интрон, е изолиран и клониран в pMOG18, линеаризиран със SnaB I и Msc I. От получения плазмид е изолиран един 3189 bp EcoR I - Hind III фрагмент и е клониран в pMOG22; получава се pMOG1253 (фиг.7). pMOG617 (фиг.9) е получен чрез клониране на хигромицин експресионната касета от pMOG22 в Hind III място на висококопийния вектор pMOG18.

···· · • ·· ··· · • · ·

...* 22···

Пример 2

Трансформация на картофи

По-долу е описан метода използуван за трансформация на сегменти от стъблото на Solarium tuberosum cv. Kardal като е използуван Agrobacterium tumefeciens. Грудкови експланти от in vitro култивирани картофени растения са използувани 3 до 8 седмици след преноса. Растенията са култивирани на среда за развъждане (Multiplication Medium -MUM) при 16-часов светлинен период (1700 ф лукса) на 24°С и 8-часов тъмен период на 2ГС (Различните среди могат да се открият на Таблица 2). Върху стерилна филтърна хартия напоена със среда за измиване (Washing Medium- WAM) са нарязвани сегменти от стъблото с размери около 5 мм и са събирани в съдче съдържащо WAM. За около 300 експланта WAM е заменяна със среда за предварително култивиране (Pre cultivation Medium* PRM). Съдчетата са култивирани при 80 об./мин. при същите условия за култивиране както е описано по-горе за около 24 часа. Всички използувани бинарни вектори в това изследване съдържат nptll ген като един растителен селектируем маркер и nptlll като бактериален селектируем маркер. Плазмид pMOG410 допълнително включва един ф химерен gus ген съдържащ един интрон (Vancanneyt et al.

MoLGen.Genet., 220, 245-250, 1990). Плазмид pMOG1156 допълнително включва gus гена и химерния cah ген кодиращ цианамид хидратаза. Плазмид pMOG874 включва допълнително cah гена. Плазмиди са подържани в E.cofi и A.tumefaciens при селекция с канамицин.

Щамът на Agrobacterium използуван в това изследване включва един рифампицин селекционен маркер в С58 хромозомна основа.

Конструкцията на хелперния щам ЕНА105 е описана от Hood et al.

(1993), Transg.Res. 2,208-218.

• ·· ·· ·· · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · ··· ·· ··

Агробактериите са култивирани за една нощ в LB среда с антибиотици (rifampicin 20 mg/l, канамицин 100mg/l). Нощната култура е разреждана до OD₆₀₀=0.1 и култивирана до OD₆oo=0.3 в LB среда без антибиотици за около 2 часа. Бактериалните суспензии са центрофугирани при 1600хд за 15 мин. на стайна температура. Бактериите са ресуспендирани в среда за измиване и използувани за експерименти с кокултивиране. Средата за предварително култивиране е отливана от съдчетата и е заменяна със суспензия от Agrobacterium. Съдчетата са инкубирани за 20 мин., след което експлантите са изплаквани два пъти със среда за измиване. Експлантите са изсушавани върху стерилна филтърна хартия и инкубирани за 48 часа в платки съдържащи среда за кокултивиране (Cocultivation Medium -СОМ). След това експлантите са прехвърляни в среда за посткултивиране (Post cultivation Medium -PCM) и инкубирани за 72 часа. Впоследствие експлантите са прехвърляни в индуцираща стръкове среда (Shoot inducing Medium - SIM), съдържаща няколко концентрации цианамид или канамицин. След две седмици експлантите са субкултивирани в същата среда и след около три седмици експлантите са поставяни в среда за удължаване на стръковете (Shoot elongation Medium - SEM), съдържаща цианамид или канамицин както бе споменато по-горе. Когато стръковете станат достатъчно дълги за да бъдат изрязани, те са прехвърляни в среда за индуциране на корени (Root inducing Medium - RIM). Стръковете, които могат да пускат корени са прехвърляни в среда индуцираща корени (RIM), съдържаща 50mg/l цианамид или 30 mg/l канамицин. Едновременно с това е определяна трансгенната природа на стръковете чрез тестиране листата на вкоренените пъпки за експресия на gus ген като е използуван хистохимичния GUS тест. Изглежда, че за pMOG1156 пускането на корени от трансгенни стръкове в среда съдържаща цианамид корелира напълно с експресията на gus гена.

····

Таблица 1. Честота на трансформацията на сегменти от стъбло на картоф pMOG1156 (cah-gus-nptil)

Селекция по време	Брой на	Брой на	Бройна	Брой на
на регенерация	инокулирани	изрезани	пускащи	gus+стръкове
(mg/l)	експланти	стръкове	корени стръкове
Цианамид 40	48	15	2	2
Цианамцд 30	48	50	12	12
Цианамид 20	48	56	6	6
Канамицин 50	48	26	16	16

pMOG41Q (gus-nptll)

Селекция по време	Брой на	Брой на	Брой на	Брой на
на регенерация	инокулата	изрязани	пускащи	gus+стръкове
(mg/l)	d експланти	стръкове	корени стръкове
цианамид 40	62	0	0	0
цианамцд 30	62	10	0	0
цианамид 20	62	48	0	0
канамицин 50	58	24	13	12

Μ pMOG874 (cah-nptll)

Селекция по време	Брой на	Брой на	Брой на	Брой на
на регенерация	инокулирани	изрязани	пускащи	gus+стръкове
(mg/l)	експланти	стръкове	корени стръкове
цианамид 40	58	10	1	n.d.
цианамид 30	58	40	8	n.d.
цианамид 20	58	81	2	n.d.
канамицин 50	58	34	26	n.d.

n.d. не е определяно

Таблица 2 Състав на различните среди

··♦

Среда:	WAM	PRM	COM	POM	SIM	SEM	RIM	MUM
Макро соли	1xMS	1x MS	1xMS	1xMS	1x MS 1x MS	1/2X MS	1/2x MS
Витамини	B5	B5	B5	B5	B5	B5	1/2R3	1/2R3
Захароза	3%	3%	3%	3%	3%	3%	1%	1%
Агар	-	0.8%	0.8%	0.8%	0.8%	0.8%	0.8%	0.8%
MES (g/l)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
РН	5.8	5.8	5.8	5.8	5.8	5.8	5.8	5.8
Zeatin Riboside	-	0.5	0.5	3.0	3.0	3.0	-	-
(mg/l)
2,4-D	-	1.0	1.0	-	-	-	-	-
IBA	-	-	-	-	-	-	0.1	-
Cefotaxim	-	-	-	200	200	200	100	-
Vancomycin	-	-		100	100	100	50

MS: Murshige and Skoog, Physiol. 15.473-479.1962

BS: Gamborg BS (Gamborg, Orl et al., Exp.Cell Res. 50.151-158,1986)

Пример 3

Трансформация на домати

По-долу е описан методът използуван за трансформация на двусемеделни на Leucopersicon esculentum cv. Money Maker като е използуван Agrobacterium tumefaciens. Бинарните вектори и щамове

Agrobaceria за този метод за трансформация са идентични с тези • ···· ·· · • ··· • ·

• ·· ·· ·· · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · ··· ·· ·· описани по-горе. Поници от домати са развивани на Среда за попълване (Germination Medium - GEM) при 16-часов светлинен период (1700 лукса) на 24°С и 8-часов тъмен период на 21 °C (съдържанието на различните среди може да бъде намерено на Таблица 4). Семеделни експланти от 5 до 7-дневни понии са нарязвани върху стерилна филтърна хартия напоена със среда за измиване (WAM) и нанасяни върху платки съдържащи среда за ко-култивиране (СОМ). Платките, всяка съдържаща около 50 експланта, са инкубирани за една нощ при същите условия както е описано по-горе.

Преинкубираните експланти са потапяни внимателно в Agrobacterium за заразяване в продължение на 20 минути.

След това експлантите са попивани до сухо със стерилна филтърна хартия и инкубирани за 48 часа на втория набор от платки за ко-култивиране. Следвайки порядъка, експлантите са инкубирани за 72 часа върху платки съдържащи среда за посткултивиране (Postcultivation Medium РОМ), след което експлантите са пренасяни в среда индуцираща стръкове (Shoot inducing Medium SiМ), съдържаща няколко концентрации от цианамид или канамицин. Всеки три седмици експлантите са субкултивирани в същата среда. След около 8-12 седмици стръковете са изрязвани и поставяни в среда за индуциране на корени (RIM). Стръковете, които могат да пускат корени са пренасяни в RIM съдържаща 50 mg/l цианамид и 30 mg/i канамицин. Едновремено с това листата на пусналите корени стръкове са тестирани за експресия на gus гена с хистохимичен GUS тест.

9 9 • ·

Таблица 3. Резултати от трансформация на доматени семеделни експланти pMOG1156 (gus-nptll-cah)

Селекция по време	Брой на	Брой на	Бройна	Брой на
на регенерация	инокулирани	изрязани	пуснали	gus+стръкове
(mg/l)	експланти	стръкове	корени стръкове
цианамид 40	30	5	3	3
цианамцд 30	30	5	0	0
цианамид 20	30	0	0	0
канамицин 100	30	5	3	4

pMOG41Q (gus-nptll)

Селекциа по време	Брой на	Бройна	Брой на	Брой на
на регенерация	инокулирани	изрязани	пуснали	gus+ стръкове
(mg/l)	експланти	стръкове	корени стръкове
цианамид 40	30	0	0	0
цианамид 30	30	3	0	0
циамамод 20	30	0	0	0
канамицин 100	30	4	3	3

PMOG874 (cah-nptll)

Селекция по време	Брой на	Брой на	Брой на	Бройна
на регенерация	инокулирани	изрязани	пуснали	gus+стръкове
(mg/l)	експпанти	стръкове	корени стръкове
цианамид 40	35	1	1	n.d.
цианамид 30	35	0	0	n.d.
цианамид 20	35	2	0	n.d.
канамицин 100	35	4	1	n.d.

n.d.: не е определяно

Таблица 4. Състав на различни среди

Среда:	WAM	COM	POM	SIM	RIM	GEM
MS Макро соли	1x	1x	1x	1x	1x	1x
Витамини	B5	B5	B5	B5	B5	B5
Захароза	3%	3%	3%	-	1%	1%
Глюкоза	-	-	-	1%	-	-
Агар	-	0.8%	0.8%	0.8%	0.8%	0.8%
MES (g/l)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
PH	5.8	5.8	5.8	5.8	5.8	5.8
Zeatin Riboside (mg/l)	-	2.0	2.0	2.0	-	-
ΙΑΑ	-	0.1	0.1	0.1	-	-
2,4-D	-	0.05	-	-	-	-
IBA	-	-	-	-	0.25	-
Carbenicillin	-	-	-	500	-
Cefotaxim	-	-	200	-	200	-
Vancomycin	-	-	50	•	-	-
Acetosyringone (mM)	-	0.2	-	-	-	-

• ···· · · ·· ·· ··· ···· ···· • ··· · · · · · · • ·· · · · ······ • · · · · · • е* ··· 31··· ··· ·· ··

Пример 4

Трансформация на Arabidopsis

По-долу е описан методът прилаган за трансформация на коренови сегменти от Arabidopsis thaliana cv С24 като е използуван Agrobacterium tumefaciens. Бинарните вектори за този метод за трансформация са идентични с тези описани по-горе.

Шест мг семена от Arabidopsis са покълвани в съдче съдържащо среда за покьлване (Germiation Medium GM) при 16-часов светлинен период (1700 лукса) на 24°С и 8-часов тъмен период на 21°С при 80 об./мин. (Съдържанието на различните среди може да бъде намерено в Таблица 4). Корени от 9-дневни поници са изолирвани в стерилно петриево съдче и събрани в среда за покълване (GM). Корените са нарязвани на сегменти от около 3-5 мм и около 100 експланта са нанасяни равномерно на найлонова мембрана (О 8см), която е поставена върху платки съдържащи среда индуцираща калуси (Calus Inducing Medium - CIM). Платките са инкубирани 3 дни при същите условия както е описано по-горе.

Щамът Agrobacterium използуван в това проучване включва един рифампицин селекционен маркер в С 58 хромозомна основа. Конструкцията на хелперния щам MOG101 е описана от Hood et al. (1993). Agrobacteria са култивирани за една нощ в LB среда с антибиотици (рифампицин 20 mg/l, канамицин 100 mg/l). Културата след развитие за една нощ е разреждана 1:10 в LB без антибиотици и оставяна да се развива за около 3 часа. Бактериалните суспензии са центрофугирани при 1600хд за 15 мин. на стайна температура. Бактериите са ресуспендирвани в GM, нагласяни до OD₆₀₀=0.1 и използувани за кокултивиране.

···· · · ·· ·· • · · ·· · · · · ··· · · ····

Мембраната съдържаща около 100 експланта е инкубирана за 2 минути със суспензията от Agrobacterium и изсушена върху стерилна филтърна хартия за отстраняване излишека от бактерии. Мембраната с експланти са култивирани за 48 часа на CIM платки. След изплакване на мембраната и експлантите с течна GM те са инкубирани в платки с индуцираща стръкове среда (SIM), съдържащи няколко концентрации цианамид или канамицин. След 5 дни мембраната с експлантите е пренасяна в същата среда (SIM) за субкултивиране. Второто субкултивиране е след 2 седмици. След около 4 седмици кокултивиране 60 стръка за една цианамидна концентрация са изрязвани и поставяни на платки със среда за удължаване на стръковете (SEM), съдържаща 30 mg/l цианамид. Стръковете, които са способни да пуснат корени са проверявани за техния трансгенен характер чрез тестиране на листата и цветовете за експресия на gus ген като е използуван хистохимичен GUS тест.

Проведени са три експеримента. Стръковете получени от експерименти 98-8 и 98-11 са пренасяни в среда за пускане на корени (SEM) съдържаща 30 mg/l цианамид. Стръковете получени от експеримент 98-13 са пренасяни в среда за пускане на корени съдържаща същата концентрация както селекционната среда (SIM), за резултати вж. Таблица 4а. Стръковете получени след канамицинова селекция (50 mg/l) са пренасяни в среда за пускане на корени съдържаща 25 mg/l канамицин.

Таблица 4. Среди, които са необходими за коренова трансформация на Arabidopsis thaliana С24

Компоненти на Средите	Среди	GM	CIM	SIM	SEM
Съставки	макро	B5	B5	B5	MS
	елементи
	микро	B5	B5	B5	MS
	елементи
	витамини	B5	B5	B5	MS
	захароза (д/1)				10
	глюкоза (д/1)	20	20	20
	Daichin arap (д/1)		10	10	10
Хормони	2,4-D		0.5
	Kinetin		0.05
	2-ip			5
	ΙΑΑ			0.15
Антибиотици	vancomycin			100	50
	Carbenicillin			500
	Cefotaxime				100
Коренови	експланти трансформирани	C	pMOG410	бяха

неспособни да регенерират върху съдържаща цианамид среда. Дори mg/l цианамид са достатъчни да предотвратят регенерация на експланти трансформирани с конструкт който не включва gus гена.

При концентрации 20 до 40 mg/i цианамид се наблюдава развитие на • ···· · · ·· ·· •· · ·· ·· ···· ···· · · ···· • ·· · · · ······ • · · · · ·

•..... 34*.........

някои калуси, но при 50mgfl и повече експлантите не бяха жизнени и ставаха напълно кафяви. От друга страна експланти трансформирани с cah гена (pMOG1156) бяха способни да регенерират при всички концентрации на цианамид, дори при 80 mg/l. При по-ниски концентрации регенерацията на стръковете беше по-бърза отколкото при тази с канамицин.

Въпреки че имаше на разположение повече стръкове, за едно третиране са събирани 60-65 стръкове и са поставяни в среда за пускане на корени. При по-ниски концентрации на цианамид се ® развиват същото количество стръкове както при селекция с канамицин (приблизително 70-100 на петриево съдче).

Налице е ясна корелация между развитието на калуси и GUS експресията при цианамидна селекция с коренови експланти трансформирани с pMOG1156 (фиг. 4b). GUS анализ на стръкове получени при цианамид 0 mgfl (NS) не проявяват оцветяване, което показва, че цианамидът е необходим за да се получат трансгенни стръкове.

Таблица 4а. Резултати от трансформация на Arabidopsis с PMOG1156

	Експеримент 98-8	Експеримент 98-11	Експеримент 98-13
Конц. на	брой на	% стръкове²	брой на	%стръкове	брой на % стръкове
Цианамцд	растения¹	корени	растения	корени	растения	корени
(mg/l)
С20	0	0	1	1.7	3	4.8
СЗО	4	б.З	2	3.2	9	14.5
С40	5	8.2	3	4.5	1	1.6
С50	nd.	nd.	5	8.1	0	0
С60	5	8.2	nd.	nd.	4	6.0
С80	9	13.8	10	15.6	8	11.4
К50	29	46.8	19	47.5	14	20.6

(1) : Общият брой на растенията, включващ стръковете развити в растения и способни да пускат корени върху съдържаща цианамид среда.

(2) : % стръкове, пускащи корени = брой растения/ общ брой стръкове* 100% (3) : % на синьо оцветени растения сравнени с общия брой растения

A • ♦ · · ·

36..........

Таблица 4b. Процент на GUS експресиращи Arabidopsis растения получена чрез селекция с цианамид или канамицин.

	pMOG 410	pMOG 1156
Третиране	с³зо³	СЗО³	Някои конц. свърз. c третиране³
С20	nd	01	0
СЗО	nd	75-100	78
С40	nd	40-100	100
С50	nd	80	nd.
СбО	nd	80	100
С80	nd	67-90	100
“Tso	ΐόδ²	82-92	100

	(1) :	% растения оцветени в синьо
	(2) :	Всички pMOG 410 стръкове са пуснали корени при канамицин 25mg/l
φ	(3) :	С = цианамид (mg/l)
	(4) :	К - канамицин (mg/l)

(5) : концентрация в среда за пускане на корени • ···· · · ·· ·· ·· · ·♦ ·· · · · · ···· · · · · · · • · · · · · ···*·· • · · · · ·

...... 37··· .......

Пример 5

Трансформация на ориз

По-долу е описан метод използуван за трансформация на калус произхождащ от скугелума на зрели ембриони от Oryza saliva cv. Taipei 309 като е използуван Agrobacterium tumefaciens щам LBA1119-pMOG1295 (включващ cah-ген) и щам LBA1119-pMOG1295 (контрола). Стерилни обелени оризови зърна бяха покьлнати в платки съдържащи ицдуцираща калус среда (Callus Induction Medium - CIM) ф на тъмно на 28°С. (Състава на различни среди може да бъде намерен на Таблица 5). След три седмици ембриогенният калус от скугелума е изолиран и субкултивиран в същата среда при същите условия. След

2-3 седмици ембриогенните калуси са нарязвани на сегменти от около

2-3 мм и култивирани за 4 дни в платки съдържащи CIM. Щамовете Agrobacterium използувани в това проучване включват рифампицин селекционен маркер в С 58 хромозомна основа. Конструкцията на хелперния щам ЕНА105 е описана от Hood et al. (1993). Agrobacteria са развивани за 4 дни в платки съдържащи АВ среда с антибиотици (рифампицин 20mg/l, канамицин 100 mg/l). Agrobacteria са събирани в LIM и ODeoo θ нагласяно до 1.0-1.5. Тази суспензия е използувана ф за кокултивиране. Калуси са инкубирани за 10 минути със суспензия от Agrobacterium и са изсушавани върху стерилна филтърна хартия за отстраняване излишека от бактерии. Калуси са култивирани за 48 часа в платки със среда за кокултивиране (СОМ) на тъмно и при 25°С. Петдесет pMOG1295 калуси и 20 pMOG1253 калуси са култивирани за една концентрация на цианамид. Използувани са следните концентрации цианамид: 0, 15, 30, 60, 100, 150, 200, 300 и 500 mg/l. Хигромицин е прилаган в концентрация 50mg/l. Калуси са инкубирани в платки с първа селекционна среда (First Selection Medium - FSM) съдържащи няколко концентрации цианамид или хигромицин на тъмно при 28°С. След 3 седмици калусите са • ·· ·· ·· · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · ··· ·· ·· пренасяни в Индуцираща ембриони среда I (Embryo Induction Medium I - EIM I) съдържаща същата концентрация цианамид или хигромицин. След други 3 седмици калусите са субкултивирани в Индуцираща ембриони среда II (EIM II) съдържаща същата концентрация цианамид или повишена концентрация на хигромицин (75 mg/l). Калуси са пренасяни в индуцираща стръкове среда (SIM) съдържаща същата концентрация цианамид както при FSM, EIM I, EIM II и са култивирани при 12 часов светлинен период (2600 лукса) и 12 часа тъмнина на 28оС. Приблизително 3 седмици след пренасяне на калусите на SIM, стръковете са регенерирани, изрязвани и поставяни в съдове съдържащи пре-оранжерийна среда (Pre-Greenhouse Medium - PGM). Калуси не са образувани при концентрации на цианамид 100 mg/l или по-високи. При 15mg/l цианамид, регенерационната честота на калус от двата конструкта беше еднаква (PMOG1253 7 от 16 калуса бяха способни да регенерират, pMOG1295 17 от 44). При 30 mg/l само 11 калуса от pMOG1295 проявиха развитие на зелен калус и 6 бяха способни да бъдат регенерирани.

····

Таблица 5. Среди необходими за трансформация на Oryza sativa Taipei 309

Среда	Среда	CIM	СОМ	LIM	FSM	EIMI	EIM II	SIM	PGM
Компоненти
Съставки	Макро елементи	N6	R2	R2	R2	LS	LS	LS	1/2MS
(9Л)	Микро елементи	В5	R2	R2	R2	LS	LS	LS	1/2 MS
	Витамини	В5	R2	R2	R2	LS	LS	LS	1/2MS
	Захароза	30			30	30	30	40	10
	Глюкоза		10	10
	Агароза тип 1		7		7	7	7	7
	Фитагел	2.5							2.5
	РН	5.8	5.2	5.2	6.0	5.8	5.8	5.8	5.8
Хормони	2,4-0	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
(mg/I)	IAA							0.5
	ВАР							0.3
	NAA								0.05
Добавки	Пролин (mg/I)	500
	Глутамин (mg/I)	500
	Казеин ензимен	300

Хидролизат (mg/I)

Ацетосирингон (μΜ) 100 100

Течност от кокосов

Орех (ml)

100 100

Антибиотици Ванкомицин ···· ··· • ·

• ··· ·· ·· • · · · • · · · • ··· ··· • · ·· ··

100 100 100

100 (mg/l) Cefotaxime

400 100

100 100

Пример 6 Трансформация на ориз с микропрожектилна пушка

По-долу е описан методът използуван за трансформация на неморфогенни клетъчни суспензии от Oryza saliva cv. IR 52 като е използувана микропрожектилна пушка (PIG) съгласно Finer et al.

О (Plant Cell Rep. 11,323-328,1992).

Продължителна, неморфогенна суспензионна култура от Oryza sativa cv. IR 52 е субкултивирана на седмични интервали в течна LS-4 (Linsmaier and Skoog, Physiol.Plant. 18, 100-127, 1962) среда и подържана на ротационна клатачка (110 об.мин.) на тъмно при 28°С. (Съдържанието на LS-4 средата може да се намери на Таблица Z). Три-четири дни след последното субкултивиране, 1.5 мл от тази клетъчна суспензия (прибл. 1.5 х 10⁶ клетки) са нанасяни равномерно на филтърна хартия (Whatman по 4), която след това се поставя на твърда LS-4 среда и се култивира на тъмно при 28°С за 24 часа и след това се използува директно за бомбардиране. За микропрожектилно бомбардиране е използувана направена в лабораторията микропрожектилна пушка (PIG) съгласно Finer et al. (1992). 300 цд волфрамови частици покрити с pMOG 617 (35S-gus и 35S-hyg) или pMOG 873 (35S-cah) бяха поставени в един държател на частици. Частиците бяха ускорени с помощта на 2.5 bar хелиев удар и трябваше да преминат 500 цт метален задържащ екран, поставен на 2 см под държателя на частици. Клетките на суспензията бяха поставени на 15 см под държателя на частици. PIG беше евакуирана до 30 mbar преди бомбардирането. След бомбардиране клетките бяха култивирани на тъмно при 28°С за 3 дни. След това филтрите с клетките са пренасяни на твърда LS-4 среда съдържаща • ·· ·· ·· · · · · • · · · · • · ··· · ·· • · · ··· ·· ·· различни концентрации цианамид или 50mg/l хигромицин В (еж. таблица 6). Субкултивирането е повтаряно всеки 9 дни. Резистентни микрокалуси, които са видими след 4-6 седмици са пренасяни на свежа LS-4 среда съдържаща съответен селективен агент. От два експеримента 7+41 калуси трансформирани с pMOG617 са намерени резистетни към хигромицин, докато при трансформация с pMOG873 7 калуса преживяват 20mg/l цианамид в първия експеримент (резултати от втория експеримент все още не са налице) и 0 + 4 калуси остават жизнеспособни при 40 mg/l цианамид. При концентрации 50 mg/l цианамид или по-високи не се формират калуси. Трансгенната природа беше потвърдена чрез тестиране на части от развиващия се калус за наличие на ДНК в трансформираните калуси с pMOG873. Един от 4-те преживели калуси на 40 mg/l цианамид се проявява като положителен за cah-ген в PCR експеримент.

Таблица 6. Среда необходима за трансформация на Oryza dativa cv. IR52

LS-4 течна LS-4 твърда

Макро елементи	LS	LS
Микро елементи	LS	LS
Витамини	LS	LS
Захароза (g/l)	30	30
Агароза Тип1	-	7
<дл)
pH	58	5 8
2,4-D (mg/l)	4	4

• ···· · · ·· ·· • · · ·· ·· ···· • ··· · · · ·· · • · · · · · ······ • · · · · · ··· ··· 42*** ··· ·· ··

Таблица 7. pMOG617

Селективен агент (тдЛ)	Брой на резистентни gus платките клонове положителен
Цианамид 20 Цианемид 30 Цианамид 40 Цианамид 50 Цианамид 00 Цианамид 70 Цианамид 80 Хигромицин 50	4 2 4 2 2 2 2 8

pMOG 873

Селективен агент (mg/l)	Брой на резистентни PCR платките клонове положителен
Цианамид 0 Цианамид 20 Цианамид 30 Цианамид 40 Цианамцд 50 Цианамид 60 Цианамид 70 Цианамид 80 Хигромицин 50	4 6 8 8 7 4 4 2 4 Пример 8

Летална крива за царевица

Изготвяни са основни разтвори от цианамид във вода от 10 и 100 mg/l и са стерилизирани чрез филтруване. Порции от разтворите са съхранявани на -20°С.

Среди са изготвяни чрез добавка на MS среда (4.4 д), захароза (20д), 2,4-D (2.0 д) и агар (8д) до 1 литър с вода. След автоклавиране е добавяно съответно количество цианамид (0, 10, 30, 50, 100, 150 • ·· ·· ·· · ·· е • · · · · • · ··· ··· • «е ··· ·♦ е· mg/I цианамид) и средата е наливана в 9 см петриеви съдчета. BMS течност е изготвяна както по-горе без агар.

BMS клетки са добавени към среда съдържаща цианамид по три начина:

a. BMS клетъчна суспензия е нанесена във falcon епруветка и течността е отстранена. BMS клетките са разположени по повърхността на агар на групи от около 5 мм диаметър, 5 групи на съдче, 3 съдчета на концентрация, като на базата на всяко петриево съдче е маркирана схемата за всяка група.

• Ь. Около 0.5 мл плътен клетъчен обем плюс 1.5 мл BMS течност са нанесени на повърхността на агар, клетките са нанесени на тънък слой на повърхонстта на агара. Изготвяни са по три съдчета за всяко третиране.

с. Около 0.5 мл плътен клетъчен обем плюс 1.5 мл BMS течност са нанасяни на филтърна хартия покриваща агара. Клетките са разпределяни равномерно върху повърхността на филтърната фартия. Изготвяно е по едно съдче за даден вид третиране.

Съдчетата са покривани с микропореста лента и са инкубирани при 25°С на тъмно. Растежът на клетките е наблюдаван след 7 и 14 дни.

РЕЗУЛТАТИ

Ден 8

Растежът на BMS клетки върху цианамид е определян след 8 дни.

Групите от BMS клетки наредени по повърхността на контролната среда са увеличили размера и израстват съответно на оригиналната им схема. Клетки на 10 mg/l не са израснали съответно на схемата, но височината на групите е повишена като образува неравна повърхност.

Видимо е леко намаление на растежа с повишаване концентрацията ···· • ·« • · ·· ·· ·· ·· · · · · • · · · · · • · · ··· ··· • · · · ··· ··· ·· ·· на цианамид с максимален ефект върху растежа наблюдаван при 50 mg/l цианамид.

Клетките, които са нанесени на повърхността на контролната среда са добре израснали и плътно покриват повърхността на средата. Наблюдавано е значимо намаление на растежа при найниското ниво на цианамид (10 mg/l), обаче ясно се забелязва и повишена плътност на клетките. Слабо повишение на клетъчната плътност се наблюдава при 30 mg/l цианамид, но беше трудно да се разграничат различни нива на растеж при по-високите концентрации.

При всички нива на цианамид клетките запазват млечно бял цвят, не е наблюдавано кафяво оцветяване на клетките.

Ден 15 (Таблица 9)

Намаляването растежа на BMS клетки при 10 mg/l е много ясно след 15 дни на цианамид, обаче клетките подредени на групи са израснали до тяхната оригинална схема. Клетките нанесени директно на повърхността на агар проявяват подобен отговор като тези наредени на групи, с подчертано намаление на растежа наблюдавано при 30 тдЛ plus. Клетки на 50тдЛ plus не проявяват белези на растеж и повърхността на групите остава много плоска, но клетките остават млечно бели на цвят. Подобен отговор е наблюдаван с клетки Ф нанесени върху филтър. Малки нараснали групи обаче са наблюдавани по повърхността на всички филтри, но те не се развиват по-нататък в колонии и видимо са включени от по-големите клетъчни агрегати на една смесена популация с размери типични за BMS суспензии.

| Проби за светлинно микроскопско наблюдение са взети от групите | клетки от всички концентрации на цианамид . С повишаване

Ii | концентрацията на цианамид се установява нарастващ брой мъртви

I j клетки, като клетъчното съдържимо е намалено и отделено от

I клетъчната стена и има повишен брой тъмни скорбелени зърна.

J

Клетките са наблюдавани ресуспендирани във вода и оцветени с FDA на UV светлина.
Таблица 9
Ниво на цианамид (твЛ)	Наблюдения
0	Нормални здрави клетки със случайни мъртви клетки
10	Белези на стрес Случайни групи мъртви клетки между здравите клетки Приблизително 5% мъртви
30	Забележителни разлики от контролните клетки Натрупване на скорбелени зърна Мъртви клетки с клетъчно съдържимо отделено от клетъчната стена (обвивка) Приблизително 15% мъртви клетки.
50	Съвършено различни от 30 Нарастващ брой мъртви клетки и натрупване на скорбелени зърна Приблизително 50% мъртви клетки
100	Болшинството са мъртви клетки Малки ясно сферични обекти, възможно мастни капки натрупани в клетките Клетки с намалени размери Около 90% мъртви клетки

150 Болшинството клетки са мъртви

Клетки изглеждащи по-тъмни на цвят дължащо се на натрупване на скорбелени зърна и феноли Случайни живи клетки видими в групи от мъртви клетки ф ________________________Приблизително 95-98% мъртви клетки_____________

Експериментът е повторен с цианамид в концентрации от 0,10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100 mg/l цианамид. Резултатите са сходни с тези описани по-горе, т.е. за клетките агрегирани на групи се наблюдава слабо намаление растежа при 10 mg/l. При концентрация 20 тдЛ цианамид клетъчните групи не показват нарастване от тяхната начална схема, но при по-ниски концентрации (<50 тдЛ) клетъчните групи проявяват известно нарастване на височина(което намалява при по-високи концентрации). Над 50 mg/l групите проявяват слабо оранжево оцветяване.

Резултатите от клетки нанесени върху повърхността на агар или върху филтри са сходни с тези при концентрация 10 mg/l, те показват слаб растеж (приблизително удвояване броя на изходните клетки), докато при концентрация 20 mg/l и по-високи се проявяват ограничени признаци на растеж.

Пример 8

Летална крива при банана (Musa)

За определяне потенциала на цианамид като селекционен агент за трансформация на банана, бяха направени две летални криви с една регенерираща ембриогенна суспензия от Grand nain 6 дневни ембриогенни суспензионни (Ed6b) култури, рутинно потапяни в M2

2,4-D течност, съдържаща 4.32 g/l MS соли, 45g/l захароза, стандарт Ixconc. MS витамини, 100mg/I глутамин, 100 тдЛ мио-инозитол, 100 mg/i биотин, 100 mg/l екстракт от малц при pH 5.3 и след автоклавиране са добавени 1.2 mg/l 2,4-D и 0.8 mg/l picloram.

Културите са пресявани (>250μ, <710μ ) и порции от около 50 μΙ пресята култура са пипетирани в 300μΙ течност в две среди за летална крива както е уточнено по-долу (3 повторения за платка). Културите са оставени да растат и преживяването е контролирано в продължение на следващите 3 седмици, преживяването на клетките е определяно след 21 дни с FDA оцветяване.

Среда А за летална крива: M2/MS/1.2 2,4-D ( както M2/MS/2.4-D с изключение на 1.0 mg/l 2,4-D, липса на пиклорам и +2.25 g/l гелрит): тази среда улеснява бързото деление и растеж на ембриогенен калус, но не ембриони.

Среда В за летална крива: M2/SH/0.5Pic, 0.5 2,4-D (както

M2/MS/2.4-D с изключение само 0.5 mg/l 2,4-D и 0.5 mg/l пиклорам,

SH соли (4.32g/l) вместо MS, +2.25 g/l гелрит): Тази среда улеснява ранното развитие на ембриото, което може да узрява и покълва чрез пренасяне на алтернативни среди.

• ·

Цианамид е добавян към двата типа среди, след автоклавиране, до концентрации 0, 20, 30, 50,75,100,150 mg/l.

Резултатите са представени на Таблица 10, където фигурите за клетъчен растеж са приблизителни визуални определения, не са прецизни измервания на обема на калуса. Няма значимо видима промяна на цвета в кафяв на културите и освобождаване на феноли до концентрации от >75 mg/l. Общо културите веднага спират да растат, като клетъчното деление е силно инхибирано. Цианамид инхибира растежа на ембриогенен калус с 40-50% дори при по-ниска концентрация от 20 mg/l, без да се предизвика значимо видимо увреждане. Ембриогенезата е тотално инхибирана при най-ниската тестиране концентрация.

Claims

1. Приложение на цианамид хидратаза като селекционен маркер.

2. Приложение на цианамид хидратаза като селекционен маркер в експерименти с растителна трансформация.

3. Приложение на претенция 2, характериззиращо се с това, че растенията са трансформирани с една нукпеотидна последователност кодираща цианамид хидратаза.

4. Приложение на претенция 3, характеризиращо се с това, че използваната нукпеотидна последователност е както е представена BSEQIDNO.1.

5. Метод за селекция на трансформирани растения включващ:

a. конструиране на вектор, включващ кодираща последователност за цианамид хидратаза и ген, който представлява интерес

b. трансформиране на споменатия вектор за растения или част от растения, или растителни клетки и

c. растеж на споменатите трансформанти в среда съдържаща цианамид.

6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че е използвана нукпеотидна последователност от SEQIDNO:1.

7. Приложение на цианамид за селекция на растения трансформирани с вектор съдържащ нукпеотидна последователност кодираща цианамид хидратаза.

• · · · · ·

8. Експресионна касета включваща нуклеотидна последователност кодираща цианамид хидратаза и ген, който представлява интерес.

9. Вектор включващ експресионна касета съгласно претенция 8.

10. Кпетка-гостоприемник включваща вектор съгласно претенция 9.

11. Кпетка-гостоприемник съгласно претенция 10, съгласно което тя е Agrobacterium.

12. Растение трансформирано с вектор съгласно претенция 9.

13. Растение трансформирано като е използувана стена на клеткагостоприемник съгласно претенция 11.