SK143999A3 - Use of cyanamide hydratase as a selection marker and method for the selection of transformed plants - Google Patents

Description

Použitie kyánamidhydratázy ako selekčného markéru a spôsob selekcie transformovaných rastlín

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nového selekčného markéru, najmä použitia kyánamidhydratázy ako selekčného markéru pri transformačných postupoch, konkrétne pri transformácii rastlín.

/ *

Doterajší stav techniky

Kyánamid (H₂N-C=N) je derivát nitrilu, ktorý sa podobne ako ďalšie deriváty nitrilu používa v poľnohospodárskej výrobe na stimulácii rastu a ako prostriedok ochrany rastlín. Kyánamid vo vodnom roztoku alebo vo forme vápenatej soli sa používá ako hnojivo, ktorým sa vnáša do pôdy amoniak metabolickou premenou kyánamidu. Má však ešte ďalšiu výhodu, a síce že pôsobí ako herbicíd. Takže pokiaľ sa používa ako hnojivo, je potrebné ho aplikovať pred sejbou.

Chemicky patrí kyánamid do triedy nitrilov. I cez relatívne vzácny výskyt zlúčenín obsahujúcich nitrilovú skupinu v prírode, enzýmy, ktoré hydrátujú túto skupiny boli nájdené ako v baktériách tak aj v rastlinách (napr. Nagasawa, T. et ’* al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 155: 1008-1016, Endo,

T., Watanabe, I., 1989, FEBS Lett. 243: 61-64). Enzým hydrá’ tujúci nitril bol zistený tiež v hube Myrothecium verrucaria (Stransky, H., Amberger, A., 1974, Z. Pflanzenphysiol. 70: 74-87), kde tento enzým hydrátuje nitrilovú skupinu kyánamidu za vzniku močoviny:

H₂N-C=N + HOH —> H₂N-CO-NH₂

Maier-Grenier et al. izolovali tento enzým a klonovali príslušný gén, ktorý ho kóduje (Proc. Natl. Acad. Sci. USA

88: 4260-4264, 1991). Ukázali tiež, že tento enzým prejavuje mimoriadne úzku substrátovú špecifickosť, ked zlúčeniny chemicky príbuzné kyánamidu nie sú rozpoznávané ako substrát.

Od selekčných markérov (značiek) sa očakáva, že transformovanej bunke poskytnú dominantný fenotyp, ktorý je možné využiť ako selekčné kritérium. Selekčné markéry je možné v zásade rozdeliť do dvoch tried: prvá je trieda génov, ktoré bunke poskytujú bud životaschopnosť alebo naopak letalitu v prítomnosti selekčného činidla, a druhá je trieda génov, ktoré majú zanedbateľný účinok na prežívanie buniek, ale poskytujú transformovanej bunke dajakú rozlíšiteľnú fyzikálnu charakteristiku.

Pri transformácii rastlín je frakcia buniek, ktoré inkorporujú novú DNA, všeobecne velmi malá, takže väčšina transformačných postupov používa také markéry, ktoré zaisťujú prežívanie transformovaných buniek v prítomnosti selekčného činidla

Rad selekčných markérov spadajúcich do tejto triedy je známy a už niekoľko rokov využívaný v transformačných experimentoch. Patrí sem napr. enzým neomycínfosfotransferáza (npt), ktorá poskytuje bunkám rezistenciu k skupine antibiotík obsahujúci kanamycín, paromycín, geneticin a neomycín, mutantné formy enzýmu acetolaktátsyntázy (als), ktorá poskytuje rezistenciu k imidazolinónom, sulfonylmočovine, triazol-pyrimidínom a pyrimidyloxybenzoátom a enzým hygromycín-3'-Ofosfotransferáza (hpfc), ktorá poskytuje rezistenciu k hygromycínu. Používa sa tiež chloramfenikoltranšferáza (cafc), ktorá detoxifikuje chloramfenikol a dihydrofolátreduktáza (dhf), ktorá neutralizuje toxické účinky metoteraxatu. Ešte ďalšou možnosťou je použitie génu bar pre rezistenciu k herbicídu bialaphosu (WO 97/05829).

Hoci už existuje rad selekčných markérov, existuje stála potreba ďalších markérov. To je spôsobené niekolkými dôvodmi, ako napr.:

keď sú transgénne rastliny transformované druhý raz novým konštruktom, je potrebné selektovať nové transformanty pomocou druhého markéru, hore uvedené selekčné markéry nie sú použitelné pri všetkých druhoch rastlín, niektoré zlúčeniny, ktoré sa musia pridať, aby bolo možné vykonať selekciu, sú antibiotiká, pritom rozširovanie génov rezistencie k antibiotikom alebo herbicídom je nutné minimalizovať ako len to je možné, aby sa zabránilo riziku prenosu rezistencie na patogény, niektoré zlúčeniny, ktoré sa musia pridať, aby bolo možné vykonať selekciu, sú relatívne drahé, takže sú potrebné lacnejšie selekčné činidlá.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje použitie génu, ktorý kóduje kyánamidhydratázu (CAH) ako nový selekčný markér. Výhodne je možné tento markér použiť pri transformácii rastlín. Gén obsahuje nukleotidovú sekvenciu uvedenú tu ako sekvencia s identifikačným číslom 1 alebo jej mutácie (muteíny) majúce funkciu kyánamidhydratázy.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob selekcie transformovaných rastlín, ktorý obsahuje skonštruovanie vektoru nesúceho kódujúcu sekvenciu CAH a požadovaný gén, transformovania rastlín, častí rastlín, rastlinných buniek alebo kalusov týmto vektorom a pestovanie výsledných transformantov v médie obsahujúcom kyánamid. Vynález ďalej obsahuje použitie kyánamidu na selekciu rastlín transformovaných génom kódujúcim CAH.

Ďalším predmetom vynálezu je expresná kazeta, ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu kyánamidhydratázu a požadovaný gén. Ďalej sú predmetom vynálezu vektory, ktoré obsahujú expresnú kazetu, a hostitelia, vrátane Agrobacterium, ktoré nesú také vektory. Predmetom vynálezu sú aj rastliny transformované takým vektorom a/alebo týmto Agrobacteriom.

Predkladaný vynález sa týka použitia génu kódujúceho kyán amidhydratázu ako selekečného markéru.

Enzým kyánamidhydratáza (CAH) poskytuje rezistenciu ku kyánamidu, čo je zlúčenina prejavujúca herbicídnu účinnosť. Teraz bolo ukázané, že táto vlastnosť génu môže byť využitá v technológii transformácie na odlíšenie transformovaných rastlín od netransformovaných. Avšak samotná herbicídna účinnosť nie je dostatočná na to, aby bol gén vhodným selekčným markérom. Na dobrú selekciu je potrebné, aby bol gén exprimovaný v takých bunkách, ktoré sú vystavené selekčným podmienkam.

Môže ísť ako o konštitutívnu expresiu alebo o expresiu špecifickú pre určité pletivo, ako treba kalus, semeno, embryonálne alebo meristémové tkanivo. Navyše je potrebné, aby gén zmenil citlivosť rastliny k toxickej zlúčenine na toleranciu bez akejkolvek reziduálnej toxickej aktivity. Pre možnosť využitia ako selekčný markér je tiež dôležitá existencia dostatočne širokého okna medzi koncentráciou toxickej zlúčeniny potrebnou na selekciu a koncentráciou, pri ktorej je v prítomnosti selekčného génu pozorovatelný rast. Okrem toho je potrebné, aby taký systém fungoval dostatočné autonómne, a to tak, aby v chimérickom pletive (tzn. v pletive, ktoré je mozaikou transformovaných a netransformovaných buniek) neboli netransformované bunky chránené susednými transformovanými bunkami a preto prežili selekciu.

Prekvapivo bolo zistené, že kombinácie génu kódujúceho CAH s toxickými vlastnosťami kyánamidu sú vhodné na použitie ako selekčný markér.

Predkladaný vynález ukazuje, že je možné uskutočňovať selekciu transformantov (tzn. transformovaných rastlín alebo častí rastlín) na základe ich tolerancie ku kyánamidu.

Ďalšou výhodou tohto systému je, že kyánamid je menený na močovinu, ktorá je v rôznych rastlinách premeňovaná na NH₃ a C0₂. NH₃ môže byt potom použitý rastlinou ako zdroj dusíka vo výžive. To je ďalšia selekčná možnosť, a síce zvýšiť okno medzi toleranciou a selekciou. Normálne obsahuje kultivačné médium amónium a dusičnany (v médie podlá Murashige a Skoog, pozri tab. 2 a 4). Pokial sú vynechané alebo je ich koncentrácia znížená, transformované rastliny obsahujúce CAH gén budú meniť kyánamid prítomný v živnom médie ako selekčné činidlo na močovinu a ďalej na amónium, ktoré sa potom využije ako zdroj dusíka. Netransformované rastliny to nie sú schopné, takže okrem herbicídneho účinku kyánamidu ešte trpia kompetitívnou nevýhodou v príjme dusíka.

Sekvencia kódujúca CAH je výhodne sekvencia uvedená tu ako sekvencia s identifikačným číslom 1 (i. č. 1). Predmetom vynálezu sú tiež mutované verzie (muteíny) tejto sekvencie.

Muteíny sú také nukleotidové sekvencie, v ktorých je zmena v nukleotidovej sekvencií,. avšak majú podobné funkčné a imunologické vlastnosti ako sekvencia i. č. 1. Tieto muteíny sa tiež nazývajú funkčné varianty. Okrem toho k po1ynukleotidom podlá vynálezu patria tiež sekvencie v podstate identické (definované ďalej) s génovou sekvenciou podlá vynálezu, ktoré kódujú proteíny, ktoré si uchovávajú aktivitu proteínu podlá vynálezu. Takže v prípade génu CAH opísaného tu, tento termín zahŕňa varianty poly-nukletidových sekvencií, ktoré sú v podstate identické so sekvenciami opísanými tu a ktoré kódujú proteíny, ktoré si uchovávajú aktivitu degradujúcu kyánamid.

Percentá sekvenčnej identity polynukleotidov a polypeptidov sa stanovia porovnaním dvoch optimálne priložených (aligned) sekvencií v porovnávacom okne, kde sekvencia v porovnávacom okne môže obsahoval inzercie alebo delécle (tzn. medzery) oproti porovnávanej sekvencií (ktorá neobsahuje delécie ani inzercie) na dosiahnutie optimálneho priloženia. Percentá sa vyrátajú stanovením počtu pozícií, v ktorých sa vyskytujú identické bázy nukleových kyselín alebo zvyšky aminokyselín, čiže počet zhodných polôh, a vydelia sa celkovým počtom pozícii v porovnávacom okne a vynásobia sa 100, čím sa dostane percentuálne vyjadrená sekvenčná identita. Optimálne priloženie (porovnanie) sekvencií je možné vykonať počítačom pomoci známych algoritmov (napr. GAP, BESTFIT, FASTA a TFAST, Wisconsin Genetics Softaware Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl, alebo BlastN a BlastX z National Center for Biotechnology Information) a alebo tiež prezeraním a porovnaním.

Termín podstatná identita alebo podstatná podobnosť označujú že polypetid obsahuje sekvenciu, ktorá je schopná hybridizácie s cielovým polypeptidom za stringentných (prísnych) podmienok. Stringentnými podmienkami hybridizácie sa rozumejú podmienky 2 x SSC pri teplote 65’C.

Polypeptidy, ktoré sú v podstate podobné majú sekvencie ako bolo uvedené hore, až na to, že pozície, ktoré nie sú iden tické, sa môžu líšiť tým, že obsahujú konzervatívne zámeny aminokyselín. Konzervatívne substitúcie aminokyselín sú vzájomné zámeny takých zvyškov aminokyselín, ktoré majú podobné postranné reťazce. Napr. skupina aminokyselín, ktoré majú alifatické postranné reťazce, tvoria glycín, alanín, valín, leu7 cín a izoleucín, skupinu aminokyselín, ktoré majú alifatickéhydroxylové postranné reťazce tvoria serín a treonín, skupinu s postranným reťazcom obsahujúcom amid tvoria asparagín a glutamín a skupinu s aromatickým postranným reťazcom tvoria fenylalanín, tyrozín a tryptofán, skupinu aminokyselín s bázickým postranným reťazcom tvoria lyzín, arginín a histidín a skupinu aminokyselín s postranným reťazcom obsahujúcom síru tvorí cysteín a metionín.

V podstate identické polynukleotidové sekvencie znamená, že polynukleotidy obsahujú sekvencie s aspoň 70% sekvenčnou identitou, výhodne aspoň s 80 % identitou, ešte výhodnejšie s 90% a najvýhodnejšie s 95% sekvenčnou identitou. Ďalším indikátorom toho, že sekvencie sú v podstate identické je to, kedf dve molekuly špecificky navzájom hybridizujú v stringentných podmienkach. Stringentné podmienky sú závislé od sekvencií a sú rôzne za rôznych okolností. Všeobecne sa stringnetné podmienky volia tak, aby teplota bola o 10°C nižšia ako je bod topenia špecifickej dvojretazcovej sekvencie (Tm) pri definovanej iónovej sile a pH. Tm je (pri definovanej iónovej sile a pH) teplota, pri ktorej 50 % cielových sekvencií hybridizuje s perfektne sa zhodujúcou sondou. Tm hybridu, ktorá je funkciou ako dĺžky tak aj zloženia báz sondy, sa nechá vyrátať podlá vzorca uvedeného v Sambrook T. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second edition), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring. Typicky stringentné podmienky pre Southernovu hybridizáciou obsahujú premývanie v 0,2 x SSC pri 65’C. Pre výhodné oligonukleotidové sondy sú premývacie podmienky typicky 42’C a 6 x SSC.

Predkladaný vynález poskytuje sekvenciu chimérickej DNA, ktorá obsahuje otvorený čítací rámec schopný kódovať proteín, ktorý má aktivitu kyánamidhydratázy. Termín chimérická DNA znamená akúkolvek DNA, ktorá obsahuje sekvencie DNA, ktoré sa prirodzene alebo v prírode nevyskytujú. Tak napr. chimérická

DNA je DNA, ktorá obsahuje uvedený otvorený čítací rámec v neprirodzenej polohe v genóme rastliny, dokonca aj vtedy, pokiaľ by rastlinný genóm kópiu tohto čítacieho rámca obsahoval v pôvodnej polohe v chromozómu. Podobne uvedený čítací rámec môže byť vložený do genómu rastliny tam, kde sa prirodzene nevyskytuje, alebo do replikónu alebo vektoru, v ktorých sa prirodzene nevyskytuje, ako sú napr. bakteriálne plazmidy alebo vírusové vektory. Chimérická DNA nie je obmedzená na molekulu DNA, ktorá je replikovateľná v hostiteľovi, ale znamená tiež DNA, ktorá je schopná ligácie do replikónu, napr. pomocou špecifickej adaptorovej sekvencie fyzicky spojenej s otvoreným čítacím rámcom podlá vynálezu. Tento otvorený čítací rámec môže, ale nemusí, byť spojený s svojimi prirodzenými regulačnými prvkami ležiacimi po smere (downstream) alebo proti smeru (upstream) transkripcie.

Otvorený čítací rámec môže pochádzať z genómovej knižnice. V takom prípade môže obsahovat jeden alebo niekoľko intrónov oddeľujúcich exóny vytvárajúce čítací rámec pre proteín podľa vynálezu. Otvorený čítací rámec môže byť tiež kódovaný jedným neprerušeným exónom, alebo cDNA komplementárnou k mRNA kódujúcej proteín podľa vynálezu. Otvorený čítací rámec podľa vynálezu môže byť tiež taký, že doňho bolo umele vložených alebo z nej bolo vyberaných jeden alebo niekoľko intrónov. Vynález zahŕňa každú z hore uvedených variantov.

Výhodne otvorený čítací rámec pochádza z pôdnej huby Myrothecium verrucaria (ako ju opísali Máier-Greiner, U.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4260-4264, 1991).

Aby bola schopná expresie v hostiteľskej bunke tak, aby poskytovala rezistenciu k toxickému selekčnému činidlu, musí chimérická DNA podľa vynálezu byt vložená do expresnej kazety spoločne s regulačnými prvkami, ktoré umožňujú, že je rozpoznaná biochemickým aparátom hostiteľskej bunky a otvorený čítací rámec je v hostiteľovi transkribovaný a translatovaný. Expresná kazeta zvyčajne obsahuje úsek iniciácie transkripcie, ktorý môže pochádzať z akéhokoľvek génu schopného expresie vo vybranom hostiteľovi, a tiež úsek iniciácie translácie na rozpoznanie ribozómami a ich nasadnutie. V eukaryotických rastlinných bunkách expresná kazeta zvyčajne obsahuje naviac úsek terminácie transkripcie lokalizovaný na downstream koniec otvoreného čítacieho rámca, ktorý dovoľuje ukončenie transkripcie a polyadenyláciu primárneho transkriptu. Okrem toho využitie kodónov (codon usage) môže byt upravené podľa využitia kodónov pri vybranom hostiteľovi. Princípy expresie chimérických konštruktov DNA vo vybranej hostiteľskej bunke sú odborníkovi známe a konštrukcia takých exprimovateľných konštruktov DNA je teraz pre odborníka rutinnou záležitosťou pre akýkoľvek druh hostiteľskej bunky, nech eukaryotickú alebo prokaryotickú.

Aby sa otvorený čítací rámec udržal v hostiteľskej bunke, zvyčajne sa poskytuje vo forme replikonu, ktorý obsahuje daný otvorený čítací rámec podľa vynálezu spojený s DNA, ktorá je rozpoznávaná a replikovaná v danom hostiteľovi. Selekcia replikonu je preto určovaná hlavne vybranou hostiteľskou bunkou. Princípy výberu vhodného replikónu pre vybranú hostiteľskú bunku spadajú do schopností bežného odborníka.

Osobitným druhom replikónu je taký, ktorý je schopný preniesť sám seba, alebo svoju časť, do inej hostiteľskej bunky, ako napr. rastlinnej bunky, a tým preniesť otvorený čítací rámec podľa vynálezu do rastlinnej bunky. Replikóny týchto vlast ností sú označované ako vektory. Príkladom takých vektorov je Ti-plazmidový vektor, ktorý, keď je prítomný vo vhodnom hostiteľovi ako je Agrobacterium tumefaciens, je schopný preniesť svoju časť, takzvaný T-úsek, do rastlinnej bunky. Rôzne typy Ti-plazmidov (pozri napr. EP 0 116 718 BI) sa teraz rutinne používajú na prenos chimérickej DNA do rastlinných buniek alebo protoplastov, z ktorých sa môžu regenerovať nové rastliny, ktoré majú trvalé inkorporovanú uvedenú chimérickú DNA v svojom genóme. Osobitne výhodné Ti-plazmidové vektory sú tzv. binárne vektory, napr. nárokované v EP 0 120 516 BI a US 4 940 838. Iné vhodné vektory, ktoré sa môžu použiť na prenos DNA podľa vynálezu do rastliny, môžu byt vybrané z vírusových vektorov, napr. neintegrujúcich rastlinných vírusových vektorov, ktoré sú napr. odvodené z dvojretazcových rastlinných vírusov (napr. CaMV) alebo jednoretazcových vírusov, geminivírusov apod. Použitie takých vírusov je výhodné, najmä pokiaľ je ťažké trvalé transformovať rastlinného hostiteľa. Čo je napr. prípad drevín, najmä niektorých stromov a viniča.

Termín hostiteľské bunky obsahujúce sekvencie chimérickej DNA podľa vynálezu v svojom genóme znamená bunky, a tiež mnohobunkové organizmy obsahujúce také bunky, alebo v podstate obsahujúce také bunky, v ktorých je trvalé inkorporovaná v ich genóme chimérická DNA, a ktoré si udržujú chimérickú DNA a predávajú ju bunkám potomstva, nech prostredníctvom mitózy alebo meiózy. Takými hostiteľskými bunkami môžu byt prokaryotické organizmy ako sú baktérie alebo eukaryotické organizmy ako napr. kvasinky. Tiež bunky z eukaryotických organizmov v tkanivovej kultúre, ako napr. bunky rastlín alebo zvierat, napr. cicavcov, môžu inkorporovať chimérickú DNA. výhodné uskutočnenie vynálezu preto poskytuje rastliny, ktoré sa v podstate skladajú z buniek, ktoré obsahujú jednu alebo niekoľko kópií chimérickej DNA v svojom genóme a ktoré sú schopné predávať túto kópiu alebo kópie svojmu potomstvu, výhodne mendelovskou dedičnosťou. Vďaka transkripcii a translácii chimér ické DNA podľa vynálezu tieto bunky tvoria CAH a prejavujú zvýšenú rezistenciu ku kyánamidu. Hoci princípy transkripcie DNA v rastlinnej bunke nie sú úplne pochopené, vytvorenie chimérickej DNA schopnej expresie v rastlinnom tkanivu, ktoré je vystavené selekcii na kyánamid, ako je napr. kalus, semeno, embryonálne pletivo alebo meristém, alebo schopné konštitu11 tívnej expresie, je teraz rutinná záležitosť. Úseky iniciácie transkripcie rutinne používané na expresiu polynukleotidov konštitutívnym spôsobom sú promotóry získané z vírusu mozaiky karfiolu, najmä 35S RNA a 19S RNA promotory a tzv. T-DNA promotory z Agrobacterium tumefaciens. Osobitne je možné spomenúť promotor nopalinsyntázy, promotor oktopinsyntázy (opísaný v EP 0 122 791 BI) a promotor mannopinsyntázy. Okrem toho je možné použiť rastlinné promotory, ktoré sú v podstate konštitutívne, ako je napr. promotor aktínového génu z ryže. Výber promotoru nie je podstatný, musí však byť jasné, že konštitutívne promotory pre vysokú hladinu expresie musia vykazovať expresiu v konkrétnom pletive, kde prebieha selekcia. Je tiež známe, že duplikácia niektorých prvkov, tzv. zosilňovačov (enhancery) môže výrazne zvýšiť hladinu expresie DNA (pozri napr. Kay, R. et al., 1987, Science 236: 1299-1302: The duplication of the seguence between -343 and -90 of the CaMV promotor increase the activity of that promotor). Okrem 35S promotoru, s jedným alebo dvoma enhancermi, je možné ako príklady promotorov s vysokou hladinou expresie uviesť svetlom indukovaný promotor malej podjednotky ribulózabisfosfátkarboxylázy (rbcSSU) a promotor väzbového proteínu chlorofylu a/b. Podlá vynálezu je možné tiež predpokladať použitie hybridných promotorov, ktoré obsahujú fyzicky spojené prvky z rôznych promótorových úsekov. Známym príkladom takého hybridného promotoru je CaMV zosilnený mannopinsyntázový promotor (US Patent 5 106 739), ktorý obsahuje prvky z manopinsyntázového promotoru spojené so zosilňovačom CaMV.

Pri transformácii jednoklíčnych rastlín použitie intrónu medzi promotorom a selekčným markérom zvyšuje expresiu.

Termín promotor teda označuje úsek DNA v polohe upstream od štruktúrneho génu, ktorý je rozpoznávaný a na ktorý sa viaže RNA polymeráza a iné proteíny zahajujúce transkripciu. Rastlinný promotor je promotor schopný iniciácie transkripcie v rastlinnej bunke. Konštitutívny promotor znamená promotor aktívny vo väčšine prostredí a podmienok a štádiách vývoja bunkové diferenciácie.

Konštitutívny promotor je výhodný v predkladanom vynáleze, pretože selekcia transformantov sa môže vykonávať v rôznych štádiách vývoja na rôznych pletivách. Takže konštitutívny promotor neobmedzuje možnosti selekcie.

'* Výber vhodného konštitutívneho promotoru je v tomto ohlade velmi dôležitý vzhladom na ostatné promotory použité • v rovnakej transformácii. Je známe, že duplikácia promotorov ovplyvňuje expresiu génov riadených týmito promótormi. Pretože cielom expresie selekčného markéru je iba využitie k selekcii rastliny, ktorá je súčasne transformovaná požadovaným génom, je potrebné si uvedomiť, že použitie rovnakého promotoru pre selekčný markér a pre požadovaný gén by mohlo pôsobiť problémy.

Pokial sa týka nezbytnosti úseku terminácie transkripcie, všeobecne sa verí, že taký úsek zvyšuje spolahlivosť a tiež účinnosť transkripcie v rastlinnej bunke. Použitie takého úseku je preto výhodné aj v predkladanom vynáleze.

Pokial sa týka použitelnosti predkladaného vynálezu na rôzne rastlinné druhy, je nutné pripomenúť, že príklady uskutočnenia ilustrujú výhodné rozpracovania vynálezu s transgén< nym rajčiakom, zemiakom, ryžou a Arabidopsis, ale využitelnosť predkladaného vynálezu nie je v skutočnosti obmedzená iba na tieto druhy rastlín.

Hoci niektoré rozpracovania predkladaného vynálezu nemôžu byt v súčasnosti uskutočnené, pretože niektoré rastlinné druhy sa dosial nepodarilo transformovať, realizácia vynálezu s takými rastlinami je však len otázkou času a nie principiálnou otázkou, pretože spôsobilosť ku genetickej transformácii ako takej nie je relevantná vzhladom na predkladaný vynález.

Transformáciou rastlín sa rozumie akýkolvek spôsob, ktorým sa DNA vnáša do rastliny. Proces transformácie nemusí nutne obsahovať obdobie regenerácie a/alebo pestovania v tkanivovej kultúre.

Transformácia rastlín je teraz rutinný postup pre obrovsky rad rastlinných druhov, a to ako Dicotyledoneae (dvojklíčnych) tak aj Monocotyledoneae (jednoklíčnych). V princípe je možné použiť akúkolvek metódu transformácie na vnesenie chimérickej DNA podlá vynálezu do vhodnej počiatočnej bunky. Vhodnú metódu je možné vybrať z metód ako je kalcium/polyetylénglykolová metóda pre protoplasty (Krens, F.Ä. et al., Náture 296: 72-74, Negrutiu, I. et al., 1987, Plánt Mol. Biol. 8: 363-373), elektroporácia protoplastov (Shillito, R.D. et al., 1985, Bio/ Technol 3: 1099-1102), mikroinjekcie do rastlinného materiálu (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), ostrelovanie rôzneho rastlinného materiálu mikročasticami pokrytými DNA alebo RNA (Klein T.M. et al., 1987, Náture 327,

70), infekcia neintegrujúcimi vírusami, prenos génu in planta sprostredkovaný Agrobacterium tumefaciens po infiltrácii rastlín alebo transformácie zrelého pelu alebo mikrospór (pozri EP 0 301 316) a ďalšie. Výhodným spôsobom podlá vynálezu je prenos DNA sprostredkovaný Agrobacterium tumefaciens. Osobitne výhodné je použitie postupu s tzv. binárnymi vektormi, ako boli opísané v EP A 120 516 a US 4 940 838. ,

Transformácia rajčiaku sa výhodne vykonáva v podstate postupom podlá Van Roekel et al. (Plánt Celí Rep. 12: 644647). Transformácia zemiaku sa výhodne vykonáva v podstate postupom dle Hoekma et al. (Plánt Celí Rep. 7: 273-278, 1989).

Hoci sú považované za trocha viac odolné transformácii, aj jednoklíčne rastliny sú schopné transformácie a je možné regenerovat fertilné transgénne rastliny z transformovaných buniek alebo embryí alebo iného rastlinného materiálu, v súčasnosti je výhodným spôsobom transformácie jednoklíčnych rastlín ostreľovanie mikročasticami, a síce embryí, explantátov alebo bunkových suspenzií, a tiež priamy príjem DNA pletivom alebo elektroporácia pletiva (Shimamoto et al., Náture 338: 274276, 1989). Transgénne rastliny kukurice boli získané vnesením génu bar zo Streptomyces hygroscopicus, ktorý kóduje fosfinotricin-acetyltransferázu (tzn. enzým, ktorý inaktivuje herbicíd fosfinotricin), ostreľovaním embryonálnych buniek v suspenznej bunkovej kultúre z kukurice mikročasticami (GordonKamm, Plánt Celí 2:603-618, 1990). Rastliny pšenice boli regenerované z embryogénnej suspenznej kultúry selekciou embryogénnych kalusov pre založenie embryogénnych suspenzných kultúr (Vasil, Bio/Technol. 8: 429-434, 1990). Kombináci s transformačným systémom pre tieto plodiny umožňuje aplikovať predkladaný vynález aj na jednoklíčne rastliny.

Jednoklíčne rastliny, vrátane hospodársky dôležitých plodín ako je ryža alebo kukurica, sú tiež schopné transformácie prenosom DNA pomocou kmeňov Agrobacterium (pozri WO 94/00977,

EP 0 159 418 Bl, Gould, J., Michal D., Hasegawa O., Ulian E.C., Peterson G., Smith R.H., Plánt Physiol. 95: 426-434, 1991).

Na získanie transgénnych rastlín, ktoré exprimujú viac »

ako jeden chimérický gén, je k dispozícii niekoľko alternatívnych postupov, vrátane nasledujúcich:

A. Použitie DNA, napr. T-DNA v binárnom plazmide, s radom modifikovaných génov fyzicky spojených s druhým génom pre selekčný markér. Výhoda takého postupu je v tom, že chimérické gény sú fyzicky spojené a preto migrujú ako jediný mendelovský lokus. Vynález je v takom prípade veľmi užitočný, pretože po15 skytuje druhý selekčný markér, ktorý môže byt pridaný k už existujúcej kombinácii selekčného markéru a požadovaného génu takže selekciu transformantov je možné potom uskutočňovať bez ohľadu na povahu prvého selekčného markéru.

B. Vzájemné opelenie transgénnych rastlín už schopných expresie jedného alebo niekoľkých chimérických génov, výhodne spojených s génom selekčného markéru, peľom z transgénnej ras tliny obsahujúcej jeden alebo niekoľko chimérických génov výhodne spojených s druhým selekčným markérom. Semená získané takým krížením sa môžu selektovať na základe prítomnosti obidvoch selekčných markérov alebo na základe prítomnosti samotných chimérických génov. Rastliny získané zo selektovaných semien sa potom môžu použiť na ďalšie kríženie, v princípe chimérické gény nie sú v jednom lokuse a gény preto môžu segregovať ako nezávislé lokusy. Takisto tu je možnosť použiť selekciu na obidva markéry, čo je výhoda poskytovaná predkladaným vynálezom.

C. Použitie niekoľkých niekoľkonásobných chimérických molekúl DNA, napr. plazmidov, z ktorých každá obsahuje jeden alebo niekoľko chimérických génov a selekčný markér. Pokiaľ j frekvencia kotransformácie vysoká, potom selekcia na základe jedného markéru je dostatočná. V opačnom prípade je výhodná selekcia na základe viac ako jedného markéru.

D. Postupná transformácia transgénnych rastlín už obsahujúcich prvý, druhý atď. chimérický gén s novou chimérickou DNA, prípadne obsahujúci tiež gén selekčného markéru. Rovnako ako v metóde B, chimérické gény nie sú v princípe na jedinom lokuse a môžu preto segregovať ako nezávislé lokusy.

E. Kombinácia niekoľkých hore uvedených stratégií. Skutočná zvolená stratégia potom závisí od radu faktorov, ktoré je možné ľahko zvážiť, ako je napr. účel rodičovských línií (či na priame pestovanie, využitie v šľachtiteľskom programu alebo produkcii hybridov), ale nie je rozhodujúca z hľadiska predkladaného vynálezu.

I keď to nie je nutné pre predkladaný vynález, je známe, že prakticky všetky rastliny môžu byt regenerované z kultivovaných buniek alebo pletív. Prostriedky regenerácie sú rôzne pre rôzne druhy rastlín, ale všeobecne sa najskôr vychádza zo suspenzie transformovaných protoplastov alebo Petriho misky s transformovanými explantátmi. Výhonky je možné indukovať priamo, alebo nepriamo (z kalusu) prostredníctvom organogénezy alebo embryogénzy a potom zakoreniť. Okrem zlúčeniny na selekciu, kultivačné médium všeobecne obsahuje rôzne aminokyseliny a hormóny, ako sú auxíny a cytokiníny. či je regenerácia účinná závisí od média, od genotypu a od histórie kultúry. Pokiaľ tieto tri premenné sú kontrolované, je regenerácia zvyčajne reprodukovateľná a opakovateľná.

Po trvalej inkorporácii sekvenciou transformovaného génu do transgénnej rastliny, znaky prenesené týmto génom môžu byť prenášané na ďalšie rastliny pohlavným krížením. Na to je možné použiť akýkoľvek spôsob štandardného kríženia, v závislosti od biologického druhu, ktorý je krížený.

Prehľad obrázkov

Obr. 1: Schéma T-DNA v pMOG874.

Obr. 2: Schéma T-DNA v pMOG1156

Obr. 3: Schéma T-DNA v pMOG22.

Obr. 4: Schéma T-DNA v pMOG1005.

Obr. 5: Schéma T-DNA v pMOG1278.

Obr. 6: Schéma T-DNA v pMOG1295.

Obr. 7: Schéma T-DNA v pMOG1253.

Obr. 8: Schéma expresnej kazety v pMOG873. Obr. 9: Schéma expresnej kazety v pM0G617.

Obr. 10: Explantáty Arabidopsis transformované a) pMOG1156 alebo b) pMOG410 selektované na médie s 50 mg/1 kyanamidu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie génu kódujúceho kyánamidhydratázu (CAH) z huby do heterolognej expresnej kazety

a) Konštrukty na transformáciu dvojklíčnych rastlín

Konštrukt pM0G874 obsahuje kódujúci úsek génu kyánamidhydratázy z pôdnej huby Myrothecium verrucaria, ktorý je operatívne spojený promotorom 35S CaMV a terminátorom 35S CaMV. Tento chimérický gén je klonovaný do binárneho vektoru pBHOl (Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901, 1987), kde nahradzuje kódujúci úsek β-glukuronidázy a terminátor nopalinsyntázy.

Konštrukt bol získaný pridaním miesta Xhol na 5'koniec a miesta SstI na 3'koniec fragmentu CAH cDNA velkosti 899 bp (pozície 235 až 1197 v sekvencií, ktorú publikovali MaierGreiner et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 42604264) metódou PCR (polymerázovej reťazovej reakcie) pomocou dvoch oligonukleotidových prajmerov PI a P2:

PI: 5' -ACCGAGCTCGAATTCGGCACGAGGTTGACATGATACCTTCCTG-3 '

P 2: 5 ’ -GACCTCGAGÄATTCGGCACGAGGTACGATCCTACTTCCTCGC- 3 ' medzi miestami Xhol a SstI v rastlinnom expresnom vektore pRTlOl, kde obidve miesta patria polylinkeru (viacpočetnému klonovaciemu miestu), ktorý je vložený medzi promotor 35S a terminačný signál 35S v pRTlOl (Topfer et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 5890). Chimérické gény potom boli štiepené PstI, presahujúce konce boli zarovnané T4 DNA polymerázou a fragment s tupými koncami bol klonovaný do Smal miesta plazmidu pBIN19 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721, 1984).

V konštrukt e pM0Gll56 je čfalší gén kódujúci β-glukuroniI dázu operatívne spojený s promotorom 35S a terminátorom 35S vložený ako Xhol/Sall fragment do Sali miesta pMOG874. Obidva tieto konštrukty obsahujú okrem nového selekčného markéru CAH konvenčný selekčný markér, a síce NPTII, spojený s promotorom nopalinsyntázy a terminátorom nopalinsyntázy ako je to v pBIN19

b. Konštrukty na transformáciu jednoklíčnych rastlín

Rovnakým spôsobom ako bol pripravený pMOG874 bola expresná kazeta klonovaná do vektoru s vysokým počtom kópií (pRTlol, Topfer et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 5890), čo viedlo k vytvoreniu pMOG873 (obr. 8).

Derivát pMOG22 (obr. 3, uložený v zbierke Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holandsko, 29. januára 1990, ako položka č. CBS 101.90) bol pripravený vložením reštrikčného miesta KpnI do polylinkeru pMOG22 medzi miesta EcoRI a Smal. Orientácia polylinkeru bola tiež obrátená. Tento plazmid, nazvaný pMOGl005, obsahuje gén rezistencie k hygromycínu medzi lávou a pravou hraničnou sekvenciou T-DNA (obr. 4). Expresná kazeta s veíkostou 1,7 kb obsahujúca gén CAH riadený 35S promotorom a 35S terminátorom bola klonovaná medzi reštrikčné miesta HindlII a BamHI. Tento plazmid bol potom nazvaný pMOG 1278 (obr. 5). Binárny vektor pMOG1295 (obr. 6) je derivát PMOG1278 a obsahuje v reštrikčnom mieste Sali expresnú kazetu GUS, ktorú opísali Vancanneyt, G. et al. (Mol. Gen. Genet.

220: 245-250, 1990).

Plazmid pMOG1253 bol odvodený z pMOG 18 (Sijmons, PCR. et al., Bio/Technol 8: 217-221, 1990, ktorý obsahuje dvojité zosilnený 35S promotor, vedúcu sekvenciu A1MV RNA 4, gén GUS a terminátor nos v jednej expresnej kazete ako EcoRI-HindlII fragment. Plazmid p35SGUSINT (Vancanneyt et al., 1990) bol štiepený SnaBI a MscI, výsledný fragment s velkostou 426 bp obsahujúci čast kódujúceho úseku génu GUS a intrón ST-LS1 bol izolovaný a klonovaný do pMOG22, čo viedlo k vytvoreniu pMOG 1253 (obr. 7). Plazmid pM0G617 bol pripravený klonovaním hygromycinovej expresnej kazety z pMOG22 do miesta HindlII vektoru s vysokým počtom kópii pMOGIS.

Príklad 2

Transformácia zemiaka

Nasledujúci príklad opisuje spôsob transformácie stonkových segmentov Solanum tuberosum cv. Kardal pomocou Agrobacterium tumefaciens. Explantáty z uzlín rastlín pestovaných in vitro boli použité 3 až 8 týždňov po prenose. Rastliny boli pestované v množiacom médie (HUM) so svetelnou periódou 16 hodín (1700 lux) pri 24°C a temnou periódou 8 hodín pri 21°C (prehlad rôznych médií je uvedený v tab. 2). Segmenty stonky dlhej približne 5 mm boli narezané na sterilnom filtračnom papiere nasiaknutom oplachovacím médiom (WAM) a potom zhromáždené v nádobe s médiom WAM. Pre asi 300 explantátov bolo WAM médium nahradené predklutivačným médiom (PRM). Kultivačné nádoby boli inkubované za otáčania 80 rpm v rovnakých podmienkach ako boli opísané hore počas 24 hodín. Všetky binárne vektory použité v tejto štúdii obsahovali gén nptll ako rastlinný selekčný markér a nptIII ako bakteriálny selekčný markér. Plazmid PMOG410 navyše niesol chimérický gén GUS obsahujúci intrón (Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220: 235-250, 1990). Plazmid pMOG1156 navyše niesol gén GUS a chimérický gén CAH kódujúci kyánamidhydratázu. Plazmid pM0G874 niesol navyše gén cah. Plazmidy boli udržované v E. coli a Agrobacterium tumefaciens pomocou selekcie na kanamycíne.

Agrobacterium tumefaciens sa pestovalo cez noc na LB médie s antibiotikami (rifampicín 29 mg/1, kanamycín 100 mg/1) Kultúra z kultivácie cez noc bola nariedená na OD₆₀q = 0,1 a potom pestovaná do dosiahnutia OD = 0,3 v LB médie bez antibiotík, čo boli asi 2 hodiny. Suspenzia baktérií potom bola centrifugovaná pri 1600 g počas 15 minút pri teplote miestnosti. Baktérie potom boli resuspendované v oplachovacom médie a použité v kokultivačnom experimente. Z nádob bolo odstránené prekultivačné médium a nahradené suspenziou s Agrobacterium. Nádoby boli potom kultivované 20 minút a potom boli explantáty opláchnuté dvakrát oplachovacím médiom. Explantáty potom boli osušené na sterilnom filtračnom papieri a potom 48 hodín kultivované na miskách obsahujúcich kokultivačné médium (COM). Potom boli explantáty prenesené na postkultivačné médium (POM) a inkubácia pokračovala 72 hodín. Potom boli explantáty prenesené na médium indukujúce výhonky (S1M) obsahujúce rôzne koncentrácie kyánamidu a kanamycínu. Po 2 týždňoch boli explantáty subkultivované na rovnakom médie a asi po troch týždňoch boli prenesené na výhonky predlžujúce médium (SEM) obsahujúce kyánamid a kanamycín rovnako ako bolo uvedené hore. Keď boli výhonky dostatočne veľké, aby mohli byt odrezané, boli prenesené na médium indukujúce korene (RIM). Výhonky schopné zakoreniť potom boli prenesené na médium indukujúce korene obsahujúce 50 mg/1 kyánamidu alebo 30 mg/1 kanamycínu. Transgénny charakter výhonkov bol skúmaný tak, že sa testovali lístočky zo zakorenených výhonkov na expresiu génu gus histochemickým testom gus aktivity. Ukázalo, sa, že pre pMOG156 zakoreňovanie transgénnych výhonkov v médie obsahujúcom kyánamid úplne korelovalo s expresiou génu gus.

Tabulka 1 pMOG1156 (cah-gus-nptll)

selekcia	počet	počet	počet	počet výhonkov
počas	inokulovaných	odrezaných	zakoreňujúcich	pozitívnych
regenerácie	explantátov	výhonkov	výhonkov	na gus (gus+)
kyánamid 40	48	15	2	2
kyánamid 30	48	50	12	12
kyánamid 20	48	56	6	6
kanamycín 50	48	26	16	16

pMOG410 (gus-nptll)

selekcia počas regenerácie	počet inokulovaných explantátov	počet odrezaných výhonkov	počet zakoreňujúcich výhonkov	počet výhonkov pozitívnych na gus (gus+)
kyánamid 40	62	0	0	0
kyánamid 30	62	10	0	0
kyánamid 20	62	48	0	0
kanamycín 50	58	24	13	12

pNOG874 (cah-nptll)

selekcia	počet	počet	počet	počet výhonkov
počas .	inokulovaných	odrezaných	zakoreňujúcich	pozitívnych
regenerácie	explantátov	výhonkov	výhonkov	na gus (gus+)
kyánamid 40	58	10	1	nestanovené
kyánamid 30	58	40	8	nestanovené
kyánamid 20	58	81	2	nestanovené
kanamycín 50	58	34	26	nestanovené

Tabulka 2

Zloženie rôznych médií

Médium	WAM	PRM	COM	POM	SIM	SEM	RIM	MUM
makrosoli	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	1/2XMS	1/2XMS
vitamíny	B5	B5	B5	B5	B5	B5	1/2 R3	1/2 R3
sacharóza	3%	3%	3%	3%	3%	3%	1%	1%
agar	-	0,8%	0,8%	0,8%	0,8%	0,8%	0,8%	0,8%
MES (g/1)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
PH zeatínribo-	5,8	5,8	5,8	5,8	5,8	5,8	5,8	5,8
zid (mg/1)	-	0,5	0,5	3,0	3,0	0,3	-	-
2,4-D	-	1,0	1,0	-	-	-	-	-
IBA	-	-	-	-	-	-	0,1	-
Cefotaxím	-	-	-	200	200	200	100	-
Vancomycín	—	—	—	100	100	100	50	—

MS: Murashige a Skoog, Plánt Physiol. 15, 473-479, 1962 B5: Gamborg B5 (Gamborg, Orl et al., Exp. Celí Res. 50:

151-158, 1986)

Príklad 3

Transformácia rajčiaka

Tento príklad opisuje spôsob transformácie klíčnych listov Lycopersicon esculentum cv. Money Maker pomocou Agrobacteriua tumefaciens. Binárne vektory a kmene Agrobacterium tumefaciens použité v tejto transformácii sú zhodné s tými, ktoré boli opísané v predchádzajúcich príkladoch. Semenáčky rajčiaku klíčili v klíčiacom médie (GEM) v podmienkach so svetelnou periódou 16 hodín (1700 lux) pri 24°C a temnou periódou 8 hodín pri 21C (prehlad rôznych médií je uvedený v tab. 4). Explantáty klíčnych lístkov zo semenáčkov starých 5 až 7 dní boli odrezané na sterilnom filtračnom papieri nasiaknutom oplachovacím médiom (WAM) a prenesené na misky obsahujúce kokultivačné médium (COM). Misky obsahujúce po 50 explantátoch boli inkubované cez noc v rovnakých podmienkach ako v predchádzajúcom príklade. Preinkubované explantáty potom boli opatrne ponorené do inokula s Agrobacterium tumefaciens na 20 minút.Explantáty potom boli osušené na sterilnom filtračnom papieri a inkubované 48 hodín na druhej sade kokultivačných misiek. Potom boli inkubované 72 hodín na miskách obsahujúcich postkultivačné médium (POM) a potom boli prenesené na médium indukujúce výhonky (SIM) obsahujúce rôzne koncentrácie kyánamidu alebo kanamycínu. Každé tri týždne boli explantáty subkultivované na rovnaké médium. Približne po 8 až 12 týždňoch boli výhonky odrezané a prenesené na médium indukujúce korene (RIM). Výhonky schopné zakoreniť boli potom prenesené na médium indukujúce korene obsahujúce 50 mg/1 kyánamidu alebo 30 mg/1 kanamycínu. Transgénny charakter výhonkov bol testovaný tak, že sa testovali lístočky zo zakorenených výhonkov na expresiu génu gus histochemickým testom GUS aktivity.

Tabuľka 3

Výsledky transformácie explantátov klíčnych lístkov rajčiaka pMOG1156 (gus-nptll-cah)

selekcia počas regenerácie	počet inokulovaných explantátov	počet odrezaných výhonkov	l počet zakoreňujúcich výhonkov	počet výhonkov pozitívnych na gus (gus+)
kyánamid 40	30	5	3	3
kyánamid 30	30	5	0	0
kyánamid 20	30	0	0	0
kanamycín 100	30	5	3	4

pMOG410 (gus-nptll)

selekcia	počet	počet	počet	počet výhonkov
počas	inokulovaných	odrezaných	zakoreňujúcich	pozitívnych
regenerácie	explantátov	výhonkov	výhonkov	na gus (gus+)
kyánamid 40	30	0	0	0
kyánamid 30	30	3	0	0
kyánamid 20	30	0	0	0
kanamycín 100	30	4	3	3

pHOG874 (cah-nptll)

selekcia	počet	počet	počet	počet výhonkov
počas	inokulovaných	odrezaných	zakoreňujúcich	pozitívnych
regenerácie.	explantátov	výhonkov	výhonkov	na gus (gus+)
kyánamid 40	35	1	1	nestanovené
kyánamid 30	35	0	0	nestanovené
kyánamid 20	35	2	0	nestanovené
kanamycín 100	35	4	1	nestanovené

Tabulka 4

Zloženie rôznych médií

Médium	WAM	COM	POM	SIM	RÍM	GEM
Makrosoli	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	1/2XMS
vitamíny	B5	B5	B5	B5	B5	B5
sacharóza	3%	3%	3%	-	1%	1%
glukóza	-	-	-	1%	-	-
agar	—	0,8%	0,8%	0,8%	0,8%	0,8%

Tabulka 4 - pokračovanie

Médium	WAM	COM	POM	S IM	RIM	GEM
MES (g/1)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
PH	5,8	5,8	5,8	5,8	5,8	5,8
zeatínribozid
(mg/1)	-	2,0	2,0	2,0	-	-
IAA	-	0,1	0,1	0,1	-	-
2,4-D	-	0,5	-	-	-	-
IBA	-	-	-	-	0,25	-
Carbenicilín	-	-	-	500	-	-
Cefotaxím	-	-	200	-	200	-
Vancomycín	-	-	50	-	-	-
Acetosyringón	(mM) -	0,2	—	—	—	—

Príklad 4

Transformácia Arabidopsis

Tento príklad opisuje spôsob transformácie segmentov koreňov Arabidopsis thaliana cv. 24 pomocou Agrobacterium tumefaciens. Binárne vektory použité v tejto transformácii boli zhodné s vektormi opísanými v predchádzajúcich príkladoch.

Šesť miligramov semien Arabidopsis thaliana bolo naklíčených v nádobe obsahujúcej kvapalné klíčiace médium (GM) v podmienkach so svetelnou periódou 16 hodín (1700 lux) pri 24’C a temnou periódou 8 hodín pri 21 ’C za otáčania 80 rpm. Zloženie rôznych médií je opísané v tab. 4. Korene zo semenáčkov starých 9 dní boli izolované v sterilnej Petriho miske a zobrané do kvapky klíčiaceho média. Potom boli korene narezané na segmenty dlhé 3 až 5 mm a približne 100 týchto explantátov bolo rozprestrených rovnomerne na nylonovú membránu (priemer 8 cm), ktorá bola umiestnená na misky obsahujúce médium indukujúce kalus (CIM). Misky potom boli inkubované 3 dni v rovnakých podmienkach aké boli opísané hore.

Kmeň Agrobacterium tumefaciens použitý v tejto štúdii niesol selekčný markér rezistencie k rifampicínu na chromozomálnom pozadí kmeňa C58. Konštrukcia pomocného kmeňa MOG101 bola opísaná v publikácii Hood et al. (1993). Agrobacterium tumefaciens sa pestovalo cez noc v médie LB s antibiotikami (rifampicín 20 mg/1, kanamycín 100 mg/1). Kultúra bola po nočnej kultivácii nariedená 1:10 s LB bez antibiotík a pestovaná ďalšie 3 hodiny. Bakteriálna suspenzia potom bola centrifugovaná pri 1600 x g 15 minút pri teplote miestnosti. Baktérie sa resuspendovali v GM na OD₆q₀ = 0,1 a takto sa použili na kokultiváciu.

Membrána obsahujúca približne 100 explantátov sa inkubovala 2 minúty so suspenziou Agrobacterium tumefaciens a potom sa osušila na filtračnom papieri, aby sa odstránil nadbytok baktérií. Potom sa membrána s explantátmi kultivovala 48 hodín na miskách s CIM. Po opláchnutí membrány a explantátov kvapalným GM sa inkubovali v miskách obsahujúcich médium indukujúce výhonky (SIM) s rôznymi koncentráciami kyánamidu alebo kanamycínu. Po piatich dňoch boli membrány s explantátmi prenesené na čerstvé rovnaké médium na subkultiváciu, druhá subkultivácia prebehla za dva týždne. Približne štyri týždne po kokultivácii bolo z každej koncentrácie kyánamidu odebraných 60 výhonkov a umiestených na misky s médiom predlžujúcim výhonky (SEM) s 30 mg/1 kyánamidu. Výhonky schopné zakoreniť boli testované na odobraných lístkoch, či majú transgénny charakter tým, že sa zisťovala expresia génu GUS histochemickým testom gus aktivity.

Boli uskutočnené tri experimenty. Výhonky získané v pokusoch 98-8 a 98-11 boli prenesené do zakoreňovacieho média (SEM) s 30 mg/1 kyánamidu. Výhonky získané v pokusu 98-13 boli prenesené do zakoreňovacieho média s rovnakými koncentráciami ako v selekčnom médie (SIM). Výsledky sú uvedené v tab. 4a. Výhonky získané po selekcii na kanamycíne (50 mg/1) boli prenesené na zakoreňovacie médium obsahujúce 25 mg/1 kanamycínu.

Tabulka 4

Médiá potrebné na transformáciu koreňových segmentov Arabidopsis thaliana

Zložka média	Médium	GM	CIM	SIM	SEM
Prísada	makroe1ementy	B5	B5	B5	MS
	mikroelementy	B5	B5	B5	MS
	vitamíny	B5	B5	B5	B5
	sacharóza (g/1)				10
	glukóza (g/1)	20	20	20
	agar (g/1)		10	10	10
Hormóny	2,4-D		0,5
	kinetín		0,05
	2-ip			5
	IAA			0,15
Antibiotiká	vancomycín			100	50
	carbenicilín			500
	cefotaxím				100

Koreňové explantáty transformované pMOG410 neboli schopné regenerácie na médie obsahujúcom kyánamid. Dokonca 20 mg/1 kyánamidu bolo už dosť, aby zabránilo regenerácii explantátov transformovaných konštruktom bez génu cah. Pri koncentrácii kyánamidu 20 až 40 mg/1 bol pozorovaný vývoj niekolkých kalusov, ale pri koncentraci 50 mg/1 a vyššej neboli explantáty životaschopné a úplne zhnedli.

Na druhej strane explantáty transformované génom cah (pMOG1156) boli schopné regenerovať vo všetkých koncentráciách kyánamidu, dokonca aj v 80 mg/1. Pri nižších koncentráciách bola regenerácia výhonkov rýchlejšia ako s kanamycínom.

I keď bolo k dispozícii viac výhonkov, z každej koncentrácie bolo odobraných 60 až 65 výhonkov a umiestených na zakoreňovacie médium. Pri nižších koncentráciách kyánamidu sa vyvinulo rovnaké množstvo výhonkov ako pri selekcii na kanamycíne (približne 70 až 100 na každú Petriho misku).

Existuje jasná korelácia medzi vývojom kalusov a expresiou GUS pri selekcii na kyánamide pri koreňových explantátoch transformovaných pMOG1156 (obr. 4b). GUS analýza výhonkov získaných na médie bez kyánamidu (0 mg/1) neukázala žiadne zafarbenie, čo ukazuje, že kyánamid je nutný na získanie transgénnych výhonkov.

Tabuľka 4a

Výsledky transformácie Arabidopsis thaliana pMOG1156

Experiment 98-8	Experiment 98-11	Experiment 98-13
koncentrácia kyánamidu (mg/1)	počet rastlín1	% zakor. výhonkov2	počet rastlín	% zakor. výhonkov	počet rastlín	% zakor. výhonkov
C20	0	0	1	1,7	3	1 4,8
C30	4	6,3	2	3,2	9	14,5
C40	5	8,2	3	4,5	1	1,6
C50	neurčené	neurčené	5	8,1	0	0
C60	5	8,2	neurčené	neurčené	4	6,0
C80	9	13,8	10	15,6	8	11,4
K50	29	46,8	19	47,5	14	20,6

(1) celkový počet rastlín znamená počet výhonkov, z ktorých sa vyvinuli rastliny a boli schopné zakoreniť v médie obsahujúcom kyánamid (2) % zakorenených výhonkov = počet rastlín/celkový počet výhonkov x 100 % (3) % modré zafarbených rastlín v porovnaní s celkovým počtom rastlín

Tabuľka 4b

Percento rastlín Arabidopsis thaliana exprimujúcich GUS po selekcii na kyánamide alebo kanamycíne

pMOG410	PMOG1156
Ošetrenie	C3303	C303	Rovnaké koncentrácie ako ošetrenie5
C20	neurčené	O1	0
C30	neurčené	75-100	78
C40	neurčené	40-100	100
C50	neurčené	80	neurčené
C60	neurčené	80	100
C80	neurčené	67-90	100
K50	1002	82-92	100

(1) % rastlín zafarbených modré (2) všetky výhonky s pMOG410 zakorenili na kanamycíne 25 mg/1 (3) C = kyánamid (mg/1) (4) K = kanamycín (mg/1) (5) koncentrácia v zakoreňovacom médie

Príklad 5

Transformácia ryže

Príklad opisuje spôsob transformácie kalusov pochádzajúcich z pletiva scutella zrelých embryí ryže (Oryza sativa cv. Taipei 309) pomocou Agrobacterium tumefaciens kmeň LBA1119pMOG1295 (ktorý nesie gén cah) a kmeň LBA1119-pMOG1253 (kontrola ).

Sterilné šupiek zbavené zrná ryže boli naklíčené na miskách obsahujúcich médium indukujúce kalus (CIM) v tme v 28’C (zloženie rôznych médií je uvedené v tab. 5). Po troch týždňoch boli izolované embryogénne kalusy pochádzajúce zo scutella a boli subkultivované na rovnaké médium za rovnakých podmienok: Po 2 až 3 týždňoch boli embryogénne kalusy narezané na segmenty velkosti 2 až 3 mm a kultivované 4 dni na miskách obsahujúcich CIM. Kmene Agrobacterium tumefaciens použité v tomto pokusu niesli rifampicínový selekčný markér v chromozomálnom základe C58. Konštrukciu pomocného kmeňa EHA105 opísali Hood et al. Agrobacterium tumefaciens sa pestovalo 4 dni na miskách s AB médiom s antibiotikami (rifampicxn 20 mg/1, kanamycín 100 mg/1). Agrobaktéria sa zobrali do LIM a ODg_OO sa upravila na 1,0 až 1,5. Táto suspenzia bola použitá na kokultiváciu. Kalusy boli inkubované 10 minút v tejto suspenzii agrobaktérií a potom osušené sterilným filtračným papierom, aby sa odstránili nadbytočné baktérie. Kalusy potom boli kultivované 48 hodín na miskách s kokultivačným médiom (COM) v tme pri 25’C. Pre každú koncentráciu kyánamidu sa použilo 50 kalusov s pMOG1295 a 20 kalusov s pMOG1253. Boli použité nasledujúce koncentrácie kyánamidu: 0, 15, 30, 60, 100, 150, 200, 300 a 500 mg/1. Hygromycín bol použitý v koncentrácii 50 mg/1. Kalusy boli inkubované najskôr na miskách s prvým selekčným médiom (FSM) s rôznymi koncentráciami kyánamidu alebo hygromycínom v tme pri 28’C. Po troch týždňoch boli alebo hygromycínom v tme pri 28’C. Po troch týždňoch boli kalusy prenesené na misky s médiom indukujúcim embryá 1 (EIM I) obsahujúcom rovnaké koncentrácie kyánamidu alebo hygromycín. Po ďalších troch týždňoch boli kalusy subkultivované na médium indukujúce embryá II (EIM II) obsahujúce rovnaké koncentrácie kyánamidu a zvýšenú koncentráciu hygromycínu (75 mg/1). Kalusy boli prenesené na médium indukujúce výhonky (SIM) obsahujúce rovnaké koncentrácie kyánamidu ako predchádzajúce FSM, EIM I a EIM II, a boli kultivované pri ^hodinovej svetelnej perióde (2600 lux) a 12hodinovej temnej perióde pri 28’C. Približne tri týždne po prenesení kalusov na SIM začali regenerovať výhonky, ktoré potom boli odrezané a prenesené do nádobiek obsahujúcich predskleníkové médium (PGM). Žiadne kalusy nevznikli v koncentrácii 100 mg/1 kyánamidu alebo vyšších. Pri koncentrácii kyánamidu 15 mg/1 bola frekvencia regenerácie pre obidva konštrukty rovnaká (pMOG1253:

z 16 kalusov bolo schopných regenerácie, pMOG1295: 17 z 44 regenerovalo). Pri koncentrácii 30 mg/1 kyánamidu sa iba pri 11 kalusoch pMOG1295 vyvinul zelený kalus a 6 bolo schopných regenerácie.

Tabulka 5

Médiá potrebné na transformáciu Oryza sativa Taipei 309

Médium
Zložka média	CIM	COM	LIM	FSM	EIM I	EIM II	SIM	PGM
základné	makroelementy	N6	R2	R2	R2	LS	LS	LS	iMS
zložky	mikroelementy	B5	R2	R2	R2	LS	LS	LS	í MS
(g/i)	vitamíny	B5	R2	R2	R2	LS	LS	LS	|B5
	sacharóza	30			30	30	30	40	10
	glukóza		10	10

Tabuľka 5 - pokračovanie

				M	é d i	u m
Zložka média	CIM	COM	LIM	FSM	EIM	EIM	SIM	PGM
						I	II
	agaróza typ I		7		7	7	7	7
	Phytagel	2,5							2,5
	PH	5,8	5,2	5,2	6,0	5,8	5,8	5,8	5,8
Hormóny	2,4-D	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
(mg/1)	IAA							0,5
	BAP							0,3
	NAA								0,5
Aditíva	prolín (mg/1)	500
	glutamín (mg/1)	500
	acetosyringon (μΜ)		100	100
	kokosové mlieko					100	100
Antibiotiká	vancomycín				100	100	100	100
(mg/1)	cefotaxím				400	100	100	100

Príklad 6

Transformácia ryže metódou ostreľovania mikročasticami

V tomto príklade sa opisuje spôsob transformácie suspenzie nemorfogénnych buniek Oryza sativa cv. IR 52 pomocou zariadenia na ostreľovanie mikročasticami (particle inflow gun, PIG) podľa Pinera et al. (Plánt celí rep. 11, 323-328, 1992). Dlhodobá kultúra nemorfogénnych buniek Oryza sativa cv. IR 52 bola subkultivovaná v týždenných intervaloch v kvapalnom

1962) a udržovaná v tme na rotačnej trepačke (110 rpm) pri 28°C (zloženie média LS-4 je uvedené v tab. 6). 3 až 4 dni po poslednej subkultivácii bol 1,5 ml tejto kultúry (tzn. približne 1,5 x 10® buniek) rovnomerne nanesený na filtračný papier (Whatman č. 4), ktorý bol umiestnený na tuhé médium LS-4 a kultúra bola kultivovaná v tme pri 28°C počas 24 hodín a potom ihneď použitá na ostreľovanie. Na ostreľovanie mikročasticami bolo použité zariadenie vyrobené za týmto účelom v laboratóriu podľa Finera et al. (Plánt Celí Rep. 11, 323-328, 1992) 300 g volfrámové častice potiahnuté buď pMOG617 (35S-gus a 35 S hyg) alebo pMOG873 (35S-cah) boli vložené na nosič častíc. Častice boli akcelerované pulzom hélia 250 kPa (2,5 bar) a museli prejsť 500 μιη kovovou mriežkou, umiestnenou 2 cm pod nosičom častíc. Bunková suspenzia bola umiestnená 15 cm pod nosičom častíc. Systém P1G bol evakuovaný pred ostreľovaním na 3 kPa (3O.mbar). Po ostreľovaní boli bunky kultivované 3 dni v tme pri 28°C. Potom boli filtre s bunkami prenesené na pevné médium LS-4 obsahujúce rôzne koncentrácie kyánamidu alebo 50 mg/l hygromycínu B (pozri tab. 6). Subkultivácia sa opakovala každých 9 dní. Rezistentné mikrokalusy, ktoré boli viditeľné po 4 až 6 týždňoch boli prenesené na čerstvé médium obsahujúce príslušné selekčné činidlo. Z dvoch pokusov bolo nájdených po transformácii pMOG617 7+41 kalusov rezistentných k hygromycínu, zatiaľ čo po transformácii s pMOG873 7 kalusov prežilo na 20 mg/l kyáamidu v prvom pokuse (výsledky z druhého pokusu nie sú dosiaľ k dispozícii) a 0 + 4 kalusy zostaly životaschopné na 40 mg/l kyánamidu. Žiadne kalusy sa nevytvorili v koncentrácii 50 mg/l kyánamidu alebo vyššej. Transgénna povaha bola potvrdená testovaním častí vyvíjajúcich sa kalusov na prítomnosť DNA pri kalusoch po transformácii s pMOG873. Jeden z 4 prežívajúcich kalusov na 40 mg/l kyánamidu vykázal pozitivitu v teste PCR na prítomnosť génu cah.

Tabuľka 6

Médiá potrebné na transformáciu Oryza sativa cv. IR 52

	kvapalné LS-4	pevné LS-4
Makroe lementy	LS	LS
Mikroelementy	LS	LS
Vitamíny	LS	LS
Sacharó za (g/1)	30	30
Agaróza Typ I (g/1)	-	7
PH	5,8	5,8
2,4-D (mg/1)	4	4

Tabuľka 7 PMOG617
Selekčné činidlo (mg/1)	Počet misiek	rezistentné klony	pozitívne na gus
Kyánamid 20	4
Kyánamid 30	2
Kyánamid 40	4
Kyánamid 50	1 ' 2		1
Kyánamid 60	2
Kyánamid 70	2
Kyánamid 80	2
Hygromycín 50	8

PMOG873

Selekčné	Počet misiek	rezistentné	pozitívne
činidlo (mg/1)		klony	na gus
Kyánamid 0	4
Kyánamid 20	6
Kyánamid 30	8
Kyánamid 40	8
Kyánamid 50	7
Kyánamid 60	4
Kyánamid 70	4
Kyánamid 80	2
Hygromycín 50	4

Príklad 8

Krivka letality kukurice

Boli pripravené rezervné roztoky kyánamidu vo vode s koncentráciami 10 a 100 mg/ml a sterilizované filtráciou. Alikvóty boli uchovávané v -20’C. Médiá boli pripravené pridaním MS média (4,4 g), sacharózy (20 g), 2,4-D (2,0 mg) a agaru (8 g) do 1 1 vody. Po autoklávovaní bolo do média pridané príslušné množstvo kyánamidu (0, 10, 30, 50, 100 a 150 mg/1) a médium bolo naliate na 9cm Petriho misky. Médium BMS bolo pripravené rovnakým spôsobom ako bolo hore opísané s vynechaním agaru.

Bunky BMS boli pridané do média obsahujúceho kyánamid tromi spôsobmi:

a) Suspenzia buniek BMS bola prenesená do skúmavky Falcon a bola odstránená kvapalina. Potom boli BMS bunky nanesené na povrch agaru a rozprestrené do zhlukov s priemerom asi 5 mm, takých zhlukov na každú misku, 3 misky pre každú koncentráciu, pritom bol na dne misky označený obrys každého zhluku.

b) Približne 0,5 ml stočeného objemu buniek približne

1,5 ml BMS v kvapaline boli nanesené na povrch agaru a jemne rozprestrené. Pre každé ošetrenie boli pripravené tri misky.

c) Približne 0,5 ml stočeného objemu buniek a približne

1,5 ml BMS v kvapaline bolo nanesené na filtračný papier položený na povrchu agaru. Bunky boli rozprestrené rovnomerne na povrchu filtru. Pre každé ošetrenie bola pripravená jedna miska. Misky boli zalepené páskou Micropore a inkubované pri 25’C v tme. Rast buniek bol pozorovaný po 7 a 14 dňoch.

Výsledky

8. deň

Rast buniek na kyánamide bol vyhodnotený po 8 dňoch. Zhluky buniek rozprestrené na povrchu kontrolného média zväčšili svoj povrch a prerástli svoj pôvodný obrys. Bunky na 10 mg/1 kyánamidu neprerástli pôvodný obrys, ale zvýšila sa výška zhlukov a vytvoril sa nerovnomerný povrch. Mierna redukcia rastu s rastúcou koncentráciou kyánamidu bola patrná, pričom najväčší účinok na rast bol pozorovaný pri 50 mg/1 kyánamidu.

Bunky, ktoré boli rozprestrené na povrchu kontrolného média, rástli dobre a husté pokryli povrch média. Významné zníženie rastu bolo pozorované pri najnižšej hladine kyánamidu (10 mg/1), avšak bola jasne viditeľná zvýšená hustota buniek. Mierne zvýšenie hustoty buniek bolo viditeľné aj pri 30 mg/1 kyánamidu, ale bolo ťažké rozlíšiť rôzne rýchlosti rastu na vyšších koncentráciách kyánamidu.

Bunky na všetkých koncentráciách kyánamidu si uchovali mliečne bielo farbu, nebolo patrné žiadne hnednutie buniek.

15. deň (pozri tab. 9)

Redukcia rastu buniek BMS na koncentrácii 10 mg/1 kyánamidu bola stále ešte velmi jasne patrná, avšak bunky usporiadané do zhlukov prerástli svoj pôvodný obrys. Bunky rozprestrené priamo na povrchu agaru vykazovali velmi podobnú odpoveď ako bunky v zhlukoch so značnou redukciou rastu pozorovanou pri koncentrácii 30 mg/1 a vyššej. Bunky na koncentrácii 50 mg/1 a vyššej neprejavili žiadne známky rastu a povrch zhlukov zostal velmi plochý, ale bunky stále boli mliečne biele. Podobná odpoveď bola pozorovaná aj pri bunkách nanesených na filtračný papier. Avšak boli pozorované malé zvýšené zhluky na povrchu všetkých filtrov, ale ďalej sa nevyvíjali do kolónií a boli zjavne súčasťami väčších agregátov buniek zo zmiešaných populácií velkostou typických v suspenzých BMS.

Zo všetkých koncentrácií kyánamidu boli odoberané vzorky zo zhlukov buniek na pozorovanie v svetelnom mikroskope. S rastúcou hladinou kyánamidu bol vidieť rastúci počet mŕtvych buniek, pričom obsah buniek sa zmrštil a oddelil od bunkovej steny, a bolo pozorované zvýšenie počtu tmavých teliesok škrobových zŕn. Na pozorovanie boli bunky resuspendované vo vode s farbivom FDA a boli pozorované pod UV svetlom.

Tabulka 9

Hladina Pozorovanie kyánamidu normálne zdravé bunky s príležitostne mŕtvou bunkou známky stresu, zvláštne zhluky mŕtvych buniek medzi živými bunkami, približne 5 % buniek mŕtvych výrazná odlišnosť od kontrolných buniek, akumulácia škrobových zŕn, mŕtve bunky so zmršteným obsahom oddeleným od bunkovej steny, približne 15 až 20 % mŕtvych buniek

50	celkom odlišné od koncentrácie 30 mg/1, zvyšujúci sa počet mŕtvych buniek a akumulácia škrobových zŕn, približne 50 % mŕtvych buniek
100	väčšina buniek mŕtvych, malé sférické objekty, zrejme tukové kvapôčky, sa akumulovali v bunkách, zmenšuje sa velkosť buniek, približne 90 % buniek mŕtvych
150	väčšina buniek mŕtvych, bunky sa zdajú tmavšie v dôsledku akumulácie škrobových zŕn a fenolov, ojedinelé živé bunky viditelné v zhlukoch mŕtvych buniek, približne 95 % až 98 % buniek mŕtvych

Experiment bol opakovaný s koncentráciami kyánamidu 0,

10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 100 mg/1. Výsledky boli podobné ako výsledky hore opísané, tzn. pri bunkách v zhlukoch f

bolo viditeľné mierne zníženie rastu pri koncentrácii kyánamidu 10 mg/1. Od 20 mg/1 zhluky buniek už neprerastali svoj pôvodný obrys, ale pri nižších koncentráciách (< 50 mg/1) zhluky buniek prejavili zvýšenie výšky (zmenšujúce sa s rastúcou koncentráciou). Nad 50 mg/1 prejavili zhluky slabo oranžové zafarbenie.

Výsledky s bunkami rozprestrenými na agaru alebo na filtroch boli podobné v tom, že pri koncentrácii 10 mg/1 bol zjavný slabý rast (približne zdvojnásobenie pôvodného počtu buniek), zatiaľ čo pri koncentrácii 20 mg/1 a vyššej prejavili obmedzený rast.

Príklad 8

Krivky letality pre banánovník (Musa sp.)

Na otestovanie potenciálu kyánamidu ako selekčného činidla na transformáciu banánovníka boli zostrojené dve krivky letality s 6 dní starou kultúrou (Ed6b) regenerovateľnej embryogénnej suspenzie Grand nain, rutinne subkultivovanou do kvapalného média M2 s 2,4-D obsahujúceho 4,32 g/1 MS solí, g/1 sacharózy, štandardné lx koncentrované MS vitamíny,

100 mg/1 glutamínu, 100 mg/1 myoinozitolu, 100 mg/1 biotínu,

100 mg/1 sladového extraktu, s pH 5,3 a s prídavkom 1,2 mg/1

2,4-D a 0,8 mg/1 picloramu po autoklávovaní.

Kultúry boli prečistené pomocou sitka (> 250 μπι, < 710 μπι) a alikvóty po 50 μΐ v 300 μΐ kvapaliny boli pipetou prenesené do dvoch médií pre letálne krivky, ktoré sú opísané dalej (3 opakovania na každú misku). Rast a prežívanie kultúr sa monitorovali počas nasledujúcich 3 týždňov a prežívanie buniek bolo vyhodnotené 21. deň pomocou FDA farbenia.

Médium pre krivku letality A: M2/MS/l,0 2,4-D (rovnaké ako M2/MS/2,4-D až na to, že bolo použité 1,0 mg/1 2,4-D, žiadny picloram a 2,25 g/1 gelritu): toto médium podporuje rýchle delenie a rast embryogénnych kalusov, ale nie embryí. Médium pre krivku letality B: M2/SH/0,5 Pic,0,5 2,4-D (rovnaké ako M2/SH/2,4-D, až na to, že bolo použité len 0,5 mg/1 2,4-D a 0,5 mg/1 picloramu, SH soli (4,32 g/1) miesto MS s 2,25 g/1 gelritu): toto médium podporuje časný vývoj embryí, ktoré môžu dozrieť a potom klíčiť po prenesení na iné médium. Kyánamid bol pridaný do obidvoch médií, po autoklávovaní, na výsledné koncentrácie 0, 20, 30, 50, 75, 100 a 150 mg/1. výsledky sú uvedené v tab. 10, kde údaje charakterizujúce bunkový rast sú približné vizuálne odhady, nie presné merania objemov buniek. Nebolo viditelné žiadne hnednutie kultúr a uvolňovanie fenolických látok až do koncentrácie 75 mg/1. Všeobecne kultúry práve prestali rásť, pričom bunkové delenie bolo extenzívne inhibované. Kyánamid inhibuje rast embryogénneho kalusu o 40 až 50 % dokonca aj pri tak nízkej koncentrácii ako je 20 mg/1, bez toho aby spôsoboval viditelné poškodenie. Embryogéneza bola úplne inhibovaná aj pri najnižších testovaných koncentráciách.

Tabulka 10

Výsledky vplyvu koncentrácie kyánamidu na bunkové kultúry banánovníka

Médium	Koncentrácia kyánamidu %	% živých buniek podlá hodnotenia	vytvorené embryá	% rastu kalusov
M2/MS/2,4-D	0	95 %	N/A	+100 %
M2/MS/2,4-D	20	60 %	N/A	+30 %
M2/MS/2,4-D	30	50 %	N/A	+20 %
M2/MS/2,4-D	50	20 %	N/A	0
M2/MS/2,4-D	75	10 %	N/A	0
M2/MS/2,4-D	100	10 %	N/A	0
M2/MS/2,4-D	150	0 %	N/A	0
M2/SH/0,5PÍC
+0,5 2,4-D	0	95 %	51	N/A
M2/SH/0,5PÍC
+0,5 2,4-D	20	50 %	0	N/A
M2/SH/0,5PÍC
+0,5 2,4-D	30	40 %	0	N/A

Tabulka ίο - pokračovanie

Médium	Koncentrácia kyánamidu %	% živých buniek podlá hodnotenia	vytvorené embryá	% rastu kalusov
M2/SH/0,5Pic +0,5 2,4-D	50	30 %	0	N/A
M2/SH/0,5PÍC +0,5 2,4-D	75	20 %	0	N/A
M2/SH/0,5Pic + 0,5 2,4-D	100	10 %	0	N/A
M2/SH/0,5PÍC +0,5 2,4-D	150	0 %	0	N/A

I

Zoznam sekvencii (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 900 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Myrothecium verrucaria (ix) ZNAKY:

(A) MENO/OZNAČENIE: CDS (B) POZÍCIA: 47..782 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:

GTACGATCCT ACTTCC'iCGC TTATqTGCTC TAAACGATTC AACAAG ATG TCT TCT 55

Met Ser Ser 1

TCA 103

GAA

GTC

AAA

GCC

AAC

GGA TGG

ACT

GCC

GTT

CCA

GTC

AGC

GCA

AAG

Ser

Glu 5

Val

Lys

Ala

Asn

Gly Trp 10

Thr

Ala

Val

Pro 15

Val

Ser

Ala

Lys

GCC 151

ATT

GTT

GAC

TCC

CTG

GGA. AAG

CTT

GGT

GAT

GTC

TCC

TCA

TAT

TCT

··

Ala 20

íle

Val

Asp

Ser

Leu 25

Gly Lys

Leu

Gly

Asp 30

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser 35

4

GTG 199

GAA

GAT

ATC

GCG

TTC

CCT GCG

GCA

GAC

AAA

CTT

GTT

GCC

GAG

GCA

Val

Glu

Asp

íle

Ala 40

Phe

Pro Ala

Ala

Asp 45

Lys

Leu

Val

Ala'

Glu 50

Ala

CAG

GCC

TTT

GTG

AAG

GCC

CGA TTG

AGT

CCC

GAA

ACC

TAC

AAT

CAC

TCC

247

Gin Ala Phe Val Lys Ala Arg Leu Ser Pro Glu Thr Tyr Asn His Ser 55 60 65

ATG CGC GTT TTC TAC TGG GGA ACC GTC ATC GCG AGA CGT TTA CTT CCC 295

Met Arg Val Phe Tyr Trp Gly Thr Val íle Ala Arg Arg Leu Leu Pro 70 75 80

GAG CAA GCT AAA GAC

TTG Leu

TCT CCA

AGT ACA TGG GCA CTG ACA TGT CTT

343 Glu Gin

Ala

Lys Asp

Ser Thr

Trp

Ala 95

Leu

Thr

Cys

Leu

Ser 90

Pro

85

CTG

CAT

GAC

GTT

GGT

ACT

GCG

GAG

GCA

TAC

TTT

ACA

TCT

ACA

CGA

ATG

391

Leu

His

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr

Phe

Thr

Ser

Thr

Arg

Met

100

105

110

115

TCC

TTC

GAT

ATT

TAC

GGT

GGC

ATT

AAG

GCT

ATG

GAG

GTG

CTC

AAG

GTC

439

Ser

Phe

Asp

íle

Tyr

Gly Gly

íle

Lys

Ala

Met

Glu

Val

Leu

Lys

Val

120

125

130

CŤT

GGG

AGT

AGC

ACC

GAC

CAG

GCT

GAG

GCT

GTT

GCC

GAG

GCC

ATC

ATT

487

Leu

Gly

Ser

Ser

Thr

Asp

Gin

Ala

Glu

Ala

Val

Ala

Glu

Ala

íle

íle

135 140 145

CGT 535

CAT

GAG

GAT

GTG

GGG

GTA

GAT

GGC

AAC

ATC

ACA

TTC

CTC

GGT

CAG

Arg

His'

Glu 150

Asp

Val

Gly Val

Asp Gly 155 .

Asn

íle

Thr

- ** Phe. 160

Leu-

Gly

Gin t · *

TTG

ATC

CAG

CTG

GCT

ACG

CTT

TAT

GAC

AAT

GTC

GGG

GCC

TAC

GAT

GGG

583

Leu

íle 3 6í·

Gin

Leu

Ala

Thr

Leu 170

Tyr

Asp

Asn

Val

Gly 175

Ala

Tyr

Asp

Gly

ATT 631

GAT

GAT

TTT

GGT

AGC

TGG

GTT

GAT

GAC

ACC

ACA

CGC

AAC

AGT

ATC

íle 180

Asp

Asp

Phe

Gly

Ser 185

Trp

Val

Asp Asp

Thr 190

Thr

Arg

Asn

Ser

íle 195

AAC

ACG

GCA

TTC

CCA

CGA

CAT

GGT

TGG

TGT

TCT

TGG

TTT

GCC

TGC

ACG

679

Asn

Thr

Ala

Phe

Pro

Arg

His

Gly

Trp Cys

Ser

Trp

Phe

Ala

cys

Thr

200 205 210

GTT 727 Val

CGT Arg

AAG Lys

GAA GAA AGT AAC AAG CCT TGG

TGC CÁC ACA ACG CAT ATC

Cys

Kis

Thr

Thr His 225

íle

Glu Glu Ser Asn 215

Lys

Pro 220

Trp

CCT

CAG

TTC

GAT

AAA

CAG

ATG

GAA

GCG

AAC

ACT

TTG

ATG

AAG

CCT

TGG

775

Pro

Gin

Phe

Asp

Lys

Gin

Met

Glu

Ala

Asn

Thr

Leu

Met

Lys

Pro

Trp

230 235 240

GAG TAA C TCTGAGTAAG CAGAGAATAT TTAGCCGGGT AGCTATAGAT GAATCTGGAC 832

Glu ·

245

AAATTCAGGC ACATTTGGTT TCACGATACA GGTATTGGAA ATAGCTTGCA GGAAGGTATC 892

ATGTCAAC

900 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 245 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 2:

Met Ser Ser Ser Glu Val Lys Ala Asn Gly Trp Thr Ala Val .Pro Val
1	5	10	15
Ser	Ala Lys Ala íle 20	Val Asp Ser Leu Gly Lys Leu 25	Gly Asp Val Ser 30
Ser	Tyr Ser Val Glu 35	Asp íle Ala Phe Pro Ala Ala 40	Asp Lys Leu Val 45
Ala	Glu Ala Gin Ala '50	Vite Val Lys Ala Arg LéuŠe.ŕ.'· 55 60	Pro'Glu-Thr Tyr
Asn 65	His Ser Met Arg	Val Phe Tyr Trp Gly Thr Val 70 75	íle Ala Arg Arg 80
Leu	Leu Pro Glu Gin 85	Ala Lys Asp Leu Ser Pro Ser 90	Thr Trp Ala Leu 95
Thr	Cys Leu Leu His 100	Asp Val Gly Thr Ala Glu Ala 105	Tyr Phe Thr Ser 110
Thr	Arg Met Ser Phe 115	Asp íle Tyr Gly Gly íle Lys 120	Ala Met Glu Val 125
Leu	Lys Val Leu Gly 130	Ser Ser Thr Asp Gin Ala Glu 135 140	Ala Val Ala Glu
Ala 145	íle Íle Arg His	Glu Asp Val Gly Val Asp Gly 150 , 155	Asn Xle Thr Phe 160
Leu	Gly Gin Leu íle 165	Gin Leu Ala Thr Leu Tyr Asp 170	Asn Val Gly Ala 175
Tyr	Asp Gly íle Asp 180	Asp Phe Gly Ser Trp Val Asp 185	Asp Thr Thr Arg 190
Asn	Ser íle Asn Thr 195	Ala Phe Pro Arg His Gly Trp 200	Cys Ser Trp Phe 205
Ala	Cys Thr Val Arg 210	Lys Glu Glu Ser Asn Lys Pro 215 220	Trp Cys His Thr
Thr	His íle Pro Gin	Phe Asp Lys Gin Met Glu Ala	Asn Thr Leu Met

225 230 235 240

Lys Pro Trp Glu *

245 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 43 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3:

ACCGAGCTCG AATTCGGCAC GAGGTTGACA TGATACCTTC CTG 43 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4:

GACCTCGAGA ATTCGGCACG AGGTACGATC CTACTTCCTC GC

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie kyánamidhydratázy ako selekčného markéru.
2. 2. Použitie kyánamidhydratázy ako selekčného markéru na transformáciu rastlín.

   .·
3. 3. Použitie podlá nároku 2, keď sa rastliny transformujú nukleotidovou sekvenciou kódujúcou kyánamidhydratázu.

   Λ
4. 4. Použitie podlá nároku 3, keď sa použije nukleotidová sekvencia uvedená tu ako sekvencia s identifikačným číslom 1.
5. 5. Spôsob selekcie transformovaných rastlín, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď:

   a. skonštruuje sa vektor, ktorý obsahuje kódujúcu sekvenciu pre kyánamidhydratázu a požadovaný gén,

   b. tento vektor sa transformuje do rastlín alebo častí rastlín alebo rastlinných buniek a

   c. transformanty sa pestujú v médie, ktoré obsahuje kyánamid.
6. 6. Spôsob podlá nároku 5,vyznačujúci sa tým, že sa použije nukleotidová sekvencia uvedená tu ako f sekvencia s identifikačným číslom 1.

   I
7. 7. Použitie kyánamidu na selekciu rastlín transformovaných vektorom, ktorý obsahuje nukleotidová sekvenciu kódujúcu kyánamidhydratázu .
8. 8. Expresná kazeta, ktorá obsahuje nukleotidová sekvenciu kódujúcu kyánamidhydratázu a požadovaný gén.

   - 47
9. 9. Vektor, ktorý obsahuje expresnú kazetu podlá nároku 8.
10. 10. Hostitelská bunka, ktorá obsahuje vektor podlá nároku 9.
11. 11. Hostitelská bunka podlá nároku 10, ktorou je Agrobacterium.
12. 12. Rastlina, ktorá je transformovaná vektorom podlá nároku 9.
13. 13. Rastlina, ktorá je transformovaná pomocou steny hostitelskej bunky podlá nároku 11.