CN113490744A - 用于产生生物视黄醇的微生物和使用其产生生物视黄醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产视黄醇微生物，所述微生物中引入了视黄醇生物合成基因；和涉及用于产生视黄醇的方法，所述方法包括培养所述微生物的步骤。本发明的微生物具有改善的产视黄醇能力，并且因此它可以有效地用于产生视黄醇，且基于产生视黄醇的方法，所述方法包括培养微生物的步骤，可以改善视黄醇产生效率。

Description

用于产生生物视黄醇的微生物和使用其产生生物视黄醇的 方法
发明背景
1.技术领域
本发明涉及用于产生生物视黄醇的微生物，其中引入β-胡萝卜素生物合成基因和视黄醇生物合成基因；和产生视黄醇的方法，所述方法包括培养微生物的步骤。
2.相关技术的描述
视黄醇是具有抗皱作用和抗氧化作用的高价值添加原料。具体而言，视黄醇及其衍生物，作为有助改善皮肤皱纹的成分，是提供优异的皱纹改善效能的原料，从而它们构成在食品药品安全部签发的通报中作为功能性化妆品原料所列示的四种成分中的三者。因此，具有上述功能的视黄醇可以用作具有抗皱效果的化妆组合物。
但是，尽管视黄醇有这种效能，不易大量生产视黄醇。产生视黄醇的现有代表性方法是从天然资源提取前体后通过戊二烯→视黄醛→视黄醇的化学反应产生终产物视黄醇及其衍生物。但是，借助这种化学过程的方法具有3,500至4,000美元/kg的生产成本，这造成含视黄醇产品的生产成本增加的问题。因此，为了实现更稳定生产和高产率，需要借助生物工艺的高效的视黄醇生产技术。
本发明人已经作出诸多努力来增加视黄醇生产，并且作为结果，他们开发了能够以高效率更稳定产生视黄醇的微生物，并且通过在多种条件下培养微生物确认视黄醇的产生量增加，由此完成了本发明。当通过本发明的酵母发酵工艺产生视黄醇时，安全性高，原因是使用生态友好型和安全的酵母株。与现有生产技术相比，本发明的酵母发酵工艺还预计改善价格竞争性，因为高效率生产因使用多拷贝质粒进行BMCO表达而成为可能。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种产视黄醇微生物，其中香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)、八氢番茄红素合酶(crtYB)、去饱和酶(crtI)、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO)和视黄醇脱氢酶(ybbO)蛋白质活性增强。
本发明的另一个目的是提供一种产生视黄醇的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物的步骤。
附图简述
图1显示视黄醇的生物合成代谢途径的设计；
图2显示确认crtE(A)基因、crtI(B)基因和crtYB(C)基因整合的SDS-PAGE；
图3显示确认BCMO-SR基因或BCMO-blh基因整合的PCR结果；
图4显示确认整合BCMO-SR或BCMO-blh基因的菌落形成(A)和主菌落形成(B)；
图5显示确认BCMO-SR(A)或BCMO-blh(B)基因整合的SDS-PAGE；
图6显示确认yybO基因整合的PCR结果；
图7显示测量本发明已转化菌株的视黄醛(A)和视黄醇(B)产生量的HPLC/UV色谱分析；
图8显示测量野生型菌株(A)和本发明已转化菌株(B)的视黄醇产生量的ESI-质谱图；
图9显示测量当使用单拷贝质粒和多拷贝质粒引入BMCO基因时视黄醇产生量的HPLC图；和
图10显示当使用单拷贝质粒或多拷贝质粒时视黄醇产生的定量比较结果的图。
优选实施方案详述
为了实现上述目的，本公开的一个方面提供一种产视黄醇微生物，其中香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)、八氢番茄红素合酶(crtYB)、去饱和酶(crtI)、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO)和视黄醇脱氢酶(ybbO)蛋白质活性增强。
另外，本发明提供微生物的用途，其中香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)、八氢番茄红素合酶(crtYB)、去饱和酶(crtI)、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO)和视黄醇脱氢酶(ybbO)蛋白质活性在视黄醇产生中增强。
如本文所用，术语“视黄醇”指一个类型的维生素A，并且视黄醇在维持皮肤表皮细胞的原初功能方面具有重要作用。具体而言，视黄醇是维生素A1的化学名称，其存在于动物的肠粘膜中并且已知在黄绿色植物中大量包含。视黄醇还转化成视黄酸作为活性形式，并且允许DNA在皮肤细胞中存在的细胞核内表达RNA以促进细胞分化，并具有减少皱纹及改善皮肤弹性的效能，原因在于其促进胶原蛋白(其是作为纤维状固体存在于动物细胞之间的纤维状蛋白质)和弹性蛋白(其由弹性纤维组成)的生物合成。如所述，视黄醇已经用作化妆品成分。但是，从天然植物资源提取前体后，视黄醇及其衍生物作为终产物主要通过化学反应产生，并且这种化学生产方法具有纯度低的缺点，原因在于掺杂其他杂质的可能性高，并且其产生量低，从而增加单位生产成本。相反，使用本发明的高效率发酵产生技术所产生的视黄醇可以用作具有如下效果的化妆组合物：预防皮肤老化、改善皮肤弹性和改善皱纹。
如本文所用，术语“香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)”指催化以下反应方案的可逆反应的酶。
[反应方案]
Figure BDA0003186544790000021
如本文所用，术语“八氢番茄红素合酶(crtYB)”，其是参与类胡萝卜素生物合成的酶之一，指催化以下反应方案的可逆反应的酶，并且特别地，它可以指合成八氢番茄红素的酶，但不限于此。
[反应方案]
Figure BDA0003186544790000031
如本文所用，术语“去饱和酶(crtI)”指催化以下反应方案的可逆反应的酶，并且特别地，它可以指合成番茄红素的酶，但不限于此。另外，去饱和酶可以与八氢番茄红素去饱和酶互换地使用。
[反应方案]
Figure BDA0003186544790000032
(1a)
Figure BDA0003186544790000033
(1b)
Figure BDA0003186544790000034
(1c)
Figure BDA0003186544790000035
(1d)
Figure BDA0003186544790000036
如本文所用，术语“β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO)”指催化以下反应方案的酶，并且特别地，它可以指使用氧分子切割β-胡萝卜素以产生两分子视黄醛的酶。β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶还可以加工β-隐黄素，胡萝卜醛、4′-阿卜-β-胡萝卜醛、α-胡萝卜素，和γ-胡萝卜素，并且它也可以与β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶)互换地使用。
[反应方案]
β-胡萝卜素+O2→2全-反-视黄醛
如本文所用，术语“视黄醇脱氢酶(ybbO)”指催化以下反应方案的可逆反应的酶，并且全-反-或顺-视黄醇可以是酶的底物。两种底物(视黄醇和NAD+)可以用来产生三种产物(视黄醛、NADH和H+)。它也可以与微粒体视黄醇脱氢酶、全-反-视黄醇脱氢酶、视黄醛还原酶和视黄素还原酶互换地使用。
[反应方案]
Figure BDA0003186544790000037
香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、去饱和酶、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶和视黄醇脱氢酶的遗传信息可以获自公共数据库，例如，国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank等，但是不限于此。
香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶和去饱和酶可以衍生自红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)，并且β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶和视黄醇脱氢酶可以衍生自盐杆菌属(Halobacterium)物种NRC-1、海洋细菌66A03或埃希氏菌属(Escherichia)物种微生物，但它们不限于其起源或序列，因为取决于微生物物种或微生物，可能存在活性蛋白质的氨基酸序列不同。尤其，视黄醇脱氢酶可以衍生自埃希氏菌属物种微生物，具体地，大肠杆菌(E.coli)，但是不限于此。
具体而言，香叶基香叶基二磷酸合酶可以是包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质；八氢番茄红素合酶可以是包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白质；并且去饱和酶可以是包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的蛋白质。对于β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO-SR可以是包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白质；并且BCMO-blh可以是包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的蛋白质。视黄醇脱氢酶可以是包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的蛋白质。但是，这些酶不限于此。在本发明中，“包含氨基酸序列的蛋白质”可以与“由氨基酸序列组成的蛋白质”互换地使用。
进一步，在本发明中，每种酶可以包含与该氨基酸序列以及上述SEQ ID NO显示80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多同源性的蛋白质，只要它具有与每种酶相同或相对应的生物学活性即可。
进一步，显而易见，在序列的部分中具有缺失、修饰、置换或添加的任何氨基酸序列也可以纳入本公开的范围，只要该氨基酸序列与上述序列具有同源性并且与上述SEQ IDNO的酶蛋白具有基本上相同或相对应的生物学活性即可。
如本文所用，术语“同源性”指与给定氨基酸序列或核苷酸序列匹配的程度，并且同源性可以表示为百分数。在本说明书中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或类似的活性的序列的同源性表示为“同源性％”。可以通过例如计算如评分、同一性、相似性等参数的标准软件，具体地BLAST2.0、或通过在DNA印迹杂交实验中在定义的严格条件下比较序列，确定序列的同源性，并且定义适当的杂交条件属于现有技术范围，并且可以使用本领域技术人员熟知的方法确定(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。术语“严格条件”指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。例如，文献中详细公开了这类条件(例如，J.Sambrook等人，上文)。
本发明的香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、去饱和酶、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶和视黄醇脱氢酶每者可以包括编码上述SEQ ID NO的氨基酸序列的多核苷酸，或与该序列显示80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多同源性的蛋白质，只要它具有与每种酶相同或相对应的生物学活性即可。具体而言，编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)的基因可以包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列；编码八氢番茄红素合酶的基因(crtYB)可以包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码去饱和酶的基因(crtI)可以包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列；对于编码β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(BCMO)的基因，BCMO-SR基因可以包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列；并且BCMO-blh基因可以包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列；并且编码视黄醇脱氢酶的基因可以包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
另外，编码酶的每个多核苷酸可以在编码区中经历各种修饰，而不改变从编码区表达的蛋白质的氨基酸序列，原因在于密码子简并性或鉴于其中蛋白质待表达的生物中优选的密码子。因此，每个多核苷酸可以包括任何多核苷酸序列而无限制，只要它编码每种酶蛋白即可。
另外，可以不限制地纳入可以从已知基因序列制备的探针，例如，在严格条件下与互补于该多核苷酸序列全部或部分的序列杂交的任何多核苷酸序列，以编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、去饱和酶、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶或视黄醇脱氢酶的活性的蛋白质。
“严格条件”指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。文献中详细公开了这类条件(例如，J.Sambrook等人，上文)。例如，严格条件可以包括这样的条件，在所述条件下具有高同源性的基因、具有40％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、甚至更具体地97％或更多和特别具体地99％或更多同源性的基因彼此杂交，而同源性低于上述同源性的基因彼此不杂交；或可以包括DNA印迹杂交的普通洗涤条件，即，在对应于60℃、1ХSSC、0.1％SDS；具体地60℃、0.1ХSSC、0.1％SDS；和更具体地68℃、0.1ХSSC、0.1％SDS的盐浓度和温度洗涤一次、具体地两次或三次。
杂交要求两个多核苷酸具有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间可能错配。术语“互补”用来描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段以及基本上与之相似的多核苷酸序列。
具体而言，使用杂交条件可以检测到具有同源性的多核苷酸，所述杂交条件包括在Tm值55℃处上述条件下的杂交步骤。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但是不限于此，并且可以由本领域技术人员根据其目的适当地控制。
用于使多核苷酸杂交的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补性程度，并且这些变量是本领域熟知的(参见Sambrook等人，上文，9.50–9.51、11.7–11.8)。
如本文所用，术语“活性增强”意指引入酶蛋白的活性，或与微生物的内源活性或修饰前活性相比，活性增加。“引入”活性意指天然地或人工地显示最初并非为微生物拥有的特定蛋白质的活性。具体而言，酶蛋白活性增强的微生物指与天然野生型微生物或非转化微生物相比，酶蛋白的活性增强的微生物。活性增强可以包括例如通过引入外来香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、去饱和酶、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶和/或视黄醇脱氢酶增强；或增强内源香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、去饱和酶、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶、和/或视黄醇脱氢酶的活性，并且具体地，本发明中增强活性的方法可以例如通过以下方式进行
1)增加编码每种酶的多核苷酸的拷贝数的方法，
2)修饰表达调节序列以增加每种多核苷酸的表达的方法，
3)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强每种酶的活性的方法，或
4)所述方法的组合，但方法不限于此。
1)增加多核苷酸的拷贝数的方法可以按多核苷酸与载体有效连接的形式进行，但不具体地限于此；或通过使多核苷酸整合入宿主细胞的染色体中进行。另外，可以通过向宿主细胞引入显示酶之活性的外来多核苷酸或通过对多核苷酸进行密码子优化所获得的多核苷酸的变体，实施拷贝数增加。可以使用外来多核苷酸，而不限于在其起点或序列中，只要它显示出与该酶相同/相似的活性。可以使用本领域技术人员适当选择的已知转化方法进行引入。当引入的多核苷酸在宿主细胞中表达时，产生酶，并且因此其活性可以增加。
其次，2)可以通过以下方式进行修饰表达调节序列以增加每个多核苷酸表达的方法，但不具体地限于此：借助缺失、插入、非保守性或保守性置换或其任意组合在核苷酸序列中诱导变异，从而进一步增强表达调节序列的活性，或用具有更强活性的核苷酸序列替换该序列。表达调节序列可以包括，但不具体地限于启动子、操纵基因序列、编码核糖体-结合位点的序列、调节转录和翻译终止的序列等。
具体地，可以在多核苷酸表达单元上游连接异源性强启动子，取代原始启动子，并且强启动子的例子可以包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等。更具体地，有效连接hxpr2启动子或UAS1B启动子以改进编码每种酶的多核苷酸的表达率，但不限于此。
另外，3)可以通过以下方式进行在染色体上修饰多核苷酸序列的方法，但不具体地限于此：通过缺失、插入、非保守性或保守性置换或其任意组合在表达调节序列中诱导变异，以进一步增强多核苷酸序列的活性，或用经修饰以具有更强活性的多核苷酸序列替换该序列。
最后，4)可以通过组合以下方法中一者或多者，进行通过1)至3)的任何组合增强活性的方法：增加编码每种酶的多核苷酸的拷贝数的方法、修饰表达调节序列以增加其表达的方法和在染色体上修饰多核苷酸序列的方法和修饰具有酶的活性的外来多核苷酸或其密码子优化的变体多核苷酸的方法。
在多核苷酸指能够实施诸功能的多核苷酸集合物的情况下，可以将其描述为基因。在本公开中，多核苷酸和基因可以互换地使用，并且多核苷酸序列和核苷酸序列可以互换地使用。
如本文所用，术语“载体”指含有编码靶蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，所述多核苷酸序列与合适的调节序列有效连接，从而能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白。调节序列可以包括能够启动转录的启动子、任何调节转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和调节转录与翻译终止的序列等。一旦转化入适当的宿主细胞，载体即可以独立于宿主基因组地复制或发挥作用，或可以整合入其基因组中。
不具体地限制本公开中所用的载体，只要它可以在宿主细胞中复制即可。可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的例子可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和细菌噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以作为噬菌体载体或粘粒载体使用。基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL、基于pET的载体等可以作为质粒载体使用。具体而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pSKH、pRS-413、pRS-414、pRS-415、pBCA或pYLI载体等，但是载体不限于此。
不具体地限制在本发明中适用的载体，并且可以使用已知的表达载体。另外，可以通过用于染色体插入的载体，使编码靶蛋白的多核苷酸整合入染色体。可以使用本领域已知的任何方法，例如，通过同源重组，但不限于此，使多核苷酸整合入染色体。可以进一步包括用于确认整合入染色体的选择标记，或可以移除与之相关的基因。选择标记用于选择经载体转化的细胞，即，旨在确认是否已经插入靶核酸分子，并且可以使用提供可选择表型如耐药性、营养缺陷型、细胞毒药物抗性或表面蛋白表达的标记。仅表达选择标记的细胞才能够在用选择剂处理的环境下幸存或表达其他表型性状，并且因此可以选定转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”意指以如此方式向宿主细胞引入包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体，从而在宿主细胞中表达多核苷酸编码的蛋白质。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，它就可以整合入并且位于宿主细胞的染色体中或以染色体外方式存在，或它可以处于任何此类情形中。另外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要可以将它引入宿主细胞并且在其中表达。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包含为自主表达所需的全部元件的基因构建体。表达盒可以常见地包括与多核苷酸有效连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以处于能够自我复制的表达载体形式。另外，可以将多核苷酸引入宿主细胞，其中将多核苷酸与为其在宿主细胞中表达所需的序列有效连接，但是不限于此。转化方法包括向细胞中引入核酸的任何方法，并且可以根据宿主细胞，通过选择本领域已知的合适的标准技术来进行。例如，可以借助电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法，氯化钙(CaCl2)沉淀法，微量注射法、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE–葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、乙酸锂–DMSO技术等实施转化，但是方法不限于此。
另外，术语“有效地连接”意指在启动并介导编码本公开靶蛋白的多核苷酸转录的启动子序列和多核苷酸序列之间的功能性连接。可以使用本领域已知的遗传重组技术制备有效的连接，并且可以使用本领域已知的酶，如限制性酶、连接酶等，但是不限于此，进行位点特异性DNA剪切和连接。
本发明的微生物可以是其中使Ku70或Ku80蛋白质活性失活或使URA3基因的活性失活的微生物。
如本文所用，术语“Ku70”或“Ku80”指Ku蛋白质，并且Ku70和Ku80形成Ku异二聚体，后者与DNA双链断口的末端结合并且借助非同源末端接合(NHEJ)参与DNA修复。在本发明中，为了增加视黄醇生物合成基因同源重组的效率，使用缺失具有抑制随机插入功能的Ku70/Ku80基因之一的微生物。
如本文所用，术语“URA3基因”指编码酵母的嘧啶合成途径中乳清苷5′-磷酸脱羧酶(ODCase)的基因。另外，URA3+酵母特征在于它可以在未添加尿嘧啶或尿苷的培养基中增殖，但它不在含有嘧啶类似物5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基中增殖。通过利用上述特征，可以使用URA3基因作为阳性或阴性标记。
根据本发明的一个示例性实施方案，为了检查是否引入了视黄醇生物合成基因，制备URA3基因缺失酵母。使用引入视黄醇生物合成基因时一并引入URA3基因的方法在未添加尿嘧啶或尿苷的培养基中选择其中引入视黄醇生物合成基因的菌株(实施例1-1)。
如本文所用，术语“失活”指这样的情形，其中如与其内源活性或修饰前活性相比，微生物最初拥有的酶蛋白的活性削弱；其中蛋白质根本不表达的情形；或其中蛋白质表达但显示无活性的情形。失活是包括以下情形的概念：如与微生物最初拥有的酶活性相比，酶本身的活性削弱或消除，原因在于编码酶等的多核苷酸中的修饰；如与野生型微生物相比，细胞内部酶总体活性水平降低或消除，原因在于抑制编码酶的基因表达或抑制翻译等；编码酶的基因的部分或整体被缺失；及它们的组合，但是不限于此。换言之，酶蛋白活性失活的微生物指这样的微生物，其中与天然野生型微生物或未修饰的微生物相比，酶蛋白的活性降低或消除。
可以通过本领域熟知的多种方法实现酶活性的失活。方法实例包括1)缺失在染色体上编码酶的基因的部分或整体的方法；2)如此修饰表达调节序列，从而减少在染色体上编码蛋白质的基因表达的方法；3)如此修饰染色体上编码蛋白质的基因序列，从而消除或削弱蛋白质的活性的方法；4)引入与染色体上编码蛋白质的基因的转录物互补性结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法；5)在染色体上编码蛋白质的基因的Shine–Dalgarno序列上游添加与Shine–Dalgarno序列互补的序列以形成二级结构，因而使得核糖体不可能结合的方法；和6)逆转录工程化(RTE)方法，所述方法向编码蛋白质的多核苷酸序列的可读框(ORF)的3′-端添加待逆转录的启动子，或它们的组合，但不特别地限于此。
缺失在染色体上编码酶的基因的部分或整体的方法可以通过用于染色体插入微生物中的载体，将染色体内部编码内源靶蛋白的多核苷酸替换为具有部分缺失的核酸序列的多核苷酸或标记基因来进行。作为缺失多核苷酸部分或整体的方法的实例，可以使用一种通过同源重组缺失多核苷酸的方法，但是不限于此。
可以通过以下方式进行修饰表达调节序列的方法：借助缺失、插入、非保守性或保守性置换或其任意组合在表达调节序列中诱导修饰，从而进一步削弱表达调节序列的活性；或用具有更弱活性的核酸序列替换该序列。表达调节序列可以包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列、和调节转录与翻译终止的序列，但是不限于此。
可以通过以下方式进行修饰染色体上基因序列的方法：借助缺失、插入、非保守性或保守性置换或其任意组合在基因序列中诱导修饰，从而进一步削弱酶的活性；或用经修饰以具有更弱活性的基因序列或经修饰以根本没有活性的基因序列替换该序列，但是不限于此。
如本文所用，术语“部分”，虽然它可能根据多核苷酸的种类变动，但可以具体地指1至300个核苷酸、更具体地1至100个核苷酸和甚至更具体地1至50个核苷酸，但是不特别地限于此。
产视黄醇微生物可以是其中香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)、八氢番茄红素合酶(crtYB)和去饱和酶(crtI)蛋白质活性增强的微生物，并且可以是能够产生β-胡萝卜素并且通过进一步增强β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶和视黄醇脱氢酶蛋白质活性，具有更加改善的产视黄醇能力的微生物。
不限制本发明的微生物，只要它是具有产生视黄醇的能力的微生物，并且具体地，微生物可以是解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
本发明的另一个方面提供一种产生视黄醇的方法，所述方法包括在培养基中培养本发明微生物的步骤。
“微生物”和“视黄醇”与上文所述相同。
如本文所用，术语“培养”指在适当控制的环境下培育微生物。可以根据本领域已知的适宜培养基和培养条件实现本发明的培养方法。可以由本领域技术人员根据待选择的微生物针对用途容易地调节培养过程。尽管不具体地对其限制，可以通过已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等执行培养微生物的步骤。不具体地限制用于培养本公开微生物的培养基和其他培养条件，但是可以使用常用于培养微生物的任何培养基。具体而言，可以在常见的培养基中在有氧条件下，同时控制温度、pH等培养本公开的微生物，所述常见的培养基含有合适的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等。
可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)，调节培养步骤中的pH，并且具体地，pH可以是5.5至7.5、5.5至7.0、6.0至7.5、6.0至7.0、6.5至7.5、或6.5至7.0，并且更具体地，培养步骤中的pH可以是6.9，但是不限于此。
另外，可以将氧或含氧气体注入培养物，以维持培养物的有氧状态；或可以不注入气体，或可以注入氮气、氢气、或二氧化碳气体以维持缺氧或微有氧状态。培养步骤中的通气速率可以是0.2vvm至1.5vvm、0.2vvm至1.3vvm、0.2vvm至1.1vvm、0.5vvm至1.5vvm、0.5vvm至1.3vvm、0.5vvm至1.1vvm、0.8vvm至1.5vvm、0.8vvm至1.3vvm、0.8vvm至1.1vvm，并且更具体地，培养步骤中的通气速率可以是0.9vvm，但是不限于此。
另外，可以将培养温度保持在20℃至45℃、或25℃至40℃、具体地在27℃至31℃、28℃至31℃、29℃至31℃或30℃至31℃，并且更具体地在30.2℃，但是不限于此。
另外，培养步骤中的反应器运行rpm可以是50转/分钟至300转/分钟，50转/分钟至250转/分钟，100转/分钟至300转/分钟，100转/分钟至250转/分钟，150转/分钟至300转/分钟，150转/分钟至250转/分钟，200转/分钟至300转/分钟，或200转/分钟至250转/分钟，并且更具体地249.9转/分钟，但是不限于此。
如本文所用，术语“培养基”指培养本发明微生物的培养物基质和/或培养微生物后所获得的产物。培养基是这样的概念，其包括含有微生物的形式和其中通过离心、过滤等从含有微生物的培养液取出微生物的形式。
在用于培养本发明产视黄醇微生物的培养基中，作为碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等可以单独或组合地使用，但是碳源不限于此。作为氮源，含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可以单独或组合地使用，但是氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等可以单独或组合地使用，但是磷源不限于此。另外，必需的生长促进材料如其他金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等可以纳入培养基中。
用于培养本发明产视黄醇微生物的培养基可以包含一种或多种选自酵母提取物、蛋白胨、大豆和葡萄糖的养分。
基于总计100重量份的培养基，酵母提取物可以在用于本发明产视黄醇微生物的培养基中按适宜的量纳入，具体地按1重量份至4重量份、1.5重量份至4重量份、2重量份至4重量份、2.5重量份至4重量份、1重量份至3.5重量份、1.5重量份至3.5重量份、2重量份至3.5重量份、或2.5重量份至3.5重量份并且更具体地按3重量份的量纳入，但是不限于此。
基于总计100重量份的培养基，蛋白胨可以在用于本发明产视黄醇微生物的培养基中按适宜的量纳入，具体地按0.5重量份至4重量份、1重量份至4重量份、1.5重量份至4重量份、2重量份至4重量份、2.5重量份至4重量份、0.5重量份至4重量份、1重量份至3.5重量份、1.5重量份至3.5重量份、2重量份至3.5重量份、或2.5重量份至3.5重量份并且更具体地按3重量份的量纳入，但是不限于此。
基于总计100重量份的培养基，大豆可以在用于本发明产视黄醇微生物的培养基中按适宜的量纳入，具体地按0.5重量份至4重量份、1重量份至4重量份、1.5重量份至4重量份、2重量份至4重量份、2.5重量份至4重量份、0.5重量份至4重量份、1重量份至3.5重量份、1.5重量份至3.5重量份、2重量份至3.5重量份、或2.5重量份至3.5重量份并且更具体地按3重量份的量纳入，但是不限于此。
另外，基于总计100重量份的培养基，葡萄糖可以在用于本发明产视黄醇微生物的培养基中按适宜的量纳入，具体地按1重量份至3重量份、1重量份至2.5重量份、1.5重量份至3重量份、或1.5重量份至2.5重量份并且更具体地按2重量份的量纳入，但是不限于此。
由培养物产生的视黄醇可以分泌入培养基或可以留在细胞中。
另外，产生视黄醇的本发明方法可以是使用微生物的多拷贝质粒的方法。具体而言，在一个示例性实施方案中，确认与单拷贝质粒转化的菌株相比，经多拷贝质粒转化的菌株中视黄醇产生增加约3倍(实施例3-2)。
另外，产生视黄醇的本发明方法可以进一步包括从培养的微生物或培养基回收视黄醇的步骤。在回收于本发明培养步骤中产生的视黄醇的步骤中，可以根据培养方法，使用本领域已知的适当方法从产视黄醇微生物及其培养液收集目的视黄醇。例如，可以使用冻干、离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养的微生物或培养基回收目的视黄醇。回收视黄醇的步骤可以进一步包括分离方法和/或纯化步骤。
下文将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于示意目的，并且本发明的范围不意在受这些实施例限制。
实施例1：选择产视黄醇菌株和通过密码子优化进行基因合成
实施例1-1：制备产生视黄醇的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)平台菌株
选择酿酒酵母作为产视黄醇菌株，其是重组蛋白生产中广泛使用的酵母株。
接下来，为了制备产视黄醇菌株，需要在酿酒酵母菌株基因组中的高效率基因操作，并且为此目的，需要建立能够反复整合或移除基因组中特定基因群的高效率基因操纵系统和能够以高效率在基因组内部进行已整合基因的同源重组的系统。因此，制备了其中建立有以上系统的酿酒酵母平台菌株。
详细地，为了增加同源重组效率，应当移除具有抑制随机插入功能的Ku70/Ku80基因之一，并且为了使用URA3作为营养缺陷型选择标记以确认外来基因整合，应当移除基因组中的URA3基因。因此，制备了其中移除URA3和Ku70的产生视黄醇的酿酒酵母平台菌株。这个菌株用于以下实验中。
实施例1-2：定制的高效率产视黄醇代谢途径的酿酒酵母设计和基因合成
如图1中确认，设计了从GGPP产生至视黄醇产生(GGPP→八氢番茄红素→链孢红素→番茄红素→β-胡萝卜素→视黄醛→视黄醇)的代谢途径。
详细地，将编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶)、八氢番茄红素合酶和去饱和酶的核苷酸序列(分别是crtE、crtI和crtYB)(其是红法夫酵母衍生的β-胡萝卜素生物合成基因)针对酿酒酵母进行密码子优化，并且随后合成每个基因；将编码β-胡萝卜素15,15’-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15’-单加氧酶)的核苷酸序列(BMCO-blh或BMCO-SR)(其是盐杆菌属物种NRC-1-或海洋细菌66A03衍生的视黄醛生物合成基因)针对酿酒酵母进行密码子优化，并且随后合成每个基因；并且将编码视黄醇脱氢酶的核苷酸序列(ybbO)(其是视黄醇生物合成基因)针对酿酒酵母进行密码子优化，并且随后合成该基因。
编码crtE、crtYB、crtI、BMCO-blh、BMCO-SR和ybbO的核苷酸序列分别由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6代表。
实施例2：制备产视黄醇菌株
实施例2-1：制备用于产视黄醇酿酒酵母的表达载体
为了在产生视黄醇的酿酒酵母平台菌株中稳定表达实施例1-2中合成的crtE、crtI、crtYB、BMCO-blh、BMCO-SR和ybbO基因核苷酸序列，制备了其中包含GPD启动子和CYC1终止子的表达载体并且应用了供载体系统重复使用的ura标记系统。
详细地，将实施例1-2中合成的编码crtE、crtI、crtYB、BMCO-blh、BMCO-SR和ybbO基因的核苷酸序列插入表达载体，在该表达载体中，分别引入GPD启动子、CYC1终止子和URABlaster盒，在多克隆位点中使用EcRI和XhoI限制性酶。分别制备向其中插入每个基因序列的pBCA_crtE、pBCA_crtI、pBCA_crtYB、pRET_BMCOO-blh、pRET_BMCOO-SR和pRET_ybbO载体。
实施例2-2：视黄醇前体生物合成基因的整合
作为酿酒酵母基因组中的整合位点，选择已知移除时增加甲羟戊酸(其是视黄醇的前体)产生的YPL062w基因和参与法呢基焦磷酸(FPP)消耗的产生法呢醇的LPP1基因和DPP1基因，以增加视黄醇前体的供应。
详细地，用实施例2-1中制备的pBCA_crtE载体转化实施例1-1中制备的产生视黄醇的酿酒酵母平台菌株，并且随后通过菌落PCR检查crtE基因是否整合在菌株中的正确位点(图2A)。当crtE基因整合在正确位点时，观察到条带4,000bp，如图3A的泳道1、5、8和10中那样。通过ura弹出法(pop-out)，从其中确认整合的菌株去除ura标记，并且随后用于后续的crtI基因整合中。
以上方法用来依次整合crtI基因和crtYB基因，并且检查基因整合情况(图2B和图2C)。当crtI基因整合在正确位点时，条带出现在4,000bp左右，如图2B的泳道11和12中那样。当crtYB基因整合在正确位点时，条带出现在6,000bp左右，如图2C的泳道1、2、5、9和10中那样。如所述那样，制备这样的菌株，其中作为视黄醇前体的β-胡萝卜素的生物合成基因—crtE、crtI和crtYB基因整合。在以下实验中，使用菌株(酿酒酵母CEN.PK2-1DΔleu2::PTEF1-ERG20Δhis3::PCCW12-tHMG1Δlpp1::PGPD-crtEΔdpp1::PGPD-crtIΔypl062w::PGPD-crtYB)作为制备产视黄醇菌株的基本菌株。
实施例2-3：视黄醇生物合成基因的整合
用实施例2-1中制备的pBCA-BCMO载体转化实施例2-2中制备的其中整合有视黄醇前体生物合成基因的酿酒酵母菌株，并且随后通过PCR和菌落形成法检查BMCO-blh或BMCO-SR基因各自是否整合在菌株中的正确位点(图3和图4)。
详细地，将pBCA-BCMO载体和pUC-3Myc URA3-PGPD载体用EcoRI/XhoI限制性酶处理以消化BCMO，随后在1％琼脂糖凝胶上电泳。纯化消化的BCMO，并将纯化的BCMO与使用EcoRI/XhoI限制性酶处理的pUC-3Myc URA3-PGPD载体连接，以制备pUC-3Myc URA3-PGPD-BCMO载体。使用EcoRI/XhoI限制性酶再次消化BCMO。此后，使用针对整合盒的引物，使BCMO基因整合入YPRCτ3基因位点，所述引物由下表1中的核苷酸序列组成。
[表1]
Figure BDA0003186544790000141
作为结果，如图3中所示，PCR结果确认，制备了用于PGPD-BCMO URA3整合的载体，其中BCMO-SR或BCMO-blh基因整合。
随后，如图4A和图4B中所示，通过菌落形成和主菌落采集法确认，BMCO-blh或BMCO-SR基因由制备的整合盒成功地转化入酿酒酵母YPRCτ3基因位点。随后，如图4C和图4D中所示，进行整合BCMO的主菌落的PCR，并且作为结果，当BCMO-SR基因整合时，条带出现在5,124bp左右，如泳道21中那样，并且当BCMO-blh基因整合时，条带出现在5,124bp左右，如泳道11和14中那样。如所述那样，制备引入BCMO基因的菌株。
最后，为制备产视黄醇菌株，制备了产视黄醇菌株，其中将编码视黄醇脱氢酶的ybbO基因引入制备的菌株。
详细地，按照与引入BCMO基因的方法相同的方式，制备用于pUC57-3Myc URA3-PGPD-ybbO整合的载体。此后，使用针对整合盒的引物，使ybbO基因整合入YPRCdelta15基因位点，所述引物由下表2中的核苷酸序列组成。
[表2]
Figure BDA0003186544790000142
作为结果，如图5中所示，进行整合ybbO的主菌落的PCR，并且作为结果，当ybbO基因整合时，条带出现在3,600bp左右，如泳道11中那样。最后，制备了其中crtE、crtYB、crtI、BMCO-blh、BMCO-SR和ybbO基因整合的产视黄醇菌株。
实施例3：检查产视黄醇菌株的视黄醇产生
实施例3-1：检查产视黄醇菌株的视黄醇产生
为了检查产视黄醇菌株的视黄醇产生情况，进行HPLC/UV色谱和ESI-质谱法。详细地，使用分析性量表(尺度：300mm×4mm)进行色谱分析。ODS C18保护柱(4mm×3mm)在运行栏之前。色谱条件如下：流动相A：乙腈/H2O/冰醋酸＝90/10/2；流动相B：乙腈/甲醇＝90/10；流动相C：100％THF。全部流动相均在使用前用0.45μm孔径的尼龙膜滤器过滤。历经26分钟的总运行时间，以下梯度程序以恒定流速(1ml/分钟)和恒定柱温(22℃)应用：0–4.5分钟100％A；4.5–6.5分钟100％B；6.5–12分钟60％B，40％C；12–15分钟60％B，40％C；15–20分钟100％B；20–26分钟100％A。
作为结果，如图6中所示，观察到通过培养产视黄醇菌株所形成的菌落的视黄醛产生峰和视黄醇产生峰。详细地，作为HPLC/UV色谱(325nm)的结果，在10.47分钟观察到视黄醛产生峰(图6A)，并且在10.97分钟观察到视黄醇产生峰。另外，如图7中所示，不同于CEN.PK野生型菌株(图7A)，本发明的产视黄醇菌株在303.2318m/z显示视黄醇产生峰(图7B)。
这些结果表明，在实施例2中制备的产视黄醇菌株能够产生视黄醇。
实施例3-2：通过多拷贝质粒检查增加视黄醇产生的效果
当培养多拷贝质粒转化的菌株时，检查产视黄醇菌株增加视黄醇产生的效果。
详细地，如图8中所示，通过使用pUC57载体引入单拷贝BCMO-SR基因而培养菌株时，它产生169.16μg/L视黄醇。相反，通过使用p426载体引入多拷贝BCMO-SR基因而培养菌株时，它产生491.09μg/L视黄醇。即，与单拷贝转化的菌株相比，多拷贝转化的菌株显示视黄醇产生增加约3倍。这些结果表明，当培养多拷贝质粒转化的微生物时，视黄醇产生可以明显地增加。
本说明书中将省略可以为本领域技术人员充分认知和推断的内容描述。除本说明书中描述的具体示例性实施方案之外，可以在不改变本发明技术精神或实质布局的情况下作出更多样的修改。因此，本发明可以按不同于本说明书具体描述和阐述的方式实施，这可以为本领域技术人员所理解。
发明效果
本发明的微生物可以具有改进的产视黄醇能力，并且因此它可以高效地用于产生视黄醇。基于产生视黄醇的方法，所述方法包括培养微生物的步骤，可以改善视黄醇产生效率。
Figure IDA0003186544850000011
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Figure IDA0003186544850000131

Claims (8)

1.用于产生视黄醇的微生物，其中香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)、八氢番茄红素合酶(crtYB)、去饱和酶(crtI)、β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO)和视黄醇脱氢酶(ybbO)蛋白质活性增强。
2.根据权利要求1所述的用于产生视黄醇的微生物，其中香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)、八氢番茄红素合酶(crtYB)和去饱和酶(crtI)衍生自红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)。
3.根据权利要求1所述的用于产生视黄醇的微生物，其中β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO)和视黄醇脱氢酶(ybbO)衍生自盐杆菌属(Halobacterium)物种NRC-1、海洋细菌66A03或埃希氏菌属(Escherichia)物种微生物。
4.根据权利要求1所述的用于产生视黄醇的微生物，其中香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)的基因包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；八氢番茄红素合酶(crtYB)的基因包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；去饱和酶(crtI)的基因包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列；β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶(β-胡萝卜素15,15′-单加氧酶，BCMO)的基因包含SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列；和视黄醇脱氢酶(ybbO)的基因包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的用于产生视黄醇的微生物，其中所述微生物是解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
6.产生视黄醇的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求1至5中任一项所述的微生物的步骤。
7.根据权利要求6所述的产生视黄醇的方法，其中培养基包含一种或多种选自酵母提取物、蛋白胨、大豆和葡萄糖的养分。
8.根据权利要求6所述的产生视黄醇的方法，还包括从培养的微生物或培养基回收视黄醇的步骤。
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