KR102202606B1 - 바이오레티놀을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 바이오레티놀의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레티놀 생합성 유전자가 도입된 레티놀을 생산하는 미생물; 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 레티놀 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 미생물은 레티놀 생산능이 향상되어, 레티놀을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있으며, 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 레티놀 생산방법을 토대로 레티놀 생산 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

바이오레티놀을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 바이오레티놀의 생산방법 {A microorganism for producing a bio-retinol and a method for preparing a bio-retinol using the same}

본 발명은 베타-카로틴 및 레티놀 생합성 유전자가 도입된 바이오레티놀을 생산하는 미생물; 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 바이오레티놀 생산방법에 관한 것이다.

레티놀은 주름 개선 및 항산화 효과를 갖는 고부가가치 원료로서, 구체적으로는 레티놀 및 이의 유도체는 피부의 주름개선에 도움을 주는 성분으로 식품의약품안전처에 기능성화장품 원료로 고시된 4가지 성분 중 3가지를 차지할 정도로 주름개선에 탁월한 효능을 주는 원료이다. 따라서, 상기와 같은 기능을 갖는 레티놀을 주름개선 효능을 가진 화장료 조성물로서 이용할 수 있다.

다만, 레티놀의 이와 같은 유용성에도 불구하고, 레티놀의 대량 생산은 용이하지 못한 실정이다. 레티놀의 기존의 대표적인 생산 방법은 천연자원에서 전구물질을 추출한 후, 펜타디엔(pentadiene)→레티날(retinal)→레티놀로 이어지는 화학 반응에 의해 최종 산물인 레티놀 및 이의 유도체를 생산하고 있다. 그러나, 이러한 화학적 공정에 의한 방법은 생산가가 1kg 당 3,500 내지 4,000 미국 달러로서, 레티놀 함유 제품의 생산 단가를 높이는 문제점이 있다. 이에, 보다 안정적인 생산과 높은 수율을 달성하기 위해, 바이오 공정을 통한 고효율 레티놀 생산 기술이 요구되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 레티놀의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 레티놀을 보다 안정적이고 고효율로 생산할 수 있는 미생물을 개발하였고, 상기 미생물을 다양한 조건에서 배양하여 레티놀의 생산량이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 효모 발효 공정에 의해 레티놀을 생산하는 경우, 친환경 안전성 효모 균주를 이용하므로 안전성이 높을 뿐만 아니라, 다중-카피(multi-copy) 플라스미드를 사용한 BMCO 발현을 이용하여 고효율 생산이 가능하므로, 기존의 생산 기술에 비해 가격 경쟁력을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 하나의 목적은 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE), 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB), 불포화효소(desaturase, crtI), 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(β-carotene 15,15' monooxygenase, BCMO), 및 레티놀 디하이드로제나제(retinol dehydrogenase, ybbO) 단백질 활성이 강화된, 레티놀을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 레티놀 생산방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE), 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB), 불포화효소(desaturase, crtI), 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(β-carotene 15,15' monooxygenase, BCMO), 및 레티놀 디하이드로제나제(retinol dehydrogenase, ybbO) 단백질 활성이 강화된, 레티놀을 생산하는 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "레티놀(retinol)"은 비타민 A의 한 종류로서, 피부의 표피세포가 원래의 기능을 유지하는 데에 중요한 역할을 한다. 구체적으로는, 비타민 A1의 화학명으로, 동물의 장 점막세포에 존재하며, 녹확생 식물에 다량 함유되어 있는 걸로 알려져 있다. 활성 형태인 레티노인산(retinoic acid)으로 변형되기도 하며, 피부세포에 존재하는 세포 핵 가운데 DNA로 하여금 RNA를 발현시켜 세포분화를 촉진하고, 동물의 세포 사이에 섬유상 고체로 존재하는 경단백질인 콜라겐과 탄성 섬유로 구성된 엘라스틴 등의 생합성을 촉진해 주름을 감소시키고 피부 탄력을 증진시키는 효능이 있다. 이처럼 레티놀은 화장품 원료로 이용되어 왔다. 다만, 주로 천연 식물자원에서 전구물질을 추출한 후 화학반응에 의해 최종산물인 레티놀 및 이의 유도체를 생산하며, 이와 같은 화학적 생산 방법은 다른 불순물이 섞여 있을 확률이 높아 순도가 낮고, 그 생산량이 낮아 생산 단가를 높이는 단점이 있었다. 이에, 본 발명의 고효율 발효생산 기술에 의해 제조된 레티놀은 피부 노화 방지, 피부 탄력 증진 주름 개선 등의 효과를 가진 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

본원에서 용어, "제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

[반응식]

farnesyl diphosphate + isopentenyl diphosphate

Geranylgeranyl pyrophosphate

본 발명에서 용어, "파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB)"는 카로티노이드 생합성에 관련된 효소 중 하나로서, 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 파이토인(Phytoene)을 합성하는 효소를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[반응식]

2 geranylgeranyl diphosphate

15-cis-phytoene + 2 diphosphate

본 발명에서 용어, "불포화효소(desaturase, crtI)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 라이코펜(Lycopene)을 합성하는 효소를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 파이토인 불포화효소(Phytoene desaturase)와 혼용될 수 있다.

[반응식]

15-cis-phytoene + 4 acceptor

all-trans-lycopene + 4 reduced acceptor(전체 반응식)

(1a) 15-cis-phytoene + acceptor

all-trans-phytofluene + reduced acceptor

(1b) all-trans-phytofluene + acceptor

all-trans-zeta-carotene + reduced acceptor

(1c) all-trans-zeta-carotene + acceptor

all-trans-neurosporene + reduced acceptor

(1d) all-trans-neurosporene + acceptor

all-trans-lycopene + reduced acceptor

본 발명의 용어, "베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(β-carotene 15,15' monooxygenase, BCMO)"는 하기 반응식의 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 산소 분자를 이용하여 베타-카로틴을 분해하여, 레티날 2분자를 생성하는 효소를 의미할 수 있다. 또한, 베타-크립토산틴, 아포카로테날, 4'-아포-베타-카로테날, 알파-카로틴 및 감마-카로틴을 분해할 수 있다. 또한, 베타-카로틴 15,15' 디옥시제나제(β-carotene 15,15' dioxygenase)와 혼용될 수 있다.

[반응식]

Beta-carotene + O₂ → 2 all-trans-retinal

본 발명의 용어, "레티놀 디하이드로제나제(retinol dehydrogenase, ybbO)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 상기 효소의 기질로는 all-trans- 또는 -cis-레티놀이 될 수 있으며, 두 개의 기질(레티놀 및 NAD⁺)을 이용하여 세 개의 산물(레티날, NADH, H⁺)을 생성할 수 있다. 또한, 마이크로조말 레티놀 디하이드로제나제(microsomal retinol dehydrogenase), all-trans 레티놀 디하이드로제나제, 레티날 리덕타제(retinal reductase) 및 레티넨 리덕타제(retinene reductase)와 혼용될 수 있다.

[반응식]

Retinol + NAD⁺

Retinal + NADH + H⁺

상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제, 파이토인 신타제, 불포화효소, 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제 및 레티놀 디하이드로제나제의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제, 파이토인 신타제 및 불포화효소는 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous)로부터 유래된 것일 수 있고, 상기 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제 및 레티놀 디하이드로제나제는 할로박테리움 속 NRC-1(Halobacterium sp. NRC-1), 해양 세균 66A03(marine bacterium 66A03) 또는 에스케리키아 속 미생물로부터 유래된 것일 수 있으나, 미생물의 종 또는 미생물에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 그 유래나 서열에 한정되지 않는다. 특히, 상기 레티놀 디하이드로제나제는 에스케리키아 속 미생물, 구체적으로는 E.coli에서 유래될 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

구체적으로, 상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 상기 파이토인 신타제는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 상기 불포화효소는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 상기 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제는 BCMO-SR은 서열번호 10의 아미노산 서열을, BCMO-blh는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 레티놀 디하이드로제나제는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 "아미노산 서열을 포함하는 단백질" 또는 "아미노산 서열로 구성되는 단백질"이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 효소들은 각각의 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 포함할 수 있다.

또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 효소 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.

본원에 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.

본 발명의 제라닐제라닐 이인산염 신타제, 파이토인 신타제, 불포화효소, 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제 및 레티놀 디하이드로제나제는 상기 각각의 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 구체적으로 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE)를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고; 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB)를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하고; 불포화효소(desaturase, crtI)를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하고; 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(BCMO)를 암호화하는 유전자는 BCMO-SR 유전자는 서열번호 4의 염기서열을, BCMO-blh 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 포함하고; 레티놀 디하이드로제나제를 암호화하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 효소들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제, 파이토인 신타제, 불포화효소, 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제 및 레티놀 디하이드로제나제 효소 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 발명에서 용어, "활성의 강화"는 효소 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 자연적 혹은 인위적으로 나타나게 되는 것을 의미한다. 구체적으로 효소 단백질의 활성이 강화된 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비해서 효소단백질의 활성이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 활성 강화는 예를 들어, 외래의 제라닐제라닐 이인산염 신타제, 파이토인 신타제, 불포화효소, 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제 및/또는 레티놀 디하이드로제나제를 도입하여 강화하는 것; 또는 내재적 제라닐제라닐 이인산염 신타제, 파이토인 신타제, 불포화효소, 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제 및/또는 레티놀 디하이드로제나제의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로, 본 발명에서 활성 강화의 방법으로는,

1) 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,

2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,

3) 상기 효소들의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 형, 또는

4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 또한 카피수 증가의 한 양태로, 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 효소와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 효소가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

구체적으로, 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있다. 더욱 구체적으로는 hxpr2 프로모터 또는 UAS1B 프로모터와 작동 가능하게 연결되어, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

마지막으로, 4) 상기 1) 내지 3)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 1 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 기능을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드 집합체인 경우 유전자로 기재될 수 있다. 본원에서 폴리뉴클레오티드와 유전자는 혼용될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 서열과 뉴클레오티드 서열은 혼용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pSKH, pRS-413, pRS-414, pRS-415 벡터, pBCA 벡터, pYLI 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함하거나, 이와 관련된 유전자를 제거할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질 전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질 전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "형질 전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, EAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 미생물은 추가로 Ku70 또는 Ku80 단백질 활성이 불활성화되거나 또는 URA3 유전자의 활성이 불활성화된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "Ku70" 또는 "Ku80"는 Ku 단백질로서, Ku70과 Ku80은 Ku 이형이량체(heterodimer)를 형성하여 절단된 DNA 이중가닥의 말단에 결합하여 비상동 말달 연결(non-homologous end joining, NHEJ) 경로를 통해 DNA 수리에 관여한다. 본 발명에서는 레티놀 생합성 유전자의 상동 재조합의 효율을 높이기 위해서는 무작위 삽입(random insertion)을 억제하는 기능을 갖는 Ku70/Ku80 유전자 중 하나가 결손된 미생물을 이용하였다.

본 발명에서 용어, "URA3 유전자"는 효모의 피리미딘 합성경로에서 오로티딘-5′'-인산탈카르복시화효소(Orotidine 5'-phosphate decarboxylase, ODCase)를 암호화하는 유전자이다. 또한, URA3＋ 효모는 우라실 또는 우리딘이 첨가되지 않은 배지에서 증식할 수 있으나, 피리미딘유사체인 5-플루오로오로토산(5-fluoroorotic acid, 5-FOA)을 포함하는 배지에서는 증식하지 못하는 특징이 있는 바, URA3 유전자는 상기 특징을 이용하여 포지티브 또는 네거티브 마커로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 레티놀 생합성 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해 URA3 유전자가 결손된 효모를 제작하였고, 레티놀 생합성 유전자 도입 시 URA3 유전자를 동시에 도입시키는 방법을 이용하여 레티놀 생합성 유전자가 도입된 균주를 우라실 또는 우리딘이 첨가되지 않은 배지에서 선별하였다(실시예 1-1).

본 발명의 용어 "불활성화"는 본래 미생물이 가진 효소 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 그 활성이 약화되는 경우; 단백질이 전혀 발현이 되지 않는 경우; 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 약화하거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 미생물에 비하여 낮거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체가 결실된 경우; 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 한정되지는 않는다. 즉 효소 단백질의 활성이 불활성화된 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비해서 효소 단백질의 활성이 낮거나 또는 제거된 미생물을 의미한다.

상기 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 코딩하는 염색체 상의 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 레티놀을 생산하는 미생물은 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE), 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB) 및 불포화효소(desaturase, crtI) 단백질 활성이 강화된 미생물로서, 베타카로틴을 생산할 수 있고, 추가적으로 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제 및 레티놀 디하이드로제나제 단백질 활성을 강화시킴으로써, 레티놀 생산능을 더욱 증가시킨 미생물일 수 있다.

본 발명의 미생물은 레티놀 생산능이 있는 미생물인 한 제한이 없으나, 구체적으로, 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 미생물을 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 레티놀 생산방법을 제공한다.

상기 "미생물"및 "레티놀"은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

배양하는 단계에서 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 조절할 수 있으며, 구체적으로 5.5 내지 7.5, 5.5 내지 7.0, 6.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.0, 6.5 내지 7.5 또는 6.5 내지 7.0일 수 있고, 보다 구체적으로 배양하는 단계에서의 pH는 6.9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 배양하는 단계에서의 폭기량은 0.2 내지 1.5 vvm, 0.2 내지 1.3 vvm, 0.2 내지 1.1 vvm, 0.5 내지 1.5 vvm, 0.5 내지 1.3 vvm, 0.5 내지 1.1 vvm, 0.8 내지 1.5 vvm, 0.8 내지 1.3 vvm, 0.8 내지 1.1 vvm일 수 있으며, 보다 구체적으로 배양 단계에서의 폭기량은 0.9 vvm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 구체적으로 27 내지 31℃, 28 내지 31℃, 29 내지 31℃ 또는 30 내지 31℃를 유지할 수 있으며, 보다 구체적으로 30.2℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 배양하는 단계에서 배양기의 운전 rpm은 50 내지 300rpm, 50 내지 250rpm, 100 내지 300rpm, 100 내지 250rpm, 150 내지 300rpm, 150 내지 250rpm, 200 내지 300rpm 또는 200 내지 250rpm일 수 있으며, 보다 구체적으로 249.9 rpm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "배지"는 본 발명의 미생물을 배양할 배양배지 및/또는 배양한 다음 수득한 산물을 의미한다. 상기 배지는 미생물을 포함하는 형태 및 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 원심분리, 여과 등으로 미생물을 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 레티놀을 생산하는 미생물을 배양하는 데에 사용되는 배양 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 레티놀을 생산하는 미생물의 배양에 사용하는 배양배지는 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone), 대두(Soy bean) 및 글루코스(Glucose)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영양성분을 포함하는 것일 수 있다.

상기 효모 추출물은 본 발명의 레티놀을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 1 내지 4 중량부, 1.5 내지 4 중량부, 2 내지 4 중량부, 2.5 내지 4 중량부, 1 내지 3.5 중량부, 1.5 내지 3.5 중량부, 2 내지 3.5 중량부 또는 2.5 내지 3.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 3 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 펩톤은 본 발명의 레티놀을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 4 중량부, 1.5 내지 4 중량부, 2 내지 4 중량부, 2.5 내지 4 중량부, 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 3.5 중량부, 1.5 내지 3.5 중량부, 2 내지 3.5 중량부 또는 2.5 내지 3.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 3 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 대두는 본 발명의 레티놀을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 4 중량부, 1.5 내지 4 중량부, 2 내지 4 중량부, 2.5 내지 4 중량부, 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 3.5 중량부, 1.5 내지 3.5 중량부, 2 내지 3.5 중량부 또는 2.5 내지 3.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 3 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 글루코스는 본 발명의 레티놀을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 1 내지 3 중량부, 1 내지 2.5 중량부, 1.5 내지 3 중량부 또는 1.5 내지 2.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 2 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배양에 의하여 생산된 레티놀은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

또한, 본 발명의 레티놀 생산방법은 상기 미생물의 멀티-카피(multi-copy) 플라스미드를 사용하는 것일 수 있다. 구체적으로, 일 실시예에서는 싱글-카피를 이용하여 형질전환된 균주 보다, 멀티-카피를 이용하여 형질전환된 균주를 배양하는 경우에 약 3배로 레티놀 생산량이 증가됨을 확인하였다(실시예 3-2).

또한, 본 발명의 레티놀 생산방법은 추가로 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 레티놀을 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 레티놀을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 레티놀을 생산하는 미생물 및 이의 배양액으로부터 목적하는 레티놀을 수집할 수 있다. 예를 들어, 동결건조, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양된 미생물 또는 배지로부터 목적하는 레티놀을 회수할 수 있다. 상기 레티놀을 회수하는 단계는 분리 공정 및/또는 정제 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 미생물은 레티놀 생산능이 향상되어, 레티놀을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있으며, 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 레티놀 생산방법을 토대로 레티놀 생산 효율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 레티놀의 생합성 대사 경로의 설계를 나타낸 도면이다.
도 2는 SDS-PAGE를 통한 crtE(A), crtI(B) 및 crtYB(C) 유전자 삽입을 확인한 도면이다.
도 3은 PCR 결과를 통한 BCMO-SR 또는 BCMO-blh 유전자 삽입을 확인한 도면이다.
도 4는 BCMO-SR 또는 BCMO-blh 유전자 삽입을 확인한 콜로니 형성(A) 및 마스터 콜로니 형성(B)을 확인한 도면이다.
도 5는 SDS-PAGE를 통한 BCMO-SR(A) 또는 BCMO-blh(B) 유전자 삽입을 확인한 도면이다.
도 6은 PCR 결과를 통한 yybO 유전자 삽입을 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 형질전화 균주의 레티날(A) 및 레티놀(B) 생산량을 측정한 HPLC/UV 크로마토그래피 분석 도표이다.
도 8은 야생형 균주(A) 및 본 발명의 형질전환 균주(B)의 레티놀 생산량을 측정한 ESI-Mass 스펙트럼 그래프이다.
도 9는 싱글-카피 플라스미드 및 멀티-카피 플라스미드를 이용하여 BMCO 유전자를 도입한 각각의 경우의 레티놀 생산량을 측정한 HPLC 그래프이다.
도 10은 싱글-카피 플라스미드 또는 멀티-카피 플라스미드를 이용한 경우의 레티놀 생산량의 정량적 비교 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 레티놀 생산용 균주 선정 및 코돈 최적화를 통한 유전자 합성

실시예 1-1: 레티놀 생산용 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae ) 플랫폼 균주 제작

재조합 단백질 생산에 널리 활용되는 효모 균주인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 레티놀 생산용 균주로 선정하였다.

다음으로, 레티놀 생산용 균주를 제작하기 위해서는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 유전체 내 고효율 유전자 조작이 필요하고, 이를 위해서는 유전체 내 반복적으로 특정 유전자군을 삽입하거나 제거할 수 있는 고효율 유전자 조작 시스템 및 삽입된 유전자가 유전체 내에서 상동 재조합(homologous recombination)이 고효율로 수행될 수 있는 시스템이 구축되어야 한다. 따라서, 상기 시스템이 구축된 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 플랫폼 균주를 제작하였다.

구체적으로, 상동 재조합의 효율을 높이기 위해서는 무작위 삽입(random insertion)을 억제하는 기능을 갖는 Ku70/Ku80 유전자 중 하나를 제거하여야 하고, 외래 유전자 삽입을 확인하기 위한 영양요구성 선별 마커(auxotrophic selection marker)로서 URA3를 사용하기 위해서는 유전체 내 URA3 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, URA3 및 Ku70가 제거된 레티놀 생산용 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 플랫폼 균주를 제작하였다. 하기의 실험부터는 상기 균주를 이용하였다.

실시예 1-2: 사카로마이세스 세레비지에 맞춤 고효율 레티놀 생산 대사경로 설계 및 유전자 합성

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, GGPP의 생산으로부터 레티놀의 생산까지의 대사경로(GGPP → Phytoene → Neurosporene → Lycopene → β-carotene → Retinal → Retinol)를 설계하였다.

구체적으로, 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous) 유래의 베타카로틴 생합성 유전자인 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase), 파이토인 신타제(Phytoene synthase) 및 불포화효소(desaturase)를 코딩하는 염기서열(각각 crtE, crtI 및 crtYB)을 사카로마이세스 세레비지에에 적합하도록 코돈 최적화한 후 각각의 유전자를 합성하였고; 할로박테리움 속 NRC-1(Halobacterium sp. NRC-1) 또는 해양 세균 66A03(marine bacterium 66A03) 유래의 레티날 생합성 유전자인 베타-카로틴 15,15'-모노옥시제나제(β-Carotene 15,15'-Monooxygenase)을 코딩하는 염기서열(각각 BMCO-blh 또는 BMCO-SR)을 사카로마이세스 세레비지에에 적합하도록 코돈 최적화한 후 각각의 유전자를 합성하였고; 레티놀 생합성 유전자인 레티놀 디하이드로제나제(retinol dehydrogenase)를 코딩하는 염기서열(ybbO)을 사카로마이세스 세레비지에에 적합하도록 코돈 최적화한 후 유전자를 합성하였다.

crtE, crtYB, crtI, BMCO-blh, BMCO-SR, 및 ybbO를 코딩하는 염기서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재하였다.

실시예 2: 레티놀 생산용 균주 제작

실시예 2-1: 레티놀 생산용 S. cerevisiae 발현 벡터 제조

상기 실시예 1-2에서 합성한 crtE, crtI, crtYB, BMCO-blh, BMCO-SR, 및 ybbO 유전자 염기서열을 레티놀 생산용 사카로마이세스 세레비지에 플랫폼 균주에서 안정적으로 발현시키기 위해 GPD 프로모터와 CYC1 터미네이터(terminator)이 포함되고, 벡터 시스템의 반복사용이 가능한 ura 마커 시스템을 적용한 발현 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 먼저 GPD 프로모터, CYC1 터미네이터 및 URA Blaster cassette가 도입된 발현 벡터에 실시예 1-2에서 합성한 crtE, crtI, crtYB, BMCO-blh, BMCO-SR, 및 ybbO 유전자를 코딩하는 염기서열을 다중 클로닝 부위(Multi Cloning Site)에 있는 EcRⅠ, XhoⅠ 제한효소를 이용하여 각각 발현 벡터에 삽입하였고, 각 유전자 서열이 삽입된 pBCA_crtE, pBCA_crtI, pBCA_crtYB, pRET_BMCO-blh, pRET_BMCO-SR 및 pRET_ybbO 벡터를 제작하였다.

실시예 2-2: 레티놀 전구체의 생합성 유전자 삽입

S. cerevisiae 게놈 내에 삽입 부위로는 레티놀의 전구체 공급을 증가시키기 위해, 제거시 레티놀의 전구체인 메발론산(mevalonate) 생산을 증가시키는 것으로 알려진 유전자 YPL062w, 및 파르네실파이로포스페이트(farnesyl pyrophosphate: FPP) 소모에 관여하는 파네솔(farnesol) 생산 유전자 LPP1, DPP1을 선정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 제작한 pBCA_crtE 벡터를 상기 실시예 1-1에서 제작한 레티놀 생산용 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 플랫폼 균주에 형질전환시킨 후, colony PCR을 통하여 균주 내의 정확한 위치에 crtE 유전자가 삽입되었는지를 확인하였다(도 2A). crtE 유전자가 정확한 자리에 삽입된 경우 도 3A의 1, 5, 8 및 10레인과 같이 4,000 bp에서 밴드가 나타난다. 삽입이 확인된 균주는 ura pop out을 통하여 ura 마커를 제거한 후, 이후의 crtI 유전자 삽입에 이용하였다.

상기와 같은 방법을 이용하여, crtI 유전자 및 crtYB 유전자를 차례로 삽입하였고, 상기 유전자가 삽입된 것을 확인하였다(도 2B 및 C). crtI 유전자가 정확한 자리에 삽입된 경우 도 2B의 11 및 12 레인과 같이 4,000 bp 부근에서 밴드가 나타나고, crtYB 유전자가 정확한 자리에 삽입된 경우 도 2C의 1, 2, 5, 9 및 10레인과 같이 6,000 bp 부근에서 밴드가 나타난다. 이와 같이 레티놀의 전구체인 베타카로틴 생합성 유전자인 crtE, crtI 및 crtYB 유전자가 삽입된 균주를 제작하였다. 하기의 실험부터는 상기 균주(S. cerevisiae CEN.PK2-1D Δleu2::P _TEF1 -ERG20 Δhis3::P _CCW12 -tHMG1 Δlpp1::P _GPD -crtE Δdpp1::P _GPD -crtI Δypl062w::P _GPD -crtYB)를 기본 균주로 하여 레티놀 생산용 균주를 제작하였다.

실시예 2-3: 레티놀 생합성 유전자 삽입

상기 2-1에서 제작한 pBCA-BCMO 벡터를 상시 실시예 2-2에서 제작한 레티놀 전구체 생합성 유전자가 삽입된 사카로마이세스 세레비지에 균주에 형질전환시킨 후, PCR 및 콜로니 형성 관찰을 통하여 균주 내의 정확한 위치에 BMCO-blh 또는 BMCO-SR 각각의 유전자가 삽입되었는지를 확인하였다(도 3-4).

구체적으로, pBCA-BCMO 벡터 및 pUC-3Myc URA3-P_GPD 벡터에 EcoRI/XhoI 제한효소를 이용하여 BCMO를 용해시키고, 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 상기 용해시킨 BCMO를 정제하였고, 상기 정제된 BCMO와 pUC-3Myc URA3-P_GPD 벡터를 EcoRI/XhoI 제한효소를 이용하여 접합시켜 pUC-3Myc URA3-P_GPD-BCMO 벡터를 제작하였다. 다시 EcoRI/XhoI 제한효소를 이용하여, BCMO를 용해시켰다. 이후, BCMO 유전자는 하기 표 1에 기재된 염기서열로 이루어진 삽입 카세트용 프라이머를 이용하여, YPRCτ3 유전자 부위에 삽입하였다.

BCMO 유전자 삽입 카세트용 프라이머 서열
Forward	ATC GTC CTT GTA TGG AAG TAT CAA AGG GGA CGT TCT TCA CCT CCT TGG AAC CAG TCA CGA CGT TGT AAA A (서열번호 13)
Reverse	AAT GAT TTA CAA TCT AGT CGC AAA AAC AAG TAC AGT GCT GAC GTC CCA TCA GGT TTC CCG ACT GGA AAG C (서열번호 14)

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, PCR 결과를 통해, 상기 BCMO-SR 또는 BCMO-blh 유전자가 삽입된, P_GPD-BCMO URA3 삽입용 벡터가 제작됨을 확인하였다.

이후, 도 4A 및 B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 콜로니 형성 확인 및 마스터 콜로니(master colony) 획득을 통해, 상기 제작된 삽입용 카세트를 이용하여 BMCO-blh 또는 BMCO-SR 유전자가 사카로마이세스 세레비지에 YPRCτ3 유전자 부위에 성공적으로 형질전환되었음을 확인하였다. 이후, 도 5A 및 5B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 BCMO 삽입 마스터 콜로니의 PCR을 수행한 결과, BCMO-SR 유전자가 도입된 경우, 21 레인과 같이 5,124 bp 부근에서 밴드가 나타나고, BCMO-blh 유전자가 도입된 경우 역시 마찬가지로 11 및 14 레인과 같이 5,124 bp 부근에서 밴드가 나타남을 확인하였다. 이와 같이, BCMO 유전자가 삽입된 균주를 제작하였다.

최종적으로, 레티놀 생산용 균주를 제작하기 위해, 상기 제작된 균주에 레티놀 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 ybbO가 삽입된 레티놀 생산용 균주를 제작하였다.

구체적으로, BCMO 유전자 도입 방법과 동일한 방법으로, pUC57-3Myc URA3-P_GPD-ybbO 삽입용 벡터를 제작하였다. 이후, ybbO 유전자는 하기 표 2에 기재된 염기서열로 이루어진 삽입 카세트용 프라이머를 이용하여, YPRCdelta15 유전자 부위에 삽입하였다.

ybbO 유전자 삽입 카세트용 프라이머 서열
Forward	AAATCCGAACAACAGAGCATAGGGTTTCGCAAACAAACTTAAATATATGCaggtttcccgactggaaag (서열번호 15)
Reverse	GTATAATCTGTATACATAATATTATAGGCTTTACCAACAATGGAATTTCGccagtcacgacgttgtaaaa (서열번호 16)

그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, ybbO 삽입 마스터 콜로니의 PCR을 수행한 결과, ybbO 유전자가 도입된 경우, 11 레인과 같이 3,600 bp 부근에서 밴드가 나타남을 확인하였다. 이와 같이, 최종적으로 crtE, crtYB, crtI, BMCO-blh, BMCO-SR, 및 ybbO 유전자가 삽입된, 레티놀 생산용 균주를 제작하였다.

실시예 3: 레티놀 생산용 균주의 레티놀 생산 확인

실시예 3-1: 레티놀 생산용 균주의 레티놀 생산 여부 확인

상기 레티놀 생산용 균주의 레티놀 생산을 확인하기 위해 HPLC/UV 크로마토그램 및 ESI-질량 스펙트럼을 수행하였다. 구체적으로, 크로마토그래피 분석방법은 분석용 스케일(analytical scale; 면적 300 mm x 4 mm)을 사용하여 수행하였다. ODS C18 보호 컬럼(guard column; 4 mm x 3 mm)은 러닝 컬럼(running column)으로 선행되었다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다: 이동상 A: 아세토나이트릴/H₂O/빙초산=90/10/2; 이동상 B: 아세토나이트릴/메탄올=90/10; 이동상 C: 100% THF. 모든 이동상은 사용 전에, 0.45 μm 포어 사이즈를 가진 나일론 멤브레인 필터로 필터링 되었다. 전체 러닝 타임 중 26분 동안, 일정한 유속(1 mL/분) 및 일정한 컬럼 농도(22 ℃)에서 다음과 같은 농도 프로그램이 적용되었다: 0-4.5분 100% A; 4.5-6.5분 100% B; 6.5-12분 60% B, 40% C; 12-15분 60% B, 40% C; 15-20분 100% B; 20-26분 100% A.

그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 레티놀 생산용 균주를 배양하여 형성된 콜로니의 레티날 생산 피크 및 레티놀 생산 피크가 관측되었다. 구체적으로, HPLC/UV 크로마토그램(325 nm)의 측정 결과, 레티날 생산 피크는 10.47 분에 관측되었으며(도 7A), 레티놀 생산 피크는 10.97 분에 관측되었다. 또한, 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, CEN.PK 야생형 균주와 달리(도 8A), 본 발명의 레티놀 생산용 균주는 303.2318 m/z에서 레티놀 생산 피크가 관측되었다(도 8B).

이로부터 상기 실시예 2에서 제작한 레티놀 생산용 균주가 레티놀을 생산할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3-2: Multi copy 플라스미드를 이용한 레티놀 생산량 증가 효과 확인

멀티-카피(multi-copy) 플라스미드를 이용하여 형질전환 균주를 배양하는 경우, 상기 레티놀 생산용 균주의 레티놀 생산량 증가 효과를 확인하였다.

구체적으로, 도 9 및 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, pUC57 벡터를 이용하여 싱글-카피로 BCMO-SR 유전자를 도입하여 배양한 경우, 레티놀 169.16 ㎍/L를 생산하였다. 이와 달리, p426 벡터를 이용하여 멀티-카피로 BCMO-SR 유전자를 도입하여 배양한 경우, 레티놀 491.09 ㎍/L를 생산하였다(도 10). 즉, 싱글-카피를 이용하여 형질전환된 균주 보다, 멀티-카피를 이용하여 형질전환된 균주를 배양하는 경우에 약 3배로 레티놀 생산량을 증가시킴을 확인하였다. 이를 통해, 멀티-카피(multi-copy) 플라스미드를 사용하여 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에, 레티놀 생산량을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> A microorganism for producing a bio-retinol and a method for preparing a bio-retinol using the same <130> KPA180876-KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2022 <212> DNA <213> GGPP synthase, crtE <400> 1 atgacggcat tggcatacta ccagatccac ctcatctaca ccctccccat cctcggtctc 60 ctcggtctgc ttacaagccc catcctcaca aagttcgaca tctacaagat ctcgatcctc 120 gtgttcatcg cgttctccgc cacgacgccc tgggacagct ggatcatccg aaacggcgca 180 tggacgtacc ctagcgcaga atctggtcaa ggtgttttcg gcacgttcct ggacgttccc 240 tacgaggagt acgcattctt cgtgatccag acggtgatca ctggcctggt ctacgtcctc 300 gcaacacgac acctcctccc atctctggca ttgcctaaga cacgttcctc tgctctctct 360 ctggctctca aggcactcat ccctttgcct atcatctacc tgttcaccgc ccacccatcc 420 ccatctccag acccattggt caccgaccat tacttctaca tgcgggctct gtccctcctc 480 atcacccctc ctactatgct gttggctgct ttgtccggtg agtacgcttt cgactggaag 540 tcgggaagag ctaagtccac catcgctgct atcatgatcc ccaccgtgta cctcatctgg 600 gtggactacg tcgctgtggg acaagactct 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ttataatatc 480 gcctttgaac ttattggatt aatttttcta gcctggtatg cacccccact cgttactttt 540 gccacatact tctgctttat ccacagcaga cgtcacttta gttttgtttg gaaacagtta 600 cagcatatga gttcaaaaaa aatgatgata ggtagtgcca ttattttatc ttgtacgagc 660 tggttgatag gcggaggaat atattttttc ctcaattcga aaatgattgc cagtgaagct 720 gctttacaaa ctgtctttat tggtcttgca gctttaacag ttcctcacat gatacttatc 780 gactttatat ttagaccaca ctcttccaga attaaaatca aaaat 825 <210> 6 <211> 807 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atgactcata aagcaacgga gatcctgaca ggtaaagtta tgcaaaaatc ggtcttaatt 60 accggatgtt ccagtggaat tggcctggaa agcgcgctcg aattaaaacg ccagggtttt 120 catgtgctgg caggttgccg gaaaccggat gatgttgagc gcatgaacag catgggattt 180 accggcgtgt tgatcgatct ggattcacca gaaagtgttg atcgcgcagc cgacgaggtg 240 atcgccctga ccgataattg tctgtatggg atctttaaca atgccggatt cggcatgtat 300 ggcccccttt ccaccatcag ccgtgcgcag atggaacagc agttttccgc caactttttc 360 ggcgcacacc agctcaccat gcgcctgtta cccgcgatgt tgccgcacgg tgaagggcgt 420 attgtgatga cctcatcggt gatgggatta atctccacac cgggtcgtgg cgcttacgcg 480 gccagtaaat atgcgctgga ggcgtggtca gacgcgctgc gcatggagct gcgccgcagc 540 ggaattaaag tcagcctgat cgaacccggt cccattcgta ctcgcttcac cgacaacgtc 600 aaccagacgc aaagtgataa accagtcgaa aatcccggca tcgccgcccg ctttacgttg 660 ggaccggaag cggtggtgga caaagtacgc catgctttta ttagcgagaa gccgaagatg 720 cgctatccgg taacgctggt gacctgggcg gtaatggtgc ttaagcgcct gctgccgggg 780 cgcgtgatgg acaaaatatt gcagggg 807 <210> 7 <211> 673 <212> PRT <213> GGPP synthase, crtE <400> 7 Met Thr Ala Leu Ala Tyr Tyr Gln Ile His Leu Ile Tyr Thr Leu Pro 1 5 10 15 Ile Leu Gly Leu Leu Gly Leu Leu Thr Ser Pro Ile Leu Thr Lys Phe 20 25 30 Asp Ile Tyr Lys Ile Ser Ile Leu Val Phe Ile Ala Phe Ser Ala Thr 35 40 45 Thr Pro Trp Asp Ser Trp Ile Ile Arg Asn Gly Ala Trp Thr Tyr Pro 50 55 60 Ser Ala Glu Ser Gly Gln Gly Val Phe Gly Thr Phe Leu Asp Val Pro 65 70 75 80 Tyr Glu Glu Tyr Ala Phe Phe Val Ile Gln Thr Val Ile Thr Gly Leu 85 90 95 Val Tyr Val Leu Ala Thr Arg His Leu Leu Pro Ser Leu Ala Leu Pro 100 105 110 Lys Thr Arg Ser Ser Ala Leu Ser Leu Ala Leu Lys Ala Leu Ile Pro 115 120 125 Leu Pro Ile Ile Tyr Leu Phe Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Asp 130 135 140 Pro Leu Val Thr Asp His Tyr Phe Tyr Met Arg Ala Leu Ser Leu Leu 145 150 155 160 Ile Thr Pro Pro Thr Met Leu Leu Ala Ala Leu Ser Gly Glu Tyr Ala 165 170 175 Phe Asp Trp Lys Ser Gly Arg Ala Lys Ser Thr Ile Ala Ala Ile Met 180 185 190 Ile Pro Thr Val Tyr Leu Ile Trp Val Asp Tyr Val Ala Val Gly Gln 195 200 205 Asp Ser Trp Ser Ile Asn Asp Glu Lys Ile Val Gly Trp Arg Leu Gly 210 215 220 Gly Val Leu Pro Ile Glu Glu Ala Met Phe Phe Leu Leu Thr Asn Leu 225 230 235 240 Met Ile Val Leu Gly Leu Ser Ala Cys Asp His Thr Gln Ala Leu Tyr 245 250 255 Leu Leu His Gly Arg Thr Ile Tyr Gly Asn Lys Lys Met Pro Ser Ser 260 265 270 Phe Pro Leu Ile Thr Pro Pro Val Leu Ser Leu Phe Phe Ser Ser Arg 275 280 285 Pro Tyr Ser Ser Gln Pro Lys Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys Leu 290 295 300 Leu Glu Glu Lys Ser Arg Ser Phe Phe Val Ala Ser Ala Gly Phe Pro 305 310 315 320 Ser Glu Val Arg Glu Arg Leu Val Gly Leu Tyr Ala Phe Cys Arg Val 325 330 335 Thr Asp Asp Leu Ile Asp Ser Pro Glu Val Ser Ser Asn Pro His Ala 340 345 350 Thr Ile Asp Met Val Ser Asp Phe Leu Thr Leu Leu Phe Gly Pro Pro 355 360 365 Leu His Pro Ser Gln Pro Asp Lys Ile Leu Ser Ser Pro Leu Leu Pro 370 375 380 Pro Ser His Pro Ser Arg Pro Thr Gly Met Tyr Pro Leu Pro Pro Pro 385 390 395 400 Pro Ser Leu Ser Pro Ala Glu Leu Val Gln Phe Leu Thr Glu Arg Val 405 410 415 Pro Val Gln Tyr His Phe Ala Phe Arg Leu Leu Ala Lys Leu Gln Gly 420 425 430 Leu Ile Pro Arg Tyr Pro Leu Asp Glu Leu Leu Arg Gly Tyr Thr Thr 435 440 445 Asp Leu Ile Phe Pro Leu Ser Thr Glu Ala Val Gln Ala Arg Lys Thr 450 455 460 Pro Ile Glu Thr Thr Ala Asp Leu Leu Asp Tyr Gly Leu Cys Val Ala 465 470 475 480 Gly Ser Val Ala Glu Leu Leu Val Tyr Val Ser Trp Ala Ser Ala Pro 485 490 495 Ser Gln Val Pro Ala Thr Ile Glu Glu Arg Glu Ala Val Leu Val Ala 500 505 510 Ser Arg Glu Met Gly Thr Ala Leu Gln Leu Val Asn Ile Ala Arg Asp 515 520 525 Ile Lys Gly Asp Ala Thr Glu Gly Arg Phe Tyr Leu Pro Leu Ser Phe 530 535 540 Phe Gly Leu Arg Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ile Pro Thr Asp Trp Thr 545 550 555 560 Glu Pro Arg Pro Gln Asp Phe Asp Lys Leu Leu Ser Leu Ser Pro Ser 565 570 575 Ser Thr Leu Pro Ser Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Arg Phe Glu Trp 580 585 590 Lys Thr Tyr Ser Leu Pro Leu Val Ala Tyr Ala Glu Asp Leu Ala Lys 595 600 605 His Ser Tyr Lys Gly Ile Asp Arg Leu Pro Thr Glu Val Gln Ala Gly 610 615 620 Met Arg Ala Ala Cys Ala Ser Tyr Leu Leu Ile Gly Arg Glu Ile Lys 625 630 635 640 Val Val Trp Lys Gly Asp Val Gly Glu Arg Arg Thr Val Ala Gly Trp 645 650 655 Arg Arg Val Arg Lys Val Leu Ser Val Val Met Ser Gly Trp Glu Gly 660 665 670 Gln <210> 8 <211> 376 <212> PRT <213> Phytoene synthase, crtYB <400> 8 Met Asp Tyr Ala Asn Ile Leu Thr Ala Ile Pro Leu Glu Phe Thr Pro 1 5 10 15 Gln Asp Asp Ile Val Leu Leu Glu Pro Tyr His Tyr Leu Gly Lys Asn 20 25 30 Pro Gly Lys Glu Ile Arg Ser Gln Leu Ile Glu Ala Phe Asn Tyr Trp 35 40 45 Leu Asp Val Lys Lys Glu Asp Leu Glu Val Ile Gln Asn Val Val Gly 50 55 60 Met Leu His Thr Ala Ser Leu Leu Met Asp Asp Val Glu Asp Ser Ser 65 70 75 80 Val Leu Arg Arg Gly Ser Pro Val Ala His Leu Ile Tyr Gly Ile Pro 85 90 95 Gln Thr Ile Asn Thr Ala Asn Tyr Val Tyr Phe Leu Ala Tyr Gln Glu 100 105 110 Ile Phe Lys Leu Arg Pro Thr Pro Ile Pro Met Pro Val Ile Pro Pro 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Leu Gln Ser Ser Val Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser 130 135 140 Ser Ala Ser Ser Glu Asn Gly Gly Thr Ser Thr Pro Asn Ser Gln Ile 145 150 155 160 Pro Phe Ser Lys Asp Thr Tyr Leu Asp Lys Val Ile Thr Asp Glu Met 165 170 175 Leu Ser Leu His Arg Gly Gln Gly Leu Glu Leu Phe Trp Arg Asp Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Val Lys Met Val Leu Gly Lys 195 200 205 Thr Gly Gly Leu Phe Arg Ile Ala Val Arg Leu Met Met Ala Lys Ser 210 215 220 Glu Cys Asp Ile Asp Phe Val Gln Leu Val Asn Leu Ile Ser Ile Tyr 225 230 235 240 Phe Gln Ile Arg Asp Asp Tyr Met Asn Leu Gln Ser Ser Glu Tyr Ala 245 250 255 His Asn Lys Asn Phe Ala Glu Asp Leu Thr Glu Gly Lys Phe Ser Phe 260 265 270 Pro Thr Ile His Ser Ile His Thr Asn Pro Ser Ser Arg Leu Val Ile 275 280 285 Asn Thr Leu Gln Lys Lys Ser Thr Ser Pro Glu Ile Leu His His Cys 290 295 300 Val Asn Tyr Met Arg Thr Glu Thr His Ser Phe Glu Tyr Thr Arg Glu 305 310 315 320 Val Leu Asn Thr Leu Ser Gly Ala Leu Glu Arg Glu Leu Gly Arg Leu 325 330 335 Gln Glu Glu Phe Ala Glu Ala Asn Ser Arg Met Asp Leu Gly Asp Val 340 345 350 Glu Ser Glu Gly Arg Thr Gly Lys Asn Val Lys Leu Glu Ala Ile Leu 355 360 365 Lys Lys Leu Ala Asp Ile Pro Leu 370 375 <210> 9 <211> 582 <212> PRT <213> desaturase, crtI <400> 9 Met Gly Lys Glu Gln Asp Gln Asp Lys Pro Thr Ala Ile Ile Val Gly 1 5 10 15 Cys Gly Ile Gly Gly Ile Ala Thr Ala Ala Arg Leu Ala Lys Glu Gly 20 25 30 Phe Gln Val Thr Val Phe Glu Lys Asn Asp Tyr Ser Gly Gly Arg Cys 35 40 45 Ser Leu Ile Glu Arg Asp Gly Tyr Arg Phe Asp Gln Gly Pro Ser Leu 50 55 60 Leu Leu Leu Pro Asp Leu Phe Lys Gln Thr Phe Glu Asp Leu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Met Glu Asp Trp Val Asp Leu Ile Lys Cys Glu Pro Asn Tyr Val 85 90 95 Cys His Phe His Asp Glu Glu Thr Phe Thr Leu Ser Thr Asp Met Ala 100 105 110 Leu Leu Lys Arg Glu Val Glu Arg Phe Glu Gly Lys Asp Gly Phe Asp 115 120 125 Arg Phe Leu Ser Phe Ile Gln Glu Ala His Arg His Tyr Glu Leu Ala 130 135 140 Val Val His Val Leu Gln Lys Asn Phe Pro Gly Phe Ala Ala Phe Leu 145 150 155 160 Arg Leu Gln Phe Ile Gly Gln Ile Leu Ala Leu His Pro Phe Glu Ser 165 170 175 Ile Trp Thr Arg Val Cys Arg Tyr Phe Lys Thr Asp Arg Leu Arg Arg 180 185 190 Val Phe Ser Phe Ala Val Met Tyr Met Gly Gln Ser Pro Tyr Ser Ala 195 200 205 Pro Gly Thr Tyr Ser Leu Leu Gln Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Gly Ile 210 215 220 Trp Tyr Pro Arg Gly Gly Phe Trp Gln Val Pro Asn Thr Leu Leu Gln 225 230 235 240 Ile Val Lys Arg Asn Asn Pro Ser Ala Lys Phe Asn Phe Asn Ala Pro 245 250 255 Val Ser Gln Val Leu Leu Ser Pro Ala Lys Asp Arg Ala Thr Gly Val 260 265 270 Arg Leu Glu Ser Gly Glu Glu His His Ala Asp Val Val Ile Val Asn 275 280 285 Ala Asp Leu Val Tyr Ala Ser Glu His Leu Ile Pro Asp Asp Ala Arg 290 295 300 Asn Lys Ile Gly Gln Leu Gly Glu Val Lys Arg Ser Trp Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Val Gly Gly Lys Lys Leu Lys Gly Ser Cys Ser Ser Leu Ser Phe 325 330 335 Tyr Trp Ser Met Asp Arg Ile Val Asp Gly Leu Gly Gly His Asn Ile 340 345 350 Phe Leu Ala Glu Asp Phe Lys Gly Ser Phe Asp Thr Ile Phe Glu Glu 355 360 365 Leu Gly Leu Pro Ala Asp Pro Ser Phe Tyr Val Asn Val Pro Ser Arg 370 375 380 Ile Asp Pro Ser Ala Ala Pro Glu Gly Lys Asp Ala Ile Val Ile Leu 385 390 395 400 Val Pro Cys Gly His Ile Asp Ala Ser Asn Pro Gln Asp Tyr Asn Lys 405 410 415 Leu Val Ala Arg Ala Arg Lys Phe Val Ile His Thr Leu Ser Ala Lys 420 425 430 Leu Gly Leu Pro Asp Phe Glu Lys Met Ile Val Ala Glu Lys Val His 435 440 445 Asp Ala Pro Ser Trp Glu Lys Glu Phe Asn Leu Lys Asp Gly Ser Ile 450 455 460 Leu Gly Leu Ala His Asn Phe Met Gln Val Leu Gly Phe Arg Pro Ser 465 470 475 480 Thr Arg His Pro Lys Tyr Asp Lys Leu Phe Phe Val Gly Ala Ser Thr 485 490 495 His Pro Gly Thr Gly Val Pro Ile Val Leu Ala Gly Ala Lys Leu Thr 500 505 510 Ala Asn Gln Val Leu Glu Ser Phe Asp Arg Ser Pro Ala Pro Asp Pro 515 520 525 Asn Met Ser Leu Ser Val Pro Tyr Gly Lys Pro Leu Lys Ser Asn Gly 530 535 540 Thr Gly Ile Asp Ser Gln Val Gln Leu Lys Phe Met Asp Leu Glu Arg 545 550 555 560 Trp Val Tyr Leu Leu Val Leu Leu Ile Gly Ala Val Ile Ala Arg Ser 565 570 575 Val Gly Val Leu Ala Phe 580 <210> 10 <211> 338 <212> PRT <213> Halobacterium salinarum <400> 10 Met Ala Leu Thr Pro Leu Thr Ala Arg Ala Arg Arg Thr Leu Ala Arg 1 5 10 15 Pro Ala Leu Ala Leu Gly Trp Val Ala Ile Ser Ile Ala Ala Leu Pro 20 25 30 Ala Ile Thr Gly Val Ser Leu Ser Pro Thr Ala Arg Tyr Ala Pro Leu 35 40 45 Val Ala Ser Ala Val Val Phe Gly Met Pro His Gly Ala Ile Asp Tyr 50 55 60 Leu Ala Leu Pro Arg Ala Val Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Trp Leu 65 70 75 80 Ala Val Val Gly Val Leu Tyr Leu Val Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Ala 85 90 95 Ala Trp Phe Phe Ala Pro Val Pro Ala Ala Phe Ala Phe Val Ala Ile 100 105 110 Thr Trp Leu His Trp Gly Gln Gly Asp Leu Tyr Pro Leu Leu Asp Phe 115 120 125 Leu Asp Val Asp Tyr Leu Asp Thr Arg Pro Arg Arg Ala Ala Thr Val 130 135 140 Leu Ile Arg Gly Gly Leu Pro Met Leu Val Pro Leu Leu Gly Phe Pro 145 150 155 160 Glu Arg Tyr Arg Ser Val Val Asp Ala Phe Ala Ala Pro Phe Gly Gly 165 170 175 Ser Val Gly Asp Leu Ala Val Phe Asp Pro Arg Val Arg Leu Trp Leu 180 185 190 Gly Val Ala Phe Ala Ala Ala Thr Val Ala Val Leu Ala Ala Gly Arg 195 200 205 Arg Arg Thr His Ser Pro Gly Ala Trp Arg Asp Ala Ala Glu Thr Leu 210 215 220 Leu Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Val Pro Pro Val Phe Ala Val Gly 225 230 235 240 Val Tyr Phe Cys Val Trp His Ser Val Arg His Val Ala Arg Ala Ile 245 250 255 Ala Val Asp Gly Ser Val His Pro Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Leu 260 265 270 Gly Pro Leu Ala Arg Phe Gly Val Glu Ala Ala Pro Met Thr Ala Ala 275 280 285 Ala Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Trp Ala Val Pro Asn Pro Pro Thr 290 295 300 Thr Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Tyr Leu Val Leu Ile Ala Val Leu 305 310 315 320 Thr Leu Pro His Val Ala Val Val Thr Trp Met Asp Arg Val Gln Gly 325 330 335 Val Leu <210> 11 <211> 275 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> predictet Brp-like protein Blh [uncultured marine bacterium 66A03] <400> 11 Met Gly Leu Met Leu Ile Asp Trp Cys Ala Leu Ala Leu Val Val Phe 1 5 10 15 Ile Gly Leu Pro His Gly Ala Leu Asp Ala Ala Ile Ser Phe Ser Met 20 25 30 Ile Ser Ser Ala Lys Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gly Ile Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Leu Leu Ala Thr Ala Phe Phe Leu Ile Trp Tyr Gln Leu Pro 50 55 60 Ala Phe Ser Leu Leu Ile Phe Leu Leu Ile Ser Ile Ile His Phe Gly 65 70 75 80 Met Ala Asp Phe Asn Ala Ser Pro Ser Lys Leu Lys Trp Pro His Ile 85 90 95 Ile Ala His Gly Gly Val Val Thr Val Trp Leu Pro Leu Ile Gln Lys 100 105 110 Asn Glu Val Thr Lys Leu Phe Ser Ile Leu Thr Asn Gly Pro Thr Pro 115 120 125 Ile Leu Trp Asp Ile Leu Leu Ile Phe Phe Leu Cys Trp Ser Ile Gly 130 135 140 Val Cys Leu His Thr Tyr Glu Thr Leu Arg Ser Lys His Tyr Asn Ile 145 150 155 160 Ala Phe Glu Leu Ile Gly Leu Ile Phe Leu Ala Trp Tyr Ala Pro Pro 165 170 175 Leu Val Thr Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Phe Ile His Ser Arg Arg His 180 185 190 Phe Ser Phe Val Trp Lys Gln Leu Gln His Met Ser Ser Lys Lys Met 195 200 205 Met Ile Gly Ser Ala Ile Ile Leu Ser Cys Thr Ser Trp Leu Ile Gly 210 215 220 Gly Gly Ile Tyr Phe Phe Leu Asn Ser Lys Met Ile Ala Ser Glu Ala 225 230 235 240 Ala Leu Gln Thr Val Phe Ile Gly Leu Ala Ala Leu Thr Val Pro His 245 250 255 Met Ile Leu Ile Asp Phe Ile Phe Arg Pro His Ser Ser Arg Ile Lys 260 265 270 Ile Lys Asn 275 <210> 12 <211> 269 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Met Thr His Lys Ala Thr Glu Met Leu Thr Gly Lys Val Met Gln Lys 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Thr Gly Cys Ser Ser Gly Met Gly Leu Glu Ser Ala 20 25 30 Leu Glu Thr Lys Arg Gln Gly Phe His Val Leu Ala Gly Cys Arg Lys 35 40 45 Pro Asp Asp Val Glu Arg Met Asn Ser Met Gly Phe Thr Gly Val Leu 50 55 60 Ile Asp Leu Asp Ser Pro Glu Ser Val Asp Arg Ala Ala Asp Glu Val 65 70 75 80 Ile Ala Thr Thr Asp Asn Cys Leu Tyr Gly Ile Phe Asn Asn Ala Gly 85 90 95 Phe Gly Met Tyr Gly Pro Thr Ser Thr Ile Ser Arg Ala Gln Met Glu 100 105 110 Gln Gln Phe Ser Ala Asn Phe Phe Gly Ala His Gln Leu Thr Met Arg 115 120 125 Thr Leu Pro Ala Met Leu Pro His Gly Glu Gly Arg Ile Val Met Thr 130 135 140 Ser Ser Val Met Gly Leu Ile Ser Thr Pro Gly Arg Gly Ala Tyr Ala 145 150 155 160 Ala Ser Lys Tyr Ala Leu Glu Ala Trp Ser Asp Ala Leu Arg Met Glu 165 170 175 Leu Arg His Ser Gly Ile Lys Val Ser Thr Met Glu Pro Gly Pro Ile 180 185 190 Arg Thr Arg Phe Thr Asp Asn Val Asn Gln Thr Gln Ser Asp Lys Pro 195 200 205 Val Glu Asn Pro Gly Met Ala Ala Arg Phe Thr Leu Gly Pro Glu Ala 210 215 220 Val Val Asp Lys Val Arg His Ala Phe Ile Ser Glu Lys Pro Lys Met 225 230 235 240 Arg Tyr Pro Val Thr Thr Val Thr Trp Ala Val Met Val Thr Lys Arg 245 250 255 Leu Leu Pro Gly Arg Val Met Asp Lys Ile Leu Gln Gly 260 265 <210> 13 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMO primer-F <400> 13 atcgtccttg tatggaagta tcaaagggga cgttcttcac ctccttggaa ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 14 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMO primer-R <400> 14 aatgatttac aatctagtcg caaaaacaag tacagtgctg acgtcccatc aggtttcccg 60 actggaaagc 70 <210> 15 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ybbO primer-F <400> 15 aaatccgaac aacagagcat agggtttcgc aaacaaactt aaatatatgc aggtttcccg 60 actggaaag 69 <210> 16 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ybbO primer-R <400> 16 gtataatctg tatacataat attataggct ttaccaacaa tggaatttcg ccagtcacga 60 cgttgtaaa 69

Claims (9)

1. 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE), 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB), 불포화효소(desaturase, crtI), 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(β-carotene 15,15' monooxygenase, BCMO), 및 레티놀 디하이드로제나제(retinol dehydrogenase, ybbO) 단백질 활성이 강화된, 효모로서,
   상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE), 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB) 및 불포화효소(desaturase, crtI)는 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous)에서 유래되고,
   상기 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(β-carotene 15,15' monooxygenase, BCMO), 및 레티놀 디하이드로제나제(retinol dehydrogenase, ybbO)는 할로박테리움 속 NRC-1(Halobacterium sp. NRC-1), 해양 세균 66A03(marine bacterium 66A03) 또는 에스케리키아 속 미생물에서 유래되며,
   상기 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(β-carotene 15,15' monooxygenase, BCMO) 유전자는 멀티-카피 플라스미드를 사용하여 도입되되,
   상기 멀티-카피 플라스미드는, p426 벡터를 이용하여 멀티-카피로 BCMO-SR 유전자를 도입하여 배양한, p426 플라스미드 벡터인 것이 특징인, 레티놀 생산능이 향상된 효모.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE) 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고; 상기 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB) 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하고; 상기 불포화효소(desaturase, crtI) 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하고; 상기 베타-카로틴 15,15' 모노옥시제나제(β-carotene 15,15' monooxygenase, BCMO) 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열을 포함하고; 레티놀 디하이드로제나제(retinol dehydrogenase, ybbO) 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것인, 레티놀 생산능이 향상된 효모.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 효모는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인, 레티놀 생산능이 향상된 효모.
   
6. 삭제
7. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 효모를 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 레티놀 생산방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 배양배지는 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone), 대두(Soy bean) 및 글루코스(Glucose)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영양성분을 포함하는, 레티놀 생산방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 레티놀 생산방법은 추가로 상기 배양된 효모 또는 배지로부터 레티놀을 회수하는 단계를 포함하는 것인, 레티놀 생산방법.
   

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