NL1010517C2

NL1010517C2 - Werkwijze voor het selecteren op de aanwezigheid van een DNA-volgorde in een genetisch gemanipuleerd organisme, een genconstruct, een verbinding en de toepassing daarvan.

Info

Publication number: NL1010517C2
Application number: NL1010517A
Authority: NL
Inventors: Antoine Raymond Stuitje; David William Rice; John Bernard Rafferty; Hendrik Johannes Jacob Nijkamp
Original assignee: Stichting Phytogen
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1998-11-10
Publication date: 2000-05-11

Description

Werkwijze voor het selecteren op de aanwezigheid van een DNA-volgorde in een genetisch gemanipuleerd organisme, een genconstruct, een verbinding en de toepassing daarvan

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het selecteren op de de aanwezigheid van een DNA-volgorde in een genetisch gemanipuleerd organisme, waarbij de DNA-volgorde deel uitmaakt van een ingebrachte vector 5 die tevens een eerste gen omvat, waarbij het eerste gen in het organisme tot expressie wordt gebracht, en waarbij het organisme in contact wordt gebracht met een remmer welke de vitaliteit van het organisme vermindert.

Een dergelijke werkwijze is in de biotechnologie 10 algemeen bekend. Zo wordt bijvoorbeeld als het eerste gen een antibiotica-resistentie-gen toegepast, en als remmer een antibioticum waarvoor het organisme in afwezigheid van het antibiotica-resistentie-gen gevoelig is. Hiermee kan op de aanwezigheid van de DNA-volgorde waarvan men eigenlijk de 15 aanwezigheid wenst vast te stellen worden geselecteerd.

Om de angst voor verspreiding van antibiotica-resis-tentie-genen weg te nemen, is er een grote behoefte aan alternatieve positieve merkers waarmee op de aanwezigheid van een DNA-volgorde in een organisme kan worden geselecteerd.

20 Volgens de onderhavige uitvinding kan dit worden bereikt doordat het organisme een tweede, endogeen gen bezit dat codeert voor een enoyl-ACP reductase, welke reductase een vitale rol speelt in het organisme en remming door de remmer de vitaliteit van het organisme aantast, en 25 a) als de remmer een remmer van de activiteit van enoyl-ACP reductase wordt toegepast; b) als het eerste eiwit, waarvoor het eerste gen codeert, een eiwit wordt toegepast dat een met enoyl-ACP reductase overeenkomende functionele activiteit bezit; en 30 c) op de vitaliteit van het organisme wordt geselec teerd.

Verrassenderwijs is gevonden dat enoyl-ACP reductase, onder de vele enzymen die in een organisme aanwezig zijn, uitstekend geschikt is om te worden geremd voor het verminde- 1010517 2 ren van de vitaliteit terwijl het eerste gen dat tot expressie wordt gebracht als positieve merker kan fungeren. In de onderhavige aanvrage wordt onder de uitdrukking "vitaliteit vermindert" verstaan het in hoofdzaak stilzetten van celde-5 ling of zelfs doden van het organisme. Onder een vector wordt elk op in het vak bekende wijze door genetische manipulatie en/of synthese vervaardigd nucleinezuurconstruct verstaan dat door transformatie, zoals transductie of transfectie, in een organisme kan worden gebracht en tot expressie kan worden 10 gebracht. Hierbij wordt tevens een construct omvat dat na tussenkomst van een reverse-transcriptase in situ in het organisme wordt gevormd. De DNA-volgorde zal voor veel toepassingen zelf een gen bevatten waarvan wordt gewenst dat dit in het organisme tot expressie kan worden gebracht.

15 Volgens een eerste uitvoeringsvorm codeert het eerste gen voor enoyl-ACP reductase en het eerste gen wordt zodanig tot expressie gebracht dat het door het eerste gen geproduceerde enoyl-ACP reductase geschikt in een ten minste 2 keer, bij voorkeur ten minste 10 keer, en met meer voorkeur 20 ten minste 25 keer hogere concentratie aanwezig is in vergelijking met het endogene enoyl-ACP reductase.

Op deze wijze kan het gebruik van niet-eigen genen worden vermeden.

Volgens een alternatieve uitvoeringsvorm wordt als 25 het eerste gen een gemuteerd gen voor enoyl-ACP reductase toegepast, en het eerste eiwit een verlaagde gevoeligheid bezit voor de remmer.

Voor een dergelijk gemuteerd gen is geen verhoogde expressie (dat wil zeggen van dit ingebrachte gen) noodzake-30 lijk en zijn eventuele nadelige gevolgen van een verhoogde enoyl-ACP reductase-activiteit bij de gastheer minimaal. Datzelfde is ook het geval bij eventuele ongewenste verspreiding.

Volgens een voorkeursuitvoering wordt als een remmer 35 een verbinding toegepast welke de binding van Triclosan aan enoyl-ACP reductase remt.

Dergelijke verbindingen, waaronder in de onderhavige aanvrage ook Triclosan zelf wordt gerekend, zijn zeer geschikt als de remmer. Binding kan op in het vak welbekende 1010517 3 wijze worden vastgesteld, bijvoorbeeld onder gebruikmaking van radioactieve analoga, zoals die met 14C. De binding wordt, bij equimolaire concentraties verbinding en remmer, geschikt met ten minste 10%, bij voorkeur met ten minste 50%, met meer 5 voorkeur ten minste 80% en met de meeste voorkeur ten minste 95% geremd.

Bij voorkeur wordt als het organisme een organisme toegepast gekozen uit een bacterie, gist, schimmel of plant.

Voor deze categorie organismen, met name gist, 10 schimmel en plant geldt dat de behoefte aan een niet op antibioticum gebaseerde positieve merker zeer groot is. Aanvraagster heeft gevonden dat een grote verscheidenheid aan planten zeer gevoelig is voor Triclosan, zoals de zandraket (Arabidopsis thaliana), koolzaad (Brassica napis), tabak 15 (Nicotina tabacum), tomaat en petunia. Van de eerste drie is door aanvraagster experimenteel aangetoond dat het enoyl-ACP reductase door Triclosan wordt geremd.

De uitvinding heeft verder betrekking op het toepassen van een gen dat codeert voor een eiwit met een functione-20 le activiteit die overeenkomt met die van enoyl-ACP reductase, voor het selecteren op de aanwezigheid van een niet voor enoyl-ACP reductase coderende DNA-volgorde in een met een vector getransformeerd organisme, waarbij de te detecteren DNA-volgorde en het gen deel uitmaken van de vector 25 waarmee het organisme wordt getransformeerd. De DNA-volgorde is een niet met het gen homologe volgorde en codeert niet voor een eiwit met een functionele activiteit die overeenkomt met die van enoyl-ACP reductase.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een gencon-30 struct dat een gen omvat dat codeert voor i) enoyl-ACP reductase of ii) een gemuteerd enoyl-ACP reductase met verlaagde gevoeligheid voor remming door a) Triclosan of b) een verbinding welke met Triclosan kan concurreren om de binding aan 35 enoyl-ACP reductase.

Een dergelijk genconstruct kan worden toegepast bij de werkwijze volgens de uitvinding. Het gen bevindt zich daarbij onder controle van een in de gewenste gastheer werkzame promotor.

1010517 4

Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een verbinding welke in staat is tot competitie met Triclosan om binding aan enoyl-ACP reductase, welke verbinding geen Triclosan is.

5 Dergelijke verbindingen zijn geschikt als alterna tieven voor Triclosan. Zo kan bijvoorbeeld Triclosan van een sulfonaatgroep of tweede hydroxylgroep worden voorzien waardoor de wateroplosbaarheid wordt verhoogd. De uitvinding heeft derhalve ook betrekking op de toepassing van de verbin-10 ding als remmer bij de werkwijze volgens de uitvinding.

1010517

Claims

1. Werkwijze voor het selecteren op de aanwezigheid van een DNA-volgorde in een genetisch gemanipuleerd organisme, waarbij de DNA-volgorde deel uitmaakt van een ingebrachte vector die tevens een eerste gen omvat, waarbij het eerste 5 gen in het organisme tot expressie wordt gebracht, en waarbij het organisme in contact wordt gebracht met een remmer welke de vitaliteit van het organisme vermindert, met het kenmerk, dat het organisme een tweede, endogeen gen bezit dat codeert voor een enoyl-ACP reductase, welke reductase een vitale rol 10 speelt in het organisme en remming door de remmer de vitaliteit van het organisme aantast, en a) als de remmer een remmer van de activiteit van enoyl-ACP reductase wordt toegepast; b) als het eerste gen een gen wordt toegepast dat 15 codeert voor een eiwit dat een functionele activiteit bezit die overeenkomt met die van enoyl-ACP reductase; en c) op de vitaliteit van het organisme wordt geselecteerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 20 dat het eerste gen voor enoyl-ACP reductase codeert en het eerste gen zodanig tot expressie wordt gebracht dat het door het eerste gen geproduceerde enoyl-ACP reductase geschikt in een ten minste 2 keer, bij voorkeur ten minste 10 keer, en met meer voorkeur ten minste 25 keer hogere concentratie 25 aanwezig is in vergelijking met het endogene enoyl-ACP reductase .

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als het eerste gen een gemuteerd gen voor enoyl-ACP reductase wordt toegepast, en het eerste eiwit een verlaagde 30 gevoeligheid bezit voor de remmer.

4. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat als een remmer een verbinding wordt toegepast welke de binding van Triclosan aan enoyl-ACP reductase remt.

5. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat als het organisme een organisme wordt 1 01 05 1 ? 1 « toegepast gekozen uit een bacterie, gist, schimmel of plant.

6. Toepassing van een gen dat codeert voor een eiwit met een functionele activiteit die overeenkomt met die van enoyl-ACP reductase, voor het selecteren op de aanwezigheid 5 van een niet voor enoyl-ACP reductase coderende DNA-volgorde in een met een vector getransformeerd organisme, waarbij de te detecteren DNA-volgorde en het gen deel uitmaken van de vector waarmee het organisme wordt getransformeerd.

7. Genconstruct dat een gen omvat dat codeert voor 10 i) enoyl-ACP reductase of ii) een gemuteerd enoyl-ACP reductase met verlaagde gevoeligheid voor remming door a) Triclosan of b) een verbinding welke met Triclosan kan concurreren om de binding aan enoyl-ACP reductase.

8. Verbinding welke in staat is tot competitie met Triclosan om binding aan enoyl-ACP reductase, welke verbinding geen Triclosan is.

9. Toepassing van de verbinding volgens conclusie 8 als remmer bij de werkwijze volgens een van de conclusies 1 20 tot 5. 101 0517