KR102074841B1

KR102074841B1 - 피드백-내성 알파-이소프로필말레이트 신타제

Info

Publication number: KR102074841B1
Application number: KR1020147029624A
Authority: KR
Inventors: 로버트 게르스트마이어; 이리스 비어그레베
Original assignee: 에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2020-02-07
Also published as: CN104302765B; WO2013160124A1; CN104302765A; BR112014021439B1; JP6341907B2; US9347048B2; CA2869683C; KR20150003752A; EP2841568A1; JP2015514431A; BR112014021439A2; PL2841568T3; US20150079641A1; ES2666072T3; CA2869683A1; EP2841568B1; DK2841568T3

Abstract

본 발명은 서열 2의 아미노산 서열에 적어도 ≥ 90%, ≥ 92%, ≥ 94%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% 또는 100%, 바람직하게는 ≥ 97%, 특히 바람직하게는 ≥ 98%, 매우 특히 바람직하게는 ≥ 99%, 극히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하며, 여기서 서열 2는 위치 553 또는 아미노산 서열의 상응하는 위치에 L-티로신 이외의 다른 단백질생성 아미노산을 갖는 것인, 단리된 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 미생물, 및 또한 상기 미생물을 사용하여 정밀 화학물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

피드백-내성 알파-이소프로필말레이트 신타제 {FEEDBACK-RESISTANT ALPHA-ISOPROPYLMALATE SYNTHASES}

특히 아미노산, 유기산, 비타민, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 포함하는 정밀 화학물질은 인간 의약, 제약 산업, 화장품, 식품 산업 및 동물 사료에서 사용된다.

매우 많은 이들 화합물이 코리네형(coryneform) 박테리아의 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 생산된다. 그의 큰 중요성 때문에, 그 생산 방법을 개선하기 위한 노력이 계속 진행중이다. 방법 개선은 발효 수단, 예를 들어 교반 및 산소 공급, 또는 영양 배지의 조성, 예를 들어 발효 동안 당 농도, 또는 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태를 제공하는 후처리, 또는 미생물 자체의 고유한 성능 특성에 관련될 수 있다.

상기 미생물의 성능 특성을 개선하기 위해 돌연변이유발, 스크리닝 및 돌연변이체 선택의 방법이 사용된다. 상기 방식으로, 항대사물질, 예를 들어 류신 유사체 4-아자류신 또는 5,5,5-트리플루오로류신에 대해 내성이고 화학적 화합물, 예를 들어 L-아미노산, 예컨대 L-류신을 생산하는 균주를 수득한다. 예로서, 참조 문헌 [Casalone et al. (Research in Microbiology 148: 613-623 1997)]을 언급할 수 있다.

마찬가지로, 수년 동안, 코리네박테리움 글루타미쿰의 L-아미노산-생산 균주의 균주 개선을 위해 재조합 DNA 기술의 방법이 사용되었고, 즉, 예를 들어 개별 아미노산 생합성 유전자가 증폭되거나 약화되고, 화학적 화합물의 생산에 대한 효과가 연구되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 생물학, 유전학 및 생명공학에 대한 요약 제시는 문헌 ["Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: L. Eggeling and M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005)], 표제 "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" (Journal of Biotechnology 104/1-3, (2003))의 문헌 [Journal of Biotechnology (Chief Editor: A. Puehler)]의 특집호, 및 저서 [T. Scheper (Managing Editor) "Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Springer Verlag, Berlin, Germany, 2003)]에서 찾을 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌 [Ikeda and Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003))], EP 1 108 790 및 [Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104/1-3, (2003))]에 기재되어 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 마찬가지로 미국 국립 의학 도서관(National Library of Medicine; 미국 메릴랜드주 베데스다)의 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information (NCBI))의 데이터베이스, 일본의 DNA 데이터 뱅크(DNA Data Bank of Japan (DDBJ); 일본 미시마) 또는 유럽 분자 생물학 래보러토리즈(European Molecular Biologies Laboratories (EMBL); 독일 하이델베르크 또는 영국 캠브리지)의 뉴클레오티드 서열 데이터베이스에서 이용가능하다.

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 α-이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 leuA 유전자는 특히, 다음 상세한 내용에 의해 설명된다:

α-이소프로필말레이트 신타제 (IPMS, EC=2.3.3.13)는 3-카르복시-3-히드록시-4-메틸펜타노에이트 (2-이소프로필말레이트)의 형성을 위해 아세틸-CoA의 아세틸기와 3-메틸-2-옥소부타노에이트 (2-엑소이소발러레이트, 케토이소발러레이트)와의 축합을 촉매한다. leuA 유전자는 1851 염기쌍 (bp)을 포함하고, 68 187의 M(r)을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 생합성 경로의 제1 단계를 촉매하는 효소는 널리 퍼져있으므로, α-이소프로필말레이트 신타제는 최종 생성물 류신에 의한 피드백 조절을 받는다 (문헌 [Patek et al., Applied Environmental Microbiology 60:133-140(1994)]). 추가로, 효소는 2가 양이온, 특히 아연의 존재 하에 조효소 A에 의해 억제된다 (문헌 [Ulm et al., Journal of Bacteriology 110(3): 1118-1126 (1972)]; [Tracy and Kohlhaw, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 72(5): 1802-1806 (1975)]).

NCBI 데이터베이스의 상세한 내용에 따라, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 α-이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 leuA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열 1에 제시하고, 그로부터 생성되는 코딩된 α-이소프로필말레이트 신타제의 아미노산 서열을 서열 4에 제시한다. 서열 3에서는, 상류 및 하류에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 보고한다.

본 발명의 목적은 세포 내에서 및/또는 배지 내에서 개선된 수율 또는 보다 높은 최종 농도의 생성물을 갖는 케토이소카프로에이트 또는 L-류신을 생산하기 위한 발효 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 심지어 높은 세포 내 농도의 류신의 존재 하에서도, 케토이소카프로에이트 또는 류신을 생산할 수 있는 방식으로 변형된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 발효를 위해 사용된 탄소 기질의 양을 기초로 하여 케토이소카프로에이트 또는 류신의 수율을 개선하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도 α-이소프로필말레이트 신타제의 돌연변이가 케토이소카프로에이트 및 류신의 생산의 증가를 일으킴을 확립하기에 이르렀다. 임의의 이론에 매이기를 바라지 않지만, 본 발명자들은 상기 돌연변이가 효소의 피드백 억제, 즉, 생성물을 효소에 결합시킴으로써 매개된 효소 활성의 저하를 감소시키거나 심지어 제거한다고 의심하였다.

표현 "류신" ("L-류신"과 동의어로 사용됨)은 또한 그의 염, 예를 들어 L-류신 히드로클로라이드, L-류신 술페이트 또는 칼슘염을 포함한다. 마찬가지로, 표현 케토이소카프로에이트 (KIC)는 또한 그의 염, 예를 들어 칼슘-KIC, 칼륨-KIC 또는 나트륨-KIC를 포함한다.

본 발명은 서열 2의 아미노산 서열에 적어도 ≥ 90%, ≥ 92%, ≥ 94%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% 또는 100%, 바람직하게는 ≥ 97%, 특히 바람직하게는 ≥ 98%, 매우 특히 바람직하게는 ≥ 99%, 극히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하며, 여기서 서열 2는 위치 553 또는 아미노산 서열의 상응하는 위치에 L-티로신 이외의 다른 단백질생성 아미노산을 갖는 것인, 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 위치 553 또는 상응하는 위치에 글루탐산, 아스파르트산, 알라닌, 시스테인, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 글루타민 및 아스파라긴으로 이루어진 군, 특히 바람직하게는 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산은 위치 553 또는 상응하는 위치에 L-아스파르트산을 갖는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 서열 5에 제시된, 위치 1657 또는 상응하는 위치에 구아닌을 갖는 핵산 서열이다.

표현 "아미노산 서열의 위치 553에 상응하는 위치" 또는 "아미노산 서열의 위치 553과 비슷한 위치"는 코딩되는 폴리펩티드의 N-말단 영역 (서열 2의 위치 553을 기준으로 함) 내의 아미노산을 코딩하는 코돈의 삽입 또는 결실에 의해, 삽입의 경우에 위치 표현 및 길이 표현이 1개의 단위에 의해 형식적으로 증가되거나, 결실의 경우에 1개의 단위에 의해 감소된다는 사실을 의미한다. 동일한 방식으로, 코딩되는 폴리펩티드의 C-말단 영역 (위치 553을 기준으로 함)의 아미노산을 코딩하는 코돈의 삽입 또는 결실에 의해, 길이 표현은 삽입의 경우에 1개의 단위에 의해 형식적으로 증가되거나, 결실의 경우에 1개의 단위에 의해 감소된다. 그러한 비슷한 위치는, 예를 들어 Clustal W 프로그램 (문헌 [Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)]) 또는 MAFFT 프로그램 (문헌 [Katoh et al., Genome Information 2005; 16(1), 22-33])을 이용하는 "정렬"의 형태에서 아미노산 서열의 비교에 의해 쉽게 확인할 수 있다.

그러한 삽입 및 결실은 효소 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. "실질적으로 영향을 미치지 않는"은 상기 변이체의 효소 활성이 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 활성과 최대 10%, 최대 7.5%, 최대 5%, 최대 2.5%, 또는 최대 1% 상이함을 의미한다.

이소프로필말레이트 신타제의 효소 활성을 결정하기 위한 방법은 문헌 [Kohlhaw et al. (Methods in Enzymology 166:423-9 (1988))]에 기재되어 있고; 시험은 CoA를 이용한 환원에 의해 DTNB (5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 엘만(Ellman) 시약)으로부터 형성된 티오니트로벤조에이트 (TNB)로 인한 412 nm에서의 흡광의 변화를 측정하는 것을 기초로 한다.

따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 삽입(들) 또는 결실(들)을 포함하는, 상기 서열을 포함하며 서열 2 또는 6의 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 최대 5, 최대 4, 최대 3, 또는 최대 2개의 아미노산의 삽입 또는 결실을 함유한다.

코리네박테리움 속의 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 단리된 효소 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 복제가능한 뉴클레오티드 서열이 바람직하며, 여기서 그에 의해 코딩되는 단백질 서열은 서열 2의 위치 553에 상응하는 위치에 L-티로신 이외의 다른 단백질생성 아미노산을 함유한다.

또한, 코리네박테리움 속의 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 단리된 효소 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 복제가능한 뉴클레오티드 서열 (DNA)이 특히 바람직하며, 여기서 연관된 아미노산 서열은 위치 553에 L-아스파르트산을 함유하고, 이를 서열 6에 제시한다.

본 발명은 추가로, 코리네박테리움 속의 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 단리된 효소 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 복제가능한 뉴클레오티드 서열 (DNA)에 관한 것이며, 상기 뉴클레오티드 서열의 염기 서열은 위치 1657에 구아닌을 함유하고, 이를 서열 5에 예시한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하며 임의로 코리네박테리움 속의 미생물에서 복제되거나 그에 적합한 플라스미드 및 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 벡터 및 폴리펩티드를 포함하는 코리네박테리움 속의 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 예시적인 폴리펩티드를 서열 6에 제시한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 또는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 본 발명에 따라 미생물이 포함하는 폴리펩티드는 야생형 효소에 비해 감소된 피드백 억제를 갖는 변형된 IPMS이고, 즉, 효소는 대사에서 그의 생성물 또는 그로부터 형성된 대사물질 중 하나, 예를 들어 KIC 또는 L-류신에 의해 야생형 효소보다 덜 억제된다.

본 발명은 바람직하게는 추가로 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 벡터 및/또는 폴리펩티드를 포함하고, 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 바람직하게는 과다발현된 형태로 존재하는 코리네박테리움 속의 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 바람직하게는 과다발현된 형태로 존재하는 코리네박테리움 속의 미생물에 관한 것이며, 여기서 연관된 아미노산 서열은 위치 553에 L-아스파르트산을 함유하고, 이를 서열 6에 제시한다.

서열 2의 위치 553에서의 아미노산 교환을 특징으로 하는 α-이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위해, 선행 기술에서 설명된 돌연변이유발 방법을 사용한다.

돌연변이유발을 위해, 시험관내 방법, 예를 들어 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 (문헌 [T. A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger [Genetic engineering for beginners], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993]), 또는 문헌 [Newton and Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994)의 핸드북]에 설명된 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용할 수 있다.

돌연변이를 생성하기 위한 추가의 지침은 선행 기술, 및 유전학 및 분자 생물학의 공지의 교재에서, 예를 들어 문헌 [Knippers ("Molekulare Genetik" [Molecular genetics], 6^th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995)], [Winnacker ("Gene und Klone" [Genes and clones], VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990)] 또는 [Hagemann ("Allgemeine Genetik" [General genetics], Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)]에서 찾을 수 있다.

시험관내 방법을 이용할 때, 야생형 균주의 단리된 총 DNA로부터 출발하여 선행 기술에서 설명된 leuA 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 증폭시키고, 임의로 적합한 플라스미드 벡터 내로 클로닝한 후, DNA를 돌연변이유발 과정으로 처리한다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 DNA 서열을 증폭시키기 위한 지침은 당업자가 특히, 문헌 [Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)의 핸드북] 및 [Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾을 수 있다. 이어서, 적합한 leuA 대립유전자를 단리하고, 연구하고, 서열분석한다. 상기 목적을 위한 지침은, 예를 들어 문헌 [Kalinowski et al. (Molecular and General Genetics 224: 317-324 (1990))], [Kalinowski et al. (Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991))] 또는 [Follettie et al. (Journal of Bacteriology 175, 4096-4103 (1993))]에서 찾을 수 있다. 서열분석에 대한 지침은, 예를 들어 문헌 [Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467 (1977))]에서 찾을 수 있다.

따라서, 본 발명은 효소 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이고, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 추가로, 효소 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이고, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 그로 이루어진다.

예를 들어, 미생물과 같은 생명체에서 발생하는 뉴클레오티드 서열의 생화학 또는 화학 구조에 대한 상세한 내용은 특히, 교재 ["Biochemie" [Biochemistry] by Berg et al. (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, Germany, 2003; ISBN 3-8274-1303-6)]에서 찾을 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 표현 "뉴클레오티드 서열" 또는 "아미노산 서열"은 예를 들어 또 다른 서열과의 융합체 내에 명시된 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 DNA, RNA 및 그의 변형된 형태를 포함하는 군으로부터의 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다.

뉴클레오티드 서열이 핵염기 또는 염기 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T)을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체로 이루어지면, 이것은 데옥시리보뉴클레오티드 서열 또는 데옥시리보핵산 (DNA)으로서 설명된다. 뉴클레오티드 서열이 핵염기 또는 염기 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 갖는 리보뉴클레오티드 단량체로 이루어지면, 이것은 리보뉴클레오티드 서열 또는 리보핵산 (RNA)으로서 설명된다. 상기 뉴클레오티드 서열에서, 단량체들은 3'→5'-포스포디에스테르 결합을 통해 서로 공유 결합된다.

화학적 관점에서 유전자는 뉴클레오티드 서열이다. 단백질/폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표현 "유전자"와 동의어로 사용한다. 2가지 표현 "유전자" 및 "코딩 영역"은 동의어로 사용되고, 동일한 방식으로 2가지 표현 "단백질" 및 "폴리펩티드"도 동의어로 사용된다.

"단백질생성 아미노산"은 천연 단백질, 즉, 미생물, 식물, 동물 및 인간으로부터의 단백질에서 발생하는 아미노산을 의미한다. 이들은 단백질을 위한 구조적 단위로서 역할을 하고, 단백질 내에서 펩티드 결합을 통해 서로 연결된다.

이하에서, 단백질생성 L-아미노산을 언급하면, 이것은 L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소류신, L-류신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-아르기닌, L-프롤린 및 임의로, L-셀레노시스테인 및 L-피롤리신의 군으로부터 선택된 그의 염을 비롯한 하나 이상의 아미노산을 의미한다. 마찬가지로 L-아미노산은 L-호모세린을 포함한다. L-아미노산 L-류신이 특히 바람직하다.

과다발현은 일반적으로 이것이 출발 균주 (모 균주)인 경우에 출발 균주 또는 야생형 균주에 비해, 리보핵산, 단백질 (폴리펩티드) 또는 효소의 세포 내 농도 또는 활성의 증가를 의미한다. 출발 균주 (모 균주)는 과다발현을 일으키는 수단이 수행되는 균주를 의미한다.

과다발현에서, 재조합 과다발현의 방법이 바람직하다. 이들은 시험관내 제공된 DNA 분자를 사용하여 미생물이 생산되는 모든 방법을 포함한다. 그러한 DNA 분자는, 예를 들어 프로모터, 발현 카세트, 유전자, 대립유전자, 코딩 영역 등을 포함한다. 이들은 형질전환, 접합, 형질도입 등의 방법에 의해 목적하는 미생물 내로 전환된다.

발현 또는 과다발현의 정도는 유전자에 의해 전사된 mRNA의 양을 측정함으로써, 폴리펩티드의 양을 결정함으로써, 및 효소 활성을 결정함으로써 확립할 수 있다.

mRNA의 양을 결정하기 위해, 특히, 노던 블롯팅(Northern Blotting) 및 정량적 RT-PCR의 방법을 이용할 수 있다. 정량적 RT-PCR에서, 역전사가 폴리머라제 연쇄 반응의 상류에 연결된다. 상기 목적을 위해, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)의 라이트사이클러(LightCycler)™ 시스템 (베링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH), 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals), 독일 만하임))을, 예를 들어 문헌 [Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008))]에 설명된 바와 같이 사용할 수 있다. 단백질의 농도는 1- 및 2-차원 단백질 겔 분리, 및 상응하는 평가 소프트웨어를 이용하는 겔 내의 단백질 농도의 후속적인 광학 확인에 의해 결정할 수 있다. 코리네형 박테리아에 대한 단백질 겔의 제조를 위한 및 단백질을 확인하기 위한 일반적인 방법은 문헌 [Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001))]에 설명된 절차이다. 마찬가지로, 단백질 농도는 검출할 단백질에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴-블롯(Western-blot) 혼성화 (문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]), 및 농도를 결정하기 위한 상응하는 소프트웨어를 사용하는 후속적인 광학 평가에 의해 결정할 수 있다 (문헌 [Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39]; [Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)]). 얻어진 데이터의 통계적 유의성은 T 검정을 이용하여 결정한다 (문헌 [Gosset, Biometrika 6(1): 1-25 (1908)]).

과다발현을 달성하기 위해, 선행 기술에서, 다수의 방법이 이용가능하다. 이들은 유전자의 발현을 제어하는 뉴클레오티드 서열을 변경시키는 것에 추가로, 또한 카피수를 증가시키는 것을 포함한다.

카피수는 미생물의 세포질 내에서 복제되는 플라스미드에 의해 증가시킬 수 있다. 상기 목적을 위해, 선행 기술에서, 대부분의 다양한 군의 미생물에 대해 많은 플라스미드가 설명되어 있고, 상기 플라스미드를 사용하여 유전자의 카피수의 목적하는 증가가 설정될 수 있다. 코리네박테리움 속에 대한 적합한 플라스미드는, 예를 들어 문헌 [Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003))], 또는 [Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005))]에 설명되어 있다.

카피수는 추가의 카피를 미생물의 염색체 내로 삽입함으로써 적어도 하나 (1)의 카피가 추가로 증가될 수 있다. 코리네박테리움 속에 대해 적합한 방법은, 예를 들어 특허 문헌 WO 03/014330, WO 03/040373 및 WO 04/069996에 설명되어 있다.

다수의 프로모터가 목적하는 유전자의 상류에 배치되거나 발현시킬 유전자에 기능적으로 연결되고, 상기 방식으로 증가된 발현이 달성되는 점에서, 유전자 발현은 추가로 증가될 수 있다. 그 예는 특허 문헌 WO 2006/069711에 설명되어 있다.

유전자의 전사는 전사를 억제하는 단백질 (리프레서(repressor) 단백질) 또는 촉진하는 단백질 (활성화제(activator) 단백질)에 의해 제어될 수 있다. 따라서, 과다발현을 달성하기 위해, 활성화제 단백질의 발현을 증가시키거나, 리프레서 단백질의 발현을 감소시키거나, 이들을 작동 중단시키거나, 달리 리프레서 단백질의 결합 부위를 제거하는 것이 마찬가지로 가능하다.

연장의 속도는 코돈 용법(codon usage)에 의해 영향을 받고; 출발 균주에서 빈번하게 발생하는 전달 (t)-RNA를 위한 코돈의 사용은 번역을 증폭시킬 수 있다. 추가로, RNA 수준에서 코돈 AUG는, 예를 들어 코돈 GUG 및 UUG보다 2 내지 3배 더 효과적이므로, 많은 미생물 (에스케리키아 콜라이에서 77%)에서 가장 빈번하게 발생하는 코돈 ATG에 대한 개시 코돈의 교환은 번역을 상당히 향상시킬 수 있다 (문헌 [Khudyakov et al., FEBS Letters 232(2): 369-71 (1988)]; [Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17): 5656-60 (1985)]). 또한, 개시 코돈 및 플랭킹 영역 사이의 상호작용 효과가 설명되었으므로 개시 코돈의 서열 환경이 최적화될 수 있다 (문헌 [Stenstrom et al., Gene 273(2): 259-65 (2001)]; [Hui et al., EMBO Journal 3(3): 623-9 (1984)]).

DNA의 취급, DNA의 소화 및 라이게이션, 형질전환 및 형질전환체의 스크리닝에 관한 지침은 특히 공지의 핸드북 [Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에서 찾을 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

문헌 [Kirchner and Tauch (Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003))]에서는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 사용할 벡터의 선택을 설명하고 있다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열이 염색체 내에 통합된 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 미생물에 관한 것이다. 상동 재조합은 본 발명에 따른 벡터의 사용과 함께, 벡터에 의해 세포 내로 전달되는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 대한 염색체 상의 DNA 절편의 교환을 허용한다. 벡터의 고리형 DNA 분자 및 염색체 상의 표적 DNA 사이의 효율적인 재조합을 위해, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 교환될 DNA 영역에는 단부에 표적 부위에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 제공되고; 이들은 벡터의 통합 및 DNA의 교환 부위를 결정한다.

예를 들어, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에서 천연 유전자 부위에서 천연 leuA 유전자에 대해 교환될 수 있거나 추가의 유전자 부위에 통합될 수 있다.

발현 또는 과다발현은 바람직하게는 코리네박테리움 속의 미생물에서 수행한다. 코리네박테리움 속 내에서, 다음 종을 기초로 한 균주가 바람직하다: 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens; 여기서 타입 균주는 DSM44549로서 기탁됨), 코리네박테리움 글루타미쿰 (여기서 타입 균주는 ATCC13032로서 기탁됨), 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes; 여기서 타입 균주는 ATCC6871로서 기탁됨). 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 매우 특히 바람직하다.

코리네박테리움 글루타미쿰 종의 일부 구성원은 선행 기술에서 다른 명칭으로 또한 공지되어 있다. 이들은 예를 들어: 균주 ATCC13870 (코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)으로 명명됨), 균주 DSM20137 (코리네박테리움 릴륨(Corynebacterium lilium)으로 명명됨), 균주 ATCC17965 (코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)로 명명됨), 균주 ATCC14067 (브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)으로 명명됨), 균주 ATCC13869 (브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로 명명됨), 및 균주 ATCC14020 (브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)으로 명명됨)을 포함한다.

코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 표현 "미크로코쿠스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)"도 마찬가지로 사용되었다. 코리네박테리움 에피시엔스 종의 일부 구성원은 또한 선행 기술에서 코리네박테리움 테르모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 예를 들어 균주 FERM BP-1539로서 불렸다.

피드백-내성 IPMS를 도입하는 수단을 위해 사용된 미생물 또는 균주 (출발 균주)는 바람직하게는 이미 둘러싸는 영양 배지 내로 KIC 또는 L-류신을 분비하고, 여기에 축적시키는 능력을 갖는다. 상기 과정을 위해, 이하에서, 표현 "생산하는"을 또한 사용한다. 특히, 과다발현 수단을 위해 사용된 균주는 ≤120시간, ≤96시간, ≤48시간, ≤36시간, ≤24시간 또는 ≤12시간 (≤는 최대를 의미함)에 세포 또는 영양 배지 내에 ≥0.10 g/l, ≥0.25 g/l, ≥0.5 g/l, ≥1.0 g/l, ≥1.5 g/l, ≥2.0 g/l, ≥4 g/l 또는 ≥10 g/l (≥는 적어도를 의미함)의 L-류신 또는 KIC를 축적하는 능력을 갖는다. 출발 균주는 바람직하게는 돌연변이유발 및 스크리닝에 의해, 재조합 DNA 기술에 의해 또는 두 방법의 조합에 의해 생산된 균주이다.

당업자는 야생형 균주, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 타입 균주 ATCC 13032 또는 균주 ATCC 14067에서, 먼저 서열 5에 따른 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 삽입한 후, 미생물을 선행 기술에 설명된 추가의 유전학적 수단에 의해 목적하는 KIC 또는 L-류신을 생산하도록 하는 점에서 본 발명의 수단에 적합한 미생물에 이르는 것이 또한 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

상기 군의 박테리아의 균주의 분류학적 분류에 대한 정보는 특히 문헌 [Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983))], [Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p. 115-142. In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, UK)], [Kaempfer and Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996))], [Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991))] 및 US-A-5,250,434에서 찾을 수 있다.

지정 "ATCC"를 갖는 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 매나서스)으로부터 입수할 수 있다. 지정 "DSM"을 갖는 균주는 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ); 독일 브룬스빅)로부터 입수할 수 있다. 지정 "NRRL"을 갖는 균주는 애그리컬쳐럴 리서치 서비스 패턴트 컬쳐 콜렉션(Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS); 미국 일리노이주 페오리아)으로부터 입수할 수 있다. 지정 "FERM"을 갖는 균주는 내셔널 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST); 일본 이바라끼 츠꾸바 1-1-1 히가시 츠꾸바 센트럴 6)로부터 입수할 수 있다.

KIC-분비 또는 -생산 균주는 예를 들어 다음을 기초로 한다:

코리네박테리움 글루타미쿰, 균주 ATCC13032,

브레비박테리움 플라붐, 균주 ATCC14067, 및

브레비박테리움 락토페르멘툼, 균주 ATCC13869.

케토이소카프로에이트의 생산과 함께, 추가로, 바람직하게는 다음 군으로부터 선택된, 케토이소카프로에이트의 생합성의 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 유전자가 (과다)발현된다:

a) 아세토락테이트 신타제 (IlvBN, EC No.: 4.1.3.18)의 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (ilvB 유전자 및 ilvN 유전자),

b) 이소머로리덕타제 (IlvC, EC No.: 1.1.1.86)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (ilvC 유전자),

c) 디히드록시산 데히드라타제 (IlvD, EC No.: 4.2.1.9)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (ilvD 유전자),

d) 트랜스아미나제 (IlvE, EC No.: 2.6.1.42)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (ilvE 유전자),

e) 이소프로필말레이트 신타제 (LeuA, EC No.: 2.3.3.13)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (leuA 유전자),

f) 이소프로필말레이트 데히드로게나제 (LeuB, EC No.: 1.1.1.85)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (leuB 유전자),

g) 이소프로필말레이트 이소머라제 (LeuC, EC No.: 4.2.1.33)의 큰 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (leuC 유전자),

h) 이소프로필말레이트 이소머라제 (LeuD, EC No.: 4.2.1.33)의 작은 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (leuD 유전자),

여기서 유전자 ilvBN, ilvC, ilvD, leuA, leuB, leuC 및 leuD가 α-케토이소카프로산 (KIC)을 위해 특히 바람직하다.

본 발명은 KIC 또는 L-류신을 생산하는 미생물을 제공하고, 여기서 미생물은 서열 5에 따른 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 사용으로 인해 피드백-내성 α-이소프로필말레이트 신타제를 갖는다.

하기 단계를 포함하는, 정밀 화학물질 KIC 또는 L-류신을 생산하기 위한 발효 방법을 제공한다:

a) 배지 내에서 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 미생물 중 하나를 발효시키는 단계, 및

b) 배지 내에 KIC 또는 L-류신이 축적되며, 여기서 발효 브로쓰(broth)가 수득되는 것인 단계. 본 경우에, 정밀 화학물질 또는 액체 또는 고체 정밀 화학물질-함유 생성물이 정밀 화학물질-함유 발효 브로쓰로부터 수득되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 방법의 사용은 케토이소카프로에이트 생산에 관하여 실시예 4에 제시된 바와 같이 또는 L-류신 생산에 관하여 실시예 5에 제시된 바와 같이, 각각의 출발 균주에 비해 수율에서 놀라운 증가를 일으킨다 (실시예 4, KIC: 0.027 g/g 대 0.012 g/g; 실시예 5, 류신: 0.041 g/g 대 0.002 g/g).

추가로, 본 발명에 따른 미생물이 KIC 또는 L-류신을 생산하고, 훨씬 더 바람직하게는 KIC 또는 L-류신을 배지 내로 분비하는 것이 특히 바람직하다. 생산된 미생물은 목적하는 유기 화학적 화합물의 생산 목적을 위해 연속적으로, 예를 들어 WO 05/021772에 설명된 바와 같이, 또는 불연속적으로 배치(batch) 방법 (배치 배양 또는 배치 방법)으로 또는 유가식(fed-batch) 또는 반복적 유가식 방법으로 배양될 수 있다. 공지의 배양 방법에 대한 일반적인 종류의 요약은 교재 [Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Process biotechnology 1. Introduction to bioengineering] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))] 또는 교재 [Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and periphery equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994))]에서 이용가능하다.

사용할 배양 배지 또는 발효 배지는 각각의 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배양 배지의 설명은 핸드북 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 포함되어 있다. 용어 배양 배지 및 발효 배지 또는 배지는 상호 교환가능하다.

탄소원으로서, 당 및 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 사탕무 또는 사탕수수 가공으로부터의 수크로스-함유 용액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예를 들어 대두 오일, 해바라기 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어 아세트산 또는 락트산을 사용할 수 있다.

질소원으로서, 유기 질소 화합물, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수-침적수, 대두분 및 우레아 또는 무기 화합물, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 사용할 수 있다. 질소원을 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.

인 공급원으로서, 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다.

배양 배지는 또한, 성장을 위해 필요한 염을, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 클로라이드 또는 술페이트의 형태로, 예를 들어 황산마그네슘 또는 황산철을 함유해야 한다. 마지막으로, 아미노산, 예를 들어 호모세린 및 비타민, 예를 들어 티아민, 비오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 물질을 상기 언급된 물질에 추가로 사용할 수 있다.

상기 출발 물질은 단일 배치의 형태로 배양액에 첨가되거나, 배양 동안 적합한 방식으로 공급될 수 있다.

배양액의 pH 제어를 위해 염기성 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수, 또는 산 화합물, 예컨대 인산 또는 황산을 적합한 방식으로 사용한다. pH는 일반적으로 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8로 조정된다. 기포 발생의 제어를 위해, 예를 들어 지방산의 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 예를 들어 항생제와 같은 적합한 선택 작용성 물질을 배지에 첨가할 수 있다. 발효를 바람직하게는 호기성 조건 하에 수행한다. 상기 호기성 조건을 유지하기 위해, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어 공기를 배양액 내로 도입한다. 과산화수소를 농축시킨 액체의 사용도 마찬가지로 가능하다. 임의로, 발효를 초대기압에서, 예를 들어 0.03 내지 0.2 MPa의 초대기압에서 수행한다. 배양의 온도는 대체로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 배치 또는 유가식 방법의 경우에, 배양은 바람직하게는 목적하는 유기 화학적 화합물을 수득하는 수단을 위해 충분한 양이 형성될 때까지 계속된다. 상기 목표는 대체로 10시간 내지 160시간 내에 도달한다. 연속 방법에서, 보다 긴 배양 시간이 가능하다. 미생물의 활동 때문에, 발효 배지 내에 및/또는 미생물의 세포 내에 정밀 화학물질의 농축 (축적)이 일어난다.

적합한 발효 배지의 예는 특히 특허 문헌 US 5,770,409, US 5,990,350, US 5,275,940, WO 2007/012078, US 5,827,698, WO 2009/043803, US 5,756,345 또는 US 7,138,266에서 찾을 수 있고; 사용된 균주의 요건에 맞추어 임의로 수행할 수 있다.

문헌 [Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958))]에 설명된 바와 같이, 이온-교환 크로마토그래피, 바람직하게는 양이온-교환 크로마토그래피에 의한 L-아미노산의 분리에 이어 닌히드린을 사용한 후속적인 후-칼럼 유도체화에 의해, L-아미노산을 발효 과정에서 하나 이상의 시점에 농도 결정을 위해 분석할 수 있다. 닌히드린 대신에, 후-칼럼 유도체화를 위해 오르토-프탈디알데히드를 또한 사용할 수 있다. 이온-교환 크로마토그래피에 관한 검토 문헌은 문헌 [Pickering (LC·GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989))]에서 찾을 수 있다.

예를 들어, 오르토-프탈디알데히드 또는 페닐이소티오시아네이트를 사용하여 예비-칼럼 유도체화를 수행하고, 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 형태로 역상 크로마토그래피 (RP)에 의해 생성된 아미노산 유도체를 분리하는 것이 마찬가지로 가능하다. 그러한 방법은 예를 들어 문헌 [Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)]에 설명되어 있다.

검출은 광도계로 진행한다 (흡광도, 형광).

아미노산 분석에 대한 요약 제시는 특히 교재 ["Bioanalytik" [Bioanalysis] by Lottspeich and Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998)]에서 찾을 수 있다.

발효 과정에서 하나 이상의 시점에 농도를 결정하기 위한 KIC와 같은 α-케토산의 분석은 예를 들어 0.025 N 황산을 사용하여 H+ 형태의 술폰화 스티렌-디비닐벤젠 중합체 상에서 이온-교환 크로마토그래피, 바람직하게는 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 케토산 및 다른 분비 생성물을 분리하고, 215 nm에서 (다르게는 또한 230 또는 275 nm에서) 후속적으로 UV 검출함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게는, REZEX RFQ - 패스트 프루트(Fast Fruit) H+ 칼럼 (페노메넥스(Phenomenex))을 사용할 수 있고; 분리상을 위해 다른 공급자 (예를 들어 바이오라드(BioRad)의 아미넥스(Aminex))도 가능하다. 유사한 분리는 공급자의 상응하는 적용 예에 설명되어 있다.

농도 (형성된 화합물/부피), 수율 (형성된 화합물/소비된 탄소원), 형성 (형성된 화합물/부피 및 시간) 및 특이적 형성 (형성된 화합물/세포 건조 질량 또는 생물 건조 질량 및 시간, 또는 형성된 화합물/세포 단백질 및 시간) 또는 다른 방법 파라미터 및 그의 조합의 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터에 관하여 본 발명에 따른 방법 또는 발효 방법의 수행은, 본 발명에 따른 프로모터 변이체가 존재하는 미생물을 사용하는 방법 또는 발효 방법을 기초로 하여 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 1.5% 또는 적어도 2% 증가한다.

발효의 수단으로 인해, 목적하는 정밀 화학물질, 바람직하게는 아미노산 또는 유기산을 함유하는 발효 브로쓰가 수득된다.

이어서, 정밀 화학물질을 함유하는 액체 또는 고체 형태의 생성물이 제공되거나 생산되거나 수득된다.

발효 브로쓰는 바람직한 실시양태에서, 미생물이 특정 시간 동안 특정 온도에서 배양된 발효 배지 또는 영양 배지를 의미한다. 발효 배지 또는 발효 동안 사용된 배지는 목적하는 화합물의 생산을 보장하고 대개 성장 및/또는 생존력을 보장하는 모든 물질 또는 성분을 함유한다.

따라서, 발효의 완료 시에, 생성된 발효 브로쓰는 다음을 함유한다:

a) 미생물의 세포의 성장으로부터 생성된 미생물의 바이오매스(biomass) (세포 질량),

b) 발효 과정에서 형성된 목적하는 정밀 화학물질,

c) 가능하게는 발효 과정에서 형성된 유기 부산물, 및

d) 발효에 의해 소비되지 않은 사용된 발효 배지 또는 출발 물질의 성분, 예를 들어 비타민, 예컨대 비오틴, 또는 염, 예컨대 황산마그네슘.

유기 부산물은 각각의 목적하는 화합물에 추가로, 발효에 사용된 미생물에 의해 생성되고 가능하게는 분비된 물질을 포함한다.

발효 브로쓰를 배양 용기 또는 발효 용기로부터 취하고, 임의로 수집하고, 정밀 화학물질을 함유하는 액체 또는 고체 형태의 생성물을 제공하기 위해 사용한다. 표현 "정밀 화학물질-함유 생성물을 수득하는"이 또한 그에 대해 사용된다. 가장 단순한 경우에, 발효 용기로부터 취한 정밀 화학물질-함유 발효 브로쓰 자체가 수득된 생성물이다.

다음의 군으로부터 선택된 하나 이상의 수단에 의해, 발효 브로쓰로부터 목적하는 유기 화학적 화합물의 농축 또는 정제가 달성된다. 상기 방식에서, 목적하는 함량의 화합물을 갖는 생성물이 단리된다.

a) 물의 부분적 (> 0% 내지 < 80%) 내지 완전한 (100%) 또는 실질적으로 완전한 (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) 제거,

b) 바이오매스의 부분적 (> 0% 내지 < 80%) 내지 완전한 (100%) 또는 실질적으로 완전한 (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) 제거 (이것은 제거 전에 임의로 불활성화된다),

c) 발효 과정에서 형성된 유기 부산물의 부분적 (> 0% 내지 < 80%) 내지 완전한 (100%) 또는 실질적으로 완전한 (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99.3%, ≥ 99.7%) 제거, 및

d) 발효에 의해 소비되지 않은 사용된 발효 배지 또는 출발 물질의 성분의 부분적 (> 0%) 내지 완전한 (100%) 또는 실질적으로 완전한 (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99.3%, ≥ 99.7%) 제거.

물의 부분적 (> 0% 내지 < 80%) 내지 완전한 (100%) 또는 실질적으로 완전한 (≥80% 내지 < 100%) 제거 (수단 a))는 또한 건조로 칭한다.

방법의 변형에서, 물, 바이오매스, 유기 부산물 및 사용된 발효 배지의 비-소비된 성분의 완전한 또는 실질적으로 완전한 제거에 의해, 순수한 (≥ 80 중량%, ≥ 90 중량%) 또는 고순도 (≥ 95 중량%, ≥ 97 중량%, ≥ 99 중량%) 생성물 형태의 목적하는 유기 화학적 화합물, 바람직하게는 L-아미노산에 성공적으로 도달된다. a), b), c) 또는 d)에 따른 수단에 대해, 매우 다양한 기술적인 지침이 선행 기술에서 이용가능하다.

코리네박테리움 속의 박테리아를 사용하여 KIC 또는 L-류신을 생산하기 위한 방법의 경우에, 발효 브로쓰의 임의의 성분을 함유하지 않는 생성물이 수득되는 방법이 바람직하다. 이들 생성물은 특히 인간 의약, 제약 산업, 및 식품 산업에서 사용된다.

본 발명에 따른 방법은 KIC 또는 L-류신의 발효 생산을 위해 사용된다.

마지막으로, 본 발명은 KIC 또는 L-류신의 발효 생산을 위한 본 발명에 따른 미생물의 사용에 관한 것이다.

본 발명을 예시적인 실시양태를 참조하여 아래에서 보다 상세히 설명할 것이다.

실시예 1:

교환 벡터 pK18mobsacB_leuA_Y553D의 생산

812 bp 길이의 교환 구축물의 합성은 진아트(GeneArt (라이프 테크놀로지스 게엠베하(Life Technologies GmbH; 독일 다름스타트))에서 수행하였다 (서열 7 참조). 단편은 ATCC13032의 leuA 유전자의 하류 영역의 206 bp에 야생형 leuA 유전자의 마지막 594 bp (C 말단), 및 또한 벡터 pK18mobsacB 내로의 클로닝을 위해 요구되는 SphI 및 BamHI 절단 부위를 모두 함유한다. 위치 195에서 (leuA 유전자의 3' 단부의 상류), 상기 교환 단편 내에서 염기 T는 염기 G로 돌연변이되고 - 이것은 야생형 코돈 TAC (아미노산 Y, 티로신을 코딩함)를 코돈 GAC (아미노산 D, 아스파르테이트를 코딩함)로 변화시킨다. 단편의 벡터 pK18mobsacB 내로의 클로닝은 진아트 회사에서 수행하였다. 생성된 교환 벡터 pK18mobsacB_leuA_Y553D는 진아트에 의해 전달되었고, 실시예의 균주들을 생산하기 위해 사용하였다 (실시예 3 참조).

실시예 2:

균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE의 생산

균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032를 전기천공에 의해 플라스미드 pK19mobsacB_DilvE (문헌 [Marienhagen et al., Journal of Bacteriology 187:7639-7646 (2005)])로 형질전환시켰다. 전기천공은 문헌 [Haynes et al. (FEMS Microbiology Letters 61: 329-334 (1989))]의 프로토콜에 따라 수행하였다.

플라스미드 pK18mobsacB 또는 pK18mobsacB_DilvE는 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 내에서 독립적으로 복제될 수 없고, 단지 재조합 사건의 결과로서 염색체 내로 통합되었으면 세포 내에 보유된다. 통합된 pK18mobsacB_DilvE를 갖는 클론의 스크리닝은 전기천공 배치를 15 mg/l의 카나마이신을 보충한 LB 한천 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Habor, New York, 1989]) 상에 플레이팅함으로써 수행하였다. 성장한 클론을 25 mg/l의 카나마이신을 함유한 LB 한천 플레이트 상으로 스트리킹(streaking)하고, 16시간 동안 33℃에서 인큐베이션하였다. 제2 재조합 사건의 결과로서 플라스미드가 절제된 돌연변이체를 스크리닝하기 위해, 클론을 LB 액체 배지 (+5 g/l의 아세트산칼륨) 내에서 비선택적으로 20시간 동안 배양한 후, 10% 수크로스를 함유하는 LB 한천 상으로 스트리킹하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다.

플라스미드 pK18mobsacB_DilvE는 출발 플라스미드 pK18mobsacB와 마찬가지로 카나마이신 내성 유전자에 추가로 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 레반 수크라제를 코딩하는 sacB 유전자의 카피를 함유한다. 수크로스-유도성 발현은 레반 (씨. 글루타미쿰에 대한 독성 생성물)의 합성을 촉매하는 레반 수크라제의 형성을 일으킨다. 따라서, 수크로스를 갖는 LB 한천 (5 g/l의 아세트산칼륨 함유) 상에서, 단지 통합된 pK18mobsacB가 다시 절제된 클론만이 성장한다. 절제 시에, 플라스미드와 함께, ilvE의 완전한 염색체 카피, 또는 ilvE의 내부 결실을 갖는 불완전한 카피가 절제될 수 있다.

대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재 하에 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에 비-성장"에 대해 검사하였다. 결실된 ilvE 대립유전자가 염색체 내에 남아있는지 검출하기 위해, 표현형 "수크로스의 존재 하에 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에 비-성장"을 갖는 대략 20개의 콜로니를 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 문헌 [Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 따라 연구하였다. 본 경우에, 콜로니의 염색체 DNA로부터, 결실된 ilvE 영역의 둘러싸는 영역을 보유하는 1개의 DNA 단편을 증폭시켰다. PCR을 위해 다음 프라이머 올리고뉴클레오티드를 선택하였다.

ilvE-XbaI-fw: 5'-gctctagagccaagcctagccattcctcaa-3'

ilvE-XbaI-rev: 5'-gctctagagccagccactgcattctcctta-3'

상기 프라이머는 완전한 ilvE 유전자좌를 갖는 대조군 클론 내에서, 대략 1.4 kb 크기의 DNA 단편의 증폭을 허용하였다. 결실된 argFRGH 유전자좌를 갖는 클론 내에서, 대략 0.6 kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 증폭시켰다.

증폭된 DNA 단편은 0.8% 강도 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 확인하였다. 그에 의해 균주가 염색체 상에 결실된 ilvE 대립유전자를 보유함을 보일 수 있었다. 상기 균주를 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE로 명명하고, 이소카프로에이트를 생산하는 그의 능력에 대해 생산 시험 (실시예 4 참조)에서 연구하였다.

실시예 3:

균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE_leuAY553D 및 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_leuAY553D의 생산

실시예 2로부터 균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 및 균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE를 실시예 1의 플라스미드 pK18mobsacB_leuA_Y553D를 사용한 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 방법은 실시예 2에 상세히 설명되어 있다.

야생형 코돈 TAC (위치 553에 티로신을 코딩함)를 코돈 GAC (위치 553에 아스파르테이트를 코딩함)로 교환하는 것은 표현형 "수크로스의 존재 하에 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에 비-성장"의 다수의 후보 클론을 서열분석함으로써 입증되었다. 상기 목적을 위해, 먼저 프라이머 leuA1 (5'-GATCTATCTAGATTGAGGGCCTTGGGCATACG-3') 및 leuA-2 (5'-GATCTAGGATCCGCGACTACGAGGCTGTTATC-3')를 갖는 leuA-1의 PCR 단편 (767 bp 길이)을 생산하고, 이것을 프라이머 leuA-3 (5'-GATCTATCTAGAAAGCTTAAACGCCGCCAGCC-3')를 사용하여 서열분석하였다. 양성 후보 클론을 선택하고, 후속적인 성능 시험 (실시예 4 및 5)으로 검사하였다.

실시예 4:

씨. 글루타미쿰 ATCC13032, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE, 및 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE_leuAY553D를 사용한 케토이소카프로에이트의 생산

케토이소카프로에이트를 생산하는 능력을 연구하기 위해, 균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE, 및 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_DilvE_leuAY553D를 10 ml의 시험 배지 내에서 각각의 경우에 16 h 동안 33℃에서 예비배양하였다. 생산 시험을 위해, 생성된 예비배양액을 각각 10 ml의 시험 배지에 출발 OD 600 (600 nm에서의 광학 밀도)이 0.1이 되도록 하는 방식으로 접종하였다. 각각의 균주가 총 9개의 진탕 플라스크를 대표하도록 하는 방식으로, 각각의 클론을 3개의 진탕 플라스크에서 검사하였다. 시험 배지는 문헌 [Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603)]에 설명된 CgXII 배지와 동일하지만, 각각의 경우에 200 mg/l의 아미노산 L-류신, L-발린 및 L-이소류신을 추가로 함유하였다. 간략함을 위해, 시험 배지의 조성을 아래 표 1에 요약한다.

100 ml 진탕 플라스크 내에서 33℃ 및 200 rpm에서 배양을 수행하였다. 진탕기의 진폭은 5 cm이었다. 24시간 후에, 배양액으로부터 샘플을 취하고, 광학 밀도를 결정하였다. 후속적으로, 세포를 잠깐 동안 원심분리하고 (벤치(bench) 원심분리기 타입 5415D (에펜도르프(Eppendorf)), 13,000 rpm, 10 min, 실온에서), 상청액 내에서 글루코스의 함량 및 케토이소카프로에이트의 함량을 결정하였다.

GENios 마이크로타이터 플레이트 광도계 (테칸(Tecan; 영국 레딩))를 사용하여 660 nm의 파장에서 광학 밀도를 결정하였다. 측정 전에 샘플을 탈염수로 1:100 희석하였다. 농도 결정을 위한 KIC의 분석은 0.025 N 황산을 사용하여 H+ 형태의 술폰화 스티렌-디비닐벤젠 중합체 상에서 양이온-교환 크로마토그래피 (REZEX RFQ - 패스트 프루트 H+ 칼럼 (페노메넥스))에 의해 케토산 및 다른 분비 생성물을 분리시킨 후, 후속적으로 215 nm에서 UV 검출하여 진행하였다.

KIC 수율의 계산을 위해, 형성된 KIC의 양을 소비된 덱스트로스의 양으로 나누었다.

케토이소카프로에이트 형성을 위한 진탕 플라스크 실험의 결과를 표 2에 제시한다.

실시예 5:

씨. 글루타미쿰 ATCC13032 및 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_leuAY553D를 사용한 L-류신의 생산

류신을 생산하는 능력을 조사하기 위해, 균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 및 씨. 글루타미쿰 ATCC13032_leuAY553D를 각각의 경우에 10 ml의 시험 배지 내에서 16 h 동안 33℃에서 예비배양하였다. 생산 시험은 실시예 4와 유사한 방식으로 수행하였지만, 단, 본 시험에서 시험 배지는 보충물질 류신, 발린 및 이소류신을 함유하지 않았다. 시험 배지는 문헌 [Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603)]에 설명된 CgXII 배지와 동일하였다.

GENios 마이크로타이터 플레이트 광도계 (테칸, 영국 레딩)를 사용하여 660 nm의 파장에서 광학 밀도를 결정하였다. 측정 전에 샘플을 탈염수로 1:100 희석하였다. 형성된 류신의 양은 이온-교환 크로마토그래피 및 닌히드린 검출을 이용한 후-칼럼 유도체화에 의해, 에펜도르프-비오트로닉(Eppendorf-BioTronik; 독일 함부르크)의 아미노산 분석기를 사용하여 결정하였다,

표 3에서, 류신 형성을 위한 진탕 플라스크 실험으로부터 수득된 성능 데이터를 요약한다.

류신 수율의 계산을 위해, 형성된 류신의 양을 소비된 덱스트로스의 양으로 나누었다.

도 1: 플라스미드 pK18mobsacB_leuA_Y553D의 지도

사용된 약어 및 명칭은 다음 의미를 갖는다.

oriV: pMB1로부터의 ColE1-유사 기점.

sacB: 단백질 레반 수크라제를 코딩하는 sacB 유전자.

RP4-mob: RP4 동원 부위.

Kan: 카나마이신에 대한 내성 유전자.

leuA-3': leuA 유전자의 594 bp (C 말단).

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Industries AG <120> Feedback-resistant leuA alleles <130> 201100362 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1851 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1851) <223> leuA encoding region <400> 1 atg tct cct aac gat gca ttc atc tcc gca cct gcc aag atc gaa acc 48 Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 cca gtt ggg cct cgc aac gaa ggc cag cca gca tgg aat aag cag cgt 96 Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg 20 25 30 ggc tcc tca atg cca gtt aac cgc tac atg cct ttc gag gtt gag gta 144 Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val 35 40 45 gaa gat att tct ctg ccg gac cgc act tgg cca gat aaa aaa atc acc 192 Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr 50 55 60 gtt gca cct cag tgg tgt gct gtt gac ctg cgt gac ggc aac cag gct 240 Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala 65 70 75 80 ctg att gat ccg atg tct cct gag cgt aag cgc cgc atg ttt gag ctg 288 Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu 85 90 95 ctg gtt cag atg ggc ttc aaa gaa atc gag gtc ggt ttc cct tca gct 336 Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala 100 105 110 tcc cag act gat ttt gat ttc gtt cgt gag atc atc gaa aag ggc atg 384 Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met 115 120 125 atc cct gac gat gtc acc att cag gtt ctg gtt cag gct cgt gag cac 432 Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His 130 135 140 ctg att cgc cgt act ttt gaa gct tgc gaa ggc gca aaa aac gtt atc 480 Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile 145 150 155 160 gtg cac ttc tac aac tcc acc tcc atc ctg cag cgc aac gtg gtg ttc 528 Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe 165 170 175 cgc atg gac aag gtg cag gtg aag aag ctg gct acc gat gcc gct gaa 576 Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu 180 185 190 cta atc aag acc atc gct cag gat tac cca gac acc aac tgg cgc tgg 624 Leu Ile Lys Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp 195 200 205 cag tac tcc cct gag tcc ttc acc ggc act gag gtt gag tac gcc aag 672 Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys 210 215 220 gaa gtt gtg gac gca gtt gtt gag gtc atg gat cca act cct gag aac 720 Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn 225 230 235 240 cca atg atc atc aac ctg cct tcc acc gtt gag atg atc acc cct aac 768 Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn 245 250 255 gtt tac gca gac tcc att gaa tgg atg cac cgc aat cta aac cgt cgt 816 Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg 260 265 270 gat tcc att atc ctg tcc ctg cac ccg cac aat gac cgt ggc acc ggc 864 Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly 275 280 285 gtt ggc gca gct gag ctg ggc tac atg gct ggc gct gac cgc atc gaa 912 Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu 290 295 300 ggc tgc ctg ttc ggc aac ggc gag cgc acc ggc aac gtc tgc ctg gtc 960 Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val 305 310 315 320 acc ctg gca ctg aac atg ctg acc cag ggc gtt gac cct cag ctg gac 1008 Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp 325 330 335 ttc acc gat ata cgc cag atc cgc agc acc gtt gaa tac tgc aac cag 1056 Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln 340 345 350 ctg cgc gtt cct gag cgc cac cca tac ggc ggt gac ctg gtc ttc acc 1104 Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr 355 360 365 gct ttc tcc ggt tcc cac cag gac gct gtg aac aag ggt ctg gac gcc 1152 Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala 370 375 380 atg gct gcc aag gtt cag cca ggt gct agc tcc act gaa gtt tct tgg 1200 Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp 385 390 395 400 gag cag ctg cgc gac acc gaa tgg gag gtt cct tac ctg cct atc gat 1248 Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile 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except for Tyr <400> 2 Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg 20 25 30 Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val 35 40 45 Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr 50 55 60 Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala 65 70 75 80 Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu 85 90 95 Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala 100 105 110 Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met 115 120 125 Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His 130 135 140 Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile 145 150 155 160 Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe 165 170 175 Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu 180 185 190 Leu Ile Lys Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp 195 200 205 Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys 210 215 220 Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn 225 230 235 240 Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn 245 250 255 Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg 260 265 270 Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly 275 280 285 Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu 290 295 300 Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val 305 310 315 320 Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp 325 330 335 Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln 340 345 350 Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr 355 360 365 Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala 370 375 380 Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp 385 390 395 400 Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp 405 410 415 Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser 420 425 430 Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly 435 440 445 Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln 450 455 460 Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp 465 470 475 480 Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln 485 490 495 Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser 500 505 510 Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly 515 520 525 Arg Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu 530 535 540 Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Xaa Asn Gln His Ala Arg Thr Ser 545 550 555 560 Gly Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly 565 570 575 Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser 580 585 590 Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His 595 600 605 Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val 610 615 <210> 3 <211> 3851 <212> DNA <213> 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Leu Ile Asp Pro Met 70 75 80 85 tct cct gag cgt aag cgc cgc atg ttt gag ctg ctg gtt cag atg ggc 1303 Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu Leu Val Gln Met Gly 90 95 100 ttc aaa gaa atc gag gtc ggt ttc cct tca gct tcc cag act gat ttt 1351 Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala Ser Gln Thr Asp Phe 105 110 115 gat ttc gtt cgt gag atc atc gaa aag ggc atg atc cct gac gat gtc 1399 Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met Ile Pro Asp Asp Val 120 125 130 acc att cag gtt ctg gtt cag gct cgt gag cac ctg att cgc cgt act 1447 Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His Leu Ile Arg Arg Thr 135 140 145 ttt gaa gct tgc gaa ggc gca aaa aac gtt atc gtg cac ttc tac aac 1495 Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile Val His Phe Tyr Asn 150 155 160 165 tcc acc tcc atc ctg cag cgc aac gtg gtg ttc cgc atg gac aag gtg 1543 Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe Arg Met Asp Lys Val 170 175 180 cag gtg aag aag ctg gct acc gat gcc gct gaa cta atc aag acc atc 1591 Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu Leu Ile Lys Thr Ile 185 190 195 gct cag gat tac cca gac acc aac tgg cgc tgg cag tac tcc cct gag 1639 Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp Gln Tyr Ser Pro Glu 200 205 210 tcc ttc acc ggc act gag gtt gag tac gcc aag gaa gtt gtg gac gca 1687 Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys Glu Val Val Asp Ala 215 220 225 gtt gtt gag gtc atg gat cca act cct gag aac cca atg atc atc aac 1735 Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn Pro Met Ile Ile Asn 230 235 240 245 ctg cct tcc acc gtt gag atg atc acc cct aac gtt tac gca gac tcc 1783 Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn Val Tyr Ala Asp Ser 250 255 260 att gaa tgg atg cac cgc aat cta aac cgt cgt gat tcc att atc ctg 1831 Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg Asp Ser Ile Ile Leu 265 270 275 tcc ctg cac ccg cac aat gac cgt ggc acc ggc gtt ggc gca gct gag 1879 Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly Val Gly Ala Ala Glu 280 285 290 ctg ggc tac atg gct ggc gct gac cgc atc gaa ggc tgc ctg ttc ggc 1927 Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu Gly Cys Leu Phe Gly 295 300 305 aac ggc gag cgc acc ggc aac gtc tgc ctg gtc acc ctg gca ctg aac 1975 Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val Thr Leu Ala Leu Asn 310 315 320 325 atg ctg acc cag ggc gtt gac cct cag ctg gac ttc acc gat ata cgc 2023 Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp Phe Thr Asp Ile Arg 330 335 340 cag atc cgc agc acc gtt gaa tac tgc aac cag ctg cgc gtt cct gag 2071 Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln Leu Arg Val Pro Glu 345 350 355 cgc cac cca tac ggc ggt gac ctg gtc ttc acc gct ttc tcc ggt tcc 2119 Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr Ala Phe Ser Gly Ser 360 365 370 cac cag gac gct gtg aac aag ggt ctg gac gcc atg gct gcc aag gtt 2167 His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala Met Ala Ala Lys Val 375 380 385 cag cca ggt gct agc tcc act gaa gtt tct tgg gag cag ctg cgc gac 2215 Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp Glu Gln Leu Arg Asp 390 395 400 405 acc gaa tgg gag gtt cct tac ctg cct atc gat cca aag gat gtc ggt 2263 Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp Pro Lys Asp Val Gly 410 415 420 cgc gac tac gag gct gtt atc cgc gtg aac tcc cag tcc ggc aag ggc 2311 Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser Gln Ser Gly Lys Gly 425 430 435 ggc gtt gct tac atc atg aag acc gat cac ggt ctg cag atc cct cgc 2359 Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly Leu Gln Ile Pro Arg 440 445 450 tcc atg cag gtt gag ttc tcc acc gtt gtc cag aac gtc acc gac gct 2407 Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln Asn Val Thr Asp Ala 455 460 465 gag ggc ggc gag gtc aac tcc aag gca atg tgg gat atc ttc gcc acc 2455 Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp Asp Ile Phe Ala Thr 470 475 480 485 gag tac ctg gag cgc acc gca cca gtt gag cag atc gcg ctg cgc gtc 2503 Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln Ile Ala Leu Arg Val 490 495 500 gag aac gct cag acc gaa aac gag gat gca tcc atc acc gcc gag ctc 2551 Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser Ile Thr Ala Glu Leu 505 510 515 atc cac aac ggc aag gac gtc acc gtc gat ggc cgc ggc aac ggc cca 2599 Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly Arg Gly Asn Gly Pro 520 525 530 ctg gcc gct tac gcc aac gcg ctg gag aag ctg ggc atc gac gtt gag 2647 Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu Gly Ile Asp Val Glu 535 540 545 atc cag gaa tac aac cag cac gcc cgc acc tcg ggc gac gat gca gaa 2695 Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser Gly Asp Asp Ala Glu 550 555 560 565 gca gcc gcc tac gtg ctg gct gag gtc aac ggc cgc aag gtc tgg ggc 2743 Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly Arg Lys Val Trp Gly 570 575 580 gtc ggc atc gct ggc tcc atc acc tac gct tcg ctg aag gca gtg acc 2791 Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser Leu Lys Ala Val Thr 585 590 595 tcc gcc gta aac cgc gcg ctg gac gtc aac cac gag gca gtc ctg gct 2839 Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His Glu Ala Val Leu Ala 600 605 610 ggc ggc gtt taa gctttacgac gcctccccct aggctctaca aaccggtggc 2891 Gly Gly Val 615 aagaattcca cgatgttgaa aattcttgcc accggtttcg tgggtgatag gaatatagag 2951 cctgtttcat gcctcgagtt ttctcaaatg atttttcgta tgcccaaggc cctcaaaacc 3011 cattagaagc acctctgggg gatataacct acccaggcca aagtcgaaat ttgagagcga 3071 ccaaaccatg agacccaaaa acttgaaaaa acatgctttc tggggcctta tgtctggtac 3131 caacgagtcc cggcgctttt cacccattag attgcgcaag ctgggcgtgc aaccatcagt 3191 ttttaaacct ttcttcacca ggtgatcgaa aatgcccggg tatcctatgg atttggtcat 3251 ctacaaccat caacgaccat ttgcatgcct tgaaatgctg tgaaacctct ctaagcaact 3311 agagttgtaa aaatgagcac cacttcggaa tcacaagatc acgccgcaag aatcgaagct 3371 gagcgccaag aagctattga ggcggctcct tttgtttccg tcagcattca atcaagtgga 3431 atccacccat cgacttcacg catggtcacc attgatttgg taacgctgtc ccctaatttg 3491 gagccggtgg aaacttttca tgccgtgttg gattccaaaa ctgatcctgg ccccttccac 3551 cttcatggcg tgacagagga agaatttgcc agcgctaagc gtttcggcca gattttgaaa 3611 agcttggacc gcctcatcga tggtcgtacc ctgttgatcc acaatgctgc gcgaagttgg 3671 ggctttattg tttccgaagc caagcgcgct atgaatgatg ctgcgcgcgc caatcgcaac 3731 agcaatcgtg gaaatcgccg tggtggtcgc ggacgccgca ggcagcgcgt ggggcacatc 3791 ccaaagccgc tggtgatcgt cgatacgctt gcatcggcgc gtcgacaagc aatcgcttta 3851 <210> 4 <211> 616 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg 20 25 30 Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val 35 40 45 Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr 50 55 60 Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala 65 70 75 80 Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu 85 90 95 Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala 100 105 110 Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met 115 120 125 Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His 130 135 140 Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile 145 150 155 160 Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe 165 170 175 Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys 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atc aag acc atc gct cag gat tac cca gac acc aac tgg cgc tgg 624 Leu Ile Lys Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp 195 200 205 cag tac tcc cct gag tcc ttc acc ggc act gag gtt gag tac gcc aag 672 Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys 210 215 220 gaa gtt gtg gac gca gtt gtt gag gtc atg gat cca act cct gag aac 720 Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn 225 230 235 240 cca atg atc atc aac ctg cct tcc acc gtt gag atg atc acc cct aac 768 Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn 245 250 255 gtt tac gca gac tcc att gaa tgg atg cac cgc aat cta aac cgt cgt 816 Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg 260 265 270 gat tcc att atc ctg tcc ctg cac ccg cac aat gac cgt ggc acc ggc 864 Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly 275 280 285 gtt ggc gca gct gag ctg ggc tac atg gct ggc gct gac cgc atc gaa 912 Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu 290 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His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly 515 520 525 cgc ggc aac ggc cca ctg gcc gct tac gcc aac gcg ctg gag aag ctg 1632 Arg Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu 530 535 540 ggc atc gac gtt gag atc cag gaa gac aac cag cac gcc cgc acc tcg 1680 Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Asp Asn Gln His Ala Arg Thr Ser 545 550 555 560 ggc gac gat gca gaa gca gcc gcc tac gtg ctg gct gag gtc aac ggc 1728 Gly Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly 565 570 575 cgc aag gtc tgg ggc gtc ggc atc gct ggc tcc atc acc tac gct tcg 1776 Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser 580 585 590 ctg aag gca gtg acc tcc gcc gta aac cgc gcg ctg gac gtc aac cac 1824 Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His 595 600 605 gag gca gtc ctg gct ggc ggc gtt taa 1851 Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val 610 615 <210> 6 <211> 616 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr 1 5 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Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn 225 230 235 240 Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn 245 250 255 Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg 260 265 270 Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly 275 280 285 Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu 290 295 300 Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val 305 310 315 320 Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp 325 330 335 Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln 340 345 350 Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr 355 360 365 Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala 370 375 380 Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp 385 390 395 400 Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp 405 410 415 Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser 420 425 430 Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly 435 440 445 Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln 450 455 460 Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp 465 470 475 480 Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln 485 490 495 Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser 500 505 510 Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly 515 520 525 Arg Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu 530 535 540 Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Asp Asn Gln His Ala Arg Thr Ser 545 550 555 560 Gly Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly 565 570 575 Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser 580 585 590 Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His 595 600 605 Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val 610 615 <210> 7 <211> 812 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> SphI cutting site <220> <221> gene <222> (7)..(600) <223> C terminus of the leuA gene <220> <221> mutation <222> (406)..(406) <223> Exchange of t for g <220> <221> misc_feature <222> (807)..(812) <223> BamH cutting site <400> 7 gcatgcgtcg gtcgcgacta cgaggctgtt atccgcgtga actcccagtc cggcaagggc 60 ggcgttgctt acatcatgaa gaccgatcac ggtctgcaga tccctcgctc catgcaggtt 120 gagttctcca ccgttgtcca gaacgtcacc gacgctgagg gcggcgaggt caactccaag 180 gcaatgtggg atatcttcgc caccgagtac ctggagcgca ccgcaccagt tgagcagatc 240 gcgctgcgcg tcgagaacgc tcagaccgaa aacgaggatg catccatcac cgccgagctc 300 atccacaacg gcaaggacgt caccgtcgat ggccgcggca acggcccact ggccgcttac 360 gccaacgcgc tggagaagct gggcatcgac gttgagatcc aggaagacaa ccagcacgcc 420 cgcacctcgg gcgacgatgc agaagcagcc gcctacgtgc tggctgaggt caacggccgc 480 aaggtctggg gcgtcggcat cgctggctcc atcacctacg cttcgctgaa ggcagtgacc 540 tccgccgtaa accgcgcgct ggacgtcaac cacgaggcag tcctggctgg cggcgtttaa 600 gctttacgac gcctccccct aggctctaca aaccggtggc aagaattcca cgatgttgaa 660 aattcttgcc accggtttcg tgggtgatag gaatatagag cctgtttcat gcctcgagtt 720 ttctcaaatg atttttcgta tgcccaaggc cctcaaaacc cattagaagc acctctgggg 780 gatataacct acccaggcca aagtcgggat cc 812 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer ilvE-XbaI-fw <400> 8 gctctagagc caagcctagc cattcctcaa 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer ilvE-XbaI-rev <400> 9 gctctagagc cagccactgc attctcctta 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Primer leuA1 <400> 10 gatctatcta gattgagggc cttgggcata cg 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Primer leuA-2 <400> 11 gatctaggat ccgcgactac gaggctgtta tc 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Primer leuA-3 <400> 12 gatctatcta gaaagcttaa acgccgccag cc 32 <210> 13 <211> 6504 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (365)..(1159) <223> kanamycin resistance gene <220> <221> gene <222> (1651)..(3072) <223> sacB gene encoding the protein levansucrase <220> <221> misc_feature <222> (3473)..(3571) <223> RP4 mobilization site <220> <221> rep_origin <222> (5091)..(5093) <223> ColE1-like origin from pMB1 <220> <221> misc_feature <222> (5531)..(6330) <223> gene type fragment <220> <221> misc_feature <222> (5737)..(6330) <223> C terminus of the leuA gene (594 bp) <220> <221> mutation <222> (5929)..(5931) <223> T to G, changes the wild-type codon TAC (encoding the amino acid Y, tyrosine) to the codon GAC (encoding the amino acid D, aspartate) (Y553D) <400> 13 cgataagcta gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg 60 gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg 120 ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct 180 tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc 240 tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc 300 gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt 360 tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 420 attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 480 gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 540 actccaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 600 tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 660 gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 720 aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 780 tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 840 cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcggatgcc 900 cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 960 aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 1020 ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 1080 cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 1140 tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgcta gaggatcgat cctttttaac 1200 ccatcacata tacctgccgt tcactattat ttagtgaaat gagatattat gatattttct 1260 gaattgtgat taaaaaggca actttatgcc catgcaacag aaactataaa aaatacagag 1320 aatgaaaaga aacagataga ttttttagtt ctttaggccc gtagtctgca aatcctttta 1380 tgattttcta tcaaacaaaa gaggaaaata gaccagttgc aatccaaacg agagtctaat 1440 agaatgaggt cgaaaagtaa atcgcgcggg tttgttactg ataaagcagg caagacctaa 1500 aatgtgtaaa gggcaaagtg tatactttgg cgtcacccct tacatatttt aggtcttttt 1560 ttattgtgcg taactaactt gccatcttca aacaggaggg ctggaagaag cagaccgcta 1620 acacagtaca taaaaaagga gacatgaacg atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca 1680 acagtattaa cctttactac cgcactgctg gcaggaggcg caactcaagc gtttgcgaaa 1740 gaaacgaacc aaaagccata taaggaaaca tacggcattt cccatattac acgccatgat 1800 atgctgcaaa tccctgaaca gcaaaaaaat gaaaaatatc aagtttctga atttgattcg 1860 tccacaatta aaaatatctc ttctgcaaaa ggcctggacg tttgggacag ctggccatta 1920 caaaacgctg acggcactgt cgcaaactat cacggctacc acatcgtctt tgcattagcc 1980 ggagatccta aaaatgcgga tgacacatcg atttacatgt tctatcaaaa agtcggcgaa 2040 acttctattg acagctggaa aaacgctggc cgcgtcttta aagacagcga caaattcgat 2100 gcaaatgatt ctatcctaaa agaccaaaca caagaatggt caggttcagc cacatttaca 2160 tctgacggaa aaatccgttt attctacact gatttctccg gtaaacatta cggcaaacaa 2220 acactgacaa ctgcacaagt taacgtatca gcatcagaca gctctttgaa catcaacggt 2280 gtagaggatt ataaatcaat ctttgacggt gacggaaaaa cgtatcaaaa tgtacagcag 2340 ttcatcgatg aaggcaacta cagctcaggc gacaaccata cgctgagaga tcctcactac 2400 gtagaagata aaggccacaa atacttagta tttgaagcaa acactggaac tgaagatggc 2460 taccaaggcg aagaatcttt atttaacaaa gcatactatg gcaaaagcac atcattcttc 2520 cgtcaagaaa gtcaaaaact tctgcaaagc gataaaaaac gcacggctga gttagcaaac 2580 ggcgctctcg gtatgattga gctaaacgat gattacacac tgaaaaaagt gatgaaaccg 2640 ctgattgcat ctaacacagt aacagatgaa attgaacgcg cgaacgtctt taaaatgaac 2700 ggcaaatggt acctgttcac tgactcccgc ggatcaaaaa tgacgattga cggcattacg 2760 tctaacgata tttacatgct tggttatgtt tctaattctt taactggccc atacaagccg 2820 ctgaacaaaa ctggccttgt gttaaaaatg gatcttgatc ctaacgatgt aacctttact 2880 tactcacact tcgctgtacc tcaagcgaaa ggaaacaatg tcgtgattac aagctatatg 2940 acaaacagag gattctacgc agacaaacaa tcaacgtttg cgccgagctt cctgctgaac 3000 atcaaaggca agaaaacatc tgttgtcaaa gacagcatcc ttgaacaagg acaattaaca 3060 gttaacaaat aaaaacgcaa aagaaaatgc cgatgggtac cgagcgaaat gaccgaccaa 3120 gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg 3180 ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccctc gcggacgtgc tcatagtcca cgacgcccgt 3240 gattttgtag ccctggccga cggccagcag gtaggccgac aggctcatgc cggccgccgc 3300 cgccttttcc tcaatcgctc ttcgttcgtc tggaaggcag tacaccttga taggtgggct 3360 gcccttcctg gttggcttgg tttcatcagc catccgcttg ccctcatctg ttacgccggc 3420 ggtagccggc cagcctcgca gagcaggatt cccgttgagc accgccaggt gcgaataagg 3480 gacagtgaag aaggaacacc cgctcgcggg tgggcctact tcacctatcc tgccccgctg 3540 acgccgttgg atacaccaag gaaagtctac acgaaccctt tggcaaaatc ctgtatatcg 3600 tgcgaaaaag gatggatata ccgaaaaaat cgctataatg accccgaagc agggttatgc 3660 agcggaaaag cgctgcttcc ctgctgtttt gtggaatatc taccgactgg aaacaggcaa 3720 atgcaggaaa ttactgaact gaggggacag gcgagagacg atgccaaaga gctcctgaaa 3780 atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg 3840 aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg 3900 tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtattt 3960 attcggcgca aagtgcgtcg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt atgatggtgt 4020 ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtttct atcagctcct gaaaatctcg ataactcaaa 4080 aaatacgccc ggtagtgatc ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg 4140 atcaacgtct cattttcgcc aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc 4200 aggatttatt tattctgcga agtgatcttc cgtcacaggt atttattcgg cgcaaagtgc 4260 gtcgggtgat gctgccaact tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag 4320 tggcttctgt ttctatcagg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt 4380 cttcgcccac cccaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 4440 cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4500 ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 4560 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 4620 cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 4680 cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 4740 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 4800 taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 4860 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 4920 agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 4980 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5040 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5100 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5160 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5220 tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 5280 aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 5340 gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca 5400 ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag 5460 cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac 5520 ccggggatcc cgactttggc ctgggtaggt tatatccccc agaggtgctt ctaatgggtt 5580 ttgagggcct tgggcatacg aaaaatcatt tgagaaaact cgaggcatga aacaggctct 5640 atattcctat cacccacgaa accggtggca agaattttca acatcgtgga attcttgcca 5700 ccggtttgta gagcctaggg ggaggcgtcg taaagcttaa acgccgccag ccaggactgc 5760 ctcgtggttg acgtccagcg cgcggtttac ggcggaggtc actgccttca gcgaagcgta 5820 ggtgatggag ccagcgatgc cgacgcccca gaccttgcgg ccgttgacct cagccagcac 5880 gtaggcggct gcttctgcat cgtcgcccga ggtgcgggcg tgctggttgt cttcctggat 5940 ctcaacgtcg atgcccagct tctccagcgc gttggcgtaa gcggccagtg ggccgttgcc 6000 gcggccatcg acggtgacgt ccttgccgtt gtggatgagc tcggcggtga tggatgcatc 6060 ctcgttttcg gtctgagcgt tctcgacgcg cagcgcgatc tgctcaactg gtgcggtgcg 6120 ctccaggtac tcggtggcga agatatccca cattgccttg gagttgacct cgccgccctc 6180 agcgtcggtg acgttctgga caacggtgga gaactcaacc tgcatggagc gagggatctg 6240 cagaccgtga tcggtcttca tgatgtaagc aacgccgccc ttgccggact gggagttcac 6300 gcggataaca gcctcgtagt cgcgaccgac gcatgcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt 6360 acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 6420 ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 6480 gcgcagcctg aatggcgaat ggcg 6504 201100362 Ausland 2

Claims

서열 2의 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 서열 2는 위치 553 또는 상응하는 위치에 아스파르트산을 갖고, 상기 폴리뉴클레오티드는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물로부터 단리된 효소 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 그에 의해 코딩되는 단백질 서열은 서열 2의 위치 553에 상응하는 위치에 아스파르트산을 함유하는 것인, 단리된 폴리뉴클레오티드.
서열 2의 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 서열 2는 위치 553 또는 상응하는 위치에 아스파르트산을 갖고, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 553 또는 상응하는 위치에 아스파르트산을 갖는 것인, 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 코딩되는 아미노산 서열이 위치 553 또는 상응하는 위치에 L-아스파르트산을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 위치 1657 또는 상응하는 위치에 구아닌을 갖는 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
코리네박테리움 속의 미생물 내에서의 복제에 적합한, 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 코리네박테리움 속의 미생물.
제9항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 과다발현된 형태로 존재하는 것인 미생물.
제9항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 통합된 것을 특징으로 하는 미생물.
제9항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는 미생물.
제9항에 있어서, 정밀 화학물질을 생산하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하며, 여기서 정밀 화학물질은 L-류신 또는 KIC인 미생물.
삭제
a) 배지 내에서 제9항에 따른 미생물 중 하나를 발효시키는 단계, 및
b) 배지 내에 KIC 또는 L-류신이 축적되며, 여기서 발효 브로쓰(broth)가 수득되는 것인 단계
를 포함하는, KIC 또는 L-류신을 생산하기 위한 발효 방법.
제15항에 있어서, 배치(batch) 방법, 유가식(fed-batch) 방법, 반복적 유가식 방법 및 연속 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 정밀 화학물질, 또는 액체 또는 고체 정밀 화학물질-함유 생성물이 정밀 화학물질-함유 발효 브로쓰로부터 수득되는 것을 특징으로 하며, 여기서 정밀 화학물질은 L-류신 또는 KIC인 방법.