CN109790554B - 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法 - Google Patents

通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法 Download PDF

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Abstract

描述了基因修饰的异丙基苹果酸合酶，利用基因修饰的异丙基苹果酸合酶制备C7‑C11 2‑酮酸的方法，以及包括基因修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物。所述基因修饰的异丙基苹果酸合酶、制备C7‑C11 2‑酮酸的方法，以及包括基因修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物可尤其适用于体内和体外生产相应的Cn_1醛、醇、羧酸和Cn_2烷烃。

Description

通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其 C5-C10化合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月30日提交的美国临时申请序列号第62/402,586号以及2016年9月30日提交的美国临时申请序列号第62/402,569号的权益，这两个申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请通过引用合并2016年8月23日创建并在2016年9月30日于美国临时申请序列号第62/402,586号中提交的37,000字节的ASCII文本文件“79045-WO-PCT_SequenceListing.txt”中的材料。
技术领域
本公开涉及使用生物酶来生产C7-C11 2-酮酸和由其制备的产物。更具体地，本公开涉及基因修饰的异丙基苹果酸合酶，使用此类基因修饰的异丙基苹果酸合酶以将2-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸和C5-C9烷烃的方法，以及包括基因修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物。
背景技术
对获得和使用化石燃料的未来稀缺性，成本和环境影响的担忧激发了人们开发廉价可再生生物质作为燃料和由其制造的化学品的替代来源的兴趣。随着原油价格的上涨，生物基化学品和工业产品已成为其石油衍生产品的有吸引力的替代品。使用厌氧微生物的发酵过程为将生物质和农业废物转化为有用产品提供了有希望的途径，同时补救了处理低价值农产品和食品加工副产品/废物时可能遇到的问题。可从低成本生物质原料制备的一些有用产品是较长链醛、烷烃、醇、烯烃和羧酸，尤其包括C6-C10醇。
C6-C10醇使用石油化学和天然原料途径生产。石油化学方法以乙烯齐聚反应为基础。齐格勒法使用铝在高压下介导乙烯齐聚反应以产生三烷基铝物质，然后在干燥空气下小心氧化并水解以得到末端醇的泊松分布，其范围为C2-C26(仅偶数碳链)。通过乙烯齐聚方法产生的烯烃的加氢甲酰化，例如通过壳层高烯烃工艺(Shell Higher Olefins Process(SHOP))，然后还原产生具有奇数碳链长度的醇。，通过氢化、酯交换和还原等标准油化学转化进行的天然油(如棕榈仁和椰子)的脂肪酸的转化也用于制备长链醇，其中大部分醇具有大于C10的碳链。对窄碳链长度分布缺乏选择性是当前生产方法的显著缺点。齐格勒法也受到水合氧化铝(Al2O3·[H2O]x)联产的影响。因此，鉴定用以产生C6-C10醇、烷烃和羧酸的更好(即对小范围的碳链长度的选择性)且较便宜的方法将具有很大的实用性。然而，微生物经常无法以经济上可行的速率或产率产生许多基于石油化学的产品。代谢工程已被广泛用于构建途径和/或将代谢物导向目标途径。目前，乙醇是使用微生物产生的最常见的生物化学品。然而，在生物燃料和化学工业中正在积极地寻求经济上可行的生产C6-C10醇和羧酸的方法。
通过微生物发酵成功生产天然氨基酸已经引起了人们对利用氨基酸生物合成途径生产目标化学品(包括较长链醇、烷烃和羧酸)的极大兴趣。特别感兴趣的是2-酮酸，其为氨基酸生物合成中的关键中间体，并且适用于可用于细胞内化学物质生物合成的不同类型的修饰。亮氨酸生物合成途径中的三种酶参与延长2-酮酸，并且可以将2-酮丁酸或2-酮异戊酸转化为更长链的2-酮酸。这些酶通常被称为异丙基苹果酸合酶、异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶，而不涉及任何特定的微生物。具体而言，在大肠杆菌中，这些酶分别被称为LeuA(基因库：登录号NC 000913.3基因ID：947465)、LeuB(基因库：登录号NC000913.3基因ID：944798)和LeuCD(基因库：登录号NC 000913.3基因ID：94576和基因ID：945642)。通过工程化大肠杆菌的LeuA基因产物延长细胞内2-酮酸的长度的可行性也扩大了可以由2-酮酸产生的生物化学物质的范围。在大肠杆菌中，LeuABCD基因将2-酮酸的长度延长一个碳单位，如在亮氨酸生物合成期间所观察到的，其中它们共同作用以将2-酮异戊酸(5-碳酸)转化为2-酮异己酸(6-碳酸)。LeuA活性位点的扩增允许将C4酮酸，2-酮丁酸[2-酮丁酸]递归延长至C9 2-酮酸，2-酮壬酸[2-酮壬酸]。
然而，需要继续开发和工程化异丙基苹果酸合酶、异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶以在各种微生物中更有效地产生C7-C11 2-酮酸。另外，需要产生具有不同催化效率的异丙基苹果酸合酶、异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶，以便更好地调节C4酮酸，例如2-酮丁酸或2-酮异戊酸向C7-C11 2-酮酸的递归延长，以将微生物的细胞代谢与2-酮酸伸长匹配。
发明内容
本公开的实施例通过提供基因修饰的异丙基苹果酸合酶，利用此类基因修饰的异丙基苹果酸合酶制备C7-C11 2-酮酸的方法和包括此类修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物来满足那些需要。基因修饰的异丙基苹果酸合酶可用于在各种微生物中生产生物基化学品和工业产品，是使用化石燃料的有吸引力的替代品。
根据本公开的实施例，提供了具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽。所述多肽包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列，并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D。
根据本公开的其它实施例，提供了具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽。所述多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D。
根据本公开的另一个实施例，提供了具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽。所述多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D。
根据本公开的其它实施例，提供了用于制备C7-C11 2-酮酸的方法。所述方法包括在至少一种C4-C10 2-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸的条件下，向至少一种C4-C10 2-酮酸底物提供(a)具有IPMS活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶(IPMS)，(b)具有异丙基苹果酸异构酶活性的异丙基苹果酸异构酶，和(c)具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶。具有IPMS活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶包括下列中的至少一种：(i)与SEQ IDNO：1具有至少80％同源性并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列。至少一种C4-C10 2-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸通过一种或多种生化反应发生。
在又另一个实施例中，提供了具有基因修饰的异丙基苹果酸合酶(IPMS)的微生物。所述微生物包括以下中的至少一种：(i)具有与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列的IPMS，所述IPMS具有IPMS活性；(ii)具有与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列的IPMS，所述IPMS具有IPMS活性；或(iii)具有与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列的IPMS，所述IPMS具有IPMS活性。
应当理解，以下概述和详细描述都是示例性和说明性的，并且旨在提供对要求保护的本公开的进一步说明。以下概述和描述均不旨在将本公开的范围限定或限制于概述或描述中提到的特定特征。
附图说明
图1.2-酮酸的伸长。图1在1至3中示出了通过异丙基苹果酸合酶、异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶的递归活性(在大肠杆菌中称为“LeuABCD途径”)的2-酮酸的伸长。在伸长后，通过4中的(硫胺素依赖性)脱羧酶的活性将所得的伸长的2-酮酸(IV)转化为醛(V)，最后通过醇脱氢酶的活性在5中转化为醇(VI)。
图2.产生1-庚醇的两种途径。图2显示了产生1-庚醇的两种相关但不同的途径。在第一种途径中，Wood-Ljungdahl途径将合成气转化为乙酰辅酶A，另一途径则将乙酰辅酶A转化为丙酮酸。然后将丙酮酸转化为2-酮丁酸，最后引发LeuABCD途径，其中将2-酮丁酸转化为C7-C11 2-酮酸(在本实施例中为2-酮辛酸)。一旦形成伸长的2-酮酸(2-酮辛酸)，(硫胺素依赖性)脱羧酶将其转化为C6-C10醛(在本实施例中为庚醇)，并且醇脱氢酶将C6-C10醛转化为C6-C10醇(在本实施例中为1-庚醇)。在第二种途径中，潜在的糖分解代谢途径之一，在本实施例中是糖酵解或戊糖磷酸途径，将C5或C6糖转化为丙酮酸，然后遵循与第一种途径中相同的途径序列以产生庚醇。
图3.构建体614(即，Marcheschi等人在《美国化学学会化学生物杂志(ACSChem.Biol.)》2012，7，689-697中报道的“大肠杆菌LeuAva变体(E.coil_LeuAvavariant)”)、1409和1414的氨基酸1-379的序列比对。图3描绘了三种蛋白质序列之间的氨基酸取代，其以灰色突出显示。
图4.pZAlac_ilvAleuA载体。显示的是用于醇生产研究的pZAlac_ilvAleuA载体。
图5.pSD-0###载体。显示的是用于醇生产研究的典型的修饰的pSD-0###载体。
图6.pZE BCD-KA6载体。显示的是用于醇生产研究的pZE BCD-KA6载体。
具体实施方式
现在将详细参考本发明公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶，利用此类基因修饰的异丙基苹果酸合酶制备C7-C11 2-酮酸的方法，以及包括此类修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物的各种实施例。基因修饰的异丙基苹果酸合酶，方法，以及微生物可用于生产生物基化学品和工业产品，并且是使用化石燃料的有吸引力的替代品。本发明公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶，方法，以及微生物可特别用于在体内和体外生产更长链烷烃、醇、烯烃和羧酸。此外，基因修饰的异丙基苹果酸合酶来自两种不同种类的微生物，在捕获和缩合乙酰辅酶A(乙酰辅酶A)和较长链2-酮酸，特别是2-酮辛酸时，具有改进和可变的催化效率。因此，这些异丙基苹果酸合酶可用以更好地调节C4酮酸，例如2-酮丁酸或2-酮异戊酸向C7-C112-酮酸的递归延长，以将微生物的细胞代谢与2-酮酸伸长匹配。
如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一种”成分的提及包括具有两种或更多种此类成分的方面，除非上下文另有明确说明。
在各种实施例中，提供了具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽。术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用。如本领域所知，多肽或蛋白质具有一条或多条氨基酸链，其可通过肽键连接在一起。在某些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽被纯化。基因修饰的异丙基苹果酸合酶的实施例包括来自两种不同种类的微生物的异丙基苹果酸合酶的若干改变的氨基酸序列：弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌。与在异丙基苹果酸合酶的活性位点具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的先前公开的来自大肠杆菌(即，LeuA：基因库登录号NC_000913.3，基因ID 947465)的基因修饰的异丙基苹果酸合酶相比，这些基因修饰的异丙基苹果酸合酶在捕获和缩合乙酰辅酶A和C6-C10 2-酮酸，特别是2-酮辛酸时表现出改进的活性和催化效率(kcat/Km)。这些特定基因修饰的符号以及本说明书中公开的基因修饰的类似符号遵循工业标准，其中氨基酸修饰被定义为起始单字母氨基酸代码，其后是氨基酸位置，其后是新的氨基酸单字母代码。这些先前公开的对来自大肠杆菌(即LeuA)的异丙基苹果酸合酶的基因修饰导致LeuA活性位点的扩增，这允许将C4酮酸，2-酮丁酸[2-酮丁酸]递归延长至C9 2-酮酸，2-酮壬酸[2-酮壬酸]。
令人惊讶的是，目前的研究人员确定，当来自先前公开的来自大肠杆菌的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的这些相同突变在来自各种生物体(包括弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌)的异丙基苹果酸合酶中进行时，这些异丙基苹果酸合酶对较长链2-酮酸的底物特异性得到改善，但催化活性很差。然而，目前的研究人员确定，来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的催化结构域内的某些特定的额外突变导致本发明公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶在捕获和缩合乙酰辅酶A和2-酮辛酸时具有改善的催化效率(kcat/Km)。来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的催化结构域内的这些额外突变也导致本发明公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶在捕获和缩合乙酰辅酶A和2-酮辛酸时具有不同的催化效率(即kcat/Km)，这可以有利地用于将微生物的细胞代谢与2-酮酸伸长匹配。因此，本发明公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶可特别用于在体内和体外更有效地生产C6-C10醛、烷烃、醇和羧酸。
已经鉴定来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的催化结构域内的各种位点是获得改善的关键。来自这两种微生物的异丙基苹果酸合酶的催化结构域由残基1-379组成。导致提高的催化活性的来自弗氏柠檬酸杆菌的异丙基苹果酸合酶的野生型序列(基因登录号KDF09799)中的基因突变包括活性位点内的H97A、S139G、N167G、P169A和G462D，以及催化结构域内的G181A、A182G、G210A、A214S、G462D、Q258H和R260A的组合。导致提高的催化活性的来自阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的野生型序列(基因登录号WP_014830637)中的基因突变包括活性位点内的H97A、S139G、N167G、P169A和G462D，以及催化结构域内的M255L、R260A、N264Q、D348E、F350E、M353L和Q355N的组合。SEQ ID NO：3-4显示来自弗氏柠檬酸杆菌的异丙基苹果酸合酶的变体的氨基酸序列，其包括指定的各种取代。SEQ ID NO：5-8显示来自阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的变体的氨基酸序列，其包括指定的各种取代。
在一些实施例中，具有异丙基苹果酸合酶的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列。在具有与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽的一些实施例中，所述多肽与构成SEQ IDNO：1的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，具有异丙基苹果酸合酶的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列。在具有异丙基苹果酸合酶的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列的一些实施例中，所述多肽与构成SEQ ID NO：1的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自弗氏柠檬酸杆菌。在某些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽还包含突变Q258H和R260A。在某些实施例中，多肽是纯化的多肽。
根据本公开的另一个实施例，提供了具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列。在多肽包括与SEQID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列的一些实施例中，所述多肽与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列。在多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列的一些实施例中，所述多肽与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自阴沟肠杆菌。在某些实施例中，多肽还包括突变M255L。在某些实施例中，多肽是纯化的多肽。
根据本公开的另一个实施例，提供了具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列。在多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列的一些实施例中，所述多肽与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列。在多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列的一些实施例中，所述多肽与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自阴沟肠杆菌。在某些实施例中，多肽还包括突变M255L、R260A和N264Q。在某些实施例中，多肽是纯化的多肽。
如本文所用，当氨基酸序列具有一定百分比或更高的同一性时，两种蛋白质(或蛋白质的区域)基本上是同源的，例如，至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。如本领域已知的，可以确定同源性百分比。例如，为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸序列中的一个或两个中引入间隙以用于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略不计)。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，那么分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸“同一性”等同于氨基酸“同源性”)。如本领域所知，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，考虑到需要引入以用于最佳比对两个序列的间隙的数量和每个间隙的长度。通常使用序列分析软件测量多肽的序列同源性。
当同源用于蛋白质或肽时，认识到不相同的残基位置通常可以因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被化学性质相似(例如电荷或疏水性)的具有侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代彼此不同的情况下，可以向上调节序列同一性百分比或同源性程度以校正取代的保守性。进行这种调节的方式是本领域技术人员已知的。以下六组各自含有彼此保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
例如，具有异丙基苹果酸合酶功能的氨基酸序列可以通过使用这些蛋白质的氨基酸序列作为查询对非冗余蛋白质序列(nr)数据库进行蛋白质-蛋白质BLAST(blastp)搜索来鉴定。可以使用默认参数在国家生物技术信息中心(NCBI)网站(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)上进行搜索。来自大肠杆菌的异丙基苹果酸合酶(LeuA)，具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的来自大肠杆菌的异丙基苹果酸合酶(构建体614)，具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的来自弗氏柠檬酸杆菌的异丙基苹果酸合酶(构建体1409)，具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的来自阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶(构建体1414)，来自双曲钩端螺旋体的异丙基苹果酸合酶(UniProtKB/Swiss-Prot登录号B0SN40)和来自结核分枝杆菌的异丙基苹果酸合酶(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P9WQB3)的氨基酸序列比对在其序列中显示25-96％相同氨基酸，或者42-97％同源序列(数据未显示)。如前所述，来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的催化结构域由残基1-379组成。另外，并且不受理论束缚，据信来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的活性位点包括以下氨基酸残基：R13、D14、Q17、L73、H97、F99、S139、E141、D142、N167、P169、D170、T171、H202、H204、E226、E234、R235、G237、N238、H300、D302和Y311。
在实施例中，被认为对于来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的功能不是必需的氨基酸残基(例如，在催化结构域之外的残基(残基1-379))可以保守或非保守地取代，并且与来自弗氏柠檬酸杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1409)和来自阴沟肠杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1414)相比，这种氨基酸取代不会显著降低修饰的异丙基苹果酸合酶的功能特性。在实施例中，对于被认为形成来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的合酶的活性位点的某些氨基酸残基的大多数保守和非保守氨基酸取代(例如，残基R13、D14、Q17、L73、H97、S139、E141、N167、P169、T171、H202、H204、E226、E234、R235、G237、N238、H300、D302和Y311).而不是文中所述的那些特定的氨基酸取代，与来自弗氏柠檬酸杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1409)和来自阴沟肠杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1414)相比，可能会降低修饰的异丙基苹果酸合酶的功能特性。在实施例中，对于被认为形成来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的合酶的活性位点的某些氨基酸残基的大多数保守和非保守氨基酸取代(例如，残基F99、D142和D170)，与来自弗氏柠檬酸杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1409)和来自阴沟肠杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1414)相比，可能不会降低修饰的异丙基苹果酸合酶的功能特性。在实施例中，对于来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的催化结构域中的某些氨基酸残基的大多数保守和非保守氨基酸取代(例如，残基L12-G15、Q17-L19、K28、L35、E44-P48、F55、L73、I81、A91、H97、S103、E117、V18、A129、S139、E141、A157、I159、N167、P169、T171、V172、P177、I198、S200、H202、H204、D206、G208、G221、A222、E226、G231、G233-R235、G237、N238、L241、I260、I266、P280、G289、S297、G298、H300-D302、Y311、P316、G320、S332、G333和G345)，而不是文中所述的那些特定的氨基酸取代，与来自弗氏柠檬酸杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1409)和来自阴沟肠杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1414)相比，可能会降低修饰的异丙基苹果酸合酶的功能特性。在实施例中，对于来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的异丙基苹果酸合酶的催化结构域中的所有其它氨基酸残基的大多数保守和非保守氨基酸取代(例如，除了残基L12-G15、Q17-L19、K28、L35、E44-P48、F55、L73、I81、A91、H97、S103、E117、V18、A129、S139、E141、A157、I159、N167、P169、T171、V172、P177、I198、S200、H202、H204、D206、G208、G221、A222、E226、G231、G233-R235、G237、N238、L241、I260、I266、P280、G289、S297、G298、H300-D302、Y311、P316、G320、S332、G333和G345之外的催化结构域中的所有氨基酸残基)，而不是文中所述的那些特定的氨基酸取代，与来自弗氏柠檬酸杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1409)和来自阴沟肠杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1414)相比，可能不会降低修饰的异丙基苹果酸合酶的功能特性。据信具有所述取代的来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的基因修饰的异丙基苹果酸合酶将赋予异丙基苹果酸合酶活性。换句话说，据信与来自弗氏柠檬酸杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1409)和来自阴沟肠杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的异丙基苹果酸合酶(构建体1414)相比，本文所述的氨基酸取代不会显著降低来自弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌的修饰的异丙基苹果酸合酶的功能特性。
本发明公开的具有改进性质的基因修饰的异丙基苹果酸合酶，特别是在捕获和缩合乙酰辅酶A和2-酮辛酸时具有改进的催化效率(即kcat/Km)，通过基因修饰以本文所述的多种方式中的一种产生。本文所用的术语“基因修饰的”或“修饰的”是指具有故意改变的氨基酸序列的本发明公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的群组，即“非野生型”氨基酸序列，或者是指微生物(取决于作为形容词的任一术语的放置位置)，其具有(至少)针对本文所述的特定的修饰的异丙基苹果酸合酶已经故意改变的基因组，或两者。这种改变可以通过重组技术完成，其中一个或多个基因从第二种不同的微生物转移到靶微生物中。可以使用转移至靶微生物中的全合成DNA通过常规方法完成重组技术。这种改变也可以通过工程技术完成，其中通常通过定点诱变改变靶微生物内的核酸，导致至少一个核酸转化为不同的核酸，因此修饰一种或多种酶。也可以采用上述方法和整个申请中描述的方法的任何组合。因此，应当理解，本发明公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶可以在体内，即通过基因修饰的微生物，或在体外使用。
在其它实施例中，提供了制备C7-C11 2-酮酸的方法。在实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法包括提供至少一种C4-C10 2-酮酸底物与一系列酶，所述酶包括基因修饰的异丙基苹果酸合酶。在一些实施例中，所述方法包括通过提供起始底物和一系列作用于底物或其产物的酶来制备C7-C11 2-酮酸。在实施例中，该系列酶包括本公开的基因修饰的异丙基苹果酸合酶。在一些实施例中，该系列酶最终使用另外的酶和步骤将底物转化为所需的C7-C112-酮酸。术语“底物”或“合适的底物”是指通过酶的作用转化或意图转化成另一种化合物的任何物质或化合物。所述术语不仅包括单一化合物，还包括化合物的组合，例如溶液、混合物和含有至少一种底物或其衍生物的其它物质。此外，术语“底物”不仅包括提供适合用作起始材料的碳源的化合物，例如任何生物质衍生的糖，还包括用于与如本文所述的代谢工程微生物相关的途径的中间物和终产物代谢物。
制备C7-C11 2-酮酸的方法还包括利用甚至进一步的其它酶和步骤将C7-C11 2-酮酸转化为所需的C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃。这些方法可以在非天然存在的，即基因工程细胞的所述实施例中的一个中以生物合成方式进行。例如，在说明性的非限制性实施例中，这些方法可以在非天然存在的微生物中进行。或者，在其它说明性的非限制性实施例中，产生C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸、或C5-C9烷烃可以通过体外方法进行，通常从不包括微生物的起始点开始。
在制备C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸、或C5-C9烷烃的方法的一些实施例中，通过一种或多种酶的作用和一种或多种生化反应，将选择的含碳底物首先转化为丙酮酸，丙酮酸转化为2-酮丁酸，或者转化为2-酮异戊酸(图2)。更具体地，在实施例中，含碳底物在一种或多种生化反应中与一种或多种酶一起提供和/或接触，使得其转化为2-酮丁酸或2-酮异戊酸。然后，通过酶、酶复合物、基因修饰的酶、基因修饰的酶复合物或其组合的作用，在“+1”途径(或LeuABCD途径，其针对大肠杆菌微生物命名)，其是非天然亮氨酸途径的一部分中，2-酮丁酸或2-酮异戊酸可以通过链伸长转化为C7-C11 2-酮酸(图1)。在实施例中，能够实现所述链伸长的酶在本文中被鉴定为构成：异丙基苹果酸合酶(例如，天然的异丙基苹果酸合酶，例如大肠杆菌异丙基苹果酸合酶，LeuA(基因库登录号NC 000913.3基因ID：947465)和/或具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶(例如，如上所述的具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶，和/或如Marcheschi等人“用于碳链伸长的合成递归“+1”途径(A synthetic recursive″+1″pathway for carbon chain elongation.)”《美国化学学会化学生物杂志(ACS chemicalbiology)》2012，7，689-697中所述，其通过引用整体并入))；异丙基苹果酸脱氢酶(例如，天然异丙基苹果酸脱氢酶，例如LeuB(基因库：登录号NC 000913.3基因ID：944798)，和/或具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶，例如LeuB′(例如，如Sanghani等人在W02015089127A1中所描述的，其通过引用整体并入))；和/或异丙基苹果酸异构酶(例如，天然LeuCD复合物(即，两种酶一起被称为异丙基苹果酸异构酶复合物)(分别为基因库：登录号NC 000913.3基因ID：945076和基因ID：945642)，和/或具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶(例如，具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的LeuCD′，如2016年9月30日提交的美国临时专利申请序列号第62/402,569号中所述，其通过引用整体并入)。在实施例中，具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶如上所述。如本领域普通技术人员所知，可以在“+1”途径中的任何点处添加合适的底物，包括中间物和终产物代谢物(如图1所示)。
在实施例中，具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶可以如上所述，和/或如Marcheschi等人“用于碳链伸长的合成递归“+1”途径(A syntheticrecursive″+1″pathway for carbon chain elongation.)”《美国化学学会化学生物杂志(ACS chemical biology)》2012，7，689-697中所述，其通过引用整体并入在某些实施例中，具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶可包含在称为Phe-47、Leu-73、His-97、Phe-99、Ser-139、Asn-167、Pro-169、Asn-197和/或Gly-462的一个或多个氨基酸残基点处具有取代的LeuA′变体。然后用氨基酸甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸取代这些靶向氨基酸中的一个或多个，这可以通过选定生物体的已知异丙基苹果酸合酶的定点诱变来进行，例如大肠杆菌的LeuA基因(基因库：登录号NC_000913.3基因ID：947465)。在某些方面，基因修饰的LeuA′可包括以下取代组合：丙氨酸取代His-97，甘氨酸取代Ser-139，甘氨酸取代Asn-167，丙氨酸取代Pro-169和天冬氨酸取代Gly-462。这些基因修饰的LeuA′变体在捕获目标2-酮酸用于催化中比野生型酶更有效(更高的kcat/Km)，因此可以提高相关“+1”途径的整体效率。
在实施例中，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶可以如Sanghani等人在W02015089127A1中所述，其通过引用整体并入。在某些实施例中，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶可包含在称为Leu-96和Val-198的一个或多个氨基酸残基点处具有取代的LeuB′变体。然后用氨基酸甘氨酸、丙氨酸和/或缬氨酸取代这些靶向氨基酸中的一个或多个，这可以通过选定生物体的已知异丙基苹果酸合酶的定点诱变来进行，例如大肠杆菌的LeuB基因(基因库：登录号NC_000913.3基因ID：944798)。在某些方面，基因修饰的LeuB′可包括以下取代：甘氨酸取代Leu-96；丙氨酸取代Val-198；丙氨酸取代Leu-96和丙氨酸取代Val-198；甘氨酸取代Leu-96和丙氨酸取代Val-198；甘氨酸取代Leu-96和甘氨酸取代Val-198′；或丙氨酸取代Leu-96。在将3-HM转化为相应的C7-C112-酮酸时，这些基因修饰的LeuB′变体比野生型酶更有效(更高的kcat/Km)，因此可以提高相关“+1”途径的整体效率。
在实施例中，具有异丙基异构酶活性的基因修饰的异丙基异构酶可以如2016年9月30日提交的美国临时专利申请序列号第62/402,569号中所述，其通过引用整体并入。在某些实施例中，基因修饰的LeuCD′酶复合物包括多种LeuCD酶复合物的改变的氨基酸序列。在实施例中，改变的氨基酸序列已经被鉴定为，在将较长链的2-烷基苹果酸(例如C4-C6 2-烷基苹果酸)异构化为其相应的3-烷基苹果酸时，与野生型大肠杆菌LeuCD酶复合物(LeuC：EcoGene登录号EG11576，基因ID 945076；和LeuD：EcoGene登录号EB11575，基因ID：945642)相比较，表现出改善的活性和催化效率(即，kcat/Km)。野生型LeuC序列和野生型LeuD序列内的各种位点已被鉴定为获得改进的关键。LeuC的野生型序列内的位点包括Val-35、Leu-411及其组合。LeuD的野生型序列内的位点包括Leu-31、His-88及其组合。在每次改变中，进行以下改变，其中：丙氨酸或甘氨酸取代LeuC的Val-35；缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代LeuC的Leu-411；缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代LeuD的Leu-31；和/或丝氨酸或丙氨酸取代LeuD的His-88。取代可以在LeuC或LeuD中的单位点(即构成三碱基对的单个氨基酸)取代到LeuC和LeuD内的各种多位点(例如2-4个位点)取代之间变化。取代可以通过已知的野生型大肠杆菌LeuCD酶复合物的定点诱变来进行。
在实施例中，基因修饰的LeuCD′酶复合物包括(a)LeuC亚基和(b)LeuD亚基。例如，在一些实施例中，LeuC亚基(a)选自由以下组成的群组：(1)包含氨基酸序列的天然LeuC亚基；和(2)包括至少一个修饰的基因修饰的LeuC亚基，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。在基因修饰的LeuCD′酶复合物的一些实施例中，LeuD亚基(b)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuD亚基；(2)包括至少一个修饰的基因修饰的LeuD亚基，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。在一些实施例中，基因修饰的LeuCD′酶复合物包括(a)(1)和(b)(2)的组合、(a)(2)和(b)(2)的组合，或(a)(2)和(b)(1)的组合。重要的是，基因修饰的LeuCD′酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
在基因修饰的LeuCD′酶复合物的某些实施例中，LeuC的氨基酸序列的至少一个修饰(a)(2)选自由以下组成的群组：(i)丙氨酸取代Val-35；(ii)甘氨酸取代Val-35；(iii)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；(iv)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；(v)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411；以及(vi)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。在基因修饰的LeuCD酶复合物的其它实施例中，LeuD的氨基酸序列的至少一个修饰(b)(2)选自由以下组成的群组：(i)丙氨酸取代Leu-31；(ii)甘氨酸取代Leu-31；(iii)缬氨酸取代Leu-31；(iv)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；(v)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；(vi)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；以及(vii)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。
在一些实施例中，基因修饰的LeuCD′酶复合物包含(a)(1)和(b)(2)的组合，并且(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在其它实施例中，基因修饰的LeuCD′酶复合物包含(a)(2)和(b)(2)的组合，并且(a)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在一些实施例中，基因修饰的LeuCD′酶复合物包含(a)(2)和(b)(2)的组合，(a)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，并且(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
在进行2-酮丁酸或2-酮异戊酸的链伸长后，C7-C11 2-酮酸然后可通过至少一种酶，例如硫胺素依赖性脱羧酶(例如具有脱羧酶活性的天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶)的作用转化为C6-C10醛。具体地，2-酮丁酸或2-酮异戊酸可以与具有脱羧酶活性的天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶一起提供和/或接触。在天然或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶作用于C7-C11 2-酮酸的实施例中，天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶将C7-C11 2-酮酸转化为比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛。在实施例中，硫胺素依赖性脱羧酶具有硫胺素依赖性脱羧酶活性。关于具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的硫胺素依赖性脱羧酶的修饰和选择的进一步公开内容包括在共同未决的国际公开号WO 2015/089127中，其通过引用整体并入本文。
C6-C10醛可以在各种工业应用中原样使用，或者可以用作生产其它化学品的中间体和/或原料使用。例如，C6-C10醛可以与醇脱氢酶(例如，天然的(登录号NC_001145.3，基因ID：855368)和/或基因修饰的醇脱氢酶)一起提供和/或接触，其将C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇。在实施例中，醇脱氢酶具有醇脱氢酶活性。或者，C6-C10醛可以与醛脱氢酶(例如，天然的和/或基因修饰的醛脱氢酶(登录号NM_000689.4))一起提供和/或接触，所述醛脱氢酶将其转化为相应的C6-C10羧酸。在实施例中，醛脱氢酶具有醛脱氢酶活性。最后，C6-C10醛可以与脂肪醛脱羰酶(例如，天然和/或基因修饰的脂肪醛脱羰酶(登录号NM_100101.3))接触，所述脂肪醛脱羰酶将其转化为相应的Cn-1烷烃。在实施例中，脂肪醛脱羰酶具有脂肪醛脱羰酶活性。
在优选的实施例中，以理想的高特异性制备产物，例如C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃。基于总产物重量(即wt)，所述高特异性可以是，例如，优选至少25％(即，％)，更优选至少40％，还更优选至少50％，最优选至少70％，作为目标产物。
如上所述，本文所述的方法可以在体内或体外进行。体内方法可优选用于商业规模生产，但在一些情况下，体外方法可适用于商业规模生产。在实施例中，出于实验室和一般研究目的，体外方法可能是特别方便的，例如，用于进行酶测定。例如，可以制备用于大规模或商业规模发酵生产酶促产物的理想微生物，例如C6-C10醇或C6-C10醇的组合。这种制备可以通过将编码所需酶的DNA或DNA片段从第一微生物插入第二微生物的基因组中来进行。在实施例中，使用重组技术，已知或认为宿主微生物具有一种或多种所需的代谢途径和/或其它所需特征。一般而言，体内方法采用微生物的野生型代谢途径，首先将合适的含碳底物转化为丙酮酸，然后在不同数量的生化反应中将丙酮酸转化为2-酮丁酸或2-酮异戊酸。
例如，本发明公开的基因修饰的“+1”途径酶复合物可以用作和/或表达为微生物中代谢途径的一部分，其通过合成代谢(例如，Wood-Ljungdah1)或分解代谢(例如，糖酵解、或戊糖磷酸途径)途径产生乙酰辅酶A(图2)。然后可以通过至少一种酶，例如硫胺素依赖性脱羧酶(例如，具有脱羧酶活性的天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶)的作用将C7-C11 2-酮酸转化为具有少一个碳的相应C6-C10醛。在一些实施例中，C6-C10醛可以进一步与适当的酶反应以形成C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-9烷烃。由于本文所述的氨基酸序列的特定改变，因此本文所述的基因修饰的异丙基苹果酸合酶在对各种底物的特异性和催化效率方面提供了一些显著差异，并且这种特异性改变在产物产率和减少或消除不需要的和/或竞争性副产物方面提供了重要的优势。例如并且如前所述，由于催化位点中的额外突变，因此与先前公开的来自大肠杆菌的具有突变H97A、S139G、N167G、P169A和G462D的基因修饰的异丙基苹果酸合酶相比，基因修饰的异丙基苹果酸合酶在捕获和缩合乙酰辅酶A和更长链2-酮酸，特别是2-酮辛酸方面表现出改善的活性和催化效率(即kcat/Km)。
在一些实施例中，所选择的微生物可具有Wood-Ljungdahl途径，也称为“合成气(合成气)固定途径”，其中将合成气转化为乙酰辅酶A，如图2所示。这可以通过某些产乙酸盐的细菌物种进行，例如梭菌属(Clostridium)，包括但不限于，特别是杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)(即C.Ijungdahlii)。在Wood-Ljungdahl途径中，将合成气转化为乙酰辅酶A通常包括通过两种酶，一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合酶的作用将二氧化碳还原成一氧化碳，然后还原成乙酰辅酶A。一氧化碳脱氢酶催化二氧化碳的还原，以及乙酰辅酶A合酶将所得的一氧化碳与甲基结合以形成乙酰辅酶A。从这点开始，乙酰辅酶A继续另一途径，其中通过PFO还原(即，铁氧还蛋白氧化还原酶)将其转化为丙酮酸。这些途径可以存在于微生物中，包括例如梭菌、大肠杆菌(即大肠杆菌)、固氮螺菌、茅孢杆菌、酵母菌和棒状杆菌。在替代实施例中，合适的(例如，非合成气)含碳底物，例如C5或C6糖(例如，葡萄糖、蔗糖、戊糖或其组合)可以通过糖分解代谢途径中的一种直接被转化为丙酮酸，例如糖酵解或戊糖磷酸途径。
在合成气或非合成气底物转化为丙酮酸后，丙酮酸可以首先通过PC(即丙酮酸羧化酶)；AAT(即天冬氨酸氨基转移酶)；ThrABC(包括：ThrA，其为双功能性天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶；ThrB，其为高丝氨酸激酶；和ThrC，其为苏氨酸合酶)；和ASD(即天冬氨酸半醛脱氢酶)被转化为L-苏氨酸。然后可以通过Ilva(即苏氨酸脱水酶)将L-苏氨酸转化为2-酮丁酸。在一个替代实施例中，丙酮酸可以通过llvBN/llvGM、llvC和llvD的作用被转化为2-酮异戊酸。
在产生2-酮丁酸或2-酮异戊酸后，非天然亮氨酸生物合成途径中天然“+1”途径部分的基因修饰用以通过一种或多种生化反应转化为C7-C11 2-酮酸。在体内方法中，涉及若干生化反应并使用“+1途径”的至少一种天然或修饰的(即内源或外源)酶，酶复合物或其组合来将2-酮丁酸或2-酮异戊酸转化为所需的C7-C11 2-酮酸(图1)。例如，在实施例中，2-酮丁酸首先被转化成2-酮戊酸，然后转化为2-酮己酸，然后转化为2-酮庚酸或直至转化为2-酮十一烷酸，即，期望的C7-C11 2-酮酸，这取决于期望的最终产物，如发生链伸长。替代地，2-酮异戊酸首先转化为2-酮异己酸，然后转化为2-酮异庚酸等。实现这种链伸长的天然酶和/或基因修饰的酶可包括异丙基苹果酸合酶(例如，具有异丙基苹果酸合酶活性的天然的异丙基苹果酸合酶和/或基因修饰的异丙基苹果酸合酶)、异丙基苹果酸脱氢酶(例如，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的天然的异丙基苹果酸脱氢酶和/或基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶)、和/或异丙基苹果酸异构酶(例如，具有异丙基苹果酸异构酶活性的天然的异丙基苹果酸异构酶和/或基因修饰的异丙基苹果酸异构酶)。在一些实施例中，仅对一种酶，酶复合物或其组合进行基因修饰。例如，在具体的实施例中，仅对异丙基苹果酸合酶进行基因修饰以从2-酮丁酸或2-酮异戊酸开始获得可接受的和/或期望的C7-C11 2-酮酸的产生。关于非天然亮氨酸生物合成途径中该部分的修饰的进一步公开内容包括在共同未决的国际WO2015089127中，其通过引用整体并入本文，并同样如上所述。在某些实施例中，可以使用基因修饰的LeuA(即LeuA′)、基因修饰的LeuB(即LeuB′)、基因修饰的LeuCD(即LeuCD′)或其组合，如引用的专利申请中所述。
一旦形成伸长的C7-C11 2-酮酸，其可以原样使用，或转化为C6-C10醛。对于此类转化，使用硫胺素依赖性脱羧酶(例如天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶)，产生具有比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛。C6-C10醛具有广泛的适用性，例如，作为生产C6-C10醇、C6-C10羧酸、C5-C9烷烃及其组合的起始物质或中间物，如上所述。图1中示出了C6-C10醇的制备。
为了使非天然生物体能够进行如上文所定义的体内转化的一部分，例如，以产生C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃，需要进行类似于本文所述的方案。通常，工作实例显示基因修饰，其涉及工程化以改变给定密码子中的一个或多个核酸碱基从而改变核酸碱基为其一部分的酶。这可以简单地用于产生修饰酶，例如出于体外测定目的。相反，为更大规模生产菌株可以优选改变宿主微生物的基因组。
为体外酶生产而设计的以下方法可以如本领域技术人员通常理解的那样进行。通常，使用合适的数据库如基因库以获得野生型酶的遗传密码，然后鉴定适于修饰的密码子。所述鉴定可以用作本领域已知的蛋白质工程方法的基础，其中计算机分子建模鉴定并且还能够区分可以有效地使用酶/底物界面的修饰的结构位置。然后使用分子生物学技术进行给定的理想修饰，其中核酸碱基的改变通过定点诱变完成。必须对变体型酶进行纯化以分离出非靶向蛋白质，留下纯化酶，其表现出高于野生型的催化效率。根据最适合给定特定酶的方法，这可以在体外适当地测定。因此显示具有所需水平的催化效率的测定酶被证实是理想的基因修饰的产物，并且可以用于体外生产方法，例如用于体外生产和/或转化给定的C7-C11 2-酮酸(例如2-酮壬酸)、C6-C10醛(例如辛醛)和/或由C6-C10醛制备的产物(例如C6-C10醇、羧酸或C5-C9烷烃)。
因此，在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法包括：在至少一种C4-C102-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸的条件下，(I)向至少一种C4-C10 2-酮酸底物提供(A)具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶，(B)具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶(例如，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的天然和/或基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶)，和(C)具有异丙基异构酶活性的异丙基异构酶(例如，具有异丙基异构酶活性的天然和/或基因修饰的异丙基异构酶)。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括天然异丙基苹果酸合酶。在一些实施例中，至少一种C4-C10 2-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸通过一种或多种生化反应发生。生化反应可以独立地发生在基因修饰的微生物内部或外部。在某些实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包括2-酮丁酸，而在其它实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包括2-酮异戊酸。在更进一步的实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包括2-甲基-2-酮戊酸。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的一些实施例中，具有异丙基苹果酸合酶的基因修饰的异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列。在具有异丙基苹果酸合酶的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ IDNO：1具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：1的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列。在具有异丙基苹果酸活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：1的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自弗氏柠檬酸杆菌。在某些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶还包括突变Q258H和R260A。
根据制备C7-C11 2-酮酸的方法的其它实施例，具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列。在具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列。在具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自阴沟肠杆菌。在某些实施例中，异丙基苹果酸合酶还包括突变M255L。
根据制备C7-C11 2-酮酸的方法的进一步实施例，具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列。在具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列。在异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自阴沟肠杆菌。在某些实施例中，异丙基苹果酸合酶还包括突变M255L、R260A和N264Q。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的一些实施例中，所述方法还包括：(II)在C7-C11 2-酮酸转化为比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下，向C7-C11 2-酮酸提供硫胺素依赖性脱羧酶(例如，具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的天然的和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶)。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的其它实施例中，所述方法甚至还包括：(III)在C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇的条件下，向C6-C10醛提供醇脱氢酶(例如，具有醇脱氢酶活性的天然和/或基因修饰的醇脱氢酶)。在其它实施例中，所述方法包括：(III)在C6-C10醛转化为相应的C6-C10羧酸的条件下，向C6-C10醛提供醛脱氢酶(例如，具有醛脱氢酶活性的天然和/或基因修饰的醛脱氢酶)。在某些实施例中，所述方法包括：(III)在C6-C10醛转化为相应的Cn-1烷烃的条件下，向C6-C10醛提供脂肪醛脱羰酶(例如，具有脂肪醛脱羰酶活性的天然和/或基因修饰的脂肪醛脱羰酶)。
为了使非天然生物体能够进行如上文所定义的体内转化的一部分，例如，以产生C6-C10醛和/或C6-C10醇，希望执行类似下文描述的方案。通常，本文包括的实例涉及异丙基苹果酸合酶工程化以改变氨基酸从而修饰酶功能，特别是活性和/或特异性方面。氨基酸的这种改变可以用于产生用于小规模目的的修饰酶，例如，用于体外测定，或者可以是基因组修饰的基础，从而产生适合于更大规模生产的微生物菌株。
所述方法可以如本领域技术人员所理解的那样进行。通常，使用合适的数据库如基因库以获得天然酶的遗传密码，然后鉴定适于修饰的密码子。所述鉴定可以用作本领域已知的蛋白质工程方法的基础，其中计算机分子建模鉴定并且还能够区分可以有效地使用酶/底物界面的修饰的结构位置。然后使用称为定点诱变的分子生物学技术进行给定的理想修饰。然后将修饰基因克隆到复制质粒载体中，当转化到宿主微生物如大肠杆菌或梭菌属物种中时，能够产生具有高于天然催化效率的酶。含有靶向变体酶的大肠杆菌或梭菌属细胞也产生其它天然蛋白质。因此，必须对变体型酶进行纯化以分离出非靶向蛋白质和一般细胞结构，留下纯化的酶，其表现出高于天然的，即高于野生型的催化效率。根据适合特定酶的方法，催化效率可以在体外适当地测定。因此显示出具有所需水平的催化效率的测定酶被证实是理想的基因修饰的产物，并且可以用于体外生产方法。例如将这种酶用于体外生产给定的C7-C11 2-酮酸和/或C6-C10醛、和/或由C6-C10醛制备的产物，例如C6-C10醇、羧酸或相应的C5-C9烷烃。
上述方法的特定应用是产生所需的微生物，用于大规模或以其它商业规模方式发酵生产酶促产物，例如C6-C10醛或可由其制备的C6-C10产物中的一种。这种制备可以通过将编码所需改良酶的DNA或DNA片段插入已知或认为具有其它所需特征，例如由特定的含碳底物产生丙酮酸(或乙酰辅酶A)的能力，或其它有利性状的第二微生物的基因组中来进行。因此，现在对第二微生物进行基因修饰，这样其产生基因修饰酶。
在另一个实施例中，还可以简单地鉴定具有可用于所需途径的天然酶的微生物，并且使用所述微生物本身作为起始微生物，或将所述微生物的基因组的适当的酶编码部分转移到已经被鉴定为可用于大规模发酵生产的生物体的基因组中。这方面的一个实例是选择产生合适的天然硫胺素依赖性脱羧酶(即DC)和天然醇脱氢酶(即ADH)的微生物。然后，所述微生物可以用作起始生物体或转化生物体，以制备基因修饰的微生物，以比野生型微生物更高的产率或特异性产生C6-C10醇。
因此，在一些实施例中，提供了包括具有异丙基苹果酸合酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物。在包括基因修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物的一些实施例中，异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列。在异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：1的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列。在异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：1的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自弗氏柠檬酸杆菌。在某些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶还包括突变Q258H和R260A。基因修饰的异丙基苹果酸合酶在微生物中表达并具有异丙基苹果酸异构酶活性。在某些实施例中，微生物是弗氏柠檬酸杆菌。在其它实施例中，微生物是大肠杆菌或梭菌属物种。
在包括基因修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列。在异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列。在异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自阴沟肠杆菌。在某些实施例中，异丙基苹果酸合酶还包括突变M255L。基因修饰的异丙基苹果酸合酶在微生物中表达并具有异丙基苹果酸异构酶活性。在某些实施例中，微生物是阴沟肠杆菌。在其它实施例中，微生物是大肠杆菌或梭菌属物种。
在包括基因修饰的异丙基苹果酸合酶的微生物的其它实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列。在异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少80％同源性(如图3所示)。在其它实施例中，异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列。在异丙基苹果酸合酶的一些实施例中，所述异丙基苹果酸合酶包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性并具有突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合酶与构成SEQ ID NO：2的催化结构域的残基1-379具有至少90％同源性(如图3所示)。在一些实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列获自阴沟肠杆菌。在某些实施例中，异丙基苹果酸合酶还包括突变M255L、R260A和N264Q。基因修饰的异丙基苹果酸合酶在微生物中表达并具有异丙基苹果酸异构酶活性。在某些实施例中，微生物是阴沟肠杆菌。在其它实施例中，微生物是大肠杆菌或梭菌属物种。
实例
制备对2-酮己酸和2-酮辛酸具有增强的催化活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶。
在通过亮氨酸生物合成途径的“+1”途径的递归活性生物合成2-酮壬酸期间，异丙基苹果酸合酶捕获并缩合乙酰辅酶A和不同长度的2-酮酸。为了有效地生物合成2-酮壬酸，希望异丙基苹果酸合酶有效地与乙酰辅酶A捕获2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸和/或2-酮辛酸，从而产生相应的2-烷基苹果酸产物(图1中的中间体II)。大肠杆菌和其它微生物的天然异丙基苹果酸合酶在捕获较长的非天然2-酮酸底物方面效率较低。为了提高天然异丙基苹果酸合酶捕获较长的2-酮酸用于催化的活性，使用如下文所述的蛋白质工程技术修饰异丙基苹果酸合酶的活性位点。
对NCBI位点进行Blast搜索，以鉴定与大肠杆菌异丙基苹果酸合酶(基因登录号EG11226)同源的异丙基苹果酸合酶。从1000多个与大肠杆菌酶同源性为23-96％的序列中，选择来自5种微生物的异丙基苹果酸合酶进行蛋白质工程，并从基因库下载其基因序列(表1)。每个下载的异丙基苹果酸合酶的开放阅读框在计算机中翻译，并且通过与结核分枝杆菌异丙基苹果酸合酶的比对鉴定活性位点残基，其结构已在早些时候报道过(Koon，N.；Squire，C.J.；Baker，E.N.“来自结核分枝杆菌LeuA的晶体结构，一种亮氨酸生物合成中的关键酶(Crystal structure of LeuA from Mycobacterium tuberculosis，a key enzymein leucine biosynthesis.)”《美国国家科学院院刊(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America)》2004，101，8295-8300.)。早期在大肠杆菌异丙基苹果酸合酶中修饰的活性位点残基His-97、Ser-139、Asn-167、Pro-169和Gly-462(Marcheschi，R.J.；Li，H.；Zhang，K.；Noey，E.L.；Kim，S.；Chaubey，A.；Houk，K.N.；Liao，J.C.“一种用于碳链伸长的合成递归“+1”路径(A synthetic recursive″+1″pathway for carbon chain elongation.)”《美国化学学会化学生物杂志(ACS chemicalbiology)》2012，7，689-697)在来自五种不同微生物物种的五种选择的异丙基苹果酸合酶的序列中进行鉴定，并如表1所示进行修饰。
表1：来自第一轮工程的异丙基苹果酸合酶(IPMS)变体的活性。
Figure BDA0002012012200000301
包含6个组氨酸的13个额外氨基酸的密码子在每个IPMS基因序列的Met-1密码子的上游融合。这种修饰允许在N-末端表达具有13个额外氨基酸的His-标记的IPMS。出于克隆的目的，向所得修饰基因中加入另外的碱基以分别在5′和3′末端引入NcoI和SacI限制性位点。整个DNA序列经SGI Inc.化学合成并克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1的NcoI和SacI位点。His-标记的IPMS在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中异源表达并用Co-NTA色谱法纯化。应注意，本文包括的序列表中没有一个显示使用的组氨酸标记，在这种情况下，其是Gly-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser。
对每种工程化的异丙基苹果酸合酶变体进行表达，纯化，然后评价对三种底物的活性，所述底物为2-酮丁酸(即2-KBut)、2-酮己酸(即2-KHex)和2-酮辛酸(即2-KOct)。2-KBut是异丙基苹果酸合酶的天然底物，并且在亮氨酸的生物合成期间在微生物中形成。2-KHex和2-KOct是异丙基苹果酸合酶的非天然底物，其将在C7-C11 2-酮酸，例如2-酮壬酸生物合成过程中在细胞内形成。
为了表达异丙基苹果酸合酶及其变体，使用标准方法用含有其基因序列的pETDuet表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞的感受态细胞(从EMD生物科技(EMDBiosciences)获得)。在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择携带表达载体的细胞。通过将单个转化体菌落转移到50mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中并在37℃下以220rpm的速度振荡温育过夜来开始起子培养。第二天，将7mL起子培养物接种到800mLTerrific Broth(TB)中，并将培养物在37℃温育直至其OD600nm达到0.5。加入最终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以诱导异丙基苹果酸合酶或其变体的表达，并将培养物转移至15℃培养箱中，持续16小时(h)。在16小时结束时，将培养物以8000转/分钟(rpm)的速度离心以使细胞造粒。将细胞粒在-80℃下保存过夜，然后纯化。
为了分离和纯化酶，将取自400mL表达培养物的细胞粒悬浮在含有1μg/mL DNA酶(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，Inc.)，罗克福德，伊利诺伊州)、1μg/mL溶菌酶(赛默飞世尔科技公司，罗克福德，伊利诺伊州)、1毫摩尔(mM)二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂混合物(RPI Corp.，芒特普罗斯佩克特，伊利诺伊州)的B-PER试剂(赛默飞世尔科技公司，罗克福德，伊利诺伊州)中。将悬浮液在室温下轻轻摇晃30分钟(min)并在15,000倍重力(xg)下离心20分钟以造粒细胞碎片。分离上清液并与5mL Co-NTA树脂(赛默飞世尔科技公司，罗克福德，伊利诺伊州)一起温育，所述树脂已经用平衡缓冲液(50mM磷酸钠，pH8.0，含有300mM氯化钠，20mM咪唑，50μL蛋白酶抑制剂混合物和15％甘油)预平衡。在4℃温育1小时后，用5倍体积的平衡缓冲液洗涤酶结合的树脂。用含有200mM咪唑的平衡缓冲液从Co-NTA树脂上洗脱异丙基苹果酸合酶或其变体。将洗脱的蛋白质用磷酸盐缓冲盐水透析，并在-20℃下作为20％甘油溶液储存。
使用下述高通量酶测定法分两步进行LeuA变体的评估。最初，测试所有变体对单一高浓度2-KBut、2-KHex和2-KOct的活性。Marcheschi等人报道了的分光光度法异丙基苹果酸合酶测定(Marcheschi，R.J.；Li，H.；Zhang，K.；Noey，E.L.；Kim，S.；Chaubey，A.；Houk，K.N.；Liao，J.C.“用于碳链伸长的合成递归“+1”路径(A synthetic recursive″+1″pathway for carbon chain elongation.)”《美国化学学会化学生物杂志(ACS chemicalbiology)》2012，7，689-697)在96孔板中适于高通量形式，用于异丙基苹果酸合酶变体的动力学评估(如表1所示)。本研究中使用的HTP异丙基苹果酸合酶测定基于CoASH的定量，所述CoASH在2-酮酸与乙酰辅酶A缩合期间作为产物之一形成。基于CoASH与Ellman试剂(二硫代硝基苯甲酸；DTNB)的反应对CoASH进行定量，其中产生等摩尔量的2-硝基-4-硫代苯甲酸，其可在412nm下监测。在HTP酶测定期间，将2mM乙酰辅酶A(SigmaA2056)和2mM 2-酮酸(2-酮丁酸、2-酮己酸或2-酮辛酸)与6-20ug异丙基苹果酸合酶或其变体在含有20mM KCl和20mMMgCl2的50mM HEPES pH 7.5中一起温育。将含有反应混合物的96孔板在30℃下温育15分钟。通过加入SDS溶液(2％最终浓度)终止反应。通过加入2mM DTNB(Pierce#22582)定量反应中形成的CoASH的量，并通过在BioTek Synergy读板器中在412nm下测量溶液的吸光度来确定形成的TNB的量。使用其消光系数12500cm-1M-1计算形成的TNB的量。在这些实验中测定了异丙基苹果酸合酶变体对三种2-酮酸的比活性(表1和2)。
在初始评估之后，对选定数量的变体进行更详细的动力学分析，以确定酶对乙酰辅酶A和2-酮辛酸的最大速率(即kcat)、Michaelis-Menten常数(即KM)和催化效率(即，kcat/KM)。进行的反应如上所述，但稍作修改。在测定乙酰辅酶A的动力学参数期间(如表3所示)，其浓度在反应混合物中在0-10mM之间变化，而2-酮辛酸在2mM下保持恒定。类似地，在测定2-酮辛酸的动力学参数期间(如表4所示)，其浓度在反应混合物中在0-3.2mM之间变化，而乙酰辅酶A在2mM下保持恒定。在缩合全部或部分2-酮酸底物(例如2-Koct)时，比野生型酶更有效(更高kcat/KM)的异丙基苹果酸合酶变体是理想的，因为其提高了相关“+1”途径的整体效率。
新型异丙基苹果酸合酶变体的初步筛选显示构建体1409、1414和1427具有对2-酮己酸和2-酮辛酸的显著活性(表1)。这表明这些酶能够使“+1”途径迭代并在体内将2-酮丁酸伸长为2-酮壬酸。然而，构建体1409和1414的另外的动力学评估证明这些酶分别具有比大肠杆菌酶低37和1.8倍的转换率(kcat)(表3)。因此，开始对1409和1414进行第二轮修饰以改善这些变体的转换率。
进行第二轮工程以改善构建体1409和1414的转换率。然而，异丙基苹果酸合酶的晶体结构仅显示2-酮酸结合中涉及的残基，而乙酰辅酶A结合中涉及的残基或转换所必需的残基是未知的。生物信息学和同源建模用于定位大肠杆菌异丙基苹果酸合酶1409和1414的催化结构域中的氨基酸取代。
具体地，使用来自双曲钩端螺旋体的截短的异丙基苹果酸合酶作为模板，产生构建体1409、1414和大肠杆菌异丙基苹果酸合酶的催化结构域的同源模型。来自双曲钩端螺旋体的截短的IPMS长度为394个氨基酸，缺少C末端调节结构域(Zhang，Z.；Wu，J.；Lin，W.；Wang，J.；Yan，H.；Zhao，W.；Ma，J.；Ding，J.；Zhang，P.；Zhao，G.P.“α-异丙基苹果酸合酶的亚结构域II对于活性是必需的：推断反馈抑制的机制(Subdomain II of alpha-isopropylmalate synthase is essential for activity：inferring a mechanism offeedback inhibition.)”《生物化学杂志(The Journal of biological chemistry)》2014，289，27966-27978)。大肠杆菌异丙基苹果酸合酶构建体1409和构建体1414的截短序列的序列比对显示三种蛋白质的催化结构域中的氨基酸取代(图3)。如表2所示，分别在1409和1414的催化结构域中进行另外的取代，以鉴定在酶的催化效率中起主要作用的残基。表2中列出的每种构建体使用定点诱变由构建体1409或1414产生，在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达为his标记的蛋白质，并在Ni-NTA琼脂糖层析上纯化。构建体1465、1466、1467、1470和1472显示2-酮辛酸底物活性比起始构建体1409增加25-450％(表2)。类似地，构建体1456、1457和1460具有与相应的起始构建体1414相同或高出33％的2-酮辛酸活性(表2)。
表2：来自第二轮工程的异丙基苹果酸合酶变体的活性
Figure BDA0002012012200000341
将表2中列出的选择构建体对乙酰辅酶A和2-酮辛酸的催化效率(kcat/KM)与Liao等人，U.S.8,298,798中公开的构建体进行比较(表3和4)。发现构建体1467在捕获乙酰辅酶A和2-酮辛酸用于催化方面比其亲本构建体1409有效21倍和9倍(表3和4)。在捕获乙酰辅酶A和2-酮辛酸用于催化方面，其也比先前公开的大肠杆菌异丙基苹果酸合酶构建体(构建体614)的效率高30-40％(表3和4)。构建体1457和1460作为催化剂也优于其亲本构建体1414，以及先前公开的大肠杆菌异丙基苹果酸合酶(构建体614)(表3和4)。
表3：乙酰辅酶A对异丙基苹果酸合酶变体的动力学参数。
Figure BDA0002012012200000351
表4异丙基苹果酸合酶变体对2-酮辛酸的动力学参数。
Figure BDA0002012012200000352
使用异丙基苹果酸合酶变体结合‘+1途径’酶在大肠杆菌的工程菌株中体内生产C4-C8醇。
菌株构建
在工程化大肠杆菌MG1655菌株(E.coli)中评估异丙基苹果酸合酶变体对醇产生的影响。修饰MG1655菌株以改善线性醇生产，使得能够从Plac启动子表达基因并赋予克隆稳定性。线性醇生产的改进涉及敲除ilvBN和ilvIH基因，以及上调大肠杆菌MG1655中的ilvA基因。敲除ilvBN和ilvIH基因消除了支链醇的产生，而上调ilvA基因增加了2-酮丁酸的产生。通过用强组成型启动子BBa_J23119和合成核糖体结合位点BBa_B0034替换其天然启动子和核糖体结合位点来实现ilvA的上调。强组成型启动子和合成核糖体结合位点均获自标准生物组件登记处(http://parts.igem.org)，由iGEM(国际基因工程机器大赛)策划的生物组件数据库。如Datsenko和Wanner(PNAS 97(12)：6640-6645)所述，通过λ(red)介导的重组进行ilvBN和ilvIH基因的敲除以及ilvA基因的天然启动子和核糖体结合位点的替换。为了能够从Plac启动子表达基因，使用λDE3溶原化试剂盒(EMD Millipore Cat#69734)将DE3溶原菌整合到MG1655中。为了确保克隆稳定性，通过λRed介导的同源重组使recA失活。用于醇生产研究的所得菌株的基因型是MG1655(DE3)ΔrecAΔilvBNΔilvIHilvAup。
载体构建
在评估异丙基苹果酸合酶变体在工程化MG1655大肠杆菌菌株中对C4-C8醇产生的影响期间，共表达以下六种酶：i)天然大肠杆菌异丙基苹果酸合酶(LeuA；基因库：登录号NC000913.3基因ID：947465)，ii)天然大肠杆菌异丙基苹果酸异构酶(LeuCD；基因库：登录号NC 000913.3基因ID：94576和基因ID：945642)，iii)表5中描述的异丙基苹果酸合酶变体，iv)大肠杆菌异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB；基因库：登录号NC 000913.3基因ID：944798)，v)来自乳酸乳球菌(Lactocossus lactis)的酮异戊酸脱羧酶(KIVD*)的F381L/V461A变体(Zhang等人《美国国家科学院院刊(PNAS)》.2008，105，20653-20658所述)，和vi)酿酒酵母乙醇脱氢酶(ADH6；基因库：登录号NC_001145.3基因ID：855368)。
表5含有异丙基苹果酸合酶变体基因的载体，其构建用于评估在工程化MG1655菌株中对醇组成的影响。
变体编号 质粒ID
614 pSD-0100
1414 pSD-0135
1457 pSD-0136
1460 pSD-0137
1409 pSD-0138
1466 pSD-0139
1467 pSD-0140
使用Marcheschi等人在(《美国化学学会化学生物杂志(ACS Chem.Biol.)》2012，7，689-697)中描述并从加州大学洛杉矶分校的James C.Liao博士小组获得的两种表达载体pZE_LeuABCD-KA6和pZAlac_ilvAleuA表达所有酶。pZAlac_ilvAleuA(图4)含有ilva和野生型LeuA基因的拷贝，并且无需任何进一步修饰即可使用。对pZE_LeuABCD-KA6进行修饰以表达表5中描述的异丙基苹果酸合酶变体以及LeuB、LeuC、LeuD和KiVD*(Zhang等人在《美国国家科学院院刊(PNAS)》.2008，105，20653-20658中描述的来自乳酸乳球菌的酮异戊酸脱羧酶的F381L/V461A变体)基因。为这些研究构建了含有不同异丙基苹果酸合酶变体基因的六种载体(如表5所示)。图5显示了典型的修饰载体pSD-0###，其与pZAlac_ilvAleuA一起用于醇生产研究。如图4所示并且在表5中列出，每个pSD-0###载体在转化细胞中表达给定的异丙基苹果酸合酶变体。两种载体中的所有基因都在pLacO1启动子下并使用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。
使用新英格兰生物科学(New England Bioscience)的Gibson组装技术将异丙基苹果酸合酶变体的基因克隆到pZE_LeuABCD-KA6载体中。最初，使用限制酶KpnI从pZE_LeuABCD-KA6载体中除去LeuABCD基因。将基因LeuBCD与独特的XmaI切割位点一起重新插入切割载体中，以使用Gibson组装产生中间载体pZE BCD-KA6(图6中所示)。在第二步中，使用Gibson组装将PCR产生的异丙基苹果酸合酶基因在XmaI位点处插入pZE BCD-KA6载体中以产生最终的pSD-0###载体。对于醇生产，用pZAlac_ilvAleuA载体(图4)和表5中列出的pSDL-0###载体中的一种转化大肠杆菌的工程化MG1655菌株(MG1655(DE3)ΔrecAΔilvBNΔilvIHilvAup)。
工程化MG1655细胞中的醇产生
在含有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择用pZAlac_ilvAleuA和表5中列出的pSDL-0###载体中的一种转化的MG1655菌株。使用来自双重抗生素LB琼脂平板的单个菌落启动在含有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/mL卡那霉素的LB培养基中的50mL起子培养物，并在37℃下在设定为200rpm的培养箱振荡器中温育过夜。温育12-16小时后，向含有5mL具有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的无菌修饰的2X M9培养基(表6中所示的组成)的血清瓶接种50μL起子培养物。
表6：用于演示大肠杆菌产生醇的培养基组成，其重组工程化以含有‘+1途径’与异丙基苹果酸合酶变体的组合。
Figure BDA0002012012200000381
将培养物在37℃下以200rpm的速度振荡温育，并在3小时后使用0.1mMIPTG诱导以表达所有基因。诱导后将培养温度降至30℃。诱导后44小时，将其转移至4℃，持续20-30分钟来收集培养物。然后将血清瓶去盖，并将发酵液快速倒入含有1mL饱和氯化钠溶液和2mL分析级甲苯的15mL锥形管中。将发酵液-氯化钠-甲苯混合物涡旋30秒，并使用通过引用整体并入本文的WO2016094604 A1中描述的GC/FID方法，对甲苯提取物进行醇分析。
表7显示了5种异丙基苹果酸合酶变体在表达其以及上述其它基因的菌株中对醇组分的影响。所有5种表达异丙基苹果酸合酶变体的细胞产生显著庚醇滴度。这表明异丙基苹果酸合酶变体在细胞内具有活性，因为仅表达野生型LeuA的菌株产生的最长的醇是己醇(Marcheschi等人《美国化学学会化学生物杂志(ACS Chem.Biol.)》2012，7，689-697)。在表达614、1409和1467的菌株中产生的可比较的庚醇水平表明，在文中使用的试验条件下，1409和1467可以在非天然途径中有效地替代614。
表7：含有‘+1途径’酶与变体异丙基苹果酸合酶组合的大肠杆菌的血清瓶发酵的平均醇滴度。
变体# 1-丁醇 1-戊醇 1-己醇 1-庚醇 总醇
1409 270.2±12.2 356.0±11.4 194.0±1.8 45.3±5.0 865.5±8.2
1467 272.9±10.3 366.4±31.6 209.5±19.8 42.0±4.3 890.8±65.6
1414 275.0±18.9 528.6±47.1 166.1±27.9 14.6±5.9 984.4±93.4
1457 302.6±8.5 541.2±26.6 200.3±0.9 25.7±7.1 1069.8±16.4
1460 262.9±15.1 621.4±38.6 197.5±19.2 18.8±4.6 1100.7±77.4
614 260.7±8.6 369.3±12.4 205.6±7.7 65.2±1.7 900.9±29.8
*ADH6和kivD也包括在所有菌株构建体中。所有滴度均以最少一式三份试验的毫克每升±标准偏差显示。诱导后44小时测量滴度。
总之，几种与专利大肠杆菌异丙基苹果酸合酶一样好或更好的异丙基苹果酸合酶可用于开发能够产生不同长度的2-酮酸的菌株。此外，表3和表4中列出的构建体1409和1414及其变体构成了一系列在缩合2-酮酸和乙酰辅酶A方面变得更有效的异丙基苹果酸合酶。它们一起提供一组异丙基苹果酸合酶，其提供机会使通过“+1”途径的通量与给定微生物中的乙酰辅酶A可用性/需求相匹配，并允许优化2-酮酸伸长。
序列表
<110> 陶氏化学公司（ The Dow Chemical Company）
Sanghani, Paresh
Delaplane, Sarah
<120> 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其C6-C10化合物的方法
<130> DOW 79045 MA / 40224.368
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 523
<212> PRT
<213> 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)
<400> 1
Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu
1 5 10 15
Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala
20 25 30
Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro
35 40 45
Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Gln
50 55 60
Val Lys Asn Ser Arg Val Cys Ala Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp
65 70 75 80
Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile
85 90 95
His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg
100 105 110
Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Val Tyr Met Val Lys Arg
115 120 125
Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Ser Cys Glu Asp Ala Gly
130 135 140
Arg Thr Pro Ile Thr Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Ala Gly Ala Lys Thr Ile Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met
165 170 175
Pro Phe Glu Phe Gly Ala Ile Ile Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro
180 185 190
Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly
195 200 205
Leu Gly Val Gly Asn Ala Leu Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln
210 215 220
Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser
225 230 235 240
Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn
245 250 255
Val Gln Thr Arg Ile Asn His Gln Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Leu
260 265 270
Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val
275 280 285
Gly Ser Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val
290 295 300
Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly
305 310 315 320
Leu Asn Gln Val Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala
325 330 335
Val Lys His Arg Met Asp Glu Met Gly Tyr Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
340 345 350
Leu Asp Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly
355 360 365
Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Asn Lys Gln
370 375 380
Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser
385 390 395 400
Gly Ser Asn Asp Ile Ala Thr Ala Ser Val Lys Leu Ala Cys Gly Glu
405 410 415
Glu Val Lys Ala Glu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Pro Val Asp Ala Ile
420 425 430
Tyr Gln Ala Ile Asn Arg Val Thr Glu Tyr Asn Ile Glu Leu Val Lys
435 440 445
Tyr Ser Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Gly Gln Val
450 455 460
Asp Ile Val Ala Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu
465 470 475 480
Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu
485 490 495
Asn Asn Ile Trp Arg Ala Glu Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys
500 505 510
Ala Gln Asn Asn Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val
515 520
<210> 2
<211> 523
<212> PRT
<213> 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)
<400> 2
Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu
1 5 10 15
Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala
20 25 30
Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro
35 40 45
Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Thr
50 55 60
Ile Lys Asn Ser Arg Val Cys Gly Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp
65 70 75 80
Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile
85 90 95
His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg
100 105 110
Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Val Tyr Met Val Lys Arg
115 120 125
Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Ser Cys Glu Asp Ala Gly
130 135 140
Arg Thr Pro Ile Asp Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Ala Gly Ala Lys Thr Ile Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met
165 170 175
Pro Phe Glu Phe Ser Asn Ile Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro
180 185 190
Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly
195 200 205
Leu Ala Val Gly Asn Ala Ile Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln
210 215 220
Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser
225 230 235 240
Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Met Asn
245 250 255
Val His Thr Arg Ile Asn His Asn Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Thr
260 265 270
Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val
275 280 285
Gly Thr Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val
290 295 300
Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly
305 310 315 320
Leu Asn Gln Val Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala
325 330 335
Val Lys His Arg Met Glu Glu Met Gly Tyr Lys Asp Ser Asp Tyr Asn
340 345 350
Met Asp Gln Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly
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Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Asn Lys Gln
370 375 380
Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser
385 390 395 400
Gly Ser Ser Asp Ile Ala Thr Ala Ser Ile Lys Leu Ala Cys Gly Asp
405 410 415
Glu Ile Lys Ala Glu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Pro Val Asp Ala Ile
420 425 430
Tyr Gln Ala Ile Asn Arg Val Thr Glu Tyr Asp Val Glu Leu Val Lys
435 440 445
Tyr Asp Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Gly Gln Val
450 455 460
Asp Ile Val Val Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu
465 470 475 480
Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu
485 490 495
Asn Asn Ile Trp Arg Ala Ala Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys
500 505 510
Ala Gln Asn Lys Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val
515 520
<210> 3
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(523)
<223> 合成-修饰的弗氏柠檬酸杆菌异丙基苹果酸合酶 (H97A S139G N167GP169A G181A A182G G210A A214S G462D)
<400> 3
Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu
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Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala
20 25 30
Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro
35 40 45
Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Gln
50 55 60
Val Lys Asn Ser Arg Val Cys Ala Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp
65 70 75 80
Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile
85 90 95
Ala Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg
100 105 110
Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Val Tyr Met Val Lys Arg
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Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Gly Cys Glu Asp Ala Gly
130 135 140
Arg Thr Pro Ile Thr Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Ala Gly Ala Lys Thr Ile Gly Ile Ala Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met
165 170 175
Pro Phe Glu Phe Ala Gly Ile Ile Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro
180 185 190
Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly
195 200 205
Leu Ala Val Gly Asn Ser Leu Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln
210 215 220
Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser
225 230 235 240
Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn
245 250 255
Val Gln Thr Arg Ile Asn His Gln Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Leu
260 265 270
Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val
275 280 285
Gly Ser Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val
290 295 300
Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly
305 310 315 320
Leu Asn Gln Val Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala
325 330 335
Val Lys His Arg Met Asp Glu Met Gly Tyr Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
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Leu Asp Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly
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Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Asn Lys Gln
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Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser
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Gly Ser Asn Asp Ile Ala Thr Ala Ser Val Lys Leu Ala Cys Gly Glu
405 410 415
Glu Val Lys Ala Glu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Pro Val Asp Ala Ile
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Tyr Gln Ala Ile Asn Arg Val Thr Glu Tyr Asn Ile Glu Leu Val Lys
435 440 445
Tyr Ser Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Asp Gln Val
450 455 460
Asp Ile Val Ala Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu
465 470 475 480
Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu
485 490 495
Asn Asn Ile Trp Arg Ala Glu Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys
500 505 510
Ala Gln Asn Asn Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val
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<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(523)
<223> 合成-修饰的弗氏柠檬酸杆菌异丙基苹果酸 (H97A S139G N167G P169AG181A A182G G210A A214S Q258H R260A G462D)
<400> 4
Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu
1 5 10 15
Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala
20 25 30
Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro
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Ala Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg
100 105 110
Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Val Tyr Met Val Lys Arg
115 120 125
Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Gly Cys Glu Asp Ala Gly
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Arg Thr Pro Ile Thr Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn
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Ala Gly Ala Lys Thr Ile Gly Ile Ala Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met
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Leu Ala Val Gly Asn Ser Leu Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln
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Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn
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Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val
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465 470 475 480
Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu
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Asn Asn Ile Trp Arg Ala Glu Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys
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<210> 5
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(523)
<223> 合成-修饰的阴沟肠杆菌异丙基苹果酸合酶 (H97A S139G N167G P169AR260A N264Q G462D)
<400> 5
Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu
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Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala
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Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro
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50 55 60
Ile Lys Asn Ser Arg Val Cys Gly Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp
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Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile
85 90 95
Ala Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg
100 105 110
Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Val Tyr Met Val Lys Arg
115 120 125
Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Gly Cys Glu Asp Ala Gly
130 135 140
Arg Thr Pro Ile Asp Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(523)
<223> 合成-修饰的阴沟肠杆菌异丙基苹果酸合酶 (H97A S139G N167G P169AR260A N264Q G462D M255L)
<400> 6
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Val Tyr Met Val Lys Arg
115 120 125
Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Gly Cys Glu Asp Ala Gly
130 135 140
Arg Thr Pro Ile Asp Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Ala Gly Ala Lys Thr Ile Gly Ile Ala Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met
165 170 175
Pro Phe Glu Phe Ser Asn Ile Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro
180 185 190
Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly
195 200 205
Leu Ala Val Gly Asn Ala Ile Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln
210 215 220
Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser
225 230 235 240
Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn
245 250 255
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260 265 270
Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val
275 280 285
Gly Thr Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val
290 295 300
Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly
305 310 315 320
Leu Asn Gln Val Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala
325 330 335
Val Lys His Arg Met Glu Glu Met Gly Tyr Lys Asp Ser Asp Tyr Asn
340 345 350
Met Asp Gln Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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<210> 7
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(523)
<223> 合成-修饰的阴沟肠杆菌异丙基苹果酸合酶 (H97A S139G N167G P169AD348E D350E M353L Q355N G462D)
<400> 7
Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu
1 5 10 15
Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala
20 25 30
Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro
35 40 45
Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Thr
50 55 60
Ile Lys Asn Ser Arg Val Cys Gly Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp
65 70 75 80
Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile
85 90 95
Ala Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg
100 105 110
Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Val Tyr Met Val Lys Arg
115 120 125
Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Gly Cys Glu Asp Ala Gly
130 135 140
Arg Thr Pro Ile Asp Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Ala Gly Ala Lys Thr Ile Gly Ile Ala Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met
165 170 175
Pro Phe Glu Phe Ser Asn Ile Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro
180 185 190
Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly
195 200 205
Leu Ala Val Gly Asn Ala Ile Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln
210 215 220
Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser
225 230 235 240
Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Met Asn
245 250 255
Val His Thr Arg Ile Asn His Asn Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Thr
260 265 270
Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val
275 280 285
Gly Thr Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val
290 295 300
Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly
305 310 315 320
Leu Asn Gln Val Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala
325 330 335
Val Lys His Arg Met Glu Glu Met Gly Tyr Lys Glu Ser Glu Tyr Asn
340 345 350
Leu Asp Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly
355 360 365
Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Asn Lys Gln
370 375 380
Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser
385 390 395 400
Gly Ser Ser Asp Ile Ala Thr Ala Ser Ile Lys Leu Ala Cys Gly Asp
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Tyr Asp Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Asp Gln Val
450 455 460
Asp Ile Val Val Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu
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Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu
485 490 495
Asn Asn Ile Trp Arg Ala Ala Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys
500 505 510
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515 520
<210> 8
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(523)
<223> 合成-修饰的阴沟肠杆菌异丙基苹果酸合酶 (H97A S139G N167G P169AD348E D350E M353L Q355N G462D M255L R260A N264Q)
<400> 8
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1 5 10 15
Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala
20 25 30
Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro
35 40 45
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50 55 60
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Ala Gln Asn Lys Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val
515 520

Claims (12)

1.一种制备C7-C11 2-酮酸的方法，所述方法包括：(I)在至少一种C4-C10 2-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸的条件下，向所述至少一种C4-C10 2-酮酸底物提供：
(a)基因修饰的异丙基苹果酸合酶(IPMS)，其选自以下中的至少一种：
(i)如SEQ ID NO：1所示并且包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D的氨基酸序列并具有IPMS活性；
(ii)如SEQ ID NO：2所示并且包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、M255L、R260A、N264Q和G462D的氨基酸序列并具有IPMS活性；或
(iii)如SEQ ID NO：2所示并且包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D的氨基酸序列并具有IPMS活性；
(b)具有异丙基苹果酸异构酶活性的异丙基苹果酸异构酶；以及
(c)具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶；
并且其中所述至少一种C4-C10 2-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸是通过一种或多种生化反应发生。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C4-C10 2-酮酸底物包括2-酮丁酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C4-C10 2-酮酸底物包括2-酮异戊酸。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括：(II)在所述C7-C11 2-酮酸转化为比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下，向所述C7-C11 2-酮酸提供具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的硫胺素依赖性脱羧酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中(I)和(II)在基因修饰的微生物的内部或外部独立地发生。
6.根据权利要求4所述的方法，还包括：(III)在所述C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇的条件下，向所述C6-C10醛提供具有醇脱氢酶活性的醇脱氢酶。
7.根据权利要求4所述的方法，还包括：(III)在所述C6-C10醛转化为相应的C6-C10羧酸的条件下，向所述C6-C10醛提供具有醛脱氢酶活性的醛脱氢酶。
8.根据权利要求4所述的方法，还包括：(III)在所述C6-C10醛转化为相应的Cn-1烷烃的条件下，向所述C6-C10醛提供具有脂肪醛脱羰酶活性的醛脱羰酶。
9.一种微生物，其包括以下中的至少一种：
(a)基因修饰的异丙基苹果酸合酶(IPMS)，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、
G210A、A214S和G462D，并具有IPMS活性；
(b)基因修饰的IPMS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、M255L、R260A、N264Q和G462D，并具有IPMS活性；或
(c)基因修饰的IPMS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D，并具有IPMS活性。
10.一种具有异丙基苹果酸活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、G181A、A182G、G210A、A214S和G462D。
11.一种具有异丙基苹果酸活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、M255L、R260A、N264Q和G462D。
12.一种具有异丙基苹果酸活性的基因修饰的异丙基苹果酸合酶多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示并包括突变H97A、S139G、N167G、P169A、D348E、D350E、M353L、Q355N和G462D。
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