DE19754929A1 - Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese und Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 5-Aminolävulinsäure Synthese - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, die Verwendung von Nukleinsäuremolekülen kodierend für ein Protein mit der Funktion einer 5-Aminolävulinsäure Synthase (ALAS) zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der ALAS, Effektoren der ALAS und die Verwendung von Effektoren der ALAS, insbesondere die Verwendung von herbizid wirksamen Inhibitoren der pflanzlichen ALAS in Pflanzenkulturen, vorzugsweise in transgenen Pflanzenkulturen.

Der Einsatz von Herbiziden zur Kontrolle von unerwünschtem Pflanzenwuchs auf landwirtschaftlichen Kulturflächen ist in der modernen Landwirtschaft weit verbreitet. Trotz des Einsatzes von Herbiziden ist eine effiziente Kontrolle von Unkräutern und Schadpflanzen nicht immer zufriedenstellend möglich, da hochwirksame Herbizide mit einem breiten Wirkungsspektrum oft eine Unverträglichkeit bei Nutzpflanzen aufweisen oder auch die Entstehung von Resistenzphänomenen beobachtet werden kann.

Diese Nachteile versuchte man bisher durch Nutzpflanzen zu umgehen, die gegenüber nicht selektiv wirksamen Herbiziden tolerant sind. Die Herbizidtoleranz kann erzeugt werden, indem das pflanzliche Enzym, welches durch das ausgewählte Herbizid inhibiert wird, derart verändert wird, daß es weniger empfindlich gegenüber dem herbiziden Wirkstoff ist. Beispielsweise werden in der WO 95/3459 Pflanzen beschrieben, die Gene von Varianten der Protoporphyrinogen Oxidase exprimieren und dadurch eine erhöhte Toleranz gegenüber herbiziden Diphenylethern und anderen Inhibitoren der pflanzlichen Protoporphyrinogen Oxidase besitzen.

Herbizidtoleranz wurde ebenfalls durch die Einführung von Enzymen auf gentechnologischem Wege in den Stoffwechsel von Kulturpflanzen erreicht, welche den applizierten herbiziden Wirkstoff deaktivieren können (z. B. EP-A-0 242 236; EP-A-0 343 100).

Es ist auch bereits bekannt, daß die Biosynthese von 5-Aminolävulinsäure (ALA) der geschwindigkeitsbestimmende und regulierende Stoffwechselschritt für die Synthese von Porphyrinen in Pflanzen, Tieren, Pilzen und Bakterien ist. Bei Pflanzen und den meisten Prokaryonten, mit Ausnahme der alpha-Gruppe der Purpurbakterien, wird ALA über den sogenannten C5-Stoffwechselweg aus Glutamat hergestellt. Der C5-Stoffwechselweg (C5-Weg) besteht aus drei Reaktionsschritten, katalysiert durch die Enzyme Glutamyl-tRNA Synthetase (EC 6.1.1.17), Glutamyl-tRNA Reduktase (EC 1.2.1.-.) und Glutamat-1-semialdehyd Aminotransferase (GSAAT, EC 5.4.3.8.) und ist bei Pflanzen in den Plastiden lokalisiert.

Die GSAAT wurde aus verschiedenen Organismen isoliert und die Strukturgene des Enzyms kloniert, z. B. aus den Pflanzen Arabidopspis thaliana, Tabak, Gerste und Sojabohne.

Die pflanzliche GSAAT kann durch heterologe Expression ihrer cDNA rekombinant produziert werden (Berry-Lowe et al. (1992) Plant Physiol. 99: 1597-1603).

Die GSAAT wird durch 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure inhibiert. Nach Applikation von 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure können die behandelten Pflanzen keine ALA und somit auch nicht mehr die Porphyrinverbindungen Chlorophyll, Häm und Sirohäm synthetisieren (Beale (1990) Plant Physiology 93: 1273-1279). Solche Pflanzen entwickeln stark chlorotisches Gewebe, welches im Licht zerstört wird.

Ein alternativer Biosyntheseweg zur Herstellung von ALA existiert in Tieren, Pilzen, Hefen und den Purpurbakterien der alpha-Gruppe, z. B. Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus. Bei diesem als Shemin-Stoffwechselweg bezeichneten Syntheseweg werden Succinyl-CoA und Glycin in einem einzigen Reaktionsschritt, katalysiert durch das Enzym 5-Aminolävulinsäure Synthase (ALAS, EC 2.3.1.37.), zu ALA Ikondensiert (Kikuchi et al. (1958) Journal of Biological Chemistry 233: 1214-1219). Bei Eukaryonten laufen die Reaktionsschritte des Shemin-Stoffwechselweges in den Mitochondrien ab.

Die ALAS wurde aus einer Vielzahl von Organismen isoliert. Das Strukturgen der ALAS wurde unter anderem auch aus Saccharornyces cerevisiae, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, dem Menschen und der Maus isoliert.

Als erstes Enzym des Shemin Tetrapyrrol-Biosyntheseweges wurde die ALAS schon früh bezüglich ihrer Regulation auf Transkriptions- und auf Enzymaktivitäts-Ebene untersucht (Lascelles (1968) Eliochem. Soc. Symp. 28: 49-59, Garnick et al. (1975) Journal of Biological Chemistry 250: 9215-9225). Insbesondere bei prokaryontischen 5-Aminolävulinat Synthasen wurde festgestellt, daß Häm ein wichtiger direkter feedback-Regulator der enzymatischen Aktivität ist.

Es wurde nun gefunden, daß man Pflanzen herstellen kann, die überraschenderweise resistent gegenüber herbizid wirksamen Inhibitoren des C5- Stoffwechselweges sind, z. B. gegen Inhibitoren der GSAAT, wenn man ein heterologes ALAS-Gen in Kulturpflanzen substitutiv oder komplementierend exprimiert, so daß man nicht selektiv wirksame Inhibitoren des C5- Stoffwechselweges als Herbizide in besagten transgenen Nutzpflanzenkulturen einsetzen kann.

Mit der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese bereitgestellt, in welchen der durch ein Herbizid spezifisch inhibierte Stoffwechselweg durch eine die Hemmung komplementierende oder substituierende, heterologe Genexpression umgangen wird. Für eine geeignete Komplementierung oder Substitution werden die Pflanzen mittels eines oder mehrerer heterologer Nukleinsäuremoleküle mit einem oder mehreren zusätzlichen oder alternativen Biosyntheseschritten ausgestattet, die zu dem Endprodukt des inhibierten Stoffwechselweges führen, so daß eine Resistenz der transgenen Pflanze gegenüber dem herbizid wirksamen Inhibitor des C5-Stoffwechselweges resultiert.

In Pflanzen verläuft die Biosynthese von ALA ausschließlich über den im Chloroplasten lokalisierten C5-Weg. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß transgene Pflanzen, welche eine heterologe ALAS-Aktivität enthalten, unabhängig von der Aktivität des C5-Weges Aminolävulinsäure für die Chlorophyll- und Hämbiosynthese produzieren können.

Dieser alternative Stoffwechselweg verleiht den transgenen Pflanzen, die über eine ALAS-Aktivität verfügen, die erwünschte Resistenz gegenüber nichtselektiven Herbiziden, welche die Bildung der Aminolävulinsäure innerhalb des C5-Wegs inhibieren, z. B. durch Hemmung des Enzyms GSAAT, indem der durch den herbiziden Wirkstoff blockierte Stoffwechselschritt umgangen wird. Eine Resistenz mittels der heterologen ALAS-Aktivität ist somit in den transgenen Pflanzen ebenfalls gegenüber Inhibitoren der Glutamyl-tRNA Synthetase und der Glutamyl­ tRNA Reduktase zu erhalten.

Erfindungsgegenstand ist daher ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, enthaltend ein oder mehrere funktionell aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, die nach einem an sich bekannten Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, Pflanzenteile, Pflanzensamen oder Vermehrungsguts stabil in das pflanzliche Genom integriert sind.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls (NS) kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Purpurbakterien, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, vorzugsweise zur Expression eines Proteins mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus in transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen oder auch bevorzugt zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, deren Expression eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT oder eines aktiven Fragments daraus supprimiert oder inhibiert ist.

Für die Herstellung von transgenen Pflanzen, die in der Lage sind, mittels des Shemin-Stoffwechselweges ALA herzustellen, können verschiedene literaturbekannte Gene kodierend für Proteine mit ALAS-Aktivität eingesetzt werden.

Die Einführung einer heterologen ALAS-Aktivität in Pflanzen unter Verwendung der cDNA der ALAS aus Saccharomyces cerevisiae (Seq. ID Nr. 4) wurde bereits von Zavgorodnyaya et al. beschrieben (1997, Plant Journal 12: 169-178).

Neben dem Einsatz der Gene kodierend für ALAS aus Hefe sind jedoch alle Nukleinsäuresequenzen kodierend für Proteine mit ALAS-Aktivität geeignet, die abgeleitet sind aus Aminosäuresequenzen von Proteinen mit ALAS-Aktivität oder deren Genen aus prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen, z. B. Tieren, Pilzen (Hefen) und Bakterien, vorzugsweise von feedback-regulierten ALAS oder deren aktiver Fragmente, z. B. die ALAS aus den Purpurbakterien der alpha-Gruppe wie Rhodobacter sphaeroides, Seq. ID Nr. 1 oder Seq. ID Nr. 2, (Neidle & Kaplan (1993) Journal of Bacteriology 175: 2292-2303) oder Rhodobacter capsulatus, Seq. ID Nr. 3 (Hornberger et al. (1990) Mol. Gen. Genet 221: 371-378).

Die Syntheserate von ALA in der Pflanze muß ausreichend sein, um den Bedarf an ALA für die physiologisch notwendige Porphyrinbiosynthese sicherzustellen. Die Produktion von ALA darf jedoch andererseits nicht so hoch liegen, daß eine direkte oder indirekte Schädigung der Pflanze erfolgt. Deshalb wird der C5-Biosyntheseweg für ALA in Pflanzen reguliert.

In ähnlicher Weise muß in den transgenen Pflanzen, welche eine heterologe ALAS- Aktivität enthalten, gewährleistet sein, daß die Synthese von ALA keine schädlichen Folgen für die Pflanzen bewirkt.

Eine derart balancierte Synthese von ALA kann z. B. auf folgende Weise gewährleistet werden, so daß der Begriff "feedback-reguliert" im Zusammenhang mit der biologischen Aktivität der ALAS wie nachstehend erläutert zu verstehen ist:
Zum einen können bevorzugt Nukleinsäuren (NS) kodierend für Proteine mit ALAS- Aktivität, die eine ausgeprägte Feedback-Regulation durch Häm aufweisen, zur Transformation von Pflanzen eingesetzt werden. Häm ist neben Chlorophyll ein wesentliches aus ALA gebildetes Produkt. Die Syntheserate von Häm ist wie die Synthese aller anderen Tetrapyrrole an die Bereitstellung von ALA gekoppelt und spiegelt somit die Synthesekapazität für das Intermediat ALA und damit indirekt auch den möglichen Substratfluß in die Chlorophyllbiosynthese wider.

Zur heterologen Expression feedback-regulierter Enzyme mit ALAS-Aktivität in Pflanzen sind daher beispielsweise, aber nicht ausschließlich, ALAS-kodierende NS aus Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus und anderen Purpurbakterien der alpha-Gruppe geeignet.

Die Feedback-Regulation der enzymatischen Aktivität einer heterologen ALAS kann in der pflanzlichen Zelle beispielsweise in Plastiden und in den Mitochondrien erfolgen, da in diesen Organellen ausgehend von 5-Aminolävulinat (ALA) die regulatorisch aktiven Verbindungen, beispielsweise Häm, gebildet werden. Deshalb ist es besonders vorteilhaft, eine heterologe NS kodierend für ein Feedback­ reguliertes Protein mit ALAS-Aktivität derart zu exprimieren, daß die funktionell intakten Expressionsprodukte (ALAS) in den Plastiden oder Mitochondrien vorliegen.

In Mitochondrien synthetisierte ALA kann durch die in der Pflanze vorhandenen Transportsysteme in die Plastiden exportiert werden, in denen die Enzyme der sich anschließenden Tetrapyrrolbiosynthese lokalisiert sind.

Die Lokalisierung einer ALAS in Plastiden kann z. B. dadurch erreicht werden, daß eine NS kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität unter Kontrolle eines in Plastiden aktiven Promotors nach den dem Fachmann bekannten Methoden in das Plastom einer Pflanze eingefügt wird. Als Promotoren stehen dabei alle in Plastiden konstitutiv aktiven Promotoren zur Verfügung, vorzugsweise z. B. die Expressions- Signalsequenzen der psbA-Kassette (Staub & Maliga (1993) EMBO Journal 12: 601606; Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22: 3819-3824) und der Prrn Promotor (Svab & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917).

Die Promotoren können z. B. nach bekannten Methoden zusammen mit der heterologen NS kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS in das Plastom insertiert werden oder die heterologe NS wird derart in das Plastom inseriert, daß es unter Kontrolle eines bereits vorhanden Promotors steht (Staub & Maliga (1995) Plant Journal 7: 845-848).

Des weiteren kann eine plastidäre Lokalisierung einer ALAS auch erreicht werden, indem die ALAS zunächst im Cytoplasma mit einer geeigneten plastidären Targetingsequenz (Transitpeptid) synthetisiert und während oder nach ihrer Synthese in den Plastiden importiert wird. Hierfür stehen dem Fachmann zahlreiche Promotoren, plastidäre Targetingsequenzen und Fusionsstrategien für NS kodierend für eine Targetingsequenz und NS kodierend für ein Protein mit ALAS- Aktivität zur Verfügung.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung können alle Promotoren eingesetzt werden, die in der Lage sind, in Pflanzen die Transkription von DNA-Sequenzen zu bewirken. Solche Promotoren sind vorzugsweise abgeleitet aus dem Genom von Pflanzen oder pflanzenpathogienen Viren, z. B. der CaMV35S Promotor sowie dessen Derivate, vorzugsweise aus dem Plastom von Pflanzen. Der eingesetzte Promotor muß ein Expressionsniveau des ALAS-Gens ermöglichen, welches ausreicht, um der transgenen Pflanze eine Resistenz gegenüber Inhibitoren des C5- Biosyntheseweges für ALA zu vermitteln.

Die NS kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität wird bevorzugt unter Kontrolle eines Promotors als Fusion mit einer DNA-Sequenz kodierend für ein plastidäres Transitpeptid kloniert, so daß das primäre Translationsprodukt N-terminal mit einem plastidären Transitpeptid versehen ist und in Plastiden importiert wird. Als plastidäre Transitpeptide werden dabei bevorzugt solche Peptidsequenzen verwendet, welche als N-terminale Fusion die Translokation von Polypeptidketten aus dem Cytoplasma in Plastiden bewirken und während oder nach diesem Prozeß abgespalten werden. Besonders bevorzugt sei als Transitpeptid für Proteine mit ALAS-Aktivität das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat Carboxylase genannt.

Die Lokalisierung einer ALAS in Mitochondrien kann erreicht werden, indem das Protein zunächst im Cytoplasma mit einer geeigneten mitochondrialen Targetingsequenz synthetisiert und während oder nach seiner Synthese in das Mitochondrium importiert wird. Hierfür stehen dem Fachmann ebenfalls zahlreiche Promotoren, mitochondriale Targetingsequenzen und Fusionsstrategien für Sequenzen kodierend für eine Targetingsequenz und Sequenzen kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität zur Verfügung.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung können die gleichen Promotoren eingesetzt werden, die für die Lokalisierung der Expressionsprodukte im Plastiden beschrieben wurden.

Die NS kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität wird bevorzugt unter Kontrolle eines Promotors als Fusion mit einer DNA-Sequenz kodierend für ein mitochondriales Transitpeptid kloniert, so daß das primäre Translationsprodukt N-terminal mit einem mitochondrialen Transitpeptid versehen ist und in Mitochondrien importiert wird.

Als mitochondriale Transitpeptide werden dabei bevorzugt solche Peptidsequenzen verwendet, welche als N-terminale Fusion die Translokation von Polypeptidketten aus dem Cytoplasma in Mitochondrien bewirken und während oder nach diesem Prozeß abgespalten werden.

Daher ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5- Aminolävulinsäure-Biosynthese enthaltend ein oder mehrere funktionell aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, in dem besagte Nukleinsäuremoleküle unter der Kontrolle eines feedback-regulierten Promotors stehen sowie die Verwendung eines feedback-regulierten Promotors, vorzugsweise eines Promotors einer pflanzlichen GSAAT oder Glutamyl-tRNA Reduktase in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen oder Pflanzen mit veränderter 5- Aminolävulinsäure-Biosynthese.

Zum anderen ist es besonders vorteilhaft, das ALAS-Gen unter Kontrolle eines in Pflanzen spezifisch regulierten Promotors zu klonieren, um eine gezielte, feedback­ regulierte Expression zu erreichen. Dazu eignen sich beispielsweise die Promotoren der Enzyme der pflanzlichen Porphyrinbiosynthese, vorzugsweise die Promotoren der Gene kodierend für Glutamyl-tRNA Reduktase und GSAAT, z. B. durch Verwendung von Promotorsequenzen die im Bereich von ca. 2 kb (kilobasen) langen, strangaufwärts gelegenen (in 3'-Richtung) Nukleinsäureabschnitten der kodierenden Bereiche besagter Gene liegen. Unter der Kontrolle eines dieser Promotoren kann erreicht werden, daß die NS kodierend für ein heterologes Protein mit ALAS-Aktivität ebenso wie die pflanzlichen Gene kodierend für Glutamyl-tRNA Reduktase und GSAAT nur bei einem physiologischen Bedarf an ALA exprimiert wird.

Darüber hinaus ist auch die kombinierte Verwendung einer NS kodierend für eine auf Protein- und Genexpressionsebene feedback-regulierter ALAS besonders vorteilhaft, d. h. sowohl ein ALAS-Protein zu exprimieren, daß eine feedback­ regulierte enzymatische Aktivität aufweist, als auch die Genexpression der feedback-regulierten ALAS unter die Kontrolle eines feedback-regulierten Promotors zu stellen.

NS kodierend für Proteine mit ALAS-Aktivität können aus tierischen, pilzlichen oder geeigneten bakteriellen Organismen isoliert oder synthetisch hergestellt werden. Die Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise mittels gängiger molekularbiologischer Methoden (Ausübel et al. in "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-X) ausgehend von DNA oder RNA aus dem jeweiligen Spenderorganismus kloniert werden. Die NS können mittels gängiger molekularbiologischer Methoden auch in vielfältiger Weise in ihrer Sequenz abgeändert, verkürzt oder erweitert werden, so daß eine Derivatisierung, z. B. durch Mutation, Deletion, Substitution oder Insertion erfolgen kann.

Gegenstand der Erfindung sind auch nicht-natürlich vorkommende chimäre Gene, mindestens enthaltend einen für die Expression einer ALAS in Pflanzen geeigneten Promotor, der funktionell mit einem DNA-Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon fusioniert ist.

Gegenstand der Erfindung sind auch rekombinante Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes nicht-natürlich vorkommendes chimäres Gen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pflanzlichen Zellen gewährleisten.

Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem DNA- Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon oder einem erfindungsgemäßen chimären Gen oder Vektor transformiert und/oder genetisch modifiziert sind, sowie Zellen, die von derart transformierten und/oder modifizierten Zellen abstammen, die ein erfindungsgemäß zu verwendendes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßes Gen oder Vektor enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzen, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, z. B. herstellbar nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, enthaltend ein DNA- Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon insbesondere Nutz- oder Zierpflanzen.

Derartige Pflanzenzellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäß zu verwendende(s) Nukleinsäuremolekül(e), wobei diese(s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor.

Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens ein erfindungsgemäßes chimäres Gen enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt, oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung.

Zur Transformation von Pflanzen werden geeignete NS-Konstrukte hergestellt, die eine translatierbare Sequenz kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität enthalten.

Dem in der Pflanzenbiotechnologie erfahrenen Fachmann stehen vielfältige Techniken zur Verfügung, um geeignete DNA-Konstrukte zur Expression eines heterologen Gens in Pflanzen herzustellen und Pflanzen mit diesem DNA-Konstrukt zu transformieren. Derartige DNA-Konstrukte werden bevorzugt durch Klonierung einer DNA-Sequenz kodierend für ALAS unter Kontrolle eines pflanzlichen Promotors in einem Pflanzen-Transformationsvektor hergestellt. Besonders bevorzugt sind hierfür binäre Pflanzen-Trnnsformationsvektoren wie z. B. pBIB oder pPCV801 und deren Derivate geeignet.

Das Gen kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität kann auch ohne eine DNA- Sequenz kodierend für ein N-terminales plastidäres oder mitochondriales Targetingpeptid unter Kontrolle eines in Pflanzen aktiven Promotors in das pflanzliche Genom insertiert werden, so daß das primäre Translationsprodukt direkt im Cytoplasma zum aktiven Protein exprimiert wird.

Mit einem der oben beschriebenen DNA-Konstrukte, welches zur funktionellen Expression eines Gens kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität in Pflanzen geeignet ist, werden Pflanzenzellen oder Plastiden transformiert. Bevorzugt wird dazu eine der gängigen gentechnologischen Methoden zur Transformation von Pflanzen (beispielsweise Potrykus & Spangenberg (Eds.) "Gene Transfer to Plants" (1995) Springer-Verlag ISBN 3-540 58406-4) oder Plastiden (beispielsweise Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22: 3819-1824) eingesetzt.

Ebenfalls ein Erfindungsgegenstand ist daher ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5- Aminolävulinsäure-Biosynthese enthaltend ein oder mehrere funktionell aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, in dem besagte Nukleinsäuremoleküle durch Plastidentransformation stabil in das pflanzliche Plastom integriert werden.

Als Empfänger-Pflanzen für ein heterologes Gen kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität kommen alle landwirtschaftlich wichtigen monokotylen und dikotylen Kulturpflanzen in Betracht, in denen herbizide Inhibitoren des C5- Stoffwechselweges zur Kontrolle unerwünschter Begleitvegetation eingesetzt werden können, vorzugsweise Mais und andere Getreide, wie beispielsweise Weizen, Roggen, Gerste, Hirse und Reis sowie Baumwolle, Tabak, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Kartoffeln, Raps, Sonnenblumen und Sojabohnen.

Bei der Expression der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, kann die kodierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106).

Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutz- oder Zierpflanzen wie z. B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Reis, Mais), Obst- und Gemüsearten, Maniok, Kartoffel, Soja, Zuckerrübe etc.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Zur Expression der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in sense-Orientierung in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.

Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Geeignete Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine sink-spezifische Expression (z. B. Kartoffelknollen, Rüben, Tomatenfrucht) oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), alle in Plastiden konstitutiv aktiven Promotoren z. B. die Expressions-Signalsequenzen der psbA-Kassette (Staub & Maliga (1993) EMBO Journal 12: 601-606; Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22: 3819-3824) und der Prrn Promotor (Svab & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917) oder für eine endosperm­ spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais. Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind im allgemeinen beliebig austauschbar.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli- Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Cha­ rakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-mole­ kularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, das Einbringen von DNA mittels der biolistischen Methode etc.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. PUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid enthalten, das eine vir-Region trägt. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig; zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist ausreichend in EP 120 516 beschrieben worden; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 146 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimenden Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould et al.:, Plant Physiol. 95(1991), 426-434; Mooney et al., Plant Cell Tiss. & Org. Cult. 25(1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

Drei der oben genannten Transformationssysteme konnten in der Vergangenheit für verschiedene Getreide etabliert werden: die Elektroporation von Gewebe, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikel-Beschluß in regenerierbare Gewebe und Zellen (Jähne et al., Euphytica 85 (1995), 35-44).

Die Transformation von Weizen wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (zur Übersicht: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178), vgl. auch Hess et al. (Plant Sci. 72 (1990), 233), Vasil et al. (Bio/Technology 10 (1992), 667-674), Weeks et al. (Plant Physiol. 102 (1993), 1077-1084) sowie Becker et al. (Plant J. 5 (2) (1994), 299-307).

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid, wie Phosphinothricin, oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin oder Hygromycin u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Des weiteren wurde gefunden, daß man herbizide Inhibitoren des pflanzlichen C5- Weges finden kann, wenn man den Einfluß einer chemischen Verbindungen auf die Aktivität der pflanzlichen GSAPT bestimmt und in Einzel- oder Reihenuntersuchungen chemisch diverse Verbindungen durchmustert. Durch geeignete Automatisierung des GSAAT-Aktivitätstests läßt sich auf diese Weise eine große Anzahl von Verbindungen untersuchen.

Erfindungsgegenstand ist daher auch ein Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung einer Testsubstanz bezüglich der Aktivität einer GSAAT, worin man

• a) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Abwesenheit einer Testsubstanz bestimmt;
• b) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Anwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; und
• c) die unter a) und b) ermittelten enzymatischen Aktivitäten vergleicht.

Das Verfahren ist geeignet, spezifische Inhibitoren oder Aktivatoren (d. h. Effektoren) der enzymatischen Aktivität der GSAAT aufzufinden, so daß u. a. Stoffe identifiziert werden können, welche eine potentielle herbizide bzw. wachstumshemmende, aber auch wachstumsfördernde Wirkung besitzen. Die zu untersuchende chemische Verbindung wird dabei bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10^-9 M und 10^-3 M, und besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10^-7 M und 10^-4 M eingesetzt.

Die Quantifizierung der Enzyminhibition oder Enzymaktivierung (d. h. der effektorischen Wirkung) kann durch einen einfachen Vergleich der katalytischen Aktivität der GSAAT in Abwesenheit und in Anwesenheit der zu untersuchenden Testsubstanz unter ansonsten identischen Testbedingungen in einer dem Fachmann bekannten Weise geschehen.

Zur Bestimmung der Aktivität der GSAAT können verschiedene biochemische Meß- Methoden eingesetzt werden, durch die entweder die Entstehung der Reaktionsprodukte der von der GSAAT katalysierten Reaktion, z. B. ALA, oder aber eine Abnahme der Konzentration der Enzymsubstrate wie Glutamatsemialdehyd gemessen werden, z. B. durch eine Endpunktsbestimmung oder nach enzymatischer Umsetzung der Substrate, die gegebenenfalls radioaktiv markiert oder mit anderen gängigen Markern versehen waren oder durch nachgeschaltete Reaktionen nachgewiesen werden können, z. B. durch gekoppelte enzymatische Reaktionen.

Dem in der Durchführung von Enzymtests erfahrenen Fachmann stehen hierfür viele Standardmethoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten zur Verfügung (s. z. B. Bergmeyer, H.U., Methoden der enzymatischen Analyse, Band 1 und 2, Verlag Chemie, Weinheim (1974), Suelter, C.H., Experimentelle Enzymologie: Grundlagen für die Laborpraxis, Fischer Stuttgart (1990)).

Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung von Testsubstanzen können mit gereinigter GSAAT durchgeführt werden, aber auch mit ganzen Zellen eines rekombinanten Organismus, welcher die GSAAT rekombinant exprimiert, mit GSAAT-haltigen Extrakten aus diesem Organismus oder angereicherten GSAAT-haltigen Fraktionen aus diesem Organismus. Als bevorzugter rekombinanter Wirtsorganismus seien Bakterien-, Insekten- und Hefezellen genannt. Alternativ kann auch eine aus Pflanzengewebe oder Pflanzenzellkulturen isolierte GSAAT verwendet werden.

Erfindungsgegenstand ist daher auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens sowie die Verwendung eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT zur Identifizierung von Effektoren der GSAAT, vorzugsweise in einem automatisierten Verfahren, z. B. in einem sog. "highthrouput screening", dessen Voraussetzung die Automatisierbarkeit des Verfahrens zur Aktivitätsbestimmung des Enzyms zur Voraussetzung hat.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind daher mittels der erfindungsgemäßen Verfahren identifizierbare Effektoren, d. h. Aktivatoren oder Inhibitoren der enzymatischen Aktivität der GSAAT, insbesondere pestizid oder herbizid wirksame Effektoren der pflanzlichen GSAAT, speziell Strukturanaloge des Glutamatsemialdehyds, Glutamats oder des 5-Aminolävulinats sowie deren Verwendung als Pestizide oder Herbizide.

Bislang waren neben Gabaculin nur extrem unselektive Inhibitoren der GSAAT bekannt, wie beispielsweise Aminooxyessigsäure. Die bekannten Inhibitoren sind nicht als Herbizide einsetzbar, da sie eine nicht nur für Pflanzen hohe Toxizität aufweisen. Erst die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren des pflanzlichen C5- Stoffwechselweges für 5-Aminolevulinsäure, welche als Herbizide in der Landwirtschaft eingesetzt werden können, läßt die Herstellung transgener Kulturpflanzen mit Resistenz gegenüber Inhibitoren des C5-Weges vorteilhaft und ökonomisch sinnvoll erscheinen.

Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der GSAAT stehen eine Reihe von geeigneten Verfahren zur Verfügung, bei denen man eine GSAAT in einem geeigneten Reaktionspuffer unter geeigneten Reaktionsbedingungen bezüglich Reaktionstemperatur und pH-Wert mit einem geeigneten Substrat, wie z. B. Glutamat-1-Semialdehyd (GSA), inkubiert. Bevorzugt wird zur Identifikation wirksamer Enzyminhibitoren dabei die GSAAT aus Pflanzen verwendet, besonders bevorzugt die GSAAT aus Arabidopsis thaliana (Seq. ID Nr. 5) oder Hordeum vulgare (Seq. ID Nr. 6). Die GSAAT kann in einer dem Fachmann bekannten Weise entweder aus den entsprechenden Pflanzen isoliert werden oder auch ausgehend von literaturbekannter cDNA rekombinant in transgenen Wirtszellen produziert werden.

Anstelle von Glutamat-1-Semialdehyd können als Substrate auch andere Verbindungen, wie z. B. 4,5-Diaminovaleriansäure, 4,5-Dioxovaleriansäure und insbesondere Mischungen dieser Verbindungen verwendet werden. Die enzymatische Reaktion kann dabei durch Zusatz von Pyridoxalphosphat oder Pyridoxaminphosphat beeinflußt werden.

Eine geeignete, beispielhafte Ausführungsform des GSAAT-Aktivitätstests ist im folgenden dargestellt, die insbesondere auch für eine automatisierte Ausführung des GSAAT-Tests geeignet ist:
Glutamat-1-Semialdehyd kann in einem Reaktionspuffer im pH-Bereich von pH 6 bis pH 8 von einem Enzym mit GSAAT-Aktivität zu 5-Aminolevulinsäure umgesetzt werden. Die 5-Aminolevulinsäure kann dann mittels zweier Derivatisierungsschritte nachgewiesen werden. Zunächst wird dazu der Lösung eine Verbindung der allgemeinen Formel R-CO-CH₂-CO-R', wie beispielsweise Acetylaceton, Acetoessigsäure, Amide und Salze der Acetoessigsäure, Acetoessigsäureester (Methylester, Ethylester, Isopropylester, u. a.) oder Derivate dieser Verbindungen, in mindestens zehnfachem molarem Überschuß zu der erwarteten Menge an 5- Aminolevulinsäure zugesetzt. Die Mischung wird dann beispielsweise für einige Minuten erhitzt (80°C bis Siedepunkt der Mischung) oder für 1 min oder länger bei 12°C bis 80°C inkubiert. Während dieser Inkubationszeit findet eine Kondensationsreaktion zwischen der Aminolevulinsäure und der zugesetzten Verbindung unter Ausbildung eines Pyrrolderivates statt. Anschließend wird die Konzentration des Pyrrolderivates beispielsweise durch Zugabe von Ehrlichs Reagenz (beispielsweise 1 Volumen) bestimmt. Bei dieser Detektionsmethode bildet das Pyrrolderivat mit dem 4-Diaminobenzaldehyd in Ehrlichs Reagenz einen farbigen Komplex, dessen Konzentration photometrisch durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden kann. Eine geeignete Wellenlänge zur Absorptionsbestimmung liegt z. B. zwischen 530 und 550 nm. Die enzymatisch gebildete Menge an 5-Aminolevulinsäure kann anhand einer Eichreihe mit 5- Aminolevulinsäure-Lösungen bekannter Konzentrationen, welche in gleicher Weise derivatisiert werden, errechnet werden.

Die geeigneten Zusammensetzungen der Reagenzien oder die Konzentrationen von Salzen, Substraten und Proteinen, die pH-Werte, die Temperaturen, die Ansatzvolumina und die Wellenlängen zur Messung oder bei der Detektion können dabei in weiten Bereichen variieren.

Mittels eines GSAAT-Aktivitätstests kann ein Fachmann auf vielfältige, bekannte Weise die effektorischen, d. h. aktivatorischen oder inhibitorischen Eigenschaften chemischer Verbindungen auf die Aktivität der GSAAT bestimmen.

Zur Überprüfung der Wirkung eines GSAAT Inhibitors auf Pflanzen in vivo stehen dem Fachmann vielfältige Methoden zur Verfügung. Die zu untersuchenden Substanzen (z. B. definierte chemische Verbindungen, aber auch heterogene Stoffgemische) werden Pflanzen appliziert, wobei verschiedenste Hilfsstoffe, wie beispielsweise Netzmittel oder Lösungsmittel, verwendet werden können. Nach der Applikation der zu untersuchenden Substanzen werden die Pflanzen bonitiert. Substanzen, welche eine Pflanze durch selektive Inhibition der GSAAT oder des C5-Stoffwechselweges schädigen, rufen mindestens ein charakteristisches Symptom hervor. Häufig entstehen nach Applikation Chlorosen, die bei dem neugebildeten Gewebe besonders ausgeprägt sein können, und die beispielsweise durch Lichteinwirkung in Nekrosen übergehen können. Weitere Symptome können eine Depression des Wachstums oder auch ein sehr rasches Absterben der Pflanze sein. Die Symptome variieren je nach Pflanzenspezies in Abhängigkeit von deren unterschiedlicher Empfindlichkeit und in Abhängigkeit der Eigenschaften des Inhibitors.

Die nachfolgenden Beispiele sollen der näheren Erläuterung der Erfindung dienen und bedeuten in keiner Weise eine Einschränkung.

Beispiel 1 Gentechnische Produktion und Reinigung der GSAAT

Die mature GSAAT aus Hordeum vulgare wird mittels der Sequenz ID Nr. 7 gentechnisch in Escherichia coli hergestellt. Dazu wird der Escherichia coli Stamm TG1 (Gibson (1984) PhD Thesis, Cambridge, UK) gleichzeitig mit dem Expressionsplasmid pATE19 (Berry-Lowe et al. (1992) Plant Physiology 99: 1597-1603) und dem Plasmid pGroESL (Goloubinoff et al. (1989) Nature 337: 44-47) transformiert. Transformierte Klone werden stets in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) mit 100 mg/l Ampicillin und 30 mg/l Chloramphenicol kultiviert.

100 ml Medium werden mit einem TG1/pATE19/pGroESL Klon angeimpft und für 14 h bei 37°C unter Schütteln in einem Kulturkolben inkubiert. Mit dieser Kultur werden 5 l Medium angeimpft und in Kulturkolben bei 37°C unter Schütteln bis zu einer Optischen Dichte von OD₅₅₀ = 0,5 herangezogen. Dann wird sofort Isopropyl-b-D-thio-galacto­ pyranosid zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt. Gleichzeitig wird die Inkubationstemperatur auf 28°C reduziert. Nach weiteren 16 h Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugation (4200 g, 20 min, 4°C) geerntet. Das Zellsediment wird in 150 ml Puffer A (50 mM Tricin/NaOH pH 7,9, 25 mM MgCl₂) resuspendiert. Die Zeilen werden dann mittels drei Passagen durch den French Press-Homogenisator (French Pressure Cell Press und 35 ml Aufschlußzelle von SLM Instruments, Inc., Rochester NY 14625 USA) bei 16000 psi und 4°C aufgeschlossen. Das Homogenisat wird anschließend für 30 min bei 25000 g und 4°C zentrifugiert. Der klare Überstand wird einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen.

Zur Chromatographie wird eine DEAE-Sepharose Fast Flow Säule (Pharmacia GmbH, Freiburg) mit einem Bettvolumen von 500 ml mit Puffer A äquilibriert. Der klare Überstand der aufgeschlossenen Zellen wird auf diese Säule aufgetragen. Anschließend wird die Säule zunächst mit 250 ml Puffer A und dann mit 1500 ml Puffer B (50 mM Tricin/NaOH pH 7,9, 25 mM MgCl₂, 20 mM NaCl) gespült. Die Elution der rekombinanten GSAAT findet mit 750 ml Puffer C (50 mM Tricin/NaOH pH 7,9, 25 mM MgCl₂, 100 mM NaCl) statt. Das Eluat wird in Fraktionen á 25 ml gesammelt und die Fraktionen, welche funktionelle GSAAT enthalten, werden mittels eines GSAAT-Aktivitätstests an Proben aus den Funktionen ermittelt. Aus 5 l Expressionskultur werden 25 nkat GSAAT erhalten.

Beispiel 2 Bestimmung der enzymatischen Aktivität der GSAAT

Die Aktivität der GSAAT wird durch einen photometrischen Nachweis des derivatisierten Reaktionsproduktes 5-Aminolevulinsäure nachgewiesen. Der Aktivitätstest wird in einer 96-Well Flachboden-Microtiterplatte (F-Form) aus Polystyrol durchgeführt.

In den Vertiefungen der Microtiterplatte (Wells) kann die gewünschte Anzahl an Einzelmessungen parallel durchgeführt werden. Die folgenden Angaben beziehen sich jeweils auf eine Vertiefung der Microtiterplatte (MTP).

Bei einer Temperatur von 20°C werden 100 µl Enzymlösung (25 pkat/ml rekombinante GSAAT aus Hordeum vulgare, 250 mM BisTris/HCl pH 6,5) und 10 µl 25% (v/v) Dimethylsulfoxyd in Wasser vorgelegt. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 5 µl 1,8 mM Glutamat-1-Semialdehyd gelöst in 100 mM HCl gestartet.

Unmittelbar nach dem Start der enzymatischen Reaktion wird der Ansatz für 30 min bei 20°C inkubiert. Anschließend werden sofort 25 µl Acetoessigsäureethylester zugesetzt, der Ansatz gut durchmischt und für 30 min bei 40°C inkubiert. Direkt im Anschluß werden 100 µl Ehrlichs Reagenz (s. u.) zugesetzt und der Ansatz für 30 min bei 20°C inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wird sofort mit Hilfe eines Microtiterplattenphotometers die Absorption der Lösung bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt.

Zur Bestimmung der enzymatisch gebildeten Menge an 5-Aminolevulinsäure wird zunächst der Blindwert (s. u.) von der Absorption des zu bestimmenden Ansatzes abgezogen. Aus dem Differenz aus Meßwert und Blindwert wird mit Hilfe einer Eichreihe die Konzentration an 5-Aminolevulinsäure im Reaktionsansatz zum Zeitpunkt unmittelbar vor Zugabe des Acetoessigsäureethylesters berechnet. Die Eichreihe wird erzeugt, indem jeweils 100 µl verschieden konzentrierter 5- Aminolevulinat-Lösungen in 250 mM BisTris/HCl pH 6,5 zunächst für 30 min bei 20°C inkubiert werden, dann mit 25 µl Acetoessigsäureethylester gemischt und 30 min bei 40°C inkubiert werden, anschließend mit 100 µl Ehrlichs Reagenz versetzt und 30 min bei 20°C inkubiert werden und die Absorption der erhaltenen Lösung sofort mit Hilfe eines Microtiterplattenphotometers bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt wird. Die Konzentration an 5-Aminolevulinsäure in den 100 µl 250 mM BisTris/HCl pH 6,5 wird bei diesem Vorgang in parallelen Ansätzen zwischen 0 µM und 150 µM variiert (0 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM, 50 µM, 100 µM, 150 µM).

Zur Bestimmung eines Blindwertes (s. o.) als Referenz zu dem gemessenen Absorptionswert einer GSAAT-Reaktion wird ein paralleler GSAAT-Aktivitätstest durchgeführt, bei welchem 1.) die enzymatische Aktivität der GSAAT blockiert wurde und der 2.) ansonsten unter den exakt gleichen Bedingungen wie der zu vergleichende Ansatz durchgeführt wurde. Zur Blockierung der GSAAT-Aktivität wird vor Reaktionsstart anstelle von 10 µl 25% (v/v) Dimethylsulfoxyd/Wasser (s. o. ) 10 µl einer Lösung von 10 mM Aminooxyessigsäure in 25% (v/v) Dimethylsulfoxyd/Wasser zusammen mit der Enzymlösung vorgelegt.

Zusammensetzung von Ehrlichs Reagenz:
1 g 4-(Dimethylamino)-benzaldehyd in 30 ml Eisessig lösen und anschließend mit 8 ml 70% Perchlorsäure mischen. Diese Lösung mit Eisessig auf ein Endvolumen von 50 ml bringen.

Beispiel 3 Identifikation von Effektoren der GSAAT

Zur Auffindung neuer Effektoren der GSAAT wird eine Anzahl von unterschiedlichen chemischen Substanzen in bezug auf ihre Wirkung durchmustert. Substanzen oder Verbindungen, welche unter den Bedingungen des GSAAT- Aktivitätstests ungünstige chemisch reaktive Eigenschaften aufweisen, z. B. Alkylierung, Halogenierung, Oxidation, Reduktion oder sonstige unspezifische kovalente Modifizierungen von Proteinen oder den eingesetzten Enzymsubstraten verursachen, sind nicht enthalten. Die Verbindungen werden in einer Konzentration von 100 µM in 25% (v/v) DMSO/Wasser gelöst.

Zur Bestimmung der Wirkung dieser Verbindungen auf die enzymatische Aktivität der GSAAT werden von jeder Verbindung 10 µl der 100 µM Lösung in eine Vertiefung einer 96 Well MTP (s. o.) gegeben. 90 Vertiefungen einer MTP werden auf diese Weise mit Lösungen der zu untersuchenden Verbindungen versehen. Zur Bestimmung der Aktivität der nicht inhibierten GSAAT (Kontrollreaktion) werden 3 Vertiefungen der gleichen MTP mit jeweils 10 µl 25% (v/v) DMSO/Wasser versehen und zur Bestimmung von Blindwerten werden die restlichen 3 Vertiefungen mit jeweils 10 µl einer Lösung von 10 mM Aminooxyessigsäure in 25% (v/v) Dimethylsulfoxyd/Wasser versehen.

Die Lösungen in den Vertiefungen der MTPs werden dann mit je 100 µl Enzymlösung (25 pkat/ml rekombinante GSAAT aus Hordeum vulgare, 250 mM BisTris/HCl pH 6,5) gemischt. Die enzymatische Reaktion wird in allen Vertiefungen einer MTP zeitgleich durch Zugabe von 5 µl 1,8 mM Glutamat-1-Semialdehyd gelöst in 100 mM HCl gestartet. Die weiteren Schritte sind identisch mit der unter Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise nach dem Start der enzymatischen Reaktion. Für jede MTP kann dann aus dem Mittelwert der Meßergebnisse für die Wells mit den Kontrollreaktionen und dem Mittelwert der Wells mit den Blindwerten die Aktivität der nicht inhibierten GSAAT bestimmt werden. Ebenso wird für jedes Well dieser MTP, in welchem eine zu untersuchende Substanz eingesetzt wurde, durch Abzug des Mittelwertes der Blindwerte die GSAAT-Aktivität bestimmt. Durch Vergleich der Aktivität der Aktivität der GSAAT in Anwesenheit einer zu untersuchenden Substanz und der Aktivität in Abwesenheit der zu untersuchende Substanz (Kontrollreaktionen) wird bestimmt, ob die Substanz effektorisch, d. h. hemmend oder aktivierend auf den GSAAT Aktivitätstest wirkt.

Verbindungen, die eine relative Reduktion der GSAAT-Aktivität um mehr als 30% gegenüber den Kontrollreaktionen bewirken, werden als potentielle Effektoren genauer untersucht.

Beispiel 4 Bestimmung der Wirkstärke der GSAAT-Effektoren

Die Wirkstärke eines Effektors der GSAAT wird bestimmt, indem der GSAAT-Test (vgl. Beispiel 2) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Effektors in der Reaktionslösung durchgeführt wird. Dabei werden Konzentrationen von 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM und 300 µM des Effektors eingesetzt. Die Inhibitor-Konstanten werden anhand der aus den gemessenen Werten abgeleiteten Aktivitäten nach den von Bergmeyer ausführlich beschriebenen Methoden berechnet (Grundlagen der enzymatischen Analyse; hrsg. von Hans Ulrich Bergmeyer, Verlag Chemie Weinheim, New York, 1977, ISBN 3-527-256776), die Konstanten für Aktivatoren können in analoger Weise ermittelt werden.

Beispiel 5 Lemna-Test

Die phytotoxische Wirkung von GSAAT-Inhibitoren kann auch in vivo durch Behandlung von Lemna Kulturen festgestellt werden.

Dazu wird Lemna gibba in steriler Kulturlösung (0,4 g/l KNO₃, 0,8 g/l CaCl₂.2 H₂O, 0,366 g/l MgSO₄.7 H₂O, 0,2 g/l KH₂PO₄, 2 ml/l Lösung I (2,23 g/l MnSO₄.4 H₂O, 83 mg/l KJ, 2,5 mg/l CoCl₂.6 H₂O, 0,86 g/l ZnSO₄.7H₂O, 2,5 mg/l CuSO₄.5 H₂O, 0,62 g/l H₃BO₃, 25 mg/l Na₂MoO₄.2 H₂O) und 2 ml/l Lösung II (14,92 g/l Na- EDTA, 10,92 g/l FeSO₄.7 H₂O)) kultiviert. Jeweils 3 Pflanzen werden unter sterilen Bedingungen in die einen 100 ml Erlenmeyerkolben gesetzt, welcher mit 50 ml Kulturlösung enthaltend den GSAAT-Inhibitor in einer Konzentration von 20 µM gefüllt ist. Die Kulturkolben werden bei 25°C im Abstand von 70 cm mit zwei 36 W Tageslicht-Leuchtstoffröhren beleuchtet (24 h Dauerlicht). Das Wachstum und das äußere Erscheinungsbild der Lemna-Pflanzen wird über 7 Tage hinweg beobachtet und mit dem Wachstum und dem äußeren Erscheinungsbild von Lemna-Pflanzen verglichen, die in Kulturlösung ohne Inhibitor unter ansonsten identischen Bedingungen kultiviert werden.

Charakteristisch für die phytotoxische Wirkung eines GSAAT-Inhibitors ist eine Chlorose der neu gebildeten Gewebe. Bei hohen Lichtintensitäten kann auch eine Nekrose des pflanzlichen Gewebes auftreten. Schnell wirkende Verbindungen führen oft schon nach einem Tag zum kompletten Absterben der Pflanzen während die langsamer wirkenden Verbindungen zunächst eine Wachstumsdepression zur Folge haben.

Beispiel 6 Inhibitoren der GSAAT

Mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurde die folgende herbizid wirksame Verbindung A (Hydrazinopropylsulfonsäure, Sulfopropylhydrazin) gefunden:

Verbindung A

Die Verbindung A führt bei einer Konzentration von 6 µM zu einer 50%igen Reduktion der GSAAT-Aktivität.

Im Lemnatest führt Verbindung A innerhalb von 48 h zu Chlorosen und einer Wachstumsdepression der Pflanzen. Nach 72 h sind mehr als 60% der Pflanzen abgestorben.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer 5- Aminolävulinsäure Synthase (ALAS), vorzugsweise einer feedback­ regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Purpurbakterien, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon stabil in das pflanzliche Genom integriert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Purpurbakterien, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon durch Plastidentransformation stabil in das pflanzliche Plastom integriert werden.

3. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Nukleinsäuremoleküle unter der Kontrolle eines feedback-regulierten Promotors stehen.

4. Verwendung eines feedback-regulierten Promotors, vorzugsweise eines Promotors einer pflanzlichen Glutamat-1-semialdehyd Aminotransferase (GSAAT) oder Glutamyl-tRNA Reduktase in einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3.

5. Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback­ regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Purpurbakterien, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen.

6. Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback­ regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Rhodobacter oder eines aktiven Fragments daraus, zur Expression eines Proteins mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus in transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen.

7. Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback­ regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Rhodobacter oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, deren Expression eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT oder eines aktiven Fragments daraus supprimiert oder inhibiert ist.

8. Nicht-natürlich vorkommendes chimäres Gen, mindestens enthaltend einen für die Expression einer ALAS in Pflanzen geeigneten Promotor, vorzugsweise eines feedback-regulierten Promotors, besonders bevorzugt eines Promotors einer pflanzlichen GSAAT oder Glutamyl-tRNA Reduktase, der funktionell verknüpft ist mit einem DNA-Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon.

9. Rekombinanter Vektor, enthaltend ein chimäres Gen gemäß Anspruch 8.

10. Transgene Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzenzelle, mit einem chimären Gen gemäß Anspruch 8 oder einem Vektor gemäß Anspruch 9 transformiert und/oder genetisch modifiziert ist.

11. Transgene Pflanze, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, enthaltend ein DNA- Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon.

12. Pflanze, Pflanzenzellen, Pflanzenteile, Pflanzensamen, Vermehrungsgut gemäß Anspruch 11, herstellbar nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3.

13. Pflanze gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nutz- oder Zierpflanze ist.

14. Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung einer Testsubstanz bezüglich der Aktivität einer GSAAT, worin man

• a) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Abwesenheit einer Testsubstanz bestimmt;
• b) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Anwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; und
• c) die unter a) und b) ermittelten enzymatischen Aktivitäten vergleicht.

15. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 14 zur Identifizierung von Effektoren der GSAAT.

16. Verwendung eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT oder ein aktives Fragment daraus zur Identifizierung von Effektoren der GSAAT.

17. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 14 in einem automatisierten Testsystem zum Prüfen der effektorischen Wirkung von Testsubstanzen.

18. Effektor der Aktivität einer GSAAT, identifizierbar durch ein Verfahren gemäß Anspruch 14.

19. Effektor der GSAAT gemäß Anspruch 18, der ein Strukturanaloges des Glutamatsemialdehyds, Glutamats oder des 5-Aminolävulinats ist.

20. Pestizide Verbindung gemäß einem der Ansprüche 18 und 19.

21. Herbizide Verbindung gemäß einem der Ansprüche 18 und 19.

22. Verwendung von Effektoren der GSAAT gemäß einem der Ansprüche 18 und 19 als Pestizid oder Herbizid.