KR20040027589A

KR20040027589A - 형질전환 아그로박테리움 튜메파시언스 균주를 이용한코엔자임 큐10의 발효 제조방법

Info

Publication number: KR20040027589A
Application number: KR1020040009921A
Authority: KR
Inventors: 하석진; 허건; 이정걸; 이현철; 구봉성; 김상용
Original assignee: 주식회사 바이오앤진; 주식회사 케이티앤지
Priority date: 2004-02-16
Filing date: 2004-02-16
Publication date: 2004-04-01
Also published as: JP2005230008A; KR100578282B1; JP4262206B2; US20050181490A1

Abstract

본 발명은 코엔자임 Q₁₀생합성 관련 유전자들의 클로닝 및 발현 방법개발과 이를 이용하여 코엔자임 Q₁₀의 산업적 생산을 위한 발효조건 최적화에 관한 것이다. 먼저 코엔자임 Q₁₀생합성 관련 유전자들인 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 및 데카프레닐이인산 합성 효소(DPS) 유전자를 아그로박테리움 튜메페시언스로부터 클로닝하고, 아그로박테리움 튜메파시언스 BNQ 0605(기탁번호 KCCM-10413호) 내로 도입시켜 코엔자임 Q₁₀을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 최종적으로는 DXS와 DPS를 동시 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제작하고 이 벡터로 생산 균주에 형질전환시키는 방법에 관한 것이다. 발효조건 최적화를 위해서 배양 온도, 배양 pH, 교반조건, 통기조건 등의 기본 배양 조건을 최적화하였으며, 균체량을 높이기 위해 용존산소량 조절 및 유가식 배양 방법을 적용하였다. 균체 내의 코엔자임 Q₁₀함량을 높이기 위해 배지 최적화와 pH-stat을 이용한 유가식 배양을 통해 코엔자임 Q₁₀의 생산량을 극대화하였다. 그 결과 DXS와 DPS를 동시 도입시킨 아그로박테리움 튜메파시언스 재조합균을 이용하였을 때 최종적으로 배양 96시간에 88.2 g/L의 균체량에 642.1 mg/L의 코엔자임 Q₁₀이 생합성 되었고, 이때 균체 내의 코엔자임 Q₁₀함량은 7.30 mg/g-균체량 이었으며 6.69 mg/L-hr의 생산성을 나타내었다.

Description

형질전환 아그로박테리움 튜메파시언스 균주를 이용한 코엔자임 큐10의 발효 제조방법{Fermentation process for the production of coenzyme Q10 by the transformed Agrobacterium tumefaciens}

본 발명은 코엔자임(Coenzyme)Q₁₀의 고농도 생산을 위한 재조합 균주 및 그 균주를 통한 코엔자임 Q₁₀의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 유전자를 분리하고 분리된 유전자와 데카프레닐이인산 합성 효소(DPS) 유전자를 동시에 삽입시킨 발현벡터(pGPRX11)를 조립한 후 아그로박테리움 튜메파시언스 균주에 삽입시켜 형질전환 아그로박테리움 튜메파시언스 균주(기탁번호: KCCM-10554호)를 제작한 후, 재조합 형질전환 균주를 발효 배양시켜 코엔자임 Q₁₀을 발효 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

코엔자임(Coenzyme)Q₁₀(2,3-디메톡시(dimethoxy)-5-메틸(methyl)-6-데카프레닐(decaprenyl)-1,4-벤조퀴논(benzoquinone))은 1957년 Crane 등에 의해서 소 심장 미토콘드리아의 성원으로서 발견되었고, 1958년에 Folkers 등에 의해서 화학구조가 밝혀졌다.

(화학식 1)

유비퀴논 (ubiquinone)으로도 불리며 비타민과 유사한 특성을 가지는 지용성 퀴논 (quinone)으로서, 생명체의 건강한 기능을 위해서 필수적으로 요구되는 물질로 알려져 있다. 생명유지에 꼭 필요한 전자 및 양자 전달체인 코엔자임 Q₁₀은 미토콘드리아 내막에서의 ATP 합성을 지탱하고, 세포막을 안정화시켜 세포의 상태 및 기능을 유지시키며, 반응성 산소종의 제거제로서 작용하여 DNA, 지질, 단백질 등에 대한 산화적 손상을 막는 역할을 한다. 심장혈관 질환, 종양성 질환, 신경변성 질환 등을 완화 또는 예방하는 역할도 알려져 있다.

코엔자임 Q₁₀의 생산에는 동식물 조직으로부터의 추출하는 방법과 다단계의 유기 화학합성 방법, 그리고 미생물 배양을 통한 발효법이 있다. 동식물 조직으로부터 대용량으로 추출, 생산하는 것은 매우 고가의 비효율적인 일이고, 또한 유기합성에 의한 방법은 낮은 수율로 인해 상업적 생산에 적용되기에는 불충분하다. 그러나 미생물 세포로부터의 직접 추출법은 미생물 세포 및 코엔자임 Q₁₀의 수율에따라 경제적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 화학합성법의 단점을 극복할 수 있는 방안으로 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

발효법에 의한 코엔자임 Q₁₀의 생산은 크립토코커스 라우렌티 (Cryptococcus laurentii) FERM-P4834, 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis) FERM-P4835, 스포로볼로마이세스 살모니컬러 (Sporobolomyces salmonicolor) FERM-4836, 트리코스포론 sp. (Trichosporon sp.) (FERM-P4650, ATCC 20566), 아우레오바시디움 sp. (Aureobasidium sp.) 등에서 보고 되어 있다.

현재 코엔자임 Q₁₀의 제조사는 일본의 교와 (Kyowa), Nisshin Flourmilling Co., LTD, 가네카 (Kaneka), 아지노모토 (Ajinomoto), 독일의 머크 (Merck)사 등이며, 미생물을 배양한 후 미생물 세포로부터 추출하는 방법을 사용하고 있으나 그 수율이 매우 낮아 대단한 고가에 판매되고 있는 실정이다.

코엔자임 Q₁₀은 세포내의 농도가 극히 낮고 복잡한 조절 기작으로 인하여 균주 선발상의 어려움과 유전공학 및 대사공학적인 접근 방식의 필요성 등으로 국내에서는 체계적인 연구가 되고 있지 않다.

미생물 내에서의 코엔자임 Q₁₀생합성 경로는 많은 효소가 관여하는 다단계반응으로서 복잡하다. 하지만, 기본적으로는 크게 3개의 단계, 즉, 코엔자임 Q₁₀의 측쇄부분인 데카프레닐이인산 (Decaprenyl diphosphate)을 합성하는 단계, 퀴논환이 형성되는 단계, 그리고, 이들 2개의 화합물을 결합시켜 치환기를 순차적으로 변환하여 코엔자임 Q₁₀을 완성시키는 단계로 이루어져 있다.

이들 생합성 단계중에서 코엔자임 Q₁₀의 측쇄 길이를 결정지어 주는 데카프레닐이인산 합성 효소 (decaprenyl diphosphate synthase, 이하 DPS라 한다)와 측쇄를 만드는데 기본 요소가 되는 이소펜테닐이인산 (isopentenyl diphosphate)을 만드는데 관여하는 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제 (1-deoxy-D-xylulose 5- phosphate synthase, 이하 DXS라 한다)가 가장 중요한 단계라 여겨진다. 따라서 코엔자임 Q₁₀의 생산 효율을 높이기 위해서 생합성에 관여하는 이들 두개의 핵심 유전자를 생산 균주인 아그로박테리움 튜메파시언스에 도입하는 것이 필요하다.

지금까지 DPS는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 글루코노박터 서브옥시단스 (Gluconobacter suboxydans) 등 몇 종류의 미생물에서 분리되고 또한 대장균에 도입된 예가 있지만, 이들 재조합 균주에서는 코엔자임 Q₁₀의 생산성이 충분치 않았다. 또한, DXS의 경우도 대장균에서 과량 발현 시켰을때 대장균의 코엔자임 Q₈의 생산성이 증가한다는 보고가 있지만 대장균의 코엔자임 Q₁₀의 생산성이 워낙 낮아서 실제 코엔자임 Q₁₀의 생산에 쓰이기에는 어려움이 있었다. 따라서 코엔자임 Q₁₀을 고생산하는 균주에 직접 핵심 효소들을 도입하는 것이 필요하게 되었다.

이러한 제조합 균주를 이용하여 코엔자임 Q₁₀을 산업적으로 생산하기 위해서는 균체 내 코엔자임 Q₁₀의 함량을 최대로 높이는 동시에 균체량을 최대로 높이기 위한 발효 조건이 필요하며 이를 위해 기본 배양 조건인 배양 온도, 배양 pH, 통기조건, 교반조건 등을 최적화가 필요하였으며 균체량을 높이기 위해 용존산소량 조절법 그리고 균체 내의 코엔자임 Q₁₀의 함량을 높이기 위한 배지 최적화와 마지막으로 pH-stat을 이용한 유가식 배양법 등의 발효조건의 확립 등이 필요하게 되었다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 코엔자임 Q₁₀생합성에 있어서 핵심 효소인 DXS를 클로닝 함과 동시에 DXS와 더불어 이미 본 발명자들이 앞서 클로닝한 DPS를 아그로박테리움 튜메파시언스 (Agrobacterium tumefaciens)내에서 각각 발현 시킬 수 있는 재조합 벡터, 그리고 DPS와 DXS를 동시 발현시킬 수 있는 재조합 벡터의 개발하는 것이다. 또한 상기의 벡터로 본 발명자들이 기존에 개발한바 있는 코엔자임 Q₁₀고생산성 균주 BNQ 0605 (KCCM-10413, 대한민국 공개특허 제2002-79661호)를 형질전환한 뒤 기본 발효 조건 확립 및 용존산소량 조절법과 배지 최적화 그리고 pH-stat을 이용한 유가식 배양법 통해 고농도의 코엔자임 Q₁₀을 생산하는데 그 목적이 있다.

도 1은 아그로박테리움 튜메파시언스로부터 클로닝 한 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS)의 전체 유전자 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. 단백질 크기는 68kDa 이다.

도 2는 본 발명자들이 클로닝한 DXS와 다른 미생물들로부터 유래한 DXS의 아미노산 서열들을 정렬하여 비교한 것으로서 동일한 아미노산들은 별표로 표시하였다. 수소 전달에 관여할 것으로 생각되는 히스티딘 잔기를 포함하는 보존된(conserved) 부위(motif)는 박스 안에 표시하였고, 싸이아민 다이포스페이트 결합부위라 예상되는 곳은 그늘지게 표시하였다. 각 DXS 들의 유래한 미생물들은 다음과 같다. ATUM: 본 발명자들이 클로닝한 DXS, ECLI: E. coli, HINF: H. influenzae, BSUB: B. subtilis, RCAP: R. capsulatus, SYNE: Synechocystis sp. PCC6803, ATHA: A. thaliana, CLA190: Streptomyces sp. strain CL190.

도 3은 재조합 플라스미드 pQX11의 구조이다.

도 4는 pQX11를 이용하여 대장균에서 발현된 DXS의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도면으로, lane A : 야생형 대장균, lane B : pQX11이 형질도입된 대장균을 IPTG 처리한 것, lane C : 발현된 DXS를 정제한 것, lane D : 표시자이다.

도 5는 대장균에서 발현되는 DXS 효소의 활성 측정을 나타낸 크로마토그램으로, A는 야생형 대장균의 세포 추출액을 이용한 반응결과이고, B는 정제된 DXS를 이용한 반응결과이다. 그리고, C는 B와 같은 조건의 반응이지만 싸이아민 다이포스페이트를 첨가하지 않은 반응 결과이다.

도 6은 재조합 플라스미드 pGP85와 pGX22의 구조이다.

도 7은 재조합 플라스미드 pGPRX11의 구조이다.

도 8은 5L 발효조에서 발효시간 경과에 따른 코엔자임 Q₁₀의 생산량 및 균주 성장곡선을 나타낸 그래프이다.

본 말명은 아그로박테리움 튜메파시언스에서 분리된 신규한 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기서열을 지니는 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 유전자를 제공하는 것이다.

또한 서열번호 1의 유전자에 의해 발현되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 신규한 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 효소를 제공하는 것이다.

한편 본 발명은 데카프레닐이인산 합성 효소(DPS) 유전자와 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 유전자를 동시에 삽입시킨 재조합 발현 벡터(pGPRX11)를 제공하는 것이다.

또한 상기 재조합 발현벡터(pGPRX11)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시언스(BNQ-pGPRX11) (기탁번호: KCCM-10554호)를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시언스(BNQ-pGPRX11) (기탁번호: KCCM-10554호)를 옥수수 침지분말 40g/L, 일인산칼륨 0.5 g/L, 이인산칼륨 0.5 g/L, 황산암모늄 15.0 g/L, 황산마그네슘 0.25 g/L를 함유한 배지에서 배양시킴을 특징으로 하는 코엔자임 Q₁₀의 발효 제조 방법을 제공하는 것이다.

이 때 상기 형질전환 균주의 배양 온도는 32℃이고, 배양 pH는 7.0, 교반조건은 400∼600 rpm, 통기조건은 0.8∼1.2 vvm임을 특징으로 한다. 또한 이 때 용존산소량은 0∼10%로 조절한다. 한편 코엔자임 Q₁₀함량을 높이기 위해 pH-stat을 이용한 유가식 배양법이 바람직하다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 크게 재조합 균주의 제작과 발효조건 최적화의 두 가지로 나뉜다. 먼저 재조합 균주의 제작은 아그로박테리움 튜메파시언스의 DXS 효소 유전자 클로닝, DXS 효소의 대장균 내 발현시스템 구축, IPTG 유도를 통한 DXS의 발현 및 발현된 DXS의 활성 확인, 그리고 DPS 또는 DXS, 그리고 DPS 와 DXS 두개의 유전자가 포함된 재조합 벡터 제작 및 상기의 재조합 벡터로 형질전환 된 두 재조합 균주 BNQ-pGP85와 BNQ-pGX22, BNQ-pGPRX11의 제작으로 구성된다.

발효조건 최적화는 재조합 균주 BNQ-pGPRX11를 이용하여 고농도의 코엔자임 Q₁₀의 생산을 위한 기본 배양 조건인 배양 온도, 배양 pH, 교반조건, 통기조건 등을 최적화 하였고 용존산소량 조절법과 유가식 배양을 통해 균체량을 증가시켰으며 옥수수 침지분말, 황산암모늄, 일인산칼륨, 이인산칼륨, 황산마그네슘, 등의 산업화 배지를 이용한 배지 최적화와 마지막으로 pH-stat을 이용한 유가식 배양을 통해 코엔자임 Q₁₀의 생산량을 증대시켰다.

DXS 유전자를 얻기 위하여 코엔자임 Q₁₀고생산 균주로 실제 코엔자임 Q₁₀생산에 이용되고 있는 아그로박테리움 튜메파시언스를 사용하였다. 일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열도 어느 정도 유사하고 그 크기도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 아그로박테리움 튜메파시언스의 DXS 유전자도 약 1.9kb 정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 이미 알려진 염기서열을 바탕으로 아그로박테리움 튜메파시언스의 DXS 전체 유전자를 클로닝 하였다. 클로닝에는 대장균 XL1-Blue와, 클로닝 벡터 pSTBlue-1를 이용하였고, DXS의 대장균 내 발현을 위하여 대장균 JM109와 발현용 벡터 pQE30 (QIAGEN)을 사용하였다. 대장균과 아그로박테리움 튜메파시언스 모두 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지를 사용하였고 plate 배지로는 각각 LB 아가를 사용하였다. 배양 방법은 대장균의 경우, 37℃, 220rpm 조건에서 12시간 배양하였고, 아그로박테리움 튜메파시언스의 경우에는 30℃, 240rpm 조건에서 16~24시간 배양하였다.

아그로박테리움 튜메파시언스에 도입하기 위한 DXS 유전자를 얻기 위해서는 pQX22를 주형으로 하고, DPS 유전자를 획득하기 위하여 본 발명자들이 개발한 바 있는 DPS 유전자 함유 플라스미드 pQD22 (Biotechnol. Progress 2003)를 주형으로 하여 PCR 방법에 의하여 DNA단편들을 획득한 뒤, 이들 DNA단편들을 먼저 pST1-Blue 벡터에 클로닝한 후 최종적으로는 A. tumefaciens용 발현벡터인 pGA748에 클로닝하였다. DPS와 DXS포함된 재조합 벡터 pGP85 와 pGX22는 먼저 E. coli를 형질전환시켜 다량의 플라스미드를 확보한 뒤 DNA 염기서열 분석을 하였다. 최종적으로 완성된 재조합 벡터 pGP85와 pGX22를 전기자극 방법 (electroporation) 방법으로 코엔자임 Q₁₀생산균주(BNQ 0605)에 주입시킨 다음, 3 ㎍/㎖의 테트라싸이클린을 포함하는 LB 고체 배지로 선별하였다. 선별된 형질전환 균주는 DPS가 주입된 것을 BNQ-pGP85라 하고, DXS가 주입된 것을 BNQ-pGX22라 명명하였다.

한편 DPS와 DXS를 동시에 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제작하기 위하여 리보좀 결합 부위(RBS)를 포함하는 DXS를 PCR을 통해서 얻은 후 PCR 산물을 플라스미드 pGP85에 삽입하였다. 이렇게 DPS 와 DXS가 동시에 들어있는 플라스미드를 pGPRX11이라 명명하였다. 형질전환된 코엔자임 Q₁₀생산균주는 플라스미드 pGA748 내부의 DNA 염기서열을 사용한 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 하여 형질전환 여부를 확인하였으며 또한 코엔자임Q₁₀의 생산 여부를 통해 확인하였다.

대부분의 DNA는 아가로스겔 (TAE buffer, 1%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 Geneclean II 겔 추출장지(Q-biogene, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(Boehringer Mannheim)를 이용하였다.

기본 배양조건 최적화실험을 위한 생장배지와 생산배지의 조성은 아래 표 1, 2와 같으며 생장배지 배양은 100 mL의 생장배지가 담긴 500 mL 삼각 플라스크에 접종하여 200rpm, 32℃에서 16∼24시간동안 진탕 배양하였다. 기본 배양 조건 최적화를 위한 실험은 5 L 발효기(코바이오텍)를 이용하여 수행하였으며 각각 배양 온도(25℃~35℃), 배양 pH(6.0~8.0), 교반조건(300~600 rpm), 통기조건(0.5~2.0 vvm)을 달리하며 약 4일간 배양하였다.

생장 배지의 성분 구성표

성분	농도(g/L)
설탕	50
효모추출물	15
펩톤	15
염화나트륨(NaCl)	7.5

생산배지의 성분 구성표

성분	농도(g/L)
옥수수 침지분말	40
황산암모늄	10
일인산칼륨(KH₂PO₄)	0.5
이인산칼륨(K₂HPO₄)	0.5
황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	0.25
설탕	50

균체량을 높이기 위한 방법으로 용존산소량 조절법과 유가식 배양법을 이용하였다. 용존산소량 조절법은 일반 배양 시 배양 24시간 후에 용존산소가 0까지 감소하므로 이때 용존 산소를 조절하여 주어 균체량을 높이기 위한 방법이다. 이때 용존 산소량의 조절은 교반속도를 달리하여 0~30%로 각각 조절하여 주었다. 유가식 배양법은 배양 중에 탄소원으로 사용되는 설탕의 배지내의 농도가 고갈되었을 때 추가로 탄소원을 첨가하여 주어 균체량을 증가시키도록 하였다.

균체내의 코엔자임 Q₁₀의 함량을 높이기 위한 방법으로 배지 최적화를 수행하였으며 각각 옥수수 침지분말, 황산암모늄, 등의 산업화 배지의 최적 농도를 확립하였다. pH-stat을 이용한 유가식 배양법은 배양 중에 탄소원으로 사용되는 설탕의 농도가 고갈되면 pH가 증가하는데 이때 일정 pH이상 증가하면 설탕이 자동으로 첨가되는 방법으로 균체량의 증가와 균체 내 코엔자임 Q₁₀의 함량을 증가시키는 효과를 보았다.

실험 중 배양액내의 코엔자임 Q₁₀의 추출과 분석법은 본 발명자들이 기존에 개발한 바 있는 추출 방법과 분석조건(대한민국 공개특허 제2002-79661호)으로 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1) 아그로박테리움 튜메파시언스의 DXS 유전자의 클로닝

DXS 유전자를 클로닝하기 위하여 아그로박테리움 튜메파시언스의 cDNA를 분리하였다. 이미 밝혀져 있는 다른 미생물들의 DXS 아미노산 서열들을 비교하여 유사성이 높은 두 아미노산 서열부위를 선정하고 그 아미노산 서열로부터 DNA 염기 서열을 유추하여 한 쌍의 PCR 프라이머를 제작하였다.

F1 5'-CA(TC)AA(AG)ATCCTCCT(CG)ACCGGCCGC-3 (서열번호 3)

R1 5'-CGC(AG)TGCTG(TC)TC(CG)GCGATGCC-3' (서열번호 4)

상기의 프라이머들을 이용하여 아그로박테리움 튜메파시언스의 cDNA로부터 873 bp 의 DNA 단편을 증폭할 수 있었다. 이렇게 얻은 PCR 결과물이 기존에 알려진 DXS들과 유사성이 높다는 것을 다양한 미생물 유래의 DXS의 DNA 염기서열과 비교하여 알아내었다. 전체 DXS 유전자를 얻기 위해서는 5'- 그리고 3'-레이스(RACE, rapid amplification of cDNA ends) 방법을 이용하였는데 5'- 그리고 3'-레이스 키트를 사용하여 제조업자의 매뉴얼(Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany)에 따라서 진행하였다. 각각의 레이스를 위해서 DXS 유전자 특이적 프라이머들을 제작하였다. 5'-레이스를 위한 프라이머는 아래와 같다.

SP1 5'-CTCGGCCATCTTGTCGAGGCC-3' (서열번호 5)

SP2 5'-ATTCGGCATGGCGGCGGTGAC-3' (서열번호 6)

SP3 5'-GCCGACGATCTTGTCGTCGAG-3' (서열번호 7)

3'-레이스를 위한 프라이머는 아래와 같다.

SP4 5'-GCAGCTTTCGGTCGCCAAG-3' (서열번호 8)

이들 프라이머들을 이용하여 레이스를 수행한 결과 DXS를 포함하는 cDNA를 얻을 수 있었다. DXS의 오픈 리딩프레임(open reading frame)을 얻기 위하여 개시코돈(start codon)으로 시작하여 종료코돈(termination codon)으로 끝나는 PCR 프라이머를 제작하였는데, 이후의 클로닝 과정을 용이하게 하기 위하여 전방 프라이머(Forward primer)에는 BamHI 절단위치를 포함시키고 후방 프라이머(Reverse primer)에는 HindIII 절단위치를 포함시켰다. 각 프라이머들의 DNA 염기서열은 아래와 같다.

DXF1 5'-GGATCCTTGACCGGAATGCCACAGAC-3' (서열번호 9)

DXB1 5'-AAGCTTCTCAGCCGGCGAAACCGAC- 3' (서열번호 10)

이들 프라이머를 이용한 PCR 결과 전후방에 각각 BamHI과 HindIII 절단위치를 포함하는 1,920 bp의 DXS cDNA 유전자를 얻을 수 있었다(도 1). 이렇게 얻은 cDNA는 DXS의 DNA 염기 서열을 아미노산으로 바꾸어(translation) 기존에 알려져 있는 DXS의 아미노산 서열들과 비교한 결과 37~59%의 높은 유사성을 보였으며, DXS의 아미노산 서열에서 필수적으로 발견되는 요소인 싸이아민 다이포스페이트 결합부위(thiamine diphosphate binding domain)와 수소 전달에 관여하는 것으로 알려진 히스티딘 잔기가 새로 클로닝한 DXS의 아미노산 서열에 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다(도 2).

(실시예 2) 아그로박테리움 튜메파시언스로부터 유래한 DXS의 대장균 내 발현 시스템 구축

아그로박테리움 튜메파시언스로부터 클로닝한 DXS를 대장균내에서 발현시켜활성을 확인하기 위하여 대장균 재조합 단백질 발현 시스템 중 잘 알려진 pQE 시스템(QIAGEN, USA)을 이용하였다. pQE 시스템은 대장균의 RNA 중합효소 (polymerase)로도 강력하게 발현이 가능한 T5 프로모터를 이용하기 때문에 일반적으로 많이 쓰이는 JM109와 같은 숙주 세포 대장균을 이용할 수 있었다.

5' 말단에 BamHI 절단위치와 3' 말단에 HindIII 절단위치를 가지고 있는 DXS 유전자 절편에 제한효소 BamHI과 HindIII를 동시에 처리한 후, 아가로스 겔 상에서 추출하여 1.9 kb DXS 유전자의 DNA를 분리, 정제하였다. 다음으로 발현용 벡터 pQE30(3.4kb)를 마찬가지로 BamHI, HindIII 이중 제한 효소 처리를 수행하고, 1.9 kb인 클론되어질 DXS 유전자를 삽입하였고 이를 pQX11이라 명명하였다(도 3).

(실시예 3) IPTG 유도를 통한 DXS 유전자의 대장균 내에서의 발현과 정제 및 SDS 전기영동 분석

pQX11 벡터가 형질도입된 대장균 JM109를 배양한 후 흡광도(600nm)가 0.5일 때 0.1mM의 IPTG을 처리하고 30℃에서 2시간 동안 반응시켜 DXS를 발현 유도하였다. 발현된 단백질 중 가용성 분획을 Ni-NTA 수지와 섞은 후 폴리프로필렌 컬럼에 넣고 240 mM의 이미다졸(imidazole)이 들어있는 완충용액으로 활성 부위만을 분리시켰다. 발현된 단백질은 10% SDS 전기영동를 이용하여 확인하였다. 분석 시료는 샘플 용액(1% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 10% 글리세롤, 브로모페놀 불루)과 함께 10분간 끓인 후 사용하였고, 쿠마시블루 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue R-250)를 이용하여 염색·확인하였다.

pQE 발현 시스템을 이용하여 IPTG를 처리하여 DXS의 발현여부를 SDS 전기영동를 이용하여 확인하였다(도 4). DNA 염기서열을 바탕으로 얻은 아미노산 서열을 통해 DXS의 크기는 68.05kDa로 추정되었는데 SDS 전기영동를 통하여 이를 확인할 수 있었다. 다른 단백질에 비해 뚜렷하게 많이 발현되었고 정제 또한 순수하게 되었음을 확인할 수 있었다.

(실시예 4) DXS 의 활성측정

발현된 DXS 의 활성을 측정하기 위해 pH 8.0 40mM 트리스 완충용액에 1mM 염화마그네슘, 1mM 싸이아민 다이포스페이트, 1mM 파이루베이트, 2mM 글리세르알데하이드 3-포스페이트, 5mM 머르캅토에탄올, 그리고 20㎍의 정제된 DXS를 섞은 후 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응의 종료를 위해 80℃에서 3분간 가열하였다. 변성된 단백질을 제거하기 위하여 13,000rpm 으로 원심분리한 후 상징액만을 취하여 고속액체크로마토그래프 시스템으로 반응 생성물을 분석하였다. 반응 생성물은 Zorbax-NH2 컬럼(Agilent technologies, Palo Alto, CA)과 자외선 검출기를 이용하여 분석하였다. 용매는 pH 3.5의 100mM 포타슘포스페이트 모노베이직 용액이었으며 유속은 1.3ml/min 이었고, 자외선 파장은 195nm 였다.

효소반응 결과물의 분석결과 예상했던 DXP가 생성되었음을 크로마토그램을 통해서 확인할 수 있었다(도 5). 또한 싸이아민 다이포스페이트가 없는 효소반응에서는 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트(DXP)가 생성되지 않는 것을 보아 본 발명자들이 아그로박테리움 튜메파시언스로부터 클로닝한 유전자가 DXS 임을 결론지을 수 있었다.

(실시예 5) 재조합 플라스미드의 제작

DPS 및 DXS의 cDNA를 포함하는 DNA를 제작하기 위하여, 각각 본 발명자들이 기존에 개발한 바 있는 재조합 플라스미드 pQD22 및 pQX11를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머로서, DPS용으로는 5' DNA 조각은 제한효소 HindIII 절단위치를 포함하며, 3' DNA 조각은 제한효소 MluI 절단위치를 포함하는데, 이들의 각각의 염기서열은 다음과 같다.

DFF8 5'-AAGCTTTTGCCGCGCAAGGCGTCAG-3' (서열번호 11)

DFB5 5'-ACGCGTTCAGTTGAGACGCTCGATGCA G-3' (서열번호 12)

DXS를 얻기위하여 사용된 PCR 프라이머는 5' DNA 조각은 제한효소 HindIII 절단위치를 포함하며, 3' DNA 조각은 제한효소 EcoRI 절단위치를 포함하는데, 이들의 각각의 염기서열은 다음과 같다.

DXF2 5'-AAGCTTTTGACCGGAATGCCACAGAC- 3' (서열번호 13)

DXB2 5'-GAATTCTCAGCCGGCGAAACCGAC- 3' (서열번호 14)

PCR 결과물들은 1% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드들을 용리하여 정제하였다. 정제된 DNA단편은 pSTBlue-1(Novagen Co.) 클로닝벡터와 16℃에서 밤새 연결반응(ligation)시켰다. 이렇게 얻은 재조합 플라스미드들은 대장균 XL1-Blue에 형질전환시키고 엠피실린이 든 (50 mg/L) 고체 배지에 도말한 후 37℃ 에서 밤새 배양하였다.

형질전환체로부터 얻어진 재조합 플라스미드들의 도입 DNA (insert DNA) 각각의 제한 효소 절단 지도 (restriction map)의 확인 및 DNA 염기서열 분석을 통하여 DNA 단편이 올바른 것인지를 확인하였다. 이렇게 확인된 재조합 플라스미드를 DPS의 경우 제한효소 HindIII와 MluI 로, DXS의 경우 HindIII와 EcoRI 으로 2시간 정도 절단하여, 순수하게 DPS와 DXS를 코딩(coding)하는 cDNA 만을 얻었다. 그런 다음, 각 cDNA 절편들을 역시 HindIII와 MluI 또는 HindIII와 EcoRI 으로 절단된 아그로박테리움 튜메파시언스 용 발현 벡터 pGA748과 연결시킨 후 대장균에 형질전환 시켰다. 그 결과 얻은 플라스미드들을 각각 pGP85와 pGX22 라 명명하였다(도 6).

DPS와 DXS를 동시발현시키는 벡터를 만들기 위하여 리보좀 결합 부위(RBS)를 포함하고 있는 DXS를 플라스미드 pGX22를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머로서, 5' DNA 조각은 제한효소 XhoI 절단위치를 포함하며, 3' DNA 조각은 제한효소 ClaI 절단위치를 포함하는데, 이들의 각각의 염기서열은 다음과 같다.

pGPXF1 5'-CTCGAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGG-3' (서열번호 15)

pGPXB1 5'-ATCGATTCAGCCGGCGAAACCGAC-3' (서열번호 16)

PCR 결과물은 제한효소 XhoI과 ClaI으로 2시간 정도 절단한 뒤 아가로스 겔 상에서 전기영동 후 순수하게 용리하였다. 그런 다음, DNS 절편을 역시 XhoI과 ClaI으로 절단된 플라스미드 pGP85와 연결시킨 후 대장균에 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균으로부터 추출하여 시퀀스를 확인한 플라스미드를 pGPRX11이라 명명하였다.

(실시예 6) 전기자극(electroporation)을 이용한 재조합 박테리아의 제작

전기자극에 사용할 수 있는 컴피턴트 세포(competent cell)를 만들기 위하여코엔자임 Q₁₀생산균주 BNQ0605의 콜로니를 5mL의 LB 배지에 접종하여 30℃, 240 rpm 으로 밤새 배양한 종배양액 1 mL을 30mL의 LB 배지에 접종하여 세포의 밀도가 5-10ㅧ107 cells/ml이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 세포들을 EPB1 버퍼(20mM Hepes pH 7.2, 5% glycerol)로 세 차례 씻어 준 후 최종적으로 EPB2 버퍼(5mM Hepes pH 7.2, 15% glycerol)로 현탁시킨 후 -70℃에서 냉각 보관하였다.

상기의 방법으로 만든 컴피턴트 세포 80㎕ 에 7~10 ㎍의 재조합 플라스미드 pGP85와 pGX22, 그리고 pGPRX11을 전기자극장치(MicroPulser, BIORAD)를 이용해서 25㎌, 2.5 ㎸로 0.5초간 전기자극을 주어 주입하였다. 1 ㎖의 LB 배지를 첨가한 후 30℃에서 2-3시간 동안 배양한 후 3㎍/㎖의 테트라싸이클린이 첨가된 LB 고체 배지에 도말한 후 72시간 동안 30℃에서 배양하여 DNA가 삽입된 세포주 콜로니들을 선별하였다.

선별된 콜로니들은 콜로니 PCR을 통해서 재조합 플라스미드의 삽입여부를 확인하였다. 콜로니 PCR 에 사용된 프라이머는 발현벡터인 pGA748의 멀티클로닝사이트(MCS)의 전후 부위 DNA 염기서열을 이용한 것으로 그 염기서열은 아래와 같다.

p748F1 5'-ATCCTTCGCAAGACCCTTC-3' (서열번호 17)

p748B1 5'-GCTTAGCTCATCGCAGATC-3' (서열번호 18)

PCR 반응은 투쓰 픽한 콜로니를 주형으로 하여 진행하였다. 선정했던 콜로니들의 PCR 결과 예상했던 DPS와 DXS 크기의 DNA 밴드를 아가로스 겔 상에서 확인할 수 있었다. 이 콜로니 PCR 결과로 재조합 발현벡터 pGP85 와 pGX22 가 코엔자임 Q₁₀생산균주 아그로박테리움 튜메파시언스 BNQ 0605에 정상적으로 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 이렇게 만들어진 균주들은 pGP85가 형질도입된 것을 BNQ-pGP85, pGX22가 형질도입된 것을 BNQ-pGX22, pGPRX11이 형질도입된 것을 BNQ-pGPRX11 (기탁번호 KCCM-10554호) 이라 명명하였다.

(실시예 7) 코엔자임 Q₁₀생산성 확인

실시예 6에서 제작한 재조합 균주 BNQ-pGP85, BNQ-pGX22 그리고 BNQ-pGPRX11의 코엔자임 Q₁₀생산성을 확인해 보기 위하여 대조군으로서 플라스미드 pGA748만을 삽입시킨 BNQ-pGA748을 함께 3㎍/㎖의 테트라싸이클린이 들어있는 통상적인 LB 배지 5ml에 접종한 후 30℃, 240rpm 조건으로 밤새 배양하였다. 종배양액 0.1㎖을 역시 3㎍/㎖의 테트라싸이클린이 들어있는 LB 배지 5ml에 접종한 후 30℃, 240rpm 조건으로 36시간 배양하였다. 배양액으로부터 코엔자임 Q₁₀의 추출 및 분석은 본 발명자들이 기존에 개발한 방법에 따라서 진행하였으며, 그 결과는 아래 표3과 같다.

재조합 균주들의 생장 및 코엔자임 Q₁₀생산성 비교

균주	생장(OD₆₆₀)	Coenzyme Q₁₀(㎍/g-DCW)
BNQ-pGA748	2.42	445
BNQ-pGX22	2.86	561
BNQ-pGP85	2.73	585
BNQ-pGPRX11	2.15	909

(실시예 8) 기본 배양조건 최적화

실시예 7에서 확인한 재조합 균주 BNQ-pGPRX11를 이용하여 기본 배양 조건 최적화를 위한 실험을 수행하였다. 배양 온도 (25℃~35℃), 배양 pH (6.0~8.0), 교반조건 (300~600 rpm), 통기조건 (0.5~2.0 vvm) 등을 달리 하여 배양을 수행하였으며 그 결과 온도는 32℃, 배양 pH는 7.0, 교반조건은 500 rpm, 통기조건은 1.0 vvm이 균체의 성장과 코엔자임 Q₁₀의 생합성에 있어서 최적 기본 배양 조건임을 확인하였고 이때 코엔자임 Q₁₀의 생합성량은 250.4 g/L이었으며 균체량은 45.4 g/L 이었다. 자세한 결과는 아래의 표 4와 같다.

재조합 균주 BNQ-pGPRX11의 기본 배양 조건

	균체량(g/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/g-DCW)
배양 온도(℃)	25	34.3	130.1	3.79
	30	37.4	188.4	5.04
	32	38.4	203.2	5.29
	35	39.1	172.3	4.41
배양 pH	6.0	32.1	151.6	4.72
	6.5	38.2	204.6	5.36
	7.0	42.1	224.8	5.33
	7.5	40.4	188.4	4.66
	8.0	49.7	110.6	2.23
교반 조건(rpm)	300	36.4	180.2	4.95
	400	40.2	219.6	5.46
	500	44.6	235.8	5.29
	600	45.7	204.6	4.48
통기 조건(vvm)	0.5	34.2	204.6	5.98
	1.0	45.4	250.4	5.51
	1.5	45.8	235.8	5.15
	2.0	43.7	219.8	5.03

(실시예 9) 용존산소량 조절법

실시예 7에서 확인한 기본 배양조건에서 배양 할 경우 약 24시간이 경과하면 배양액내의 용존산소량이 0까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 용존 산소량은 균체의 성장에 있어서 중요한 요소 중의 하나이므로 이를 조절하여 줌으로 해서 균체의 성장을 증가시키기 위해 용존산소량을 교반속도를 이용하여 0~10, 10~20, 20~30%로 조절하여 주었으며 조절하지 않은 경우와 비교 하였다. 그 결과 용존 산소량을 0~10%으로 조절하여 준 경우 균체의 성장과 코엔자임 Q₁₀의 생합성에 있어서 최적 조건임을 확인하였으며 이때 균체량은 54.1 g/L까지 증가하였으며 코엔자임 Q₁₀의 생합성도 이에 따라 증가하여 281.6 mg/L이었다(표 5)

BNQ-pGPRX11의 코엔자임 Q₁₀생산을 위한 최적 용존 산소량

	균체량(g/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/g-DCW)
No control	44.9	250.4	5.57
DO 0~10 %	51.2	280.2	5.47
DO 10~20 %	48.1	265.8	5.52
DO 20~30 %	40.0	221.3	5.53

(실시예 10) 유가식 배양법

균체량을 증가시키기 위한 또 다른 방법으로 탄소원이 고갈될 경우 추가로 탄소원을 첨가해주는 유가식 배양법을 사용하였다. 유가식 배양은 탄소원으로 사용되는 설탕이 고갈될 경우 50 g/L씩 간헐적으로 첨가해주는 방법으로 하였다. 이때 균체량은 70.2 g/L 이었으며 코엔자임 Q₁₀의 생합성량은 352.6 mg/L이었고 균체당 코엔자임 Q₁₀의의 함량은 5.02 mg/g-균체량 이었다 (표 6).

BNQ-pGPRX11의 코엔자임 Q₁₀생산을 위한 유가식 배양

	균체량(g/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/g-DCW)	생산성(mg/g-DCW)
회분식 배양	51.2	280.2	5.47	3.89
유가식 배양	70.2	352.6	5.02	3.67

(실시예 11) 배지 내 옥수수 침지분말의 최적 농도

배지성분 중에 질소원으로 사용되는 옥수수 침지분말의 최적 농도를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 옥수수 침지분말은 가격이 저렴할 뿐 아니라 다양한 무기물들을 함유하고 있어서 산업용 배지의 구성성분으로 많이 사용되고 있다. 실험 결과 40 g/L의 옥수수 침지분말을 첨가한 경우 균체량은 71.2 g/L 이었으며 코엔자임 Q₁₀의 생합성량은 438.6 mg/L이었고 균체당 코엔자임 Q₁₀의의 함량은 6.16 mg/g-균체량 이었다(표 7).

질소원으로 사용되는 옥수수 침지분말의 최적 농도

	균체량(g/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/g-DCW)
CSP 30 g/L	62.4	361.0	5.78
CSP 40 g/L	71.2	438.6	6.16
CSP 50 g/L	72.6	403.7	5.56
CSP 60 g/L	70.2	352.6	5.02

(실시예 12) 배지 내 황산암모늄의 최적 농도

균체내의 코엔자임 Q₁₀의 함량을 높이기 위해 황산암모늄의 최적 농도를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 실험 결과 황산암모늄은 15 g/L를 첨가했을 경우 가장 우수한 결과를 보여 최종적으로 배양 96시간에 79.2 g/L의 균체가 생성되었고 코엔자임 Q₁₀의 생합성량은 548.2 mg/L이었으며 이때의 균체내의 코엔자임 Q₁₀함량은 6.92 mg/g-균체량 이었다(표 9).

황산암모늄의 최적 농도

황산암모늄	균체량(g/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/g-DCW)
5 g/L	71.4	472.6	6.62
10 g/L	78.1	521.7	6.68
15 g/L	79.2	548.2	6.92
20 g/L	79.0	500.1	6.33

(실시예 13) pH-stat을 이용한 유가식 배양법

유가식 배양 방법에 있어서 균체량과 균체내의 코엔자임 Q₁₀의 함량을 높이기 위해 pH-stat을 이용한 탄소원 첨가방법과 기존의 간헐적 탄소원 첨가방법을 비교하였다. pH-stat을 이용한 방법은 배양 중에 설탕이 고갈될 경우 배양액의 pH가 7.0에서 증가한다는 것을 이용한 것으로 이때 pH 조절용으로 사용되는 염산 수용액(1.0N) 대신에 75%의 고농도의 설탕 용액을 첨가해 주는 방법이다. 소량의설탕 용액이 첨가되면 pH는 곧 7.0으로 낮아지고 다시 고갈되면 pH의 증가로 인해 고농도의 설탕 용액이 첨가되는 방법이다. 이 방법을 사용하게 되면 배양액내의 설탕의 농도는 항상 거의 0 g/L에 가까운 매우 낮은 상태를 유지하게 되며 이로 인해 당 농도의 증가로 인한 균체의 성장에 대한 저해를 적게 받으며 균체의 성장을 원활히 유도할 수가 있었다. 실험 결과 pH-stat을 이용한 유가식 배양이 간혈적 첨가에 의한 유가식 배양보다 효과적이라는 것을 확인하였으며 이때 균체량은 88.2 g/L 이었으며 코엔자임 Q₁₀의 생합성량은 642.1 mg/L이었고 균체당 코엔자임 Q₁₀의의 함량은 7.30 mg/g-균체량 이었으며 생산성은 6.69 mg/g-hr이었다 (표 10).

기존의 간헐적 탄소원 첨가법과 pH-stat 유가식 배양법의 비교

	균체량(g/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/L)	코엔자임 Q₁₀(mg/g-DCW)	생산성(mg/g-DCW)
간헐적 첨가	79.2	548.2	6.92	5.71
pH-stat	88.2	642.1	7.30	6.69

본 발명의 효과는 본 발명을 통해 전량 수입에 의존하고 있는 코엔자임 Q₁₀의 생합성 능력을 현저하게 증가시킨 재조합 균주 아그로박테리움 튜메파시언스 BNQ-pGPRX11와 발효공정을 개발함으로써 코엔자임 Q₁₀의 저비용 고수율 산업적 발효생산에 이용할 수 있으며 수입대체효과 및 국제 경쟁력에서 비교우위를 점할 수 있다.

Claims

아그로박테리움 튜메파시언스에서 분리된 신규한 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기서열을 지니는 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 유전자
서열번호 1의 유전자에 의해 발현되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 신규한 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 효소
데카프레닐이인산 합성 효소(DPS) 유전자와 1-데옥시-디-자이룰로스 5-포스페이트 신테아제(DXS) 유전자를 동시에 삽입시킨 재조합 발현 벡터(pGPRX11)
상기 재조합 발현벡터(pGPRX11)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시언스(BNQ-pGPRX11) (기탁번호: KCCM-10554호)균주
제 4항의 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시언스(BNQ-pGPRX11) (기탁번호: KCCM-10554호)균주를 옥수수 침지분말 40g/L, 일인산칼륨 0.5 g/L, 이인산칼륨 0.5g/L, 황산암모늄 15.0 g/L, 황산마그네슘 0.25 g/L를 함유한 배지에서 배양시킴을 특징으로 하는 코엔자임 Q₁₀의 발효 제조 방법
제 5항에 있어서, 상기 형질전환 균주의 배양 온도는 32℃이고, 배양 pH는 7.0, 교반조건은 400~600 rpm, 통기조건은 0.8~1.2 vvm임을 특징으로 하는 코엔자임 Q₁₀의 발효 제조 방법
제 5항에 있어서, 발효조 내의 용존산소량은 0~10%로 조절하고, 코엔자임 Q₁₀함량을 높이기 위해 pH-stat을 이용한 설탕의 발효조 내의 첨가를 통한 유가식 배양법임을 특징으로 하는 코엔자임 Q₁₀의 발효 제조 방법