CN1693466A - 生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。此菌是含有放射形土壤杆菌的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌。构建方法包括以下步骤：1)从放射形土壤杆菌的菌液中提取总基因组DNA；2)用聚合酶链反应扩增出5－氨基乙酰丙酸合成酶基因；3)将扩增出的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pGEM－T连接，进行DNA测序；4)将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a连接，构建出重组子pET28a－A.R－hemA；5)将重组子pET28a－A.R－hemA转化至宿主菌中，即可。本发明有较高的可溶5－氨基乙酰丙酸合成酶表达，且经优化表达后胞外ALA的产量高达4.8g/L。

Description

生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevμlinic acid，ALA)广泛存在于生物中，是卟啉生物合成途径中第一个复合物，也是形成血红素、细胞色素、维生素B₁₂等四吡咯化合物的共同前体。另外，ALA作为一种光动力学剂(photodynamic agent，PDT)，在农用化学品及医学领域具有广泛的用途。在农业领域，ALA具有除草、杀虫、增加植物抗逆性和促进植物生长等多种功能，易降解无残留且对人畜无毒性，成为极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域，ALA具有选择性杀死癌细胞的作用，被称为第二代光动力学药物(photodynamic medicine)，具有对正常细胞毒害小，病人避光时间短，疗效好，无残留等显著特点，被用来治疗皮肤癌、膀胱癌、结肠癌和胰腺癌等多种癌症。因此，ALA的合成研究引起广泛重视。

由于化学法合成ALA步骤繁琐且产率低，故采用生物合成方法。其一是生物诱变法，优化类球红细菌的突变株CR 720(Rhodobacter sphaeroides CR720)培养条件，ALA的产量可达27mmol/L，但其培养条件复杂、周期长和成本较高。其二是基因工程方法，Mariet J.Vander Werf等(1996年)和Choi等(1999年)分别构建了含有类球红细菌Rhodobacter sphaeroides和大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobiμm japonicμm.的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(hemA)的工程菌，用于生产ALA。但至今还未见有利用放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因生产ALA的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。

本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌是含有放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.1332，保藏日期：2005.3.18，分类命名：大肠埃希氏菌，保藏单位地址：中国科学院微生物研究所。

上述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因具有SEQ ID NO.1所示的序列。

上述5-氨基乙酰丙酸合成酶具有SEQ ID NO.2所示的序列或在其基础上减少、替代、增加一个或多个氨基酸残基的具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的氨基酸序列。

生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从放射形土壤杆菌的菌液中提取总基因组DNA；

2)用聚合酶链反应扩增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因；

3)将扩增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pGEM-T连接，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

4)将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a或pTRC99a连接，构建出重组子pET28a-A.R-hemA或pTRC99a-A.R-hemA；

5)将重组子pET28a-A.R-hemA或pTRC99a-A.R-hemA转化至宿主菌中，即可。

为获得较高的5-氨基乙酰丙酸的产量，本发明中的宿主菌以采用大肠杆菌BL21(DE3)为宜。

本发明将一种放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因接入表达载体pET28a转化大肠杆菌，在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下，有较高的可溶5-氨基乙酰丙酸合成酶表达，且经优化表达后胞外ALA的产量高达4.8g/L。

附图说明

图1是重组质粒pET28-A.R-hemA的构建图，图中，A.R-hemA为5-氨基乙酰丙酸合成酶基因，Kana+为卡那霉素抗性基因，EcoRI和HindIII为限制性内切酶位点；

图2是工程菌BL21(DE3)pET28-A.R-hemA5诱导表达示意图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明

实施例1

本发明生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1.放射形土壤杆菌基因组DNA的提取

1)将过夜培养的菌液放在1.5ml离心管中，13,000×g离心1min后去上清；

2)用475μl TE缓冲液溶解后，加溶菌酶至终浓度100μg/ml，37℃保温20min；

3)加10％(w/v)十二烷基璜酸钠(SDS)溶液至终浓度2％(w/v)，同时加20mg/ml蛋白酶K至终浓度100μg/ml，混匀后，37℃保温1h；

4)加1/5体积5mol/L NaCl混匀，再加1/5体积2×溴化十六烷三甲基铵(CTAB)，65℃保温30min；

5)加等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液，酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，13,000×g离心5min；

6)取上清液加等体积的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1，13,000×g离心5min；

7)取上清液加2倍体积的无水乙醇及1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH4.6)，于-20℃下静置10min后，13,000×g离心5min；

8)去上清液所得的DNA沉淀用70％的乙醇洗2次后，自然风干后，溶于TE缓冲液中(含20μg/ml RNase)，55℃水浴处理15min，即得到基因组DNA。

2.用聚合酶链反应(PCR)扩增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因

1)分别取上述提取的基因组DNA 20μg，浓度均为10μmol/L的两引物

各1μl，(5’端引物为GGAATTCGGATCCATGGACTTCGAGGCATTT，3’端引物为TTAAGCTTCCTCACGCCACCGCACGCGC)，10×反应缓冲液2μl，(5unit/μl)PfuDNA聚合酶0.5μl，4种脱氧核苷酸(dNTP)浓度均为10mmol/L的混合液0.5μl，于0.5mlPCR管中，其余用双蒸水补足20μl；

2)将上述20μl反应液，放入PCR仪中，反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min；

3)把PCR扩增后的产物，加5μl上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定出一条约1.2Kb的条带；

3.将扩增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pGEM-T连接，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列

1)将PCR扩增的hemA基因用胶回收试剂盒(QIAquick Gel ExtractionKit(50)进行切胶回收；

2)在10μl的反应体系中取7μl回收的基因片断加0.5μl 200μmol/L脱氧腺苷酸(dATP)，0.3μl 25mmol/L MgCl₂，0.2μl(5unit/μl)TaqDNA聚合酶，1μl 10×反应缓冲液，其余用双蒸水补齐，此反应系统在70℃下反应30min，加上脱氧腺苷酸(A’)末端；

3)将具有A’末端的目的基因与克隆载体pGEM-T在16℃下连接2h，然后转化感受态细胞TG1(见图1)；

4)在含100μg/μl的氨苄青霉素及5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和IPTG各800μg的LB培养基平板上经蓝白斑系统筛选出阳性克隆，即从转化皿上挑出8个白色克隆进行鉴定(1升LB培养基含10克含蛋白胨、5克酵母粉、10克氯化钠pH 7.0)；

5)对这8个克隆用EcoRHI和HindIII双酶切，其中5个分别在约3kb和1.2kb处有条带，具有1.2kb的基因片断认为连接成功，其余3个只有在3kb处有条带，说明目的基因没有连接上；

6)用EcoRI和HindIII双酶切鉴定出有正确插入的克隆(即重组子)命名为pGEM-A.R-hemA，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a连接，构建出重组子pET28a-A.R-hemA，用此重组子转化至大肠杆菌

1)用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切重组质粒pGEM-A.R-hemA；切下1.2kb片断进行胶回收；

2)用内切酶EcoRI和HindIII处理表达载体pET28a，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收5.0kb的大片断；

3)两种回收产物在16℃下连接6h，然后转化感受态细胞BL21(DE3)，这样hemA基因就定向连接到表达载体pET28a的EcoRI和HindIII位点处，将这种表达载体命名为pET28a-A.R-hemA，而含有这种表达载体的工程菌命名为BL21(DE3)pET28a-A.R-hemA，即为本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌(见图1)。

实施例2

5-氨基乙酰丙酸合成酶在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下的表达

1)将本发明工程菌BL21(DE3)pET28a-A.R-hemA培养在含50ml的LB培养基的250ml的摇瓶中，先在37℃，200rpm下培养1.5h；然后降温至28℃，用4μl 1mol/L IPTG诱导，继续培养4h后，取30ml菌液于8000×g离心10min去上清液；

2)用3ml 50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)重悬，超声破胞，其条件为400w工作5min，间歇5min，重复30次，13,000×g离心10min；

3)取上清液进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为200v，500mA，时间为1h10min；

4)根据电泳结果在约44.0kDa处有占总蛋白量23.7％的可溶蛋白表达(见图2)，此大小与根据SEQ ID NO.2的氨基酸序列大小基本一致，即认为此蛋白为5-氨基乙酰丙酸合成酶。

实施例3

5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力测定

1)将500μl含有50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、20mmol/L MgCl₂、0.1mol/L甘氨酸、0.1mmol/L磷酸吡哆醛、0.2mmol/L琥珀酸辅酶A和破胞后的细胞抽提物的混合液，于37℃反应10min；

2)取300μl上述反应液加150μl 10％三氯乙酸于1.5mL离心管中混合，13,000×g离心5min；

3)取300μl上清液与400μl 1mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.6)和35μl乙酰丙酮混合，沸水浴15min；

4)待其冷却后，再加入700μl新配制的Ehrlich试剂(于50ml量筒中，依次加入30ml的冰乙酸，1g对-二甲氨基苯甲醛，5ml 70％的高氯酸，5ml水，溶解后用冰乙酸稀释至50ml)，反应5min后在554nm处测其吸光值，ALA的浓度(mg/L)＝26.35×OD₅₅₄-0.09(R²＝0.9993)；

5)蛋白浓度由蛋白质浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)测定，测出含有hemA基因的重组菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力为13.8nmol^-1min^-1mg of protein^-1(1个酶单位定义为1min内生成1 nmol ALA所需的酶量；酶的比活力为每毫克蛋白所含的酶单位)，而不含重组子的大肠杆菌BL21(DE3)检测不到5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性。

SEQ ID NO.1

长度：1086bp

类型：脱氧核糖核酸

链数：双链

几何结构：线性

来源：从放射形土壤杆菌基因组中PCR扩增而来

特征：编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的核苷酸序列

ATGgacttcg ggcattttt tacgacggaa ctgcagagcc tgcattctga gggacgctat   60

Cgcgtttttg cggatatcgaa cgccggcagg gcaattttcc ccgcgcgaca cggtacaac  120

Gccaatggcg agcgcaagga cgtaaccgtc tggtgttcca acgattatct gggcatgggc  180

Cagaacccca aagtcatcga agccatgaaa gccgccatcg atcactgtgg cgcgggtgcg  240

Ggaggcaccc ggaacatttc tgggaccaac catcatcacg tcctgctgga acaggaactt  300

Gccgatctgc acggcaagga atcggcgctg atcttcacgt cgggttacgt ttccaactgg 360

Gcgacactcg gtacacttgg ccagaaaatt ccgggcctca tcattttctc cgatgcgctc 420

Aaccatgcct cgatgatcga aggcatccgt tacggccgtt gcgagcgggt gatctggaaa 480

Cacaatgatc tcgaagatct cgaggcaaag cttcaaggca gccgatccat gtacggaccg 540

Cgcggcggcg gtattgccga gcgcgaaggc ctgatggatc gcctgacgat catcgaggga 600

Acgctcggca aggctttcgg cgtgatgggc ggttatattg ccgggtccac ggcggtctgt 660

Gattttatcc gttctttcgc ctccggtttc atcttcacga cggccctgcc gccgtcgctc 720

Gctgccggcg caatcgcctc gatccagcat ttgaaggcaa gcccctttga gcgcgcccgc 780

Catcaggacc gggtgcgcaa gctgcggggg cttctggatg cacgcggcat tccgcatatg 840

Gacaatccca gccatatcgt accggtcatg gtgggcgatg ccgccaagtg caaatggatt 900

Tcggatatcc tgctcgacaa tcacggcgtc tatgtccagc cgatcaacta tccgaccgtg 960

Ccgcgcaaga ccgagcgtct gcgcatcacc ccgacaccgc tgcacaccga tgccgacatc 1020

Gaacagttgg tcggcgcgtt gcaccagctc tggtcgcatt gtgcgctggc gcgtgcggtg 1080

GcgTGA                                                            1086

SEQ ID NO.2

长度：362氨基酸残基

类型：肽链

链数：单链

几何结构：线性

来源：放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因推断得到

特征：具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性

M D F E A F F T T E L Q S L H  15

S E G R Y R V F A D I E R R Q  30

G N F P R A T R Y N A N G E R  45

K D V T V W C S N D Y L G M    60

G Q N P K V I E A M K A A I D  75

H C G A G A G G T R N I S G T  90

N H H H V L L E Q E L A D L H  105

G K E S A L I F T S G Y V S N  120

W A T L G T L G Q K I P G L I  135

I F S D A L N H A S M I E G I  150

R Y G R C E R V I W K H N D L  165

E D L E A K L Q G S R S M Y G  180

P R G G G I A E R E G L M D R  195

L T I I E G T L G K A F G V M  210

G G Y I A G S T A V C D F I R  225

S F A S G F I F T T A L P P S  240

L A A G A I A S I Q H L K A S  255

P F E R A R H Q D R V R K L R  270

G L L D A R G I P H M D N P S  285

H I V P V M V G D A A K C K W  300

I S D I L L D N H G V Y V Q P  315

I N Y P T V P R K T E R L R I  330

T P T P L H T D A D I E Q L V  345

G A L H Q L W S H C A L A R A  360

V   A                          362

Claims (5)

1.一种生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于此菌是含有放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.1332。

2.根据权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于所说的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于所说的5-氨基乙酰丙酸合成酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或在其基础上减少、替代和增加一个或多个氨基酸残基的具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从放射形土壤杆菌的菌液中提取总基因组DNA；

2)用聚合酶链反应扩增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因；

3)将扩增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pGEM-T连接，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

4)将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a或pTRC99a连接，构建出重组子pET28a-A.R-hemA或pTRC99a-A.R-hemA；

5)将重组子pET28a-A.R-hemA或pTRC99a-A.R-hemA转化至宿主菌中，即可。

5.根据权利要求4所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于所说的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

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