CN117460829A - 修饰型α-异丙基苹果酸合酶 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种新颖IPMS变异体，其可对各种微生物赋予包含L‑亮氨酸或其前体的派生物的生产能力。所述IPMS变异体以序列号2所示的氨基酸序列为基准而包含选自下述(a')～(c')中的至少两种氨基酸取代：(a')与第530位的甘氨酸残基相当的氨基酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代；(b')与第532位的甘氨酸残基相当的氨基酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代；及(c')与第535位的丙氨酸残基相当的氨基酸残基向丙氨酸残基以外的氨基酸残基的取代。
Description
技术领域
本发明涉及一种降低了由亮氨酸引起的反馈抑制的修饰型α-异丙基苹果酸合酶、对所述修饰型α-异丙基苹果酸合酶进行编码的多核苷酸、导入了所述多核苷酸的基因修饰微生物、以及使用所述基因修饰微生物来生产规定的目标物质的方法。
此外，本申请基于2021年3月29日向日本专利厅提交的日本专利申请No.特愿2021-054521而主张优先权，在本说明书中出于所有目的而引用所述日本专利申请的内容。此外，在本说明书中也出于所有目的而引用本申请中所提及的各现有技术文献的公开内容。
背景技术
L-亮氨酸是必需的氨基酸的一种，是广泛用于医药、食品、饲料添加物、工业药品等中的高价的氨基酸，主要使用微生物来生产。具体而言，包含L-亮氨酸的支链氨基酸的发酵生产主要是利用埃希菌(Escherichia)属微生物或棒状杆菌(corynebacterium)属微生物来进行。已知以丙酮酸为起点经过各种阶段而生物合成2-酮异己酸来作为前体。在此种L-亮氨酸生物合成路径中，α-异丙基苹果酸合酶(α-isopropyl malate synthase)(2-异丙基苹果酸合酶、α-异丙基苹果酸合酶(α-isopropyl malic acid synthase)、EC 2.3.3.13；以下，有时称为“IPMS”)发挥主要作用，从各种生物种中分离对所述酶进行编码的基因，进而在大量的生物种中也确定了所述基因的核苷酸序列及酶类蛋白质的氨基酸序列。
且说，已知，在L-亮氨酸生物合成路径中，IPMS发挥重要作用，但经常可产生其酶活性因所生成的最终产物即L-亮氨酸而受到抑制的反馈抑制，从以前起，此种反馈抑制在利用微生物的L-亮氨酸的工业生产中便成为问题，从而开发了可解决所述问题的各种技术。
例如，在专利文献1中，公开了一种通过对具有L-亮氨酸生产能力、且消除了由L-亮氨酸引起的抑制的α-异丙基苹果酸合酶进行编码的脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid，DNA)而经形质转换的微生物、以及使用所述微生物的L-亮氨酸的制造方法。在专利文献1记载的技术中，所谓“消除了由L-亮氨酸引起的抑制的α-异丙基苹果酸合酶”，是从具有L-亮氨酸生产能力的大肠埃希菌(E.coli)的变异株进行克隆而得的由变异型leuA基因编码的变异型IPMS，所述变异型IPMS的特征在于相对于对应的野生型IPMS而具有规定的氨基酸取代。在专利文献1中，实际上，通过利用若干个变异型IPMS编码核酸对规定的大肠埃希菌菌株进行形质转换而获取L-亮氨酸生产株，关于所获得的各L-亮氨酸生产株，记载了对IPMS的比活性及由L-亮氨酸引起的反馈抑制的程度以及L-亮氨酸的生产能力进行评价而得的结果。
进而，在专利文献2中，公开了一种相对于源自谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)的由LeuA基因编码的野生型IPMS的氨基酸序列而使第553位的酪氨酸残基变异为天冬氨酸而得的变异型IPMS、对所述变异型IPMS进行编码的核苷酸、以及用于利用导入了所述核苷酸的微生物来制造L-亮氨酸或酮异己酸(ketoisocaproate，KIC)的发酵法的技术，并提及了所述变异型IPMS降低了由L-亮氨酸等引起的酶活性的反馈抑制。更详细而言，在专利文献2中，制作对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株导入对所述变异型IPMS进行编码的基因(变异型leuA基因)而得的基因重组菌株，对于所述基因重组菌株，使用野生型ATCC13032株作为对照并进行KIC及L-亮氨酸的制造试验，结果，确认到：相对于野生型ATCC13032株，所述基因重组菌株被赋予了这些物质的生产能力。
进而，在专利文献3中，也公开了一种相对于源自谷氨酸棒状杆菌的由LeuA基因编码的IPMS而具有规定的氨基酸取代的变异型IPMS、导入了对所述变异型IPMS进行编码的核酸的谷氨酸棒状杆菌重组菌株、以及使用所述重组菌株的L-亮氨酸的制造方法。认为在专利文献3中记载有：关于所述变异型IPMS所具有的氨基酸取代，在相同文献中作为基准的IPMS的氨基酸序列中，是第494位的精氨酸被取代为组氨酸，第497位的甘氨酸被取代为天冬氨酸，且第499位的亮氨酸被取代为缬氨酸。但是，在谷氨酸棒状杆菌所具有的野生型IPMS(LeuA基因蛋白质)的氨基酸序列中，第494位、第497位及第499位的各氨基酸与专利文献3中提及的取代前的各氨基酸不同，专利文献3是基于中文的文献，因此其公开内容有很多不清楚的点。
进而，在专利文献4中，公开了一种具有IPMS活性的新颖变异型多肽、对所述变异型多肽进行编码的多核苷酸、包含所述多肽的微生物、以及对所述微生物进行培养而生产L-亮氨酸的方法。在专利文献4中，所谓“具有IPMS活性的新颖变异型多肽”，更具体而言，被规定为在源自谷氨酸棒状杆菌的由LeuA基因编码的野生型IPMS氨基酸序列中，第558位的精氨酸残基被取代为精氨酸以外的其他氨基酸残基或第561位的甘氨酸残基被取代为甘氨酸以外的其他氨基酸残基而得的具有IPMS活性的变异型多肽。在专利文献4中，实际制作的IPMS变异体及导入了所述IPMS变异体的菌株为分别具有R558H、R558A、R558Q、G561D、G561R、G561Y的各氨基酸取代的IPMS变异体、以及具有基于R55H及G561D的组合的氨基酸取代的IPMS变异体、与分别导入了这些变异体的谷氨酸棒状杆菌重组菌株，并确认到这些重组菌株相对于野生株而言提高了L-亮氨酸的生产能力。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开2001-37494号公报
专利文献2：日本专利特表2015-514431号公报
专利文献3：中国专利申请公开第104480058号公报
专利文献4：日本专利特表2020-503045号公报
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种新颖IPMS变异体，其可对各种微生物赋予包含L-亮氨酸或其前体的派生物的生产能力。
解决问题的技术手段
为了解决所述问题而反复进行了努力研究，结果，通过将对于针对L-亮氨酸的反馈抑制具有抗性的IPMS的多种独立的变异适当组合，而观察到单独的变异中未获得的显著的L-亮氨酸生产性的增加，从而完成了本发明。
即，根据本发明的形态，提供以下内容。
[1]一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由下述(A)～(C)的任一者规定的氨基酸序列，且与包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质相比，降低了L-亮氨酸反馈抑制：
(A)在序列号2所示的氨基酸序列中，具有选自下述(a)～(c)中的至少两种取代的氨基酸序列；
(B)相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有60％以上的序列同一性，且包含选自下述(a)～(c)中的至少两种取代的氨基酸序列；
(C)在序列号2所示的氨基酸序列中，包含选自下述(a)～(c)中的至少两种取代，且在除了存在所述至少两种取代的部位以外的部位缺失、取代、插入或附加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，
(a)第530位的甘氨酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代、
(b)第532位的甘氨酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代、及
(c)第535位的丙氨酸残基向丙氨酸残基以外的氨基酸残基的取代。
[2]根据[1]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(B)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有84％以上的序列同一性的氨基酸序列。
[3]根据[1]或[2]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(B)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(a)～(c)中规定的所有取代。
[5]根据[4]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
[6]一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，与对应的野生型2-异丙基苹果酸合酶相比，具有降低L-亮氨酸反馈抑制的至少一种氨基酸变异，
所述至少一种氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准而包含选自下述(a')～(c')中的至少两种取代：
(a')与第530位的甘氨酸残基相当的氨基酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代；
(b')与第532位的甘氨酸残基相当的氨基酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代；及
(c')与第535位的丙氨酸残基相当的氨基酸残基向丙氨酸残基以外的氨基酸残基的取代。
[7]根据[6]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少一种氨基酸变异包含所述(a')～(c')中规定的所有取代。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含在源自棒状杆菌属细菌的野生型2-异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列中具有所述至少两种取代的氨基酸序列。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少两种取代是选自下述(d)～(f)中的至少两种取代：
(d)第530位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基、谷氨酸残基、赖氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、谷氨酰胺残基、半胱氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苏氨酸残基或组氨酸残基的取代；
(e)第532位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、脯氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苏氨酸残基或组氨酸残基的取代；及
(f)第535位的丙氨酸残基或与所述丙氨酸残基相当的氨基酸残基向苏氨酸残基、丝氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、天冬氨酸残基、苯基丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基或组氨酸残基的取代。
[10]根据[9]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(d)～(f)中规定的所有取代。
[11]根据[10]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
[12]根据[1]至[11]中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少两种取代是选自下述(g)～(j)中的至少两种取代：
(g)第530位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基的取代；
(h)第532位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基的取代；及
(j)第535位的丙氨酸残基或与所述丙氨酸残基相当的氨基酸残基向苏氨酸残基、缬氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基或异亮氨酸残基的取代。
[13]根据[12]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(g)～(j)中规定的所有取代。
[14]根据[13]所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
[15]一种多核苷酸，对根据[1]至[14]中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶进行编码。
[16]一种微生物，导入了根据[15]所述的多核苷酸。
[17]一种微生物，包含根据[1]至[14]中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶。
[18]根据[16]或[17]所述的微生物，为棒状型细菌。
[19]根据[18]所述的微生物，为谷氨酸棒状杆菌。
[20]根据[16]至[19]中任一项所述的微生物，其中野生型α-异丙基苹果酸合酶活性经降低或经灭活。
[21]一种生产目标物质的方法，包括：
(I)通过在规定的培养基或反应介质中对根据[16]至[20]中任一项所述的微生物进行培养或使其反应而产生目标物质；以及
(II)回收所述目标物质。
[22]根据[21]所述的方法，其中所述目标物质为(2S)-2-异丙基苹果酸酯、2-异丙基苹果酸酯、(2R,3S)-3-异丙基苹果酸酯、(2S)-2-异丙基-3-氧代琥珀酸酯、4-甲基-2-氧代戊酸酯或L-亮氨酸或在生物合成路径上经由这些化合物的代谢产物。
[23]根据[21]或[22]所述的方法，其中所述目标物质为L-亮氨酸或由其衍生的代谢产物。
发明的效果
根据本发明，可利用对反馈抑制具有高的抗性的IPMS变异体，并且可使用所述IPMS变异体以高的产率与生产性来生产包含L-亮氨酸或其前体的派生物。
附图说明
[图1]是用于说明在本发明的实施方式中微生物可具有的代谢路径的图。
具体实施方式
本发明的形态是具有IPMS活性的新颖变异型多肽。即，根据所述形态，如由所述[1]或[6]所示的构成要素所确定的那样，提供一种降低了L-亮氨酸反馈抑制的修饰型α-异丙基苹果酸合酶。更详细而言，所述新颖变异型多肽中，包含UniprotKB(通用蛋白质知识库(Universal Protein Knowledge Base))：P42455的氨基酸序列的多肽的从N末端起为第530位、第532位、第535位的甘氨酸、甘氨酸、丙氨酸中的至少两个、或与这些相当的氨基酸残基中的至少两个分别被取代为其他氨基酸残基。所述变异型多肽与UniprotKB：P42455的具有IPMS活性的多肽相比，至少对反馈抑制具有高的抗性。
此处，在下述表1中示出UniprotKB：P42455的氨基酸序列。
[表1]
UniprotKB：P42455的氨基酸序列为源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032/DSM20300/BCRC11384/JCM1318/LMG3730/NCIMB10025株的野生型IPMS的氨基酸序列。在序列表中，在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032株所具有的基因组序列中，将包含对所述野生型IPMS进行编码的区域(编码序列(coding sequence，CDS))的核苷酸序列以及所述野生型IPMS的氨基酸序列分别依序表示为序列号1、序列号2。
所谓本发明中的“反馈抑制”，是指代谢系统的最终产物成为抑制剂而抑制所述代谢系统的初期阶段中的反应。在本发明中，是指L-亮氨酸或其衍生物在其生物合成路径的第一阶段中抑制传播的IPMS的活性，但众所周知，若结构相似，则显示出仅程度不同的抑制活性。因此，在仅称为“反馈抑制”的情况下，对于IPMS而言的抑制剂并不限定于L-亮氨酸。若消除IPMS的反馈抑制，则与没有消除的情况相比，可提高L-亮氨酸的生产性。不过，在称为“L-亮氨酸反馈抑制”的情况下，是指IPMS受到由L-亮氨酸引起的反馈抑制，在称为“降低了L-亮氨酸反馈抑制”等的情况下，是指作为对象的IPMS至少具有降低或消除由L-亮氨酸引起的反馈抑制的性质。所述修饰型α-异丙基苹果酸合酶除了具有降低L-亮氨酸反馈抑制的性质以外，还可具有降低由L-亮氨酸的衍生物或其他代谢产物引起的反馈抑制的性质，但未必必须具有。
在本发明中，所谓“对反馈抑制具有高的抗性”，是指即便在存在高浓度的抑制剂时，也不受抑制地维持酶活性。对于反馈抑制的抗性可通过将存在抑制剂时的IPMS活性与不存在抑制剂时的活性加以比较来评价。
所谓本发明中的IPMS，是使2-酮异戊酸(2-ketoisovalerate；3-methyl-2-oxobutanoate(3-甲基-2-氧代丁酸酯))与乙酰辅酶A反应并转换为L-亮氨酸的前体之一即异丙基苹果酸(isopropylmalate)的酶。更具体而言，如图1所示，IPMS是对从3-甲基-2-氧代丁酸酯〔3-methyl-2-oxobutanoate〕向(2S)-2-异丙基苹果酸酯〔(2S)-2-isopropylmalate〕的代谢反应、即3-甲基-2-氧代丁酸酯+乙酰辅酶A+H2O＝(2S)-2-异丙基苹果酸酯+辅酶A+H+的反应式所表示的反应进行催化的酶，其酶活性被定义为EC编号2.3.3.13。
本发明中的IPMS只要是具有所述转换活性且降低了所述反馈抑制的修饰型酶，则可源自任何生物，优选为源自棒状型细菌的酶。进而优选为，可为源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的IPMS，具体而言，可为相对于UniprotKB：P42455的氨基酸序列而包含规定的氨基酸取代的物质，但并不限定于这些。进而，所述IPMS也可包含与UniprotKB：P42455的氨基酸序列(序列号2)具有至少80％、84％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列同一性的多肽。例如，只要是具有此种序列同源性或序列同一性且显示出与IPMS相应的效果的氨基酸序列，则具有缺失、修饰、取代或附加了一部分序列的氨基酸序列的物质当然也包含于本发明中。另外，在使用UniprotKB：P42455以外的氨基酸序列的情况下，可通过与UniprotKB：P42455进行比对(alignment)来推断应插入变异的相同的氨基酸残基。比对可利用通常的程序，例如可列举库拉斯塔鲁(Clustal)或BLAST(局部序列排比检索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool))。比对也可为立体结构的叠加，因此，例如可通过利用皮莫鲁(PyMOL)等分子图形工具来进行评价。
在本发明中，所谓“棒状型细菌”，是指伯杰氏鉴定细菌学手册(Bargeys Manualof Determinative Bacteriology，第8卷，p.599，1974年)中所定义的一群微生物。
更详细而言，作为棒状型细菌，可列举：棒状杆菌(Corynebacterium)属菌、短杆菌(Brevibacterium)属菌、节杆菌(Arthrobacter)属菌、分枝杆菌(Mycobacterium)属菌、微球菌(Micrococcus)属菌、微杆菌(Microbacterium)属菌等。
进而详细而言，可参照WO2019156152A1中所记载的定义。
所谓本发明中的“变异”、“变异型”或“变异体”，是指某一基因的碱基序列发生变化且氨基酸的序列随之发生变化的基因、多肽、酶、或具有这些的微生物。所谓IPMS的变异体或变异型IPMS，是IPMS的氨基酸序列与野生型相比变化了一个氨基酸以上的物质，是指活性或对于针对L-亮氨酸及其衍生物的反馈抑制的程度发生了变化的变异体。
具体而言，本发明的具有IPMS活性的变异型多肽可为包含UniprotKB：P42455的氨基酸序列的多肽的从N末端起为第530位、第532位、第535位的氨基酸残基即甘氨酸、甘氨酸、及丙氨酸中的至少两个、或与这些氨基酸相当的氨基酸残基中的至少两个分别被取代为其他氨基酸残基而得的物质。在此情况下，所述其他氨基酸残基是指从自20种标准氨基酸中去除野生型IPMS中的变异前的氨基酸残基而得的19种中选择的一种氨基酸残基。
另外，在所述变异型多肽中，也可包含与序列号2(表1)所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列同一性的多肽。例如，只要是具有此种序列同源性或序列同一性且显示出与IPMS相应的效果的氨基酸序列，则除了第530位、第532位、第535位的变异以外还具有缺失、修饰、取代或附加了一部分序列的氨基酸序列的酶变异体也包含于本发明中。另外，对于本领域技术人员而言，明确的是：于在UniprotKB：P42455的N末端附加或缺失了一部分氨基酸的情况下，考虑到所述氨基酸的数量而推算出的物质也包含于本发明中。
此外，在本发明中，所述“在除了存在至少两种取代的部位以外的部位缺失、取代、插入或附加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“一个或多个”(“一个或者多个”)的范围并无特别限定，在特定的实施方式中，例如为1个至400个、1个至300个、1个至200个、1个至100个、1个至50个、1个至30个。在其他实施方式中，“一个或多个”(“一个或者多个”)的范围至少为2个以上，优选为2个至20个，更优选为2个至10个，进而优选为2个至5个，特别优选为2个至4个、2个至3个、例如2个。
此外，在所述[6]所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶中，“对应的野生型2-异丙基苹果酸合酶(α-异丙基苹果酸合酶)”按照字义解释即可，在本发明所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶中，是指作为L-亮氨酸反馈抑制的降低基准的野生型2-异丙基苹果酸合酶(α-异丙基苹果酸合酶)。即，与作为基准的野生型2-异丙基苹果酸合酶(α-异丙基苹果酸合酶)相比，修饰型α-异丙基苹果酸合酶具有可降低L-亮氨酸反馈抑制的程度的至少一种氨基酸变异，且所述至少一种氨基酸变异只要包含由所述(a')、(b')及(c')规定的氨基酸取代中的至少两种即可。
进而，在所述[6]所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶中，(a')、(b')及(c')中分别记载的“相当的氨基酸残基”的意义在于以序列号2所示的氨基酸序列中所含的氨基酸为基准，在作为导入变异的对象的IPMS的氨基酸序列中确定取代部位。即，所述(a')、(b')及(c')中的“相当的氨基酸残基”具体是指在利用库拉斯塔鲁W(ClustalW)或库拉斯塔鲁X(ClustalX)(生物信息学、第23卷、第21期、2008年11月、第2947页-第2948页；Bioinformatics,Volume23,Issue 21,1November 2007,pp2947-2948)等方法，对序列号2所示的氨基酸序列，基于作为导入变异的对象的IPMS的氨基酸序列的同一性进行一对一对齐(双序列比对(pairwise alignment))时，与所述(a')、(b')及(c')所示的各氨基酸残基一对一对齐的氨基酸。
在特定的实施方式中，本发明所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶包含选自由G530D/G532D/A535T、G530E/G532D/A535T、G530K/G532D/A535T、G530A/G532D/A535T、G530V/G532D/A535T、G530F/G532D/A535T、G530N/G532D/A535T、G530C/G532D/A535T、G530P/G532D/A535T、G530R/G532D/A535T、G530L/G532D/A535T、G530I/G532D/A535T、G530T/G532D/A535T、G530H/G532D/A535T、G530D/G532E/A535T、G530D/G532K/A535T、G530D/G532A/A535T、G530D/G532V/A535T、G530D/G532F/A535T、G530D/G532N/A535T、G530D/G532C/A535T、G530D/G532P/A535T、G530D/G532L/A535T、G530D/G532I/A535T、G530D/G532T/A535T、G530D/G532H/A535T、G530D/G532D/A535S、G530D/G532D/A535V、G530D/G532D/A535K、G530D/G532D/A535D、G530D/G532D/A535N、G530D/G532D/A535F、G530D/G532D/A535C、G530D/G532D/A535G、G530D/G532D/A535L、G530D/G532D/A535I、及G530D/G532D/A535H所组成的群组中的三重变异。
此外，本发明所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶可具有的氨基酸序列可基于对序列号2所示的氨基酸序列(谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的野生型IPMS)进行本领域技术人员已知的BLAST分析而检索到的各种IPMS同源物的氨基酸序列来设计。若对序列号2所示的氨基酸序列进行BLAST分析，则可发现例如源自沙漠棒状杆菌(Corynebacteriumdeserti)的IPMS(登记号(Accession No.)WP_053543926.1，序列同一性94.64％)、源自高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)的IPMS(登记号WP_006768473.1，序列同一性90.26％)、源自耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)的IPMS(登记号WP_015399748.1，序列同一性82.62％)、源自产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)的IPM(登记号WP_040354747.1，序列同一性79.14％)、源自马里斯棒状杆菌(Corynebacterium maris)的IPMS(登记号WP_041631981.1，序列同一性79.87％)、源自哈迪斯棒状杆菌(Corynebacterium hadale)的IPMS(登记号WP_095538136.1，序列同一性76.02％)等IPMS同源物。基于这些IPMS同源物的各氨基酸序列，可设计本发明所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶可具有的氨基酸序列。此外，由这些登记号确定的氨基酸序列通过引用而作为一部分被组入本说明书中。此外，具有通过对这些氨基酸序列实施所述(a')、(b')及(c')、或所述(d)、(e)及(f)、或所述(g)、(h)及(j)所示的各氨基酸取代中的至少两种而得的氨基酸序列的变异型多肽是作为本发明所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶的实施方式而明示于本说明书中。
在若干实施方式中，本发明所涉及的修饰型α-异丙基苹果酸合酶具有通过在真核生物、原核生物、真菌类、细菌、古细菌、棒状型细菌、棒状杆菌属(例如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、沙漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、马里斯棒状杆菌(Corynebacterium maris)、哈迪斯棒状杆菌(Corynebacterium hadale))本来具有的野生型α-异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列中实施所述(a')、(b')及(c')、或所述(d)、(e)及(f)、或所述(g)、(h)及(j)所示的各氨基酸取代中的至少两种而得的氨基酸序列。
本发明的其他形态是一种多核苷酸，其对所述变异型多肽进行编码。
所述多核苷酸只要包含对本发明所涉及的变异型多肽或修饰型α-异丙基苹果酸合酶进行编码的碱基序列，则可具有任何序列。
导入变异前的野生型leuA基因的多核苷酸可为从由具有leuA基因的生物制备的基因组DNA通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)而扩增的序列，也可对以已知的基因信息为基础而设计的碱基序列进行人工基因合成。另外，只要对相同的多肽进行编码，则密码子(codon)的组合可为任意，也可考虑到密码子使用频率或二次结构等进行设计。
对所述野生型多核苷酸导入变异的方法可为体外(in vitro)也可为体内(invivo)。在体外导入变异的方法有基于使用导入了变异的引物的PCR的方法、或在易错(error-prone)的条件下进行PCR并随机导入变异的方法等，但并不限于此。在体内导入变异的方法有反复进行培养的传代而使其自然发生突然变异的方法、或利用紫外线或烷基化剂等变异原进行处理的方法等，但并不限于此。
根据本发明的进一步的其他形态，提供一种微生物，其包含所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)或多核苷酸。在特定的实施方式中，本发明所涉及的微生物具有包含L-亮氨酸或其前体的派生物生产能力。此外，在若干实施方式中，本发明所涉及的微生物是包含例如真菌类等真核微生物、原核生物、细菌、古细菌、棒状杆菌属、棒状型细菌的微生物。此外，关于所述L-亮氨酸的前体，相符的是异丙基苹果酸、2-酮异己酸等2-酮异戊酸以后的亮氨酸生物合成路径中的所有中间体，具体而言，包含构成图1所示的L-亮氨酸生物合成路径的各种代谢物。进而，L-亮氨酸的派生物中包含L-亮氨酸及可由其前体生物合成的所有物质。其中，可考虑例如由2-酮异己酸派生的3-羟基异戊酸、3-甲基丁醇、异戊基乙酸等，但并不限定于这些。
本发明中的所述微生物中包含通过形质转换而人工制造的微生物、或自然产生的微生物。
例如，所述微生物也可为通过包含对所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)进行编码的多核苷酸的载体(vector)而经形质转换的微生物。在若干实施方式中，所述微生物包含通过各种已知的方法来表达所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)的微生物。
在特定的实施方式中，在所述微生物中，对所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)进行编码的多核苷酸可以能够在宿主细胞内表达的形态导入。在其他实施方式中，在所述微生物中，对所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)进行编码的多核苷酸可以在宿主细胞内不表达所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)的形态导入。此外，经形质转换的基因(对所述变异型多肽进行编码的多核苷酸)在以在宿主细胞内表达所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)的形态导入的情况下，可插入至染色体内，也可位于染色体外。另外，在所述基因在以在宿主细胞内进行表达的形态导入的情况下，对所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)进行编码的多核苷酸可为任何形态，具体而言可具有DNA或核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)的形态。
在若干实施方式中，本发明所涉及的微生物除了表达所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)以外，还具有对3-甲基-2-氧代丁酸酯、(2S)-2-异丙基苹果酸酯、2-异丙基苹果酸酯、(2R,3S)-3-异丙基苹果酸酯、(2S)-2-异丙基-3-氧代琥珀酸酯、4-甲基-2-氧代戊酸酯、L-亮氨酸依序进行生物合成的生物合成路径。在其他实施方式中，本发明所涉及的微生物除了表达所述变异型多肽(修饰型α-异丙基苹果酸合酶)以外，还在生物合成路径上具有对由这些化合物中的至少一种衍生的代谢产物进行生物合成的一个或多个生物合成路径。
进而，在若干实施方式中，本发明所涉及的微生物可为野生型α-异丙基苹果酸合酶活性经降低或经灭活的微生物。如此，在野生型α-异丙基苹果酸合酶活性经降低或经灭活的微生物的情况下，在所述微生物中，对于目标物质的生成，可排除野生型酶所显示出的L-亮氨酸反馈抑制的不良影响，另一方面，表达出降低了所述反馈抑制的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，因此可效率良好地进行向目标物质的代谢反应。结果，根据所述微生物，能够以特别高的产率与生产性来生产目标物质。微生物中的野生型α-异丙基苹果酸合酶活性的降低或灭活具体可通过基因组上所存在的leuA或其同源基因(野生型α-异丙基苹果酸合酶编码基因)或其基因表达调节区域(e.g.启动子(promoter)区域)的破坏等方法来实现。
根据本发明的进一步的其他形态，如上所述，提供一种生产目标物质的方法，其包括：(I)通过在规定的培养基或反应介质中对本发明所涉及的所述微生物进行培养或使其反应而产生目标物质；以及(II)回收所述目标物质。在特定的实施方式中，生产目标物质的方法也可包括：(I)在培养基中对本发明所涉及的所述微生物中的可生产L-亮氨酸的棒状型细菌进行培养或使其反应，从而生产L-亮氨酸或在代谢路径上由L-亮氨酸衍生的代谢产物的步骤；以及(b)从所述微生物或培养培养基中回收步骤(II)中生产的所述L-亮氨酸或代谢产物的步骤。
所谓“培养”，通常是指使所述微生物在适宜地调节后的环境条件下繁殖，但本发明中的“进行培养或使其反应”并不限定于此种通常意义的培养，例如，也包含如下形态、即、不伴随所述微生物的实质上的增殖而是可通过使所述微生物的代谢的至少一部分发挥功能来实现所述目标物质的生产的培养或反应的形态。本发明中的培养或反应过程可通过采用本技术领域中已知的适宜的培养基、反应介质与培养条件来进行。本领域技术人员可根据所选择的菌株容易地调整并使用此种培养、反应过程。具体而言，所述培养或反应、即步骤(I)可为分批、连续及流加式培养，但并不限定于这些。
进而，在步骤(I)中，只要本发明所涉及的微生物可生成目标物质，则培养或反应的条件并无限定，作为目标物质，例如在生产L-亮氨酸或由其衍生的代谢产物的情况下，通常，步骤(I)优选为在微需氧条件或需氧条件下执行。在若干实施方式中，对于步骤(I)，以所述规定的培养基或反应介质的溶解氧浓度(DO)成为约0ppm～约60ppm、优选为约0ppm～约40ppm、例如约0ppm～约8.0ppm的范围的方式执行步骤(I)。在其他实施方式中，可以所述溶解氧浓度(DO)成为约0ppm～约2ppm、优选为约0ppm～约1ppm、更优选为0ppm～0.5ppm的范围的方式执行步骤(I)。进而，在特定的实施方式中，以ORP(Oxidation-ReductionPotential，氧化-还原电位)成为约-500mV～约700mV、约-500mV～约550mV、约-400mV～约500mV、约-400mV～约400mV、约-350mV～约350mV、约-300mV～约300mV、约-250mV～约200mV、或约-250mV～约100mV的范围的方式执行步骤(I)。通常，在利用棒状型细菌等能够高密度地培养的微生物的情况下，若在伴有利用大气的通气、搅拌的微需氧或需氧条件下进行步骤(I)，则在培养或反应开始后，培养基或反应介质的DO及ORP随着微生物的增殖而降低，在充分增殖后，DO值几乎为零，ORP值降低至约-300mV～约-200mV的范围。其中，根据所利用的微生物的种类或性质、全期搅拌等各种条件，也有时DO不为零，本发明不受所述数值范围的限定。
在特定的实施方式中，目标物质为(2S)-2-异丙基苹果酸酯、2-异丙基苹果酸酯、(2R,3S)-3-异丙基苹果酸酯、(2S)-2-异丙基-3-氧代琥珀酸酯、4-甲基-2-氧代戊酸酯或L-亮氨酸或在生物合成路径上经由这些化合物的代谢产物。如图1所示，(2S)-2-异丙基苹果酸酯至L-亮氨酸为止的所述化合物为微生物可具有的L-亮氨酸生物合成路径中的代谢物。如图1中所说明的那样，因所述L-亮氨酸生物合成路径中的最终产物即L-亮氨酸而会反馈抑制可对3-甲基-2-氧代丁酸酯+乙酰辅酶A+H2O＝(2S)-2-异丙基苹果酸酯+辅酶A+H+的反应式所表示的反应进行催化的野生型IPMS的活性，但本发明中，在野生型IPMS的基础上/代替野生型IPMS，采用具有L-亮氨酸反馈抑制抗性的修饰型α-异丙基苹果酸合酶作为构成要素，因此可以高的产率与生产性来生产目标物质。
在本发明所涉及的生产目标物质的方法中，作为回收步骤(I)中生成的标的物质(例如L-亮氨酸或由其衍生的下游代谢产物)的方法，并无特别限定，可根据培养、反应方法，使用本领域中已知的适宜的方法从微生物或者培养基或反应介质中回收目标物质(e.g.L-亮氨酸或其前体、派生物或衍生物)。例如，可使用离心分离、过滤、阴离子交换色谱法、结晶化、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)等，并使用本领域中已知的适宜的方法从微生物或者培养基或反应介质中回收所述目标物质。另外，所述(II)所涉及的回收步骤包括回收包含所述目标物质的馏分或粗生成物的步骤，在特定的实施方式中，也可还包括通过一种或多种方法对所述目标物质进行精制的步骤。
实施例
以下，列举实施例来更详细地说明本申请。然而，这些实施例是用于例示性地说明本申请的例子，本申请并不限定于这些实施例。
(1)表达质粒载体的制作
获取棒状型细菌的IPMS基因氨基酸序列(UniprotKB：P42455)，通过人工基因合成来合成包含对5'末端及3'末端附加限制性内切酶NdeI及BamHI识别序列而得的碱基序列的DNA。将利用NdeI及BamHI切断所述DNA而得的DNA片段与利用相同的限制性内切酶切断作为表达载体的pGE409(WO2020090016A1)而得的片段混合，利用T4DNA连接酶(NEB)连接(ligation)。将所获得的质粒命名为pGE1835。
(2)变异导入
使用规定的各种引物对，通过与WO2019156152A1中所记载的方法相同的方法，以pGE1835为模板进行变异导入，获取下述表2所示的变异导入质粒。
[表2]
| 质粒名 | 变异 |
| pGE1925 | G530D |
| pGE1926 | G532D |
| pGE1927 | A535T |
| pGE1996 | G530D/G532D |
| pGE1995 | G530D/A535T |
| pGE1978 | G532D/A535T |
| pGE1881 | G530D/G532D/A535T |
(3)变异导入2(以三重变异体为基础的各残基的允许性评价)
使用规定的各种引物对，通过与WO2019156152A1中记载的方法相同的方法，以pGE1881为模板进行变异导入。
(4)ΔleuA株的制备
谷氨酸棒状杆菌的染色体基因重组是利用WO2019156152A1中记载的方法来进行。
关于染色体基因重组用质粒，使用规定的各种引物对，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模型进行PCR，使用融合HD克隆套组(In-Fusion HD CloningKit)将利用KpnI及BamHI切断的pGE209(WO2019156152A1)的DNA片段连结成环状，由此获取质粒载体pGE1781。
通过电穿孔(electroporation)将pGE1781导入至谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株，通过WO2019156152A1中记载的无标记基因重组法制作ΔleuA株。
(5)IPMS变异体过度表达株
在ΔleuA株中电穿孔表3、表4中记载的各表达质粒，利用卡那霉素(Kanamycin)进行筛选，获得变异型IPMS的过度表达株。
(6)培养
对所获得的形质转换体在A琼脂培养基(WO2020090016A1)中进行画线培养，在33℃下培养24小时，将增殖的菌体以OD610＝0.2的方式植菌至加入有25μg/mL Km的生产培养基10mL中，在33℃、200rpm下进行24小时振荡培养。培养结束后，对培养液进行离心分离而分离出上清液与颗粒，上清液中的L-亮氨酸的浓度是通过高效液相色谱法依照(WO2020090016A1)中记载的方法来分析。使颗粒在破碎用缓冲液(50mM Tris(7.5)，100mMKCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸钠(sodium ethylene diamine tetraacetic acid))中悬浮，并依照(WO2020090016A1)中记载的方法利用珠粒缓冲器(beads shocker)使细胞破碎。细胞破碎液的蛋白质浓度是依照布拉德福德(Bradford)法来定量。关于细胞破碎液中的异丙基苹果酸合成酶的酶活性，对100mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mM 4-PDS(4,4'-Dithiodipyridine(4,4'-二硫二吡啶))、2mM Acetyl-CoA(乙酰-辅酶A)、2mM 3-甲基-2-氧代丁酸混合细胞破碎液，游离的CoA与4-PDS反应而生成4-硫吡啶(4-thiopyridine)，测定因此而引起的324nm的吸光度变化。为了测定由L-亮氨酸引起的反馈抑制，而在反应液中添加10mM的L-亮氨酸。
＜生产培养基＞
葡萄糖40g、(NH4)2SO4 20g、脲5g、KH2PO4 1g、K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.25g、MOPS42g、CaCl2 10mg、FeSO4·7H2O 10mg、MnSO4·H2O 10mg、ZnSO4·7H2O 1mg、CuSO4 0.2mg、NiCl2·6H2O 0.02mg、生物素0.2mg、硫胺素盐酸盐0.2mg、原儿茶酸(protocatechuic acid，PCA)30mg/L、pH 7.4
(7)变异体的性能试验1
使用通过向ΔleuA株导入质粒而过度表达野生型及变异型的IPMS的菌株，比较L-亮氨酸的生产、IPMS的活性及L-亮氨酸存在下的IPMS的残存活性。
如表3所示，在棒状型细菌具有的IPMS中，也可通过向亮氨酸结合部位周边的残基导入变异，获取在保持L-亮氨酸生产能力的同时、获得了对L-亮氨酸而言的反馈抑制抗性的变异型IPMS。然而，制作将这些变异分别组合而得的双重变异体，结果，虽然对L-亮氨酸而言的反馈抑制抗性高，但L-亮氨酸生产量及IPMS活性大幅降低。进而，制作导入了所有三种变异的三重变异体，结果，意外地维持了高的IPMS活性与对L-亮氨酸而言的反馈抑制抗性，与单重变异体相比也观察到显著的L-亮氨酸生产量的增加。
[表3]
(8)变异体的性能试验2
关于三重变异体的各自的残基，为了验证在向其他氨基酸残基的变异的情况下是否也可获得相同的效果，而将各残基取代为不同的氨基酸残基，使用向ΔleuA株导入了质粒的过度表达株，比较L-亮氨酸的生产、IPMS的活性及L-亮氨酸存在下的IPMS的残存活性。将其结果示于表4中。
在所有的变异体中，均维持了高的L-亮氨酸反馈抑制抗性，但L-亮氨酸生产量与IPMS活性因变异型而大不相同，得知，并不是只要获得对反馈抑制有抗性的酶便可获得高的L-亮氨酸生产性。
与野生型酶相比，通过G530D、G530E、G530K、G530A、G530V、G530N、G530C、G530P、G530R、G530L、G530I、G530T、G530H、G532D、G532A、G532V、G532P、G532L、G532I、G532T、G532H、A535T、A535S、A535V、A535K、A535D、A535F、A535G、A535L、A535I、A535H各自的位置处的变异的组合，可期待对L-亮氨酸生产量的增加有效的IPMS的性能提高。
[表4]
产业上的可利用性
本发明在各种化学物质的工业生产领域中具有高的产业上的可利用性。
序列表
<110> 绿色地球研究所株式会社
伊藤忠富隆达化工株式会社
<120> 修饰型α-异丙基苹果酸合酶
<130> PC000974Y
<150> JP 2021-054521
<151> 2021-03-29
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1951
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221> CDS
<222> (50)..(1900)
<223> leuA (α-异丙基苹果酸合酶编码区)
<400> 1
tgttgccggt cgtggaccca cccaaaactt tttaagaagg ttgaacaca atg tct cct 58
Met Ser Pro
1
aac gat gca ttc atc tcc gca cct gcc aag atc gaa acc cca gtt ggg 106
Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr Pro Val Gly
5 10 15
cct cgc aac gaa ggc cag cca gca tgg aat aag cag cgt ggc tcc tca 154
Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg Gly Ser Ser
20 25 30 35
atg cca gtt aac cgc tac atg cct ttc gag gtt gag gta gaa gat att 202
Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val Glu Asp Ile
40 45 50
tct ctg ccg gac cgc act tgg cca gat aaa aaa atc acc gtt gca cct 250
Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr Val Ala Pro
55 60 65
cag tgg tgt gct gtt gac ctg cgt gac ggc aac cag gct ctg att gat 298
Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala Leu Ile Asp
70 75 80
ccg atg tct cct gag cgt aag cgc cgc atg ttt gag ctg ctg gtt cag 346
Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu Leu Val Gln
85 90 95
atg ggc ttc aaa gaa atc gag gtc ggt ttc cct tca gct tcc cag act 394
Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala Ser Gln Thr
100 105 110 115
gat ttt gat ttc gtt cgt gag atc atc gaa aag ggc atg atc cct gac 442
Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met Ile Pro Asp
120 125 130
gat gtc acc att cag gtt ctg gtt cag gct cgt gag cac ctg att cgc 490
Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His Leu Ile Arg
135 140 145
cgt act ttt gaa gct tgc gaa ggc gca aaa aac gtt atc gtg cac ttc 538
Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile Val His Phe
150 155 160
tac aac tcc acc tcc atc ctg cag cgc aac gtg gtg ttc cgc atg gac 586
Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe Arg Met Asp
165 170 175
aag gtg cag gtg aag aag ctg gct acc gat gcc gct gaa cta atc aag 634
Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu Leu Ile Lys
180 185 190 195
acc atc gct cag gat tac cca gac acc aac tgg cgc tgg cag tac tcc 682
Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp Gln Tyr Ser
200 205 210
cct gag tcc ttc acc ggc act gag gtt gag tac gcc aag gaa gtt gtg 730
Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys Glu Val Val
215 220 225
gac gca gtt gtt gag gtc atg gat cca act cct gag aac cca atg atc 778
Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn Pro Met Ile
230 235 240
atc aac ctg cct tcc acc gtt gag atg atc acc cct aac gtt tac gca 826
Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn Val Tyr Ala
245 250 255
gac tcc att gaa tgg atg cac cgc aat cta aac cgt cgt gat tcc att 874
Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg Asp Ser Ile
260 265 270 275
atc ctg tcc ctg cac ccg cac aat gac cgt ggc acc ggc gtt ggc gca 922
Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly Val Gly Ala
280 285 290
gct gag ctg ggc tac atg gct ggc gct gac cgc atc gaa ggc tgc ctg 970
Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu Gly Cys Leu
295 300 305
ttc ggc aac ggc gag cgc acc ggc aac gtc tgc ctg gtc acc ctg gca 1018
Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val Thr Leu Ala
310 315 320
ctg aac atg ctg acc cag ggc gtt gac cct cag ctg gac ttc acc gat 1066
Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp Phe Thr Asp
325 330 335
ata cgc cag atc cgc agc acc gtt gaa tac tgc aac cag ctg cgc gtt 1114
Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln Leu Arg Val
340 345 350 355
cct gag cgc cac cca tac ggc ggt gac ctg gtc ttc acc gct ttc tcc 1162
Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr Ala Phe Ser
360 365 370
ggt tcc cac cag gac gct gtg aac aag ggt ctg gac gcc atg gct gcc 1210
Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala Met Ala Ala
375 380 385
aag gtt cag cca ggt gct agc tcc act gaa gtt tct tgg gag cag ctg 1258
Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp Glu Gln Leu
390 395 400
cgc gac acc gaa tgg gag gtt cct tac ctg cct atc gat cca aag gat 1306
Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp Pro Lys Asp
405 410 415
gtc ggt cgc gac tac gag gct gtt atc cgc gtg aac tcc cag tcc ggc 1354
Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser Gln Ser Gly
420 425 430 435
aag ggc ggc gtt gct tac atc atg aag acc gat cac ggt ctg cag atc 1402
Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly Leu Gln Ile
440 445 450
cct cgc tcc atg cag gtt gag ttc tcc acc gtt gtc cag aac gtc acc 1450
Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln Asn Val Thr
455 460 465
gac gct gag ggc ggc gag gtc aac tcc aag gca atg tgg gat atc ttc 1498
Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp Asp Ile Phe
470 475 480
gcc acc gag tac ctg gag cgc acc gca cca gtt gag cag atc gcg ctg 1546
Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln Ile Ala Leu
485 490 495
cgc gtc gag aac gct cag acc gaa aac gag gat gca tcc atc acc gcc 1594
Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser Ile Thr Ala
500 505 510 515
gag ctc atc cac aac ggc aag gac gtc acc gtc gat ggc cgc ggc aac 1642
Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly Arg Gly Asn
520 525 530
ggc cca ctg gcc gct tac gcc aac gcg ctg gag aag ctg ggc atc gac 1690
Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu Gly Ile Asp
535 540 545
gtt gag atc cag gaa tac aac cag cac gcc cgc acc tcg ggc gac gat 1738
Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser Gly Asp Asp
550 555 560
gca gaa gca gcc gcc tac gtg ctg gct gag gtc aac ggc cgc aag gtc 1786
Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly Arg Lys Val
565 570 575
tgg ggc gtc ggc atc gct ggc tcc atc acc tac gct tcg ctg aag gca 1834
Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser Leu Lys Ala
580 585 590 595
gtg acc tcc gcc gta aac cgc gcg ctg gac gtc aac cac gag gca gtc 1882
Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His Glu Ala Val
600 605 610
ctg gct ggc ggc gtt taa gctttacgac gcctccccct aggctctaca 1930
Leu Ala Gly Gly Val
615
aaccggtggc aagaattcca c 1951
<210> 2
<211> 616
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr
1 5 10 15
Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg
20 25 30
Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val
35 40 45
Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr
50 55 60
Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala
65 70 75 80
Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu
85 90 95
Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala
100 105 110
Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met
115 120 125
Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His
130 135 140
Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile
145 150 155 160
Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe
165 170 175
Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Ile Lys Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp
195 200 205
Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys
210 215 220
Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn
225 230 235 240
Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn
245 250 255
Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg
260 265 270
Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly
275 280 285
Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu
290 295 300
Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val
305 310 315 320
Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp
325 330 335
Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln
340 345 350
Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr
355 360 365
Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala
370 375 380
Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp
385 390 395 400
Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser
420 425 430
Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly
435 440 445
Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln
450 455 460
Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp
465 470 475 480
Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln
485 490 495
Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser
500 505 510
Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly
515 520 525
Arg Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu
530 535 540
Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser
545 550 555 560
Gly Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly
565 570 575
Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser
580 585 590
Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His
595 600 605
Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val
610 615
Claims (23)
1.一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由下述(A)～(C)的任一者规定的氨基酸序列，且与包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质相比，降低了L-亮氨酸反馈抑制：
(A)在序列号2所示的氨基酸序列中，具有选自下述(a)～(c)中的至少两种取代的氨基酸序列；
(B)相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有60％以上的序列同一性，且包含选自下述(a)～(c)中的至少两种取代的氨基酸序列；
(C)在序列号2所示的氨基酸序列中，包含选自下述(a)～(c)中的至少两种取代，且在除了存在所述至少两种取代的部位以外的部位缺失、取代、插入或附加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，
(a)第530位的甘氨酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代、
(b)第532位的甘氨酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代、及
(c)第535位的丙氨酸残基向丙氨酸残基以外的氨基酸残基的取代。
2.根据权利要求1所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(B)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有84％以上的序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(B)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(a)～(c)中规定的所有取代。
5.根据权利要求4所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
6.一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，与对应的野生型2-异丙基苹果酸合酶相比，具有降低L-亮氨酸反馈抑制的至少一种氨基酸变异，
所述至少一种氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准而包含选自下述(a')～(c')中的至少两种取代：
(a')与第530位的甘氨酸残基相当的氨基酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代；
(b')与第532位的甘氨酸残基相当的氨基酸残基向甘氨酸残基以外的氨基酸残基的取代；及
(c')与第535位的丙氨酸残基相当的氨基酸残基向丙氨酸残基以外的氨基酸残基的取代。
7.根据权利要求6所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少一种氨基酸变异包含所述(a')～(c')中规定的所有取代。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含在源自棒状杆菌属细菌的野生型2-异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列中具有所述至少两种取代的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少两种取代是选自下述(d)～(f)中的至少两种取代：
(d)第530位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基、谷氨酸残基、赖氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、谷氨酰胺残基、半胱氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苏氨酸残基或组氨酸残基的取代；
(e)第532位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、脯氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苏氨酸残基或组氨酸残基的取代；及
(f)第535位的丙氨酸残基或与所述丙氨酸残基相当的氨基酸残基向苏氨酸残基、丝氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、天冬氨酸残基、苯基丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基或组氨酸残基的取代。
10.根据权利要求9所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(d)～(f)中规定的所有取代。
11.根据权利要求10所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少两种取代是选自下述(g)～(j)中的至少两种取代：
(g)第530位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基的取代；
(h)第532位的甘氨酸残基或与所述甘氨酸残基相当的氨基酸残基向天冬氨酸残基的取代；及
(j)第535位的丙氨酸残基或与所述丙氨酸残基相当的氨基酸残基向苏氨酸残基、缬氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基或异亮氨酸残基的取代。
13.根据权利要求12所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(g)～(j)中规定的所有取代。
14.根据权利要求13所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
15.一种多核苷酸，对如权利要求1至14中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶进行编码。
16.一种微生物，导入了如权利要求15所述的多核苷酸。
17.一种微生物，包含如权利要求1至14中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶。
18.根据权利要求16或17所述的微生物，为棒状型细菌。
19.根据权利要求18所述的微生物，为谷氨酸棒状杆菌。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的微生物，其中野生型α-异丙基苹果酸合酶活性经降低或经灭活。
21.一种生产目标物质的方法，包括：
(I)通过在规定的培养基或反应介质中对如权利要求16至20中任一项所述的微生物进行培养或使其反应而产生目标物质；以及
(II)回收所述目标物质。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述目标物质为(2S)-2-异丙基苹果酸酯、2-异丙基苹果酸酯、(2R,3S)-3-异丙基苹果酸酯、(2S)-2-异丙基-3-氧代琥珀酸酯、4-甲基-2-氧代戊酸酯或L-亮氨酸或在生物合成路径上经由这些化合物的代谢产物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述目标物质为L-亮氨酸或由其衍生的代谢产物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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