DE69923628T2 - 3,4-Dihydroxy-2-butanone 4-Phosphate Synthase - Google Patents

3,4-Dihydroxy-2-butanone 4-Phosphate Synthase Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie der Pilze. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäure-Fragment, das ein Protein codiert, das in dem Riboflavin-Biosynthese-Stoffwechselweg des Pilzes beteiligt ist.
  • Riboflavin, das auch als Vitamin B2 bezeichnet wird, ist der Präkursor des Flavinmononucleotids (FMN) und Flavinadenindinucleotids (FAD), die wesentliche Cofaktoren für eine Reihe von wichtigen Stoffwechselenzymen sind, welche die Hydrid-, Sauerstoff- und Reaktionen mit Elektronenübertragung vermitteln. Riboflavin-abhängige Enzyme schließen Succinatdehydrogenase ein, NADH-Dehydrogenase, Fenedoxin-NADP+-Oxidoreduktase, Acyl-CoA-Dehydrogenase und den Pyruvatdehydrogenase-Komplex. Dementsprechend sind die Fettsäureoxidation, der TCA-Zyklus, der mitochondrische Elektronentransport, die Photosynthese und zahlreiche andere Zellularprozesse entscheidend abhängig entweder von FMN oder FAD als den prosthetischen Gruppen. Andere bedeutende Flavoproteine schließen Glutathionreduktase ein, Glykolatoxidase, P450-Oxidoreduktase, Squalen-Epoxidase, Dihydroorotat-Dehydrogenase und α-Glycerophosphat-Dehydrogenase. Die genetische Disruption der Riboflavin-Biosynthese in Escherichia coli (Richter et al., J. Bacteriol. 174:4050-4056 (1992)) und Saccharomyces cerevisiae (Santos et al., J. Biol. Chem. 270:437-444 (1995)) führt zu einem letalen Phänotyp, der lediglich durch Riboflavin-Ergänzung überwunden wird. Dieses ist nicht überraschend, wenn man die Reihe der schädlichen pleiotropen Effekte betrachtet, die mit einem Riboflavin-Entzug auftreten würden.
  • Riboflavin wird synthetisiert durch Pflanzen und zahlreiche Mikroorganismen und einschließlich Bakterien und Pilze (Bacher, A., Chemistry and Biochemistry of Flavoproteins (Müller, F., Herausg.) Bd. 1, S. 215-259, Chemical Rubber Co., Boca Raton, FL (1990)). Da Vögel, Säugetiere und andere höhere Organismen nicht in der Lage sind, das Vitamin synthetisch herzustellen und statt dessen von seiner Nahrungsaufnahme abhängig sind, um ihren Stoffwechselanforderungen zu genügen, sind die Enzyme, die für die Riboflavin-Biosynthese verantwortlich sind, beliebte Ziele für zukünftige Antibiotika, Fungizide und Herbizide, da sie keine nachteiligen Auswirkungen auf solche Non-Target-Organismen ausüben. Darüber hinaus ist es möglich, dass die entfernt verwandten pflanzlichen und mikrobiellen Enzyme über ausgeprägte Merkmale verfügen, die sich bei der Entwicklung potentieller organismus-spezifischer Inhibitoren ausbeuten lassen könnten. Somit würde ein detailliertes Verständnis der Struktur, des Mechanismus, der Kinetik und der Substrat-Bindungseigenschaften des/der Riboflavin-Biosyntheseenzyms/Biosyntheseenzyme von Pflanzen beispielsweise als Ausgangspunkt für den gezielten Aufbau chemischer Verbindungen dienen, die als Herbizide nützlich sein könnten. Hat man erst einmal ein authentisches pilzliches oder pflanzliches Protein oder mehrere davon an der Hand, so wird diese ein wertvolles Mittel für das in vitro-Screening chemischer Datenbanken bei der Suche nach Inhibitoren für die Riboflavin-Biosynthese bieten.
  • Die pilzliche und bakterielle Riboflavin-Biosynthese ist seit mehr als 4 Jahrzehnten umfangreich untersucht worden (neuere Übersichtsarbeiten siehe bei Bacher, A., Chemistry and Biochemistry of Flavoproteins (Müller, F., Herausg.) Bd. I, S. 215-259 und 293-316, Chemical Rubber Co., Boca Raton, FL (1990)). Der synthetische Weg besteht aus 7 verschiedenen, durch Enzym katalysierten Reaktionen mit Guanosin-5'-triphosphat (GTP) als den hervorragenden Präkursor.
  • Figure 00020001
  • Während die zweiten und dritten Schritte der Riboflavin-Biosynthese in entgegengesetzter Reihenfolge in Bakterien und Pilzen ablaufen sind in beiden Mikroorganismen die übrigen Intermediate des Weges identisch. Lumazin-Synthase (LS), das vorletzte Enzym der Riboflavin-Biosynthese, katalysiert die Kondensation 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat (DHBP) mit 4-Ribitylamino-5-amino-2,6-dihydroxypyrimidin (RAADP) um 1 Mol des jeweiligen Orthophosphates und 6,7-Dimethyl-8-(1'-D-ribityl)-lumazins (DMRL), dem intermediären Präkursor von Riboflavin, zu ergeben. Der abschließende Schritt der Riboflavin-Biosynthese wird durch Riboflavin-Synthase (RS) vermittelt. Dieses Enzym katalysiert die Dismutation von zwei Molekülen von DMRL, um 1 Mol Riboflavin und RAADP zu ergeben.
  • Ribulose-5-phosphat dient als Substrat für die Erzeugung von DHBP, das mit Hilfe des Enzyms 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (DS) katalysiert wird. Die komplexe Enzymreaktion, bei der DS beteiligt ist, bringt die Eliminierung von C-4 aus den Ribulose-5-phosphat als Formiat über eine zwischenmolekulare Umlagerung sowie die Umlagerung der Hydroxymethyl-Gruppe in Stellung 1 zu einer Methyl-Gruppe mit sich. Der katalytische Prozess umfasst wahrscheinlich eine Reihe von Reaktionen der Tautomerisierung. Es ist bemerkenswert, dass eine solche komplexe Reaktion mit Hilfe eines einzigen und relativ kleinen Proteins ablaufen kann!
  • DS-codierende Gene sind von zahlreichen Organismen geklont worden, einschließlich Escherichia coli (Genbank, Zugriffnummer X66720; Richter et al., J. Bacteriol. 174:4050-4056 (1992)), Vibrio harveyi (Genbank, Zugriffnummer M27139; Swartzman et al., J. Biol. Chem. 265:3513-3517 (1989)), Photobacterium phosphoreum (Genbank, Zugriffnummer L11391; Lee et al., J. Bacteriol. 176:2100-2104 (1994)), Bacillus subtilis (Genbank, Zugriffnummer X51510; Kil et al., Mol. Gen. Genet. 233:483-486 (1992)), Bacillus amyloliquefaciens (Genbank, Zugriffnummer X95955; Gusarov et al., Mol. Biol. 31:446-453 (1997)), Actinobacillus pleurpneumoniae (Genbank, Zugriffnummer U27202; Fuller et al., J. Bacteriol. 177:7265-7270 (1995)), Saccharomyces cerevisiae (Genbank, Zugriffnummer Z21619; Revuelta, J. L., direkte Einreichung; WO 9411515) und Ashbya gossypii (DGen-Zugriffnummer 95N-T03516; DE 4420785 ). Obgleich die zahlreichen DS-Homologa alle bestimmte strukturelle Merkmale gemeinsam haben, ist ihre Gesamthomologie bei der primären Aminosäuremenge verhältnismäßig schwach. Wie beispielsweise mit dem "Genetics Computer Group Gap"-Programm (Wisconsin Package Version 9,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc., unter Verwendung ihrer Standardfehlerwerte für die "gap creation penalty" von 12 und der "gap extension penalty" von 4) ermittelt wurde, ist das Escherichia coli lediglich zu 61%, 25%, 16%, 27%, 33%, 45% und 43% identisch mit den homologen Proteinen von Vibrio harveyi, Photobacterium phosphoreum, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Actinobacillus pleuropneumoniae, Saccharomyces cerevisiae bzw. Ashbya gossypii. Darüber hinaus ergeben paarweise Vergleiche dieser 8 Proteine, dass die zwei Homologstoffe, die am ähnlichsten sind, lediglich 61% der Identität teilen. Die einzigen bekannten, isolierten pilzlichen DS-Gene sind die von Ashbya gossypii und Saccaromyces cerevisiae.
  • Richter et al. (Methods in Enzymology, Bd. 280, 1997, S. 374-382) befassen sich mit der Biosynthese von Riboflavin und speziell mit dem Assay und der Herstellung des DS-Enzyms. Tabelle 1 dieses Dokumentes führt eine Reihe von Genen unter vermutlichen Genen auf, die auf das DS-Enzym zielen, zusammen mit ihren Zugriffnummern der Genbank und einschließlich der von Saccharomyces cerevisiae.
  • Al-Hassan et al. (Journal of the Chemical Society, Perkin I, 1980, S. 2645-2656) beschreiben spezielle Enzyminhibitoren in der Vitamin-Biosynthese und speziell der Synthese und der inhibitorischen Eigenschaften einiger Substrate und Übergangszustände von Analogstoffen von RS. Dieses Dokument offenbart, dass viele geeignete Targetenzyme in der Biosynthese von Vitaminen gefunden werden können.
  • Andersson et al. (Structure, 1996, Bd. 4, Nr. 10, S. 1161-1170) befassen sich mit der Kristallstruktur des ternären Komplexes von 1,3,8-Trihydroxynaphthalen-Reduktase von Magnaporthe grisea mit NADPH und einem Inhibitor mit aktiver Stelle. Das Enzym 1,3,8-Trihydroxynaphthalen-Reduktase katalysiert eine wesentliche Reaktion in der Biosynthese von Melanin, ein schwarzes Pigment, das für die Pathogenese von Magnaporthe grisea entscheidend ist. Das Enzym ist das biochemische Target mehrerer kommerziell wichtiger Fungizide, die verwendet werden, um Reisbräune in Reispflanzen zu verhüten.
  • Aus der vorstehend ausgeführten Diskussion wird offensichtlich, dass über pilzliche DS-Gene/Proteine und ihre Beziehung zu bekannten Homologen zu wenig bekannt ist, um eine Isolation von DS-codierenden Genen aus irgendwelchen pilzlichen oder pflanzlichen Spezies unter Anwendung der überwiegen klassischen Vorgehensweisen zu ermöglichen. Die letzteren schließen Methoden mit der Hybridisierungssonde von cDNA-Banken mit homologen oder heterologen Genen ein, die PCR-Amplifikation des Gens, das von Interesse ist, unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern, die den konservierten Aminosäuresequenz-Motiven entsprechen und/oder der immunologischen Detektion von exprimierten cDNA-Inserts in mikrobiellen Wirten. Leider ist von diesen Methoden nicht zu erwarten, dass sie für die Isolation pilzlicher oder pflanzlicher DS-Gene sehr nützlich sein würden, da sie alle vorbehaltlos auf dem Vorhandensein einer signifikanten strukturellen Ähnlichkeit (d.h. DNA oder Aminosäuresequenz) mit bekannten Proteinen und Genen beruhen, die die gleiche Funktion haben. Angesichts der Feststellung, dass DS-Proteine so schlecht konserviert sind, ist es selbst unter Mikroorganismen im höchsten Maße unwahrscheinlich, dass die bekannten mikrobiellen Homologen signifikante strukturelle Ähnlichkeiten mit ihren Gegenspielern in höheren Pflanzen teilen würden.
  • Eine alternative Vorgehensweise, die zum Klonen von biosynthetischen Genen in anderen Stoffwechselwegen von höheren Eukaryoten angewendet worden ist, verläuft über die Komplementierung von mikrobiellen Mutanten, denen die Enzymaktivität fehlt, die von Interesse ist. Da diese Strategie lediglich auf der funktionellen Ähnlichkeit zwischen einem zerteilten Wirtsprotein und dem Target-Gen beruht, das von Interesse ist, ist sie ideal geeignet zum Klonen von strukturell unterschiedlichen Proteinen, die die gleiche Reaktion katalysieren. Für die funktionelle Komplementierung wird eine cDNA-Bank in einem Vektor konstruiert, der die Expression der cDNA in dem mikrobiellen Wirt dirigieren kann. Die Plasmidbank wird sodann in die mutante Mikrosonde eingeführt und Kolonien ausgewählt, die nicht mehr länger phänotypisch mutant sind. So wurden praktisch die Arabidopsis GTP-Cyclohydrolase II (Kobayashi et al., Gene 160:303-304 (1995)), LS (Garcia-Ramirez et al., J. Biol. Chem. 270:23801-23807 (1995)) und RS (Santos et al., J. Biol. Chem. 270:437-444 (1995)) von Hefe insgesamt über die funktionelle Komplementierung von mikrobiellen Riboflavin-Auxotrophen geklont. Diese Strategie hat auch beim Isolieren von Genen aus höheren Eukaryoten funktioniert, die in anderen metabolischen Wegen beteiligt waren und einschließlich der Lysin-Biosynthese (Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228:287-293 (1991)), Purin-Biosynthese (Aimi et al., J. Biol. Chem. 265:9011-9014 (1990)) und Tryptophan-Biosynthese (Niyogi et al., Plant Cell 5:1011-1027 (1993)) und ist außerdem erfolgreich in der Isolierung von verschiedenen Pflanzengenen eingesetzt worden, einschließlich Glutaminsynthetase (Snustad et al., Genetics 120:1111-1124 (1988)), Pyrrolin-5-carboxylat-Reduktase (Delauney et al., Mol. Genet. 221:299-305 (1990)), Dihydrodipicolinat-Synthase (Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228:287-293 (1991)), 3-Isopropylmalat-Dehydrogenase (Ellerstrom et al., Plant Mol. Biol. 18:557-566 (1992)) und Dihydroorotat-Dehydrogenase (Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992)).
  • Trotz der offensichtlich attraktiven Merkmale des Klonens durch funktionellen Komplementierung gibt es mehrere Gründe dafür, warum diese Vorgehensweise nicht funktionieren wird, wenn ein pilzliches DS-Gen angewendet wird. Erstens, könnte die pilzliche cDNA-Sequenz nicht in den angemessenen Mengen in der mutanten Mikrosonde aus einer Reihe von Gründen exprimiert werden, einschließlich Verschiedenheiten in der bevorzugten Codon-Nutzung. Zweitens, könnten das geklonte DS-Gen kein funktionelles Polypeptid erzeugen, wenn die Enzymaktivität beispielsweise eine posttranslationelle Modifikation erforderlich machen würde, wie beispielsweise eine Acetylierung, Glykosylierung oder Phosphorylierung, die von dem mikrobiellen Wirt nicht ausgeführt werden können. Drittens, könnte heterologes pilzliches Protein für den Wirt tödlich sein und seine Expression dadurch unmöglich machen. Viertens, könnte es dem pilzlichen Protein nicht gelingen, seine native Konformation in der fremden mikrobiellen Umgebung zu erreichen, was auf Faltungsprobleme zurückzuführen ist, einschließlich Körperformausbildung oder verschiedene andere Gründe. Würde irgendeines dieser Ereignisse auftreten, wäre das Klonen des DS-Gens durch funktionelle Komplementierung nicht möglich.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment, das ein unentbehrliches pilzliches Enzym codiert, das bei der Riboflavin-Biosynthese beteiligt ist. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment, das eine pilzliche DS codiert, worin es sich bei dem Pilz um Magnaporthe grisea handelt. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäure-Fragmente, die zu dem Nucleinsäure-Fragment komplementär sind, welches ein pilzliches DS-Enzym codiert.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung chimäre Gene, die ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment aufweisen, welches ein pilzliches DS-Enzym codiert und wirksam mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft. Alternativ betrifft die Erfindung chimäre Gene, die Nucleinsäure-Fragmente aufweisen, welche zu dem Nucleinsäure-Fragment komplementär sind, das das Enzym codiert, welches wirksam mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft wird. Die Expression irgendeines dieser chimären Gene führt zur Erzeugung von Mengen an codierten Enzymen in transformierten Wirtszellen, die gegenüber den in den nicht transformierten Wirtszellen erzeugten Mengen verändert sind (d.h. erhöht oder verringert).
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine transformierte Wirtszelle, die in ihrem Genom ein chimäres Gen aufweist, das ein pilzliches DS-Enzym codiert und wirksam mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, wobei die Expression des chimären Gens zur Erzeugung veränderter Mengen an pilzlichem DS-Enzym in der transformierten Wirtszelle führt. Die transformierten Wirtszellen können eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs sein und schließen Zellen ein, die sich von höheren Pflanzen oder Mikroorganismen ableiten. Die Erfindung schließt außerdem transformierte Pflanzen ein, die sich aus transformierten Wirtszellen höherer Pflanzen ergeben.
  • Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verändern der Stärken der Expression an pilzlichem DS-Enzym in einer transformierten Wirtszelle, welches Verfahren umfasst: a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem chimären Gen, das ein pilzliches DS-Enzym codiert und wirksam mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft ist und b) Aufziehen der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression des chimären Gens geeignet sind, wobei die Expression des chimären Gens zur Erzeugung veränderter Stärken eines Magnaporthe grisea-DS-Enzym in der transformierten Zelle führt.
  • Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, um ein Nucleinsäure-Fragment zu erhalten, das eine Aminosäuresequenz codiert, welche eine pilzliche DS codiert.
  • Zusätzlich wird ein Verfahren zum Evaluieren mindestens einer Verbindung auf ihre Fähigkeit gewährt, die Aktivität eines pilzlichen DS-Enzyms zu hemmen und damit als eine chemische Substanz zum Pflanzenschutz zu dienen, welches Verfahren die Schritte umfasst: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einem chimären Gen, das ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment aufweist, welches ein pilzliches DS-Enzym codiert, wobei das chimäre Gen wirksam mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft ist; (b) Aufziehen der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) unter Bedingungen, die zur Expression des chimären Gens geeignet sind, wobei die Expression des chimären Gens zur Erzeugung des pilzlichen DS-Enzyms führt; (c) Kontaktieren der transformierten Wirtszelle mit einer chemischen Verbindung und (d) Vergleichen der metabolischen Aktivität der transformierten Wirtszelle, die mit der chemischen Verbindung mit der metabolischen Aktivität einer unbehandelten Wirtszelle kontaktiert worden ist, wobei eine Abnahme der metabolischen Aktivität in der kontaktierten transformierten Wirtszelle im Vergleich zu der unbehandelten transformierten Wirtszelle in Schritt (d) zeigt, dass die chemische Verbindung potentiell als chemische Substanz zum Pflanzenschutz verwendbar ist.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Evaluieren mindestens einer Verbindung auf ihre Fähigkeit zum Hemmen der Aktivität eines pilzlichen DS-Enzyms gewährt, das damit als eine chemische Substanz zum Pflanzenschutz dient, welches Verfahren die Schritte umfasst: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einem chimären Gen, das ein Nucleinsäure-Fragment aufweist, welches ein pilzliches DS-Enzym codiert, wobei das chimäre Gen wirksam mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft ist; (b) Aufziehen der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) unter Bedingungen, die zur Expression des chimären Gens geeignet sind, wobei die Expression des chimären Gens zur Erzeugung des pilzlichen DS-Enzyms führt; (c) wahlweise Reinigen des durch die transformierte Wirtszelle exprimierten Enzyms; (d) Kontaktieren des Enzyms mit einer chemischen Verbindung und (e) Vergleichen der Aktivität des Enzyms, das mit der Testverbindung kontaktiert worden ist, mit der Aktivität des unbehandelten Enzyms, wobei eine Abnahme der Aktivität des kontaktierten Enzyms im Vergleich zu dem Aktivitätswert des unbehandelten Enzyms in Schritt (e) zeigt, dass die chemische Verbindung potentiell als chemische Substanz und Pflanzenschutz verwendbar ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND SEQUENZBESCHREIBUNGEN
  • 1 zeigt eine Anordnung einer primären Aminosäuresequenz mit bekannten mikrobiellen DS-Homologen und das geklonte Magnaporthe grisea-DS-Protein, das mit dem GCG Pileup-Programm (Genetics Computer Group, Madison, WI) erzeugt wurde.
  • Escherichia coli, Vibrio harveyi, Saccharomyces cerevisiae (Genbank, Zugriffnummer X66720, M27139 bzw. Z21619) und Ashbya gossypii (DGen-Zugriffnummer 95N-T03516) betragen lediglich 43,5%, 52,7%, 52,5% und 48,1% identisch mit dem Magnaporthe grisea-Homolog an dem primären Aminosäuresequenzwert unter Anwendung des GAP-Programms des GCG-Pakets.
  • Die folgenden Sequenzbeschreibungen und Sequenzlisten, die hierin beigefügt sind, entsprechen den Regeln, die für Offenbarungen von Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenzen in Patentanmeldungen maßgeblich sind, wie sie in dem WIPO-Standard ST.25 festgesetzt sind. Die "Sequenzbeschreibungen" enthalten den 1-Buchstaben-Code für die Nucleotidsequenzzeichen und die 3-Buchstaben-Code für Aminosäuren die in Übereinstimmung mit den IUPAC-IYUB-Standards festgelegt worden sind und beschrieben wurden in den Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) und dem Biochemical Journal 219(2):345-373 (1984), die hierin als Fundstelle einbezogen sind. Die vorliegende Erfindung nutzt die Wisconsin Package Version 9.0-Software von Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, unter Anwendung ihrer Standardfehlerwerte für die "Gap-Creation-Penalty" von 12 und der "Gap-Extension-Penalty" von 4. Die Gaps verwenden den Algorithmus von Needleman und Wunsch, um die Anordnung von 2 kompletten Sequenzen zu ermitteln, welche die Zahl der Anpassungen auf ein Maximum bringt und die Zahl der Gaps auf ein Minimum bringt.
  • SEQ ID NR:1 ist die Nucleotidsequenz einer geklonten cDNA-codierenden Magnaporthe grisea DS.
  • SEQ ID NR:2 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz der geklonten cDNA, die Magnaporthe grisea DS codiert.
  • SEQ ID NR:3 ist der 5'-Primer, der in der Amplifikation von E. coli DS mit der Genbank Zugriffsnummer X66720 verwendbar ist.
  • SEQ ID NR:4 ist der 3'-Primer, der für die Amplifikation von E. coli DS mit der Genbank Zugriffsnummer X66720 verwendbar ist.
  • SEQ ID NR:5 ist der 5'-Primer, der für die Einführung eines DNA-Fragments verwendbar ist, der die Kanamycin-Beständigkeit in das E. coli DS-Gen mit der Genbank Zugriffsnummer X66720 einführt bzw. an einer Not1-Spaltstelle.
  • SEQ ID NR:6 ist der 3'-Primer, der für die Einführung eines DNA-Fragments verwendbar ist, der die Kanamycin-Beständigkeit in das E. coli DS-Gen mit der Genbank Zugriffsnummer X66720 einführt bzw. an einer Not1-Spaltstelle.
  • SEQ ID NR:7 ist einer der PCR-Primer, die für die Einführung einer Not1-Spaltstelle in das Mittelteil von E. coli DS mit der Genbank Zugriffsnummer X66720 verwendbar ist (hybridisiert zu nt 968-987).
  • SEQ ID NR:8 ist einer der PCR-Primer, die für die Einführung einer Not1-Spaltstelle in das Mittelteil von E. coli DS mit der Genbank Zugriffsnummer X66720 verwendbar ist (hybridisiert zu nt 940-957).
  • SEQ ID NR:9 ist der 5'-Primer, der für die Einführung von Magnaporthe grisea DS in den E. coli-Expressionsvektor, pET-24a(+) (Novagen) verwendbar ist.
  • SEQ ID NR:10 ist der 3'-Primer, der für die Einführung von Magnaporthe grisea DS in den E. coli-Expressionsvektor, pET-24a(+) (Novagen) verwendbar ist.
  • Es wurde 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (DS) des Magnaporthe grisea-Riboflavin-biosynthetischen Weges durch funktionelle Komplementierung eines Escherichia coli-Auxotrophs geklont.
  • Es wurde ein Nucleinsäure-Fragment, welches das DS-Protein codiert, aus Magnaporthe grisea isoliert. In die Erfindung einbezogen ist auch ein Assay unter Verwendung des Proteins, das durch das Nucleinsäure-Fragment codiert wird, um chemische Substanzen zum Pflanzenschutz (Fungizide) im Zusammenhang mit dem pilzlichen Riboflavin-biosynthetischen Weg zu screenen.
  • In der vorliegenden Offenbarung werden eine Reihe von Begriffen und Abkürzungen verwendet. Es werden die folgenden Festlegungen geboten:
    "3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase" wird abgekürzt als DS und bezieht sich auf das Enzym, das die Umwandlung von Ribulose-5-phosphat zu 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat und Ameisensäure katalysiert.
  • "Polymerase-Kettenreaktion" wird abgekürzt mit PCR.
  • "Exprimierte Sequenzmarkierung" wird abgekürzt mit EST.
  • "3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat" wird abgekürzt mit DHBP.
  • "Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid" wird abgekürzt mit IPTG.
  • "Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gelelektrophorese" wird abgekürzt mit SDS-PAGE.
  • "Offenes Leseraster" wird abgekürzt mit ORF.
  • Ein "isoliertes Nucleinsäure-Fragment" ist ein Polymer von RNA oder DNA, das ein- oder doppelsträngig ist und wahlweise synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthält. Ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment in Form eines Polymers von DNA kann ein oder mehrere Segmente von cDNA, genomische DNA oder synthetische DNA aufweisen.
  • "Auxotroph" bezeichnet die für Wachstum, Sporenbildung und Kristallerzeugung der Mikroorganismen erforderlichen Ernährungsbedingungen. Für die Aufgaben der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "auxotroph" hierin so festgelegt, dass er einen Organismus bezeichnet, welcher zum Wachstum die Zuführung von Riboflavin benötigt.
  • Die Begriffe "Wirtszelle" und "Wirtsorganismus" bezeichnen eine Zelle, die in der Lage ist, fremde oder heterologe Gene aufzunehmen und solche Gene unter Erzeugung eines aktiven Genproduktes zu exprimieren. Geeignete Wirtszellen schließen Mikroorganismen ein, wie beispielsweise Bakterien und Pilze sowie Pflanzenzellen.
  • Der Begriff "metabolische Aktivität" bezeichnet die normale Zellaktivität, die erforderlich ist, um das Wachstum aufrecht zu erhalten. Wie hierin zu verstehen ist, werden Reagentien, wie beispielsweise chemische Substanzen zum Pflanzenschutz, die die metabolische Aktivität hemmen, in der Regel das Zellwachstum hemmen.
  • Der Begriff "weitgehend ähnlich" bezieht sich auf Nucleinsäure-Fragmente, worin Änderungen in einer oder mehreren Nucleotidbasen zur Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren führen wobei jedoch nicht die funktionellen Eigenschaften des durch die DNA-Sequenz codierten Proteins beeinflusst werden. "Weitgehend ähnlich" bezeichnet auch Nucleinsäure-Fragmente, worin Änderungen in einer oder mehreren Nucleotidbasen nicht die Fähigkeit des Nucleinsäure-Fragmentes beeinflussen, die Veränderung der Genexpression mit Hilfe der Antisense- oder Cosuppressionstechnologie zu vermitteln. "Weitgehend ähnlich" bezeichnet auch Modifikationen von Nucleinsäure-Fragmenten der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise die Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Nucleotidbasen, die die funktionellen Eigenschaften des resultierenden Transkriptes in Anbetracht der Fähigkeit zum Vermitteln der Veränderung der Genexpression mit Hilfe der Antisense- oder Cosuppressionstechnologie oder der Veränderung der funktionellen Eigenschaften des resultierenden Proteinmoleküls nicht wesentlich beeinflussen. Es gilt daher als selbstverständlich, dass die Erfindung mehr als die speziellen exemplarischen Sequenzen umfasst.
  • Ein "wesentlicher Teil" bezeichnet eine Aminosäure- oder Nucleotidsequenz, die ausreichend von der Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder Nucleotidsequenz eines Gens aufweist, um eine vermutliche Identifikation dieses Polypeptids oder Gens entweder durch manuelle Evaluierung der Sequenz von einem Durchschnittsfachmann oder durch rechnergestützten Sequenzvergleich und Identifikation unter Verwendung von Algorithmen zu ermöglichen, wie beispielsweise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). In der Regel ist eine Reihe von 10 oder mehr angrenzenden Aminosäuren oder 30 oder mehr Nucleotiden erforderlich, um mutmaßlich eine Polypeptid- oder Nucleinsäuresequenz als Homolog zu einem bekannten Protein oder Gen zu identifizieren. Darüber hinaus können im Zusammenhang mit Nucleotidsequenzen, genspezifische Oligonucleotid-Sonden, die 20 bis 30 angrenzende Nucleotide aufweisen, in sequenzabhängigen Methoden der Genidentifikation (z.B. Southern-Hybridisierung) und Isolation (z.B. in situ-Hybridisierung von bakteriellen Kolonien oder Bakteriophagen-Plaques) verwendet werden. Darüber hinaus lassen sich kurze Oligonucleotide (in der Regel 12 Basen oder länger) als Amplifikationsprimer in PCR verwenden, um ein teilweises Nucleinsäue-Fragment zu erhalten, welches die Primer aufweist. Dementsprechend weist ein "wesentlicher Teil" einer Nucleotidsequenz genug von der Sequenz auf, um die spezielle Identifikation und/oder Isolation eines die Sequenz aufweisenden Nucleinsäure-Fragmentes zu ermöglichen. Die vorliegende Patentbeschreibung enthält Lehren zu partiellen oder vollständigen Aminosäure- und Nucleotidsequenzen, die ein oder mehrere spezielle pilzliche Proteine codieren. Der Fachmann auf dem Gebiet, der aus den hierin veröffentlichten Sequenzen Nutzen zieht, kann jetzt alle oder einen wesentlichen Teil der offenbarten Sequenzen für die in der Fachwelt bekannten Aufgaben verwenden.
  • Beispielsweise ist in der Fachwelt bekannt, dass die Antisense-Suppression und Cosuppression der Genexpression unter Anwendung von Nucleinsäure-Fragmenten erreicht werden können, die weniger als den gesamten Codierungsbereich eines Gens repräsentieren, sowie mit Hilfe von Nucleinsäure-Fragmenten, die nicht 100% der Identität mit dem supprimierenden Gen teilen. Außerdem sind Veränderungen in einem Gen, die zu der Erzeugung einer chemisch gleichwertigen Aminosäure an einer bestimmten Stelle führen, nicht aber die funktionellen Eigenschaften des codierten Proteins beeinflussen, auf dem Fachgebiet gut bekannt. So kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, die eine hydrophobe Aminosäure ist, durch ein Codon ersetzt werden, das einen anderen weniger hydrophoben Rest codiert, wie beispielsweise Glycin, oder einen hydrophoberen Rest codiert, wie beispielsweise Valin, Leucin oder Isoleucin. In ähnlicher Weise kann man auch von Änderungen erwarten, die zur Substitution eines der negativ geladenen Reste durch ein anderes, wie beispielsweise Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder eines der positiv geladenen Reste für ein anderes, wie beispielsweise Lysin für Arginin, ein funktionell gleichwertiges Produkt erzeugen. Nucleotidänderungen, die zu einer Änderung der N-terminalen und C-terminalen Abschnitte des Proteinmoleküls führen, würden erwartungsgemäß nicht die Aktivität des Proteins verändern. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen liegt durchaus in den routinemäßigen Fertigkeiten des Durchschnittsfachmannes wie auch die Bestimmung der Erhaltung der biologischen Aktivität der codierten Produkte. Darüber hinaus erkennt der Fachmann, dass weitgehend ähnliche Sequenzen, welche die vorliegende Erfindung umfasst, auch durch deren Fähigkeit zum Hybridisieren unter strengen Bedingungen (0,1 X SSC, 0,1% SDS, 65°C) mit den hierin exemplifizierten Sequenzen festgelegt sind. Bevorzugte und weitgehend ähnliche Nucleinsäure-Fragmente der vorliegenden Erfindung sind solche Nucleinsäure-Fragmente, deren DNA-Sequenzen zu 90% identisch mit der DNA-Sequenz der Nucleinsäure-Fragmente sind, die hierin aufgeführt sind. Am meisten bevorzugt sind Nucleinsäure-Fragmente, die zu 95% identisch mit der DNA-Sequenz der Nucleinsäure-Fragmente sind, die hierin genannt sind.
  • Die "Codon-Degeneration" bezeichnet die Redundanz im genetischen Codon, die eine Variation der Nucleotidsequenz erlaubt, ohne dass die Aminosäuresequenz eines codierten Polypeptids beeinflusst wird. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung jedes beliebige Nucleinsäure-Fragment, welches die gesamte oder einen wesentlichen Teil der Aminosäuresequenz codiert, welche das DS-biosynthetische Enzym codiert, wie es in der SEQ ID NR:2 festgelegt ist. Der Fachmann ist durchaus vertraut mit den "Codon-Verzerrungen", die sich durch eine spezifische Wirtszelle beim Gebrauch von Nucleotid-Codons zum Festlegen einer bestimmten Aminosäure zeigen. Daher ist es beim Synthetisieren eines Gens zur verbesserten Expression in einer Wirtszelle wünschenswert, das Gen so aufzubauen, dass sich die Häufigkeit der Codon-Nutzung der Häufigkeit der Nutzung des bevorzugten Codons der Wirtszelle annähert.
  • Der Begriff "prozentuale Identität" ist auf dem Fachgebiet als eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehreren Polynucleotidsequenzen dafür bekannt, dass sie durch Vergleichen der Sequenzen ermittelt wird. Auf dem Fachgebiet bedeutet "Identität" auch den Grad der Verwandtschaft zwischen Polypeptid- oder Polynucleotidsequenzen, was jeweils in Frage kommt, der über die Anpassung zwischen den Reihen derartiger Sequenzen ermittelt wird. "Identität" und "Ähnlichkeit" lassen sich mühelos mit Hilfe bekannter Methoden berechnen, einschließlich solche, die in den folgenden Fundstellen beschrieben wurden, ohne auf diese beschränkt zu sein: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Herausg.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Herausg.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., und Griffin H. G., Herausg.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Herausg.) Academic Press (1987); und Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. und Devereux, J., Herausg.) Stockton Press, New York (1991). Bevorzugte Methoden zur Bestimmung der Identität sind so beschaffen, dass sie die größte Anpassung zwischen den getesteten Sequenzen ergeben. Methoden zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit sind in öffentlich verfügbaren Computerprogrammen kodifiziert. Bevorzugte Computerprogramm-Methoden zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: das GCG-Pileup-Programm, das in dem GCG-Programm-Package enthalten ist und in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, indem Algorithmen nach Needleman und Wunsch mit deren Standardfehlerwerten für Gap-Creation-Penalty=12 und Gap-Extension-Penalty=4 verwendet wurden (Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASTA (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)). Das BLAST X-Programm ist öffentlich verfügbar bei der NCBI und bei anderen Quellen (BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl. Library Med. (NCBI NLM) NIH, Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Eine andere bevorzugte Methode zur Bestimmung der prozentualen Identität ist die mit Hilfe der Methode des DNASTAR-Protein-Anordnungsprogramms unter Verwendung des Jotun-Hein-Algorithmus (Hein et al., Methods Enzymol. 183:626-645 (1990)). Fehlerparameter für die Jotun-Hein-Methode zum Anordnen sind: bei mehrfachen Anordnungen, Gap-Penalty=11, Gap-Längs-Penalty=3, bei paarweisen Anordnungen ktuple=6. Zur Veranschaulichung ist ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz von beispielsweise mindestens 95% "Identität" zu einer Referenz-Nucleotidsequenz der SEQ ID NR:1 hat, so auszulegen, dass die Nucleotidsequenz des Polynucleotids identisch ist mit der Referenzsequenz mit der Ausnahme, dass die Polynucleotidsequenz bis zu 5 Punkt-Mutationen pro jeweils 100 Nucleotide der Referenz-Nucleotidsequenz von SEQ ID NR:1 hat. Um mit anderen Worten ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz von mindestens 95% Identität mit einer Referenz-Nucleotidsequenz zu erhalten, können bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz weggelassen sein oder durch anderes Nucleotid ersetzt sein, oder es kann eine Zahl von Nucleotiden bis zu 5% der Gesamtnucleotide in der Referenzsequenz in die Referenzsequenz insertiert sein. Diese Mutationen der Referenzsequenz können an den terminalen Stellen 5' oder 3' der Referenz-Nucleotidsequenz auftreten oder an irgendeiner beliebigen Stelle zwischen terminalen Positionen, die entweder einzeln unter den Nucleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren angrenzenden Gruppen im Inneren der Referenzsequenz eingestreut sind. Analog ist unter einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens beispielsweise 95% Identität zu einer Refrenzaminosequenz der SEQ ID NR:2 hat, zu verstehen, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit der Referenzsequenz mit der Ausnahme identisch ist, dass in die Polypeptidsequenz bis zu 5 Aminosäure-Veränderungen pro jeweils 100 Aminosäuren der Referenzaminosequenz in der SEQ ID NR:2 einbezogen sein können. Um mit anderen Worten ein Polypeptid zu erhalten, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 95% Identität zu einer Referenz-Aminosäuresequenz hat, können bis zu 5% der Aminosäure-Reste in der Referenzsequenz weggelassen oder durch andere Aminosäure ersetzt sein oder eine Zahl von Aminosäuren bis zu 5% der Gesamtaminosäure-Reste in der Referenzsequenz in die Referenzsequenz insertiert sein. Diese Veränderungen der Referenzsequenz können an den Amino- oder Carboxy-terminalen Stellen der Referenz-Aminosäuresequenz auftreten oder an irgendeiner beliebigen Stelle zwischen diesen terminalen Stellen entweder einzeln unter den Resten der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren angrenzenden Gruppen im Inneren der Referenzsequenz eingestreut sein.
  • Der Begriff "komplementär" wird zur Beschreibung der Beziehung zwischen Nucleotidbasen verwendet, die zum Hybridisieren untereinander in der Lage sind. Damit ist im Bezug auf DNA Adenosin komplementär zu Thymin und Cytosin ist komplementär zu Guanin.
  • "Synthetische Gene" können von Oligonucleotid aufbauenden Blöcken zusammengebaut werden, die chemisch unter Anwendung von Prozeduren synthetisiert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Diese aufbauenden Blöcke werden unter Erzeugung von Gensegmenten ligiert oder reassoziiert werden, die anschließend enzymatisch zum Aufbau des gesamten Gens zusammengebaut werden. "Chemisch synthetisiert" im Zusammenhang mit einer Sequenz einer DNA bedeutet, dass die Nucleotide als Komponenten in vitro zusammengebaut werden. Eine manuelle chemische Synthese einer DNA kann unter Anwendung etablierter Prozeduren ausgeführt werden oder es kann eine automatisierte chemische Synthese unter Verwendung einer der vielen kommerziell verfügbaren Maschinen ausgeführt werden. Dementsprechend können die Gene auf optimale Genexpression zugeschnitten werden auf der Grundlage einer Optimierung der Nucleotidsequenz, um die Codon-Verzerrung der Wirtszelle wiederzugeben. Der Fachmann erkennt die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Genexpression, wenn die Codon-Nutzung gegenüber solchen, vom Wirt bevorzugten vorgezogen wird. Die Bestimmung bevorzugter Codons kann auf der Grundlage einer Übersicht von Genen erfolgen, die von der Wirtszelle abgeleitet sind, wo die Sequenzinformation zur Verfügung steht.
  • "Gen" bezieht sich auf ein Nucleinsäure-Fragment, das ein spezifisches Protein exprimiert, worin regulatorische Sequenzen einbezogen sind, die der Codierungssequenz vorgeschaltet sind (5'-nicht codierende Sequenzen) und folgen (3'-nicht codierende Sequenzen). "Natives Gen" bezeichnet ein Gen, das in der Natur mit seinen eigenen regulatorischen Sequenzen angetroffen wird. "Chimäres Gen" bezeichnet jedes beliebige Gen, bei dem es sich um kein natives Gen handelt, das regulatorische und codierende Sequenzen aufweist und, die nicht gemeinsam in der Natur angetroffen werden. Dementsprechend kann ein chimäres Gen regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen aufweisen, die von unterschiedlichen Quellen deriviert sind, oder regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen aufweisen, die von der gleichen Quelle deriviert sind, die jedoch in einer solchen unterschiedlichen Weise angeordnet sind, wie sie in der Natur nicht angetroffen werden. "Endogenes Gen" bezeichnet ein natives Gen in seiner natürlichen Umgebung im Genom eines Organismus. Ein "fremdes" Gen bezeichnet ein Gen, das normalerweise im Wirtsorganismus nicht angetroffen wird, das jedoch in dem Wirtsorganismus mit Hilfe eines Gentransfers eingeführt wurde. Fremdgene können native Gene aufweisen, die in einem nicht nativen Organismus insertiert sind, oder chimäre Gene. Ein "Transgen" ist ein Gen, das in das Genom mit Hilfe einer Transformationsprozedur eingeführt worden ist.
  • "Codierende Sequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die auf eine spezifische Aminosäuresequenz codiert. "Regulatorische Sequenz" beziehen sich auf Nucleotidsequenzen, die sich stromaufwärts (5'-nicht codierende Sequenzen) innerhalb oder stromabwärts (3'-nicht codierende Sequenzen) einer codierenden Sequenz befinden und die die Transkription, RNA-Bearbeitung oder – Stabilität oder Translation der zugehörigen codierenden Sequenz beeinflusst. Regulatorische Sequenzen können Promotoren einschließen, Translations-Leader-Sequenzen, Introne und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen.
  • "Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die zum Kontrollieren der Expression einer codierenden Sequenz oder funktionellen RNA in der Lage ist. Im Allgemeinen befindet sich eine codierende Sequenz in 3'-Stellung zu einer Promotorsequenz. Die Promotorsequenz besteht aus proximalen und distaleren Elementen stromaufwärts, wobei letztere Elemente oftmals als Enhancer bezeichnet werden. Dementsprechend ist eine "Enhancer" eine DNA-Sequenz, welche die Promotoraktivität stimulieren kann und ein angeborenes Element des Promotors oder ein heterologes Element sein kann, das insertiert ist, um den Grad oder die Gewebespezifität eines Promotors zu erhöhen. Promotoren lassen sich in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen ableiten oder setzen sich aus verschiedenen Elementen zusammen, die aus unterschiedlichen Promotoren abgeleitet sind, die in der Natur angetroffen werden, oder die sogar synthetische DNA-Segmente aufweisen. Für den Fachmann gilt als selbstverständlich, dass unterschiedliche Promotoren die Expression eines Gens in verschiedenen Geweben oder Zellarten oder an unterschiedlichen Stadien der Entwicklung oder in Reaktion auf unterschiedliche Außenbedingungen dirigieren können. Promotoren, die ein Gen dazu bringen, dass es in den meisten Zelltypen und am häufigsten exprimiert werden, werden üblicherweise als "konstitutive Promotoren" bezeichnet. Es werden ständig neue Promotoren der verschiedensten Typen entdeckt, die in Pflanzenzellen von Nutzen sind; zahlreiche Beispiele finden sich in den Übersichtsarbeiten von Okamuro und Goldberg (Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989)). Es gilt ferner als selbstverständlich, dass, da in den meisten Fällen die exakten Bindungen regulatorischer Sequenzen nicht vollständig definiert worden sind, DNA-Fragmente unterschiedlicher Längen über identische Promotoraktivität verfügen können.
  • Die "Translations-Leitsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die sich zwischen der Promotorsequenz eines Gens und der codierenden Sequenz befindet. Die Translations-Leitsequenz liegt in der vollständig bearbeiteten mRNA stromaufwärts von der Translations-Startsequenz vor. Die Translations-Leitsequenz kann das Bearbeiten des primären Transkripts zu mRNA, mRNA-Stabilität oder Translationswirksamkeit beeinflussen. Beispiele für Translations-Leitsequenzen sind bereits beschrieben worden (Turner et al., Mol. Biotech. 3:225 (1995)).
  • Die "3'-nicht codierenden Sequenzen" bezeichnen DNA-Sequenzen, die sich stromabwärts an einer codierenden Sequenz befinden und in die Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen sowie andere Sequenzen einbezogen sind, die Regulationssignale codieren, welche das Bearbeiten einer mRNA oder die Genexpression beeinflussen können. Das Polyadenylierungssignal ist in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass es die Addition von Polyadenylsäure-Trakten an dem 3'-Ende des mRNA-Präkursors beeinflusst. Die Verwendung unterschiedlicher 3'-nicht codierender Sequenzen wurde von Ingelbrecht et al. exemplifiziert, Plant Cell 1:671-680 (1989).
  • "RNA-Transkript" bezeichnet das Produkt, das sich aus der RNA Polymerase-katalysierten Transkription einer DNA-Sequenz ergibt. Wenn es sich bei dem RNA-Transkript um eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz handelt, wird sie als das primäre Transkript bezeichnet oder kann eine RNA-Sequenz sein, die von einer posttranskriptionellen Bearbeitung des primären Transkriptes abgeleitet ist und als die voll entwickelte RNA bezeichnet wird. "Messenger-RNA" (mRNA) bezeichnet die RNA, die keine Introns hat und die durch die Zelle in ein Protein translatiert werden kann. "cDNA" bezeichnet eine doppelsträngige DNA, die zur mRNA komplementär und von dieser abgeleitet ist. "Sense-RNA" bezeichnet ein RNA-Transkript, in das die mRNA einbezogen ist und so in ein Protein mit Hilfe der Zelle translatiert werden kann. "Antisense-RNA" bezeichnet ein RNA-Transkript, das komplementär zu dem gesamten primären Target-Transkript oder der mRNA ist oder zu einem Teil davon und die Expression eines Zielgens blockiert (US-P-5107065). Der komplementär Charakter einer Antisense-RNA kann bei jedem beliebigen Teil des spezifischen Gen-Transkriptes vorhanden sein, d.h. an der 5'-nicht codierenden Sequenz, 3'-nicht codierenden Sequenz, den Intronen oder der codierenden Sequenz. "Funktionelle RNA" bezeichnet die Antisense-RNA, Ribozym-RNA oder eine andere RNA, die noch nicht translatiert ist, aber schon einen Einfluss auf Zellularprozesse ausübt.
  • Der Begriff "wirksam verknüpft" bezeichnet die Assoziation von Nucleinsäuresequenzen an einem einzelnen Nucleinsäure-Fragment, so dass die Funktion des einen durch die des anderen beeinflusst wird. Beispielsweise ist ein Promotor wirksam mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er in der Lage ist, die Expression dieser codierenden Sequenz zu beeinflussen (d.h. dass sich die codierende Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors befindet). Codierende Sequenzen können wirksam mit regulatorischen Sequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein.
  • Der Begriff "Expression", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die Transkription und stabile Akkumulation von Sense (mRNA)- oder Antisense-RNA, die sich von dem Nucleinsäure-Fragment der Erfindung ableitet. Expression kann auch auf eine Translation von mRNA in ein Polypeptid bezogen sein. "Antisense-Inhibition" bezeichnet die Erzeugung von Antisense-RNA-Transkripten, die zur Unterdrückung der Expression des Targetproteins in der Lage sind. "Überexpression" bezeichnet die Erzeugung eines Genproduktes in transgenen Organismen, die die Mengen der Erzeugung in normalen oder nicht transformierten Organismen übertreffen. "Cosuppression" bezeichnet die Erzeugung von Sense-RNA-Transkripten, die in der Lage sind, die Expression identischer oder weitgehend ähnlicher fremder oder endogener Gene zu unterdrücken (US-P-5231020).
  • "Veränderte Mengen" bezeichnet die Erzeugung von Genprodukten) in Organismen in Mengen oder Anteilen, die sich von denen normaler oder nicht transformierter Organismen unterscheiden.
  • "Transformation" bezeichnet den Transfer eines Nucleinsäure-Fragmentes in das Genom eines Wirtsorganismus, was zu einem genetisch stabilen Erbgut führt. Wirtsorganismen, die transformierte Nucleinsäure-Fragmente enthalten, werden als "transgene" Organismen bezeichnet. Beispiele für Methoden der Pflanzentransformation schließen Agrobacterium vermittelte Transformation ein (DE Blaere et al., Meth. Enzymol. 143:277 (1987)) und die Technik der partikelbeschleunigten Transformation oder "Gen-Transfer mit Partikelkanone" (Klein et al., Nature, London 327:70-73 (1987); US-P-4945050).
  • Eine Magnaporthe grisea DS ist isoliert und identifiziert worden durch Vergleich von Random-cDNA-Sequenzen mit einer Genbank-Datenbasis unter Verwendung der BLAST-Algorithmen, die in der Fachwelt gut bekannt sind. Die Nucleotidsequenz von Magnaporthe grisea DS-cDNA ist in der SEQ ID NR:1 bereitgestellt und die abgeleitete Aminosäuresequenz in der SEQ ID NR:2. Ein DS-Gen von anderen Pilzen lässt sich jetzt durch Vergleich von Random-cDNA-Sequenzen mit der Magnaporthe grisea DS-Sequenz identifizieren, wie sie hierin bereitgestellt ist.
  • Das Nucleinsäure-Fragment der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um cDNA's und Gene zu isolieren, die eine homologe DS von der gleichen oder einer anderen pilzlichen Spezies codieren. Die Isolation homologer Gene unter Anwendung von sequenzabhängigen Protokollen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele für sequenzabhängige Protokolle schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Methoden der Nucleinsäurehybridisierung und Methoden der DNA- und RNA-Amplifikation, wie sie durch zahlreiche Anwendungen der Technik der Nucleinsäure-Amplifikation exemplifiziert worden sind (z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Ligase-Kettenreaktion). Derartige Protokolle können so modifiziert werden, dass sie Gene identifizieren, die DS-Homologe codieren, die über mindestens 60% Identität auf dem Aminosäureniveau mit der Sequenz verfügen, die in der SEQ ID NR:2 festgelegt ist, wobei die Identifikation von Genen, die Proteine mit etwa 70% Identität bis etwa 90% Identität codieren, leicht sein wird und wobei die Identifikation von Genen, die Proteine codieren, die über etwa 100% Identität mit der Sequenz verfügen, die in SEQ ID NR:2 festgelegt ist, elementar ist.
  • Beispielsweise ließen sich DS-Gene entweder als cDNA's oder genomische DNA's direkt unter Verwendung der gesamten oder eines Teils der erfindungsgemäßen Nucleinsäue-Fragmente als DNA-Hybridisierungssonden isolieren, um Bibliotheken von beliebigen gewünschten Pilzen zu screenen, indem die auf dem Fachgebiet gut bekannten Methoden eingesetzt werden. Spezielle Oligonucleotid-Sonden, die auf der erfindungsgemäßen DS-Sequenz beruhen, können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden (Maniatis, infra) konzipiert und synthetisiert werden. Darüber hinaus lassen sich ganze Sequenzen verwenden, um direkt DNA-Sonden mit Hilfe von Methoden zu synthetisieren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, wie beispielsweise Random-Primer, Methoden der DNA-Markierung, Nick-Translation oder End-Markierung oder RNA-Sonden unter Verwendung verfügbarer in nitro-Transkriptionssysteme. Darüber hinaus können spezielle Primer so konzipiert und angewendet werden, dass sie einen Teil der vollen Länge der erfindungsgemäßen Sequenzen amplifizieren. Die resultierenden Produkte der Amplifikation können während der Amplifikationsreaktionen direkt markiert werden oder können nach den Amplifikationsreaktionen markiert werden und als Sonden benutzt werden, um die volle Länge von cDNA oder genomischen Fragmenten unter geeignet strengen Bedingungen zu isolieren.
  • Darüber hinaus lassen sich zwei kurze Segmente des erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Fragments in PCR-Protokollen zum Amplifizieren von längeren Nucleinsäure-Fragmenten verwenden, die homologe DS-Gene von DNA oder RNA codieren. Die Polymerase-Kettenreaktion kann auch auf einer Bibliothek von geklonten Nucleinsäure-Fragmenten ausgeführt werden, wobei die Sequenz eines der Primer von dein erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Fragment abgeleitet ist und die Sequenz des anderen Primers den Vorteil des Vorhandenseins von Polyadenylsäure-Trakten an dem 3'-Ende des mRNA-Präkursors nutzt, der pilzliche DS codiert. Alternativ kann die zweite Primersequenz auf Sequenzen bezogen sein, die von dem clonierenden Vektor abgeleitet sind. Beispielsweise kann der Fachmann das RACE-Protokoll (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8998 (1988)) anwenden, um cDNA's unter Anwendung der PCR zu erzeugen, um Kopien des Bereichs zwischen einer einzelnen Stelle in dem Transkript und dem 3'- oder 5'-Ende zu amplifizieren. Aus den erfindungsgemäßen Sequenzen lassen sich Primer konzipieren, die in 3'- und 5'-Richtungen orientiert sind. Unter Anwendung kommerziell verfügbarer 3'-RACE oder 5'-RACE-Systemen (BRL) lassen sich spezielle 3'- oder 5'-cDNA-Fragmente isolieren (Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)). Produkte, die mit Hilfe der 3'- und 5'-RACE-Prozeduren erzeugt wurden, können unter Erzeugung von cDNA's voller Länge kombiniert werden (Frohman et al., Techniques 1:165 (1989)).
  • Schließlich erleichtert die Verfügbarkeit des erfindungsgemäßen Nucleotids und der abgeleiteten Aminosäuresequenz das immunologische Screening von cDNA-Expressionsbibliotheken. Es lassen sich synthetische Peptide, die Abschnitte der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz repräsentieren, synthetisieren. Diese Peptide können verwendet werden, um Tiere zu immunisieren, um polyklonale oder monoklonale Antikörper mit Spezifität auf Peptide oder Proteine zu erzeugen, die die Aminosäuresequenz aufweisen. Diese Antikörper können anschließend verwendet werden, um cDNA-Expressionsbibliotheken zu screenen, um cDNA-Klone in voller Länge zu isolieren, die von Interesse sind. (Lerner et al., Adv. Immunol. 36:1 (1984); Maniatis infra).
  • Die Nucleinsäure-Fragmente der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um transgene Pflanzen zu schaffen, in denen das erfindungsgemäße DS-Protein in höheren oder geringeren Anteilen als normalerweise vorhanden ist. Derartige Manipulationen würden verständlicherweise die intrazellularen Mengen an Riboflavin verändern und die essentiellen Cofaktoren FAD und FMN somit neuartige Phänotypen von potentiellem kommerziellem Wert erzeugen. Alternativ könnte es bei einigen Anwendungen wünschenswert sein, das erfindungsgemäße DS-Protein in speziellen Pflanzengeweben und/oder Zelltypen oder im Verlaufe von Entwicklungsstadien zu exprimieren, in denen sie normalerweise nicht auftreten.
  • Eine Überexpression der erfindungsgemäßen DS kann erreicht werden, indem zunächst ein chimäres Gen konstruiert wird, worin der DS-codierende Bereich wirksam mit dem Promotor verknüpft ist, der in der Lage ist, die Expression eines Gens in den gewünschten Geweben zu dem gewünschten Entwicklungsstadium zu dirigieren. Aus Gründen der Einfachheit kann das chimäre Gen Promotorsequenzen und Translations-Leitsequenzen aufweisen, die von den gleichen Genen abgeleitet sind. 3'-nicht codierende Sequenzen, die Transkriptions-Terminationssignale codieren, müssen ebenfalls bereitgestellt werden. Die erfindungsgemäßen chimären Gene können auch ein oder mehrere Introne aufweisen, um die Genexpression zu erleichtern.
  • Sodann können Plasmid-Vektoren konstruiert werden, welche die erfindungsgemäßen chimären Gene aufweisen. Die Wahl des Plasmid-Vektors hängt von der Methode ab, die zur Transformation von Wirtspflanzen angewendet werden wird. Dem Fachmann sind die genetischen Elemente gut bekannt, die auf dem Plasmid-Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren, selektieren und zu vermehren, die das chimäre Gen enthalten. Der Fachmann wird ebenfalls erkennen, dass unterschiedliche unabhängige Transformationsereignisse in verschiedenen Graden und Mustern der Expression resultieren werden (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)) und dass derartige mehrfache Ereignisse gescreent werden müssen, um die Linien zu erhalten, die den gewünschten Expressionsgrad und -muster zeigen. Ein solches Screening kann mit Hilfe der Southern-Analyse der DNA, der Northern-Analyse der mRNA-Expression, der Western-Analyse der Proteinexpression oder einer Phänotyp-Analyse ausgeführt werden.
  • Bei einigen Anwendungen kann es nützlich sein, das DS-Protein in unterschiedliche Zellkompartimente zu dirigieren oder deren Abscheidung aus der Zelle zu erleichtern. Es wird daher in Betracht gezogen, dass das vorstehend beschriebene chimäre Gen durch Hinzufügung einer geeigneten, intrazellularen oder extrazellularen Targetsequenz zu deren codierenden Bereichen weiter modifiziert werden kann. Dieses schließt Chloroplast-Transitpeptide ein (Keegstra et al., Cell 56:247-253 (1989)), Signalsequenzen, welche Proteine zum endoplasmischen Retikulum dirigieren (Chrispeels et al., Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. 42:21-53 (1991)), und ein Zellkern-Lokalisierungssignal (Raikhel et al., Plant Phys. 100:1627-1632 (1992)). Obgleich die vorgenannten Fundstellen Beispiele für jede von diesen geben, ist die Liste nicht erschöpfend, und es können in der Zukunft mehr Targetsignale von Nutzen entdeckt werden. Es ist beispielsweise gezeigt worden, dass die RS von reifem Spinat in Chloroplasten angesiedelt ist. Ferner ist nachgewiesen worden, dass Antikörper, die gegen das gereinigte rekombinante Protein gerichtet sind, speziell mit einem Polypeptid der erwarteten Größe wechselwirken, wenn Spinat-Chloroplastextrakte einer SDS-PAGE und Western-Analyse unterworfen werden.
  • Es kann bei einigen Anwendungen außerdem wünschenswert sein, die Expression des DS-Gens in Pflanzen zu verringern oder zu eliminieren. Um dieses zu erreichen, kann das für Antisense- oder Cosuppression der DS konzipierte chimäre Gen konstruiert werden, indem die Gene oder Gen-Fragmente, welche Teile dieser Enzyme codieren, mit Pflanzen-Promotorsequenzen verknüpft werden. Auf diese Weise lässt sich ein chimäres Gen konzipieren, welches die Antisense-RNA für die gesamte oder einen Teil der DS exprimiert, indem das DS-Gen oder Gen-Fragmente in entgegengesetzter Orientierung mit den Pflanzen-Promotorsequenzen verknüpft werden. Die chimäre Cosuppressions- oder Antisense-Genkonstrukte ließen sich dann über gut bekannte Transformationsprotokolle in die Pflanzen einführen, um die endogene Expression von DS-Genprodukten zu verringern oder zu eliminieren.
  • Das in heterologen Wirtszellen erzeugte DS-Protein und speziell das in den Zellen von mikrobiellen Wirten erzeugte DS-Protein kann verwendet werden, um Antikörper auf Enzyme mit Hilfe von Methoden herzustellen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Die Antikörper wären zum Detektieren des erfindungsgemäßen DS-Proteins in situ in Zellen oder in vitro in Zellextrakten von Nutzen. Bevorzugte heterologe Wirtszellen für die Erzeugung des erfindungsgemäßen DS-Proteins sind mikrobielle Wirte. Mikrobielle Expressionssysteme und Expressionsvektoren, die regulatorische Sequenzen enthalten und die einen hohen Grad der Expression von Fremdproteinen dirigieren, sind der Fachwelt gut bekannt. Es könnte jede von diesen verwendet werden, um chimäre Gene für die Erzeugung der erfindungsgemäßen DS zu konstruieren. Diese chimären Gene könnten sodann in die entsprechenden Mikroorganismen über eine Transformation eingeführt werden, um eine hochgradige Expression des erfindungsgemäßen DS-Proteins zu gewähren.
  • Mikrobielle Wirtszellen, die für die Expression der erfindungsgemäßen DS-Enzyme geeignet sind, schließen alle beliebigen Zellen ein, die zur Expression der chimären Gene in der Lage sind, die diese Enzyme codieren. Derartige Zellen schließen sowohl Bakterien als auch Pilze ein, einschließlich beispielsweise die Hefen (z.B. Aspergillus, Saccharomyces, Pichia, Candida und Hansenula), Vertreter des Genus Bacillus sowie die Enterobakterien (z.B. Escherichia, Salmonella und Shigella). Die Methoden für die Transformation derartiger Wirte und die Expression von Fremdproteinen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und Beispiele geeigneter Protokolle finden sich in "Manual of Methods for General Bacteriology" (Gerhardt et al., Herausg., American Society for Microbiology, Washington, DC (1994) oder in Brock, T. D., "Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology", 2. Ausgabe, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)).
  • Vektoren oder Kassetten, die für die Transformation geeigneter mikrobieller Wirtszellen verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Im typischen Fall enthalten die Vektoren oder Kassetten Sequenzen, welche die Transkription und Translation des entsprechenden Gens, eines ausgewählten Markers und von Sequenzen dirigieren, die die selbständige Replikation oder chromosomale Integration erlauben. Geeignete Vektoren weisen einen Bereich 5' des Gens auf, welches transkriptionelle Initiierungskontrollen beherbergt, und einen Bereich 3' des DNA-Fragmentes, welches die transkriptionelle Terminierung steuert. Am meisten bevorzugt werden beide Kontrollbereiche von Genen abgeleitet, die zu der transformierten Wirtszelle homolog sind, obgleich als selbstverständlich gilt, dass derartige Kontrollbereiche nicht von den Genen abgeleitet sein müssen, die im Bezug auf die spezielle Spezies nativ sind, die als Produktionswirt ausgewählt wird.
  • Initiations-Kontrollregionen oder -Promotoren, die verwendbar sind, um die Expression des Gens, welches das DS-Enzym codiert, in die gewünschte Wirtszelle zu treiben, sind zahlreich und der Fachwelt vertraut. Es ist nahezu jeder Promotor, der in der Lage ist, diese Gene anzutreiben, für die vorliegende Erfindung geeignet, einschließlich die Folgenden, ohne auf diese beschränkt zu sein: CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (verwendbar für die Expression in Saccharomyces); AOX1 (verwendbar für die Expression in Pichia) und lac, trp, IPL, IPR, T7, tac und trc (verwendbar für die Expression in Escherichia coli). Die Terminationskontrollregionen können auch von verschiedenen Genen angetrieben werden, die für die bevorzugten Wirte nativ sind. Gegebenenfalls kann es sein, dass eine Terminierungsstelle nicht erforderlich ist, wobei jedoch ihre Einbeziehung besonders bevorzugt ist.
  • Das erfindungsgemäße DS-Protein kann auch als ein Mittel zur Erleichterung des Aufbaus und/oder der Identifikation spezieller chemischer Agentien verwendet werden, deren Verwendung als Fungizide, Herbizide oder Antibiotika sich als nützlich erweisen könnte. Dieses könnte entweder durch rationalen Aufbau und Synthese starker Enzyminhibitoren erreicht werden, die aus der strukturellen und/oder mechanistischen Information resultieren, die von dem gereinigten, erfindungsgemäßen pilzlichen Protein abgeleitet ist, oder durch in vitro-Randomscreening chemischer Bibliotheken. Das DS-Protein katalysiert einen unentbehrlichen Schritt in der Synthese von Riboflavin in Pflanzen und den meisten Mikroorganismen und wird für die Erzeugung von FAD und FMN benötigt essentielle prosthetische Gruppen für eine Reihe wichtiger Redox-Enzyme. Dementsprechend ist zu erwarten, dass eine signifikante in vivo-Hemmung von jeglichem DS-Protein den Zellstoffwechsel stark lähmt und wahrscheinlich zum Tod aller Organismen führen wird, die die endogene Erzeugung von Riboflavin als die einzige Quelle des Vitamins benötigen.
  • Alle oder ein Teil der Nucleinsäure-Fragmente der vorliegenden Erfindung können auch als Sonden für genetische und physikalische Kartierung der Gene verwendet werden, von denen sie ein Bestandteil sind, sowie als Marker für Merkmale, die mit der Expression des erfindungsgemäßen DS verknüpft sind. Eine solche Information kann nützlich sein in der Pflanzenaufzucht, um Linien mit den gewünschten Phänotypen zu entwickeln.
  • Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Fragmente als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Marker verwendet werden. Es können Southern-Blots (Maniatis) von Restriktions-abgebauter pflanzengenomischer DNA mit Nucleinsäure-Fragmenten der vorliegenden Erfindung als Sonde ausgeführt werden. Die resultierenden Bandenmuster können anschließend genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen unterworfen werden, wie beispielsweise MapMaker (Lander et al., Genomics 1:174-181 (1987)), um eine genetische Karte zu konstruieren. Zusätzlich können die Nucleinsäure-Fragmente der vorliegenden Erfindung zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, welche Restriktions-Endonuclease-behandelte genomische DNA's einer Reihe von Individuen enthalten, die die Eltern und Nachkommen einer bestimmten genetischen Hybridisierung repräsentieren. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird vermerkt und verwendet, um die Position der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz in der genetischen Karte zu berechnen, die zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al., Am. J. Hum. Genet. 32:314-331 (1980)).
  • Die Erzeugung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen deriviert sind, zur Verwendung in der genetischen Kartierung wurde von Bernatzky und Tanksley (Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41 (1986)) beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben das genetische Kartieren von speziellen cDNA-Klonen unter Anwendung der vorstehend ausgeführten Methodik und Variationen davon. Beispielsweise können zum Kartieren F2-Zwischenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, wahllos gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Reihen von Individuen verwendet werden. Derartige Methoden sind in der Fachwelt gut bekannt.
  • Nucleinsäuresonden, die von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen abgeleitet sind, können auch für physikalische Kartierung verwendet werden (d.h. die Anordnung von Sequenzen auf physischen Genomkarten; siehe hierzu Hoheisel et al., "Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide", S. 319-346, Academic Press (1996) und die darin zitierten Fundstellen).
  • In einer anderen Ausführungsform können Nucleinsäuresonden, die von der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz abgeleitet sind, in einer in situ-Hybridisierungskartierung mit direkter Fluoreszens (FISH) verwendet werden. Obgleich die gegenwärtigen Methoden der FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (bis zu mehreren hundert kb), können Verbesserungen der Empfindlichkeit die Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden möglich machen.
  • Es kann eine Vielzahl von auf Nucleinsäure-Amplifikation basierenden Methoden der genetischen und physikalischen Kartierung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen ausgeführt werden. Beispiele schließen Allel-spezifische Amplifikation ein, Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS), Allel-spezifische Ligation, Nucleotid-Verlängerungsreaktionen, Radiation-"Hybrid-Mapping" und "Happy-Mapping". Bei diesen Methoden wird die Sequenz eines Nucleinsäure-Fragmentes verwendet, um Primer-Paare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu konstruieren und zu erzeugen. Der Aufbau solcher Primer ist in der Fachwelt gut bekannt. In Methoden unter Einsatz des PCR-basierenden genetischen Kartierens kann es erforderlich sein, die Unterschiede der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen entsprechen. Dieses ist jedoch im Allgemeinen bei Kartierungsmethoden nicht erforderlich. Eine solche Information kann in der Pflanzenaufzucht nützlich sein, um Linien mit den gewünschten Phänotypen zu entwickeln.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter festgelegt, worin alle Anteile und Prozentangaben, sofern nicht anders angegeben, auf Gewicht bezogen sind und die Gradangaben auf Celsius. Es gilt als selbstverständlich, dass diese Beispiele, obgleich bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt werden, lediglich der Veranschaulichung dienen.
  • Hierin wurden Standardmethoden des rekombinanten DNA- und Molekularklonens angewendet, wie sie in der Fachwelt gut bekannt sind und beschrieben wurden von: Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989; und von T. J. Silhavy, M. L. Bennan und L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, N. Y. (1984) und von Ausubel, F. M. et al., "Cunent Protocols in Molecular Biology", veröffentlicht von Greene Publishing Assoc. und Wiley Interscience (1987).
  • Die Manipulationen der Gensequenzen wurden ausgeführt unter Anwendung der Reihe der Programme, die verfügbar sind bei der Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI).
  • Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: "s" bedeutet Sekunde(n), "min" bedeutet Minute(n), "h" bedeutet Stunde(n), "d" bedeutet Tag(e), "μl" bedeutet Mikroliter, "ml" bedeutet Milliliter, "1" bedeutet Liter, "mM" bedeutet millimolar, "M" bedeutet molar, "mMol" bedeutet Millimol(e).
  • BEISPIEL 1
  • PCR-KLONEN AUF ESCHERICHIA COLI-DS
  • Es wurden genspezifische PCR-Primer verwendet, um das Escherichia coli-DS-Gen von der Genom-DNA zu amplifizieren, während einzelne Restriktionsorte zu deren flankierende Regionen für nachfolgende Ligation in die Plasmide mit hoher Kopienzahl zugefügt wurden. Die für diese Aufgabe verwendeten Primer beruhten auf den veröffentlichten DNA-Sequenzen des Escherichia coli-DS-Gens (Genbank Zugriffnummer X66720) und bestanden aus den folgenden Nucleotiden:
    Primer 1 – (SEQ ID NR:3):
    5'-ACT CAT TTA cca tgg CTC AGA CGC TAC TTT CCT C-3'
    Primer 2 – (SEQ ID NR:4):
    5'-ATC TTA CTg tcg acT TCA GCT GGC TTT ACG CTC-3'
  • Die unterstrichenen Basen hybridisieren zu dem Ziel-Gen, während die kleinen Buchstaben die Restriktionsorte (NcoI oder Sall) angeben, die den Enden der PCR-Primer hinzugefügt wurden.
  • Die Amplifikation des DS-Gens wurde unter Verwendung der Primer 1 und 2 und von Genom-DNA von Escherichia coli-Stamm W3110 (Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75:2276-2284 (1978)) erreicht. Primer 1 hybridisiert am Start des Gens und führt eine NcoI-Stelle an dem Start-Codon des Proteins ein, während Primer 2 an der gegenüberliegenden Seite hybridisiert und eine Sall-Stelle unmittelbar hinter dem Stop-Codon liefert. Die 100 μl-PCR-Reaktionen enthielten etwa 100 ng Genom-DNA und beide Primer mit einer Endkonzentration bei 0,5 μM. Die anderen Reaktionskomponenten wurden von dem GeneAmp PCR Reagent Kit (Perkin Elmer) entsprechend dem Herstellerprotokoll bereitgestellt. Die Amplifikation wurde in einem DNA-Thermocycler 480 (Perkin Elmer) für 28 Zyklen ausgeführt, die jeweils 1 min bei 94°C, 2 min bei 53°C und 2 min bei 72°C umfassten. Nach dem letzten Zyklus gab es eine 7-minütige Extensionsdauer bei 72°C. Das PCR-Produkt wurde mit NcoI und Sall zerlegt und in ähnlich aufbereitetes pGEM-5Zf(+) (Promega, Madison, WI) ligiert. Das Letztere wurde als ein geeigneter Klonierungsvektor gewählt, da ihm eine NotI-Spaltstelle nach dem Doppelverdau mit NcoI und Sall (siehe nachfolgend) fehlte. Das Ligations-Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli-DH5α-kompetente Zellen (GibcoBRL) umzuwandeln, und Transformanten wurden auf LB-Medien, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, gewählt.
  • Plasmide, die das geklonte Escherichia coli-DS-Gen ernten, wurden mit Hilfe der Restriktionsverdauungsanalyse identifiziert. Die Plasmid-DNA wurde aus einer Reihe von Ampicillinresistenten Kolonien unter Anwendung des Wizard DNA-Reinigungssystems (Promega, Madison, WI) isoliert und mit NcoI und Sall einer Spaltung unterzogen. Die Proben wurden mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese analysiert und ein repräsentatives Plasmid für das Gen, das ein Insert der korrekten Größe liefert, vollständig sequenziert, um das Fehlen von PCR-Fehlern zu verifizieren. Abgesehen von solchen Nucleotiden an den 5'- und 3'-Enden, die vorsätzlich für Klonierungsaufgaben verändert wurden, war die amplifizierte Escherichia coli-DS-Gensequenz mit derjenigen identisch, die in der Literatur veröffentlicht wurde.
  • BEISPIEL 2
  • INSERTIONSINAKTIVIERUNG DES ESCHERICHIA COLI-DS-GENS
  • Um bakterielle Auxotrophe zu erzeugen, denen die Fähigkeit zum Synthetisieren von Riboflavin fehlt, wurde das geklonte Escherichia coli-DS-Gen durch Insertionsinaktivierung nicht funktionierend umgewandelt. Verkürzt gesagt, wurde in die Mitte der codierenden Region der Ziel-Gene eine einzige NotI-Stelle eingeführt und ein DNA-Fragment, welches Kanamycin-Beständigkeit vermittelt, in die bearbeitete Stelle ligiert. Die Letztere wurde über die kommerziell verfügbare Kanr GenBlock-Cartridge (Pharmacia) bereitgestellt, die durch PCR modifiziert wurde, um NotI-Spaltstellen an ihren beiden Enden hinzuzufügen. Diese Modifikation wurde unter Verwendung der Primer 3 und 4 in einer Standard-PCR-Reaktion erreicht; wobei die unterstrichenen Abschnitte den Kanr-GenBlock hybridisieren und die kleinen Buchstaben die NotI-Spaltstellen angeben.
    Primer 3 – (SEQ ID NR:5):
    5'-AAC TAG ATC Agc ggc cgc AGC CAC GTT GTG TCT CAA A-3'
    Primer 4 – (SEQ ID NR:6):
    5'-GAC AAA CAT Agc ggc cgc TGA GGT CTG CCT CGT GAA-3'
  • Nach der Amplifikation wurde der modifizierte Kanr-GenBlock mit NotI gespalten und das resultierende Fragment mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese gereinigt.
  • PCR-Primer wurden auch verwendet, um eine einzelne NotI-Spaltstelle in die Mitte des Escherichia coli-DS-Gens einzuführen. Dieses wurde durch Anwendung der "inversen PCR-Methode" erreicht, die ausführlich von Ochman et al. in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" (Innis et al., Herausg.) S. 219-227, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben wurde. Die Targets für die inverse PCR sind in der Regel doppelsträngige kreisrunde DNA-Moleküle. Im Gegensatz zu anderen PCR-Anwendungen sind die zwei Primer jedoch voneinander weg orientiert, so dass ihre 3'-Enden sich in entgegengesetzten Richtungen um die gesamte kreisrunde Matrize erstrecken. Wenn die Primer so gebaut sind, dass sie unmittelbar angrenzend aneinander hybridisieren, wird ein lineares DNA-Fragment erzeugt, in welchem die gesamte Vektorsequenz einbezogen ist und als seine Start- und Stopstellen die ursprünglichen Primer-Bindungsorte hat. Das Nettoergebnis ist analog einem Linearisieren eines kreisrunden Plasmids an einem vorgegebenen Ort. Indem man entsprechende Nucleotidsequenzen an den nicht hybridisierenden 5'-Enden beider PCR-Primer anbringt, ist es damit möglich, einen einzelnen Restriktionsort an jeder gewünschten Stelle im Inneren einer kreisrunden Matrix einzuführen.
  • Die Primer 5 und 6 (die zu nt 968-987 und nt 940-957 der DNA-Sequenz mit der Genbank Zugriffnummer X66720 hybridisieren) wurden konzipiert, um eine NotI-Spaltstelle in die Mitte des Escherichia coli-DS-Gens einzuführen, wobei die Nucleotide, die zum Ziel-Gehen hybridisieren, unterstrichen sind und die NotI-Spaltstellen in Kleinbuchstaben angegeben sind.
    Primer 5 – (SEQ ID NR:7):
    5'-AAC TAG ATC Agc ggc cgc TGA CCG TAT TAC GAC-3'
    Primer 6 – LS(SEQ ID NR:8):
    5'-GAC AAA CAT Agc ggc cgc GTA GTC ACA CCT TCA GCT-3'
  • Die kreisrunde Matrix zur inversen PCR war das pGEM-5Zf(+)-Konstrukt, welches das Escherichia coli-DS-Gen enthält. Die 100 μl-PCR-Reaktionen enthielten 0,5 ng Plasmid-DNA und Primer 5 und Primer 6 hatten beide eine Endkonzentration von 0,5 μM. Die Amplifikation wurde in einem DNA Thermocycler 480 (Perkin Elmer) für 30 Zyklen ausgeführt, die jeweils 50 s bei 94°C, 1 min bei 55°C und 3 min bei 72°C umfassten. Das PCR-Produkt wurde mit NotI gespalten und das resultierende Fragment mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese gereinigt; wobei das abgetrennte Band die erwartete Größe hatte. Anschließend wurde das gereinigte Fragment mit T4 DNA-Ligase (Novagen) rezirkularisiert, um ein funktionelles Plasmid zu regenerieren, wobei ein Aliquot des Ligationsreaktionsgemisches verwendet wurde, um Escherichia coli-DH5α-kompetente Zellen (GibcoBRL) zu transformieren. Für das Wachstum wurden LB-Medien gewählt, die Ampicillin (100 μg/ml) enthielten und die Plasmid-DNA aus einer Reihe von Transformanten für die Restriktionsverdauungsanalyse mit NotI, Sall und NcoI isoliert. Für die weitere Manipulation wurde ein repräsentatives Plasmid ausgewählt, welches das korrekte Spaltmuster mit diesen Enzym liefert.
  • Zum Insertieren des Kanamycin-beständigen Gens wurde das vorstehend beschriebene Plasmidkonstrukt mit NotI gespalten und mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Das Fragment wurde dann mit einem 4-fachen molaren Überschuss der modifizierten Kanr Genblock-Patrone inkubiert und einer Standard-Ligierungsreaktion in Gegenwart von T4 DNA-Ligase (Novagen) unterworfen. Es wurde ein Aliquot des Ligierungsreaktionsgemisches verwendet, um Escherichia coli-DH5α-kompetente Zellen (GibcoBRL) zu transformieren, wobei für das Wachstum LB-Platten ausgewählt wurden, die Kanamycin (30 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielten. Plasmide, die das aufgetrennte Escherichia coli-DS-Gen ernten, wurden mit Hilfe der Restriktionsverdauungsanalyse identifiziert. Die Plasmide wurden mit NcoI und Sall gespalten und anschließend einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen, um auf das Vorhandensein eines insertierten, Kanamycin-beständigen Gens zu prüfen. Für die weitere Manipulation wurde ein repräsentatives Plasmid ausgewählt, das Fragmente der korrekten Größe liefert. Die DNA-Sequenzanalyse dieses Plasmids bestätigte, dass das Kanamycin-beständige Gen an der richtigen Stelle in dem Ziel-Gen insertiert worden war.
  • BEISPIEL 3
  • ERZEUGUNG VON ESCHERICHIA COLI-DS-AUXOTROPH
  • Die insertionsaktivierte Escherichia coli-DS wurde von dem vorstehend beschriebenen Plasmidkonstrukt unter Verwendung von NcoI und Sall befreit und mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Das Fragment wurde sodann in den Escherichia coli-Stamm ATCC 47002 (vollständig beschrieben von Balbas et al., Gene 136:211-213 (1993)) eingeführt und isogen gemacht mit JC7623 (beschrieben von Bachmann, B., in "Escherichia coli und Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology", (Niedhardt et al., Herausg.), S. 2466, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)), und zwar durch Elektroporation unter Verwendung eines BTX Transfektors 100 (Biotechnologies and Experimental Research Inc.) entsprechend dem Herstellerprotokoll. Die Wahl dieses Stammes als Startrezipient für den Genaustausch basiert auf seinem ermittelten "hyper-rec"-Phänotyp und damit zusammenhängenden Fähigkeit zu einer Doppel-Crossingover-homologen Rekombination hoher Frequenz (Wyman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:2880-2884 (1985); Balbas et al., Gene 136:211-213 (1993); Balbas et al., Gene 172:65-69 (1996)). Damit war zu erwarten, dass das insertionsaktiviert Escherichia coli-DS-Gen wirksam seinen funktionellen chromosomalen Gegenspieler in ATCC 47002 unter Kanamycinauswahl ersetzen würde.
  • Nach der Elektroporation wurden die transformierten Zellen erneut in 1,0 ml S.O.C.-Medien (GibcoBRL) suspendiert, die mit Riboflavin (400 μg/ml) ergänzt wurden, und wurde für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Kanamycin-Beständigkeit wurde sodann auf LB-Platten bei 37°C selektiert, die sowohl Riboflavin (400 μg/ml) als auch Kanamycin (30 μg/ml) enthielt; die Kolonien erschienen 24-48 Stunden später. Der Phänotypnachweis des korrekten chromosomalen Integrationsereignisses wurde durch Replikationsversuche erzielt. Riboflavin-Auxotrophe, die sich aus der Doppel-Crossingover-homologen Rekombination des zerlegten Ziel-Gens ergeben, würden erwartungsgemäß gegenüber Kanamycin resistent sein, empfindlich gegenüber Ampicillin und würden ein Wachstum lediglich in Gegenwart von zugesetztem Riboflavin zeigen. Zur weiteren Untersuchung wurde eine repräsentative Bakterienkolonie ausgewählt, die diesen Phänotyp zeigte.
  • Obgleich ATCC 47002 ein hervorragender Stamm zur Schaffung von Escherichia coli-"knockouts" ist, machen ihn seine mehrfachen Mutationen in dem recBCD-Ort zur Vermehrung von Plasmiden des ColE1-Typs unfähig (Balbas et al., Gene 172:65-69 (1996)). Dementsprechend ist das vorstehend beschriebene Riboflavin-Auxotroph zum Screening von Plasmid-cDNA-Bibliotheken durch funktionelle Komplementierung nicht geeignet. Um dieses Ziel zu erreichen, war es daher notwendig, das insertionsinaktivierte DS-Gen von dem Chromosom ATCC 47002 zu einem geeigneten Wildtyp-Hintergrund zu bewegen. Diese Manipulation wurde durch generalisierte Phagentransduktion unter Verwendung von P1vir und Anwendung von Standardmethoden erreicht, wie sie ausführlich beschrieben wurden von Miller, J. H. in "Experiments in Molecular Genetics", S. 201-205, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972). Es wurden Escherichia coli-W3110 (Campbell et al., Proc Natl. Acad. Sci. 75:2276-2284 (1978) als der Rezipientenstamm für das insertionsinaktivierte DS-Gen gewählt. Nach der Phagentransduktion wurde Bakterienwachstum auf LB-Medien selektiert, die mit Kanamycin (35 μg/ml) und Riboflavin (400 μg/ml) ergänzt waren. Sodann wurden stabile Transduktanten, die das zerteilte Escherichia coli-DS-Gen ernten, mit Hilfe von Replika-Plattierungsversuchen identifiziert, die analog den vorstehend für ATCC 47002 beschriebenen waren. So wurden einzelne Kolonien auf Platten, die LB-Medien, Natriumcitrat (7,5 mM), Magnesiumsulfat (1,5 nM) und Kanamycin (35 μg/ml) mit oder ohne Riboflavin (400 μg/ml) enthielten, "gepatcht". Das DS-Riboflavin-Auxotroph, das für die weitere Untersuchung und für das nachfolgende Komplementationsklonen (siehe nachfolgend) ausgewählt wurde, war lediglich in der Lage, in Gegenwart des zugesetzten Riboflavins zu wachsen und war gegenüber Ampicillin (100 μg/ml) oder Streptomycin (25 μg/ml) nicht beständig, wobei die Empfindlichkeit auf Streptomycin charakteristisch für W3110, nicht aber für ATCC 47002 ist.
  • BEISPIEL 4
  • KLONEN DES MAGNAPORTHE GRISEA-DS-GENS DURCH FUNKTIONELLE KOMPLEMENTIERUNG
  • Es wurde eine Magnaporthe grisea-cDNA-Expressionsbibliothek in den NotI und Sall-Spaltstellen des Lambda ZipLox-Vektors (GibcoBRL) aus isolierter mRNA unter Anwendung konventioneller Methoden erzeugt (Maniatis, siehe oben) und unter Anwendung des Herstellerprotokolls einer Masseexcidierung unterworfen. Bei der Excision waren die befreiten cDNA-Inserts in dein Plasmid-Vektor pZL1 enthalten, der dem Ampicillin Beständigkeit verleiht und deren Expression in Escherichia coli bei Induktion mit Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) ermöglicht. Die resultierende Mischung der excidierten Plasmide wurde sodann in das Escherichia coli-DS-Auxotroph (das W3110-Derivat) unter Anwendung eines BTX-Transvektors 100 (Biotechnologies and Experimental Research Inc.) und des Protokolls des Herstellers elektroporiert. Die transformierten Zellen wurden auf Wachstum in Abwesenheit von zugesetztem Riboflavin selektiert auf Platten, die B-Agar (LB-Medien, die Natriumcitrat (7,5 mM) enthalten, Magnesiumsulfat (1,5 mM), Kanamycin (35 μg/ml), Ampicillin (100 μg/ml) und IPTG (0,6 mM). Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden bei 37°C wurde bakterielles Wachstum beobachtet und in Frequenzen von etwa 2,1 × 10–5 Riboflavin-unabhängige Kolonien gewonnen. Die Plasmid-DNA wurde aus einer repräsentativen Kolonie isoliert und einer weiteren Analyse unterzogen, wobei das ausgewählte Plasmid in der Lage war, das Escherichia coli-DS-Auxotroph zu Riboflavin-Prototrophie zu transformieren. Das in diesem Plasmid enthaltene cDNA-Insert wurde sodann vollständig auf einem automatischen ABI 377-Sequencer (Applied Biosystems) unter Verwendung von Fluoreszensdidesoxyterminatoren und auftragsspezifischen Primern sequenziert.
  • Die näherungsweise 1,3 kbp des Magnaporthe grisea-cDNA-Inserts, die das Escherichia coli-DS-Auxotroph retteten, codieren eindeutig eine 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase. Die Nucleotidsequenz des offenen Leserasters (ORF) für dieses Protein und seine vorhergesagte primäre Aminosäuresequenz sind in den SEQ ID NR:1 bzw. SEQ ID NR:2 ausgeführt.
  • Von den verschiedenen mikrobiellen DS-Homologen, die in 1 gezeigt sind, zeigt das Magnaporthe grisea-Protein (SEQ ID NR:2) die größte Ähnlichkeit mit Vibrio harveyi- und Saccharomyces cerevisiae-Proteinen bei dem primären Aminosäuresequenz-Wert (z.B. näherungsweise 53% Identität). Gegenwärtig sind die einzigen bekannten isolierten pilzlichen DS-Gene die von Ashbya gossypii und Saccharomyces cerevisiae. Paarweise Vergleiche der drei pilzlichen DS-Proteine liefern die folgenden prozentualen Identitäten:
    52,5% – Magnaporthe grisea gegenüber Saccaromyces cerevisiae,
    48,1% – Magnaporthe grisea gegenüber Ashbya gossypii,
    59,9% – Saccharomyces cerevisiae gegenüber Ashbya gossypii.
  • Aus den vorgenannten Zahlen wird offensichtlich, dass die bekannten pilzlichen DS-Proteine eine eher geringe Gesamthomologie bei ihrem primären Aminosäurewert haben. Darüber hinaus ist die Magnaporthe grisea-DS näherungsweise nur zu 44% identisch mit dem entsprechenden Protein von Escherichia coli.
  • BEISPIEL 5
  • EXPRESSION VON MAGNAPORTHE GRISEA-DS IN ESCHERICHIA COLI
  • Die geklonte Magnaporthe grisea-DS, die in Beispiel 4 identifiziert wurde, wurde auf Insertion in den auf T7 Promotor basierenden Escherichia coli-Expressionsvektor, pET-24a(+) (Novagen) unter Verwendung der Primer 7 (SEQ ID NR:9) und 8 (SEQ ID NR:10) modifiziert. Der Primer 7 (5'-CTA CTC ATT TCA TAT GCC TTC CAC AGA CAG CAT-3') (SEQ ID NR:9) hybridisiert zu nt 1-20 der Magnaporthe grisea-DS (SEQ ID NR:1). Diese wurde so konzipiert, dass sie die Proteinsynthese in Escherichia coli an der normalen Startstelle auslöst und zum Zwecke des Klonens eine einzige NdeI stromaufwärts von dem Start-Met-Rest einbaut. Primer 8 (5'-CAT CTT ACT AGA TCT TCA ACC CGA CCC ATT CGT C-3') (SEQ ID NR:10) hybridisiert an dem anderen Ende des ORF zu nt 684-702 und führt eine einzige BgIII-Stelle unmittelbar hinter dem Stop-Codon des Proteins ein. Das Target für die PCR-Amplifikation war das gereinigte Plasmid, das den cDNA-Insert für die Magnaporthe grisea-DS enthält. Das vorhergesagte PCR-Produkt codiert die volle Länge der Magnaporthe grisea-DS ohne Modifikationen (SEQ ID NR:2).
  • Nach der Amplifikation des Ziel-Gens wurde das PCR-Fragment mit NdeI und BgIII gespalten und in die NdeI- und BamHI-Stellen der Polylinkerregion von pET-24a(+) (Novagen) ligiert. Die Letztere ist ein hochgradiger Escherichia coli-Expressionsvektor, der einen T7 Promotor enthält und auf Kanamycin selektiert ist. Anschließend wurde ein Aliquot des Ligationsreaktionsgemisches verwendet, um ein Plasmidtragendes Derivat von Escherichia coli BL21 (DE3) unter Verwendung des BTX-Transvektors 100 (Biotechnologies and Experimental Research Inc.) nach dem Protokoll des Herstellers zu transformieren. Das in den BL21 (DE3)-Zellen enthaltende Plasmid, das für die Transformation verwendet wurde, war pGroESL (Goloubinoff et al., Nature 337:44-47 (1985)), welches dem Chloramphenicol Widerstandsfähigkeit vermittelt und konstitutiv die Escherichia coli-GroEL- und GroES-Proteine, zwei molekulare Chaperone, überexprimiert, von denen aus früheren Studien bekannt ist, dass sie das Falten bestimmter anderer Proteine fördern. Es war zu erwarten, dass das Vorhandensein von pGroESL in den bakteriellen Wirtszellen die Erzeugung von löslicher Magnaporthe grisea-DS verbessern würde, die ansonsten ausschließlich in Einschlusskörperchen angetroffen werden. Nach der Transformationsprozedur wurden die Zellen auf LB-Medien aufgezogen, die sowohl Kanamycin (50 μg/ml) und Chloramphenicol (60 μg/ml) enthielten, und wurden bei 37°C inkubiert, um einzelne Kolonien zu erhalten. Es wurden die Klone, die ein Magnaporthe grisea-DS-Insert in pET-24a(+) ernten, durch PCR-Reaktionen unter Verwendung einzelner erneut suspendierter Kolonien und Primer 7 und 8 identifiziert. Nach dieser Prozedur wurde ein repräsentatives Klon für die Erzeugung von rekombinantem Protein (siehe nachfolgend) ausgewählt und dessen Plasmid-DNA vollständig sequenziert, um auf PCR-Fehler zu prüfen, wobei jedoch keine gefunden wurden.
  • Um Magnaporthe grisea-DS in Escherichia coli zu exprimieren, wurde der vorstehend beschriebene Stamm bei 37°C in LB-Medien aufgezogen, die Kanamycin (50 μg/ml) und Chloramphenicol (60 μg/ml) enthielten. Die Zellen wurden mit IPTG (1 mM) bei einem A600nm von etwa 1,0 induziert und 3 Stunden später durch Zentrifugieren geerntet. Die Magnaporthe grisea-DS war in dem bakteriellen Wirt in Mengen von mehr als 10% des Gesamtproteins gut exprimiert. Allerdings wurden selbst bei einer Überexpression von GroEL und GroES lediglich etwa 25% des rekombinanten Proteins als löslich ermittelt, und es war dieses Material, das entsprechend der nachfolgenden Beschreibung gereinigt wurde.
  • BEISPIEL 6
  • REINIGUNG VON REKOMBINANTER MAGNAPORTHE GRISEA-DS
  • Die Reinigungsschritte wurden bei 0° bis 4°C ausgeführt. Es wurden Pellets von Escherichia coli-Zellen, die Magnaporthe grisea-DS (6,4 g Nassgewicht) enthielten, in 3 Volumina von 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2, pH 7,5 (Puffer P) suspendiert. Die Suspension wurde zur Desintegration in eine French-Press bei 20.000 psi mit 3 Durchläufen durch die Zelle unter Kühlen mit Eiswasser zwischen jedem Durchlauf genommen. Das resultierende Homogenat wurde 20 min bei 18.500 g zentrifugiert und 5 ml des resultierenden Überstandes (53 mg/ml) auf eine "Pharmacia-Q-Sepharose-Fast-Flow"-Säule (1 cm × 5 cm) geladen, die mit Puffer P geeicht war. Nach dem Auswaschen der Säule mit 15 ml Puffer P wurde die Säule mit einem linearen Gradienten (0 bis 1 M NaCl in Puffer P) entwickelt. Die DS-Aktivität wurde gegen Ende des Gradienten eluiert. Aktive Fraktionen wurden (200 mg Protein in 10 ml) gesammelt, bis 5 ml eingeengt und gegen 5 mM Kaliumphosphat, 2,0 mM MgCl2, pH 7,5 vor dem Laden auf eine Calbiochem-Hydroxylapatit-Säule (1 cm × 7 cm), die mit 5 mM Kaliumphosphat, 2,0 mM MgCl2, pH 7,5, geeicht war, 50 × einer Diafiltration unterzogen. In der Säule eluierte aktive Fraktionen wurden mit Eich-Puffer gewaschen. Dieses wurde bis 2,5 ml (5,4 mg/ml) eingeengt und 20 × gegen 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 vor dem Schnellgefrieren in flüssigem Stickstoff einer Diafiltration unterzogen, gefolgt von einer Aufbewahrung bei –80°C bis zum Gebrauch. Die gereinigte DS war nach Bewertung mit Hilfe von SDS-PAGE und Coomassie-Blaufärbung homogen. Die Ausbeute an DS betrug 13,5 mg bezogen auf einen Extinktionskoeffizienten mit 280 nm von 7.270 M–1cm–1, berechnet mit Hilfe des GCG-Peptidesort-Programmes (Genetics Computer Group, Madison, WI). Die Ausbeute der DS-Aktivität (1,5 μMol/min) betrug 35% derjenigen des rohen Homogenats. Die spezifische Aktivität betrug 0,11 μMol/min/mg Protein, was eine 10-fache Reinigung gegenüber dem rohen Homogenat darstellt.
  • Der Edman-Abbau von gereinigter rekombinanter Magnaporthe grisea-DS ergab, dass ihre ersten 17 Aminosäuren mit denjenigen des Proteins identisch sind, das in der SEQ ID NR:2 gezeigt ist. Allerdings ist, ähnlich einer Reihe anderer Proteine, die in Escherichia coli überexprimiert sind, ihr Starter-Met-Rest durch den bakteriellen Verlust entfernt. Angesichts dieser Tatsache beträgt ihre vorhergesagte Molmasse 24.871,88 Dalton, was in ausgezeichneter Übereinstimmung mit dem Wert steht, der unter Anwendung der Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie bestimmt wurde (24.870,7). Was noch wichtiger ist, gereinigte rekombinante Magnaporthe grisea-DS ist katalytisch aktiv. In dem in vitro-Enzymassay, der nachfolgend beschrieben wird, zeigte sie eine Wechselzahl von näherungsweise 2,8 min–1 (bezogen auf den Protomer) bei 25°C. Auf dem Wege eines Vergleichs erhält man die veröffentlichte Wechselzahl von Escherichia coli-DS bei 37°C mit 0,66 min–1 (Richter et al., J. Bacteriol. 174:4050-4056 (1992)) und Candida guilliermondii-DS bei 37°C mit 5,6 min–1 (Volk et al., J. Biol. Chem. 265:19479-19485 (1990)). Nimmt man an, dass die Enzymreaktion durch ein Q10 (Temperaturkoeffizient) von 2 charakterisiert ist, legen diese Beobachtungen nahe, dass die gereinigte rekombinante Magnaporthe grisea-DS wahrscheinlich vollständig aktiv ist.
  • BEISPIEL 7
  • ASSAY ZUM MESSEN DER DS-ENZYMAKTIVITÄT
  • Es wurden Assays (0,125 ml) auf DS-Aktivität in 96-Muldenplatten bei 25°C ausgeführt. In die Reaktion (30 min) einbezogen waren 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM Ribose-5-phosphat, 0,25 Einheiten Pentosephosphat-Isomerase und DS. Es wurden Ribose-5-phosphat und Pentosephosphat-Isomerase verwendet, um DS-Substrat-Ribulose-5-phosphat im Gleichgewicht mit Ribose-5-phosphat aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und Gründen der Reinheit verwendet. In der Praxis können die Ribose-5-phosphat- und Pentosephosphat-Isomerase durch das reine DS-Substrat, Ribulose-5-phosphat, mit sehr ähnlichen Ergebnissen ersetzt werden. Die Implikation besteht darin, dass Ribose-5-phosphat nicht die katalytischen Eigenschaften von DS beeinträchtigt. Nach 30 min wurde das Produkt 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat mit Hilfe einer Modifikation einer Methode bestimmt, die für die Bestimmung von Diacetyl entwickelt worden war (Mattessich et al., Anal. Biochem. 180:349-350 (1989)). Zu jeder Reaktion wurden 0,1 ml einer gesättigten Creatin-Lösung gegeben, gefolgt von 0,05 ml einer α-Naphthol-Lösung (35 mg/ml in 1,0 N NaOH). Es wurden Standardkurven mit 0 bis 36 nMol/0,125 ml Diacetyl oder 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat ermittelt und diese wie vorstehend für die Reaktionsproben behandelt. Die Farbe ließ man für 30 min vor dem Ablesen der Absorptionswerte bei 525 nm unter Verwendung eines Plattenlesers "Spectra Max Plus" (Molecular Devices) entwickeln. Für die Inhibitions-Assays wurden die Konzentrationen von Ribose-5-phosphat zu 0,5 mM geändert und Inhibitoren zu den Reaktionen in 2 μl DMSO gegeben.
  • SEQUENZLISTE-FREIE AUFSTELLUNG
    Figure 00270001
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001

Claims (17)

  1. Isoliertes Nucleinsäure-Fragment, das ein pilzliches DS-Enzym codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Nucleinsäure-Fragment, aufweisend eine Sequenz, die die Aminosäuresequenz, festgelegt in SEQ ID NR. 2, codiert, (b) einem isolierten Nucleinsäure-Fragment, aufweisend eine Sequenz, die ein Polypeptid mit mindestens 90% Identität mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR. 2 festgelegt ist, codiert; und (c) ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment, das zu (a) oder (b) komplementär ist.
  2. Isoliertes Nucleinsäure-Fragment nach Anspruch 1, wie es in SEQ ID NR.1 festgelegt ist.
  3. Isoliertes Nucleinsäure-Fragment nach Anspruch 1 oder 2, das ein pilzliches DS-Enzym codiert, das von Magnaporthe grisea erhalten werden kann.
  4. Polypeptid, das mindestens 20% Identität mit der Aminosäuresequenz hat, die in der SEQ ID NR.2 festgelegt ist, und das ein pilzliches DS-Enzym codiert.
  5. Polypeptid nach Anspruch 4 mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR. 2 festgelegt ist.
  6. Expressionsvektor, aufweisend ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
  7. Chimäres Gen, aufweisend ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das funktionsfähig mit einer geeigneten Regulationssequenz verknüpft ist.
  8. Transformierte Wirtszelle, aufweisend eine Wirtszelle und das chimäre Gen nach Anspruch 7.
  9. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 8, worin die Wirtszelle eine pflanzliche Zelle ist.
  10. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 8, worin die Wirtszelle Escherichia coli ist.
  11. Verfahren zum Verändern der Expressionsstärke einer pilzlichen DS in einer Wirtszelle, umfassend: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem chimären Gen nach Anspruch 7 und (b) Aufziehen der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) unter Bedingungen, die für die Expression des chimären Gens geeignet sind, was zur Erzeugung veränderter Stärken eines Magnaporthe grisea DS-Enzyms in Bezug auf die Expressionsstärke einer nichttransformierten Wirtszelle führt.
  12. Verfahren zum Erhalten eines Nucleinsäure-Fragmentes, das ein pilzliches DS-Enzym codiert, umfassend: (a) Sondenbehandlung einer cDNA oder Genombank mit dem isolierten Nucleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit dem isolierten Nucleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hybridisiert, und (c) Sequenzieren der cDNA oder des Genom-Fragmentes, das den in Schritt (b) identifizierten Klon aufweist, worin die sequenzierte cDNA oder das Genom-Fragment ein pilzliches DS codieren.
  13. Verfahren zum Erhalten eines Nucleinsäure-Fragmentes, das ein pilzliches DS-Enzym codiert, umfassend: (a) Synthetisieren eines Oligonucleotid-Primers, das dem Abschnitt der in SEQ ID NR. 1 festgelegten Sequenz entspricht, und (b) Amplifizieren eines cDNA-Inserts, das in einem Klonierungsvektor vorhanden ist, indem der Oligonucleotid-Primer von Schritt (a) verwendet wird sowie ein Primer, der die Sequenzen des Klonierungsvektors repräsentiert, worin das amplifizierte cDNA-Insert ein pilzliches DS-Enzym codiert.
  14. Verfahren zum Evaluieren mindestens einer chemischen Verbindung auf ihre Fähigkeit zum Hemmen der Aktivität eines pilzlichen DS-Enzyms, das durch das isolierte Nucleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist, welches Verfahren die Schritte umfasst: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einem chimären Gen, das ein Nucleinsäure-Fragment nach Anspruch 1 aufweist, das ein pilzliches DS-Enzym codiert, wobei das chimäre Gen funktionsfähig mit geeigneten Regulationssequenzen verknüpft ist, (b) Aufziehen der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) unter Bedingungen, die zur Expression des chimären Gens geeignet sind, das zur Erzeugung des pilzlichen DS-Enzyms führt, (c) Kontaktieren der transformierten Wirtszelle mit einer chemischen Verbindung und (d) Vergleichen: (1) der metabolischen Aktivität der transformierten Wirtszelle, die mit der chemischen Verbindung kontaktiert worden ist, mit (2) der metabolischen Aktivität der transformierten Wirtszelle, die nicht mit der chemischen Verbindung kontaktiert worden ist, worin der Grad der metabolischen Aktivität von Schritt (d)(1), der kleiner ist als der Grad der metabolischen Aktivität von Schritt (d)(2), zeigt, dass die chemische Verbindung potentiell als eine chemische Substanz zum Pflanzenschutz verwendbar ist.
  15. Verfahren zum Evaluieren mindestens einer chemischen Verbindung auf ihre Fähigkeit zum Hemmen der Aktivität eines pilzlichen DS-Enzyms, das durch das isolierte Nucleinsäue-Fragment nach Anspruch 1 codiert ist, welches Verfahren die Schritte umfasst: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einem chimären Gen, aufweisend ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment nach Anspruch 1, das ein pilzliches DS-Enzym codiert, wobei Gen funktionsfähig mit geeigneten Regulationssequenzen verknüpft ist, (b) Aufziehen der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) unter Bedingungen, die zur Expression des chimären Gens geeignet sind, das zur Erzeugung des pilzlichen DS-Enzyms Fuhrt, (c) Wahlweise Reinigen des pilzlichen DS-Enzyms, das durch die transformierte Wirtszelle exprimiert ist, (d) Kontaktieren des pilzlichen DS-Enzyms mit einer chemischen Verbindung und (e) Vergleichen: (1) der Aktivität des pilzlichen DS-Enzyms, das mit der chemischen Verbindung kontaktiert worden ist, mit (2) der Aktivität des pilzlichen DS-Enzyms, das nicht mit der chemischen Verbindung kontaktiert worden ist, wobei der Grad der Aktivität von Schritt (e)(1), der kleiner ist als der Grad der Aktivität von Schritt (e)(2), zeigt, dass die chemische Verbindung potentiell als eine chemische Substanz zum Pflanzenschutz verwendbar ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin das isolierte Nucleinsäure-Fragment mit der Sequenz in Sequenz ID NR. 1 korrespondiert und worin das pilzliche DS-Enzym-Fragment mit der Sequenz in Sequenz ID NR. 2 korrespondiert.
  17. Pflanze, enthaltend das chimäre Gen nach Anspruch 6.
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