CN103468736A - 一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法，该方法以荚膜红细菌（DSMNo.1710）基因组DNA为模板，扩增得到编码ALA合成酶的含有较多大肠杆菌稀有密码子的hemA基因，将其克隆到表达载体pET28a上，并利用E.coliRosetta(DE3)表达上述重组质粒，首次实现该荚膜红细菌hemA基因在E.coliRosetta（DE3）胞内高活性表达。本发明工程菌有非常高的可溶ALA合成酶表达，获得的ALA合成酶比活力高达198.2nmol^-1•min^-1•mgofprotein^-1。将其应用于生产，所得胞外ALA产量高达8.61g/L，具有非常好的工业化前景。

Description

一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，尤其涉及一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法。 

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-amino1evulinic acid, ALA)广泛存在于生物体中，是生物体内四吡咯类化合物（如血红素、卟啉和维生素B₁₂等）的共同前体。5-氨基乙酰丙酸在农业上可用作光合作用促进剂、抗逆剂、落叶剂和除草剂等，用途广泛、对人畜无毒性，是极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域，5-氨基乙酰丙酸作为新一代光动力学药物，在脑瘤、皮肤癌、膀胱癌和结肠癌等疾病的诊断和治疗方面有着极大的应用价值。基于ALA广阔的应用前景，其合成已引起广泛的重视。 

ALA的生产主要有化学合成法和生物合成法。前者步骤繁琐、副产物多且产率低；后者克服了前者的弊端，主要通过生物诱变法或基因工程法来实现。生物诱变法主要是优化类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)突变株，但其培养周期长，成本较高；基因工程法主要是构建含有ALA合成酶基因的工程菌，至今报道的ALA合成酶基因来源主要有类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、沼泽红假单胞菌( Rhodopseudomonas palustris) 等。 

本发明利用E.coli Rosetta(DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus) hemA基因，通过胞内高活性表达ALA合成酶，进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的荚膜红细菌hemA基因胞内高活性表达的方法是利用E.coli Rosetta(DE3)，表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因。 

上述荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法，包括以下步骤： 

（1）从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA；

（2）PCR扩增ALA合成酶基因；

（3）采用双酶切法，将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接，并转化至DH5α，筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemA的阳性克隆；

（4）将重组质粒pET28a-R.C.hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，筛选得到工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA。

（5）发酵培养工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA，使其胞内高活性表达荚膜红细菌hemA基因。 

本发明的有益效果是，本发明将一种含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因接入表达载体pET28a获得的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3)，在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作用下，实现胞内高活性可溶表达ALA合成酶。表达的ALA合成酶比活力高达198.2 nmol^-1min^-1mg of protein^-1，比现已投入工业化生产的含放射形土壤杆菌hemA基因的工程菌获得的ALA合成酶（151.1 nmol^-1min^-1mg of protein^-1）提高31.2%。经初步优化后，将其应用于生产，胞外ALA产量高达8.61 g/L，处于国际化领先水平。 

附图说明

图1是重组质粒pET28a-R.C.hemA的构建图；图中，R.C.hemA为荚膜红细菌hemA基因，kana+为卡那霉素抗性基因，HindⅢ和NdeI为限制性内切酶位点。 

图2是工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA发酵、诱导表达、纯化得到的ALA合成酶的电泳图。 

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将更加明显。 

实施例1：构建本发明的工程菌，包括以下步骤： 

1．从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA，该步骤由以下子步骤来实现：

1.1、将荚膜红细菌培养至菌液OD₆₀₀大于1，收集备用；

1.2、按AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒的标准步骤，提取基因组DNA；

可以取5 μl提取得到的基因组DNA，加1 μl 6×loading buffer，用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2．PCR扩增得到ALA合成酶基因，该步骤由以下子步骤来实现： 

2.1、设计引物Primer1（SEQ ID NO.1：5’-GGGAATTCCATATGGACTACAATCT CGCGCTC-3’）和Primer2（SEQ ID NO.2：5’-CCCAAGCTTAGGCCTCGGCGCGATT CAC-3’），合成，两种引物分别溶于不含RNase（核糖核酸酶，Ribonuclease）的水中，配制成两个浓度均为10 μM的溶液；

2.2、取2 μl步骤1提取的基因组DNA至PCR管，加入步骤2.1配制的两种引物各2 μl、10 μl 的5× PrimeSTAR GXL Buffer、4 μl的dNTP Mixture（2.5 mM each）、1 μl 的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，最后用灭菌蒸馏水补足至50 μl，得反应液；

2.3、将上述50 μl反应液放入PCR仪中，反应条件为：首先98℃预变性10 min，然后98℃变性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸1.2 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，得PCR扩增产物；

2.4、在上述PCR扩增产物中加入5 μl的10×loading buffer，混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定出一条约1.2kb的条带。

2.5、用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）回收上述条带，即得到ALA合成酶基因hemA。 

2.6、对上述ALA合成酶hemA基因进行DNA测序，得到SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。该序列含有较多的大肠杆菌稀有密码子，见附表1； 

表1

 3．采用双酶切法，将扩增得到的ALA合成酶基因hemA与质粒pET28a连接，并转化至DH5α，筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemA的阳性克隆，该步骤由以下子步骤来实现：

3.1、取上述ALA合成酶基因和pET28a质粒各24 μl，分别加入限制性内切酶HindⅢ和NdeI（TaKaRa）各1.5 μl，10×K buffer 3 μl；

3.2、将上述两个双酶切反应体系置于37℃水浴中反应3 h，加入3 μl 10×loading buffer停止反应，经1%琼脂糖凝胶电泳，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）回收，分别得到ALA合成酶和pET28a质粒的双酶切产物；

3.3、根据电泳条带的亮度以及片段的大小，确定连接时目的片段与载体的体积比为2:3。分别取上述ALA合成酶和pET28a的酶切产物2 μl和3 μl，与5 μl Solution I（TaKaRa）混匀；

3.4、将上述10 μl连接体系置于16℃，连接过夜，得到的连接产物转化感受态细胞DH5α；

3.5、经卡那霉素抗性平板筛选出阳性克隆，挑取6个单菌落进行培养，并用AxyPrep质粒小量制备试剂盒提取重组质粒；

3.6、将上述6个重组质粒双酶切（HindⅢ和NdeI），其中5个分别在5kb和1.2kb处有条带，认为连接成功，命名为重组质粒pET28a-R.C.hemA；另外一个只有在5kb处有条带，说明目的基因没有连接上；

4．将重组质粒pET28a-R.C.hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，筛选得到含有上述重组质粒的工程菌，命名为Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA，即为本发明的工程菌。

实施例2：荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达 

1、将本发明工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA接种至含50 ml LB培养基的250 ml摇瓶，置于37℃、200 rpm摇床，培养2 h后降温至28℃，用25 μl 0.1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，继续培养6 h。

2、取2 ml菌液至离心管，4℃、12000 rpm离心1 min，弃上清液； 

3、用1 ml 50 mM Tris-HCl（pH7.5）重悬，4℃、12000 rpm离心1 min，弃上清液；

4、用1 ml 50mM Tris-HCl（pH7.5）重悬后进行超声破胞，其条件为：200 W，工作5 s，间歇7 s，重复10次；

5、4℃、12000 rpm离心10 min，取上清液进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

6、根据电泳结果，在47kDa附近有蛋白条带（见图2），此蛋白即为5-氨基乙酰丙酸合成酶融合蛋白。

实施例3：5-氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测定 

1、将实施例2中的菌液破胞，离心后得到的上清液即为ALA合成酶的粗酶；

2、将上述粗酶通过QIAGEN Ni-NTA亲和层析和Sephadex G-25凝胶过滤层析，纯化得到ALA合成酶的纯酶；

3、用BCA Protein Assay Kit测定上述纯酶的蛋白浓度；

4、将上述纯酶稀释至蛋白浓度为0.1 mg/ml，加入终浓度为50 mM的Tris-HCl（pH7.5）、0.1 M的甘氨酸、0.27 mM的磷酸吡哆醛、0.2 mM的琥珀酰辅酶A，配成500 μl反应体系，于37℃振荡反应10 min，加入150 μl 10%三氯乙酸终止反应；

5、取300 μl上述反应液与400 μl 1 M乙酸盐缓冲液（pH4.6）和35 μl乙酰丙酮混匀，沸水浴反应15 min；

6、待其冷却后取200 μl，加入200 μl新配制的Ehrlich试剂，显色30 min，用紫外分光光度计测量其在554 nm处的吸光度，ALA的浓度（mg/L）=14.251×OD₅₅₄-0.2808（R²=0.9998）；

7、计算得到5-氨基乙酰丙酸合成酶纯酶的比活力为198.2 nmol^-1min^-1mg of protein^-1（一个酶活力单位定义为在37℃条件下，每分钟产生1 nmol 5-氨基乙酰丙酸所需的酶量；比活力为每毫克蛋白所含的酶单位）。

8、按照上述步骤1-7，用CN101063105所述的工程菌代替本发明的工程菌，进行5-氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测定，得到CN101063105所述的工程菌表达的5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力为151.1 nmol^-1min^-1mg of protein^-1。 

该实施例说明本发明的工程菌能高活性表达ALA合成酶，其比活力比CN101063105所述的工程菌（已投入工业化生产）提高31.2%。 

实施例4：工程菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸 

按照CN101063105所述的方法，利用本发明的工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA发酵生产5-氨基乙酰丙酸。经过28.5 h的发酵，5-氨基乙酰丙酸的产量高达8.61 g/L。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。 

<110>  浙江大学

 

<120>  一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gggaattcca tatggactac aatctcgcgc tc                                   32

 

 

<210>  2

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cccaagctta ggcctcggcg cgattcac                                        28

 

 

<210>  3

<211>  1207

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atggactaca atctcgcgct cgacaaagcg atccagaagc tccacgacga gggacgttac     60

 

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catgatctca agcagatcga cgggctcgtt catgccatgg atctgctctg ggcgcgctgt   1200

 

gcgctga                                                             1207

Claims (2)

1.一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法，其特征在于，该方法利用E.coli Rosetta(DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因。

2.根据权利要求1所述的荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA；

（2）PCR扩增ALA合成酶基因hemA；

（3）采用双酶切法，将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接，并转化至DH5α，筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemA的阳性克隆；

（4）将重组质粒pET28a-R.C.hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，筛选得到工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA；

（5）发酵培养工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA，使其胞内高活性表达荚膜红细菌hemA基因。

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