KR100332353B1 - Ala신타아제발현대장균및이를이용한생합성델타-아미노레불린산의제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용하여 ALA 생성 균주 중 하나인 브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum)의 ALA 신타아제(ALA synthase)를 코딩하는 hemA 유전자가 삽입된 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 이를 이용한 생합성 ALA 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum)의 hemA 유전자가 삽입된 발현벡터로 형질전환된 대장균을 작제하고, 이 대장균을 글리신 및 숙신산이 첨가된 배양액에 배양하면서 레불린산을 첨가하여 ALA를 수득하는 효율적인 생합성 ALA 제조방법을 제공한다. 본 발명의 생합성 ALA 제조방법에 따르면, 종래의 다른 균주에 의한 ALA 제조방법이 가지는 ALA 생산에 장시간이 소요되고, 배양 조건이 어려우며, 세포내 ALA 탈수효소(ALA dehydratase)의 피드-백 억제(feed-back inhibition) 현상에 의한 수율 저하 등의 문제점을 개선함으로써, 제초 활성을 나타낼 수 있는 농도인 3 내지 5mM 이상의 높은 수율로 ALA를 효율적으로 생산하여 정제단계가 없이도 제초제로서 활용할 수 있는 생합성 ALA를 제조할 수 있다.

Description

ＡＬＡ 신타아제 발현 대장균 및 이를 이용한 생합성 델타-아미노레불린산의 제조방법
본 발명은 대장균을 이용한 생합성 델타-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid, 이하, 'ALA'라 함)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용하여 ALA 생성 균주 중 하나인 브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum)의 ALA 신타아제(ALA synthase)를 코딩하는 hemA 유전자가 삽입된 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 이를 이용한 생합성 ALA 제조방법에 관한 것이다.
지구상의 인구의 급속한 증가로 인하여 파생된 생태계의 파괴, 환경의 오염, 자원의 고갈 및 식량의 부족 등 부수적으로 많은 문제들이 생겨나고 있다. 고도의 과학 발전으로 식량의 공급량은 늘어났으나, 인구증가에는 못 미치고 있어, 아직도 충분한 양의 식량 공급은 어려운 상태이다. 이러한 문제 극복의 한 방법으로서, 인류는 식량의 생산량을 증가시키기 위해 많은 농약을 연구 개발하여 사용하고 있다. 농약으로 사용되는 제제로서는 제초제가 가장 많은 비율(제초제 39.2%, 살충제 32.7%, 살균제 22%, 생장 조절제 6.1%)을 차지하고 있으며, 현재는 독성이 강한 디페닐 에테르(DPEs: diphenylether), 및 옥사디아졸(oxadiazol) 등과 같은 합성 포토다이나믹(photodynamic) 제초제를 화학적 합성을 통하여 생산하여 사용하고 있으나, 이러한 합성 포토다이나믹 제초제의 동물과 인체에의 유해성과 느린 분해속도로 인한 환경오염의 문제가 제기되고 있다.
이에, 잔류 독성이 적고, 생산하기 쉬운 미생물 대사 산물을 이용한 생물 유래의 농약의 개발이 활발히 연구되어 왔으며, 현재까지 실질적으로 사용 가능한 생물 유래의 제초 활성물질은 비아라포스(bialaphos), 헤르비시딘(herbicidin), 헤르비마이신(herbimycin), 싸이클로헥시미드(cycloheximide) 등 30 여종으로 집약할 수 있다. 그러나, 이러한 물질들도 인체에 강한 독성을 나타내는 것으로 보고되고 있기에, 선택성이 탁월하고, 인체에 독성이 없으며, 또한 생분해가 가능한 제초 활성 물질이 필연적으로 요구된다.
일반적으로, 델타-아미노레불린산은 모든 생물계에서 헴(heme), 박테리오-클로로필(bacterio-chlorophyll), 코리노이드(corrinoid) 등테트라피롤(tetrapyrrole) 화합물의 주요 전구 물질로서, 태양광선에 의해서 강력한 산화 물질인 클리드(pchlide)가 형성되고, 이 물질에 의한 일련의 산화 반응이 일어나 쌍자엽 식물에게만 선택적으로 잎의 인지질을 파괴하여 고사시키는 포토다이나믹 물질이다. 그러므로, ALA는 사람, 동물 및 농작물 등에는 피해를 주지 않으면서 잡초를 선택적으로 고사시키는 환경친화성의 제초제로 활용될 수 있다(참조: Rebeiz C.A., Montazer-Zouhoor A., Hopen H., and Wu S.M., Enzyme Microb. Technol., 6:390(1984)).
또한, ALA는 이러한 제초제로서 뿐만 아니라, 낮은 농도에서 사용할 때 식물 광합성의 증진, 호흡의 저해 및 이산화탄소의 동화를 촉진시켜서 성장을 촉진시키는 효과가 있어(참조: Hua Z., et al., Cancer Reasearch. 55:1723(1995); Matsumoto T.H., et al., Weed Research, 37:60(1992); Matsumoto T.H., et al., Pesticide Biochemistry, 48:214(1994); Rebeiz N., et al., Photochem. Photobiol., 55: 431(1995)), 볍씨를 1 내지 3 ppm의 ALA용액에 1 내지 48 시간 침지 후, 파종을 하였을 경우 크기, 무게 및 뿌리의 성장이 촉진되는 것으로 밝혀졌다.
그 외에도 ALA는 트리초푸시아 니(Trichopusia ni) 등과 같은 해충의 살충제로서 그 사용 범위가 확대되고 있다. 특히, ALA를 이용한 살충효과는 특정 대사단계에 관여하여 효력을 나타내는 기존의 살충제와는 달리 그 작용단계가 복잡하므로 해충이 이에 대한 저항성을 개발하기가 어려우므로, 환경 친화 살충제로서의 활용이 가능하다. 그밖에 ALA는 피부암 치료제 및 미생물 저항성 약품 등 의학 분야에서도 생물활성 물질로 사용될 수 있다고 보고되어 있는데, 특히 여러 종류의 악성종양 치료를 위한 광역학 치료법(PDT: photodynamic theraphy)의 포토센시타이저(photosensitizer)로서도 광범위하게 이용될 수 있는 것으로 밝혀져서 활발한 연구가 진행 중이다. 악성종양 부위에 ALA의 투여로 세포 내 포르피린(porphyrin), 특히 헴 생합성 경로의 최종 전구체인, 프로토포르피린 Ⅸ(protoporphyrin Ⅸ)의 농도가 급증되어 가시광선의 조사에 손상을 입혀 종양을 사멸시키는 것으로 밝혀졌다. 반면에, 정상 세포는 ALA의 흡수가 종양 세포에 비하여 낮고 또한 느린 성장 속도로 인하여, 상대적으로 축적되는 프로토포르피린 Ⅸ의 농도가 낮으므로, 빛의 조사로 인한 손상이 낮은 것으로 밝혀졌다.
현재, ALA는 복잡한 유기 합성법을 이용하여 생산하고 있으나(참조: Beale S.I., et al., Phytochemistry, 18:441(1979)), 생산단가가 높아 채산성이 없으므로, 로도박터 스패로이데(Rhodobacter sphaeroides), 클로스트리디움 써모아세티움(Clostridium thermoaceticum), 메타노박터리움 써모오토트로피컴(Methanobacterium thermoautotropicum), 아그네멜룸 쿠아드러프리컴(Agnemellum quadruplicum), 아나시스티스 마리나(Anacystis marina) 및 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 등 미생물의 발효를 이용한 ALA의 생산법 및 그 이용에 관한 연구들이 진행되고 있다(참조: Sasaki K., et al., J. Ferment. Technol., 65:511(1987); Sasaki K., et al., Biotechnol. Lett., 15:859(1993); Tanaka T., et al., Biotechnol. Lett., 13:589(1991); Janschen R., et al., FEMS Microb. Lett., 12:167(1981); Kipe-Not J.A. and Steven S.E., Plant Physiol.,65:126(1980); Beale S.I., and Castelfranco P.A., Plant Physiol., 53:297(1974)).
ALA는 헴(heme)의 전구체로서, 두 가지의 생합성계(C4, 및 C5경로)에 의하여 생합성되는 것으로 알려져 있는데, 동물, 진균, 호기성 세균류 등에서 발견되는 C4계는 글리신(glycine)과 숙시닐-CoA(succinyl - CoA)의 축합에 의하여 생성되며, 이 반응은 피리독살 인산 의존성(pyridoxal phosphate dependent) 효소인 ALA 신타아제에 의하여 촉매된다. 또 다른 경로인 C5계는 식물, 조류, 대장균 등에서 발견되고 있으며, 이 경로는 글루탐산(glutamate)으로부터 글루타밀-tRNA 합성효소(glutamyl-tRNA synthetase), 글루타믹-tRNA 수소 이탈 효소(glutamic-tRNA dehydrogenase) 및 글루탐산-1-세미알데히드(glutamate-1-semialdehyde: GSA) 아미노기 전이효소(transaminase)에 의한 일련의 반응에 의해서 ALA로 전환된다. 분자 생물학적인 ALA 생합성 경로는 ALA 영양 요구 변이주(ALA auxotrophy)의 분리를 통하여 밝혀졌는데, C4경로의 ALA 신타아제 유전자는 두 가지의 동위효소(isozyme) hemA 및 hemT가 존재하는 것으로 밝혀졌고, 반면에 C5경로는 hemA, hemL 및 hemM 유전자들에 의하여 구성되어 있다.
이러한 미생물에 의한 ALA의 합성 증대를 위하여 전구체인 글루탐산, 글리신, 및 숙신산을 배양액 중에 보강하거나 유기 폐자원으로부터 저급지방산의 분리 및 첨가효과 등에 관한 연구가 있었으며, pH, 온도의 조절, 산소의 공급, 광합성세균들의 경우에는 빛의 조사 등에 의한 ALA 생성량의 증가에 관한 연구 등도 보고되었다. 또한, 이들 미생물과 돌연변이 균주들을 이용하여 위에서 언급한 요소들에 관한 연구도 보고되었으며, ALA 의 세포 내 축적과 이에 따른 배양액중의 배출을 향상시키기 위하여 레불린산(levulinic acid)의 간헐적인 첨가로 ALA를 포르포빌리노겐(porpho bilinogen)으로의 전환을 방지하는 방법이 일반적으로 연구되었다.
그러나, 이러한 미생물을 이용한 ALA 생합성의 연구에 사용된 미생물들 중에서 로도박터(Rhodobacter)및 클로렐라(Chlorella)들을 제외하고는 수율이 낮아 현실적으로 산업화가 부적합하고, 로도박터(Rhodobacter)및 클로렐라(Chlorella) 균주를 이용한 경우도 제초제로서 실용화하기가 어려웠다.
따라서, 높은 수율로 ALA를 수득할 수 있고, 순수정제를 통해 산업화할 수 있으며, 실질적인 제초제로서의 실용화를 위해 유전공학 기법을 이용한 새로운 균주의 개량이 절실히 필요로 하게 되었다.
이에, 본 발명자는 광합성 세균들을 이용한 ALA 생성에 있어서, 종래의 다른 균주에 의한 ALA 제조방법이 가지는 ALA 생산에 장시간이 소요되고, 배양 조건이 어려우며, 세포 내 ALA 탈수효소(ALA dehydrase)의 피드-백 억제(feed-back inhibition) 현상에 의한 수율의 저하 등의 문제점이 개선되고, 제초 활성을 나타낼 수 있는 농도인 3 내지 5 mM 이상의 높은 수율로 ALA를 효율적으로 생산하여 정제단계가 없이도 제초제로서 활용할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, ALA 생성 균주 중 하나인 브라디리조비움 야포니컴의 ALA 신타아제를코딩하는 hemA 유전자를 클로닝하여 ALA 신타아제를 발현하는 대장균 및 이를 이용하여 효율적으로 생합성 ALA를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 ALA 생성 균주 중 하나인 브라디리조비움 야포니컴의 hemA 유전자를 클로닝하여 ALA 신타아제를 발현하는 재조합 대장균을 완성하고 이를 이용한 효율적인 생합성 ALA 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 전기 ALA 신타아제를 발현하는 재조합 대장균을 이용한 효율적인 생합성 ALA 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 제조하는데 있어서, hemA 유전자가 pUC 18에 서브클로닝된 벡터를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 제조하는데 있어서, hemA 유전자가 pET23a에 클로닝된 발현벡터를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 배양할 때, 글리신 첨가량에 따른 델타-아미노레불린산 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 배양할 때, 숙신산 첨가량에 따른 델타-아미노레불린산 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 배양할 때, 레불린산을 첨가하지 않는 경우의 델타-아미노레불린산 생산량과 대장균의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 배양할 때, 레불린산 30mM을 배양초기에 첨가하는 경우의 델타-아미노레불린산 생산량과 대장균의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 배양할 때, 레불린산 30mM을대수증식기 중기에 첨가하는 경우의 델타-아미노레불린산 생산량과 대장균의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 배양할 때, 레불린산 30mM을 대수증식기 말기에 첨가하는 경우의 델타-아미노레불린산 생산량과 대장균의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 배양할 때, 대수증식기 말기에 첨가하는 레불린산 첨가량에 따른 델타-아미노레불린산 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 ALA 신타아제 발현 대장균을 발효기에서 배양할 때, 중성 pH 유지와 레불린산 첨가에 따른 델타-아미노레불린산 생산량을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 ALA 생성 균주 중 하나인 브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum)의 hemA 유전자가 삽입된 발현벡터로 형질전환된 대장균을 작제하고, 이 대장균을 글리신 및 숙신산이 첨가된 배양액에 배양하면서 레불린산을 첨가하여 ALA를 수득하는 효율적인 생합성 ALA 제조방법을 제공한다.
이하에서는, 본 발명의 생합성 ALA 제조방법을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum, ATCC 10324, U.S.A.)을 YEX 배양액(bacto yeast extract 0.4g, xylose 3 g, K2HPO40.52g, MgSO4·7H2O 0.2g, NaCl 0.64g/ℓ)에서 배양시켜 원심분리한 다음, 세포를 파괴하여 일반적인DNA 정제법에 의해 순수한 DNA를 분리하였다. ALA 신타아제를 코딩하는 hemA 유전자 DNA 절편을 얻기 위하여, 상기에서 순수하게 분리된 DNA로부터 hemA 유전자의 서열 양끝에 BamH I 및 Nde I 절단부위를 포함시켜 합성된 프라이머 ALAS1(참조: 서열번호 1)와 EcoR I 절단부위를 포함시켜 합성된 프라이머 ALAS2(참조: 서열번호 2)를 이용한 중합효소 연쇄반응을 하여 hemA 유전자 DNA 절편(참조: 서열번호 3)을 증폭시켰다. 전기에서 증폭되어진 hemA 유전자 DNA 절편과 pUC18 벡터를 BamH I으로 각각 절단하여 분리, 정제하고, hemA 유전자 DNA 절편을 pUC18 벡터에 삽입하여 서브클로닝된 벡터 pUC18/hemA를 제조하고(참조: 도 1), 이를E. coliBL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 이어, 서브클로닝된 벡터 pUC18/hemA를 Nde I과 EcoR I으로 제한효소 처리하여 절단한 다음, 분리 및 정제하여 발현벡터 pET23a에 삽입할 hemA 유전자 DNA절편을 얻었다. T7 프로모터가 포함되어 있는 발현벡터 pET23a 역시 전기의 제한효소로 절단하여 분리, 정제하고, 전기 hemA 유전자 DNA 절편을 발현벡터 pET23a에 삽입하여 발현벡터 pET23a/hemA를 제조하였다(참조: 도 2). 이 발현벡터를E. coliBL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 ALA 신타아제를 발현하는 발현균주를 제조하였다. 본 발명자는 상기 형질전환체를 'E. coliBL21(DE3) with ALAS'라 명명하고, 1998년 7월 28일에 서울특별시 서대문구 신촌동 134번지에 소재하는 사단법인 한국종균협회에 KFCC-11046의 수탁번호로 기탁하였다.
상기의 ALA 신타아제를 발현할 수 있는 형질전환 대장균E. coliBL21(DE3) with ALAS(KFCC 11046)를 통상적인 암피실린(ampicillin) 함유 LB 배지에 ALA 생산을 위해 숙신산(succinic acid), 글리신(glycine) 및 각종 미네랄 등이 첨가된 배지에서 배양하는데, 전기 형질전환 대장균(KFCC 11046)에서 발현된 ALA 신타아제에 의해 글리신과 숙시닐-CoA의 축합반응이 촉매되어 ALA를 생산하게 된다. 생산된 ALA는 세포내 ALA 탈수효소(ALA dehydratase)에 의해 일부 포르포빌리노겐으로 전이되는데, 중성 pH를 유지하면서 레불린산을 배양 중에 첨가함으로써, ALA의 전이를 억제하여 높은 수율로 ALA을 수득할 수 있다. 또한, 발효기를 이용하여 대량으로 배양함으로써, ALA 생산을 산업화할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 브라디리조비움 야포니컴의 hemA 유전자의 서브클로닝
브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum, ATCC 10324, U.S.A.)을 O.D600= 2.0 까지 YEX 배양액(bacto yeast extract 0.4g, xylose 3g, K2HPO40.52g, MgSO4·7H2O 0.2g, NaCl 0.64g/ℓ)에서 배양하여 원심분리 후, SET 완충액(75mM NaCl, 25mM EDTA, 20mM Tris, pH 7.5)에 용해시키고, 리소자임을 첨가하여 세포를 파괴하였다. 이 반응액에 1/10의 10% SDS, 1/3의 5M NaCl 및 동량의 클로로포름을 첨가하여 원심분리한 다음, 단백 분해효소 K와 RNA 분해효소 A를 첨가하여 37℃에서 15분 동안 방치하였다. 여기에 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1)을 첨가하여 원심분리를 행하고, 상등액을 모아 1/10 양의 3M 아세트산 나트륨을 첨가하여 잘 혼합한 다음, 두 배의 100% 에탄올을 첨가하고 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA는 70% 에탄올로 세척하여 원심분리한 다음, 여분의 에탄올을 제거하고 TE 완충액에 현탁시켜 순수한 DNA를 분리하였다. hemA 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭시키기 위하여, 상기에서 순수하게 분리된 DNA 125ng(1㎕), hemA 유전자의 서열 양끝에 BamH I, Nde I 및 EcoR I 절단부위를 포함시켜 합성된 프라이머 ALAS1(참조: 서열번호 1), ALAS2(참조: 서열번호 2) 각각 100pmole(1㎕), 10X Taq DNA중합효소 반응 완충액(100mM Tris-HCl (pH 8.3), 400mM KCl, 15mM MgCl2, 10mM DTT, 500㎍/㎖ BSA), dNTP(각각 10mM)(4㎕), 1U의 Taq DNA 중합효소, 그리고 정제수를 가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고, 수분증발을 방지하기 위해 미네랄오일을 가하였다. 전기 혼합물을 94℃에서 1분, 52℃에서 2분, 72℃에서 3분의 순으로 30회 반복시키고, 최종단계에서 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 확인, 분리 및 정제하였다. 상기에서 증폭되어진 hemA 유전자(참조: 서열번호 3)를 pUC18 벡터에 서브클로닝하기 위하여, 중합효소 연쇄반응 산물과 플라스미드 벡터를 BamH I으로 절단하여 분리, 정제하고, 전기의 삽입될 DNA 0.2㎍(2㎕), pUC18 벡터 0.1㎍(1㎕), 5X T4 리가제 완충액(2㎕), T4 DNA 리가제 1.5U(0.5㎕), 5mM ATP(1㎕) 및 정제수(2.5㎕)를 혼합하여 16℃에서 16시간 동안 반응시켜서 hemA 유전자가 삽입된 벡터 pUC18/hemA를 제조하고(참조: 도 1), 이 벡터를E. coliBL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다.
실시예 2: ALA 신타아제 발현 대장균의 작제
실시예 1에서 제작된 hemA 유전자가 삽입된 벡터 pUC18/hemA를 Nde I과 EcoR I으로 제한효소 처리하여 절단한 다음, 분리 및 정제하여 발현벡터 pET23a(Novagen Inc., U.S.A.)에 삽입할 hemA 유전자를 코딩하는 DNA절편을 얻고, T7 프로모터가 포함되어 있는 발현벡터 pET23a 역시 전기의 제한효소로 절단하여 분리, 정제하였다. 전기 삽입될 hemA 유전자 DNA 0.1㎍(1㎕), 발현벡터 pET23a 0.2㎍(2㎕), 5X T4 리가제 완충액(2㎕), T4 DNA 리가제 1.5U(0.5㎕), 5mM ATP(1㎕) 및 정제수(2.5㎕)를 혼합하여 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 hemA 유전자가 삽입된 발현벡터 pET23a/hemA를 제조하였다(참조: 도 2). 그런 다음,E. coliBL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 ALA 신타아제를 발현하는 대장균을 작제하였으며, 이를 'E. coliBL21(DE3) with ALAS'라 명명하고, 1998년 7월 28일에 서울특별시 서대문구 신촌동 134번지에 소재하는 사단법인 한국종균협회에 KFCC-11046의 수탁번호로 기탁하였다.
실시예 3: ALA 생산의 최적조건 결정 및 수율 측정
실시예 2에서 제작된 hemA 유전자를 포함하고 있는 형질전환 대장균E. coliBL21(DE3) with ALAS(KFCC 11046)를 통상적인 암피실린(ampicillin) 함유 LB 배지에 ALA 생산을 위해 숙신산(succinic acid), 글리신(glycine) 및 각종 미네랄 등을 넣어 배양하였다. 최적의 ALA생산 조건을 결정하기 위하여, 배양액에 숙신산 60mM과 글리신 0, 30, 60, 90 또는 120mM의 농도별로 첨가한 후, ALA 생산수율을 측정하였고, 글리신 30mM과 숙신산 0, 30, 60, 90, 120 또는 150mM의 농도별로 첨가한후, ALA 생산수율을 측정하였다. 또한, 생산된 ALA가 포르포빌리노겐으로 전이되는 것을 억제하는 레불린산을 30 내지 90mM 농도로 배양초기, 대수증식기 중기 또는 대수증식기 말기에 첨가한 후, ALA 생산수율을 측정하였다. 그 결과, 배양액에 글리신 30mM 및 숙신산 90mM을 첨가할 경우, 무첨가시 보다 약 3배의 ALA 생산량을 보였고(참조: 도 3 및 도 4), 글리신 30mM 및 숙신산 90mM을 첨가하고 레불린산 30 내지 90mM을 대수증식기 말기에 첨가할 경우, 무첨가 또는 다른 성장시기에 첨가한 경우 보다 ALA 생산량의 증가를 보였다(참조: 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d 및 도 6). 도 5b, 도 5c, 도 5d 및 도 6에서 화살표는 레불린산 첨가시기를 나타낸다.
한편, 생성된 ALA양을 측정하기 위하여 배양 여과액 10㎕에 1M 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.7) 0.5㎖, 아세틸 아세톤 50㎕를 첨가한 다음, 10분간 가열하고, 실온에서 냉각하여 형성된 2-메틸-3-아세틸-5-프로피오닌산 피롤에 MER(modified Ehrlich's reagent: ρ-dimethylaminobenzaldehyde 1g, glacial acetic acid 30㎖, 70% perchloric acid 8㎖, acetic acid 12㎖) 3㎖을 가하여 15분간 실온에서 방치하였다. 이때 착색된 화합물 양을 555nm에서 측정한 다음 ALA 표준곡선으로부터 ALA 생산량을 환산하여 정량하였다.
실시예 4: 발효기를 이용한 ALA 생산의 최적화
ALA 생산의 산업화를 위해 발효기(Jar Fermentor, 한국발효기, 한국)를 이용한 발효조건을 최적화하는 실험을 실시하였다. 일반적인 배양조건으로 발효기의 3ℓ 용기에 1ℓ의 배양액을 넣어 실험을 행하였고, 배지는 실시예 3에서 검토된 30mM 글리신과 90mM 숙신산을 첨가한 LB 배지를 사용하였다. 배지의 초기 pH는 pH6.5로 적정하여 사용하였으며, 암피실린을 첨가하여 400rpm, 37℃에서 배양하였다. 배양 중 거품을 제거하기 위하여 안티-포움 A(Anti-foam A, Sigma, U.S.A.)를 첨가하였고, 산소 공급은 1Nℓ/분의 양으로 공급하였다.
중성 pH유지에 의한 ALA 생성효과를 관찰하기 위하여, 50㎖ LB 배지에 균을 접종한 후, 200rpm, 37℃에서 7시간 배양하여, 발효기에 5% 전배양균을 접종하였고, 5N HCl로 pH 7.0을 유지하며 실험을 행하였다. 중성 pH유지 및 레불린산 첨가에 의한 복합 효과를 관찰하기 위하여 50㎖ LB 배지에 균을 접종한 후, 200rpm, 37℃에서 7시간 배양하여, 30mM 글리신과 90mM 숙신산을 첨가한 LB 배지 1ℓ에 5% 전배양균을 접종하여 5N HCl로 pH 7.0을 유지하였고, 대수증식기 말기에 30mM 레불린산을 첨가하여 실험을 행하였다. 그 결과, 중성 pH를 유지하며 대수증식기 말기에 30mM의 레불린산을 첨가할 경우, ALA 생산량이 증가가함을 알 수 있었다(참조: 도 7). 도 7에서 화살표는 레불린산 첨가시기를 나타낸다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 ALA 생성균주 중 하나인 브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum)의 hemA 유전자가 삽입된 발현벡터로 형질전환되어 ALA 신타아제를 발현할 수 있는 대장균을 이용한 효율적인 생합성 ALA의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생합성 ALA 제조방법에 따르면, 종래의 다른 균주에 의한 ALA 제조방법이 가지는 ALA 생산에 장시간이 소요되고, 배양 조건이 어려우며, 세포 내 ALA 탈수효소(ALA dehydrase)의 피드-백 억제(feed-back inhibition) 현상에 의한 수율의 저하 등의 문제점을 개선함으로써, 제초 활성을 나타낼 수 있는 농도인 3 내지 5 mM 이상의 높은 수율로 ALA를 효율적으로 생산하여 정제단계가 없이도 제초제로서 활용할 수 있는 생합성 ALA를 제조할 수 있다.
[서열 목록]
서열번호: 1
서열의 길이: 29
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 1본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산 합성DNA
[서열 1]
GGGATCCATA TGGATTACAG CCAGTTCTT 29
서열번호: 2
서열의 길이: 27
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 1본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산 합성DNA
[서열 2]
GGGGAATTCC TACTCCGCCG CCAGCGA
서열번호: 3
서열의 길이: 1230
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: genomic DNA
기원
생물명: 브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum)
[서열 3]
ATGGATTACA GCCAGTTCTT TAATTCCGCC CTCGATCGCC TCCACACTGA ACGGCGTTAC 60
CGCGTGTTCG CCGATCTGGA ACGCATGGCG GGCCGATTTC CGCATGCGAT CTGGCACTCG 120
CCCAAGGGCA AGCGCGACGT CGTGATCTGG TGCTCCAACG ACTATCTCGG CATGGGTCAG 180
CATCCGAAGG TCGTCGGCGC CATGGTCGAG ACCGCAACGC GCGTCGGCAC CGGCGCGGGC 240
GGCACCCGCA ACATCGCCGG CACGCATCAT CCGCTGGTGC AGCTCGAGGC CGAGCTCGCC 300
GATCTCCACG GCAAGGAAGC CGCGCTGCTG TTCACCTCGG GCTATGTCTC GAACCAGACC 360
GGCATCGCGA CCATCGCAAA GCTCATTCCG AACTGCCTGA TCCTGTCGGA CGAGCTCAAC 420
CACAATTCAA TGATCGAGGG CATCCGCCAG TCCGGCTGCG AGCGGCAAGT GTTCCGCCAC 480
AACGATCTCG CCGACCTCGA AGCGCTGTTG AAGGCGGCGG GTGCGAACCG GCCGAAGCTG 540
ATCGCCTGCG AGAGCCTCTA TTCCATGGAC GGCGACGTCG CTCCGCTCGC CAAGATCTGC 600
GATCTCGCCG AGAAATATAA CGCGATGACC TATGTCGACG AAGTCCACGC GGTCGGCATG 660
TACGGCCCGC GCGGCGGCGG CATCGCCGAG CGTGACGGCG TCATGCATCG CATCGACATT 720
CTCGAAGGCA CGCTGGCCAA GGCGTTCGGC TGCCTCGGCG GCTACATCGC CGCCAACGGC 780
CGGATCATCG ACGCCGTGCG CTCCTATGCG CCGGGCTTCA TCTTCACCAC CGCGCTGCCG 840
CCGGCGATCT GCTCGGCCGC GACCGCCGCG ATCAAGCACC TGAAGACCTC GAGCTGGGAG 900
CGCGAGCGCC ACCAGGACCG CGCCGCCCGC GTCAAGGCGA TCCTCAACGC CGCCGGTCTC 960
CCGGTGATGT CGAGCGACAC CCACATCGTG CCGCTGTTCA TCGGCGATGC CGAGAAGTGC 1020
AAGCAGGCCT CCGACCTGCT GCTCGAAGAG CACGGCATCT ACATCCAGCC GATCAACTAT 1080
CCGACCGTCG CCAAGGGCTC CGAGCGCCTG CGCATCACGC CCTCGCCCTA TCACGATGAC 1140
GGCCTGATCG ATCAGCTCGC CGAAGCCCTG TTGCAAGTGT GGGACCGCCT CGGCCTGCCG 1200
CTCAAGCAAA AGTCGCTGGC GGCGGAGTAG 1230

Claims (1)

  1. 브라디리조비움 야포니컴(Bradyrhizobium japonicum)의 hemA 유전자가 삽입된 발현벡터 pET23a/hemA로 형질전환된 대장균 E. coli BL21(DE3) with ALAS(KFCC-11046)을 글리신 30 내지 120mM 및 숙신산 30 내지 150mM이 첨가된 배양액에서 배양하면서 레불린산 30 내지 90mM을 대수증식기 말기에 첨가하여 델타-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid)를 수득하는 공정을 포함하는 생합성 델타-아미노레불린산의 제조방법.
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