CN113994002A

CN113994002A - 新型启动子及其用途

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Publication number: CN113994002A
Application number: CN202180002100.6A
Authority: CN
Inventors: 权娜罗; 李翰衡; 金惠美; 朴素静; 金柄秀
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113994002B; EP4105332A1; EP4105332A4

Abstract

提供了一种新型启动子以及使用其生产目标材料的方法。更具体地，提供了具有启动子活性的新型多核苷酸，各自包含该多核苷酸的基因表达盒和宿主细胞，以及使用微生物生产目标材料的方法。

Description

新型启动子及其用途

技术领域

本公开涉及一种新型启动子和使用其生产目标材料的方法。更具体地，本公开涉及具有启动子活性的新型多核苷酸，各自包含该多核苷酸的载体和宿主细胞，以及使用微生物生产目标材料的方法。

背景技术

L-氨基酸是蛋白质的基本结构单元，并用作医药原料、食品添加剂、动物饲料、营养品、农药、杀菌剂等的重要原料。在L-氨基酸中，L-赖氨酸是必需氨基酸，在生物体内不进行生物合成，并已知是促进生长、钙代谢、促进胃液分泌和抵抗疾病所必需的。L-赖氨酸广泛用于饲料、医药品、食品等。L-色氨酸也是人体必需氨基酸之一，用于饲料添加剂、输液剂、医药原料、保健食品原料等。

生产氨基酸的常用方法主要包括使用微生物如短杆菌或棒状杆菌的发酵方法(Amino Acid Fermentation,Gakkai Shuppan Center:195–215,1986)，除了大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉属、Klebsiella、Erwinia、Pantoea等(美国专利号3,220,929和6,682,912)，也包括通过合成的工业方法，如单氯乙酸酯法、Strecker法等。

此外，已经进行了许多关于氨基酸的有效生产的研究，例如，努力开发具有高氨基酸生产效率的微生物或发酵技术。具体地，已经开发出目标材料特异性方法来在棒状杆菌属菌株中增加编码氨基酸生物合成中所涉及酶的基因的表达或去除氨基酸生物合成中不必要的基因(韩国专利号10-0924065和1208480)。除了这些方法之外，还使用删除不参与氨基酸生产的基因的方法和删除在氨基酸生产中的特定功能未知的基因的方法。然而，仍然需要研究能够以高产率高效生产L-氨基酸的方法。

鉴于此技术背景，本发明人开发了一种具有启动子活性的新型多核苷酸，其能够在棒状杆菌属微生物中以高产率生产目标材料，并且他们发现当将该多核苷酸引入微生物中时，可以提高目标材料的生产率，从而完成了本公开。

本发明人为制备具有启动子活性的新型多核苷酸进行了大量努力，结果发现当靶基因启动子通过碱基取代改良时，改良后的启动子能够调控与其可操作连接的基因的表达，从而完成了本公开。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的位置178处的核苷酸被C取代。

本公开的另一目的是提供一种包含所述多核苷酸和靶基因的基因表达盒。

本公开的又一目的是提供一种包含所述多核苷酸或所述基因表达盒的宿主细胞。

本公开的又一目的是提供一种生产目标材料的方法，该方法包括在培养基中培养所述宿主细胞；并从所述培养基中回收目标材料的步骤。

本发明的又一目的是提供一种多核苷酸作为启动子的用途，其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的位置178处的核苷酸被另一个核苷酸取代。

具体实施方式

下面将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式也可应用于其他描述和实施方式。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下描述的具体描述的限制。

此外，本领域技术人员将认识到或将能够仅使用常规实验来确定本文描述的本公开的特定实施方式的许多等价物。此外，这些等价物应被解释为落入本公开的范围内。

为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的位置178处的核苷酸被C取代。

如本文所用，术语“SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列”可以指NCgl0859基因的启动子序列的一部分。

在这点上，术语“NCgl0859基因”是指固有地存在于棒状杆菌属微生物中的基因或编码功能未知的假设蛋白质的基因。

对应于SEQ ID NO：1的序列可以来源于棒状杆菌(Corynebacterium sp.)，特别是来源于谷氨酸棒状杆菌的序列。然而，具有活性等同于或大于该多核苷酸活性的序列可以包括在本公开的启动子中而不受限制。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指其中核苷酸单体共价结合成长链的核苷酸聚合物，是指具有预定长度或更长的DNA链。

如本文所用，术语“启动子”是指编码区上游的非翻译核苷酸序列，其包括聚合酶的结合位点并具有启动启动子靶基因转录成mRNA的活性，即与聚合酶结合的DNA结构域，以启动基因的转录。启动子可以位于mRNA转录起始结构域的5'结构域。

如本文所用，术语“具有启动子活性的多核苷酸”是指包含RNA聚合酶或增强子等的结合位点的DNA区域，用于表达与其下游可操作连接的基因，即靶基因，并且存在于靠近目的基因的转录位点。就本发明的目的而言，该多核苷酸可作为通用启动子，与细胞中现有的启动子或内源性启动子相比，该多核苷酸可调控(例如增加或减少)与其可操作连接的靶基因的表达以及由靶基因编码的蛋白质的产生和/或活性，并且它可以调节(例如增加或减少)蛋白质生产中涉及的目标产物(生物活性材料，例如选自氨基酸、核酸、维生素、蛋白质、脂肪酸、有机酸等中的一种或多种)的产生和/或活性，但不限于此。

本公开的多核苷酸可以包括任何多核苷酸序列而不受限制，只要其具有启动子活性即可。

在一个实施方式中，本发明的具有启动子活性的多核苷酸可以包括具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸被另一个核苷酸取代。具体地，多核苷酸可以由具有启动子活性的多核苷酸组成，其中SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸被另一个核苷酸取代。具有启动子活性的多核苷酸在本公开中可以与“变体启动子”互换使用，并且在本公开中可以使用所有上述术语。

例如，具有启动子活性的多核苷酸可以是具有现有启动子活性的多核苷酸序列的特定位置处的核苷酸被取代，从而减弱或增强启动子活性的多核苷酸。

在一个实施方式中，变体启动子可以是其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的位置178处的核苷酸被另一个核苷酸取代的启动子。

对“其他核苷酸”没有限制，只要它是与取代前的核苷酸不同的核苷酸即可。例如，当描述“SEQ ID NO：1的位置178处的核苷酸被另一个核苷酸取代”时，表示该核苷酸被除了胸腺嘧啶(T)之外的腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)取代。此外，除非另有说明，当核苷酸在本公开中被描述为“取代”时，意味着该核苷酸被与取代之前的核苷酸不同的核苷酸取代。

同时，本领域技术人员可以通过本领域已知的序列比对，在任意多核苷酸序列中识别出与本发明的SEQ ID NO：1的位置178对应的位置处的核苷酸。除非本公开中另有说明，当描述“特定SEQ ID NO的特定位置处的核苷酸”时，显然该核苷酸还包括任何多核苷酸序列中的“相应位置处的核苷酸”。因此，其中选自由与SEQ ID NO：1的多核苷酸序列的位置178对应的位置处的核苷酸组成的组中的任何一个或多个核苷酸被任何具有启动子活性的多核苷酸序列中的另一个核苷酸取代的多核苷酸序列也包括在本公开的范围内。

本公开的多核苷酸可为其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、即NCgl0859基因的启动子序列被改变的多核苷酸。具体地，改变可以是用另一个核苷酸替换序列的位置178处的核苷酸。具体地，可以是SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的位置178处的核苷酸被C取代。

与没有改变的多核苷酸相比，多核苷酸可能具有改变(增加或减少)的启动子活性。因此，可调节(增加或减少)与多核苷酸可操作连接的靶基因的表达和靶基因编码的蛋白质的活性，此外，可调节除靶基因之外的基因的表达。

例如，当SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的位置178处的核苷酸被另一个核苷酸取代时，可以提供具有比未取代(未改变)启动子序列更弱或更强的活性的启动子。

此外，多核苷酸可以是参与增加目标材料、特别是L-氨基酸、更特别是L-赖氨酸的产率或产量的多核苷酸。

本发明人首次研究了通过改变NCgl0859基因的启动子来增加L-氨基酸，更特别是L-赖氨酸的产量的效果。

如本文所用，作为碱性α-氨基酸之一的“L-赖氨酸”是未在体内合成的必需氨基酸。L-赖氨酸可应用于但不限于各种产品，如饲料或饲料添加剂，或食品、食品添加剂、医药产品等。

在一个实施方式中，本发明的具有启动子活性的多核苷酸可以包含SEQ ID NO：2的多核苷酸序列。具体地，该多核苷酸可以基本上由或可以由SEQ ID NO：2的多核苷酸序列组成，但不仅限于此。

此外，不限于上述实施方式，在不显著降低启动子活性的范围内，可以在多核苷酸序列中包括各种改变。例如，可以通过已知的诱变方法，例如定向进化、定点诱变等来改变本公开的核苷酸序列。

在这点上，术语“改变”是指遗传或非遗传稳定的表型变化，并且在本公开中，它可以与“修饰”或“突变”互换使用。

因此，在本发明中，具有启动子活性的多核苷酸可以是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的同源性或同一性的多核苷酸序列。具有同源性或同一性的核苷酸序列可以是在上述类别中除了具有100％同一性的序列之外，具有小于100％同一性的序列。

同时，虽然在本公开中描述为“具有特定SEQ ID NO所示的核苷酸序列的多核苷酸”或“包含特定SEQ ID NO所示的核苷酸序列的多核苷酸”，但显然具有核苷酸序列的多核苷酸部分序列缺失、修饰、取代或添加的序列也可用于本公开，只要其具有与由相应SEQ IDNO.的核苷酸序列组成的多核苷酸的活性相同或对应的活性即可。

例如，在对应的SEQ ID NO的核苷酸序列的内部或末端添加无意义的序列，或在相应SEQ ID NO的核苷酸序列的内部或末端缺失部分序列的多核苷酸显然是也包括在本公开的范围内，只要其具有与多核苷酸相同或对应的活性即可。

同源性或同一性是指两个给定核苷酸序列的匹配程度，可以用百分比表示。

术语“同源性”和“同一性”经常可以互换使用。

保守多核苷酸的序列同源性或同一性可以使用标准比对算法来确定，并且可以与由所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上同源或相同的序列可以在中等或高度严格下沿着序列的全长或至少约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的全长杂交。还考虑了包含简并密码子而不是杂交多核苷酸中的密码子的多核苷酸。

任何两个多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法来确定，例如使用默认参数的“FASTA”程序，例如，如Pearson等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444所述。或者，如在EMBOSS包的Needleman程序中执行的那样(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或后续版本)，同源性、相似性或同一性可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)(包括GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,SF,等人，J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,编辑,Academic Press,San Diego,1994,以及CARILLO等人(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)来确定。例如，同源性、相似性或同一性可以使用国家生物技术信息数据库中心的BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序比较序列信息来确定，例如Needleman等人，(1970)，J Mol Biol.48:443，如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482所披露的。总之，GAP程序定义为通过将相似排列的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列中的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可以包括：(1)二进制比较矩阵(包含1代表身份和0代表非身份)和Gribskov等人，(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编辑，Atlas OfProtein Sequence And Structure，国家生物医学研究基金会，第353-358页(1979)(或者，EDNAFULL的替代矩阵(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本))；(2)每个空缺3.0罚分，每个空缺中的每个符号附加0.10罚分(或者，空缺开放罚分10，空缺扩展罚分0.5)；和(3)终端空缺不受罚分。因此，本公开中使用的术语“同源性”或“同一性”表示序列之间的相关性。

此外，可以包括可从已知基因序列制备的探针，例如具有相同活性并在严格条件下与上述多核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交的多核苷酸序列，而没有限制。“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献中具体公开(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二次编辑,Cold SpringHarbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,Inc.，New York)。例如，严格条件可以包括如下条件：具有高度同源性或同一性的基因、具有40％或更多，特别是70％或更多，80％或更多，85％或更多，或90％或更多，更特别是95％或更多，更特别是97％或更多，并且具体特别是99％或更多的同源性或同一性的基因彼此杂交，而具有低于上述同源性的同源性或同一性的基因彼此不杂交；或者可以包括Southern杂交的普通洗涤条件，即洗涤1次，特别是2-3次，盐浓度和温度对应于60℃，1×SSC，0.1％SDS，特别是60℃，0.1×SSC和0.1％SDS，并更特别是68℃、0.1×SSC和0.1％SDS。

杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管取决于杂交的严格程度，核苷酸之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可相互杂交的核苷酸之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列以及与其基本相似的核酸序列互补的分离的核酸片段。

具体地，可以使用包括在上述条件下Tm值为55℃的杂交步骤的杂交条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，本领域技术人员可以根据其目的适当控制。

适用于多核苷酸杂交的严格性取决于多核苷酸的长度和互补性，并且变量是本领域众所周知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51、11.7-11.8)。

可以使用标准分子生物学技术分离或制备本公开的具有启动子活性的多核苷酸。例如，可以使用标准合成技术制备多核苷酸，该技术使用自动DNA合成仪，但制备方法不限于此。

本公开的具有启动子活性的多核苷酸可以用作启动子。

启动子可以位于mRNA转录起始位点的5'-区域。

与现有启动子相比，启动子可能具有增加或减少的启动子活性。换言之，启动子可以增加或减少靶基因编码的蛋白质的表达和/或活性以及靶基因在宿主细胞中的表达。就本发明的目的而言，其表达增强或减弱的靶基因可根据所生产的产品而改变，该启动子可作为用于增强或减弱靶基因的通用启动子使用。

本公开的另一方面提供了包含多核苷酸和靶基因的基因表达盒。

本公开的多核苷酸与上述相同。

如本文所用，术语“基因表达盒”是指包含启动子和靶基因并且能够表达可操作连接在启动子下游的靶基因的单元盒。能够帮助靶基因有效表达的各种因素可以包括在基因表达盒的内部或外部。通常，除了与靶基因可操作连接的启动子之外，基因表达盒还可以包括转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号，但不限于此。

就本公开的目的而言，“靶基因”是指其表达受本公开的启动子序列调控的基因。由靶基因编码的蛋白质可以被表达为“靶蛋白”，并且编码“靶蛋白”的基因可以被表达为“靶基因”。

此外，由于密码子简并性或考虑到生物体优选的表达多核苷酸的密码子，编码靶蛋白的多核苷酸在不改变多肽序列的范围内在编码区内具有各种修饰。多核苷酸序列的描述与上述相同。

特别地，表述“由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成”是指，当使用限制酶时，核苷酸的添加、缺失和/或改变被/不被排除，这可能发生在当相应的多核苷酸通过连接到靶基因而作为启动子时连接到靶基因的过程。

此外，由SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的具有启动子活性的多核苷酸可以包括任何核苷酸序列而不受限制，只要它是与全部或部分序列的互补序列杂交的核苷酸序列即可。SEQ ID NO：2的核苷酸序列在严格条件下具有本公开的启动子活性。

本公开的又一方面提供了包含多核苷酸、或包含多核苷酸和靶基因的基因表达盒的重组载体。

本公开的多核苷酸、靶基因和基因表达盒与上述相同。

如本文所用，术语“载体”是指具有能够在合适宿主中表达靶基因的遗传物质的人工DNA分子，并特别是指包括与其可操作连接的编码靶蛋白的基因的核苷酸序列的DNA构建体。

如本文所用，术语“可操作连接”是指本公开的具有启动子活性的多核苷酸与基因序列功能性连接以启动和介导靶基因的转录。可使用本领域已知的基因重组技术实现可操作的连接，并且可以使用本领域已知的限制酶和连接酶进行位点特异性DNA切割和连接，但不限于此。

本公开中使用的载体没有特别限制，只要它可以在宿主细胞中表达，并且可以使用本领域已知的任何载体转化宿主细胞。通常使用的载体的示例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。

例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等；作为质粒载体，可以使用基于pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些，但不限于此。具体地，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等，但载体不限于此。此外，可以通过本领域已知的任何方法、例如同源重组来实现多核苷酸插入染色体中。

由于本公开的载体可以通过诱导同源重组而插入染色体中，因此可另外包括选择标记以确认基因成功插入染色体中。选择标记用于筛选载体转化的细胞，即确定是否插入了多核苷酸。可以使用提供可选择表型的标记，例如抗药性、营养缺陷型、对毒剂的抗性或表面蛋白的表达。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞能够存活或表现出不同的表型，因此可以选择转化细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞以允许由多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。此外，只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，转化的多核苷酸是位于宿主细胞的染色体上还是染色体外都没有关系，两种情况都包括在内。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白质的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以被引入宿主细胞并在其中表达即可。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞，该表达盒是包括所有自我表达所需元件的基因构建体，或者以包含其的载体形式。

转化方法包括将编码目标蛋白的基因导入细胞的任何方法，可以根据宿主细胞选择本领域已知的合适的标准技术进行。例如，转化方法可能包括电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、醋酸锂-DMSO技术等，但方法不限于此。

本公开的又一方面提供了包含多核苷酸或基因表达盒的宿主细胞。

具体地，宿主细胞可以是棒状杆菌属的微生物，但不限于此。

多核苷酸和基因表达盒与上述相同。

如本文所用，术语“微生物”包括所有野生型微生物和天然或人工遗传修饰的微生物，并且它是包括由于外源基因的插入或内源基因的活性增强或减弱而具有特定减弱或增强机制的微生物的概念。在本公开中，微生物可以包括任何微生物而没有限制，只要其与本公开的多核苷酸一起引入或包括本公开的多核苷酸即可。

在本公开中，微生物可以包括多核苷酸，特别是多核苷酸和/或包括多核苷酸的载体，更特别是包括编码目标蛋白的基因的载体，但不限于此。此外，多核苷酸和载体可以通过转化引入微生物中，但不限于此。

微生物是用包含本发明的多核苷酸和编码靶蛋白的基因的载体转化以表达靶蛋白的细胞或微生物，就本发明的目的而言，宿主细胞或微生物可以是任何微生物，只要它能够产生包括目标蛋白质的目标产物。

如本文所用，术语“产生目标蛋白质或目标产物的微生物”包括所有野生型微生物和天然或人工遗传修饰的微生物，并且它是指由于外源基因的插入或内源基因的活性增强或失活而具有特定减弱或增强机制的微生物。微生物可以是包括用于产生目标蛋白质或产物的遗传修饰的微生物。

就本公开的目的而言，产生目标蛋白质或目标产物的微生物可以是通过包含本公开的多核苷酸而提高了目标蛋白质或目标产物的生产力的微生物。具体地，在本公开中，产生目标蛋白质或目标产物的微生物，或具有目标蛋白质或目标产物生产力的微生物可以是其中目标蛋白质或目标产物的生物合成途径中的一些基因被增强或减弱，或者目标蛋白或目标产物的降解途径中的一些基因被增强或减弱的微生物。

关于本公开的目的，包括多核苷酸的微生物可以具有增加的L-氨基酸，特别是L-赖氨酸的产量。

在本发明中，微生物可以包括任何微生物，只要是引入了具有本发明的启动子活性的多核苷酸，从而能够作为启动子发挥作用的微生物即可。

微生物具体可以是棒状杆菌属的微生物，更具体地为谷氨酸棒状杆菌或黄色棒状杆菌，并且最具体地为谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。

本公开的另一方面提供了一种生产目标材料的方法，该方法包括在培养基中培养宿主细胞；并从介质中回收目标材料的步骤。

所述宿主细胞与上述相同。

在本公开中，目标材料可以是氨基酸。具体地，除非另有说明，氨基酸可以是L型氨基酸，并且可以选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸及其组合，但不限于此。

更具体地，氨基酸可以是L-赖氨酸，但不限于此。

如本文所用，术语“培养”是指在适当且人工控制的环境条件下培养微生物。在本公开中，使用包含多核苷酸的微生物生产目标材料的方法可以通过使用本领域公知的方法进行。具体地，可以分批、分批补料或重复补料分批过程连续进行培养，但不限于此。培养中使用的培养基必须适当满足特定菌株的要求。公开了棒状杆菌属微生物的培养基(例如，Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society forBacteriology，华盛顿特区，美国，1981)。

作为培养基中要使用的碳源，可以包括糖类和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂，如豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油等；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，如甘油和乙醇；以及有机酸，如乙酸。这些材料可以单独使用或混合使用，但不限于此。

作为要使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或混合使用，但不限于此。

作为要使用的磷源，可以使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。此外，培养基可以包含生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述材料之外，还可以使用生长必需的材料，例如氨基酸和维生素。此外，合适的前体可用于培养基中。可以在培养过程中以分批或连续方式将上述原料充分加入培养物中。

在微生物培养过程中，可以使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾或氨，或酸性化合物如磷酸或硫酸适当调节培养物的pH。此外，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来防止泡沫的产生。为了保持有氧条件，可以将氧气或含氧气体(例如空气)引入培养物中。

培养(培养基)的温度通常可以为20℃至45℃，特别是25℃至40℃。培养可以持续到获得所需量的目标材料，但具体可以进行10小时至160小时。

关于从培养(培养基)中回收目标材料，可以通过本领域公知的常用方法分离回收目标材料。分离方法可以采用离心、过滤、层析、结晶等。例如，可以通过离子交换层析分离通过低速离心培养基并去除生物质而获得的上清液，但不限于此。

回收步骤还可包括纯化过程。

本公开的另一方面提供了多核苷酸作为启动子的用途，其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的位置178处的核苷酸被另一个核苷酸取代。

所述多核苷酸与上述相同。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，以下实施例仅是用于说明本发明的优选实施例，并不用于限制本发明的范围。另一方面，本说明书中未描述的技术事项可以被本公开的本领域或类似技术领域的技术人员充分理解和容易地实施。

实施例1.包含新型启动子序列的重组载体的制备

首先，基于美国国立卫生研究院基因库(NIH GenBank)，获得包括野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032的NCgl0859启动子区的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。为了检查启动子变体(PNCgl0859(t178c)；SEQ ID NO：2)对L-赖氨酸产生的影响，所述启动子变体中对应于SEQID NO:1的多核苷酸的位置178处的核苷酸由T被C取代，使用质粒pDCM2(韩国专利公开号10-2020-0136813)制备用于制备表达其的菌株的载体，所述质粒用于在棒状杆菌的染色体中插入和替换基因。

具体地，以野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032的gDNA(基因组DNA)为模板，使用SEQID NO：3和4序列的一对引物和SEQ ID NO：5和6序列的一对引物分别进行PCR。以上述得到的两个片段的混合物为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6序列的一对引物进行重叠PCR，从而得到片段。PCR在以下条件下进行：94℃变性5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒，30个循环；和72℃5分钟。用SmaI处理pDCM2质粒，并将得到的PCR产物融合克隆到其中。在融合克隆中，使用

HD克隆试剂盒(Clontech)。所得载体命名为pDCM2-PNCgl0859(t178c)。用于制备载体的引物序列信息见下表1。

[表1]

实施例2.包括新型启动子序列的微生物L-赖氨酸生产力的评价

2-1.PNCgl0859变体表达菌株的制备

将实施例1制备的基因取代的载体导入谷氨酸棒状杆菌CJ3P(US 9556463 B2)菌株中，以制备引入变体的L-赖氨酸生产菌株“CJ3P_PNCgl0859(t178c)”。

具体地，经电穿孔进行转化(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545)，并然后对通过同源序列重组的方式将载体插入染色体中的菌株在含有25mg/L卡那霉素的琼脂培养基上进行选择。对初次选择的菌株进行二次交叉以选择引入目标变体的菌株。使用SEQ ID NO：7和8的一对引物通过PCR检查最终转化菌株中的变异(取代)，然后测序。用于制备PNCgl0859变体表达菌株的引物序列信息如下表2所示。

[表2]

SEQ ID NO	引物名称	5′序列3′
			7	PNCgl0859_5F	CCGGCTTGAGCAGTTCG
8	PNCgl0859_6R	GCGACGAAGGATCCTGG

2-2.PNCgl0859变体表达菌株的L-赖氨酸生产力的比较

通过实施例2-1中制备的菌株和对照亲本菌株的烧瓶发酵效价来分析L-赖氨酸生产力。

首先，将各菌株接种在含有25mL种子培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养20小时。将1mL的种子培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。在这点上，种子培养基和生产培养基的组成如下。

种子培养基(pH 7.0)

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、0.1mg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙和2mg烟酰胺(基于1L蒸馏水)

生产培养基(pH 7.0)

100g葡萄糖、40g(NH₄)₂SO₄、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆、3g尿素、1g KH₂PO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺和30g CaCO₃(基于1L蒸馏水)

培养终止后，使用HPLC测定L-赖氨酸生产力，各菌株的培养基中的赖氨酸浓度和浓度增加率如下表3所示。

[表3]

菌株名称	L-赖氨酸浓度	赖氨酸浓度增加率(％)
			CJ3P	8.03	-
CJ3P_PNCgl0859(t178c)	9.84	22.5

如表3所示，证实了引入变异的谷氨酸棒杆菌CJ3P_PNCgl0859(t178c)菌株与未引入变异的谷氨酸棒杆菌CJ3P菌株相比，L-赖氨酸浓度增加了22.5％。

换言之，证实了该变异显著提高了微生物的L-赖氨酸生产力。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，在不改变本公开的技术精神或本质特征的情况下，可以以不同的具体形式来实施本公开。对此，应当理解，上述实施方式不是限制性的，而是在所有方面都是示例性的。本公开的范围由所附权利要求而不是由其前面的描述限定，因此落入权利要求的范围和界限内的所有变化和修改或这些范围和界限的等同物旨在被权利要求涵盖。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 新型启动子及其用途

<130> OPA21218

<150> KR 10-2021-0059092

<151> 2021-05-07

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 400

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 启动子

<400> 1

acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60

caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120

aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagctct 180

gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240

taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300

aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360

gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400

<210> 2

<211> 400

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 启动子变体

<400> 2

acctatcgtg cgctggacgc taaccaatag tgagtgagcc gaaatccctg tttgtaacaa 60

caccattaac catcgtgtgg actgatactg gattccacca tcgcggaagg cggtctcgac 120

aaacgcctta gactcttcag gtttttcaga ttctcatcat tgataatcgt cacaagccct 180

gattcttttc gatctgtgat aaacgcctac cactcttcgt caatctcacc gctgggtagg 240

taaagaaccg ccgaattgcc ttggaagtca tcaaacgaca tcaaaatatt ttgtaagcga 300

aggatcgtac caaataaggc aataaactct ttttactttt cctcaacttc ctgaaaagtc 360

gccgccctag aattcactaa gtttccgata tctttaaccc 400

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物1F

<400> 3

tgaattcgag ctcggtaccc ccaccgcctt cacaccg 37

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物2R

<400> 4

gatcgaaaag aatcagggct tgtgacgatt atc 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物3F

<400> 5

gataatcgtc acaagccctg attcttttcg atc 33

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物4R

<400> 6

gtcgactcta gaggatcccc gcagtacata gatcgggg 38

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物5F

<400> 7

ccggcttgag cagttcg 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物6R

<400> 8

gcgacgaagg atcctgg 17

Claims

1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的位置178处的核苷酸被C取代。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成。

3.一种基因表达盒，其包含根据权利要求1所述的多核苷酸和靶基因。

4.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1所述的多核苷酸或根据权利要求3所述的基因表达盒。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是棒状杆菌属的微生物。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。

7.一种生产目标材料的方法，所述方法包括：在培养基中培养根据权利要求4所述的宿主细胞；并从所述培养基中回收所述目标材料的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述目标材料是氨基酸。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述目标材料是L-赖氨酸。