BR112014021439B1 - Polipeptídeo de isopropilmalato sintase e a sequência de nucleotídeos que o codifica, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium e uso do mesmo, bem como processo fermentativo para a produção de kic ou l-leucina - Google Patents

Abstract

sintases de alfa-isopropilmalato resistente à retroalimentação. a presente invenção refere-se a uma sequência de nucleotídeos isolada que codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos (maior igual) 90 %, (maior igual) 92 %, (maior igual) 94 %, (maior igual) 96 %, (maior igual) 97 %, (maior igual) 98 %, (maior igual) 99 % ou 100 %, de preferência (maior igual) 97 %, particularmente de preferência (maior igual) 98 %, muito particularmente preferivelmente (maior igual) 99 %, e muito preferencialmente 0 %, idêntica à sequência de aminoácidos da seq id no: 2, em que a seq id no: 2, na posição 553, ou em uma correspondente posição da sequência de aminoácidos, tem um aminoácido proteinogênico diferente de l-tirosina, a um microrganismo que compreende a sequência de nucleotídeos e também a um processo para a produção de produtos químicos puros utilizando este microrganismo.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma sequência de nucleo-tídeo isolada que codifica para uma sequência de aminoácido que é pelo menos > 90 %, > 92 %, > 94 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 % ou 100 %, de preferência > 97 %, particularmente de preferência > 98 %, muito particularmente preferivelmente > 99 %, e muito preferencialmente 100 %, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a SEQ ID NO: 2, na posição 553, ou a uma correspondente posição da sequência de aminoácidos, tem um aminoácido proteino- gênico diferente de L-tirosina, a um microrganismo que compreende a sequência de nucleotídeos e também a um processo para a produção de produtos químicos puros utilizando este microrganismo.

[0002] Os produtos químicos puros, que incluem, em particular, osaminoácidos, ácidos orgânicos, vitaminas, nucleosídeos e os nucleotí- deos, são usados em medicina humana, na indústria farmacêutica, na cosmética, na indústria de alimentos e na alimentação animal.

[0003] Um grande números destes compostos é produzido pormeio da fermentação de cepas de bactérias corineformes, em especial de Corynebacterium glutamicum. Devido à grande importância do mesmo, o trabalho está constantemente em curso sobre a melhoria do processo de produção. As melhorias de processo podem relacionar-se às medidas de fermentação, tais como, por exemplo, agitação e alimentação com oxigênio, ou a composição dos meios de cultura, tais como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou adsorvido para dar a forma do produto, por exemplo, a cromatogra- fia de troca iônica, ou as propriedades de desempenho intrínsecas do próprio microrganismo.

[0004] Os métodos de mutagênese, o rastreio e a seleção de mu-tantes são utilizados para melhorar as propriedades dos referidos mi-crorganismos de desempenho. Deste modo obtêm-se as cepas que são resistentes a antimetabolitos, tais como, por exemplo, o análogo de leucina 4-azaleucina ou 5,5,5-trifluoroleucina e produzem os compostos químicos, por exemplo, os L-aminoácidos, tais como L-leucina. A título de exemplo, pode ser feita menção da literatura de referência Casalone et al. (Research in Microbiology 148: 61 a -623, 1997).

[0005] Durante alguns anos, do mesmo modo, os métodos da tecnologia de DNA recombinante têm sido utilizados para melhoramento de cepas das cepas produtoras de L-aminoácidos de Corynebacterium glutamicum, em que, por exemplo, os genes da biossíntese de amino- ácidos individuais são amplificados ou atenuados e o efeito sobre a produção do composto químico é estudado.

[0006] As apresentações resumidas sobre a biologia, genética ebiotecnologia de Corynebacterium glutamicum podem ser encontradas no "Manual de Corynebacterium glutamicum" (Eds.: L. e M. Eggeling Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005), na edição especial do Journal of Biotechnology (editor Chefe: A. Puhler) com o título "Uma Nova Era na Corynebacterium Biotecnologia glutamicum" (Journal of Biotechnology 104 / 1-3, (2003)) e no livro de T. Scheper (Managing Editor) " Produção Microbial de L-Aminoácidos" (Avanços em Engenharia Bioquímica / Biotecnologia 79, Springer Verlag, Berlin, Alemanha, 2003).

[0007] A sequência de nucleotídeos do genoma de Corynebacte-rium glutamicum é descrita em Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99 a 109 (2003)), em EP 1 108 790 e na Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 / 1 a 3, (2003)).

[0008] As sequências de nucleotídeos do genoma de Corynebacte-rium glutamicum também estão disponíveis no banco de dados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) da National Library of Medicine (Bethesda, Maryland, EUA), no Banco de Dados de DNA do Japão (DDBJ, Mishima, Japão) ou na base de dados de sequência de nucleotídeos dos European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemanha ou em Cambridge, Reino Unido).

[0009] O gene leuA que codifica a sintase de α-isopropilmalato deCorynebacterium glutamicum é descrito, inter alia, por meio dos seguintes detalhes:

[00010] A sintase de α-isopropilmalato (IPMS, = CE 2.3.3.13) catalisa a condensação de o grupo acetila de acetil-CoA com 3-metil-2- oxobutanoato (2-oxoisovalerato, cetoisovalerato) para a formação de 3-carbóxi-3-hidróxi-4-metilpentanoato (2-isopropilmalato). O gene leuA compreende 1.851 pares de base (pb) e codifica um polipeptídeo tendo um M (r) de 68 187. Como é comum para as enzimas que catalisam a primeira etapa de uma via de biossíntese, a sintase de α- isopropilmalato está sujeita à regulação por meio da retroalimentação por meio do produto final leucina (Patek et al., Applied Environmental Microbiology 60: 133 a 140 (1994)). Além disso, a enzima é inibida por meio da coenzima A na presença de cátions bivalentes, especialmente de zinco (Ulm et al, Journal of Bacteriology 110 (3): 1118 a 1126(1972); Tracy e Kohlhaw, Proceedings of the National Academy of Sciences dos Estados Unidos da América 72 (5): 1802 a 1806 (1975)).

[00011] A sequência de nucleotídeos do gene leuA que codifica a sintase de α-isopropilmalato de Corynebacterium glutamicum, de acordo com os dados da base de dados do NCBI, é representada na SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos daí resultante da sintase de α-isopropilmalato codificada na SEQ ID NO: 4 em SEQ ID NO: . três sequências nucleotídicas, situadas a montante e a jusante são relatadas adicionalmente.

[00012] O objetivo da presente invenção é proporcionar um processo fermentativo para a produção de cetoisocaproato ou L-leucina com um rendimento melhorado ou uma concentração final maior do produto intracelularmente e / ou no meio.

[00013] Um outro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma célula que é modificada de uma tal maneira que, mesmo na presença de altas concentrações intracelulares de leucina, é capaz de produzir cetoisocaproato ou leucina.

[00014] Um outro objetivo da presente invenção é o de melhorar o rendimento de cetoisocaproato ou leucina, com base na quantidade de substrato de carbono utilizado para a fermentação.

[00015] Os inventores da presente invenção constataram surpreendentemente que uma mutação da sintase de α-isopropilmalato leva a um aumento na produção de cetoisocaproato e leucina. Sem pretender estar ligado a qualquer teoria, os inventores suspeitam que esta mutação reduz ou mesmo elimina a inibição de retorno da enzima, isto é, a redução da atividade enzimática mediada por meio da ligação do produto para a enzima.

[00016] A expressão "leucina", a qual é usada como sinônimo de "L-leucina", também inclui os sais dos mesmos, tais como, por exemplo, cloridrato de L-leucina, L-leucina ou de sulfato de sal de cálcio. Do mesmo modo, a expressão cetoisocaproato ( KIC ) compreende também os sais dos mesmos, tais como, por exemplo, cálcio- KIC, potássio- KIC ou sódio- KIC .

[00017] A presente invenção refere-se a uma sequência de nucleo- tídeos isolada que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos > 90 %, > 92 %, > 94 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 % ou 100 %, de preferência > 97 %, particularmente de preferência > 98 %, muito particularmente preferivelmente > 99 %, e muito preferencial- mente 100 %, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a SEQ ID NO: 2, na posição 553, ou a uma correspondente posição da sequência de aminoácidos, tem um aminoácido proteino- gênico que não seja L -tirosina.

[00018] Em uma modalidade preferida, a sequência de aminoácidos codificada por meio da sequência de ácido nucleico segundo a presente invenção apresenta, na posição 553 ou em uma posição correspondente, um aminoácido que é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico, alanina, cisteína, serina, treo- nina, lisina, arginina, glutamina e asparagina, em particular, de preferência a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e ácido aspá- rtico.

[00019] Em uma modalidade preferida, a sequência de aminoácidos codificada por meio da sequência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção tem, na posição 553, ou uma posição correspondente, o ácido L-aspártico.

[00020] Em uma modalidade preferida, a sequência de ácido nu- cleico de acordo com a presente invenção é uma sequência de ácido nucleico possuindo uma guanina na posição 1657, ou em uma posição correspondente, representada na SEQ ID NO: 5.

[00021] A expressão "uma posição correspondente à posição 553 da sequência de aminoácidos" ou "uma posição similar à posição 553 da sequência de aminoácidos" entende-se o fato de que, por meio da inserção ou por meio da deleção de um códon que codifica um amino- ácido na região do terminal N (com base na posição 553 da SEQ ID N ° 2) do polipeptídeo codificado, a indicação de posição e de comprimento no caso de uma inserção é formalmente aumentada em uma unidade, ou, no caso de uma deleção, diminuída por meio de uma unidade. Da mesma forma, por meio da inserção ou deleção de um códon que codifica um aminoácido na região terminal C (com base na posi- ção 553) do polipeptídeo codificado, a instrução de comprimento, no caso de uma inserção, é formalmente aumentada em uma unidade, ou, no caso de uma deleção, a diminuição de uma unidade. Tais posições equivalentes, podem ser prontamente identificadas por meio da comparação das sequências de aminoácidos na forma de um "alinhamento", por exemplo, usando o programa Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637 a 4680 (1994)) ou o Programa MAFFT (Katoh et al, informações sobre o genoma de 2005;. 16 (1),22 a 33).

[00022] Tais inserções e deleções não afetam a atividade enzimáti- ca substancialmente. "Não afetar substancialmente" significa que a atividade enzimática da referida variante difere por um máximo de 10 %, um máximo de 7,5 %, um máximo de 5 %, um máximo de 2,5 %, ou, no máximo, 1 %, a partir da atividade do polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[00023] Um método para a determinação da atividade enzimática da sintase de isopropilmalato é descrito em Kohlhaw et al. (Methods in Enzymology 166: 423 a 9 (1988)); o teste é baseado na medição da alteração na extinção a 412 nm devido em derivados de tionitrobenzo- ato (TNB) formados a partir de DTNB (ácido 5,5 '-ditiobis (2-ácido ni- trobenzoico), reagente de Ellman), por meio da redução com CoA.

[00024] A presente invenção refere-se correspondentemente também às sequências de nucleotídeos e as moléculas de ácido nucleico que compreendem tais sequências e que codificam variantes do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 2 ou 6, os quais contêm uma ou mais inserção (ões) ou deleção (ões). De preferência, o polipeptídeo contém um máximo de 5, um máximo de 4, um máximo de 3, ou um máximo de 2 inserções ou deleções de aminoácidos.

[00025] Dá-se preferência às sequências de nucleotídeos replicáveis que codificam a sintase de isopropilmalato da enzima que são iso- lados a partir de microrganismos do gênero Corynebacterium, em especial de Corynebacterium glutamicum, em que as sequências de proteínas codificadas contêm, dessa maneira, um aminoácido proteinogê- nico que não seja L-tirosina na posição correspondente à posição 553 da SEQ ID NO: 2.

[00026] Particular preferência, além disso, é dada a uma sequência de nucleotídeos replicáveis (DNA) que codifica para a sintase de iso- propilmalato da enzima e que é isolada a partir de microrganismos do gênero Corynebacterium, em especial de Corynebacterium glutami- cum, em que a sequência de aminoácido associada contém, na posição 553, ácido G - aspártico, representado na SEQ ID NO: 6.

[00027] A presente invenção refere-se ainda a uma sequência de nucleotídeos replicáveis (DNA) que codifica para a sintase de isopropi- lmalato da enzima e que é isolada a partir de microrganismos do gênero Corynebacterium, em especial de Corynebacterium glutamicum, a sequência de bases da sequência de nucleotídeos que contém, na posição 1657, guanina, ilustrada na SEQ ID NO: 5.

[00028] A presente invenção refere-se ainda a plasmídeos e vetores que compreendem as sequências de nucleotídeos de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, se replicam em microrganismos do gênero Corynebacterium, ou são adequados para esse fim.

[00029] A presente invenção refere-se ainda aos microrganismos do gênero Corynebacterium, que compreendem as sequências de nu- cleotídeos, vetores e polipeptídeos de acordo com a presente invenção.

[00030] A presente invenção refere-se ainda a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por meio da sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção. Um polipeptídeo exemplificativo é representado na SEQ ID NO 6.

[00031] Em uma modalidade particularmente preferida, o polipeptí- deo de acordo com a presente invenção ou o polipeptídeo codificado por meio da sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção ou o polipeptídeo que compreende o microrganismo de acordo com a presente invenção é um IPMS modificado tendo inibição de retroalimentação reduzida em relação à da enzima do tipo selvagem, ou seja, a enzima é inibida menos do que a enzima do tipo selvagem por meio de um dos seus produtos ou um metabolito formado no metabolismo dos mesmos, por exemplo, KIC ou L-leucina.

[00032] A presente invenção refere-se ainda, preferencialmente, aos microrganismos do gênero Corynebacterium, que compreendem as sequências de nucleotídeos, vetores e / ou polipeptídeos de acordo com a presente invenção e em que os microrganismos das sequências de nucleotídeos que codificam para a sintase de isopropilmalato estão presentes de preferência na forma sobre-expressa.

[00033] A presente invenção refere-se ainda particularmente de preferência de microrganismos do gênero Corynebacterium, que contêm as sequências de nucleotídeos de acordo com a presente invenção e em que as sequências de nucleotídeos que codificam para a sin- tase de isopropilmalato estão presentes de preferência na forma de sobre-expressa, em que a sequência de aminoácido associada contém ácido aspártico L na posição 553, representada na SEQ ID NO: 6.

[00034] Para gerar as sequências de nucleotídeos de acordo com a presente invenção que codifica a sintase de α-isopropilmalato caracterizada por meio de uma troca de aminoácidos na posição 553 da SEQ ID NO: 2, os métodos de mutagênese descritos na técnica anterior são utilizados.

[00035] Para a mutagênese, os métodos in vitro tais como, por exemplo, os oligonucleotídeos mutagênicos (TA Brown: Gentechnolo- gie fur Einsteiger [engenharia genética para principiantes], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) ou a reação em cadeia da polimerase (PCR), como descrito no Manual por Newton e Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994), podem ser utilizados.

[00036] Outras instruções para gerar mutações podem ser encontradas no estado da técnica e livros de genética e biologia molecular conhecidos como, por exemplo, o livro por Knipper ("Molekulare Gene- tik" [genética molecular], 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), que por Winnacker ("Gene und Klone" [Genes e clones], VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou por Hagemann ("Allgemeine Genetik" [genéticas gerais], Gustav Fischer Verlag, Estugarda, 1986).

[00037] Quando são utilizados os métodos in vitro, o gene leuA descrito na técnica anterior, partindo de DNA total de isolado de uma cepa de tipo selvagem, é amplificado utilizando a reação em cadeia da polimerase, opcionalmente, clonado em vetores de plasmídeo apropriados, e o DNA é então submetido para o processo de mutagênese. As instruções para a amplificação de sequências de DNA usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) podem ser encontradas por meio das pessoas que são versadas na técnica, inter alia, no manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Pratical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) e em Newton e Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994). Os alelos leuA adequados são então isolados, estudados e sequenciados. As instruções para essa finalidade podem ser encontradas, por exemplo, em Kalinowski et al. (Molecular and Geral Genetic 224: 317 324 (1990)),Kalinowski et al. (Molecular Microbiology 5: 1197 a 204 (1991)) ou Fol- lettie et al. (Journal of Bacteriology 175, 4096 a 4103 (1993)). As instruções sobre a sequenciação podem ser encontradas, por exemplo, em Sanger et al. (Proceedings, da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, 74: 5463 a 5467, (1977)).

[00038] Por conseguinte, a presente invenção relaciona-se com um polinucleotídeo isolado que codifica a sintase de isopropilmalato da enzima, em que o polinucleotídeo isolado compreende um polinucleo- tídeo que tem a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 5.

[00039] A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado que codifica a sintase de isopropilmalato da enzima, em que o polinu- cleotídeo isolado compreende a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 5 ou é constituído da mesma.

[00040] Os detalhes sobre a estrutura bioquímica ou química de sequências de nucleotídeos como os que ocorrem em seres vivos, tais como, por exemplo, microrganismos, podem ser encontrados, inter alia, no livro de texto "Biochemie" [Bioquímica] por Berg et al. (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlim, Alemanha, 2003; ISBN 3-8274-1303-6).

[00041] Em uma modalidade, a expressão "sequência de nucleotí- deos" ou "sequência de aminoácidos" entende-se por moléculas de ácido nucleico a partir do grupo que compreende o DNA, RNA e as suas formas modificadas, ou polipeptídeos que compreendem a sequência especificada, por exemplo, na fusão com outra sequência, ou consistem no mesmo.

[00042] Se a sequência de nucleotídeos que consiste em monôme- ros de desoxirribonucleotídeo com as nucleobases ou bases adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T), então esta é descrita como desoxirribonucleotídeo ou sequência de ácido desoxirribonucleico (DNA). Se a sequência de nucleotídeos que consiste em monômeros de ribonucleotídeos com as nucleobases ou bases adenina (A), guani- na (G), citosina (C) e uracila (U), em seguida, esta é descrita como uma sequência de ribonucleotídeos ou de ácido ribonucleico (RNA). Nas sequências de nucleotídeos referidas, os monômeros são ligados de forma covalente uns aos outros através de uma ligação 3^ 5'-fosfodiéster.

[00043] Um gene, do ponto de vista químico, é uma sequência de nucleotídeos. Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína / polipeptídeo é utilizada na presente invenção como sinônimo do termo "gene". As duas expressões "gene" e "região de codificação" são usadas como sinônimos e, do mesmo modo, as duas expressões "proteína" e "polipeptídeo".

[00044] "Aminoácidos proteinogênicos" são tomados para significar os aminoácidos que ocorrem em proteínas naturais, que é dizer em proteínas a partir de microrganismos, plantas, animais e seres humanos. Eles servem como unidades estruturais das proteínas em que se encontram ligados uns aos outros através de ligações peptídicas.

[00045] Se, a seguir, os L-aminoácidos proteinogênicos são mencionado, isto significa que um ou mais dos aminoácidos, incluindo os seus sais selecionados a partir do grupo de ácido L-aspártico, L- asparagina, L-treonina, L-serina, ácido L-glutâmico, L glutamina, L- glicina, L-alanina, L-cisteina, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L- leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L- arginina, L-prolina e, opcionalmente, a L-selenocisteína e L-pirrolisina. Os L-aminoácidos que compreende, igualmente, L-homoserina. É dada preferência particular para o L-aminoácido L-leucina.

[00046] Por sobre-expressão, entende-se, em geral, um aumento na concentração intracelular ou na atividade de um ácido ribonucleico, uma proteína (polipeptídeo) ou uma enzima, em comparação com a cepa de partida (cepa parental) ou cepa de tipo selvagem, se esta for a cepa de partida . A cepa de partida (cepa parental), entende-se a cepa em que a medida que leva à sobre-expressão foi levada a cabo.

[00047] Na sobre-expressão, são preferidos os métodos de sobre- expressão recombinantes. Estes incluem todos os métodos em que um microrganismo é produzido utilizando uma molécula de DNA proporcionada in vitro. Tais moléculas de DNA compreendem, por exemplo, promotores, cassetes de expressão, genes, alelos, regiões de codificação, etc Estes são convertidos para o microrganismo desejado por meio de métodos de transformação, conjugação, transdução, ou métodos semelhantes.

[00048] A extensão da expressão ou sobre-expressão pode ser estabelecida através da medição da quantidade de mRNA transcrito pelo gene, por meio da determinação da quantidade do polipeptídeo, e por meio da determinação da atividade da enzima.

[00049] Para determinar a quantidade de mRNA, inter alia, o método de transferência de Northern e RT-PCR quantitativa pode ser usado. Em RT-PCR quantitativa, uma transcrição reversa é ligada a montante da reação em cadeia da polimerase. Para esta finalidade, o sistema LightCyclerTM da Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha) pode ser utilizado, tal como descrito, por exemplo, em Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190 a 197 (2008)). A concentração da proteína pode ser determinada por meio da separação 1 - e 2-dimensional dos géis de proteínas e subsequente identificação óptica da concentração dos géis de proteínas, utilizando um software de avaliação correspondente. Um método comum para a preparação dos géis de proteínas de bactérias corineformes e para a identificação de proteínas é o procedimento descrito por Hermann et al. (Eletroforese, 22: 1712-23 (2001)). A concentração de proteína pode também ser determinada por Western-blot de hibridação com um anticorpo específico para a proteína que se pretende detectar (Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) e subsequente avaliação óptica com o software correspondente para a determinação da concentração (Lohaus e Meyer (1998) Biospektrum 5: 32 a 39; Lotts- peich, Angewandte Chemie 321: 2630 a 2647 (1999)). A significânciaestatística dos dados obtidos é determinada usando um teste T (Gos- set, Biometrika, 6 (1): 1-25 (1908)).

[00050] Para alcançar a sobre-exressão, na técnica anterior, uma multiplicidade de métodos estão disponíveis. Estes incluem, em adição à modificação das sequências nucleotídicas que controlam a expressão do gene, também aumentando o número de cópias.

[00051] O número de cópias pode ser aumentado por meio dos plasmídeos que se replicam no citoplasma do microrganismo. Para este efeito, no estado da técnica, uma grande quantidade de plasmí- deos é descrita para os mais diferentes grupos de microrganismos, com o qual os plasmídeos no aumento desejado do número de cópias do gene podem ser definidos. Os plasmídeos adequados para o gênero Corynebacterium são descritos, por exemplo, em Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), de 27-40, (2003)), ou em Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920 a 5928 (2005)).

[00052] O número de cópias pode, adicionalmente, ser aumentado em pelo menos um (1) através da inserção de copiar mais cópias no cromossoma do microrganismo. Os métodos adequados para o gênero Corynebacterium são descritos, por exemplo, nos documentos de patente WO 03/014330, WO 03/040373 e WO 04/069996.

[00053] A expressão genética pode ser aumentada, adicionalmente, em que uma pluralidade de promotores são posicionados a montante do gene desejado, ou sejam funcionalmente ligados ao gene que está a ser expresso e deste modo o aumento da expressão é conseguido. Exemplos destes são descritos no documento de patente WO 2006 / 069711.

[00054] A transcrição de um gene pode ser controlada por meio das proteínas que inibem a transcrição (proteínas repressoras) ou promo- vem as proteínas (ativadores). Portanto, para obter a sobre-expressão, é igualmente possível aumentar a expressão de proteínas ativadoras ou reduzir a expressão das proteínas repressoras ou desligá-las ou então para eliminar os locais de ligação das proteínas repressoras.

[00055] A taxa de alongamento é afetada pelo uso de códon; a utilização de códons para a transferência de (t)-RNA que ocorre frequentemente na cepa de partida pode amplificar a tradução. Além disso, a troca de um códon de iniciação para o códon ATG que ocorre mais frequentemente em muitos microrganismos (77% em Escherichia coli) pode melhorar consideravelmente a tradução, uma vez que, ao nível do RNA, o códon AUG é duas a três vezes mais eficaz do que, por exemplo, os códons GUG e UUG (Khudyakov et al, FEBS Letters 232 (2) : 369-71 (1988); Reddy et al, Proceedings, da Academia Nacional de Ciências dos U.S. 82 (17): 5656 a 60 (1985)). Além disso, o ambi-ente da sequência do códon de iniciação pode ser optimizado desde que os efeitos interativos entre o códon de iniciação e as regiões flan- queadoras sejam descritos (Stenstrom et al, Gene 273 (2) : 259 a 65 (2001), Hui et al, EMBO Journal 3 (3) : 623 a 9 (1984)).

[00056] As instruções sobre a manipulação do DNA, digestão e ligação de DNA, transformação e rastreio de transformantes podem ser encontradas, inter alia, no manual conhecido por Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

[00057] A presente invenção também se refere aos vetores que compreendem o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção.

[00058] Kirchner e Tauch (Journal of Biotechnology 104: 287 a 299 (2003)) descrevem uma seleção dos vetores a serem empregados em Corynebacterium glutamicum.

[00059] A presente invenção refere-se ainda a um microrganismo de acordo com a presente invenção, caracterizado pelo fato de a se- quência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção ser integrada em um cromossoma. Permite a recombinação homóloga, com a utilização dos vetores de acordo com a presente invenção, a troca de seções de DNA no cromossoma de polinucleotídeos de acordo com a presente invenção, que são transportados para dentro da célula por meio do vetor. Por recombinação eficiente entre a molécula de DNA de tipo anel do vetor e o DNA alvo no cromossoma, na região do DNA que é para ser trocada contendo o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção é proporcionado nas extremidades com sequências nucleotídicas homólogas ao local alvo; estes determinam o local da integração do vetor e de troca do DNA.

[00060] Por exemplo, o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção pode ser trocado por meio do gene nativo leuA no local do gene nativo no cromossoma, ou integrado em um local do gene adicional.

[00061] A expressão ou a sobre-expressão é preferivelmente realizada em microrganismos do gênero Corynebacterium. Dentro do gênero Corynebacterium, as cepas são preferidas que têm por base as seguintes espécies: Corynebacterium efficiens, em que o tipo de cepa está depositado como DSM44549, Corynebacterium glutamicum, em que o tipo de cepa foi depositado como ATCC13032, e Corynebacte- rium ammoniagenes, em que o tipo de cepa está depositado como ATCC6871. As espécies Corynebacterium glutamicum são muito particularmente preferidas.

[00062] Alguns membros das espécies Corynebacterium glutami- cum também são conhecidos na técnica anterior sob outros nomes. Estes incluem, por exemplo: cepa ATCC13870, o que tem sido chamado de Corynebacterium acetoacidophilum, cepa DSM20137, o que tem sido chamado de Corynebacterium lilium, cepa ATCC17965, o que tem sido chamado de Corynebacterium melassecola, cepa ATCC14067, o que tem sido chamado de flavum Brevibacterium, cepa ATCC13869, o que tem sido chamado Brevibacterium lactofermentum, e cepa ATCC14020, o que tem sido chamado de Brevibacterium diva- ricatum.

[00063] A expressão "Micrococcus glutamicus" para Corynebacte- rium glutamicum foi igualmente utilizada. Alguns membros da espécie Corynebacterium efficiens também foram chamados os Corynebacte- rium thermoaminogenes da técnica anterior, tais como, por exemplo, cepa FERM BP-1539.

[00064] Os microrganismos ou cepas (linhagens de partida) utilizados para as medidas de introdução de um IPMS resistente à retroalimentação, de preferência já possui a capacidade de secretar KIC ou L-leucina no meio nutriente circundante e acumulando a partir daí. Para este processo, a seguir, a expressão "produzir" é também utilizada. Em particular, as cepas utilizadas para as medidas de sobre-exressão possuem a capacidade de se acumular na célula ou no meio nutriente (> significa pelo menos) > 0,10 g / l, 0.25 g / l, > 0,5 g / l, > 1,0 g / l, > 1,5 g / l, > 2,0 g / l, > 4 g / l ou > 10 g / l de L-leucina ou de KIC em (< significa no máximo) < 120 horas, 96 horas, < < de 48 horas, < 36 horas < 24 horas ou < 12 horas. As cepas de partida são de preferência as cepas que foram produzidas por meio da mutagênese e de rastreio, por meio de técnicas de DNA recombinante ou por meio de uma combinação de ambos os métodos.

[00065] É compreensível para aqueles versados na técnica que também é possível se chegar a um microrganismo adequado para as medidas da presente invenção, em que, em uma cepa selvagem, tal como, por exemplo, no tipo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ou na cepa ATCC 14067, em primeiro lugar, o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção de acordo com a SEQ ID NO: 5 é inserido e, em seguida, o microrganismo é causado, por outras medidas genéticas descritas na técnica anterior, para produzir o KIC dese- jado ou L-leucina.

[00066] A informação sobre a classificação taxonômica de cepas deste grupo de bactérias pode ser encontrada, entre outros, em Seiler (Journal of General Microbiology 129, de 1433 a 1477 (1983)), Kinoshi- ta (1985, Glutamic Acid Bacteries, p. 115 a 142. In: . Demain e Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms . The Benjamin / Cummins Publishing Co., Londres, Reino Unido), Kampfer e Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989 a 1005 (1996)), Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255 a 260 (1991)) e na US-A-5, 250,434.

[00067] As cepas que possuem a designação "ATCC" podem ser obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As cepas que possuem a designação "DSM" podem ser obtidas a partir da Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DSMZ, Brunswick, Alemanha). As cepas com a designação "NRRL" podem ser obtidas a partir do Serviço de Coleta de Pesquisa de Cultura de Patentes Agropecuária (ARS, Peoria, Illinois, EUA). As cepas com a designação "FERM" podem ser obtidas junto ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japão).

[00068] KIC-secretores ou as cepas produtoras são baseados, por exemplo, em:Corynebacterium glutamicum, cepa ATCC13032, Brevibacterium flavum, cepa ATCC 14067 e Brevibacterium lactofermentum, cepa ATCC 13869.

[00069] Em combinação com a produção de cetoisocaproato, além disso, de preferência, um ou mais genes de sequências de nucleotí- deos são (sobre) expressos que codificam as enzimas da biossíntese de cetoisocaproato, selecionadas a partir do grupo:polinucleotídeos (gene ilvB e genes ilvN) que codificam as subunida- des de uma sintase de acetolactato (IlvBN, Número EC: 4.1.3.18) polinucleotídeo (gene ilvC) que codifica uma isomeroredutase (IlvC, No. EC: 1.1.1.86)polinucleotídeo (gene ilvD) que codifica uma desidratase do ácido dihi- dróxi (ilvD, No. EC: 4.2.1.9)polinucleotídeo (gene ilvE) que codifica uma transaminase (ILVE, No. EC: 2.6.1.42)polinucleotídeo (gene leuA) que codifica para uma sintase de isopropi- lmalato (leuA, No. EC: 2.3.3.13)polinucleotídeo (gene leuB) que codifica uma desidrogenase de iso- propilmalato (LeuB, No. EC: 1.1.1.85)polinucleotídeo (gene Leuc), que codifica a subunidade grande de uma isomerase de isopropilmalato (Leuc, No. EC: 4.2.1.33) polinucleotídeo (gene leuD) que codifica a pequena subunidade de uma isomerase de isopropilmalato (LeuD, No. EC: 4.2.1.33)em que os genes ilvBN, ilvC, ilvD, leuA, leuB, leuC e leuD são particularmente preferidos para o ácido α-oicocetoisocaproico (KIC).

[00070] A presente invenção fornece um microrganismo que produz KIC ou L-leucina, em que o microrganismo tem uma sintase de α- isopropilmalato resistente àretroalimentação, devido à utilização do polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, de acordo com a SEQ ID NO: 5.

[00071] O processo fermentativo para a produção do KIC de produto químico puro, ou a L-leucina, compreendendo as seguintes etapas: fermentação de um dos microrganismos de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12 em um meio,acumulação do KIC, ou L-leucina no meio, em que um caldo de fermentação é obtido. Neste caso, é preferível que o produto químico puro, ou um produto contendo o produto químico puro líquido ou sólido seja obtido a partir do caldo de fermentação contendo o produto quí- mico puro.

[00072] A utilização de um tal processo de acordo com a presente invenção conduz, como mostrado no Exemplo 4, com referência a produção de ketoisocaproate ou como mostrado no Exemplo 5, com referência à produção de L-leucina, a um aumento extraordinário na produtividade em comparação com a respectiva cepa de partida (Exemplo 4, KIC : 0,027 g / g versus 0,012 g / g; Exemplo 5, leucina:0,041 g / g versus 0,002 g / g).

[00073] Além disso, é particularmente preferido que o microrganismo de acordo com a presente invenção produza KIC ou L-leucina, ainda mais preferivelmente segregue KIC ou L-leucina para o meio. Os microrganismos podem ser cultivados produzidos continuamente - tal como descrito, por exemplo, em WO 05 / 021772 - ou descontinu- amente no processo em batelada (cultura em batelada ou processo em batelada) ou em alimentação em batelada ou repetitivo processo de alimentação em batelada, para efeitos de produção do composto químico orgânico desejado. Um resumo de um tipo geral sobre métodos de cultivo conhecidos está disponível no livro por Chmiel (Biopro- zesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Processo bio-tecnologia 1. Introdução à bioengenharia] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)), ou no livro didático por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [biorreatores e equipamentos periferia] (Vie- weg Verlag, Brunswick / Wiesbaden, 1994)).

[00074] O meio de cultura ou meio de fermentação, que é para ser usado de forma adequada deve satisfazer as exigências das respectivas linhagens. As descrições de meios de cultura de vários microrganismos estão contidas no manual "Manual de Métodos de Bacteriologia Geral" da Sociedade Americana de Bacteriologia (Washington DC, EUA, 1981). O meio de cultura e as condições de fermentação, ou em meio são mutuamente trocáveis.

[00075] Como fonte de carbono, os açúcares e hidratos de carbono podem ser utilizados, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, as soluções de açúcar de beterraba ou açúcar de processamento de cana, amido, hidrolisado de amido e celulose, óleos e gorduras contendo sacarose, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos graxos, tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois, tais como, por exemplo, glicerol, metanol e etanol, e ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido láctico.

[00076] Como fonte de nitrogênio, os compostos orgânicos nitroge- nados tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de infusão de milho, farinha de soja e ureia ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio podem ser utilizados. As fontes de nitrogênio podem ser utilizadas individualmente ou como uma mistura.

[00077] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico ou os sais contendo sódio correspondente podem ser utilizados.

[00078] O meio de cultura deve, além disso, conter sais, por exemplo, sob a forma de cloretos ou sulfatos de metais tais como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e ferro, tais como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, os quais são necessários para o crescimento. Finalmente, as substâncias essenciais de crescimento, tais como aminoácidos, por exemplo, homosserina e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina ou ácido pantotênico, podem ser utilizadas para além das substâncias acima mencionadas.

[00079] Os referidos materiais de partida podem ser adicionados à cultura sob a forma de um único lote, ou são fornecidos em uma forma adequada durante a cultura.

[00080] Os compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou água de amônia, ou compostos de ácido, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, são utilizados de uma maneira apropriada para o controle do pH da cultura. O pH é geralmente ajustado para 6,0 a 8,5, de preferência 6,5 a 8. Para o controle do desenvolvimento de espuma, agentes anti-espuma podem ser utilizados, tal como, por exemplo, ésteres de poliglicol de ácidos graxos. Para manter a estabilidade dos plasmídeos, as substâncias que atuam seletivamente adequadas, tais como, por exemplo, os antibióticos, podem ser adicionados ao meio. A fermentação é preferencialmente realizada em condições aeróbias. De modo a manter as referidas condições ae- róbicas, o oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio, tais como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. A utilização de líquidos que são enriquecidos com peróxido de hidrogênio é de igual modo possível. Opcionalmente, a fermentação é realizada a uma pressão superior à atmosférica, por exemplo, a uma pressão superior à atmosférica de 0,03 a 0.2 MPa. A temperatura da cultura é geralmente de 20 ° C a 45 ° C, e de preferência de 25 ° C a 40 ° C, especialmente de preferência de 30 ° C a 37 ° C. No caso de processos em batelada ou alimentação em batelada, a cultura é preferivelmente continuada até que uma quantidade suficiente para o ato de se obter o composto químico orgânico desejado seja formado. Este objetivo é alcançado geralmente dentro de 10 horas a 160 horas. Nos processos contínuos, o tempo de cultura mais longo são possíveis. Devido à atividade dos microrganismos, o enriquecimento (acumulação) de produtos químicos puros, no meio de fermentação e / ou nas células dos microrganismos ocorre.

[00081] Exemplos de meios de fermentação adequados podem ser encontrados, inter alia, nos documentos de patente U.S. 5.770.409, U.S. 5.990.350, U.S. 5.275.940, WO 2007 / 012078, U.S. 5.827.698, WO 2009 / 043803, U.S. 5.756.345, ou U.S. 7.138.266; As modificações adequadas podem, opcionalmente, ser levadas a cabo com os requisitos das cepas utilizadas.

[00082] Os L-aminoácidos podem ser analisados para a determinação da concentração de um ou mais pontos do tempo no decurso da fermentação, por meio da separação dos L-aminoácidos por meio de cromatografia de troca iônica, de preferência a cromatografia de troca catiônica, com subsequente pós-coluna de derivatização, utilizando ninidrina, tal como descrito em Spackman et al. (Química Analítica 30: 1190 a 1206 (1958)). Em vez de ninidrina, orto-ftaldialdeído também pode ser usado para pós-coluna de derivatização. Um artigo de revisão sobre cromatografia de troca iônica pode ser encontrado em Pickering (LC • GC (Revista de Ciência cromatográfica) 7 (6), 484 a 487 (1989)).

[00083] É igualmente possível executar uma derivação de pré- coluna, utilizando, por exemplo, orto-ftaldialdeído ou fenilisotiocianato, e para separar os derivados de aminoácidos resultantes por meio da cromatografia de fase reversa (RP) de preferência sob a forma de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) . Tal método é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Química Analítica 51: 11671174 (1979)).

[00084] Detecção de procedimentos por meio da fotometria (absorção, fluorescência).

[00085] A apresentação resuminda em análise de aminoácidos pode ser encontrada, entre outros, no livro "Bioanalytik" [Bioanalysis] por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1998).

[00086] A análise de ácidos α-ceto tal como KIC para determinar a concentração de um ou mais pontos do tempo no decurso da fermen- tação pode ser realizada através da separação dos ceto-ácidos e outros produtos de secreção por meio de cromatografia de troca iônica, de preferência cromatografia de troca catiônica, em um polímero de estireno-divinilbenzeno sulfonado na forma H +, por exemplo, utilizando ácido sulfúrico a 0,025 N com detecção UV subsequente em 215 nm (em alternativa, também a 230 ou 275 nm). De preferência, um REZEX PDO - coluna Fast Fruit + (Phenomenex) pode ser usado; outros fornecedores para a fase de separação (por exemplo, da BioRad Aminex) são possíveis. As separações semelhantes são descritas em exemplos de aplicação correspondentes dos fornecedores.

[00087] O desempenho dos processos ou processos de fermentação de acordo com a presente invenção em relação a um ou mais dos parâmetros selecionados a partir do grupo de concentração (composto formado por volume), o rendimento (composto formado por fonte de carbono consumido), a formação (composto formado por volume e tempo) e formação específica (composto formado por célula seca em massa ou a massa bio seca e o tempo =ou composto formado por proteína de célula e do tempo) ou de outros parâmetros de processamento e as suas combinações, é aumentado em pelo menos a 0,5 %, pelo menos 1 %, em menos de 1,5 % ou, pelo menos, 2 %, com base em processos ou processos de fermentação com os microrganismos, em que a variante do promotor de acordo com a presente invenção está presente.

[00088] Devido às medidas da fermentação, um caldo de fermentação é obtido, que contém o produto químico puro desejado, de preferência o aminoácido ou o ácido orgânico.

[00089] Em seguida, um produto sob a forma líquida ou sólida que contém o produto químico puro, é fornecido ou produzido ou obtido.

[00090] Um caldo de fermentação é tomado como significando, em uma modalidade preferida, um meio de fermentação ou meio nutritivo em que um microrganismo é cultivado durante um determinado perío- do de tempo e em uma certa temperatura. O meio de fermentação, ou os meios utilizados durante a fermentação, contém / contêm todas as substâncias ou componentes que assegurem a produção do composto desejado, e tipicamente garantem o crescimento e / ou a viabilidade.

[00091] Após a conclusão do processo fermentativo, o caldo de fermentação resultante contem consequentementea biomassa (massa celular) do microrganismo resultante do crescimento das células do microrganismo,o produto químico puro desejado formado no decurso da fermentação, os subprodutos orgânicos, possivelmente formado no decurso da fermentação, eos componentes do meio de fermentação utilizados ou os materiais de partida, que não são consumidospor meio da fermentação, tais como, por exemplo, vitaminas, tais como biotina, ou sais, tais como sulfato de magnésio.

[00092] Os subprodutos orgânicos incluem substâncias que são geradas, além do respectivo composto desejado por meio dos microrganismos utilizados para a fermentação e são possivelmente segregados.

[00093] O caldo de fermentação é retirado do vaso de cultura ou do recipiente de fermentação, opcionalmente recolhido e utilizado para proporcionar um produto sob a forma líquida ou sólida, contendo o produto químico puro. A expressão "obtenção do produto puro contendo química" também é utilizada para esse fim. No caso mais simples, o caldo de fermentação contendo o produto químico puro retirado do recipiente de fermentação é o produto obtido.

[00094] Por meio de uma ou mais das ações selecionadas de entre o grupoparcial (> 0 % e <80 %) para completar (100 %) ou virtualmente completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %) remoção da água, parcial (> 0 % e <80 %) para completar (100 %) ou virtualmente completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %) remoção da biomassa, em que este é opcionalmente inativado antes da remoção,parcial (> 0 % e <80 %) para completar (100 %) ou virtualmente completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, 99,7 % >) remoção do orgânica subprodutos formados no decurso da fermentação, eparcial (> 0 %) para completar (100 %) ou virtualmente completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) remoção dos componentes do meio de fermentação utilizado ou os materiais de partida que não são consumidos por meio da fermentação, uma concentração ou purificação do composto químico orgânico desejado é obtida a partir do caldo de fermentação. Desta maneira, os produtos são isolados que têm um conteúdo desejado do composto.

[00095] A parcial (> 0 % e <80 %) a completa (100 %) ou virtualmente completa (> 80 % a <100 %) remoção de água (medida a)) é também denominada secagem.

[00096] Em uma variante do processo, por meio da remoção completa ou praticamente completa da água, a biomassa, o subprodutos orgânicos e os componentes não consumidos do meio de fermentação utilizado, puro (> 80 %, em peso, > 90 % em peso ) ou de alta pureza (> 95 %, em peso, > 97 %, em peso, > 99 % em peso) das formas de produto do composto químico orgânico desejado, de preferência os L- aminoácidos, são obtidos com sucesso. Para as medidas de acordo com a), b), c) ou d), uma grande variedade de técnicas de instruções estão disponíveis na técnica anterior.

[00097] No caso dos processos para a produção de KIC ou L- leucina, utilizando as bactérias do gênero Corynebacterium, são preferidos processos nos quais os produtos são obtidos, que não conte- nham quaisquer componentes do caldo de fermentação. Estes produtos são utilizados, em particular, em medicina humana, na indústria farmacêutica, e na indústria alimentar.

[00098] O processo de acordo com a presente invenção serve para a produção fermentativa de KIC ou L-leucina.

[00099] A presente invenção finalmente refere-se ao uso do microrganismo de acordo com a presente invenção para a produção fermen- tativa de KIC ou L-leucina.

[000100] A presente invenção será descrita em mais pormenores a seguir com referência às modalidades exemplares.

Exemplo 1A produção do vetor de troca pK18mobsacB_leuA_Y553D

[000101] A síntese de um 812 pb de um construto de troca longofoi realizada a GeneArt (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) (vide SEQ ID NO: 7). O fragmento contém o último 594 pb do gene leuA de tipo selvagem (terminal C) de 206 pb da região a jusante do gene de leuA ATCC13032, e também os locais de corte, tanto Sphl e BamHI necessários para a clonagem no vetor de pK18mobsacB. Na posição 195, a montante da extremidade 3 ' do gene leuA, nesse fragmento de troca, a base do T está mutada para a base G - isto muda o códon de tipo selvagem TAC (que codifica o aminoácido Y, tirosina) para o códon GAC (que codifica o aminoácido D, aspartato). A clona-gem do fragmento no vetor pK18mobsacB foi realizada na empresa GeneArt. O vetor de troca resultante pK18mobsacB_leuA_Y553D foi entregue por GeneArt e utilizado para produzir as cepas de exemplo (vide o Exemplo 3).

Exemplo 2Produção de cepa C. glutamicum ATCC13032_DilvE

[000102] A cepa C. glutamicum ATCC13032 foi transformada com o plasmídeo pK19mobsacB_DilvE (Marienhagen et al., Journal of Bacte- riology 187: 7639 a 7646 (2005)) por meio da eletroporação. A eletro- poração foi levada a cabo de acordo com o protocolo de Haynes et al. (FEMS Microbiology Letters 61: 329 a 334 (1989)).

[000103] O plasmídeo ou pK18mobsacB pK18mobsacB_DilvE não pode replicar-se independentemente em C. glutamicum ATCC13032 e só é mantido na célula se, em consequência de um caso de recombi- nação, que tem integrado no cromossoma. O rastreio de clones possuindo um pK18mobsacB_DilvE integrado foi realizado por meio do chapeamento da eletroporação em batelada em ágar LB (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a Ed., Cold Spring Ha- bor, Nova Iorque, 1989), que foi suplementado com 15 mg / l de ca- namicina. Os clones que cresceram foram riscados em placas de ágar LB contendo 25 mg / l de canamicina e incubados durante 16 horas a 33 ° C. Para o rastreio de mutantes, em que, como consequência de um segundo caso de recombinação, o plasmídeo foi excizado, os clones foram cultivados 20 horas não seletivamente em um meio LB líquido (+ 5 g / l de acetato de potássio), depois semeados em placas de ágar LB contendo 10 % de sacarose e incubados durante 24 horas.

[000104] O plasmídeo pK18mobsacB_DilvE contém, assim como o plasmídeo de partida pK18mobsacB, para além do gene de resistência à canamicina, uma cópia do gene sacB que codifica a sacarase levano a partir de Bacillus subtilis. A expressão indutivel de sacarose conduz à formação de sacarase levano, que catalisa a síntese de levano, o produto tóxico para C. glutamicum. Em ágar LB (contendo 5 g / l de acetato de potássio), com sacarose, portanto, apenas os clones crescem em que o pK18mobsacB integrado foi novamente excizado. Na excisão, em conjunto com o plasmídeo, tanto a cópia cromossômica completa de ilvE pode ser excizada, quanto a cópia incompleta com a deleção interna de ilvE.

[000105] Aproximadamente 40 a 50 colônias foram examinadas quanto ao fenótipo "do crescimento na presença de sacarose" e "não crescimento na presença de canamicina". A fim de detectar se o alelo ilvE excluído manteve-se no cromossoma, cerca de 20 colônias, que possuem o fenótipo "do crescimento na presença de sacarose" e "não crescimento na presença de canamicina" foram estudadas de acordo com o método padrão de PCR Innis et al. (Protocolos de PCR. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) usando a reação em cadeia da polimerase. Neste caso, a partir do DNA cromossô- mico das colônias, um fragmento de DNA foi amplificado que transporta as regiões circundantes da região ilvE excluída. Os seguintes oligo- nucleotídeos iniciadores foram selecionados para PCR.ilvE-Xbal-FW 5'-gctctagagccaagcctagccattcctcaa-3 'ilvE-Xbal-rev 5'-gctctagagccagccactgcattctcctta-3 '

[000106] Os iniciadores permitem, em clones de controle possuindo local ilvE completa, a amplificação de um fragmento de DNA kb de tamanho aproximadamente de 1,4. Os clones que possuem um local ar- gFRGH suprimido, os fragmentos de DNA com um tamanho aproximado de 0,6 kb foram amplificados.

[000107] Os fragmentos de DNA amplificados foram identificados por meio da eletroforese em um gel de ágarose a 0,8 % de força. Poderia ser, assim, mostrado que a cepa transporta um alelo ilvE eliminado no cromossoma. A cepa foi denominada C. glutamicum ATCC13032_DilvE e foi estudada no teste de produção (vide o Exemplo 4) por meio da sua capacidade de produzir Isocaproate.

Exemplo 3Produção da cepa C. glutamicum

[000108] ATCC13032_DilvE_leuAY553D e C. glutamicumATCC13032_leuAY553D

[000109] A cepa de C. glutamicum ATCC13032 e cepa C. glutami- cum ATCC13032_DilvE do Exemplo 2 foram transformadas por meio da eletroporação com o plasmídeo de pK18mobsacB_leuA_Y553D Exemplo 1. O método é descrito em detalhe no Exemplo 2.

[000110] As trocas do códon de tipo selvagem TAC (que codifica a tirosina na posição 553) parao códon GAC (que codifica aspartato na posição 553), foram demonstradas por meio da sequenciação de uma pluralidade de clones candidatos do fenótipo "do crescimento na presença de sacarose" e "não crescimento na presença de canamicina ". Para esta finalidade, em primeiro lugar um fragmento de PCR de leuA- 1 (767 pb de comprimento) com os iniciadoresleuA1 (5'-GATCTATCTAGATTGAGGGCCTTGGGCATACG-3 ') e leuA-2 (5 '-GATCTAGGATCCGCGACTACGAGGCTGTTATC-3') foi produzido, e este foi sequenciado com o iniciadorleuA-3 (5'-GATCTATCTAGAAAGCTTAAACGCCGCCAGCC-3 ').

[000111] Os clones candidatos positivos foram selecionados e analisados no teste de desempenho subsequente (Exemplos 4 e 5).

Exemplo 4Produção de cetoisocaproato com C. glutamicum ATCC13032, C. glu- tamicum ATCC13032_DilvE e C. glutamicum ATCC13032_DilvE_ leuAY553D

[000112] Para estudar a sua capacidade de produzir cetoisocaproa- to, a cepas C. glutamicum ATCC13032, C. glutamicum ATCC13032_DilvE e C. glutamicum ATCC13032_DilvE_leuAY553D foram pré-cultivadas em 10 ml de meio de teste em cada caso, durante 16 horas a 33 ° C. Para o ensaio de produção, cada 10 ml de meio de teste foram inoculadas com a pré-cultura resultante de tal maneira que o diâmetro externo de partida 600 (densidade óptica a 600 nm) foi de 0,1. Cada clone foi examinado em três frascos de agitação de tal maneira que cada uma das cepas está representada por um total de nove frascos de agitação. O meio do teste foi idêntico ao meio descrito no CgXII Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593 a 5603), mas adicionalmente, continha, em cada caso 200 mg / l de aminoácidos L-leucina, L-valina e L-isoleucina. Por uma questão de simplicidade, a composição do meio de ensaio está resumida na Tabela 1 a seguir.Tabela 1: Composição do meio de CgXII com adição de, em cada caso, 200 mg / l de aminoácidos L-leucina, L-valina e L-isoleucina

[000113] A cultura foi realizada a 33 ° C e 200 rpm em 100 ml de frascos de agitação. A amplitude do agitador era de 5 cm. Após 24 horas, foram retiradas amostras das culturas e a densidade óptica foi determinada. Subsequentemente, as células foram centrifugadas breve- mente fora (centrífuga de bancada tipo 5415D (Eppendorf) a 13 000 rpm, 10 min, temperatura ambiente) e o conteúdo de glicose e o teor de cetoisocaproato foram determinados no sobrenadante.

[000114] A densidade óptica foi determinada em um comprimento de onda de 660 nm utilizando uma placa de microtitulação fotômetro GENios (Tecan, Reading, Reino Unido). As amostras foram diluídas a 1: 100 antes de medição com água desmineralizada. A análise de KIC para determinação da concentração de produto por meio da separação dos cetoácidos e outros produtos de secreção por meio da cromato- grafia de troca catiônica (REZEX PDO - coluna Fast Fruit H + (Pheno- menex)) em um polímero de estireno-divinilbenzeno sulfonado na forma H + utilizando ácido sulfúrico a 0,025 N com subsequente detecção de UV a 215 nm.

[000115] Para o cálculo do rendimento de KIC, a quantidade de KIC formada foi dividida pela quantidade de dextrose consumida.

[000116] Os resultados da experiência do frasco de agitação para a formação de cetoisocaproato estão apresentados na Tabela 2.Tabela 2: Formação cetoisocaproato após 24 horas de incubação. Abreviaturas: KIC = cetoisocaproato

Exemplo 5:

[000117] Produção de L-leucina com C. glutamicum ATCC13032 eC. glutamicum ATCC13032_leuAY553D

[000118] Para investigar a sua capacidade para produzir a leucina, a cepas de C. glutamicum ATCC13032 e C. glutamicum ATCC13032_leuAY553D foram pré-cultivadas em cada caso em 10 ml de meio de teste durante 16 horas a 33 ° C. O teste de produção foi efetuado de uma forma semelhante ao Exemplo 4, com a exceção de uma adaptação do meio de teste que, para este teste, não contêm os suplementos de leucina, valina e isoleucina. O meio do teste foi idêntico ao meio descrito no CgXII Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593 a 5603).

[000119] A densidade óptica foi determinada em um comprimento de onda de 660 nm utilizando uma placa de microtitulação fotômetro Genios (Tecan, Reading, Reino Unido). As amostras foram diluídas a 1: 100 antes de medição com água desmineralizada. A quantidade de leucina formada foi determinada utilizando um analisador de aminoáci- dos a partir de Eppendorf-Biotronik (Hamburgo, Alemanha), por meio da cromatografia de troca iônica e derivatização pós-coluna com detecção de ninidrina.

[000120] Na Tabela 3, os dados de desempenho obtidos a partir da experiência dos frascos de agitação sobre a formação de leucina encontram-se resumidos.

[000121] Para o cálculo do rendimento de leucina, a quantidade de leucina que se formou foi dividida pela quantidade de dextrose consumida.Tabela 3: Formação de Leucina depois de incubação por 24 horas.

Figura 1: Mapa do plasmídeo pK18mobsacB_leuA_Y553D

[000122] As abreviaturas e nomes utilizados têm os seguintes significados. oriV: origem ColE1-like de pMB1sacB: o gene sacB que codifica a proteína levulanoinvertaseRP4-mob: mobilização local RP4Kan: gene de resistência a canamicinaleuA-3 ': 594 pares de bases do gene leuA (terminal C)

Claims (16)

1. Sequência de nucleotídeos isolada, caracterizada pelo fato de que tem guanina na posição 1657 da SEQ ID NO: 5 ou em uma posição correspondente da SEQ ID NO: 5, em que é como representada na SEQ ID NO: 5, e em que codifica uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 2, em que SEQ ID NO: 2, na posição 553, ou em uma posição correspondente da sequência de aminoácidos, possui um aminoácido proteinogênico diferente de L-tirosina e em que a sequência de nucleotídeos é uma sequência de nucleotídeos replicável que codifica a enzima isopropilmalato sintase isolada de microrganismos do gênero Corynebacterium, em que as sequências proteicas codificadas pelas mesmas contêm um aminoácido proteinogênico diferente de L- tiro- sina na posição correspondente à posição 553 da SEQ ID NO: 2.

2. Sequência de nucleotídeos isolada, caracterizada pelo fato de que tem guanina na posição 1657 da SEQ ID NO: 5 ou em uma posição correspondente da SEQ ID NO: 5, em que é como representada na SEQ ID NO: 5, e em que codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a SEQ ID NO: 2, na posição 553, ou em uma posição correspondente do sequência de aminoácidos, tem um amino- ácido proteinogênico diferente de L-tirosina e em que a sequência de aminoácidos codificada pela referida sequência de nucleotídeos possui, na posição 553 ou em uma posição correspondente, um aminoácido que é selecionado dentre o grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico, alanina, cisteína, serina, treonina, lisina, arginina, glutami- na e asparagina, particularmente preferencialmente dentre o grupo que consiste em ácido glutâmico e ácido aspártico.

3. Sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos codificada desse modo tem, na posição 553, ou uma posição correspondente, o ácido L-aspártico.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 3, em que é apropriado para a replicação em microrganismos do gênero Corynebacterium.

6. Polipeptídeo de isopropilmalato sintase, caracterizado pelo fato de que tem inibição de retroalimentação reduzida em relação à enzima do tipo selvagem, que é codificada por meio da sequência de nucleotídeos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido polipeptídeo é representado por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que SEQ ID NO: 2, na posição 553, ou em uma posição correspondente da sequência de ami- noácidos, possui um aminoácido proteinogênico diferente de L-tirosina e em que contém um aminoácido proteinogênico diferente de L- tirosina na posição correspondente à posição 553 da SEQ ID NO: 2, ouem que o referido polipeptídeo é representado por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que a SEQ ID NO: 2, na posição 553, ou em uma posição correspondente da sequência de ami- noácidos, tem um aminoácido proteinogênico diferente de L-tirosina e em que possui, na posição 553 ou em uma posição correspondente, um aminoácido que é selecionado dentre o grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico, alanina, cisteína, serina, treonina, lisina, ar- ginina, glutamina e asparagina, particularmente preferencialmente dentre o grupo que consiste em ácido glutâmico e ácido aspártico, ouem que o referido polipeptídeo tem, na posição 553, ou uma posição correspondente, o ácido L-aspártico.

7. Microrganismo do gênero Corynebacterium, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou o polipeptídeo como definido na reivindicação 6, ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 5.

8. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 está presente na forma supe- rexpressa.

9. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de nu- cleotídeos está integrada em um cromossomo.

10. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que é Corynebacterium glutamicum.

11. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo tem a capacidade de produzir um produto químico fino.

12. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 11, ca-racterizado pelo fato de que o produto químico fino é L-leucina ou KIC.

13. Processo fermentativo para a produção de KIC ou L- leucina, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) fermentação de um dos microrganismos como definidos em qualquer uma das reivindicações 7 a 12 em um meio,(b) acumulação de KIC ou L-leucina no meio, em que um caldo de fermentação é obtido.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é um processo que é selecionado dentre o grupo que consiste em um processo em batelada, um processo de alimentação em batelada, um processo de alimentação em batelada repetitivo e um processo contínuo.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 14, caracterizado em fato de que o produto químico fino, ou um produto contendo o produto químico fino líquido ou sólido é obtido a partir do caldo de fermentação contendo o produto químico fino.

16. Uso do microrganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que é para a produção fermentativa de L-leucina ou KIC.

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