KR102098170B1 - 베타카로틴을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 베타카로틴의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타카로틴 생합성 유전자가 도입된 베타카로틴을 생산하는 미생물; 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 베타카로틴 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 미생물은 베타카로틴 생산능이 향상되어, 베타카로틴을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있으며, 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 베타카로틴 생산방법을 토대로 베타카로틴 생산 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

베타카로틴을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 베타카로틴의 생산방법 {A microorganism for producing a beta-carotene and a method for preparing a beta-carotene using the same}

본 발명은 베타카로틴 생합성 유전자가 도입된 베타카로틴을 생산하는 미생물; 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 베타카로틴 생산방법에 관한 것이다.

현재 가축이나 어류 양식장의 경우 항생제 남용으로 인해 규제가 강화되고 있어, 항생제 대체 방안 연구 개발 및 제품화가 활발히 진행되고 있으며, 이러한 시대적 요구에 따라 여러 기관 및 업체에서 질병에 강하면서도 면역력을 증가하여 항생제 사용을 대체하는 사료첨가제를 출시하고 있는 실정이다.

베타카로틴은 비타민 A(레티놀)의 전구체로 항산화 효과(활성산소 억제, 염증제거)가 매우 뛰어나며 세포 손상을 막아주고 세포 재생을 도와주며 인체 및 동물에서 항산화제로 신체를 보호하는 기능을 가지고 있으며 감염, 바이러스 및 세균으로부터 신체를 보호할 수 있는 신체면역 체계 강화의 역할을 한다. 따라서, 상기와 같은 기능을 갖는 베타카로틴을 항생제를 대체하는 사료첨가제로 이용할 수 있다.

다만, 베타카로틴의 이와 같은 유용성에도 불구하고, 천연 베타카로틴은 대량생산이 용이하지 못한 실정이다. 베타카로틴의 대표적 생산 방법은 녹황색 채소로부터 베타-카로틴의 직접 추출 방법이다. 그러나, 이 방법은 계절과 기후 변동에 영향을 받으며, 장기간이 소요되며, 수율 또한 저조한 문제점이 있다. 좀더 안정적인 생산과 높은 수율을 달성하기 위하여 베타-카로틴의 화학적 합성도 시도되었으나, 화학적 합성 생산물의 안전성이 아직 인정되지 못하여 식용으로 사용하기에는 부적합하다.

부족하고 안정적이지 못한 생산량 및 인체사용 안전성에 관련된 문제 때문에 카로티노이드를 많이 합성하는 녹조류인 두날리엘라(Dunaliella)의 이용에 관한 연구가 많이 진행되어 왔고, 몇몇 산업적 이용에서 두날리엘라(Dunaliella)를 베타-카로틴 생산에 이용하고 있지만(한국 공개특허 제10-2010-0081388호), 이들 조류의 베타카로틴 합성 기작의 특성상 만족할 만한 수율을 얻지 못하고 있어 고효율·저비용의 생산을 위한 우수한 균주 개발의 필요성이 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 베타카로틴의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 베타카로틴을 생산할 수 있는 미생물을 개발하였고, 상기 미생물을 다양한 조건에서 배양하여 베타카로틴 생산량이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB) 및 불포화효소(desaturase, crtI) 단백질 활성이 강화된, 베타카로틴을 생산하는 미생물로서, 상기 미생물은 고지용성 효모 균주인, 베타카로틴을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베타카로틴 생산방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB) 및 불포화효소(desaturase, crtI) 단백질 활성이 강화된, 베타카로틴을 생산하는 미생물로서, 상기 미생물은 고지용성 효모 균주인, 베타카로틴을 생산하는 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "베타카로틴(bete-carotene)"은 비타민 A(레티놀)의 전구체로서, 항산화 효과(활성산소 억제, 염증제거)가 매우 뛰어나며 세포 손상을 막아주고 세포 재생을 도와주며 인체 및 동물에서 항산화제로 신체를 보호하는 기능을 가지고 있으며 감염, 바이러스 및 세균으로부터 신체를 보호할 수 있는 신체면역 체계 강화의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 제조된 베타카로틴은 사료 첨가제로 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB)"는 카로티노이드 생합성에 관련된 효소 중 하나로서, 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 파이토인(Phytoene)을 합성하는 효소를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[반응식]

2 geranylgeranyl diphosphate ↔ 15-cis-phytoene + 2 diphosphate

본 발명에서 용어, "불포화효소(desaturase, crtI)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 구체적으로, 라이코펜(Lycopene)을 합성하는 효소를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 파이토인 불포화효소(Phytoene desaturase)와 혼용될 수 있다.

[반응식]

15-cis-phytoene + 4 acceptor ↔ all-trans-lycopene + 4 reduced acceptor(전체 반응식)

(1a) 15-cis-phytoene + acceptor ↔ all-trans-phytofluene + reduced acceptor

(1b) all-trans-phytofluene + acceptor ↔ all-trans-zeta-carotene + reduced acceptor

(1c) all-trans-zeta-carotene + acceptor ↔ all-trans-neurosporene + reduced acceptor

(1d) all-trans-neurosporene + acceptor ↔ all-trans-lycopene + reduced acceptor

또한, 본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물은 추가로 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE) 단백질 활성이 강화된 것일 수 있다.

본원에서 용어, "제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE)"는 하기 반응식의 가역 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

[반응식]

farnesyl diphosphate + isopentenyl diphosphate ↔ Geranylgeranyl pyrophosphate

상기 파이토인 신타제, 불포화효소 및 제라닐제라닐 이인산염 신타제의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 파이토인 신타제, 불포화효소 및 제라닐제라닐 이인산염 신타제는 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous)에 유래된 것일 수 있으나, 미생물의 종 또는 미생물에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 그 유래나 서열에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 파이토인 신타제는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 상기 불포화효소는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 제라닐제라닐 이인산염 신타제는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 "아미노산 서열을 포함하는 단백질"은 "아미노산 서열을 가지는 단백질", 또는 "아미노산 서열로 구성되는 단백질"이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 효소들은 각각의 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 포함할 수 있다.

또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 효소 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.

본원에 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.

본 발명의 파이토인 신타제, 불포화효소 및 제라닐제라닐 이인산염 신타제는 상기 각각의 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 구체적으로 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB)를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고; 불포화효소(desaturase, crtI)를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며, 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE)을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 효소들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 파이토인 신타제, 불포화효소 및 제라닐제라닐 이인산염 신타제 효소 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 발명에서 용어, "활성의 강화"는 효소 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 자연적 혹은 인위적으로 나타나게 되는 것을 의미한다. 구체적으로 효소 단백질의 활성이 강화된 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비해서 효소단백질의 활성이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 활성 강화는 예를 들어, 외래의 파이토인 신타제, 불포화효소 및/또는 제라닐제라닐 이인산염 신타제를 도입하여 강화하는 것; 또는 내재적 파이토인 신타제, 불포화효소 및 제라닐제라닐 이인산염 신타제의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로, 본 발명에서 활성 강화의 방법으로는,

1) 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,

2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,

3) 상기 효소들의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 형, 또는

4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 또한 카피수 증가의 한 양태로, 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 효소와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 효소가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

구체적으로, 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있다. 더욱 구체적으로는 hxpr2 프로모터 또는 UAS1B 프로모터와 작동 가능하게 연결되어, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

마지막으로, 4) 상기 1) 내지 3)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 1 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 기능을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드 집합체인 경우 유전자로 기재될 수 있다. 본원에서 폴리뉴클레오티드와 유전자는 혼용될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 서열과 뉴클레오티드 서열은 혼용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pSKH, pRS-413, pRS-414, pRS-415 벡터, pBCA 벡터, pYLI 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함하거나, 이와 관련된 유전자를 제거할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질 전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질 전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "형질 전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, EAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 미생물은 추가로 Ku70 또는 Ku80 단백질 활성이 불활성화되거나 또는 URA3 유전자의 활성이 불활성화된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "Ku70" 또는 "Ku80"는 Ku 단백질로서, Ku70과 Ku80은 Ku 이형이량체(heterodimer)를 형성하여 절단된 DNA 이중가닥의 말단에 결합하여 비상동 말달 연결(non-homologous end joining, NHEJ) 경로를 통해 DNA 수리에 관여한다. 본 발명에서는 베타카로틴 생합성 유전자의 상동 재조합 효율을 높이기 위해 DNA 수리에 관여하는 단백질 중 하나인 Ku70이 결손된 미생물을 이용하였다.

본 발명에서 용어, "URA3 유전자"는 효모의 피리미딘 합성경로에서 오로티딘-5′-인산탈카르복시화효소(Orotidine 5'-phosphate decarboxylase, ODCase)를 암호화하는 유전자이다. 또한, URA3＋ 효모는 우라실 또는 우리딘이 첨가되지 않은 배지에서 증식할 수 있으나, 피리미딘유사체인 5-플루오로오로토산(5-fluoroorotic acid, 5-FOA)을 포함하는 배지에서는 증식하지 못하는 특징이 있는 바, URA3 유전자는 상기 특징을 이용하여 포지티브 또는 네거티브 마커로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 베타카로틴 생합성 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해 URA3 유전자가 결손된 효모를 제작하였고, 베타카로틴 생합성 유전자 도입 시 URA3 유전자를 동시에 도입시키는 방법을 이용하여 베타카로틴 생합성 유전자가 도입된 균주를 우라실 또는 우리딘이 첨가되지 않은 배지에서 선별하였다(실시예 1-1).

본 발명의 용어 "불활성화"는 본래 미생물이 가진 효소 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 그 활성이 약화되는 경우; 단백질이 전혀 발현이 되지 않는 경우; 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 약화하거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 미생물에 비하여 낮거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체가 결실된 경우; 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 한정되지는 않는다. 즉 효소 단백질의 활성이 불활성화된 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비해서 효소 단백질의 활성이 낮거나 또는 제거된 미생물을 의미한다.

상기 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 코딩하는 염색체 상의 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 베타카로틴을 생산하는 미생물은 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB) 및 불포화효소(desaturase, crtI) 단백질 활성이 강화된 미생물로서, 베타카로틴을 생산할 수 있고, 추가적으로 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE) 단백질 활성을 강화시킴으로써, 베타카로틴 생산능을 더욱 증가시킨 미생물일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 제라닐제라닐 이인산염(Geranylgeranyl diphosphate, GGPP)을 생산하는 미생물일 수 있다.

본 발명의 미생물은 베타카로틴 생산능이 있는 미생물인 한 제한이 없으나, 구체적으로, 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 미생물을 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베타카로틴 생산방법을 제공한다.

상기 "미생물" 및 "베타카로틴"은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

배양하는 단계에서 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 조절할 수 있으며, 구체적으로 5.5 내지 7.5, 5.5 내지 7.0, 6.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.0, 6.5 내지 7.5 또는 6.5 내지 7.0일 수 있고, 보다 구체적으로 배양하는 단계에서의 pH는 6.9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 배양하는 단계에서의 폭기량은 0.2 내지 1.5 vvm, 0.2 내지 1.3 vvm, 0.2 내지 1.1 vvm, 0.5 내지 1.5 vvm, 0.5 내지 1.3 vvm, 0.5 내지 1.1 vvm, 0.8 내지 1.5 vvm, 0.8 내지 1.3 vvm, 0.8 내지 1.1 vvm일 수 있으며, 보다 구체적으로 배양 단계에서의 폭기량은 0.9 vvm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 구체적으로 27 내지 31℃, 28 내지 31℃, 29 내지 31℃ 또는 30 내지 31℃를 유지할 수 있으며, 보다 구체적으로 30.2℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 또한 배양하는 단계에서 배양기의 운전 rpm은 50 내지 300rpm, 50 내지 250rpm, 100 내지 300rpm, 100 내지 250rpm, 150 내지 300rpm, 150 내지 250rpm, 200 내지 300rpm 또는 200 내지 250rpm일 수 있으며, 보다 구체적으로 249.9 rpm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물의 균주성장 O.D.를 최대로 하기 위한 최적의 배양 조건은 배양 pH 6.9, 배양온도 30.2℃, 폭기량 0.9 vvm 및 운전 rpm 249.9 rpm임을 확인하였고, 경제적인 배양공정을 위한 조건은 배양 pH 6.1, 배양온도 27.5℃, 폭기량 0.5 vvm 및 운전 rpm 100.0 rpm임을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "배지"는 본 발명의 미생물을 배양할 배양 배지 및/또는 배양한 다음 수득한 산물을 의미한다. 상기 배지는 미생물을 포함하는 형태 및 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 원심분리, 여과 등으로 미생물을 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물을 배양하는 데에 사용되는 배양 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물의 배양에 사용하는 배양배지는 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone), 대두(Soy bean) 및 글루코스(Glucose)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영양성분을 포함하는 것일 수 있다.

상기 효모 추출물은 본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 1 내지 4 중량부, 1.5 내지 4 중량부, 2 내지 4 중량부, 2.5 내지 4 중량부, 1 내지 3.5 중량부, 1.5 내지 3.5 중량부, 2 내지 3.5 중량부 또는 2.5 내지 3.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 3 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 펩톤은 본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 4 중량부, 1.5 내지 4 중량부, 2 내지 4 중량부, 2.5 내지 4 중량부, 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 3.5 중량부, 1.5 내지 3.5 중량부, 2 내지 3.5 중량부 또는 2.5 내지 3.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 3 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 대두는 본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 4 중량부, 1.5 내지 4 중량부, 2 내지 4 중량부, 2.5 내지 4 중량부, 0.5 내지 4 중량부, 1 내지 3.5 중량부, 1.5 내지 3.5 중량부, 2 내지 3.5 중량부 또는 2.5 내지 3.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 3 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 글로코스는 본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물의 배양배지에 적절량 포함될 수 있으며, 구체적으로 배양 배지 전체 100 중량부 기준으로 1 내지 3 중량부, 1 내지 2.5 중량부, 1.5 내지 3 중량부 또는 1.5 내지 2.5 중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 2 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 베타카로틴을 생산하는 미생물의 균주성장 O.D.를 최대로 하기 위한 최적의 배양 배지 조성은 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 효모 추출물 3.0%, 펩톤 3.0% 및 대두 4.0%임을 확인하였고, 경제적인 배양공정을 위한 배양 배지 조성은 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 효모 추출물 1.97%, 펩톤 1.0% 및 대두 2.0%임을 확인하였다.

상기 배양에 의하여 생산된 베타카로틴은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

또한, 본 발명의 베타카로틴 생산방법은 추가로 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 베타카로틴을 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 베타카로틴을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 베타카로틴을 생산하는 미생물 및 이의 배양액으로부터 목적하는 베타카로틴을 수집할 수 있다. 예를 들어, 동결건조, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양된 미생물 또는 배지로부터 목적하는 베타카로틴을 회수할 수 있다. 구체적으로, 일 실시예에서는 베타카로틴 생산용 균주를 포함하는 배양물에서 균주만을 수득하기 위해 3회의 원심분리를 수행하였고, 이를 통해 수득한 균주 내에 포함된 수용액이나 다량의 수분을 제거하기 위해 동결건조를 수행하여, 베타카로틴을 포함하는 동결건조 분말을 수득하였다(실시예 4). 상기 베타카로틴을 회수하는 단계는 분리 공정 및/또는 정제 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 미생물은 베타카로틴 생산능이 향상되어, 베타카로틴을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있으며, 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 베타카로틴 생산방법을 토대로 베타카로틴 생산 효율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 야로위아 리포리티카 내 베타카로틴 생합성 대사 경로의 설계를 나타낸 도면이다.
도 2는 YLOS(Y. lipolytica one-step transformation)법을 이용한 베타카로틴 생산용 균주 제작 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 SDS-PAGE를 통한 crtE(A), crtI(B) 및 crtYB(C) 유전자 삽입을 확인한 도면이다.
도 4는 균주의 색상 차이를 이용한여 베타카로틴 생산용 균주가 제작된 것을 확인한 도면이다.
도 5의 A는 효모 추출물(A), 펩톤(B) 및 대두(C)가 균주 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이고, 도 5의 B 내지 D는 최적의 배양배지 조건을 확립하기 위해 다양한 조건에서의 균주성장 O.D.값을 나타낸 도면이다.
도 6은 최적의 배양배지 조건(A) 및 경제적인 배양을 위한 배양배지 조건(B)를 나타낸 도면이다.
도 7은 배양 pH(A), 배양 온도(B), 폭기량(C) 및 운전 rpm(D)이 균주 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 최적의 배양 조건을 확립하기 위해 다양한 조건에서의 균주성장 O.D.값을 나타낸 도면이다.
도 9는 최적의 배양 조건(A) 및 경제적인 배양을 위한 조건(B)를 나타낸 도면이다.
도 10의 A는 1L 배양시의 균주 성장 O.D.값 및 글루코스 소모량을 나타낸 것이고, B는 배양 시간에 따른 베타카로틴 생산을 배양액 색상으로 확인한 것이다.
도 11은 10L 배양시의 균주 성장 O.D.값 및 글루코스 소모량을 나타낸 것이다.
도 12의 A 및 B는 500L 배양시의 균주 성장 O.D.값 및 글루코스 소모량을 나타낸 것이고, C는 배양 시간에 따른 베타카로틴 생산을 배양액 색상으로 확인한 것이다.
도 13의 A는 원심분리에 따른 배양액의 혼탁도를 비교한 것이고, B는 동결건조하여 회수한 베타카로틴 생산용 군주 건조분말을 보여주는 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 베타카로틴 생산용 균주 제작

실시예 1-1: 베타카로틴 생산용 야로위아 리포리티카 ( Yarrowia lipolytica ) 플랫폼 균주 제작

베타카로틴은 지용성 물질로서, 일반적으로 세포 내 세포막에서 생산되어 축적되므로, 고지용성 효모 균주로 알려진 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)를 베타카로틴 생산용 균주로 선정하였다.

다음으로, 베타카로틴 생산용 균주를 제작하기 위해서는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 균주의 유전체 내 고효율 유전자 조작이 필요하고, 이를 위해서는 유전체 내 반복적으로 특정 유전자군을 삽입하거나 제거할 수 있는 고효율 유전자 조작 시스템 및 삽입된 유전자가 유전체 내에서 상동 재조합(homologous recombination)이 고효율로 수행될 수 있는 시스템이 구축되어야 한다. 따라서, 상기 시스템이 구축된 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 플랫폼 균주를 제작하였다.

구체적으로, 상동 재조합의 효율을 높이기 위해서는 random insertion을 억제하는 기능을 갖는 Ku70/Ku80 유전자 중 하나를 제거하여야 하고, 외래 유전자 삽입을 확인하기 위한 영양요구성 선별 마커(auxotrophic selection marker)로서 URA3를 사용하기 위해서는 유전체 내 URA3 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, URA3 및 Ku70가 제거된 베타카로틴 생산용 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 플랫폼 균주를 제작하였고, 하기의 실험부터는 상기 균주를 이용하였다.

실시예 1-2: 야로위아 리포리티카 맞춤 고기능성 베타카로틴 생산 대사경로 설계 및 유전자 합성

야로위아 리포리티카는 제라닐제라닐 이인산염(Geranylgeranyl diphosphate: GGPP)까지 자체 생산하는 것으로 알려져 있는 바, GGPP에서 베타카로틴을 생산 하기 위한 대사경로를 설계하였다.

구체적으로, 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous) 유래의 베타카로틴 생합성 유전자인 crtE , crtI 및 crtYB를 코딩하는 염기서열을 야로위아 리포리티카에 적합하도록 코돈 최적화 한 후 각각의 유전자를 합성하였다(도 1).

crtE , crtI 및 crtYB를 코딩하는 염기서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재하였다.

실시예 1-3: 베타카로틴 생산용 Y. lipolytica 발현 벡터 제조

상기 실시예 1-2에서 합성한 crtE , crtI 및 crtYB 유전자 염기서열을 베타카로틴 생산용 야로위아 리포리티카 플랫폼 균주에서 안정적으로 발현시키기 위해 UAS1B 프로모터와 XPR2 터미네이터(terminator)이 포함되고, 벡터 시스템의 반복사용이 가능한 ura 마커 시스템을 적용한 발현 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 먼저 UAS1B 프로모터, XPR2 터미네이터 및 URA Blaster cassette가 도입된 발현 벡터에 실시예 1-2에서 합성한 crtE , crtI 및 crtYB를 코딩하는 염기서열을 KpnⅠ, BamHⅠ 제한효소를 이용하여 각각 발현 벡터에 삽입하였고, 각 유전자 서열이 삽입된 pBCA_crtE, pBCA_crtI 및 pBCA_crtYB 벡터를 제작하였다.

실시예 1-4: 베타카로틴 생합성 유전자 삽입 및 베타카로틴 생산 확인

상동 재조합을 이용하여 원하는 유전자 부분에 외래 유전자를 도입하는 YLOS(Y. lipolytica one-step transformation)법을 이용하여 실시예 1-1에서 제작한 균주 내부로 베타카로니 생합성 유전자를 삽입하고자 하였고, YLOS법의 지속적인 이용을 위해 ura blaster cassette을 사용하여 ura 마커를 제거 해줌으로써 베타카로틴 생산용 균주를 제작하였다(도 2)

구체적으로, 상기 실시예 1-3에서 제작한 pBCA_crtE 벡터를 상기 실시예 1-1에서 제작한 베타카로틴 생산용 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 플랫폼 균주에 형질전환시킨 후, colony PCR을 통하여 균주 내의 정확한 위치에 crtE 유전자가 삽입되었는지를 확인하였다(도 3A). crtE 유전자가 정확한 자리에 삽입된 경우 도 3A의 1, 5, 8 및 10 레인과 같이 4,000 bp에서 밴드가 나타난다. 삽입이 확인된 균주는 ura pop out을 통하여 ura 마커를 제거한 후, 이후의 crtI 유전자 삽입에 이용하였다.

상기와 같은 방법을 이용하여, crtI 유전자 및 crtYB 유전자를 차례로 삽입하였고, 상기 유전자가 삽입된 것을 확인하였다(도 3B 및 C). crtI 유전자가 정확한 자리에 삽입된 경우 도 3B의 11 및 12 레인과 같이 4,000 bp 부근에서 밴드가 나타나고, crtYB 유전자가 정확한 자리에 삽입된 경우 도 3C의 1, 2, 5, 9 및 10레인과 같이 6,000 bp 부근에서 밴드가 나타난다. 이와 같이 베타카로틴 생합성 유전자인 crtE, crtI 및 crtYB 유전자가 삽입된 베타카로틴 생산용 균주를 제작하였다.

상기 베타카로틴 생산용 균주를 배양한 결과, 기존의 야로위아 리포리티카 균주의 콜로니는 일반적으로 하얀색을 띄지만, 상기 베타카로틴 생산용 균주의 콜로니는 베타카로틴의 색인 주황색을 띄는 것을 확인하였는 바(도 4), 상기 실험에서 제작한 균주가 베타카로틴을 생산할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 2: Flask 수준 발효를 통한 베타카로틴 생산용 Y. lipolytica 배양 배지조성 및 배양조건 최적화

실시예 2-1: Flask scale 발효를 통한 배지조성 최적화

실시예 1에서 제작한 베타카로틴 생산용 균주의 배양 배지 조성을 최적화 하기 위해, Flask scale에서 베타카로틴 생산용 균주 발효를 실시하였다. Flask scale 발효에서는 에어레이션(aeration) 및 배양 간 pH조절에 한계를 가지고 있으므로 베타카로틴 생산용 균주의 배지 영양성분의 함량을 최적화 하는 것을 목적으로 수행하였다.

먼저, 배양 배지에 포함될 배지 영양성분으로 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone) 및 대두(Soy bean)를 선정하였고, 먼저 세포 배양 튜브 상에서 배지 5ml에 베타카로틴 생산용 균주 콜로니 1개를 접종하여 24시간 배양하였고, 상기 배양물을 250ml 플라스크의 45ml 배양 배지에 접종하여 배양을 수행하였다. 또한, 반응표면분석법(Response surface methodology, RSM) 중 하나인 중심합성계획법(central composite design, CCD)을 이용한 통계학적 최적화를 수행하였으며 각 조건별 균주들의 성장 O.D.값을 측정하여 최적화 지표로 사용하였다.

구체적으로, 상기에서 선정한 배지 영양성분인 효모 추출물(X1), 펩톤(X2) 및 대두(X3)를 독립변수(independent variables)로 하여 각각 5단계의 수준에서 중심합성계획법에 따라 최적화를 수행하였다(표 1).

Variables		Coded and actual level
		-1.68	-1	0	+1	+1.68
X1	Yeast extract (%)	0.32	1.0	2.0	3.00	3.68
X2	Peptone (%)	0.32	1.0	2.0	3.00	3.68
X3	soy bean (%)	1.32	2	30.8	4.00	4.68

또한, 표 2에 나타낸 바와 같이, 중심합성계획법 설계에 따라 3개의 독립변수를 변화시켜 17회의 독립실험을 통해 공정변수간의 상호작용 경향성, 신뢰성 및 예측 등을 SuperPro Designer 9.0 (Intelligen, Inc., US) 프로그램을 이용하여 분석하였고, 2차 회귀방정식을 아래와 같이 구하여 독립변수 상호영향을 고려하여 최적조건을 예측하였고, 종속변수의 일차항, 이차항과 교차항의 계수의 유의성을 판단하기 위한 ANOVA 분석을 통해(표 3) 실험값과 예측값의 일치를 확인하였으며, 이를 통해 전체 회귀모델의 유의성을 확인하였고(p<0.001), 또한, 일차항에서 효모 추출물(X1), 펩톤(X2) 및 대두 (X3) 농도가 유의한 영향을 미치는 것을 확인하였다(p<0.001).

<배지 조성 최적화를 위한 2차 회귀방정식>

Y=15.41+1.43X₁+1.01X₂+1.14X₃-1.23X₁X₂-0.033X₁X₃+1.67X₂X₃+0.36X₁ ²+0.41X₂ ²+ 0.59X₃ ²

Std No	X1	X2	X3	Cell growth (O.D.)
1	1.00	1.00	2.00	13.74
2	3.00	1.00	2.00	19.36
3	1.00	3.00	2.00	15.08
4	3.00	3.00	2.00	14.40
5	1.00	1.00	4.00	13.08
6	3.00	1.00	4.00	17.18
7	1.00	3.00	4.00	19.70
8	3.00	3.00	4.00	20.28
9	0.32	2.00	3.00	13.72
10	3.68	2.00	3.00	19.64
11	2.00	0.32	3.00	14.54
12	2.00	3.68	3.00	19.10
13	2.00	2.00	1.32	14.96
14	2.00	2.00	4.68	19.70
15	2.00	2.00	3.00	15.36
16	2.00	2.00	3.00	15.90
17	2.00	2.00	3.00	14.90

	ANOVA for response surface quadratic model
	Sum of Squares	F value	P value
Model	98.99	15.58	0.0008
X1	28.06	39.74	0.0004
X2	13.88	19.66	0.0030
X3	17.89	25.34	0.0015
X1X2	12.05	17.07	0.0044
X2X3	22.24	31.50	0.0008
X1 2	1.47	2.08	0.1928
X2 2	1.90	2.69	0.1453
X3 2	3.93	5.57	0.054

상기 실험을 수행한 결과, 각 독립변수 영향평가 시 효모 추출물, 펩톤, 대두의 함량이 증가할수록 균주 성장 O.D.가 증가하는 경향성을 확인하였다(도 5A). 또한, 상기 베타카로틴 생산용 균주 배양 시 배지내의 대두 함량이 3.0%로 고정되었을 때, 배지 내 펩톤 함량과 효모 추출물 함량 1.68% 이상 증가함에 따라 균주 성장 O.D.값이 증가하는 것을 확인하였다(도 5B).

또한, 상기 베타카로틴 생산용 균주 배양 시 배지 내의 펩톤 함량이 2.0%로 고정되었을 때, 대두 함량과 효모 추출물 함량이 균주 성장에 어떠한 영향을 미치는 지 확인하였다.

그 결과, 대두의 경우 배지 내 함량이 2.16% 구간에서부터 균주 성장률에 미치는 영향이 증가하기 시작하며, 효모 추출물의 경우 배지 내 함량이 1.16% 이상일 때 균주 성장률에 미치는 영향이 증가하기 시작하는 것을 확인하였는 바(도 5C), 이는 배지내의 대두 함량이 3.0%로 고정되었을 때 효모 추출물의 배지 내 함량이 균주 성장률 증가에 영향을 미쳤던 1.68% 보다 낮은 함량에서부터 균주 성장 O.D.값 증가에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 따라서, 대두와 효모 추출물 간의 비례적 균주 성장 O.D. 증가 경향으로 보아 대두 첨가가 긍정적인 영향을 주는 것으로 예측할 수 있다.

상기 베타카로틴 생산용 균주 배양 시 배지 내의 효모 추출물 함량이 2.0%로 고정되었을 때, 대두와 펩톤의 함량이 균주 성장에 어떠한 영향을 미치는 지 확인하였다.

그 결과, 상기 배지 내의 펩톤 함량이 2.0%로 고정되었을 때와 유사한 경향성을 확인할 수 있었으며, 대두 함량과 펩톤 함량이 증가함에 따라 균주성장에 미치는 영향이 증가하는 것을 확인하였다(도 5D). 따라서, 대두와 기존 조성물 펩톤 함량 간의 비례적 균주 성장 O.D.값의 증가 경향으로 보아 대두 첨가가 긍정적인 영향을 주는 것으로 예측할 수 있다.

다음으로, 균주 성장률 최대화 조건 예측을 위해 독립변수에 제한사항 없이 종속변수인 균주 성장 O.D.의 목적값을 최대로 설정하고 SuperPro Designer 9.0을 통해 최적화 조건을 예측한 결과, 효모 추출물 3.0%, 펩톤 3.0% 및 대두 4.0% 최적조건에서 균주성장 O.D.가 20.77인 것을 확인하였다(도 6A).

다만, 경제적인 추출공정 운전을 위해서는 균주 성장률을 최대로 유지하면서 에너지와 재료 투입의 최소화가 필요하므로, 균주성장 O.D. 목적값을 최대로 설정하고 효모 추출물, 펩톤 및 대두의 배지 내 함량을 최소로 제한조건을 설정하여 최적화 조건을 예측한 결과, 효모 추출물 1.97%, 펩톤 1.0%, 대두 2.0% 조건에서 최대 균주 성장 O.D. 15.84인 것을 확인하였다(도 6B).

실시예 2-2: Laboratory scale 발효를 통한 Y. lipolytica 배양조건 최적화

배양조건과 관련하여, 발효기 수준의 발효에서는 flask 발효에서 불가능했던 배양 간 일정한 pH 및 폭기량 유지가 가능하여 균주 성장에 보다 안정적인 성장환경을 제공이 가능하다는 이점이 있으므로 flask 수준의 발효에서보다 향상된 균주 성장률을 얻을 수 있을 것이라 예상하였고, 향후 10L 수준의 발효기 운용 시의 최적화된 배양조건 설정을 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 1L 발효를 통해 베타카로틴 생산용 균주의 배양에 영향을 미치는 인자로 pH, 배양온도, 폭기량 및 교반 rpm을 선정하여 통계학적 최적화 기법의 일종인 반응표면분석법을 도입하여 독립변수 상호영향을 고려하여 최적조건을 예측하고자 통계학적 최적화를 수행하였다. 배양 배지조성 최적화에 대한 실험계획은 상기 실시예 2-1과 동일하게 중심합성계획법을 실험설계에 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 SuperPro Designer 9.0 (Intelligen, Inc., US) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 또한, 디자인에 따라 확인한 균주 성장 O.D.값을 이차반응 모형식에 적용하고, 다중회귀분석에 의하여 분석하여, 최적의 배양조건을 결정하였다.

구체적으로, 실시예 2-1의 배양배지 최적화를 통해 선정된 혼합 배지(효모 추출물 3%, 펩톤 3% 및 대두 4%)에 글루코스 함량을 2%로 설정하였다. 또한, 1L 발효기에 working volume을 500 mL로 진행하였고, 균주 접종량은 working volume의 10%에 해당하는 50Ml를 접종한 후, 균주 배양 간 pH는 1N 염산과 1M 수산화나트륨 용액을 이용하여 조절하였다. 상기 조건 하에서, pH(X₁), 배양온도(X₂), 폭기량(X₃), 운전 rpm(X₄) 독립변수(independent variables)로 설정하여 각각 5단계의 수준에서 중심합성계획법에 따라 최적화를 수행하였다(표 4).

Variables		Coded and actual level
		-1.68	-1	0	+1	+1.68
X1	pH	5.5	6.0	6.5	7.0	7.5
X2	Temperature (?)	20.0	25.0	30.0	35.0	40.0
X3	Aeration (vvm)	0.3	0.5	0.8	1.0	1.3
X4	Agitation (rpm)	25.0	100.0	175.0	250.0	325.0

또한, 상기 4개의 독립변수를 변화시켜 27회 독립실험을 통해 공정변수간의 상호작용 경향성, 신뢰성 및 예측 등을 SuperPro Designer 9.0(Intelligen, Inc,. US) 프로그램을 이용하여 분석하였고, 각 조건별 균주들의 성장 O.D. 값을 측정하여 최적화 지표로 사용하였다(표 5).

Std No	X1	X2	X3	X4	Cell growth (O.D.)
1	6.0	25.0	0.5	100.0	46.17
2	7.0	25.0	0.5	100.0	53.25
3	6.0	35.0	0.5	100.0	51.73
4	7.0	35.0	0.5	100.0	57.71
5	6.0	25.0	1.0	100.0	50.23
6	7.0	25.0	1.0	100.0	62.27
7	6.0	35.0	1.0	100.0	52.08
8	7.0	35.0	1.0	100.0	64.37
9	6.0	25.0	0.5	250.0	45.77
10	7.0	25.0	0.5	250.0	61.16
11	6.0	35.0	0.5	250.0	55.05
12	7.0	35.0	0.5	250.0	59.83
13	6.0	25.0	1.0	250.0	59.19
14	7.0	25.0	1.0	250.0	72.48
15	6.0	35.0	1.0	250.0	66.68
16	7.0	35.0	1.0	250.0	75.27
17	5.5	30.0	0.8	175.0	51.09
18	7.5	30.0	0.8	175.0	73.86
19	6.5	20.0	0.8	175.0	40.78
20	6.5	40.0	0.8	175.0	52.02
21	6.5	30.0	0.3	175.0	58.06
22	6.5	30.0	1.3	175.0	69.48
23	6.5	30.0	0.8	25.0	65.96
24	6.5	30.0	0.8	325.0	70.16
25	6.5	30.0	0.8	175.0	62.22
26	6.5	30.0	0.8	175.0	64.73
27	6.5	30.0	0.8	175.0	69.85

다음으로, 반응표면 분석법 중 하나인 중심합성계획법 이용하여 2차 회귀방정식을 아래와 같이 구하여 독립변수 상호영향을 고려하여 최적조건을 예측하였고, 종속변수의 일차항, 이차항과 교차항의 계수의 유의성을 판단하기 위한 ANOVA 분석을 통해(표 6) 실험값과 예측값 일치를 확인 하였으며 전체 회귀모델의 유의성을 확인하였고(p<0.0001), 또한, 일차항에서 배양 pH(X₁), 배양온도(X₂), 폭기량(X₃), 운전 rpm(X₄)이 유의한 영향을 미치는 것을 확인하였다(p<0.05).

<배양 조건 최적화를 위한 2차 회귀방정식>

Y=65.60+5.21X₁+2.28X₂+3.95X₃+2.75X₄-1.01X₁X₂+0.81X₁X₃+0.29X₁X₄-0.23X₂X₃+ 1.98X₃X₄-1.09X₁ ²-5.11X₂ ²-0.77X₃ ²+0.31X₄ ²

	ANOVA for response surface quadratic model
	Sum of Squares	F value	P value
Model	2081.91	13.56	<0.0001
X1	650.57	59.34	<0.0001
X2	124.53	11.36	0.0056
X3	373.94	34.11	<0.0001
X4	181.59	16.56	0.0016
X1X2	16.34	1.49	0.2455
X1X3	10.54	0.96	0.34661
X1X4	1.36	0.12	0.7310
X2X3	0.88	0.080	0.7821
X2X4	1.13	0.10	0.7536
X3X4	62.86	5.73	0.0339
X1 2	25.31	2.31	0.1546
X2 2	556.53	50.76	<0.0001
X3 2	12.54	1.14	0.3059
X4 2	1.99	0.18	0.6773

상기 실험을 수행한 결과, 각 독립변수 영향평가시 배양 pH(X₁), 배양온도(X₂), 폭기량(X₃), 운전 rpm(X₄)이 증가할수록 균주 성장 O.D.값이 증가하는 경향성을 확인하였으며(도 7) 일부 배양 조건이 고정되었을 때, 다른 배양 조건이 어떻게 영향을 미치는지 확인하였다.

(1) 폭기량이 0.8 vvm, 운전 rpm 175로 고정되었을 때, 온도와 pH가 높아질수록 균주 성장 O.D.값이 크게 증가함을 보이나 배양온도 28~32℃, pH 7.6 이후로 서서히 감소하는 경향을 확인하였다(도 8A).

(2) 배양온도 30℃, 운전 rpm 175로 고정되었을 때, 배양 시 폭기량과 pH가 증가함에 따라 균주 성장 O.D.값이 증가하다가, pH 7.6 부근 이후로 다시 감소하며 pH 6.9~7.6 사이에서 균주 성장 O.D.값이 최대임을 확인하였고, 폭기량은 pH 5.5~6.2 구간에서는 균주 성장 O.D.값의 증가량이 미미한 것을 확인했으며, pH 6.9~7.6 구간에서는 균주 성장 O.D.값의 증가에 비교적 높은 영향을 미치는 것을 확인하였다(도 8B).

(3) 배양온도 30℃, 폭기량 0.8 vvm으로 고정되었을 때, 배양 시 pH 7.6 부근 이후로 다시 감소하는 경향성을 확인하였으며, pH 6.9~7.6 사이에서 최대값이 나타남을 확인하였고, 운전 rpm은 pH 5.5~6.2 구간에서는 균주 성장 O.D.값 증가량에 미치는 영향이 미미한 수준을 확인하였으나, 균주 성장 O.D.값이 증가하기 시작하는 pH 6.9~7.6 구간에서는 균주 성장 O.D.값 증가에 상대적으로 높은 영향을 미치는 것을 확인하였다(도 8C).

(4) 배양 pH 6.5, 운전 rpm 175로 고정되었을 때, 배양온도가 증가함에 따라 배양온도 32℃ 부근 이후로 다시 감소하는 경향성을 확인하였고, 배양온도 28~32℃ 사이에서 균주 성장 O.D.값이 최대값을 나타냄을 확인하였다. 또한, 폭기량은 배양온도 20~24℃ 구간에서는 균주 성장 O.D.값의 증가량에 미치는 영향이 미미한 수준임을 확인하였으나, 균주 성장 O.D.값이 증가하기 시작하는 배양온도 28~32℃ 구간에서는 균주 성장 O.D. 값의 증가에 상대적으로 높은 영향을 미치는 것을 확인하였다(도 8D).

(5) 배양 pH 6.5, 폭기량 1.0 vvm으로 고정되었을 때, 배양온도 32℃ 부근 이후로 다시 감소하는 형태로 변화를 보여주며 배양온도 28~32℃ 사이에서 균주 성장 O.D.값이 최대값을 나타냄을 확인하였다. 또한, 운전 rpm은 배양온도 20~24℃ 구간에서는 균주 성장 O.D.값의 증가량에 미치는 영향이 미미한 수준임을 확인하였으나, 균주 성장 O.D.값이 증가하기 시작하는 배양온도 28~32℃ 구간에서는 균주 성장 O.D.값 증가에 상대적으로 높은 영향을 미치는 것을 확인하였다(도 8E).

(6) 배양 pH 7.0, 배양온도 30℃로 고정되었을 때, 폭기량 및 운전 rpm이 증가할수록 균주 성장 O.D.값이 증가함을 확인하였고, 폭기량은 운전 rpm이 25~175rpm인 구간에서 균주성장 O.D.값에 미치는 영향이 미미한 수준임을 확인하였으나, 균주 성장 O.D.값이 최대인 325 rpm 구간에서 상대적으로 높은 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한, 균주 성장 O.D.값을 증가시키기 위해서는 배양 간 공급되는 폭기량 이외에 공급된 폭기를 교반을 통한 효율적 분산이 이루어져야 한다는 것을 알 수 있다(도 8F).

다음으로, 균주 성장률 최대화 조건 예측을 위해 독립변수에 제한사항 없이 종속변수인 균주성장 O.D.의 목적값을 최대로 설정하고 SuperPro Designer 9.0을 통해 최적화 조건을 예측한 결과, 배양 pH 6.9, 배양온도 30.2℃, 폭기량 0.9 vvm및 운전 rpm 249.9 rpm에서 균주 성장 O.D값이 75.49 확인하였다(도 9A).

또한, 경제적인 추출공정 운전을 위해서는 균주 성장률을 최대로 유지하면서 낮은 배양온도와 운전 rpm 운전으로 에너지를 절감하기 위해, 균주 성장 O.D. 목적 값을 최대로 설정하고 배양 pH, 배양온도, 폭기량과 운전 rpm을 최소로 제한조건을 설정하여 최적화를 수행했을 때 배양pH 6.1, 배양온도 27.5℃, 폭기량 0.5 vvm 및 운전 rpm 100.0 rpm 조건에서 최대 균주 성장 O.D 값이 53.11으로 예측하였다(도 9B).

실시예 2-3: 배지조성 및 배양 조건 최적화 validation test (1L 발효기)

1L 발효는 플라스크 배양에서 얻은 최적조건이 발효기 조건에 부합하는지에 대한 평가를 위해 수행하는 발효의 1번째 단계로 긍극적으로 pilot scale 발효공정의 타당성을 확인하기 위해 실험실 수준에서 진행하는 선행발효이며, 실험실 수준에서 진행하는 발효조 크기 중에서 가장 작은 scale이다. 따라서, 상기 실시예 2-1 및 2-2에서 얻은 최적화 조건을 이용하여 1L 발효기로 배양 시 생산되는 베타카로틴의 양과 균주 성장이 최적화 결과인 균주 성장률 O.D.(600nm) 75.49에 실제 달성여부를 확인하고, 또한 향후 pilot scale 발효 진행 시 글루코스 공급 주기를 파악하기 위해 글루코스 함량 측정 또한 진행하여, 발효 간 베타카로틴 생산용 균주의 당 소모 경향 파악을 목적으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2-1의 배지조성 최적화에 따라 효모 추출물 3%, 펩톤 3%, 대두 4%, 글루코스 2%를 포함하는 배양배지에서 실시예 2-2의 배양조건 최적화를 통해 확립한 배양조건인 pH 6.9, 온도 30.2℃, 폭기량 0.9 vvm 및 운전 rpm 249.9 rpm으로 배양을 진행하였다. 또한, 1L 발효기에 working volume을 500 mL로 진행하였으며 접종량은 working volume의 10%에 해당하는 50 mL 접종한 후, 균주 배양 간 pH는 1N 염산과 1M 수산화나트륨 용액을 이용하여 조절하였고, 정확한 validation test를 위해 3반복 실험을 진행하였다. 또한, 8시간 간격으로 발효액의 O.D.를 측정하였다.

상기 배양 결과, 발효 시작 후 96시간이 지난 샘플에서, 균주 성장 O.D.값이 74.42로서, 예측한 최적화 결과인 75.49와 유사한 것을 확인하였다(도 10A). 또한, 96시간 발효 시 24시간 대비 배양액의 색상이 주황색을 나타낸 것으로 보아 베타카로틴이 생성된 것을 간접적으로 확인할 수 있었다(도 10B).

다음으로, 1L 발효간 배지 내 글루코스 함량 측정을 통해, 발효간 베타카로틴 생산용 균주의 당 소모량의 측정과 pilot scale 발효 진행 시 글루코스 공급 주기를 파악하기 위해, 페놀-황산법을 통한 당 함량을 측정하였다. 상기 페놀-황산법은 당 함량 측정에 많이 이용되는 방법으로서, 미량의 시료로 측정이 가능하며, 황산을 사용하기 때문에 전분, 셀룰로오스 등과 같은 고분자 물질도 가수분해하지 않고 시료로 사용이 가능하다. 구체적으로, 환원당을 95% 황산으로 처리하면 탈수되어 furfural 또는 그 유도체인 phenol류나 방향족 anmine류에 의해 발색하는 원리를 이용하여 흡광도 492nm에서 측정하였고, 글루코스 용액으로 구한 표준곡선을 이용하여 정량분석을 진행하였다.

상기 글루코스 함량 측정 결과, 배지 내 당 함량은 초기 배지성분(효모 추출물 3%, 펩톤 3%, 글루코스 2%, 대두 4%)으로 0시간 측정 시 1.91%, 배양 24시간이 지난 후 측정 시 1.09%의 당 함량이 측정되었는 바, 24시간에 1%의 당이 소모되는 것을 확인하였으며, 공급 후 당 함량은 3.92%, 배양 48시간이 지난 후 2.08%, 72 시간이 지난 후 0.99%, 96시간이 지난 후 0.24%로 측정되어 베타카로틴 생산용 균주의 당 소모경향을 파악 할 수 있었다(도 10A)

실시예 2-4: 배지조성 및 배양 조건 최적화 validation test (10L 발효기)

10L 발효는 pilot scale로 가는 2번째 단계로 pilot scale 공정의 타당성을 확인하기 위해 실험실 수준에서 진행하는 발효이며, 실험실 수준에서 진행하는 발효조 크기 중에서 가장 큰 scale이다. 일반적으로 laboratory scale은 1~10L 발효기를 나타내며, pilot scale은 산업적 규모인 50-1000L 규모를 나타낸다. 상기 실시예 2-3에서 1L 발효를 통해 얻어진 최적화 조건을 이용하여 10L 발효기로 scale-up을 하였을 시 생산되는 베타카로틴의 양과 균주 성장이 1L 발효기에서 얻어진 결과와 동일한 결과를 나타내는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2-1의 배지조성 최적화에 따라 효모 추출물 3%, 펩톤 3%, 대두 4%, 글루코스 2%를 포함하는 배양배지에서 실시예 2-2의 배양조건 최적화를 통해 확립한 배양조건인 pH 6.9, 온도 30.2℃, 폭기량 0.9 vvm 및 운전 rpm 249.9 rpm으로 배양을 진행하였다. 또한, 10L 발효기에 working volume을 5L로 진행하였으며 접종량은 working volume의 10%에 해당하는 500 mL 접종한 후, 균주 배양 간 pH는 1N 염산과 1M 수산화나트륨 용액을 이용하여 조절하였고, 정확한 validation test를 위해 3반복 실험을 진행하였다. 또한, 8시간 간격으로 발효액의 O.D.를 측정하였다.

상기 배양 결과, 발효 시작 후 96시간이 지난 샘플에서, 균주 성장 O.D.값이 70.4로서, 예측한 최적화 결과인 75.49와 유사한 것을 확인하였고, 베타카로틴 함량을 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 베타카로틴 생산량은 1.97 mg/g 임을 확인하였다(도 11).

또한, 상기 글루코스 함량 측정 결과, 배지 내 당 함량은 초기 배지성분(효모 추출물 3%, 펩톤 3%, 글루코스 2%, 대두 4%)으로 0시간 측정 시 1.86%의 글루코스 함량을 나타내었고, 배양 24시간 후 글루코스 3%를 공급한 후 3.89%, 배양 96시간이 지난 후 0.03%로 측정되어 베타카로틴 생산용 균주의 당을 소모하여 성장하는 것을 확인하였다(도 11).

실시예 3: 베타카로틴 대량생산을 위한 Pilot scale 발효

Scale-up은 실험실 규모의 결과를 공장규모의 산업적 생산으로 전환시키는 과정으로서, 실험실에서 성공한 프로세스를 산업적 규모의 장치에서도 경제적으로 성립하도록 그 규모를 확대하는 것이다. 상기와 같은 scale-up을 통해 발효조의 규모는 1L, 10L 및 500L로 점점 커지게 된다. 상기 실시예 2에서의 실험실 수준의 최적화 조건이 산업적 수준에서도 적용되는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2-1의 배지조성 최적화에 따라 효모 추출물 3%, 펩톤 3%, 대두 4%, 글루코스 2%를 포함하는 배양배지에서 실시예 2-2의 배양조건 최적화를 통해 확립한 배양조건인 pH 6.9, 온도 30.2℃, 폭기량 0.9 vvm 및 운전 rpm 249.9 rpm으로 배양을 진행하였다. 또한, 500L 발효기에 working volume을 150L로 진행하였으며 접종량은 working volume의 1%에 해당하는 1.5L 접종한 후, 균주 배양 간 pH는 1N 염산과 1M 수산화나트륨 용액을 이용하여 조절하였고, 배양간 발생하는 기포제거를 위해 효모 성장에 억제영향을 끼치지 않으며 그 중 효율적인 기능을 가진 Antifoam Y-30 선정하여 사용하였다.

또한, 상기의 초기 배지조성으로 발효를 24시간 진행한 후, 실시예 2-4에서와 동일하게 배양 24시간 후에 글루코스 3%를 공급하여 발효를 진행하였고, 총 발효 시간은 96시간 진행하였으며 8시간 간격으로 샘플링하여 1회당 20ml씩, 총 working volume 0.18%에 해당되는 양인 260 ml을 샘플링하여 96시간 발효간 Oxygen transfer rate(OTR)에 영향을 주지 않는 수준으로 진행하였다.

상기 배양 결과, 발효 시작 후 96시간이 지난 샘플에서, 균주 성장 O.D.값이 66.8로서, 이는 Labortory scale 진행 시 확인한 74.42의 O.D.값에 대해 약 1.11배 낮은 결과이지만, 이는 실제 Pilot scale 진행시 발생하는 발효기의 구조적 차이로 인한 오차라고 예상된다. 또한, 베타카로틴 함량을 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 베타카로틴 생산량은 1.12 mg/g 임을 확인하였다(도 12A 및 B). 또한, 총 당 함량은 초기 배지성분(효모 추출물 3%, 펩톤 3%, 대두 4%, 글루코스 2%,)으로 배양시작 직후 측정 시 1.92%의 글루코스 함량을 나타내었고, 글루코스 3% 공급 직후 4.17%, 배양 96시간 후 0.57%로 측정되어, 베타카로틴 생산용 균주가 당을 소모하여 성장하는 것을 확인하였다.

또한, 96시간 발효간 샘플링하여 얻은 배양액의 O.D.값을 측정한 결과, 0~16시간 구간에서는 O.D.값의 차이가 크게 나타나지 않는 것을 확인하였는 바, 이는 유도기로 판단되며, 16~96시간 구간에서는 O.D.값이 지속적으로 증가하는 것으로 보아 대수기로 판단된다(도 12A 및 B). 또한, 96시간 발효간 샘플링하여 얻은 배양액의 색상이 시간이 지날수록 점점 주황색을 나타낸 것으로 보아 베타카로틴이 생성된 것을 간접적으로 확인할 수 있었다(도 12C).

실시예 4: 베타카로틴 회수를 위한 원심분리 및 동결건조 진행 및 베타카로틴 생산용 균주의 동결건조분말로부터 베타카로틴 추출

실시예 4-1: 베타카로틴 생산용 균주의 회수

베타카로틴 생산용 균주로부터 생산된 베타카로틴을 회수하기 위해, 먼저 상기 균주의 동결건조분말을 수득하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 배양배지와 상기 베타카로틴 생산용 균주를 분리하기 위해, disc bowl type의 원심분리기를 이용하였고, 최대한 많은 균주를 확보하기 위해 3회 원심분리를 진행하였다. 그 결과, 원심분리의 횟수가 증가할수록 배지의 혼탁도가 감소된 것을 확인하였는 바(도 13A), 3회의 원심분리로 인해 최대한 많은 균주를 확보할 수 있음을 알 수 있다.

다음으로, 균주 내에 포함된 수용액이나 다량의 수분을 제거하기 위해 상기 원심분리에 의해 수득한 슬러지 50kg 원료를 동결건조시켜, 베타카로틴을 함유한 균주의 동결건조 원료 2.6kg을 수득하였다(도 13B).

실시예 4-2: 베타카로틴 생산 균주의 동결건조분말로부터 베타카로틴 추출

상기 실시예 4-1에서 수득한 베타카로틴 생산용 균주의 동결건조분말의 베타카로틴 함량을 분석하기 위해, 상기 동결건조 원료의 5g을 취하여 아세톤 20ml을 첨가한 후, 빛을 차단하여 추출을 진행하였으며, 추출물의 상층액은 원심분리하여 0.45μm 필터로 여과하여 HPLC 분석을 위한 검액으로 사용하였다.

HPLC 분석법은 식품의약품안전청 고시 제 2011-68호 ‘건강기능식품의 기준 및 규격 고시전문’을 참고로 하였고, 베타카로틴 분석에 사용된 HPLC 분석 조건은 표 7과 같으며, 분석결과 500L 배양시 1.1 mg/g의 베타카로틴 함량을 확인하였다. 또한, 동결건조한 시료는 배양액 150L에서 2.6kg 수득하였는 바, 배양액 1L에 포함되어 있는 Dry cell weight는 17.3 g/L로 확인하였다. 10L 발효기 및 500L 발효기 사용시의 베타카로틴 생산량, 균주 O.D.값 및 건조중량값은 하기 표 8에 기재하였다.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> A microorganism for producing a beta-carotene and a method for preparing a beta-carotene using the same <130> KPA180226-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1131 <212> DNA <213> Phytoene synthase, crtYB <400> 1 atggactacg caaacatcct caccgcaatc ccattggagt tcaccccaca ggatgatatc 60 gtgctgttgg agccttacca ctacctcggt aagaaccctg gtaaggagat ccgttctcag 120 ctcatcgagg cattcaacta ctggctggat gtcaagaagg aggacctgga ggtcatccag 180 aacgtcgttg gaatgttgca cacggcttct ttgctcatgg acgatgtgga ggattcttcg 240 gtgttgcgta gaggttctcc tgttgctcac ctcatctacg gtatccctca gacaatcaac 300 accgctaact acgtgtactt cctggcgtac caggagatct tcaagctgcg acctacgcct 360 atccccatgc ccgttatccc cccgtcttct gcttctttgc aatcttctgt ttcttccgct 420 tcttcttcct ccagcgctag ctccgaaaac ggtggaacaa gcacacccaa ttcccaaatc 480 cccttctcca aggatacata cctcgataag gtgattacgg acgagatgct ctccctgcac 540 agaggacagg gacttgagct tttctggaga gactcgctta cttgcccgtc ggaagaagag 600 tacgttaaga tggtgctggg 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Pro Phe Ser Lys Asp Thr Tyr Leu Asp Lys Val Ile Thr Asp Glu Met 165 170 175 Leu Ser Leu His Arg Gly Gln Gly Leu Glu Leu Phe Trp Arg Asp Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Val Lys Met Val Leu Gly Lys 195 200 205 Thr Gly Gly Leu Phe Arg Ile Ala Val Arg Leu Met Met Ala Lys Ser 210 215 220 Glu Cys Asp Ile Asp Phe Val Gln Leu Val Asn Leu Ile Ser Ile Tyr 225 230 235 240 Phe Gln Ile Arg Asp Asp Tyr Met Asn Leu Gln Ser Ser Glu Tyr Ala 245 250 255 His Asn Lys Asn Phe Ala Glu Asp Leu Thr Glu Gly Lys Phe Ser Phe 260 265 270 Pro Thr Ile His Ser Ile His Thr Asn Pro Ser Ser Arg Leu Val Ile 275 280 285 Asn Thr Leu Gln Lys Lys Ser Thr Ser Pro Glu Ile Leu His His Cys 290 295 300 Val Asn Tyr Met Arg Thr Glu Thr His Ser Phe Glu Tyr Thr Arg Glu 305 310 315 320 Val Leu Asn Thr Leu Ser Gly Ala Leu Glu Arg Glu Leu Gly Arg Leu 325 330 335 Gln Glu Glu Phe Ala Glu Ala Asn Ser Arg Met Asp Leu Gly Asp Val 340 345 350 Glu Ser Glu Gly Arg Thr Gly Lys Asn Val Lys Leu Glu Ala Ile Leu 355 360 365 Lys Lys Leu Ala Asp Ile Pro Leu 370 375 <210> 5 <211> 582 <212> PRT <213> desaturase, crtI <400> 5 Met Gly Lys Glu Gln Asp Gln Asp Lys Pro Thr Ala Ile Ile Val Gly 1 5 10 15 Cys Gly Ile Gly Gly Ile Ala Thr Ala Ala Arg Leu Ala Lys Glu Gly 20 25 30 Phe Gln Val Thr Val Phe Glu Lys Asn Asp Tyr Ser Gly Gly Arg Cys 35 40 45 Ser Leu Ile Glu Arg Asp Gly Tyr Arg Phe Asp Gln Gly Pro Ser Leu 50 55 60 Leu Leu Leu Pro Asp Leu Phe Lys Gln Thr Phe Glu Asp Leu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Met Glu Asp Trp Val Asp Leu Ile Lys Cys Glu Pro Asn Tyr Val 85 90 95 Cys His Phe His Asp Glu Glu Thr Phe Thr Leu Ser Thr Asp Met Ala 100 105 110 Leu Leu Lys Arg Glu Val Glu Arg Phe Glu Gly Lys Asp Gly Phe Asp 115 120 125 Arg Phe Leu Ser Phe Ile Gln Glu Ala His Arg His Tyr Glu Leu Ala 130 135 140 Val Val His Val Leu Gln Lys Asn Phe Pro Gly Phe Ala Ala Phe Leu 145 150 155 160 Arg Leu Gln Phe Ile Gly Gln Ile Leu Ala Leu His Pro Phe Glu Ser 165 170 175 Ile Trp Thr Arg Val Cys Arg Tyr Phe Lys Thr Asp Arg Leu Arg Arg 180 185 190 Val 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15 Ile Leu Gly Leu Leu Gly Leu Leu Thr Ser Pro Ile Leu Thr Lys Phe 20 25 30 Asp Ile Tyr Lys Ile Ser Ile Leu Val Phe Ile Ala Phe Ser Ala Thr 35 40 45 Thr Pro Trp Asp Ser Trp Ile Ile Arg Asn Gly Ala Trp Thr Tyr Pro 50 55 60 Ser Ala Glu Ser Gly Gln Gly Val Phe Gly Thr Phe Leu Asp Val Pro 65 70 75 80 Tyr Glu Glu Tyr Ala Phe Phe Val Ile Gln Thr Val Ile Thr Gly Leu 85 90 95 Val Tyr Val Leu Ala Thr Arg His Leu Leu Pro Ser Leu Ala Leu Pro 100 105 110 Lys Thr Arg Ser Ser Ala Leu Ser Leu Ala Leu Lys Ala Leu Ile Pro 115 120 125 Leu Pro Ile Ile Tyr Leu Phe Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Asp 130 135 140 Pro Leu Val Thr Asp His Tyr Phe Tyr Met Arg Ala Leu Ser Leu Leu 145 150 155 160 Ile Thr Pro Pro Thr Met Leu Leu Ala Ala Leu Ser Gly Glu Tyr Ala 165 170 175 Phe Asp Trp Lys Ser Gly Arg Ala Lys Ser Thr Ile Ala Ala Ile Met 180 185 190 Ile Pro Thr Val Tyr Leu Ile Trp Val Asp Tyr Val Ala Val Gly Gln 195 200 205 Asp Ser Trp Ser Ile Asn Asp Glu Lys Ile Val Gly Trp Arg Leu Gly 210 215 220 Gly Val Leu Pro Ile Glu Glu Ala Met Phe Phe Leu Leu Thr Asn Leu 225 230 235 240 Met Ile Val Leu Gly Leu Ser Ala Cys Asp His Thr Gln Ala Leu Tyr 245 250 255 Leu Leu His Gly Arg Thr Ile Tyr Gly Asn Lys Lys Met Pro Ser Ser 260 265 270 Phe Pro Leu Ile Thr Pro Pro Val Leu Ser Leu Phe Phe Ser Ser Arg 275 280 285 Pro Tyr Ser Ser Gln Pro Lys Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys Leu 290 295 300 Leu Glu Glu Lys Ser Arg Ser Phe Phe Val Ala Ser Ala Gly Phe Pro 305 310 315 320 Ser Glu Val Arg Glu Arg Leu Val Gly Leu Tyr Ala Phe Cys Arg Val 325 330 335 Thr Asp Asp Leu Ile Asp Ser Pro Glu Val Ser Ser Asn Pro His Ala 340 345 350 Thr Ile Asp Met Val Ser Asp Phe Leu Thr Leu Leu Phe Gly Pro Pro 355 360 365 Leu His Pro Ser Gln Pro Asp Lys Ile Leu Ser Ser Pro Leu Leu Pro 370 375 380 Pro Ser His Pro Ser Arg Pro Thr Gly Met Tyr Pro Leu Pro Pro Pro 385 390 395 400 Pro Ser Leu Ser Pro Ala Glu Leu Val Gln Phe Leu Thr Glu Arg Val 405 410 415 Pro Val Gln Tyr His Phe Ala Phe Arg Leu Leu Ala Lys Leu Gln Gly 420 425 430 Leu Ile Pro Arg 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Gly Asp Val Gly Glu Arg Arg Thr Val Ala Gly Trp 645 650 655 Arg Arg Val Arg Lys Val Leu Ser Val Val Met Ser Gly Trp Glu Gly 660 665 670 Gln

Claims (16)

1. 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB), 불포화효소(desaturase, crtI), 및 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE) 단백질 활성이 강화되고, Ku70 또는 Ku80의 활성이 불활성화된,
   베타카로틴을 생산하는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 미생물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE), 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB) 및 불포화효소(desaturase, crtI)는 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous)에서 유래된 것인, 미생물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 파이토인 신타제(Phytoene synthase, crtYB)를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고; 상기 불포화효소(desaturase, crtI)를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며, 상기 제라닐제라닐 이인산염 신타제(GGPP synthase, crtE)을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것인, 미생물.
   
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6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 제라닐제라닐 이인산염(Geranylgeranyl diphosphate, GGPP)을 생산하는 미생물인 것인, 미생물.
   
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8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 URA3 유전자의 활성이 불활성화된 것인, 미생물.
   
9. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베타카로틴 생산방법으로서,
   상기 배양배지는 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone), 대두(Soy bean) 및 글루코스(Glucose)의 영양성분을 포함하며,
   (a) 상기 효모 추출물은 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 1 내지 4 중량부로 포함되고; (b) 상기 펩톤은 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 0.5 내지 4 중량부로 포함되고; (c) 상기 대두는 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 1 내지 5 중량부로 포함되고; (d) 상기 글루코스는 배양배지 전체 100 중량부 기준으로 1 내지 3 중량부로 포함되는 것인, 베타카로틴 생산방법.
   
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12. 제9항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 pH 5.5 내지 7.5의 범위에서 수행하는 것인, 베타카로틴 생산방법.
    
13. 제9항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 배양온도 27 내지 31℃의 범위에서 수행하는 것인, 베타카로틴 생산방법.
    
14. 제9항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 폭기량 0.2 내지 1.5 vvm의 범위에서 수행하는 것인, 베타카로틴 생산방법.
    
15. 제9항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 운전 rpm 50 내지 300rpm의 범위에서 수행하는 것인, 베타카로틴 생산방법.
    
16. 제9항에 있어서, 상기 베타카로틴 생산방법은 추가로 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 베타카로틴을 회수하는 단계를 포함하는 것인, 베타카로틴 생산방법.

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