CZ363999A3 - Použití kyanamidhydratázy jako selekčního markéru a způsob selekce transformovaných rostlin - Google Patents

Abstract

Použití kyanamidhydralázyjako selekčníhomarkéru pro transformaci rostlin. Kyanamid působíjako herbicid a rostliny transformované genem kódujícímkyanamidhydratázujako schopné přeměňovat kyanamid na močovinu, což umožňuje selektovat transformované rostliny na základě přežívání za selekčního tlaku kyaamidu.

Description

Použití kyanamidhydratázy jako selekce transformovaných rostlin

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového selekčního markéru, zejména užití kyanamidhydratázy jako selekčního markéru při transformačních postupech, konkrétně při transformaci rostlin.

Dosavadní stav techniky

Kyanamid (H₂N-C=n) je derivát nitrilu, který se podobně jako další deriváty nitrilu užívá v zemědělské výrobě pro stimulaci růstu a jako prostředek ochrany rostlin. Kyanamid ve vodném roztoku nebo ve formě vápenaté soli se používá jako hnojivo, kterým se vnáší do půdy amoniak metabolickou přeměnou kyanamidu. Má však ještě další výhodu, a sice že působí jako herbicid. Takže pokud se užívá jako hnojivo, je třeba ho aplikovat před setím.

Chemicky patří kyanamid do třídy nitrilu. I přes relativně vzácný výskyt sloučenin obsahujících nitrilovou skupinu v přírodě, enzymy, které hydratují tuto skupiny byly nalezeny jak v bakteriích tak i v rostlinách (např. Nagasawa, T. et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 155: 1008-1016, Endo, T., Watanabe, I., 1989, FEBS Lett. 243: 61-64). Enzym hydratující nitril byl nalezen také u houby Myrothecium verrucaria (Stránský, H., Amberger, A., 1974,

Z. Pflanzenphysiol. 70: 74-87), kde tento enzym hydratuje nitrilovou skupinu kyanamidu za vzniku močoviny:

H₂N-CsN + HOH => H₂N-CO-NH₂

Maier-Grenier et al. izolovali tento enzym a klonovali příslušný gen, který ho kóduje (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4260-4264, 1991). Ukázali také, že tento enzym projevuje • · · * · · • · · · · • ·· ·· · ··· mimořádně úzkou substrátovou specifičnost, kdy sloučeniny chemicky příbuzné kyanamidu nejsou rozpoznávány jako substrát.

Od selekčních markérů (značek) se čeká, že transformované buňce poskytnou dominantní fenotyp, který je možné využít jako selekční kritérium. Selekční markéry lze v zásadě rozdělit do dvou tříd: první je třída genů, které buňce poskytují buďto životaschopnost nebo naopak letalitu v přítomnosti selekčního činidla, a druhá je třída genů, které mají zanedbatelný účinek na přežívání buněk, ale poskytují transformované buňce nějakou rozlišitelnou fyzikální charakteristiku.

Při transformaci rostlin je frakce buněk, které inkorporují novou DNA, obecně velmi malá, takže většina transformačních postupů užívá takové markéry, které zajišťují přežívání transformovaných buněk v přítomnosti selekčního činidla.

Řada selekčních markérů spadajících do této třídy je známa a již několik let experimentech. Patří sem např.

využívána v transformačních enzym neomycínfosfotransferáza (npt) , která uděluje buňkám rezistenci ke skupině antibiotik obsahující kanamycin, paromycin, geneticin a neomycin, mutantní formy enzymu acetolaktátsyntázy (ais), která uděluje rezistenci k imidazolínonům, sulfonylmočovině, triazolpyrimidinům a pyri.midyLoxvbenzoátům a enzym hygrom.ycin-3' -0fosfotransferáza (npt), která uděluje rezistenci k hygromycinu. Užívá se také chloramfenikoltransferáza (cat), která detoxifikuje chloramfenikol a dihydrofolátreduktáza (dhf) , která neutralizuje toxické účinky metoteraxatu. Ještě další možností je užití genu bar pro rezistenci k herbicidu bialaphosu (WO 97/05829).

Ačkoliv již existuje řada selekčních markérů, existuje stálá potřeba dalších markérů. To je způsobeno několika důvody, jako např.:

···· ♦ · ♦ * ····»· ··* ····*« * - ··· ·· · · ···· ·* ·*

- když jsou transgenní rostliny transformovány podruhé novým konstruktem, je třeba selektovat nové transformanty pomocí druhého markéru,

- výše uvedené selekční markéry nejsou použitelné u všech druhů rostlin,

- některé sloučeniny, které se musí přidat, aby bylo možné provést selekci, jsou antibiotika, přitom rozšiřování genů rezistence k antibiotikům nebo herbicidům je nutno minimalizovat jak jen to je možné, aby se zabránilo riziku přenosu rezistence na patogeny,

- některé sloučeniny, které se musí přidat, aby bylo možné provést selekci, jsou relativně drahé, takže jsou potřeba levnější selekční činidla.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje použití genu, který kóduje kyanamidhydratázu (CAH) jako nový selekční markér. Výhodně lze tento markér užít při transformaci rostlin. Gen obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci identifikačního čísla 1 nebo její mutace (muteiny) mající funkci kyanamidhydratázy.

Předmětem vynálezu je dále způsob selekce transformovaných rostlin, který obsahuje zkonstruování vektoru nesoucího kódující sekvenci CAH a požadovaný gen, transformování rostlin, částí rostlin, rostlinných buněk nebo kalusů tímto vektorem a pěstování výsledných transformant v médiu obsahujícím kyanamid.

Vynález dále obsahuje použití kyanamidu pro selekci rostlin transformiovaných genem kódujícím CAH.

Dalším předmětem vynálezu je expresní kazeta, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující kyanamidhydratázu a požadovaný gen. Dále jsou předmětem vynálezu vektory, které obsahují expresní kazetu, a hostitelé, včetně Agrobacterivm, kteří nesou takové vektory. Předmětem vynálezu jsou i rostliny transformované takovým vektorem a/nebo tímto Agrobacteriem.

Předkládaný vynález se týká užití genu kódujícího kyanamidhydratázu jako slekečního markéru.

Enzym kyanamidhydratáza (CAH) uděluje rezistenci ke kyanamidu, což je sloučenina projevující herbicidní účinnost. Nyní bylo ukázáno, že tato vlastnost genu může být využita v technologii transformace pro odlišení transformovaných rostlin od netransformovaných. Avšak samotná herbicidní účinnost není dostatečná k tomu, aby byl gen vhodným selekečním markérem. Pro dobrou selekci je třeba, aby byl gen exprimován v takových buňkách, které jsou vystaveny selekčním podmínkám. Může jít jak o konstitutivní expresi nebo o expresi specifickou pro určité pletivo, jako třeba kalus, semeno, embryonální nebo meristémovou tkáň. Navíc je potřeba, aby gen změnil citlivost rostliny k toxické sloučenině na toleranci bez jakékoliv reziduální toxické aktivity. Pro možnost využití jako selekční markér je také důležitá existence dostatečně širokého „okna mezi koncentrací toxické sloučeniny potřebnou pro selekci a koncentrací, při které za přítomnosti selekčního genu je pozorovatelný růst. Kromě toho je třeba, aby takový systém fungoval dostatečně autonomně, a to tak, aby v chimérickém pletivu (tj. v pletivu, které je mozaikou transformovaných a netransformovaných buněk) nebyly netransformované buňky chráněny sousedními transformovanými buňkami a tudíž přežily selekci.

Překvapivě bylo zjištěno, že kombinace genu kódujícího CAH s toxickými vlastnostmi kyanamidu jsou vhodné pro použití jako selekční markér.

Předkládaný vynález ukazuje, že je možné provádět selekci transformant (tj. transformovaných rostlin nebo částí rostlin) na základě jejich tolerance ke kyanamidu.

Další výhodu tohoto systému je, že kyanamid je přeměňován na močovinu, která je u různých rostlin přeměňována na NH₂ a CO2. NH3 pak může být užit rostlinou jako zdroj dusíku ve výživě. To je další selekční možnost, a sice zvýšit „okno mezi tolerancí a selekcí. Normálně obsahuje kultivační médium amonium a dusičnany (v médiu dle Murashige a Skoog, viz tab. 2 a 4). Pokud jsou vynechány nebo je jejich koncentrace snížena, transformované rostliny obsahující CAH gen budou přeměňovat kyanamid přítomný v živném médiu jako selekční činidlo na močovinu a dále na amonium, které se pak využije jako zdroj dusíku. Netransformované rostliny toho nejsou schopny, takže kromě herbicidního účinku kyanamidu ještě trpí kompetitivní nevýhodou v příjmu dusíku.

Sekvence kódující CAH je výhodně sekvence uvedená zde jako sekvence identifikačního čísla 1 (i. č. 1). Předmětem vynálezu jsou také mutované verze (muteiny) této sekvence.

Muteiny jsou takové nukleotidové sekvence, ve kterých je změna v nukleotidové sekvenci, avšak mají podobné funkční a imunologické vlastnosti jako sekvence i. č se také nazývají funkční varianty k polynukleotidům podle vynálezu patří v podstatě identické (definované níže) s genovou sekvencí podle vynálezu, které kódují proteiny, které si uchovávají aktivitu proteinu podle vynálezu. Takže v případě genu CAH popsaného zde, tento termín zahrnuje varianty polynukletidových sekvencí, které jsou v podstatě identické se sekvencemi popsanými zde a které kódují proteiny, které si uchovávají aktivitu degradující kyanamid.

„Procenta sekvenční identity polynukleotidů a polypeptidů se stanoví srovnáním dvou optimálně přiložených („aligned) sekvencí ve srovnávacím okně, kde sekvence ve srovnávacím okně může obsahovat inzerce nebo delece (tj. mezery) oproti srovnávané sekvenci (která neobsahuje delece ani inzerce) pro dosažení optimálního přiložení. Procenta se

1. Tyto muteiny Kromě toho také sekvence aminokyselin aminokyselin, vypočtou stanovením počtu pozic, ve kterých se vyskytují identické baze nukleových kyselin nebo zbytky aminokyselin, čili počet shodných poloh, a vydělí se celkovým počtem pozic ve srovnávacím okně a vynásobí se 100, čímž se dostane procentuálně vyjádřená sekvenční identita. Optimální přiložení (srovnání) sekvencí lze provést počítačem pomocí známých algoritmů (např. GAP, BESTFIT, FASTA a TFAST, Wisconsin Genetics Softaware Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., MAdison, WI, nebo BlastN a BlastX z National center for Biotechnology Information) a nebo také prohlížením a srovnáním.

Termín „podstatná identita nebo „podtstatná podobnost označují že polypetid obsahuje sekvenci, která je schopna hybridizace s cílovým polypeptidem za stringentních (přísných) podmínek. Stringentními podmínkami hybridizace se myslí podmínky 2 x SSC při teplotě 65 °C.

Polypeptidy, které jsou „v podsttatě podobné sdílejí sekvence jak bylo uvedeno výše, až na to, že pozice, které nejsou identické, se mohou lišit tím, že obsahují konzervativní záměny aminokyselin. Konzervativní substituce jsou vzájemné záměny takových zbytků které mají podobné postranní řetězce. Např.

skupina aminokyselin, které mají alifatické postranní řetězce, tvoří glycin, alanin, valin, leucin a isoleucin, skupinu aminokyselin, které mají alifatické-hydroxylové postranní řetězce tvoří serin a threonin, skupinu s postranním řetězcem obsahujícím amid tvoří asparagin a glutamin a skupinu s aromatickým postranním řetězcem tvoří fenylalanin, tyrosin a tryptofan, skupinu aminokyselin s bazickým řetězcem tvoří lysin, arginin a histidin aminokyselin s postranním řetězcem obsahujícím síru tvoří cystein a methionin.

„V podstatě identické polynukleotidové sekvence znamená, že polynukleotidy obsahují sekvence s alespoň 70% sekvenční postranním a skupinu identitou, výhodně alespoň s 80 % identitou, ještě výhodněji s 90% a nejvýhodněji s 95% sekvenční identitou. Dalším indikátorem toho, že sekvence jsou v podstatě identické je to, když dvě molekuly specificky navzájem hybridizují ve stringentních podmínkách. Stringentní podmínky jsou závislé na sekvencích a jsou různé za různých okolností. Obecně se stringnetní podmínky volí tak, aby teplota byla o 10 “C nižší než bod tání specifické dvoj řetězcové sekvence (Tm) při definované iontové síle a pH. Tm je (při definované iontové síle a pH) teplota, při které 50 % cílových sekvencí hybridizuje s perfektně se shodující sondou. Tm hybridu, které je funkcí jak délky tak i složení baží sondy, se dá vypočítat podle vzorce uvedeného v Sambrook T. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second edition), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring. Typicky stringentní podmínky pro Southernovu hybridizaci obsahují promývání ve 0,2 x SSC při 65°C. Pro výhodné oligonukleotidové sondy jsou promývací podmínky typicky 42 °C a 6 x SSC.

Předkládaný vynález poskytuje sekvenci chimérické DNA, která obsahuje otevřený čtecí rámec schopný kódovat protein, který má aktivitu kyanamidhydratázy. Termín chimérická DNA znamená jakoukoliv DNA, která obsahuje sekvence DNA, které se přirozeně či v přírodě nevyskytují. Tak např. chimérická DNA je DNA, která obsahuje uvedený otevřený čtecí rámec v „nepřirozené poloze v genomu rostliny, dokonce i tehdy, pokud by rostlinný genom kopii tohoto čtecího rámce obsahoval v původní poloze v chromozómu. Podobně uvedený čtecí rámec může být vložen do genomu rostliny tam, kde se přirozeně nevyskytuje, nebo do replikonu nebo vektoru, ve kterých se přirozeně nevyskytuje, jako jsou např. bakteriální plazmidy nebo virové vektory. Chimérická DNA není omezena na molekulu DNA, která je replikovatelná v hostiteli, ale znamená také DNA, která je schopna ligace do replikonu, např. pomocí specifické adaptorové sekvence fyzicky spojené s otevřeným « * • * čtecím rámcem podle vynálezu. Tento otevřený čtecí rámec může, ale nemusí, být spojen se svými přirozenými regulačními prvky ležícími po směru („downstream) nebo proti směru („upstream) transkripce.

Otevřený čtecí rámec může pocházet z genomové knihovny. V takovém případě může obsahovat jeden nebo několik intronů oddělujících exony vytvářející čtecí rámec pro protein podle vynálezu. Otevřený čtecí rámec může být také kódován jedním nepřerušeným exonem, nebo cDNA komplementární k mRNA kódující protein podle vynálezu. Otevřený čtecí rámec podle vynálezu může být také takový, do něho bylo uměle vloženo nebo z něho bylo vyjmuto jeden nebo několik intronů. Vynález zahrnuje každou z výše uvedených variant.

Výhodně otevřený čtecí rámec pochází z půdní houby Myrothecium verrucaria (jak ji popsali Maier-Greiner, U.H. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4260-4264, 1991).

Aby byla schopna exprese v hostitelské buňce tak, aby poskytovala rezistenci k toxickému selekčnímu činidlu, musí chimérická DNA podle vynálezu být vložena do expresní kazety společně s regulačními prvky, které umožňují, že je rozpoznána biochemickým aparátem hostitelské buňky a otevřený čtecí rámec je v hostiteli transkribován a translatován. Expresní kazeta obvykle obsahuje úsek iniciace transkripce, který může pocházet z jakéhokoliv genu schopného exprese ve vybraném hostiteli, a také úsek iniciace translace pro rozpoznání ribozomy a jejich nasednutí. V eukaryotických rostlinných buňkách expresní kazeta obvykle obsahuje navíc úsek terminace transkripce lokalizovaný na „downstream konec otevřeného čtecího rámce, který dovoluje ukončení transkripce a polyadenylaci primárního transkriptu. Kromě toho využití kodonů („codon usage) může být upraveno podle využití kodonů u vybraného hostitele. Principy exprese chimérických konstruktů DNA ve vybrané hostitelské buňce jsou odborníkovi známy a konstrukce takových exprimovatelných konstruktů DNA je • · · nyní pro odborníka rutinní záležitostí pro jakýkoliv druh hostitelské buňky, ať eukaryotickou nebo prokaryotickou.

Aby se otevřený čtecí rámec udržel v hostitelské buňce, obvykle se poskytuje ve formě replikonu, který obsahuje daný otevřený čtecí rámec podle vynálezu spojený s DNA, která je rozpoznávána a replikována v daném hostiteli. Tudíž selekce replikonu je určována hlavně vybranou hostitelskou buňkou. Principy výběru vhodného replikonu pro vybranou hostitelskou buňku spadají do schopností běžného odborníka.

Zvláštním druhem replikonu je takový, který je schopen přenést sám sebe, nebo svou Část, do jiné hostitelské buňky, jako např. rostlinné buňky, a tím přenést otevřený čtecí rámec podle vynálezu do rostlinné buňky. Replikony těchto vlastností jsou označovány jako vektory. Příkladem takových vektorů je Ti-plazmidový vektor, který, když je přítomen ve vhodném hostiteli jako je Agrobacterium tumeťacier.s, je schopen přenést svou část, tak zvaný T-úsek, do rostlinné buňky. Různé typy Ti-plazmidů (viz např. EP 0 116 718 Bl) se nyní rutinně užívají k přenosu chimérické DNA do rostlinných buněk nebo protoplastů, ze kterých se mohou regenerovat nové rostliny, které mají trvale inkorporovanou uvedenou chimérickou DNA ve svém genomu. Zvláště výhodné Ti-plazmidové vektory jsou tzv. binární vektory, např. nárokované v EP 0 120 516 Bl a US 4 940 838. Jiné vhodné vektory, které se mohou použít pro přenos DNA podle vynálezu do rostliny, mohou být vybrány z virových vektorů, např. neintegrujících rostlinných virových vektorů, které jsou např. odvozeny z dvouřetězcových rostlinných virů (např. CaMV) nebo jednořetězcových virů, geminivirů a pod. Použití takových virů je výhodné, zvláště pokud je těžké trvale transformovat rostlinného hostitele. Což případ dřevin, zvláště některých stromů a vinné révy.

Termín „hostitelské buňky obsahující sekvence chimérické DNA podle vynálezu ve svém genomu znamená buňky, a také mnohabuněčné organismy obsahující takové buňky, nebo

okud	je těžké
Což	je např.
révy	•
mce	ch imé ir i c ké

v podstatě obsahující takové buňky, ve kterých je trvale inkorporována v jejich genomu chimérická DNA, a které si udržují chimérickou DNA a předávají ji buňkám potomstva, ať prostřednictvím mitózy nebo meiózy. Takovými hostitelskými buňkami mohou být prokaryotické organismy jako jsou bakterie nebo eukaryotické organismy jako např. kvasinky. Také buňky z eukaryotických organismů ve tkáňové kultuře, jako např. buňky rostlin nebo zvířat, např. savců, mohou inkorporovat. chimérickou DNA. Tudíž výhodné provedení vynálezu poskytuje rostliny, které v podstatě sestávají z buněk, které obsahují jednu nebo několik kopií chimérické DNA ve svém genomu a které jsou schopny předávat tuto kopii nebo kopie svému potomstvu, výhodně mendelovskou dědičností. Díky transkripci a translaci chimérické DNA podle vynálezu tyto buňky tvoří CAH a projevují zvýšenou rezistenci ke kyanamidu. Ačkoliv principy transkripce DNA v rostlinné buňce nejsou plně pochopeny, vytvoření chimérické DNA schopné exprese v rostlinné tkáni, které je vystavena selekci na kyanamidu, jako je např. kalus, semeno, embryonální pletivo nebo meristém, nebo schopné konstitutivní exprese, je nyní rutinní záležitostí. Úseky iniciace transkripce rutinně užívané pro expresi polynukleotidů konstitutivním způsobem jsou promotory získané z viru mozaiky květáku, zejména 35S RNA a 19S RNA promotory a tzv. T-DNA promotory z Agrobacteríum tumefaciens. Zvláště je možné zmínit promotor nopalinsyntázy, promotor oktopinsyntázy (popsaný v EP 0 122 791 Bl) a promotor mannopinsyntázy. Kromě toho je možné užít rostlinné promotory, které jsou v podstatě konstitutivní, jako je např. promotor aktinového genu z rýže. Výběr promotoru není podstatný, musí však být jasné, že konstitutivní promotory pro vysokou hladinu exprese musí vykazovat expresi v konkrétním pletivu, kde probíhá selekce. Je také známo, že duplikace některých prvků, tzv. zesilovačů („enhancers) může výrazně zvýšit hladinu exprese DNA (např. viz Kay, R. et al., 1987, Science 236: 1299-1302:

The duplication of the sequence between -343 and -90 of the CaMV promotor increase the activity of that promotor). Kromě 35S promotoru, s jedním nebo dvěma enhancery, lze jako příklady promotorů s vysokou hladinou exprese uvést světlem indukovaný promotor malé podjednotky ribulózabisfosfátkarboxylázy (rbcSSU) a promotor vazebného proteinu chlorofylu a/b. Podle vynálezu lze také předpokládat užití hybridních promotorů, které obsahují fyzicky spojené prvky z různých promotorových úseků. Známým příkladem takového hybridního promotoru je CaMV zesílený mannopinsyntázový promotor (US Patent 5 106 739), který obsahuje prvky z manopinsyntázového promotoru spojené se zesilovačem CaMV.

Při transformaci jednoděložných rostlin použití intronu mezi promotorem a selekčním markérem zvyšuje expresi.

Termín „promotor tedy označuje úsek DNA v poloze „upstream od strukturního genu, který je rozpoznáván a na který se váže RNA polymeráza a jiné proteiny zahajující transkripci. „Rostlinný promotor je promotor schopný iniciace transkripce v rostlinné buňce. „Konstitutivní promotor znamená promotor aktivní ve většině prostředí a podmínek a stadiích vývoje buněčné diferenciace.

Konstitutivní promotor je výhodný v předkládaném vynálezu, neboť selekce transformant se může provádět v různých stadiích vývoje na různých pletivech. Takže konstitutivní promotor neomezuje možnosti selekce.

Výběr vhodného konstitutivního promotoru je v tomto ohledu velmi důležitý vzhledem k ostatním promotorům užitým v téže transformaci. Je známo, že duplikace promotorů ovlivňuje expresi genů řízených těmito promotory. Jelikož cílem exprese selekčního markéru je pouze využití k selekci rostliny, která je současně transformovaná požadovaným genem, je třeba si uvědomit, že použití stejného promotoru pro selekční markér a pro požadovaný gen by mohlo působit potíže.

Pokud se týče nezbytnosti úseku terminace transkripce, obecně se věří, že takový úsek zvyšuje spolehlivost a také účinnost transkripce v rostlinné buňce. Použití takového úseku je proto výhodné i v předkládaném vynálezu.

Pokud se týče použitelnosti předkládaného vynálezu na různé rostlinné druhy, je třeba připomenout, že příklady provedení ilustrují výhodná provedení vynálezu s transgenním rajčetem, bramborem, rýží a Arabidopsis, ale využitelnost předkládaného vynálezu není ve skutečnosti omezena pouze na tyto druhy rostlin.

Ačkoliv některá provedení předkládaného vynálezu nemohou být v současné době uskutečněna, neboť některé rostlinné druhy se dosud nepodařilo s takovým rostlinami j principiální otázkou,

13Γ3.ΓΪ s řo ι?ΓΓι.Ξΐ c x ^}3Ro t3ROV3 k předkládanému vynálezu.

„Transformací rostlin transformovat, prove však jen otázkou neboť ;ůsobilost

O ΤΊ

Č3SU relevantní vynálezu a nikoliv genetické vzhledem se míní jakýkoliv způsob, kterým se DNA vnáší do rostliny. Proces transformace nemusí nutně » / ro s~\ pěstování tkáňové rutinním postupem pro to jak Dicotyledoneae obsahovat období regenerace RuXtuřo

Transformace rostlin je nyní obrovskou řadu rostlinných druhů, (dvouděložných) tak i Monocotyledoneae (jednoděložných). V principu lze užít jakoukoliv metodu transformace pro vneseni chimérické DNA podle vynálezu do vhodné počáteční buňky.

Vhodnou metodu lze kalcium/polyetylénglykolová metoda pí vybrat metod jako je protoplasty (Krens, al., Nátuře 296: 72-74, Negrutiu,· I. et al., 1987,

Plant Mol. Biol. (Shillito, R.D. et

8: 363-373), al., 1985,

J- CA \

Bio/Technol 3:

protoplastů 1099-1102), A. et al., mikroinjekce do rostlinného materiálu (Crossway 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), ostřelování různého rostlinného materiálu mikročásticemi pokrytými DNA nebo RNA (Klein T.M. et al., 1987, Nátuře 327, 70), infekce neintegrujícími viry, přenos genu in planta zprostředkovaný Agrobacterium tumefaciens po infiltraci rostlin nebo transformace zralého pylu nebo mikrospor (viz EP 0 301 316) a další. Výhodným způsobem podle vynálezu je přenos DNA zprostředkovaný Agrobacterium tumefaciens. Zvláště výhodné je použití postupu s tzv. binárními vektory, jak byly popsány v EP A 120 516 a US 4 940 838.

Transformace rajčete se výhodně provádí v podstatě postupem dle Van Roekel et al. (Plant Cell Rep. 12: 644-647). Transformace bramboru se výhodně provádí v podstatě postupem dle Hoekma et al. (Plant Cell Rep. 7: 273-278, 1989).

Ačkoliv jsou považovány za poněkud více odolné transformaci, i jednoděložné rostliny jsou schopné transformace a je možné regenerovat fertilní transgenní rostliny z transformovaných buněk nebo embryí nebo jiného rostlinného materiálu. V současné době je výhodným způsobem transformace jednoděložných rostlin ostřelováni mikročásticemi, a sice embryí, explantátů nebo buněčných suspenzi, a také přímý příjem DNA pletivem nebo elektroporace pletiva (Shimamoto et al., Nátuře 338: 274-276, 1989). Transgenní rostliny kukuřice byly získány vnesením genu bar ze Streptomyces hygroscopicus, který kóduje fosfinotricinacetyltransferázu (tj. enzym, který inaktivuje herbicid fosfinotricin), ostřelováním embryonálních buněk v suspenzní buněčné kultuře z kukuřice mikročásticemi (Gordon-Kamm, Plant Cell .2:603-618, 1990). Rostliny pšenice byly regenerovány z embryogenní suspenzní kultury selekcí embryogenních kalusů pro založení embryogenních suspenzních kultur (Vasil, Bio/Technol. 8: 429-434, 1990). Kombinace s transformačním systémem pro tyto plodiny umožňuje aplikovat předkládaný vynález i na jednoděložné rostliny.

Jednoděložné rostliny, včetně hospodářsky důležitých plodin jako je rýže nebo kukuřice, jsou také schopny

transformace přenosem DNA pomocí kmenů Agrobacterium (viz WO 94/00977, EP 0 159 418 Bl, Gould, J., Michal D., Hasegawa 0., Ulian E.C., Peterson G., Smith R.H., Plant Physiol. 95: 426-434, 1991).

Pro získání transgenních rostlin, které exprimují více než jeden chimérický gen, je k dispozici několik alternativních postupů, včetně následujících:

A. Použití DNA, např. T-DNA v binárním plazmidů, s řadou modifikovaných genů fyzicky spojených s druhým genem pro selekční markér. Výhoda takového postupu je v tom, že chimérické geny jsou fyzicky spojeny a proto migrují jako jediný mendelovský lokus. Vynález je v takovém případě velmi užitečný, neboť poskytuje druhý selekční markér, který může být přidán k již existující kombinaci selekčnímu markéru a požadovaného genu. Takže selekci transformant lze potom provádět bez ohledu na povahu prvního selekčního markéru.

B. Vzájemné opylení transgenních rostlin již schopných exprese jednoho nebo několika chimérických genů, výhodně spojených s genem selekčního markéru, pylem z transgenní rostliny obsahující jeden nebo několik chimérických genů výhodně spojených s druhým selekčním markérem. Semena získaná takovým křížením se mohou selektovat na základě přítomnosti obou selekčních markérů nebo na základě přítomnosti samotných chimérických genů. Rostliny získané ze selektovaných semen se pak mohou užít pro další křížení. V principu chimérické geny nejsou v jednom lokusu a geny tudíž mohou segregovat jako nezávislé lokusy. Také zde je možnost užít selekci na oba markéry, což výhoda poskytovaná předkládaným vynálezem.

C. Použití několika několikanásobných chimérických molekul DNA, např. plazmidů, z nichž každá obsahuje jeden nebo několik chimérických genů a selekční markér. Pokud je frekvence kotransformace vysoká, pak selekce na základě jednoho markéru je dostatečná. V opačném případě je výhodná selekce na základě více než jednoho markéru.

D. Postupná transformace transgenních rostlin již obsahujících první, druhý atd. chimérický gen s novou chimérickou DNA, případně obsahující také gen selekčního markéru. Stejně jako v metodě B, chimérické geny nejsou v principu na jediném lokusu a mohou proto segregovat jako nezávislé lokusy.

E. Kombinace několika výše uvedených strategií.

Skutečná zvolená strategie pak závisí na řadě faktorů, které lze snadno zvážit, jako je např. účel rodičovských linii (zda pro přímé pěstování, využití ve šlechtitelském programu nebo produkci hybridů), ale není rozhodující z hlediska předkládaného vynálezu.

I když to není nutné pro předkládaný vynález, je známo, že prakticky všechny rostliny mohou být regenerovány z kultivovaných buněk nebo pletiv. Prostředky regenerace jsou různé pro různé druhy rostlin, ale obecně se nejdříve vyhází ze suspenze transformovaných protoplastů nebo Petriho misky s transformovanými explantáty. Výhonky je možné indukovat přímo, nebo nepřímo (z kalusu) prostřednictvím organogeneze nebo embryogenze a pak zakořenit. Kromě sloučeniny pro selekci, kultivační médium obecně obsahuje různé aminokyšeLíny a hormony, jako jsou auxiny a cytokininy. Zda je regenerace účinná závisí na médiu, na genotypu a na historii kultury. Pokud tyto tři proměnné jsou kontrolovány, je regenerace obvykle reprodukovatelná a opakovatelná.

Po trvalé inkorporaci sekvenci transformovaného genu do transgenní rostliny, znaky přenesené tímto genem mohou být přenášeny na další rostliny pohlavním křížením. K tomu lze užít jakýkoliv způsob standardního křížení, v závislosti na biologickém druhu, který je křížen.

• · ·

Přehled obrázků

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

nebo

1:	Schéma	T-DNA	V	PMOG874.
2:	Schéma	T-DNA	v	PMOG1156
3:	Schéma	T-DNA	v	pMOG22.
4:	Schéma	T-DNA	v	pMOG1005.
5:	Schéma	T-DNA	v	pMOG1278.
6:	Schéma	T-DNA	v	pMOG1295.
7 :	Schéma	T-DNA	v	pMOG1253.

8: Schéma expresní kazety v pMOG873.

9: Schéma expresní kazety v pMOG617.

10: Explantáty Arabídopsis transformované a) pMOG1156 b) pMOG410 selektované na médiu s 50 mg/1 kyanamidu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování genu kódujícího kyanamidhydratázu (CAH) z houby do heterologní expresní kazety

a) Konstrukty pro transformaci dvouděložných rostlin

Konstrukt pMOG874 obsahuje kódující úsek genu kyanamidhydratázy z půdní houby Myrothecium verrucaria, který je operativně spojen promotorem 35S CaMV a terminátorem 35S

EMBO J. 6: 3901, β-glukuronidázy a

CaMV. Tento chimérický gen je klonován do binárního vektoru pBHOl (Jefferson et al. nahrazuje kódující úsek nopalinsyntázy.

Konstrukt byl získán přidáním místa Xhol na 5'konec a místa Sstl na 3'konec fragmnetu CAH cDNA velikosti 899 bp (pozice 235 až 1197 v sekvenci, kterou publikovali MaierGreiner et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 42601987), kde terminátor • ·

4264) metodou PCR (poiymerázové řetězové reakce) pomocí dvou oligonukleotidových primerů Pl a P2:

ΡΪ : 5 ' -ACCGAGCTCGAATTCGGCACGAGGTTGACATGATACCTTCCTG-3'

P2 : 5 ' -GACCTCGAGAATTCGGCACGAGGTACGATCCTACTTCCTCGC-3 ' mezi místy Xhol a Sstl v rostlinném expresní vektoru pRTlOl, kde obě místa patří polyiinkeru (vícečetnému klonovacímu místu), který je vložen mezi promotor 35S a terminační signál 35S v pRTlOl (Topfer et ai., ±987, Nuci. Acids Res. 15: 5890).

Chimérické geny pak byly štěpeny Pstl, přesahující konce byly zarovnány T4 DNA poiymerázou a fragment s tupými konci byl klonován do Smál místa plazmidu pB±N±9 (Bevan, M., Nuci. Acids Res. 12: 8711-8721, 1984).

V konstruktu pMOG1156 je další gen kódující β-giukuronidázu operativně spojený s promotorem 35S a terminátorem 35S vložen jako Xnol/Sail fragment do Sail místa pMOG874.

Oba tyto konstrukty obsahují kromě nového selekčního markéru CAH konvenční selekční markér, a sice NPTII, spojený s promotorem nopalinsyntázy a terminátorem nopaiinsyntázy jako je tomu v pBIN19.

b. Konstrukty pro transformaci jednoděložnýcn rostlin

Stejným způsobem jako byl připraven pMOG874 byla expresní kazeta klonována do vektoru s vysokým počtem kopií (pRTlOl, Topfer et al., ±987, Nuci. Acids Res. 15: 5890), což vedlo k vytvoření pMOG873 (obr. 8).

Derivát pMOG22 (obr. 3, uložen ve sbírce Centraai Bureau voor Scnimmelcultures, Baarn, Nizozemí, 29. ledna 1990, jako položka č. CBS 101.90) byl připraven vložením restrikčního místa Kpn± do polyiinkeru pMOG22 mezi místa EcoRI a Smál. Orientce polyiinkeru byla také obrácena. Tento plazmid, zvaný pMOGiOOS, obsahuje gen rezistence k hygromycinu mezi levou a pravou hraniční sekvencí T-DNA (obr. 4). Expresní kazeta velikosti 1,7 kb obsahující gen CAH řízený 35S promotorem a 35S terminátorem byl klonován mezi restrikční místa HindlII a BamHI. Tento plazmid byl pak nazván pMOG1278 (obr. 5). Binární vektor pMOG1295 (obr. 6) je derivát pMOG1278 a obsahuje v restrikčním místě Sáli expresní kazetu GUS, kterou popsali Vancanneyt, G. et al. (Mol. Gen. Genet. 220: 245-250, 1990).

Plazmid pMOG1253 byl odvozen z pMOG 18 (Sijmons, PCR. et al., Bio/Technol 8: 217-221, 1990, který obsahuje dvojitě zesílený 35S promotor, vedoucí sekvenci A1MV RNA 4, gen GUS a terminátor nos v jedné expresní kazetě jakožto EcoRI-HindlII fragment. Plazmid p35SGUSINT (Vancanneyt et al., 1990) byl štěpen SnaBI a MscI, výsledný fragment velikosti 426 bp obsahující část kódujícího úseku genu GUS a intron ST-LS1 byl izolován a klonován do pMOG22, což vedlo k vytvoření pMOG1253 (obr. 7). Plazmid pMOG617 byl připraven klonováním hygromycinové expresní kazety z pMOG22 do místa HindlII vektoru s vysokým počtem kopií pMOG18.

Příklad 2

Transformace bramboru

Následující příklad popisuje způsob transformace stonkových segmentů Solanum tuberosum cv. Kardal pomocí Agrobacterium tumefaciens. Explantáty z uzlin rostlin pěstovaných in vitro byly použity 3 až 8 týdnů po přenosu. Rostliny byly pěstovány v množícím médiu (MUM) se světelnou periodou 16 hodin (1700 lux) při 24 °C a temnou periodou 8 hodin při 21 °C (přehled různých médiií je uveden v tab. 2). Segmenty stonku dlouhé přibližně 5 mm byly nařezány na sterilním filtračním papíru nasáklém oplachovacím médiem (WAM) a pak shromážděny v nádobě s médiem WAM. Pro asi 300 explantátů bylo WAM médium nahrazeno předklutivačním médiem (PRM). Kultivační nádoby byly inkubovány za rotování 80 rpm ve * · stejných podmínkách jak byly popsány výše po 24 hodin. Všechny binární vektory použité v této studii obsahovaly gen nptll jako rostlinný selekční markér a nptlll jako bakteriální selekční markér. Plazmid pMOG410 navíc nesl chimérický gen GUS obsahující intron (Vancanneyt et al 235-250, 1990).

a chimérický gen

Mol. Gen. Genet. 220: Plazmid pMOG1156 navíc nesl gen GUS CAH kódující kyanamidhydratázu. Plazmid pMOG874 nesl navíc gen cah. Plazmidy byly udržovány v E. coli a Agrobacterium tumefaciens pomocí selekce na kanamycinu.

Agrobacterium tumefaciens se pěstovalo přes noc na LB médiu s antibiotiky (rifampicin 29 mg/1, kanamycin 100 mg/1). Kultura z kultivace přes noc byla naředěna na OD₆₀o = 0,1 a pak pěstována do dosažení OD = 0,3 v LB médiu bez antibiotik, což byly asi 2 hodiny. Suspenze bakterií pak byla centrifugována při 1600 g po 15 minut při teplotě místnosti. Bakterie pak byly resuspendovány v oplachovacím médiu a použity v kokultovačním experimentu. Z nádob bylo odstraněno prekultivační médium a nahrazeno suspenzí s Agrobacterium. Nádoby pak byly kultivovány 20 minut a pak byly explantáty opláchnuty dvakrát oplachovacím médiem. Explantáty pak byly osušeny na sterilním filtračním papíru a pak 48 hodin kultivovány na miskách obsahujících kokultivační médium (COM). Pak byly explantáty přeneseny na postkultivační médium (POM) a inkubace pokračovala 72 hodin. Pak byly explantáty přeneseny na médium indukující výhonky (SIM) obsahující různé koncentrace kyanamidu a kanamycinu. Po 2 týdnech byly explantáty subkultivovány na stejné médium a asi po třech týdnech byly přeneseny na výhonky prodlužující médium (SEM) obsahující kyanamid a kanamycin stejně jak bylo uvedeno výše. Když byly výhonky dostatečně velké, aby mohly být odříznuty, byly přeneseny na médium indukující kořeny (RIM). Výhonky schopné zakořenit pak byly přeneseny na médium indukující kořeny obsahující 50 mg/1 kyanamidu nebo 30 mg/1 kanamycinu. Transgenní charakter výhonků byl zkoumán tak, že se testovaly * · lístečky ze zakořeněných výhonků na expresi genu gus histochemickým testem gus aktivity. Ukázalo se, že pro pMOG156 zakořeňování transgenních výhonků v médiu obsahujícím kyanamid plně korelovalo s expresi genu gus.

Tabulka 1

PMOG1156 (cah-gus-nptll)

selekce	počet	počet	počet	počet výhonků
v průběhu	inokulovaných	odřezaných	zakořeňuj ících	pozitivních na
regenerace	explantátů	výhonků	výhonků	gus (gus+)
kyanamid 40	48	15	2	2
kyanamid 30	48	50	12	12
kyanamid 20	48	56	6	6
kanamycin 50	48	26	16	16

PMOG410 (gus-nptll)

selekce v průběhu regenerace	počet inokulovaných explantátů	počet odřezaných výhonků	počet zakořeňuj ících výhonků	počet výhonků pozitivních na gus (gus+)
kyanamid 40	62	0	0	0
kyanamid 30	62	10	0	0
kyanamid 20	62	48	0	0
kanamycin 50	58	24	13	12

PMOG874 (cah-nptll)

selekce v průběhu regenerace	počet inokulovaných explantátů	počet odřezaných výhonků	počet zakořeňuj ících výhonků	počet výhonků pozitivních na gus (gus+)
kyanamid 40	58	10	1	nestanoveno
kyanamid 30	58	40	8	nestanoveno
kyanamid 20	58	81	2	nestanoveno
kanamycin 50	58	34	26	nestanoveno

Tabulka 2

Složeni různých médií

Médium	WAM	PRM	COM	POM	SIM	SEM	RIM	MUM
makrosoli	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	l/2xMS	l/2xMS
vitamíny	B5	B5	B5	B5	B5	B5	1/2 R3	1/2 R3
sacharóza	3%	3%	3%	3%	3%	3%	1%	1%
agar		0,8%	0,8%	0,8%	0, 8%	0, 8%	0, 8%	0, 8%
MES(g/1)	0, 5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0, 5	0,5
pH	5,8	5,8	5,8	5,8	5,8	5, 8	5, 8	5,8
zeatinribo- sid (mg/1)		0,5	0, 5	3,0	3,0	0,3
2,4-D	-	1,0	1,0	-	-	-	-	-
IBA		-	-	-	-	-	0,1	-
Cefotaxim	-	-	-	200	200	200	100	-
Vancomycin	—	-	-	100	100	100	50	-

MS: Murashige a Skoog, Plant Physiol. 15, 473-479, 1962

B5: Gamborg B5 (Gamborg, Orl et al., Exp. Cell Res. 50: 151158, 1986)

Příklad 3

Transformace rajčat

Tento příklad popisuje způsob transformace děloh Lycopersicon esculentum cv. Money Maker pomocí Agrobacterium tumefaciens. Binární vektory a kmeny Agrobacterium tumefaciens použité v této transformaci jsou shodné s těmi, které byly popsány v předchozích příkladech. Semenáčky rajčete klíčily v klíčícím médiu (GEM) v podmínkách se světelnou periodou 16 hodin (1700 lux) při 24 °C a temnou periodou 8 hodin při 21 °C (přehled různých médií je uveden v tab. 4) . Explantéty * · děložních lístků ze semenáčků starých 5 až 7 dnů byly odříznuty na sterilním filtračním papíru nasáklém oplachovacím médiem (WAM) a přeneseny na misky obsahující kokultivační médium (COM). Misky obsahujíc po 50 explantátech byly inkubovány přes noc ve stejných podmínkách jako v předchozím příkladu.

Preinkubované explantáty pak byly šetrně ponořeny do inokula s Agrobacteríum tumefaciens na 20 minut.

Explantáty pak byly osušeny na sterilním filtračním papíru a inkubovány 48 hodin na druhé sadě kokultivačních misek. Pak byly inkubovány 72 hodin na miskách obsahujících postkultivační médium (POM) a pak byly přeneseny na médium indukující výhonky (SIM) obsahující různé koncentrace kyanamidu nebo kanamycinu. Každé tři týdny byly explantáty subkultivovány na stejné médium. Přibližně po 8 až 12 týdnech byly výhonky odřezány a přeneseny na médium indukující kořeny (RIM). Výhonky schopné zakořenit pak byly přeneseny na médium indukující kořeny obsahující 50 mg/1 kyanamidu nebo 30 mg/1 kanamycinu. Transgenní charakter výhonků byl testován tak, že se testoval lístečky ze zakořeněných výhonků na expresi genu gus histochemickým testem GUS aktivity.

Tabulka 3

Výsledky transformace explantátů děložních lístků rajčete pMOG1156 (gus-nptII-cah)

selekce v průběhu regenerace	počet inokulovaných explantátů	počet odřezaných výhonků	počet zakořeňuj ících výhonků	počet výhonků pozitivních na gus (gus+)
kyanamid 40	30	5	3	3
kyanamid 30	30	5	0	0
kyanamid 20	30	0	0	0
kanamycin 100	30	5	3	4

pMOG410 (gus-nptll)

selekce v průběhu regenerace	počet inokulovaných explantátů	počet odřezaných výhonků	počet zakořeňuj ících výhon, kxí	počet výhonků pozitivních na gus (gus+)
kyanamid 40	30	0	0	0
kyanamid 30	30	3	0	0
kyanamid 20	30	0	0	0
kanamycin 100	30	4	3	3

pMOG874 (cah-nptll)

selekce v průběhu regenerace	počet inokulovaných explantátů	počet odřezaných výhonků	počet zakořeňuj ících výhonků	počet výhonků pozitivních na gus (gus+)
kyanamid 40	35	1	1	nestanoveno
kyanamid 30	35	0	0	nestanoveno
kyanamid 20	35	2	0	nestanoveno
kanamycin 100	35	4	1	nestanoveno

Tabulka 4

Složení různých médií

Médium	WAM	COM	POM	SIM	RIM	GEM
Makrosoli	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	lxMS	l/2xMS
vitamíny	B5	B5	B5	B5	B5	B5
sacharóza	3%	3%	3%	-	1%	1%
glukóza		-	-	1%	-	-
agar	-	0,8%	0,8%	0, 8%	0,8%	0,8%
MES(g/1)	0,5	0,5	0, 5	0,5	0,5	0,5
pH	5,8	5,8	5,8	5, 8	5,8	5, 8
zeatinribosid(mg/1)	-	2,0	2,0	2,0	-	-
IAA	—	0,1	0,1	0,1	-	-

Tabulka 4 - pokračování Složení různých médií

Médium	WAM	COM	POM	SIM	RIM	GEM
2,4-D	-	0,5	-	-	-	-
IBA	-	-	-	-	0,25	-
Carbenicilin	-	-	-	500	-	-
Cefotaxim	-	-	200	-	200	-
Vancomycin	-	-	50	-	-	-
Acetosyringon (mM)	-	0,2	-	-	-	-

Příklad 4

Transformace Arabidopsis

Tento příklad popisuje způsob transformace segmentů kořenů Arabidopsis thaliana cv. 24 pomocí Agrobacterium tumefaciens. Binární vektory použité v této transformaci byly shodné s vektory popsanými v předchozích příkladech.

Šest miligramů semen Arabidopsis thaliana bylo naklíčena v nádobě obsahující kapalné klíčící médium (GM) v podmínkách se světelnou periodou 16 hodin (1700 lux) při 24 °C a temnou periodou 8 hodin při 21 °C za otáčení 80 rpm. Složení různých médií je popsáno v tab. 4. Kořeny ze semenáčků starých 9 dnů byly izolovány ve sterilní Petriho misce a sebrány do kapka klíčícího média. Pak byly kořeny nařezány na segmenty dlouhé 3 až 5 mm a přibližně 100 těchto explantátů bylo rozprostřeno rovnoměrně na nylonovou membránu (průměr 8 cm), která byla umístěna na misky obsahující médium indukující kalus (CIM). Misky pak byly inkubovány 3 dny ve stejných podmínkách jaké byly popsány výše.

Kmen Agrobacterium tumefaciens použitý v této studii nesl selekční markér rezistence k rifampicinu na chromozomálním pozadí kmene C58. Konstrukce pomocného kmenu MOG101 byla popsana publikaci Hood et al. (1993) . Agrobacterium. tumefaciens se pěstovalo přes noc v médiu LB s antibiotiky (rifampicin 20 mg/1, kanamycin 100 mg/1). Kultura byla po noční kultivaci naředěna 1:10 s LB bez antibiotik a pěstována další 3 hodiny. Bakteriální suspenze pak byla centrifugována při 1600 x g 15 minut při teplotě místnosti. Bakterie se resuspendovaly v GM na OD₆₀₀ = 0,1 a takto se použily pro kokultivaci.

Membrána obsahující přibližně 100 explantátů se inkubovala 2 minuty se suspenzí Agrobacterium tumefaciens a pak se osušila na filtračním papíru, aby se odstranil nadbytek bakterií. Pak se membrána s explantáty kultivovala 48 hodin na miskách s CIM. Po opláchnutí membrány a explantátů kapalným GM se inkubovaly v miskách obsahujících médium indukující výhonky (SIM) s různými koncentracemi kyanamidu nebo kanamycinu. Po pěti dnech byly membrány s explantáty přeneseny na čerstvé stejné médium pro subkultivaci, druhá subkultivace proběhla za dva týdny. Přibližně čtyři týdny po kokultivaci bylo z každé koncentrace kyanamidu odebráno 60 výhonků a umístěno na misky s médiem prodlužujícím výhonky (SEM) s 30mg/l kyanamidu. Výhonky schopné zakořenit byly testovány na odebraných lístcích, zda mají transgenní charakter tím, že se zjišťovala exprese genu GUS histochemickým testem gus aktivity.

Byly provedeny tři experimenty. Výhonky získané v pokusech 98-8 a 98-11 byly přeneseny do zakořeftovacího média (SEM) s 30 mg/1 kyanamidu. Výhonky získané v pokusu 98-13 byly přeneseny do zakořeftovacího média se stejnými koncentracemi jako v selekčním médiu (SIM). Výsledky jsou uvedeny v tab. 4a. Výhonky získané po selekci na kanamycinu (50 mg/1) byly přeneseny na zakořeňovací médium obsahující 25 mg/1 kanamycinu.

• 44 • 4 »4 ···« »44

Tabulka 4

Média potřebná pro transformaci kořenových segmentů Arabidopsis thaliana

Složka média	Médium	GM	CIM	SIM	SEM
Přísada	makroelementy	B5	B5	B5	MS
mikroelementy	B5	B5	B5	MS
vitaminy	B5	B5	B5	B5
sacharóza (g/1)				10
glukóza (g/1)	20	20	20
agar (g/1)		10	10	10
Hormony	2,4-D		0,5
kinetin		0, 05
2-ip			5
IAA			0,15
Antibiotika	vancomycin			100	50
carbenicillin			500
cefotaxim				100

Kořenové explantáty transformované pMOG410 nebyly schopny regenerace na médiu obsahujícím kyanamid. Dokonce 20 mg/1 kyanamidu bylo již dost, aby zabránilo regeneraci explantátů transformovaných konstruktem bez genu cah. Při koncentraci kyanamidu 20 až 40 mg/1 byl pozorován vývoj několika kalusů, ale při koncentraci 50 mg/1 a vyšší nebyly explantáty životaschopné a úplně zhnědly.

Na druhé straně explantáty transformované genem cah (pMOG1156) byly schopné regenerovat ve všech koncentracích kyanamidu, dokonce i v 80 mg/1. Při nižších koncentracích byla regenerace výhonků rychlejší než s kanamycinem.

I když bylo k dispozici více výhonků, z každé koncentrace bylo odebráno 60 až 65 výhonků a umístěno na zakořeňovací médium. Při nižších koncentracích kyanamidu se vyvinulo stejné množství výhonků jako při selekci na kanamycinu (přibližně 70 až 100 na každou Petriho misku).

Existuje jasná korelace mezi vývojem kalusů a expresí GUS při selekci na kyanamidu u kořenových explantátů transformovaných pMOG1156 (obr. 4b). GUS analýza výhonků získaných na médiu bez kyanamidu (0 mg/1) neukázala žádné zbarvení, což ukazuje, že kyanamid je nutný pro získání transgenních výhonků.

Tabulka 4a

Výsledky transformace Arabidopsis thaliana pMOG1156

	Experiment 98-8	Experiment 98-11	Experimen	t 98-13
koncentrace	počet	%zakoř.	počet	%zakoř.	počet	%zakoř.
kyanamidu (mg/1)	rostlin1	výhonků1 2 3	rostlin	výhonků	rostlin	výhonků
C20	0	0	1	1,7	3	CO
C30	4	6, 3	2	3,2	9	14,5
C40	5	8,2	3	4,5	1	1,6
C50	neurčeno	neurčeno	5	8,1	0	0
C60	5	8,2	neurčeno	neurčeno	4	6,0
C80	9	13,8	10	15, 6	8	11,4
K50	29	46,8	19	47,5	14	20,6

(1) celkový počet rostlin znamená počet výhonků, ze kterých se vyvinuly rostliny a byly schopny zakořenit v médiu obsahujícím kyanamid (2) % zakořeněných výhonků = počet rostlin/ celkový počet výhonků x 100 % (3) % modře zbarvených rostlin ve srovnání s celkovým počtem rostlin

Tabulka 4b

Procento rostlin Arabidopsis thaliana exprimujících GUS po selekci na kyanamidu nebo kanamycinu

	PMOG410	PMOG1156
Ošetření	0*3 0s	C303	Stejné koncentrace jako ošetření6
C20	neurčeno	O1	0
C30	neurčeno	75-100	78
C40	neurčeno	40-100	100
C50	neurčeno	80	neurčeno
C60	neurčeno	80	100
C80	neurčeno	67-90	100
K50	Ϊ002	82-92	100

(1) % rostlin zbarvených modře (2) všechny výhonky s pMOG410 zakořenily na kanamycinu 25 mg/1 (3) C = kyanamid (mg/i) (4) K = kanamycin (mg/1) (5) koncentrace v zakořeňovacím médiu

Příklad 5

Transformace rýže

Příklad popisuje způsob transformace kalusů pocházejících z pletiva scutella zralých embryí rýže (Oryza sativa cv. Taipei 309) pomocí Agrobacteríum tumefaciens kmene LBAlll9-pMOG1295 (který nese gen cah) a kmene LBAlll9-pMOG1253 (kontrola).

Sterilní slupek zbavená zrna rýže byla naklíčena na miskách obsahujících médium indukující kalus (CIM) ve tmě ve 28 °C (složení různých médií je uvedeno v tab. 5) . Po třech týdnech byly izolovány embryogenní kalusy pocházející ze scutella a byly subkultivovány na stejné médium za stejných podmínek. Po 2 až 3 týdnech byly embryogenní kalusy nařezány na segmenty velikosti 2 až 3 mm a kultivovány 4 dny na miskách obsahujících CIM. Kmeny v tomto pokusu nesly v chromozomálním základu

Agrobacterium tumefaciens použité rifampicinový selekční markér Konstrukci pomocného kmene Agrobacterium tumefaciens se s AB médiem s antibiotiky

C58

EHA105 popsal Hood et al. pěstovalo 4 dny na miskách (rifampicin 20 mg/1, kanamycin 100 mg/1). Agrobakteria se sebrala do LIM a OD₆oo se upravila na 1,0 až 1,5. Tato suspenze byla užita pro kokukltivaci. Kalusy byly inkubovány 10 minut v této suspenzi agrobakterií a pak osušeny sterilním filtračním papírem, aby se odstranily nadbytečné bakterie. Kalusy pak byly kultivovány 48 hodin na miskách s kokultivačním médiem (COM) ve tmě při 25 °C. Pro každou koncentraci kyanamidu se užilo 50 kalusů s pMOG1295 a 20 kalusů s pMOG1253. Byly užity následující koncentrace kyanamidu: 0, 15, 30, 60, 100, 150, 200, 300

Hygromycin byl užit v koncentraci 50 mg/1.

inkubovány nejdříve na miskách s prvním selekčním médiem (FSM) s různými koncentracemi kyanamidu nebo hygromycinem ve tmě při 28 °C. Po třech týdnech byly kalusy přeneseny na misky s médiem indukujícím embrya I (EIM I) obsahujícím stejné koncentrace kyanamidu nebo hygromycin.

týdnech byly kalusy subkultivovány na embrya II (EIM II) obsahující stejné koncentrace kyanamidu a zvýšenou koncentraci hygromycinu (75 mg/1). Kalusy byly přeneseny na médium indukující výhonky (SIM) obsahující stejné koncentrace kyanamidu jako předchozí FSM, EIM I a EIM II, a byly kultivovány při 12hodinové světelné periodě (2600 lux) a 12hodinové temné periodě při 28 °C. Přibližně tři týdny po přenesení kalusů na SIM začaly regenerovat výhonky, které pak byly odříznuty a přeneseny do nádobek obsahující a 500 mg /1. Kalusy byly

Po dalších třech médium indukujícím » I» předskleníkové médium. (PGM). Žádné kalusy nevznikly v koncentraci 100 mg/1 kyanamidu nebo vyšších. Při koncentraci kyanamidu 15 mg/1 byla frekvence regenerace pro oba konstrukty stejná (pMOG1253: 7 ze 16 kalusů bylo schopno regenerace, pMOG1295: 17 ze 44 regenerovalo). Při koncentraci 30 mg/1 kyanamidu pouze u 11 kalusů pMOG1295 se vyvinul zelený kalus a 6 bylo schopno regenerace.

Tabulka 5

Média potřebná pro transformaci Oryza sativa Taipei 309

Složka média	Médium
CIM	COM	LIM	FSM	EIM I	EIM II	SIM	PGM
základní složky (g/1)	makroelemnty	N6	R2	R2	R2	LS	LS	LS	72MS
mikroelementy	B5	R2	R2	R2	LS	LS	LS	72ms
vitaminy	B5	R2	R2	R2	LS	LS	LS	72b5
sacharóza	30			30	30	30	40	10
glukóza		10	10
agaróza typ I		7		7	7	7	7
Phytagel PH .............	2,5							2,5
5, 8	5,2	5,2	6, 0	5, 8	5,8	5, r> □	5,8
Hormony (mg/1)	2,4-D	2,5	2, 5	2,5	2,5	2, 5	2, 5
IAA							0, 5
BAP							0, 3
NAA								0,5
Aditiva	Prolin (mg/1)	500
glutamin (mg/1)	500

Tabulka 5 - pokračováni

Média potřebná pro transformaci Oryza sativa Taipei 309

				M	é d	i u	m
Složka média		CIM	COM	LIM	FSM	EIM I	EIM II	SIM	PGM
	acetosyringon	(μΜ)		100	100
	kokosové (ml)	mléko					100	100
Antibiotika (mg/1)	Vancomycin				100	100	100	10 0
	Cefotaxim				400	100	100	10 0

Příklad 6

Transformace rýže metodou ostřelování mikročásticemi

V tomto příkladu se popisuje způsob transformace suspenze nemorfogrnních buněk Oryza sativa cv. IR 52 pomocí zařízení pro ostřelování mikročásticemi („particle inflow gun, PIG) podle Finer et al. (Plant cell rep. 11, 323-328, 1992).

Dlouhodobá kultura nemorfogenních buněk Oryza sativa cv. IR 52 byla subkultivována v týdenních intervalech v kapalném médiu LS-4 (Linsmeier a Skoog, Physiol. Plant. 18, 100-127, 1962) a udržována ve tmě na rotační třepačce (110 rpm) při 28 °C (složení média LS-4 je uvedeno v tab. 6). 3 až 4 dny po poslední subkultivaci byl 1,5 ml této kultury (tj. přibližně

1,5 χ 10⁶ buněk) bylo rovnoměrně naneseno na filtrační papír (Whatman č. 4), který byl umístěn na tuhé médium LS-4 a byly kultivovány ve tmě při 28 C po 24 hodin a pak ihned použito pro ostřelování. Pro ostřelování mikročásticemi bylo užito zařízené vyrobené pro tento účel v laboratoři podle Finer et al. (Plant Cell Rep. 11, 323-328, 1992). 300 μς volframové částice potažené buď pMOG617 (35S-gus a 35 S hyg) nebo pMOG873 (35S-cah) byly vloženy na nosič částic. Částice byly akcelerovány pulzem helia 250 kPa (2,5 bar) a musely projít 500 μιη kovovou mřížkou, umístěnou 2 cm pod nosičem částic. Buněčná suspenze byla umístěna 15 cm pod nosičem částic. Systém PIG byl evakuována před ostřelováním na 3 kPa (30 mbar) . Po ostřelování byly buňky kultivovány po 3 dny ve tmě při 28 °C. Pak byly filtry s buňkami přeneseny na pevné médium LS-4 obsahující různé koncentrace kyanamidu nebo 50 mg/1 hygromycinu B (viz tab. 6). Subkultivace se opakovala každých 9 dnů. Rezistentní mikrokalusy, které byly viditelné po 4 až 6 týdnech byly přeneseny na čerstvé médium obsahující příslušné selekční činidlo. Ze dvou pokusů bylo nalezeno po transformaci pMOG617 7+41 kalusů rezistentních k hygromycinu, zatímco po transformaci s pMOG873 7 kalusů přežilo na 20 mg/1 kyanamidu v prvním pokusu (výsledky z druhého pokusu nejsou dosud k dispozici) a 0 + 4 kalusy zůstaly životaschopné na 40 mg/1 kyanamidu. Žádné kalusy se nevytvořily v koncentraci 50 mg/1 kyanamidu nebo vyšší. Transgenní povaha byla potvrzena testováním částí vyvíjejících se kalusů na přítomnost DNA u kalusů po transformaci s pMOG873. Jeden ze 4 přežívajících kalusů na 40 mg/1 kyanamidu vykázal pozitivitu v testu PCR na přítomnost genu cah.

Tabulka 6

Média potřebná pro transformaci Oryza sativa cv. IR 52

	kapalné LS-4	pevné LS-4
Makroelementy	LS	LS
Mikroelementy	LS	LS
Vitaminy	LS	LS

Tabulka 6 - pokračování

Sacharóza (g/1)	30	30
Agaróza Typ I (g/1)	-	7
pH	5,8	5,8
2,4-D (mg/1)	4	4

Tabulka 7 pMOG617

Selekční	Počet misek	rezistentní klony	pozitivní na gus
činidlo	(mg/1)
Kyanamid	20	4
Kyanamid	30	2
Kyanamid	40	4
Kyanamid	50	2
Kyanamid	60	2
Kyanamid	70	2
Kyanamid	80	2
Hygromycin 50	8

pMOG873

Selekční činidlo (mg/1)	Počet misek	rezistentní klony	pozitivní na gus
Kyanamid 0	4
Kyanamid 20	6
Kyanamid 30	8
Kyanamid 40	8
Kyanamid 50	7
Kyanamid 60	4
Kyanamid 70	4
Kyanamid 80	2
Hygromycin 50	4

Příklad 8

Křivka letality kukuřice

Byly připraveny zásobní roztoky kyanamidu ve vodě o koncentracích 10 a 100 mg/ml a sterilizovány filtrací. Alikvoty byly uchovávány v -20 °C.

Média byla připravena přidáním MS média (4,4 g), sacharózy (20 g), 2,4-D (2,0 mg) a agaru (8 g) do 1 1 vody. Po autoklávování bylo do média přidáno příslušné množství kyanamidu (0, 10, 30, 50, 100 a 150 mg/1) a médium bylo nalito na 9cm Petriho misky. Médium BMS bylo připraveno stejně jak bylo výše popsáno s vynecháním agaru.

Buňky BMS byly přidány do média obsahujícího kyanamid třemi způsoby:

a) Suspenze buněk BMS byla přenesena do zkumavky Falcon a byla odstraněna kapalina. Pak byly BMS buňky naneseny na povrch agaru a rozprostřeny do shluků o průměru asi 5 mm, 5 takových shluků na každou misku, 3 misky pro každou koncentraci, přitom byl na dně misky označen obrys každého shluku.

b) Přibližně 0,5 ml stočeného objemu buněk přibližně

1,5 ml BMS v kapalině byly naneseny na povrch agaru a jemně rozprostřeny. Pro každé ošetření byly připraveny tři misky.

c) Přibližně 0,5 ml stočeného objemu buněk a přibližně

1,5 ml BMS v kapalině bylo naneseno na filtrační papír položený na povrchu agaru. Buňky byly rozprostřeny rovnoměrně na povrchu filtru. Pro každé ošetření byla připravena jedna miska.

Misky byly zalepeny páskou Micropore a inkubovány ve 25 °C ve tmě. Růst buněk byl pozorován po 7 a 14 dnech.

• · ·

Výsledky

8. den

Růst buněk na kyanamidu byl vyhodnocen po 8 dnech. Shluky buněk rozprostřené na povrchu kontrolního média zvětšily svůj povrch a přerostly svůj původní obrys. Buňky na 10 mg/1 kyanamidu nepřerostly původní obrys, ale zvýšila se výška shluků a vytvořil se nerovnoměrný povrch. Mírná redukce růstu s rostoucí koncentrací kyanamidu byla patrná, přičemž největší účinek na růst byl pozorován při 50 mg/1 kyanamidu.

Buňky, které byly rozprostřeny na povrchu kontrolního média, rostly dobře a hustě pokryly povrch média. Významné snížení růstu bylo pozorováno při nejnižší hladině kyanamidu (10 mg/1), avšak byla jasně viditelná zvýšená hustota buněk. Mírné zvýšení hustoty buněk bylo viditelné i při 30 mg/1 kyanamidu, ale bylo těžké rozlišit různé rychlosti růstu na vyšších .koncentracích kyanamidu.

Buňky na všech koncentracích kyanamidu si uchovaly mléčně bílou barvu, nebylo patrno žádné hnědnutí buněk,

15. den (viz tab. 9)

Redukce růstu buněk BMS na koncentraci 10 mg/1 kyanamidu byla stále ještě velmi jasně patrná, avšak buňky uspořádané do shluků přerostly svůj původní obrys. Buňky rozprostřené přímo na povrchu agaru vykazovaly velmi podobnou odpověď jako buňky ve shlucích se značnou redukcí růstu pozorovanou při koncentraci 30 mg/1 a vyšší. Buňky na koncentraci 50 mg/1 a vyšší nejevily žádné známky růstu a povrch shluků zůstal velmi plochý, ale buňky stéle byly mléčně bílé. Podobné odpověď byla pozorována i u buněk nanesených na filtrační papír. Avšak byly pozorovány malé zvýšené shluky na povrchu všech filtrů, ale dál se nevyvíjely do kolonií a byly zjevně součástmi větších agregátů buněk ze smíšených populací velikostí typických v suspenzích BMS.

Ze všech koncentrací kyanamidu byly odebírány vzorky ze shluků buněk pro pozorování ve světelném mikroskopu. S rostoucí hladinou kyanamidu byl· vidět rostoucí počet odumřelých buněk, přičemž obsah buněk se smrštil a oddělil od buněčné stěny, a bylo pozorováno zvýšení počtu tmavých tělísek škrobových zrn. Pro pozorováni byly buňky resuspendovány ve vodě s barvivém EDA a byly pozorovány pod UV světlem.

Tabulka 9

Hladina kyanamidu	Pozorování
0	normální zdravé buňky s příležitostně odumřelou buňkou
10	známky stresu, zvláštní shluky mrtvých buněk mezi živými buňkami, přibližně 5 % buněk odumřelo
30	výrazná odlišnost od kontrolních buněk, akumulace škrobových zrn, odumřelé buňky se smrštěným obsahem odděleným od buněčné stěny, přibližně 15 až 20 % odumřelých buněk
50	zcela odlišné od koncentrace 30 mg/1, zvyšující se počet odumřelých buněk a akumulace škrobových zrn, přibližně 50 % odumřelých buněk
100	většina buněk odumřelých, malé sférické objekty, zřejmě tukové kapénky, se akumulovaly v buňkách, zmenšuje se velikost buněk, přibližně 90 % buněk odumřelo
150	většina buněk odumřelých, buňky se jeví tmavší v důsledku akumulace škrobových zrn a fenolů, ojedinělé živé buňky viditelné ve shlucích odumřelých buněk, přibližně 95 % až 98 % buněk odumřelo

Experiment byl opakován s koncentracemi kyanamidu 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 9é a 100 mg/1. Výsledky byly podobné jako výsledky výše popsané, tzn. u buněk ve shlucích bylo viditelné mírné snížení růstu při koncentraci kyanamidu 10 mg/1. Od 20 mg/1 shluky buněk již nepřerůstaly svůj původní obrys, ale při nižších koncentracích (< 50 mg/1) shluky buněk jevily zvýšení výšky (zmenšující se s rostoucí koncentrací). Nad 50 mg/1 jevily shluky slabě oranžové zabarvení.

Výsledky s buňkami rozprostřenými na agaru nebo na filtrech byly podobné v tom, že při koncentraci 10 mg/1 byl zjevný slabý růst (přibližně zdvojnásobení původního počtu buněk), zatímco při koncentraci 20 mg/1 a vyšší jevily omezené projevy růstu.

Příklad 8

Křivky letality pro banánovník (Musa sp.)

Pro otestování potenciálu kynamidu jako selekčního činidla pro transformaci banánovníku byly sestrojeny dvě křivky letality s 6 dnů starou kulturou (Ed6b) regenerovatelné embryogenní suspenze Grand nain, rutinně subkultivovanou do kapalného média M2 s 2,4-D obsahujícího 4,32 g/1 MS solí, 45 g/1 sacharózy, standardní Ix koncentrované MS vitaminy, 100 mg/1 glutaminu, 100 mg/1 myoinositolu, 100 mg/1 biotinu, 100 mg/1 sladového extraktu, s pH 5,3 a s přídavkem 1,2 mg/1 2,4-D a 0,8 mg/1 picloramu po autoklávování.

Kultury byly přečištěny pomocí sítka (> 250 pm, < 710 pm) a alikvoty po 50 pl ve 300 pl kapaliny byly pipetou přeneseny do dvou médií pro letální křivky, která jsou popsána dále (3 opakování na každou misku). Růst a přežívání kultur se monitorovaly po následující 3 týdny a přežívání buněk bylo vyhodnoceno 21. den pomocí FDA barvení.

Médium pro křivku letality A: M2/MS/l,0 2,4-D (stejné jako M2/MS/2,4-D až na to, že bylo užito 1,0 mg/1 2,4-D, žádný picloram a 2,25 g/1 gelritu): toto médium podporuje rychlé dělení a růst embryogenních kalusů, ale ne embryí.

Médium pro křivku letality B: M2/SH/0,5 Pie,0,5 2,4-D (stejné jako M2/SH/2,4-D, až na to, že bylo užito jen 0,5 mg/1 2,4-D a 0,5 mg/1 picloramu, SH soli (4,32 g/1) místo MS s 2,25 g/1 gelritu): toto médium podporuje časný vývoj embryí, která mohou dozrát a pak klíčit po přenesení na jiné médium.

Kyanamid byl přidán do obou médií, po autoklávování, na výsledné koncentrace 0, 20, 30, 50, 75, 100 a 150 mg/1.

Výsledky jsou uvedeny v tab. 10, kde údaje charakterizující buněčný růst jsou přibližné vizuální odhady, nikoliv přesná měření objemů buněk. Nebylo viditelné žádné hnědnutí kultur a uvolňování fenolických látek až do koncentrace 75 mg/1. Obecně kultury právě přestaly růst, přičemž buněčné dělení bylo extenzivně inhibováno. Kyanamid inhibuje růst embryogenního kalusu o 40 až 50 % dokonce i při tak nízké koncentraci jako 20 mg/1, aniž by způsoboval viditelné poškození. Embryogeneze byla úplně ínhibována i při nejnižších testovaných koncentracích.

Tabulka 10

Výsledky vlivu koncentrace kyanamidu na buněčné kultury banánovníku

Médium	Koncentrace kyanamidu	% živých buněk dle hodnocení pomocí FDA	vytvořená embrya (průměr)	% růstu kalusů
M2/MS/2,4-D	0	95 %	N/A	+100 %
M2/MS/2,4-D	20	60 %	N/A	+30 %
M2/MS/2,4-D	30	50 %	N/A	+20 %
M2/MS/2,4-D	50	20 %	N/A	0

Tabulka 10 - pokračování

Výsledky vlivu koncentrace kyanamidu na buněčné kultury banánovníku

Médium	Koncentrace kyanamidu	% živých buněk dle hodnocení	vytvořená embrya (průměr)	% růstu kalusů
pomocí	?DA
M2/MS/2,4-D	75	10	o. 0	N/A	0
M2/MS/2,4-D	100	10	o o	N/A	0
M2/MS/2,4-D	150	0	Q, O	N/A	0
M2/SH/0,5Pic +0,5 2,4-D	0	95	%	51	N/A
M2/SH/0,5PÍC + 0,5 2,4-D	20	50	o o	0	N/A
M2/SH/0,5Pic + 0,5 2,4 —D	30	40	Q, O	0	N/A
M2/SH/0,5Pic + 0,5 2, 4-D	50	30	O O	0	N/A
M2/SH/0,5Pic +0,5 2,4-D	75	20	o. 0	0	N/A
M2/SH/0,5Pic + 0,5 2,4-D	100	10	o. o	0	N/A
M2/SH/0,5Pic + 0,5 2,4-D	150	0	o. o	0	N/A

Seznam sekvenci (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 900 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Myrothecium verrucaria (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 47..782 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

GTACGATCCT ACTTCCŤCGC TTATCTGCTC TAAACGATTC AACAAG ATG TCT TCT 55

Met Ser Ser

TCA

GAA

GTC

AAA

GCC

AAC

GGA TGG

ACT

GCC

GTT

CCA

GTC

1 AGC

GCA

AAG

103

Ser

Glu

Val

Lys

Ala

Asn

Gly Trp

Thr

Ala

Val

Pro

Val

Ser

Ala

Lys

5

10

15

GCC

ATT

GTT

GAC

TCC

CTG

GGA.AAG

CTT

GGT

GAT

GTC

TCC

TCA

TAT

TCT

151

Ala 20

Ile Val

Asp

Ser

Leu 25

Gly Lys

Leu Gly Asp 30

Val

Ser Ser

Tyr

Ser 35

GTG

GAA

GAT

ATC

GCG

TTC

CCT

GCG

GCA

GAC

AAA

CTT

GTT

GCC

GAG

GCA

199

Val

Glu

Asp

Ile

Ala

Phe

Pro

Ala

Ala

Asp

Lys

Leu

Val

Ala

Glu

Ala

40

45

50

CAG

GCC

TTT

GTG

AAG

GCC

CGA

TTG

AGT

CCC

GAA.

ACC

TAC

AAT

CAC

TCC

247

Gin

Ala

Phe

Val

Lys

Ala

Arg

Leu

Ser

Pro

Glu

Thr

Tyr

Asn

His

Ser

55

60

65

ATG

CGC

GTT

TTC

TAC

TGG

GGA

ACC

GTC

ATC

GCG

AGA

CGT

TTA

CTT

CCC

295

Met

Arg

Val

Phe

Tyr

Trp

Gly

Thr

Val

Ile

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Pro

75 80 • · · ♦··· · · » · • · · · ·· » · ♦ · ·

Β Β · · ·Β»« «· ·· β··· ·· · ·

GAG CAA GCT 343

AAA Lys

GAC TTG TCT CCA

AGT ACA TGG GCA CTG ACA TGT CTT

Glu

Gin Ala 85

Asp

Leu Ser 90

Pro

Ser

Thr

Trp

Ala 95

Leu

Thr

Cys

Leu

CTG

CAT

GAC

GTT

GGT

ACT

GCG

GAG

GCA

TAC

TTT

ACA

TCT

ACA

CGA

ATG

391

Leu

His

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr

Phe

Thr

Ser

Thr

Arg

Met

100

105

110

1Ϊ5

TCC

TTC

GAT

ATT

TAC

GGT

GGC

ATT

AAG

GCT

ATG

GAG

GTG

CTC

AAG

GTC

439

Ser

Phe

Asp

Ile

Tyr

Gly

Gly

Ile

Lys

Ala

Met

Glu

Val

Leu

Lys

Val

120

125

130

CŤT

GGG

AGT

AGC

ACC

GAC

CAG

GCT

GAG

GCT

GTT

GCC

GAG

GCC

ATC

ATT

487

Leu

Gly

Ser

Ser

Thr

Asp

Gin

Ala

Glu

Ala

Val

Ala

Glu

Ala

Ile

Ile

135

140

145

CGT

CAT

GAG

GAT

GTG

GGG

GTA

GAT

GGC

AAC

ATC

ACA

TTC

CTC

GGT

CAG

535

Arg

His

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Asp

Gly

Asn

Ile

Thr

Phe

Leu

Gly

Gin

150 . . ... 155 160 ,

TTG 583 Leu

ATC CAG CTG

GCT Ala

ACG CTT TAT GAC AAT GTC

GGG GCC TAC GAT GGG

Ile Gin 3 65

Leu

Thr

Leu 170

Tyr Asp

Asn Val

Gly 175

Ala

Tyr

Asp

Gly

ATT

GAT

GAT

TTT

GGT

AGC

TGG

GTT

GAT

GAC

ACC

ACA

CGC

AAC

AGT

ATC

631

Ile

Asp

Asp

Phe

Gly

Ser

Trp

Val

Asp

Asp

Thr

Thr

Arg

Asn

Ser

Ile

180 185 190 195

AAC

ACG

GCA

TTC

CCA

CGA

CAT

GGT

TGG

TGT

TCT

TGG

TTT

GCC

TGC

ACG

679

Asn

Thr

Ala

Phe

Pro

Arg

His

Gly

Trp

Cys

Ser

Trp

Phe

Ala

Cys

Thr

200

205

210

GTT CGT AAG GAA GAA 727	AGT Ser	AAC AAG CCT TGG	TGC CAC ACA ACG CAT ATC
Val Arg Lys	Glu Glu 215	Asn	Lys	Pro Trp 220	Cys	His	Thr Thr 225	His	Ile
CCT CAG TTC	GAT AAA	CAG	ATG	GAA	GCG AAC	ACT	TTG	ATG AAG	CCT	TGG
775
Pro Gin Phe	Asp Lys	Gin	Met	Glu	Ala Asn	Thr	Leu	Met Lys	Pro	Trp
230				235				240
GAG TAA C TCTGAGTAAG CAGAGAATAT	TTAGCCGGGT .	AGCTATAGAT GAATCTGGAC

832

Glu *

245

AAATTCAGGC ACATTTGGTT TCACGATACA GGTATTGGAA ATAGCTTGCA GGAAGGTATC 892

ATGTCAAC

900 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 245 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

Met Ser 1

Ser Ser Glu Val 5

Lys

Ala Asn Gly Trp Thr 10

Ala

Val

.Pro 15

Val

Ser

Ala

Lys

Ala

Ile

Val

Asp

Ser

Leu

Gly

Lys

Leu

Gly

Asp

Val

Ser

20

25

30

Ser

Tyr

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Ala

Phe

Pro

Ala

Ala

Asp

Lys

Leu

Val

35

40

45

Ala

Glu

Ala

Gin

Ala

Vi. o

Val

Lys

Ala

Arg

Leu

.Šeř'

Pro

Glu

Thr

Tyr

'50

55

60

; '

Asn

His

Ser

Met

Arg

Val

Phe

Tyr

Trp

Gly

Thr

Val

Ile

Ala

Arg

Arg

65

70

75

80

Leu

Leu

Pro

Glu

Gin

Ala

Lys

Asp

Leu

Ser

Pro

Ser

Thr

Trp

Ala

Leu

85

90

95

Thr

Cys

Leu

Leu

His

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr

Phe

Thr

Ser

100

105

110

Thr

Arg

Met

Ser

Phe

Asp

Ile

Tyr

Gly

Gly

Ile

Lys

Ala

Met

Glu

Val

115

120

125

Leu

Lys

Val

Leu

Gly

Ser

Ser

Thr

Asp

Gin

Ala

Glu

Ala

Val

Ala

Glu

130

135

140

Ala

Ile

Ile

Arg

His

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Asp

Gly

Asn

Ile

Thr

Phe

145

150

155

160

Leu

Gly

Gin

Leu

Ile

Gin

Leu

Ala

Thr

Leu

Tyr

Asp

Asn

Val

Gly

Ala

165

170

175

Tyr

Asp

Gly

Ile

Asp

Asp

Phe

Gly

Ser

Trp

Val

Asp

Asp

Thr

Thr

Arg

180

185

190

Asn

Ser

Ile

Asn

Thr

Ala

Phe

Pro

Arg

His

Gly

Trp

Cys

Ser

Trp

Phe

195

200

205

Ala

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Glu

Glu

Ser

Asn

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Thr

210

215

220

Thr

His

Ile

Pro

Gin

Phe

Asp

Lys

Gin

Met

Glu

Ala

Asn

Thr

Leu

Met

225

230

235

240

Lys

Pro

Trp

Glu

*

245 ·

• » · fr · · ·

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

ACCGAGCTCG AATTCGGCAC GAGGTTGACA TGATACCTTC CTG 43 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

GACCTCGAGA ATTCGGCACG AGGTACGATC CTACTTCCTC GC

Claims (13)

1. Použití kyanamidhydratázy jako selekčního markéru.

2. Použití kyanamidhydratázy jako selekčního markéru pro transformaci rostlin.

3. Použití podle nároku 2, kdy rostliny se transformují nukleotidovou sekvencí kódující kyanamidhydratázu.

4. Použití podle nároku 3, kdy se užije nukleotidová sekvence uvedená zde jako sekvence identifikačního čísla 1.

5. Způsob selekce transformovaných rostlin vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a. zkonstruuje se vektor, který obsahuje kódující sekvenci pro kyanamidhydratázu a požadovaný gen,

b. tento vektor se transformuje do rostlin nebo částí rostlin nebo rostlinných buněk a

c. transformanty se pěstují v médiu, které obsahuje kyanamid.

6. Způsob podle nároku 5vyznačující se tím, že se užije nukleotidová sekvence uvedená zde jako sekvence identifikačního čísla 1.

7. Použití kyanamidu pro selekci rostlin transformovaných vektorem, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující kyanamidhydratázu.

8. Expresní kazeta, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující kyanamidhydratázu a požadovaný gen.

9. Vektor, který obsahuje expresní kazetu podle nároku 8.

• ·

10. Hostitelská buňka, která obsahuje vektor podle nároku 9.

11. Hostitelská buňka podle nároku 10, která je Agrobacteríum.

12. Rostlina, která je transformovaná vektorem podle nároku 9.

13.Rostlina, která je transformovaná pomocí stěny hostitelské buňky podle nároku 11.