JP2024075803A - 改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｌ－ロイシンやその派生物質の優れた生産能を各種微生物に付与できる新規ＩＰＭＳ変異体を提供すること。【解決手段】下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を有してなるアミノ酸配列を含み、かつ野生型α－イソプロピルマレートシンターゼと比較して、Ｌ－ロイシンフィードバック阻害が低減された改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。（ａ）第５３０番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、（ｂ）第５３２番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、及び（ｃ）第５３５番目のアラニン残基のアラニン残基以外のアミノ酸残基への置換。【選択図】なし
Description
本発明は、ロイシンによるフィードバック阻害が低減された改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ、該改変型α－イソプロピルマレートシンターゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変微生物、並びに該遺伝子改変微生物を用いて所定の目的物質を生産する方法に関する。
Ｌ－ロイシンは、必須アミノ酸の一種であって、医薬、食品、飼料添加物、工業薬品などに広範囲に用いられる高価なアミノ酸であり、主に微生物を用いて生産される。具体的には、Ｌ－ロイシンを含む分枝鎖アミノ酸の発酵生産は、主にエシェリキア属微生物又はコリネバクテリウム属微生物を利用して行われている。ピルビン酸を起点に各種段階を経て２－ケトイソカプロン酸が前駆体として生合成されることが知られている。このようなＬ－ロイシン生合成の経路においては、α－イソプロピルマレートシンターゼ（又はα－イソプロピルリンゴ酸シンターゼ；以下、「ＩＰＭＳ」と言うことがある。）が主要な役割を担っており、各種の生物種から該酵素をコードする遺伝子が単離されており、さらに多くの生物種において当該遺伝子のヌクレオチド配列並びに酵素タンパク質のアミノ酸配列も決定されている。
ところで、Ｌ－ロイシン生合成経路において、ＩＰＭＳが重要な役割を担っているものの、その酵素活性が、生成された最終産物であるＬ－ロイシンによって阻害されてしまうフィードバック阻害がしばしば生じ得ることが知られており、従来から、このようなフィードバック阻害が、微生物を利用したＬ－ロイシンの工業生産において問題となっており、この問題を解決し得る各種技術が開発されている。
例えば、特許文献１には、Ｌ－ロイシン生産能を有し、かつＬ－ロイシンによる阻害が解除されたα－イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードするＤＮＡにより形質転換された微生物、及びこれを用いたＬ－ロイシンの製造方法が開示されている。特許文献１に記載の技術において、「Ｌ－ロイシンによる阻害が解除されたα－イソプロピルリンゴ酸シンターゼ」とは、Ｌ－ロイシン生産能を有するエシェリキア・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ）の変異株からクローニングした変異型ｌｅｕＡ遺伝子にコードされる変異型ＩＰＭＳであり、該変異型ＩＰＭＳは、対応する野生型ＩＰＭＳに対して所定のアミノ酸置換を有することを特徴としている。特許文献１には、実際に、所定のエシェリキア・コリ菌株をいくつかの変異型ＩＰＭＳコード核酸で形質転換することによりＬ－ロイシン生産株を取得し、得られた各Ｌ－ロイシン生産株について、ＩＰＭＳの比活性及びＬ－ロイシンによるフィードバック阻害の程度並びにＬ－ロイシンの生産能について評価した結果が記載されている。
更に、特許文献２には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＬｅｕＡ遺伝子にコードされる野生型ＩＰＭＳのアミノ酸配列に対し、第５５３番目のチロシン残基がアスパラギン酸に変異した変異型ＩＰＭＳ、これをコードするヌクレオチド、及び該ヌクレオチドが導入された微生物を利用したＬ－ロイシン又はケトイソカプロエート（ＫＩＣ）を製造するための発酵法なる技術が開示されており、上記変異型ＩＰＭＳは、Ｌ－ロイシン等による酵素活性のフィードバック阻害が低減されたものであることが言及されている。より詳細には、特許文献２では、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株に上記変異型ＩＰＭＳをコードする遺伝子（変異型ｌｅｕＡ遺伝子）が導入された遺伝子組換え菌株を作製し、該遺伝子組換え菌株について、野生型ＡＴＣＣ１３０３２株をコントロールとして用いてＫＩＣ及びＬ－ロイシンの製造試験を行ったところ、野生型ＡＴＣＣ１３０３２株に対し、上記遺伝子組み換え菌株には、これら物質の生産能が付与されることが確認されている。
更に、特許文献３にも、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＬｅｕＡ遺伝子にコードされるＩＰＭＳに対し、所定のアミノ酸置換を有する変異型ＩＰＭＳ、これをコードする核酸が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム組み換え菌株、並びに該組換え菌株を用いたＬ－ロイシンの製造方法が開示されている。特許文献３には、上記変異型ＩＰＭＳが保有するアミノ酸置換は、同文献において基準とされるＩＰＭＳのアミノ酸配列において、第４９４番目のアルギニンがヒスチジンに置換され、第４９７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、かつ第４９９番目のロイシンがバリンに置換されたものであることが記載されているものと思料される。しかしながら、コリネバクテリウム・グルタミカムが保有する野生型ＩＰＭＳ（ＬｅｕＡ遺伝子タンパク質）のアミノ酸配列においては、第４９４番目、第４９７番目及び第４９９番目の各アミノ酸は、特許文献３で言及される置換前の各アミノ酸と相違しており、特許文献３は、中国語による文献であるところ、その開示内容は不明な点が多い。
更に、特許文献４には、ＩＰＭＳ活性を有する新規変異型ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドを含む微生物、及び該微生物を培養してＬ－ロイシンを生産する方法が開示されている。特許文献４において、「ＩＰＭＳ活性を有する新規変異型ポリペプチド」とは、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＬｅｕＡ遺伝子にコードされる野生型ＩＰＭＳアミノ酸配列において、第５５８番目のアルギニン残基がアルギニン以外の他のアミノ酸残基に置換され又は第５６１番目のグリシン（残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換された、ＩＰＭＳ活性を有する変異型ポリペプチドとして規定されている。特許文献４において、実際に作製されたＩＰＭＳ変異体並びに該ＩＰＭＳ変異体が導入された菌株は、Ｒ５５８Ｈ、Ｒ５５８Ａ、Ｒ５５８Ｑ、Ｇ５６１Ｄ、Ｇ５６１Ｒ、Ｇ５６１Ｙの各アミノ酸置換をそれぞれ保有するＩＰＭＳ変異体、並びにＲ５５Ｈ及びＧ５６１Ｄの組み合わせによるアミノ酸置換を保有するＩＰＭＳ変異体と、これら変異体がそれぞれ導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム組換え菌株であり、これらの組換え菌株は、野生株に対してＬ－ロイシンの生産能が向上していることが確認されている。
本発明の目的は、Ｌ－ロイシンやその派生物質の優れた生産能を各種微生物に付与できる新規ＩＰＭＳ変異体を提供することにある。
上記を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｌ－ロイシンに対するフィードバック阻害に耐性を持つＩＰＭＳの複数の独立した変異を適切に組み合わせることで、単独の変異では得られなかった顕著なＬ－ロイシン生産性の増加が観察され、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の態様によれば、以下が提供される。
［１］下記の（Ａ）～（Ｃ）の何れかに規定されるアミノ酸配列を含み、かつ表１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と比較して、Ｌ－ロイシンフィードバック阻害が低減された改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（Ａ）表１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を有してなるアミノ酸配列；
（Ｂ）表１に示すアミノ酸配列に対し６０％以上の配列同一性を有し、かつ下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を含む、アミノ酸配列；
（Ｃ）表１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を含み、かつ該少なくとも２つの置換が位置する部位を除く部位に１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ａ）第５３０番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、
（ｂ）第５３２番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、及び
（ｃ）第５３５番目のアラニン残基のアラニン残基以外のアミノ酸残基への置換。
［１］下記の（Ａ）～（Ｃ）の何れかに規定されるアミノ酸配列を含み、かつ表１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と比較して、Ｌ－ロイシンフィードバック阻害が低減された改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（Ａ）表１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を有してなるアミノ酸配列；
（Ｂ）表１に示すアミノ酸配列に対し６０％以上の配列同一性を有し、かつ下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を含む、アミノ酸配列；
（Ｃ）表１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を含み、かつ該少なくとも２つの置換が位置する部位を除く部位に１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ａ）第５３０番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、
（ｂ）第５３２番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、及び
（ｃ）第５３５番目のアラニン残基のアラニン残基以外のアミノ酸残基への置換。
［２］上記（Ｂ）に規定のアミノ酸配列は、表１に示すアミノ酸配列に対し８４％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列である、［１］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［３］上記（Ｂ）に規定のアミノ酸配列は、表１に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［４］上記（ａ）～（ｃ）に規定の置換全てを含む、［１］～［３］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［５］上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［３］上記（Ｂ）に規定のアミノ酸配列は、表１に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［４］上記（ａ）～（ｃ）に規定の置換全てを含む、［１］～［３］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［５］上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［６］対応する野生型２－イソプロピルマレートシンターゼと比較して、Ｌ－ロイシンフィードバック阻害を低減する少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、
上記少なくとも１つのアミノ酸変異が、表１に示すアミノ酸配列を基準として、下記の（ａ’）～（ｃ’）から選択される少なくとも２つの置換を含む、改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ａ’）第５３０番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（ｂ’）第５３２番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換；及び
（ｃ’）第５３５番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基のアラニン残基以外のアミノ酸残基への置換。
上記少なくとも１つのアミノ酸変異が、表１に示すアミノ酸配列を基準として、下記の（ａ’）～（ｃ’）から選択される少なくとも２つの置換を含む、改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ａ’）第５３０番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（ｂ’）第５３２番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換；及び
（ｃ’）第５３５番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基のアラニン残基以外のアミノ酸残基への置換。
［７］上記少なくとも１つのアミノ酸変異が、上記（ａ’）～（ｃ’）に規定の置換全てを含む、［６］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［８］コリネバクテリウム属細菌に由来する野生型２－イソプロピルマレートシンターゼのアミノ酸配列において上記少なくとも２つの置換を有してなるアミノ酸配列を含む、［１］～［７］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［８］コリネバクテリウム属細菌に由来する野生型２－イソプロピルマレートシンターゼのアミノ酸配列において上記少なくとも２つの置換を有してなるアミノ酸配列を含む、［１］～［７］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［９］上記少なくとも２つの置換が、下記の（ｄ）～（ｆ）から選択される少なくとも２つの置換である、［１］～［８］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ｄ）第５３０番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、グルタミン残基、システイン残基、プロリン残基、アルギニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、スレオニン残基又はヒスチジン残基への置換；
（ｅ）第５３２番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、スレオニン残基又はヒスチジン残基への置換；及び
（ｆ）第５３５番目のアラニン残基又は当該アラニン残基に相当するアミノ酸残基のスレオニン残基、セリン残基、バリン残基、リジン残基、アスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基又はヒスチジン残基への置換。
（ｄ）第５３０番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、グルタミン残基、システイン残基、プロリン残基、アルギニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、スレオニン残基又はヒスチジン残基への置換；
（ｅ）第５３２番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、スレオニン残基又はヒスチジン残基への置換；及び
（ｆ）第５３５番目のアラニン残基又は当該アラニン残基に相当するアミノ酸残基のスレオニン残基、セリン残基、バリン残基、リジン残基、アスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基又はヒスチジン残基への置換。
［１０］上記（ｄ）～（ｆ）に規定の置換全てを含む、［９］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［１１］上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、［１０］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［１２］上記少なくとも２つの置換が、下記の（ｇ）～（ｊ）から選択される少なくとも２つの置換である、［１］～［１１］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ｇ）第５３０番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換；
（ｈ）第５３２番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換；及び
（ｊ）第５３５番目のアラニン残基又は当該アラニン残基に相当するアミノ酸残基のスレオニン残基、バリン残基、グリシン残基、ロイシン残基又はイソロイシン残基への置換。
［１１］上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、［１０］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［１２］上記少なくとも２つの置換が、下記の（ｇ）～（ｊ）から選択される少なくとも２つの置換である、［１］～［１１］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ｇ）第５３０番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換；
（ｈ）第５３２番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換；及び
（ｊ）第５３５番目のアラニン残基又は当該アラニン残基に相当するアミノ酸残基のスレオニン残基、バリン残基、グリシン残基、ロイシン残基又はイソロイシン残基への置換。
［１３］上記（ｇ）～（ｊ）に規定の置換全てを含む、［１２］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［１４］上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、［１３］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［１５］［１］～［１４］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
［１４］上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、［１３］に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
［１５］［１］～［１４］の何れか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
［１６］［１５］に記載のポリヌクレオチドが導入された、微生物。
［１７］［１］～［１４］のいずれか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼを含む、微生物。
［１８］コリネ型細菌である、［１６］又は［１７］に記載の微生物。
［１９］コリネバクテリウム・グルタミカムである、［１８］に記載の微生物。
［１７］［１］～［１４］のいずれか１つに記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼを含む、微生物。
［１８］コリネ型細菌である、［１６］又は［１７］に記載の微生物。
［１９］コリネバクテリウム・グルタミカムである、［１８］に記載の微生物。
［２０］（Ｉ）［１６］～［１９］の何れか１つに記載の微生物を所定の培地又は反応媒体で培養又は反応せしめることにより目的物質を産生すること；並びに
（ＩＩ）該目的物質を回収すること、
を含む、目的物質を生産する方法。
（ＩＩ）該目的物質を回収すること、
を含む、目的物質を生産する方法。
［２１］上記目的物質が、（２Ｓ）－２－イソプロピルマレート、２－イソプロピルマレート、（２Ｒ，３Ｓ）－３－イソプロピルマレート、（２Ｓ）－２－イソプロピル－３－オクソサクシネートマレート、４－メチル－２－オクソペンタノエート若しくはＬ－ロイシン又は生合成経路上これらの化合物を経由する代謝産物である、［２０］に記載の方法。
［２２］上記目的物質が、Ｌ－ロイシン又はこれから誘導される代謝産物である、［２０］又は［２１］に記載の方法。
本発明によれば、フィードバック阻害に高い耐性を持つＩＰＭＳ変異体を利用することができ、それを用いてＬ－ロイシンやその前駆体を含む派生物を高い収率と生産性をもって生産することができる。
本発明の一態様は、ＩＰＭＳ活性を有する新規変異型ポリペプチドである。前記新規変異型ポリペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５３０番目、５３２番目、５３５番目のアミノ酸であるグリシン、グリシン、アラニンをそれぞれ別のアミノ酸残基に置換されている。前記変異型ポリペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のＩＰＭＳ活性を有するポリペプチドに比べて、フィードバック阻害に高い耐性を持つことを特徴とする。
ここで、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のアミノ酸配列を、下記の表１に示す。
本発明における「フィードバック阻害」とは、代謝系の最終産物が阻害剤となり、その代謝系の初期段階での反応を阻害することを意味する。本発明においては、Ｌ－ロイシン又はその誘導体がその生合成経路の第１段階を媒介するＩＰＭＳの活性を阻害することを意味するが、構造が似ていれば程度の差こそあれ阻害活性を示すことが広く知られているため、阻害剤はこれらに限定されるものではない。ＩＰＭＳのフィードバック阻害を解除すると、そうでないものに比べてＬ－ロイシンの生産性を向上させることができる。
本発明において「フィードバック阻害に高い耐性を持つ」とは、高濃度の阻害剤存在下においても、酵素活性を阻害されることなく維持することを意味する。フィードバック阻害への耐性は、阻害剤存在下におけるＩＰＭＳ活性を阻害剤非存在下における活性と比較することによって評価できる。
本発明におけるＩＰＭＳとは、２－ケトイソ吉草酸（２－ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）をアセチルＣｏＡと反応させてＬ－ロイシンの前駆体の１つであるイソプロピルリンゴ酸（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ）に変換する酵素である。本発明におけるＩＰＭＳは、前記変換活性を有する酵素であればいかなる生物由来であってもよいが、コリネ型細菌に由来する酵素であることが好ましい。さらに好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＩＰＭＳであってもよく、具体的にはＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、前記ＩＰＭＳは、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。例えば、このような相同性を有し、ＩＰＭＳに相応する効果を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。また、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５以外のアミノ酸配列を用いる場合は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５とアラインメントすることにより変異を入れるべき相同なアミノ酸残基を推定することができる。アラインメントには一般的なプログラムを利用することができ、例えば、ＣｌｕｓｔａｌやＢＬＡＳＴが挙げられる。アラインメントは立体構造の重ね合わせでもよく、そのために例えば、ＰｙＭＯＬなどの分子グラフィクスツールを利用することができる。
ることによって評価できる。
ることによって評価できる。
本発明において「コリネ型細菌」とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８巻，ｐ．５９９、１９７４年）に定義されている一群の微生物を指す。
より詳細には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌等が挙げられる。
さらに詳細には、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載された定義を参照することができる。
より詳細には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌等が挙げられる。
さらに詳細には、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載された定義を参照することができる。
本発明における「変異」、「変異型」又は「変異体」とは、ある遺伝子の塩基配列が変化し、それに伴いアミノ酸の配列が変化した遺伝子、ポリペプチド、酵素、又はそれらを持つ微生物を指す。ＩＰＭＳの変異体あるいは変異型ＩＰＭＳとは、ＩＰＭＳのアミノ酸配列が野生型と比べて１アミノ酸以上変化したものであり、活性やＬ－ロイシン及びその誘導体に対するフィードバック阻害の程度が変化した変異体を意味する。
具体的には、本発明のＩＰＭＳ活性を有する変異型ポリペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から５３０番目、５３２番目、５３５番目のアミノ酸であるグリシン、グリシン、アラニンがそれぞれ別のアミノ酸残基に置換されている。前記別のアミノ酸残基とは、２０種類の標準アミノ酸から野生型ＩＰＭＳにおける変異前のアミノ酸残基を除いた１９種類から選ばれる１つのアミノ酸残基を指す。
また、前記変異型ポリペプチドには、表１に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するポリペプチドが含まれてもよい。例えば、このような相同性を有し、ＩＰＭＳに相応する効果を示すアミノ酸配列であれば、５３０、５３２、５３５番目の変異に加えて、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する酵素変異体も本発明に含まれる。また、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のＮ末端に一部のアミノ酸が付加又は欠損した場合に当該アミノ酸の数を考慮して算定されるものも本発明に含まれることは当業者にとって明らかである。
本発明の他の態様は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
前記ポリヌクレオチドは、該当する変異型ポリペプチドをコードする塩基配列であればどのような配列であってもよい。
前記ポリヌクレオチドは、該当する変異型ポリペプチドをコードする塩基配列であればどのような配列であってもよい。
変異導入前の野生型ｌｅｕＡ遺伝子のポリヌクレオチドは、ｌｅｕＡ遺伝子を有する生物から調製したゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した配列でもよいし、公知の遺伝子情報を元に設計した塩基配列を人工遺伝子合成してもよい。また、同じポリペプチドをコードする限りにおいてはコドンの組み合わせは何でもよく、コドン使用頻度や二次構造などを考慮して設計してもよい。
前記野生型ポリヌクレオチドに変異を導入する方法はｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を導入する方法は、変異を導入したプライマーを用いたＰＣＲによる方法や、エラープローンな条件でＰＣＲを行いランダムに変異を導入する方法などがあるが、これに限らない。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて変異を導入する方法は、培養の継代を繰り返して自然に突然変異を起こさせる方法や、紫外線やアルキル化剤などの変異原で処理する方法などがあるが、これに限らない。
本発明のさらに他の態様は、前記変異型ポリペプチドを含む、Ｌ－ロイシンやその前駆体を含む派生物生産能を有するコリネ型細菌を含む微生物である。前駆体にはイソプロピルリンゴ酸、２－ケトイソカプロン酸などの２－ケトイソ吉草酸以降のロイシン生合成経路における全ての中間体が該当する。さらに、派生物はＬ－ロイシンおよびその前駆体から生合成されうる全ての物質が該当する。これには例えば、２－ケトイソカプロン酸から派生する３－ヒドロキシイソ吉草酸、３－メチルブタノール、イソアミル酢酸などが考えられるが、これらに限定されるものではない。
本発明における前記微生物には、形質転換により人工的に製造されたものや、自然に発生したものが全て含まれる。
例えば、前記微生物は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物であってもよいが、様々な公知の方法により前記変異型ポリペプチドを発現する微生物が全て含まれる。
形質転換される遺伝子は、宿主細胞内で発現するものであれば、染色体内に挿入されていても、染色体外に位置していてもよい。また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ＤＮＡやＲＮＡが含まれ、宿主細胞内に導入されて発現するものであればいかなるものであってもよい。
本発明のさらに他の態様は、（ａ）前記Ｌ－ロイシンを生産するコリネ型細菌を培地で培養してＬ－ロイシンを生産するステップと、（ｂ）前記微生物又は培養培地からＬ－ロイシンを回収するステップとを含む、Ｌ－ロイシンを生産する方法である。
本発明における「培養」とは、前記微生物を好適に調節された環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記培養ステップで生成されたＬ－ロイシンを回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて微生物又は培地から目的とするＬ－ロイシンを収集することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－ロイシンを回収することができる。また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよい。
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）発現プラスミドベクターの作製
コリネ型細菌のＩＰＭＳ遺伝子アミノ酸配列（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５）を取得し、人工遺伝子合成により５’末端および３’末端に制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ認識配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡを合成した。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断して得たＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＧＥ４０９（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）を同様の制限酵素で切断した断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）でライゲーションした。得られたプラスミドをｐＧＥ１８３５と命名した。
コリネ型細菌のＩＰＭＳ遺伝子アミノ酸配列（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５）を取得し、人工遺伝子合成により５’末端および３’末端に制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ認識配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡを合成した。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断して得たＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＧＥ４０９（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）を同様の制限酵素で切断した断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）でライゲーションした。得られたプラスミドをｐＧＥ１８３５と命名した。
（２）変異導入
所定の各種プライマーペアを使用し、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載された方法と同様の方法によりｐＧＥ１８３５をテンプレートとして変異導入を行い、下記の表２に示す変異導入プラスミドを取得した。
所定の各種プライマーペアを使用し、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載された方法と同様の方法によりｐＧＥ１８３５をテンプレートとして変異導入を行い、下記の表２に示す変異導入プラスミドを取得した。
（３）変異導入２（３重変異体をベースとした各残基の許容性評価）
所定の各種プライマーペアを使用し、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載された方法と同様の方法によりｐＧＥ１８８１をテンプレートとして変異導入を行った。
所定の各種プライマーペアを使用し、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載された方法と同様の方法によりｐＧＥ１８８１をテンプレートとして変異導入を行った。
（４）ΔｌｅｕＡ株の作製
コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体遺伝子組み換えは、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載の方法で行った。
コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体遺伝子組み換えは、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載の方法で行った。
染色体遺伝子組み換え用プラスミドは、所定の各種プライマーペアーを用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＧＥ２０９（ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１）のＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて環状に連結させることにより、プラスミドベクターｐＧＥ１７８１を取得した。
ｐＧＥ１７８１をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株にエレクトロポレーションにより導入し、ＷＯ２０１９１５６１５２Ａ１に記載のマーカーレス遺伝子組み換え法によりΔｌｅｕＡ株を作製した。
（５）ＩＰＭＳ変異体過剰発現株
ΔｌｅｕＡ株に表３、４に記載の各発現プラスミドをエレクトロポレーションし、カナマイシンでセレクションすることで変異型ＩＰＭＳの過剰発現株を得た。
ΔｌｅｕＡ株に表３、４に記載の各発現プラスミドをエレクトロポレーションし、カナマイシンでセレクションすることで変異型ＩＰＭＳの過剰発現株を得た。
（６）培養
得られた形質転換体をＡ寒天培地（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）にストリークして３３℃で２４時間培養し、増殖した菌体を、２５μｇ／ｍＬ Ｋｍを加えた生産培地１０ｍＬにＯＤ６１０＝０．２になるように植菌し、３３℃，２００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後に、培養液を遠心分離して上清とペレットを分離し、上清中のＬ－ロイシンの濃度は高速液体クロマトグラフィーにより（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）に記載の方法に従って分析した。ペレットは破砕用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（７．５）， １００ ｍＭ ＫＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し、（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）に記載の方法に従いビーズショッカーで細胞を破砕した。細胞破砕液のタンパク質濃度はブラッドフォード法に従って定量した。細胞破砕液中のイソプロピルリンゴ酸合成酵素の酵素活性は、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）， ２ ｍＭ ４－ＰＤＳ（４，４′－Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）， ２ ｍＭ Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ， ２ ｍＭ ３－メチル－２－オキソブタン酸に細胞破砕液を混ぜ、遊離したＣｏＡが４－ＰＤＳと反応して４－ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅが生成されることによる３２４ ｎｍの吸光度変化を測定した。Ｌ－ロイシンによるフィードバック阻害の測定のためには、反応液に１０ ｍＭのＬ－ロイシンを添加した。
得られた形質転換体をＡ寒天培地（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）にストリークして３３℃で２４時間培養し、増殖した菌体を、２５μｇ／ｍＬ Ｋｍを加えた生産培地１０ｍＬにＯＤ６１０＝０．２になるように植菌し、３３℃，２００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後に、培養液を遠心分離して上清とペレットを分離し、上清中のＬ－ロイシンの濃度は高速液体クロマトグラフィーにより（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）に記載の方法に従って分析した。ペレットは破砕用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（７．５）， １００ ｍＭ ＫＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し、（ＷＯ２０２００９００１６Ａ１）に記載の方法に従いビーズショッカーで細胞を破砕した。細胞破砕液のタンパク質濃度はブラッドフォード法に従って定量した。細胞破砕液中のイソプロピルリンゴ酸合成酵素の酵素活性は、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）， ２ ｍＭ ４－ＰＤＳ（４，４′－Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）， ２ ｍＭ Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ， ２ ｍＭ ３－メチル－２－オキソブタン酸に細胞破砕液を混ぜ、遊離したＣｏＡが４－ＰＤＳと反応して４－ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅが生成されることによる３２４ ｎｍの吸光度変化を測定した。Ｌ－ロイシンによるフィードバック阻害の測定のためには、反応液に１０ ｍＭのＬ－ロイシンを添加した。
＜生産培地＞
グルコース４０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ，尿素 ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ， ＭＯＰＳ ４２ｇ，ＣａＣｌ２ １０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｍｇ，ＣｕＳＯ４ ０．２ｍｇ，ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０２ｍｇ，ビオチン ０．２ｍｇ，チアミン塩酸塩 ０．２ｍｇ，ＰＣＡ ３０ｍｇ／Ｌ，ｐＨ７．４
グルコース４０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ，尿素 ５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ， ＭＯＰＳ ４２ｇ，ＣａＣｌ２ １０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｍｇ，ＣｕＳＯ４ ０．２ｍｇ，ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０２ｍｇ，ビオチン ０．２ｍｇ，チアミン塩酸塩 ０．２ｍｇ，ＰＣＡ ３０ｍｇ／Ｌ，ｐＨ７．４
（７）変異体の性能試験１
野生型および変異型のＩＰＭＳをΔｌｅｕＡ株へのプラスミド導入により過剰発現した菌株を用いて、Ｌ－ロイシンの生産、ＩＰＭＳの活性およびＬ－ロイシン存在下におけるＩＰＭＳの残存活性を比較した。その結果を表３に示す。
野生型および変異型のＩＰＭＳをΔｌｅｕＡ株へのプラスミド導入により過剰発現した菌株を用いて、Ｌ－ロイシンの生産、ＩＰＭＳの活性およびＬ－ロイシン存在下におけるＩＰＭＳの残存活性を比較した。その結果を表３に示す。
表３に示すとおり、コリネ型細菌の持つＩＰＭＳにおいてもロイシン結合部位周辺の残基へ変異を導入することにより、Ｌ－ロイシン生産能を保持すると共に、Ｌ－ロイシンに対するフィードバック阻害耐性を獲得した変異型ＩＰＭＳを取得することができた。しかし、これらの変異をそれぞれ組み合わせた二重変異体を作製したところ、Ｌ－ロイシンに対するフィードバック阻害耐性は高かったものの、Ｌ－ロイシン生産量およびＩＰＭＳ活性は大きく低下した。さらに、３つの変異を全て導入した三重変異体を作製したところ、予期せぬことに高いＩＰＭＳ活性とＬ－ロイシンに対するフィードバック阻害耐性を維持し、一重変異体と比較しても顕著なＬ－ロイシン生産量の増加が観察された。
（８）変異体の性能試験２
三重変異体のそれぞれの残基について、他のアミノ酸残基への変異でも同様の効果が得られるかどうかの検証のため、各残基を異なるアミノ酸残基へ置換し、ΔｌｅｕＡ株へプラスミド導入した過剰発現株を用いて、Ｌ－ロイシンの生産、ＩＰＭＳの活性およびＬ－ロイシン存在下におけるＩＰＭＳの残存活性を比較した。その結果を表４に示す。
三重変異体のそれぞれの残基について、他のアミノ酸残基への変異でも同様の効果が得られるかどうかの検証のため、各残基を異なるアミノ酸残基へ置換し、ΔｌｅｕＡ株へプラスミド導入した過剰発現株を用いて、Ｌ－ロイシンの生産、ＩＰＭＳの活性およびＬ－ロイシン存在下におけるＩＰＭＳの残存活性を比較した。その結果を表４に示す。
全ての変異体において高いＬ－ロイシンフィードバック阻害耐性を維持したが、Ｌ－ロイシン生産量とＩＰＭＳ活性は変異型によって大きく異なり、フィードバック阻害に耐性のある酵素さえ得られれば高いＬ－ロイシン生産性が得られるわけではないことが分かった。
野生型酵素と比較すると、Ｇ５３０Ｄ、Ｇ５３０Ｅ、Ｇ５３０Ｋ、Ｇ５３０Ａ、Ｇ５３０Ｖ、Ｇ５３０Ｎ、Ｇ５３０Ｃ、Ｇ５３０Ｐ、Ｇ５３０Ｒ、Ｇ５３０Ｌ、Ｇ５３０Ｉ、Ｇ５３０Ｔ、Ｇ５３０Ｈ、Ｇ５３２Ｄ、Ｇ５３２Ａ、Ｇ５３２Ｖ、Ｇ５３２Ｐ、Ｇ５３２Ｌ、Ｇ５３２Ｉ、Ｇ５３２Ｔ、Ｇ５３２Ｈ、Ａ５３５Ｔ、Ａ５３５Ｓ、Ａ５３５Ｖ、Ａ５３５Ｋ、Ａ５３５Ｄ、Ａ５３５Ｆ、Ａ５３５Ｇ、Ａ５３５Ｌ、Ａ５３５Ｉ、Ａ５３５Ｈのそれぞれの位置における変異の組み合わせによりＬ－ロイシン生産量の増加に効果のあるＩＰＭＳの性能向上が期待できる。
本発明は、各種化学物質の工業生産の分野において高い産業上の利用可能性を有する。
ここで、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ４２４５５のアミノ酸配列（配列番号１）を、下記の表１に示す。
Claims (22)
- 下記の（Ａ）～（Ｃ）の何れかに規定されるアミノ酸配列を含み、かつ表１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と比較して、Ｌ－ロイシンフィードバック阻害が低減された改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（Ａ）表１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を有してなるアミノ酸配列；
（Ｂ）表１に示すアミノ酸配列に対し６０％以上の配列同一性を有し、かつ下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を含む、アミノ酸配列；
（Ｃ）表１に示すアミノ酸配列において、下記の（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも２つの置換を含み、かつ該少なくとも２つの置換が位置する部位を除く部位に１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ａ）第５３０番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、
（ｂ）第５３２番目のグリシン残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換、及び
（ｃ）第５３５番目のアラニン残基のアラニン残基以外のアミノ酸残基への置換。 - 上記（Ｂ）に規定のアミノ酸配列は、表１に示すアミノ酸配列に対し８４％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 上記（Ｂ）に規定のアミノ酸配列は、表１に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 上記（ａ）～（ｃ）に規定の置換全てを含む、請求項１～３の何れか１項に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 対応する野生型２－イソプロピルマレートシンターゼと比較して、Ｌ－ロイシンフィードバック阻害を低減する少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、
上記少なくとも１つのアミノ酸変異が、表１に示すアミノ酸配列を基準として、下記の（ａ’）～（ｃ’）から選択される少なくとも２つの置換を含む、改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ａ’）第５３０番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（ｂ’）第５３２番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基のグリシン残基以外のアミノ酸残基への置換；及び
（ｃ’）第５３５番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基のアラニン残基以外のアミノ酸残基への置換。 - 上記少なくとも１つのアミノ酸変異が、上記（ａ’）～（ｃ’）に規定の置換全てを含む、請求項６に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- コリネバクテリウム属細菌に由来する野生型２－イソプロピルマレートシンターゼのアミノ酸配列において上記少なくとも２つの置換を有してなるアミノ酸配列を含む、請求項１～７の何れか１項に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 上記少なくとも２つの置換が、下記の（ｄ）～（ｆ）から選択される少なくとも２つの置換である、請求項１～８の何れか１項に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ｄ）第５３０番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、グルタミン残基、システイン残基、プロリン残基、アルギニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、スレオニン残基又はヒスチジン残基への置換；
（ｅ）第５３２番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、スレオニン残基又はヒスチジン残基への置換；及び
（ｆ）第５３５番目のアラニン残基又は当該アラニン残基に相当するアミノ酸残基のスレオニン残基、セリン残基、バリン残基、リジン残基、アスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基又はヒスチジン残基への置換。 - 上記（ｄ）～（ｆ）に規定の置換全てを含む、請求項９に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 上記少なくとも２つの置換が、下記の（ｇ）～（ｊ）から選択される少なくとも２つの置換である、請求項１～１１の何れか１項に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ：
（ｇ）第５３０番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換；
（ｈ）第５３２番目のグリシン残基又は当該グリシン残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換；及び
（ｊ）第５３５番目のアラニン残基又は当該アラニン残基に相当するアミノ酸残基のスレオニン残基、バリン残基、グリシン残基、ロイシン残基又はイソロイシン残基への置換。 - 上記（ｇ）～（ｊ）に規定の置換全てを含む、請求項１２に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 上記（Ａ）又は（Ｃ）に規定されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ。
- 請求項１～１４の何れか一項に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１５に記載のポリヌクレオチドが導入された、微生物。
- 請求項１～１４のいずれか一項に記載の改変型α－イソプロピルマレートシンターゼを含む、微生物。
- コリネ型細菌である、請求項１６又は１７に記載の微生物。
- コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１８に記載の微生物。
- （Ｉ）請求項１６～１９の何れか１項に記載の微生物を所定の培地又は反応媒体で培養又は反応せしめることにより目的物質を産生すること；並びに
（ＩＩ）該目的物質を回収すること、
を含む、目的物質を生産する方法。 - 上記目的物質が、（２Ｓ）－２－イソプロピルマレート、２－イソプロピルマレート、（２Ｒ，３Ｓ）－３－イソプロピルマレート、（２Ｓ）－２－イソプロピル－３－オクソサクシネートマレート、４－メチル－２－オクソペンタノエート若しくはＬ－ロイシン又は生合成経路上これらの化合物を経由する代謝産物である、請求項２０に記載の方法。
- 上記目的物質が、Ｌ－ロイシン又はこれから誘導される代謝産物である、請求項２０又は２１に記載の方法。
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