CN104302765A - 反馈抗性α-异丙基苹果酸合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％相同，其中SEQ ID NO:2在553位或在该氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸，本发明涉及一种包含所述核苷酸序列的微生物，也涉及使用这种微生物生产精细化学品的方法。

Description

反馈抗性α-异丙基苹果酸合酶
本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％相同，其中SEQ ID NO:2在553位或在所述氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸(proteinogenic amino acid)，本发明涉及一种包含所述核苷酸序列的微生物，也涉及使用这种微生物生产精细化学品的方法。
精细化学品，其尤其包括氨基酸、有机酸、维生素、核苷和核苷酸，用于人类医学、制药产业、化妆品、食品产业和动物饲料。
大量这些化合物是通过棒状细菌菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)发酵产生的。由于其非常重要，改进该产生方法的工作一直在进行。方法改进可以涉及发酵措施，例如，搅动和供给氧气，或者营养培养基的组成，例如，发酵期间的糖浓度，或者通过譬如离子交换层析给出产品形式的步骤，或者微生物本身的内在性能。
诱变、筛选和突变选择的方法被用来改进所述微生物的性能。用这种方式，获得的菌株耐抗代谢物，例如亮氨酸类似物4-氮亮氨酸或5,5,5-三氟亮氨酸，并产生化合物，例如L-氨基酸，如L亮氨酸。举例来说，可提及参考文献Casalone et al.(Research in Microbiology 148:613-623 1997)。
若干年来，重组DNA技术的方法已用于L-氨基酸-生产菌株谷氨酸棒杆菌的改进，其中，例如增强或减弱单个氨基酸生物合成基因，并研究对化合物产生的影响。
可在“Handbook of Corynebacterium glutamicum”(Eds.:L.Eggeling andM.Bott,CRC Press,Taylor&Francis,2005)、Journal of Biothechnology(主编：A.Pühler)特刊，标题为“A New Era in Corynebacterium glutamicumBiotechnology”(Journal of Biotechnology 104/1-3,(2003))、和T.Scheper(总编辑)的书“Microbial Production of L Amino Acids”(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology 79,Springer Verlag,Berlin,Germany,2003)中找到谷氨酸棒杆菌生物学、遗传学和生物技术的综述。
在Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99-109(2003))、EP1108790和Kalinowski等(Journal of Biotechnology104/1-3,(2003))中描述了谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列。
在国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)(Bethesda,Maryland,USA)、日本DNA数据库(DDBJ,Mishima,Japan)或者欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库(EMBL,Heidelberg,Germany or Cambridge,UK)中也有谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列。
尤其通过如下细节描述来自谷氨酸棒杆菌的编码α-异丙基苹果酸合酶的leuA基因：
α-异丙基苹果酸合酶(IPMS,EC＝2.3.3.13)催化乙酰-CoA的乙酰基与3-甲基-2-氧代丁酸盐(酯)(2-氧代异戊酸盐(酯)，酮基异戊酸盐(酯))的缩合，用于3-羧基-3-羟基-4-甲基戊酸盐(酯)(2-异丙基苹果酸盐(酯))的形成。leuA基因包含1851碱基对(bp)，并编码分子量为68187的多肽。对于催化生物合成路径第一步的酶很普遍，α-异丙基苹果酸合酶受终产物亮氨酸的反馈调节(Patèk et al.,Applied Environmental Microbiology 60:133-140(1994))。并且，在二价阳离子尤其是锌离子存在的情况下，该酶受辅酶A的抑制(Ulm et al.,Journal of Bacteriology 110(3):1118–1126(1972)；Tracy and Kohlhaw,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 72(5):1802–1806(1975))。
根据NCBI数据库的详情，编码来自谷氨酸棒杆菌的α异丙基苹果酸合酶的leuA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由其编码产生的α-异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。在SEQ ID NO:3中位于上游和下游的核苷酸序列另有报道。
本发明的目的是提供一种用于产生酮异己酸或L-亮氨酸的发酵方法，所述方法具有提高的产量或者在细胞内和/或培养基中有更高的产物终浓度。
本发明的另一目的是提供一种以这样的方式被修饰的细胞，即使存在高的细胞内浓度的亮氨酸，也能够产生酮异己酸或亮氨酸。
本发明的另一目的是基于用于发酵的碳底物量提高酮异己酸或亮氨酸的产量。
本发明的发明者令人惊讶地证实α-异丙基苹果酸合酶的一个突变引起酮异己酸和亮氨酸产生的提高。不希望被任何理论束缚，本发明人推测这个突变降低或者甚至消除了所述酶的反馈抑制，即通过产物结合至所述酶介导的酶活性的下降。
表述“亮氨酸”与“L-亮氨酸”同义使用，也包括它的盐，例如L-亮氨酸盐酸盐，L-亮氨酸硫酸盐或者钙盐。类似地，表述酮异己酸(KIC)也包括它的盐，例如钙-KIC、钾-KIC或钠-KIC。
本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％地相同，其中SEQ ID NO:2在553位或在该氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸。
在一个优选实施方案中，由本发明的核苷酸序列编码的氨基酸序列在553位或者相应位置具有选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸，特别优选选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸。
在一个优选实施方案中，由本发明的核酸序列编码的氨基酸序列在553位或相应位置具有L-天冬氨酸。
在一个优选实施方案中，本发明的核酸序列是在1657位或相应位置具有鸟嘌呤的核酸序列，如SEQ ID NO:5所示。
表述“相应于所述氨基酸序列的553位的位置”或者“氨基酸序列的553位的同等位置”是指，通过在编码的多肽的N-末端区域(基于SEQ IDNO:2的553位)插入或缺失一个编码氨基酸的密码子，在插入的情况下位置表述和长度表述形式上增加一个单位，或者，在缺失的情况下，减少一个单位。同样地，通过在编码的多肽的C-末端区域(基于553位)插入或缺失一个编码氨基酸的密码子，在插入的情况下长度表述形式上增加一个单位，或者，在缺失的情况下，减少一个单位。这种同等位置可以通过以“比对”的形式比较氨基酸序列而容易鉴定，例如使用Clustal W程序(Thompson etal.,Nucleic Acids Research 22,4637-4680(1994))或者MAFFT程序(Katoh etal.,Genome Information 2005；16(1),22-33)。
这些插入和缺失不实质上影响酶活性。“不实质上影响”指所述变体的酶活性与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的活性相差最多10％、最多7.5％、最多5％、最多2.5％或最多1％。
Kohlhaw等(Methods in Enzymology 166:423-9(1988))描述了一种用于确定异丙基苹果酸合酶的酶活性的方法；所述测试基于测量用CoA还原DTNB(5,5’-二硫代-(2-硝基苯甲酸)，Ellman's试剂)形成的硫代硝基苯甲酸盐(酯)(TNB)引起的412nm处的消光变化。
本发明相应地也涉及包含这种序列和编码SEQ ID NO:2或6的多肽变体的核苷酸序列和核酸分子，其包含一个或多个插入或缺失。优选地，所述多肽包含最多5个、最多4个、最多3个或最多2个氨基酸插入或缺失。
优选分离自棒杆菌属的微生物，特别是谷氨酸棒杆菌的编码异丙基苹果酸合酶的可复制核苷酸序列，其中由其编码的蛋白质序列在相应于SEQID NO:2的553位的位置包含除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸。
进一步地，特别优选编码异丙基苹果酸合酶并分离自棒杆菌属的微生物，特别是谷氨酸棒杆菌的可复制核苷酸序列(DNA)，其中相关氨基酸序列在553位包含L-天冬氨酸，如SEQ ID NO:6所示。
本发明进一步涉及编码异丙基苹果酸合酶并分离自棒杆菌属微生物，特别是谷氨酸棒杆菌的可复制核苷酸序列(DNA)，所述核苷酸序列的碱基序列在1657位包含鸟嘌呤，如SEQ ID NO:5所示。
本发明进一步涉及质粒和载体，所述质粒和载体包含本发明的核苷酸序列，以及任选地在棒杆菌属微生物中复制或适合于棒杆菌属微生物。
本发明进一步涉及包含本发明的核苷酸序列、载体和多肽的棒杆菌属微生物。
本发明进一步涉及包含由本发明的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽。一个实例性多肽如SEQ ID NO:6所示。
在一个特别优选实施方案中，本发明的多肽或由本发明的核苷酸序列编码的多肽或者本发明的微生物包含的多肽是修饰的IPMS，其相对于野生型酶具有降低的反馈抑制，即所述酶比野生型酶更少受其产物之一或代谢中形成的代谢物例如KIC或L-亮氨酸的抑制。
本发明优选进一步涉及包含本发明的核苷酸序列、载体和/或多肽的棒杆菌属微生物，并且在所述微生物中，编码异丙基苹果酸合酶的核苷酸序列优选以过表达的形成存在。
本发明进一步特别优选涉及包含本发明的核苷酸序列的棒杆菌属微生物，其中编码异丙基苹果酸合酶的核苷酸序列优选以过表达的形式存在，其中相关氨基酸序列在553位包含L天冬氨酸，如SEQ ID NO:6所示。
为了产生本发明的编码特征在于SEQ ID NO:2的553位存在氨基酸置换的α-异丙基苹果酸合酶的核苷酸序列，采用现有技术中描述的诱变方法。
可采用体外方法诱变，例如，突变寡核苷酸(T.A.Brown:Gentechnologiefür Einsteiger[初学者遗传工程],Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,1993)或Newton和Graham的手册(PCR,Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,1994)中描述的聚合酶链式反应(PCR)。
可在现有技术和已知的遗传和分子生物学教科书中找到更多的生成突变的操作指南，例如，Knippers编的教科书("Molekulare Genetik"[分子遗传学],6th edition,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,Germany,1995)、Winnacker编的("Gene und Klone"[基因和克隆]VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)或者Hagemann("Allgemeine Genetik"[普通遗传学],GustavFischer Verlag,Stuttgart,1986)。
当采用体外方法时，采用聚合酶链式反应从野生型菌株的分离的全长DNA扩增现有技术中描述的leuA基因，任选克隆至合适的质粒载体中，接着所述DNA接受诱变过程。采用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA序列的操作指南可由本领域技术人员发现于Gait编的手册：Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,UK,1984)和Newton和Graham的：PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany,1994)。接着分离、研究并测序合适的leuA等位基因。用于该目的的操作指南可在例如Kalinowski等(Molecular and General Genetics 224:317324(1990))、Kalinowski等(Molecular Microbiology 5:1197-204(1991))或Follettie等(Journal of Bacteriology 175,4096-4103(1993))中找到。测序的操作指南可在例如Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,74:5463-5467,(1977))中找到。
因此本发明涉及一种编码异丙基苹果酸合酶的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明进一步涉及一种编码异丙基苹果酸合酶的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或由其组成。
出现于例如微生物的生物中的核苷酸序列的生物化学或化学结构详情尤其可在Berg等的教科书"Biochemie"[生物化学](Spektrum AkademischerVerlag Heidelberg,Berlin,Germany,2003；ISBN 3-8274-1303-6)中找到。
在一个优选实施方案中，表述“核苷酸序列”或“氨基酸序列”是指来自包括DNA、RNA和其修饰形式的组的核酸分子，或者包括特定序列例如与另一序列融合或由其组成的多肽。
如果所述核苷酸序列由具有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的脱氧核糖核苷酸单体组成，则其描述为脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核酸(DNA)。如果所述核苷酸序列由具有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核糖核苷酸单体组成，则其描述为核糖核苷酸序列或核糖核酸(RNA)。在所述核苷酸序列中，所述单体通过3’→5’磷酸二酯键相互共价结合。
从化学角度来看，基因是核苷酸序列。编码蛋白质/多肽的核苷酸序列在本文与表述“基因”同义使用。“基因”和“编码区域”这两种表述同义使用，“蛋白质”和“多肽”这两种表述也同义使用。
“蛋白原氨基酸”是指出现在天然蛋白质，即来自微生物、植物、动物和人类的蛋白质中的氨基酸。它们作为蛋白质的结构单元，其中它们通过肽键相互连接。
如果下文中提到蛋白原L-氨基酸，是指一或多个选自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸，和任选地，L-硒半胱氨酸和L-吡咯赖氨酸的氨基酸(包括其盐)。所述L-氨基酸也包括L-高丝氨酸。特别优选的L-氨基酸是L-亮氨酸。
过表达通常是指与起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株(如果其为起始菌株的话)相比，核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性升高。起始菌株(亲本菌株)是指实施引起过表达措施的菌株。
在过表达中，优选重组过表达的方法。这包括使用体外提供的DNA分子产生微生物的所有方法。这样的DNA分子包括，例如，启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区等。这些经由转化、接合、转导或类似方法转变成期望的微生物。
能够通过测量由所述基因转录的mRNA的量、通过确定多肽的量、和通过确定酶活性证实表达或过表达的程度。
尤其可采用Northern印迹和定量RT-PCR的方法确定mRNA的量。在定量RT-PCR中，在聚合酶链式反应前先进行逆转录。为此目的，可使用例如Jungwirth等人(FEMS Microbiology Letters 281,190-197(2008))所描述的Roche Diagnostics的LightCyclerTM系统(Boehringer Mannheim GmbH,RocheMolecular Biochemicals,Mannheim,Germany)。可通过1-维和2-维蛋白质凝胶分离并随后使用相应评估软件在凝胶中光学鉴定蛋白质浓度来确定蛋白质的浓度。用于制备棒状细菌的蛋白质凝胶和鉴定蛋白质的常用方法是Hermann等(Electrophoresis,22:1712-23(2001))描述的过程。也可通过用特异于待测蛋白质的抗体的Western-blot杂交(Sambrook et al.,Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989)并随后用相应的确定浓度的软件光学评估(Lohaus andMeyer(1998)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,Angewandte Chemie 321:2630-2647(1999))来确定蛋白质浓度。采用T检验确定所得数据的统计学显著性(Gosset,Biometrika 6(1):1-25(1908))。
现有技术中，为实现过表达，可采用许多方法。除了修饰控制所述基因表达的核苷酸序列外，这些方法也包括增加拷贝数。
可通过在微生物细胞质内复制的质粒增加拷贝数。为此目的，现有技术中描述了用于大多数各种微生物群的大量质粒，使用所述质粒能够设定所述基因拷贝数的期望的增加。在例如Tauch等(Journal of Biotechnology104(1-3),27-40,(2003))、或Stansen等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 71,5920-5928(2005))中描述了适合于棒杆菌属的质粒。
通过插入更多拷贝至微生物染色体中，拷贝数也能够额外增加至少一(1)个拷贝。在例如专利文献WO 03/014330、WO 03/040373和WO 04/069996中描述了适合于棒杆菌属的方法。
基因表达也能够因多个启动子位于期望基因的上游或者启动子功能性地连接至所述待表达基因并且用这种方式实现表达增加而额外增加。专利文献WO 2006/069711中描述了这样的例子。
可以通过抑制转录的蛋白质(阻遏蛋白)或促进转录的蛋白质(激活蛋白)控制基因的转录。因此，为实现过表达，也可以增加激活蛋白的表达或降低阻遏蛋白的表达或者关闭其表达或者消除阻遏蛋白的结合位点。
延伸速率受密码子使用的影响；使用针对经常出现在起始菌株的转运(t)-RNA的密码子能够增强翻译。此外，在许多微生物中(77％在大肠杆菌)经常发生的起始密码子置换为密码子ATG能够显著增强翻译，因为在RNA水平，密码子AUG比例如密码子GUG和UUG有效2-3倍(Khudyakov et al.,FEBS Letters 232(2):369-71(1988)；Reddy et al.,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA 82(17):5656-60(1985))。而且，由于已有描述起始密码子与侧翼区域之间的相互影响(Stenstrom et al.,Gene273(2):259-65(2001)；Hui et al.,EMBO Journal 3(3):623-9(1984))，所以起始密码子的序列环境也能够被优化。
操作DNA、DNA消化和连接、转化和转化子筛选的操作指南尤其可在已知的Sambrook等的手册"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",SecondEdition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中找到。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体。
Kirchner和Tauch(Journal of Biotechnology 104:287-299(2003))描述了用于谷氨酸棒杆菌的载体的选择。
本发明进一步涉及本发明的微生物，其特征在于本发明的核苷酸序列整合进染色体。使用本发明的载体，同源重组使得染色体上的DNA片段置换为通过所述载体被转运至细胞内的本发明的多核苷酸。为了载体的环形DNA分子与染色体上的靶DNA之间的有效重组，包含本发明的多核苷酸的待置换DNA区域的末端具有与靶位点同源的核苷酸序列；这决定载体整合和DNA置换的位点。
例如，本发明的多核苷酸可以在染色体的天然基因位点置换天然leuA基因，或者整合在另一基因位点。
表达或过表达优选在棒杆菌属的微生物中进行。棒杆菌属内，优选基于如下种类的菌株：有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)，其中模式菌株保藏为DSM44549，谷氨酸棒杆菌，其中模式菌株保藏为ATCC13032，以及产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，其中模式菌株保藏为ATCC6871。非常特别优选谷氨酸棒杆菌。
谷氨酸棒杆菌种的一些成员在现有技术中也有其他名称。这包括例如菌株ATCC13870，其被称为嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)，菌株DSM20137，其被称为百合棒杆菌(Corynebacteriumlilium)，菌株ATCC17965，其被称为栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)，菌株ATCC14067，其被称为黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)，菌株ATCC13869，其被称为乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)，和菌株ATCC14020，其被称为扩展短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)。
谷氨酸棒杆菌也使用表述“谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)”。有效棒杆菌的一些成员在现有技术中也被称为嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，例如，菌株FERM BP-1539。
用于引入反馈抗性IPMS的措施的微生物或菌株(起始菌株)优选已经具有分泌KIC或L-亮氨酸至外周营养培养基并在其中累积的能力。对此步骤，在下文中也使用术语“产生”。特别地，用于过表达措施的菌株具有在细胞内或营养培养基中在(≤表示最多)≤120小时、≤96小时、≤48小时、≤36小时、≤24小时或者≤12小时内累积(≥表示至少)≥0.10g/l、0.25g/l、≥0.5g/l、≥1.0g/l、≥1.5g/l、≥2.0g/l、≥4g/l或者≥10g/l L-亮氨酸或KIC的能力。起始菌株优选是通过诱变和筛选、重组DNA技术或两种方法组合产生的菌株。
本领域技术人员能够理解也可以获得适合本发明的措施的微生物，其中在野生菌株中，例如在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032或者菌株ATCC 14067中，首先插入本发明SEQ ID NO:5的多核苷酸，接着通过现有技术中描述的其他遗传措施引起所述微生物产生期望的KIC或者L-亮氨酸。
这群细菌的菌株系统分类信息尤其可在Seiler(Journal of GeneralMicrobiology 129,1433-1477(1983))、Kinoshita(1985,Glutamic AcidBacteria,p.115-142.In:Demain and Solomon(ed),Biology of IndustrialMicroorganisms.The Benjamin/Cummins Publishing Co.,London,UK),和Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42,989-1005(1996))、Liebl等(International Journal of Systematic Bacteriology 41,255-260(1991))和US5,250,434A中找到。
具有“ATCC”名称的菌株可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)获得。具有“DSM”名称的菌株可从德国微生物保藏中心(DSMZ,Brunswick,Germany)获得。具有“NRRL”名称的菌株可从美国北方农业研究所培养物保藏中心(ARS,Peoria,Illinois,US)获得。具有“FERM”名称的菌株可从日本高级工业科学技术研究所(AIST Tsukuba Central 6,1-1-1Higashi,Tsukuba Ibaraki,Japan)获得。
分泌或产生KIC的菌株基于例如：
谷氨酸棒杆菌，菌株ATCC13032，
黄色短杆菌，菌株ATCC 14067和
乳发酵短杆菌，菌株ATCC 13869。
另外，与产生酮异己酸联合，优选以下核苷酸序列的一个或多个基因(过)表达，所述核苷酸序列编码生物合成酮异己酸的酶，选自：
a)编码乙酰乳酸合酶(IlvBN,EC No.:4.1.3.18)亚基的多核苷酸(ilvB基因和ilvN基因)
b)编码异构还原酶(IlvC,EC No.:1.1.1.86)的多核苷酸(ilvC基因)
c)编码二羟基酸脱水酶(IlvD,EC No.:4.2.1.9)的多核苷酸(ilvD基因)
d)编码转氨酶(IlvE,EC No.:2.6.1.42)的多核苷酸(ilvE基因)
e)编码异丙基苹果酸合成酶(LeuA,EC No.:2.3.3.13)的多核苷酸(leuA基因)
f)编码异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB,EC No.:1.1.1.85)的多核苷酸(leuB基因)
g)编码异丙基苹果酸异构酶(LeuC,EC No.:4.2.1.33)大亚基的多核苷酸(leuC基因)
h)编码异丙基苹果酸异构酶(LeuD,EC No.:4.2.1.33)小亚基的多核苷酸(leuD基因)
其中特别优选用于α-酮异己酸(KIC)的ilvBN、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC和leuD基因。
本发明提供一种产生KIC或L-亮氨酸的微生物，其中所述微生物由于使用本发明SEQ ID NO:5的多核苷酸而具有反馈抗性α-异丙基苹果酸合酶。
用于生产精细化学品KIC或L-亮氨酸的发酵方法包括如下步骤：
a)在培养基中发酵权利要求7至12任一项的微生物的一种，
b)在培养基中累积KIC或L-亮氨酸，其中获得发酵液。在这种情况下，优选从所述含有精细化学品的发酵液中获得所述精细化学品或含有液体或固体精细化学品的产物。
如关于酮异己酸生产的实施例4所示或关于L亮氨酸生产的实施例5所示，使用本发明的方法比各个起始菌株在产量上有显著增加(实施例4，KIC：0.027g/g vs.0.012g/g；实施例5，亮氨酸：0.041g/g vs.0.002g/g)。
此外，特别优选本发明的微生物生产KIC或L-亮氨酸，更优选分泌KIC或L-亮氨酸至培养基中。为了产生期望的有机化合物，产生的微生物可以连续培养(例如WO05/021772中所述)或者以分批方法(分批培养或分批方法)或补料分批或重复补料分批方法不连续培养。在Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[生物技术进展1.生物工程介绍](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[生物反应器及外围设备](ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中有已知培养方法常规类型的总结。
要使用的培养培养基或发酵培养基必须恰当满足各菌株的需求。在美国细菌学会的手册"Manual of Methods for General Bacteriology"(WashingtonD.C.,USA,1981)中包含各种微生物的培养基的描述。术语培养培养基和发酵培养基或培养基是相互可换的。
至于碳源，可使用糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖浆、来自甜菜糖或甘蔗加工的含蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素，油类和脂肪，例如豆油、葵花油、花生油和椰子脂，脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类，例如甘油、甲醇和乙醇，以及有机酸类，例如乙酸或乳酸。
对于氮源，可使用有机氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或作为混合物使用。
对于磷源，可使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
此外，培养基必须含有盐，例如以金属如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物或硫酸盐形式，例如硫酸镁或硫酸铁，其是生长必须的。最后，除了上述物质外，可使用生长必需物质例如氨基酸，例如激素和维生素，例如硫胺素、生物素或泛酸。
所述原料可以以单批形式添加到培养物中，或在培养过程中以合适的形式供给。
以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物，例如磷酸或硫酸，控制培养物的pH。所述pH通常调节到6.0至8.5，优选6.5至8。为了控制泡沫形成，可使用止泡剂，例如脂肪酸的聚甘油酯。为了保持质粒的稳定性，可向培养基中加入合适的选择性作用物质，例如抗生素。优选在需氧条件下进行发酵。为了维持所述需氧条件，将氧气或含氧气体混合物例如空气引入培养物。也可以使用富含过氧化氢的液体。任选地，所述发酵在超大气压下进行，例如在0.03至0.2MPa超大气压下。培养的温度通常为20℃至45℃，优选25℃至40℃，特别优选30℃至37℃。在分批或补料分批方法的情况下，优选培养持续直到形成足够用于测量获得的希望的有机化合物的量。通常在10小时至160小时内达到这个目标。在连续方法中，培养时间可能更长。由于所述微生物的活性，所述精细化学品在发酵培养基和/或微生物细胞内出现富集(累积)。
可在专利文献US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275,940、WO2007/012078、US 5,827,698、WO 2009/043803、US 5,756,345或US 7,138,266中找到合适的发酵培养基的例子；任选地，针对所用菌株的需要进行适当修改。
通过离子交换层析优选阳离子交换层析分离L-氨基酸，随后使用茚三酮柱后衍生(如Spackman等所述(Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958))所述)，可以分析L-氨基酸以确定其在发酵过程中的一个或多个时间点的浓度。除了茚三酮，正邻苯二醛也可用于柱后衍生。可在Pickering(LC·GC(Magazine of Chromatographic Science)7(6),484-487(1989))找到离子交换层析的综述文章。
也可以进行柱前衍生，例如使用正邻苯二醛或异硫氰酸苯酯，并通过反相层析(RP)优选高效液相层析(HPLC)的形式分离所得到的氨基酸衍生物。例如，在Lindroth等(Analytical Chemistry 51:11671174(1979))中描述了这种方法。
进行光度(吸收，荧光)检测。
可尤其在Lottspeich和Zorbas的教科书"Bioanalytik"[生物分析]by(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)中找到关于氨基酸分析的综述。
通过离子交换层析优选阳离子交换层析，在H+形式的例如使用0.025N硫酸磺化的苯乙烯二乙烯苯聚合物上分离酮酸和其他分泌产物，随后在215nm处(或者也可在230或275nm)UV检测，可以分析α-酮酸例如KIC以确定其在发酵过程中的一个或多个时间点的浓度。优选地，可使用REZEXRFQ–Fast Fruit H+柱(Phenomenex)；分离相的其他供应商(例如BioRad的Aminex)也可以。在供应商的相应使用实例中描述了类似分离。
基于用存在本发明的启动子变体的微生物的方法或发酵方法，在选自浓度(每体积形成的化合物)、产量(每碳源消耗形成的化合物)、形成(每体积和时间形成的化合物)和特定形成(每细胞干重量或生物干重量和时间形成的化合物或每细胞蛋白质和时间形成的化合物)或其他方法参数和其组合的一个或多个参数方面，本发明的方法或发酵方法的效能提高至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％。
由于发酵的措施，获得含有期望的精细化学品优选氨基酸或有机酸的发酵液。
接着，提供或生产或获得含有所述精细化学品的液体或固体形式的产物。
在一个优选实施方案中，发酵液是指发酵培养基或营养培养基，其中微生物在一定温度下培养一定时间。在发酵中使用的发酵培养基或培养基，包含确保产生期望的化合物，通常确保生长和/或生存能力的所有物质或成分。
当发酵完成，得到的发酵液相应包含
a)源于所述微生物的细胞生长的微生物的生物量(细胞物质)，
b)发酵过程中形成的期望的精细化学品，
c)发酵过程中可能形成的有机副产物，和
d)没有被发酵消耗的使用的发酵培养基或原材料的成分，例如维生素，例如生物素，或盐，例如硫酸镁。
有机副产物包括由在发酵中使用的微生物生成并可能被分泌的除了各种期望的化合物之外的物质。
从培养瓶或发酵容器收回发酵液，任选地收集发酵液，并用于提供含有所述精细化学品的液体或固体形式的产物。因此也使用表述“获得含有所述精细化学品的产物”。在最简单的情况下，从发酵容器收回的含有所述精细化学品的发酵液是获得的产物本身。
通过选自如下的一种或多种措施实现期望的有机化合物从发酵液中浓缩或纯化：
a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或实质上完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除水份，
b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或实质上完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除生物量，其中所述生物量任选地在去除前被失活，
c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或实质上完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除在发酵过程中形成的有机副产物，和
d)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或实质上完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除未被发酵消耗的所用发酵培养基或原材料的成分。
以这种方式，分离具有期望含量的化合物的产物。
部分(>0％至<80％)至完全(100％)或实质上完全(≥80％至<100％)去除水份(措施a))也称为干燥。
在所述方法的一种变形中，通过完全或实质上完全去除水、生物量、有机副产物和所用发酵培养基的未消耗成分，成功获得纯的(按重量计≥80％，按重量计≥90％)或高纯度(按重量计≥95％，按重量计≥97％，按重量计≥99％)产物形式的期望的有机化合物，优选L-氨基酸。对于a)、b)、c)或d)的措施，现有技术中有大量的技术指南。
在使用棒杆菌属细菌生产KIC或L-亮氨酸的方法的情况中，优选获得不含发酵液任何成分的产物的方法。特别地，这些产物用于人类医学、制药产业，和食品产业。
本发明的方法用于发酵生产KIC或L-亮氨酸。
本发明最后涉及本发明的微生物用于发酵生产KIC或L-亮氨酸的应用。
下文将参考示例性实施方案更详细描述本发明。
实施例1
产生置换载体pK18mobsacB_leuA_Y553D
在GeneArt(Life Technologies GmbH,Darmstadt,Germany)合成812bp长的置换构建体(见SEQ ID NO:7)。该片段包含野生型leuA基因的最后594bp(C末端)至ATCC13032的leuA基因下游区域206bp，还有用于克隆进pK18mobsacB载体所需的SphI和BamHI两个切割位点。在该置换片段195位，leuA基因3’末端上游，碱基T突变为碱基G－这将野生型密码子TAC(编码氨基酸Y，酪氨酸)变为密码子GAC(编码氨基酸D，天冬酰胺)。在GeneArt公司将所述片段克隆进入pK18mobsacB载体。GeneArt交付所得置换载体pK18mobsacB_leuA_Y553D，并用于产生实施例菌株(见实施例3)。
实施例2
产生谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032_DilvE
通过电穿孔用质粒pK19mobsacB_DilvE转化谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032(Marienhagen et al.,Journal of Bacteriology 187:7639–7646(2005))。根据Haynes等的方法(FEMS Microbiology Letters 61:329-334(1989))进行电穿孔。
质粒pK18mobsacB或pK18mobsacB_DilvE不能在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中独立复制，仅在其被整合进染色体(作为重组事件的结果)后才能保留在细胞内。通过将电穿孔批次在添加了15mg/l卡那霉素的LB琼脂上铺板，筛选具有整合了pK18mobsacB_DilvE的克隆(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Habor,NewYork,1989)。生长的克隆在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上划线，并在33℃孵育16小时。为了筛选其中的质粒已被切除的突变体(作为第二次重组事件的结果)，克隆在LB液体培养基(+5g/l乙酸钾)中非选择性地培养20小时，接着在含有10％蔗糖的LB琼脂上划线，并孵育24小时。
除了卡那霉素抗性基因外，与起始质粒pK18mobsacB一样，质粒pK18mobsacB_DilvE还含有编码来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶sacB基因的拷贝。蔗糖诱导表达导致形成果聚糖蔗糖酶，其催化果聚糖的合成，果聚糖对谷氨酸棒杆菌是毒性产物。因此在有蔗糖的LB琼脂(含有5g/l乙酸钾)上，只有那些其中整合的pK18mobsacB被再次切除了的克隆生长。在切除中，与质粒一起，ilvE的完整的染色体拷贝或者内部带有缺失ilvE的不完整拷贝可被切除。
测试了大约40至50个菌落的表型“在有蔗糖时生长”和“在有卡那霉素时不生长”。为了检测缺失的ilvE等位基因保留在了染色体中，按照Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications,1990,Academic Press)使用聚合酶链式反应研究了大约20个具有表型“在有蔗糖时生长”和“在有卡那霉素时不生长”的菌落。在这种情况中，从菌落的染色体DNA扩增一段DNA片段，其携带缺失的ilvE区域的周围区域。选择如下引物寡核苷酸用于PCR：
ilvE-XbaI-fw 5′-gctctagagccaagcctagccattcctcaa-3′
ilvE-XbaI-rev 5′-gctctagagccagccactgcattctcctta-3′
所述引物能够在具有完整ilvE基因座的对照克隆中扩增大约1.4kb大小的DNA片段。在具有缺失的argFRGH基因座的克隆中扩增大约0.6kb大小的DNA片段。
在0.8％强度琼脂糖凝胶中电泳鉴定扩增的DNA片段。从而能够显示菌株在染色体上携带缺失的ilvE等位基因。所述菌株命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE，在生产测试中(见实施例4)研究其产生异己酸的能力。
实施例3
产生谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE_leuAY553D和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_leuAY553D菌株
用实施例1的质粒pK18mobsacB_leuA_Y553D电穿孔转化实施例2的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032和谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032_DilvE。实施例2中详细描述了该方法。
通过对多个具有表型“在有蔗糖时生长”和“在有卡那霉素时不生长”的候选克隆测序，证实密码子GAC(在553位编码天冬酰胺)置换了野生型密码子TAC(在553位编码酪氨酸)。为此目的，首先制备具有如下引物的leuA-1PCR片段(767bp长)：
leuA1(5′-GATCTATCTAGATTGAGGGCCTTGGGCATACG-3′)和
leuA-2(5`-GATCTAGGATCCGCGACTACGAGGCTGTTATC-3′)，用引物
leuA-3(5′-GATCTATCTAGAAAGCTTAAACGCCGCCAGCC-3′)测序。
选择阳性候选克隆并在随后生产性能测验(实施例4和5)中测定。
实施例4
用谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE_leuAY553D生产酮异己酸
为了研究其产生酮异己酸的能力，每种情况下，在10ml测试培养基中于33℃预培养谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE_leuAY553D，16h。对于产生测试，用所得预培养物接种每10ml测试培养基，使得起始OD600(600nm处光密度)为0.1。每个克隆在三个摇瓶中测定，这样每个菌株由总共九个摇瓶代表。测试培养基与Keilhauer等人描述的CgXII培养基(Journal of Bacteriology(1993)175:5593-5603)相同，但是每种情况中额外含有200mg/l氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸。为了简单起见，所述测试培养基的构成总结于如下表1。
表1：在每种情况中添加了200mg/l氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的CgXII培养基的构成
成分 每升含量
(NH4)2SO4 20g
尿素 5g
KH2PO4 1g
K2HPO4 1g
MgSO4·7H2O 0.25g
3-吗啉基丙磺酸(MOPS) 42g
CaCl2 0.01g
FeSO4·7H2O 0.01g
MnSO4·H2O 0.01g
ZnSO4·7H2O 0.001g
CuSO4 0.0002g
NiCl2·6H2O 0.00002g
生物素 0.0002g
原儿茶酸 0.03g
葡萄糖 40g
L-缬氨酸 0.2g
L-异亮氨酸 0.2g
L-亮氨酸 0.2g
pH(用NaOH) 7
在100ml摇瓶中于33℃，200rpm进行培养。摇床振幅为5cm。24小时后，从培养物取样，测定光密度。随后，简单离心细胞(台式离心机型号5415D(Eppendorf)，13000rpm，10min，室温)，测定上清中的葡萄糖和酮异己酸的含量。
使用GENios微量板光度计(Tecan,Reading UK)测定660nm波长处的光密度。测定前用脱盐水1：100稀释样品。通过阳离子交换层析(REZEX RFQ–Fast Fruit H+column(Phenomenex))在H+形式的使用0.025N硫酸磺化的苯乙烯二乙烯苯聚合物上分离酮酸和其他分泌产物，随后在215nm处UV检测，分析并确定KIC的浓度。
形成的KIC量除以消耗的右旋糖的量用于计算KIC产量。
酮异己酸形成的摇瓶试验结果显示于表2.
表2：孵育24小时后酮异己酸的形成。缩略语：KIC＝酮异己酸
实施例5
用谷氨酸棒杆菌ATCC13032和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_leuAY553D生产L-亮氨酸
为了研究其产生亮氨酸的能力，每种情况中，在10ml测试培养基中于33℃预培养谷氨酸棒杆菌ATCC13032和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE_leuAY553D 16小时。以类似实施例4的方式进行产生测试，除了该测试的测试培养基的调整，其不添加亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。所述测试培养基与Keilhauer等所描述的CgXII培养基(Journal ofBacteriology(1993)175:5593-5603)相同。
使用GENios微量板光度计(Tecan,Reading UK)确定660nm波长处的光密度。测定前用脱盐水1：100稀释样品。使用来自Eppendorf-BioTronik(Hamburg,Germany)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和茚三酮柱后衍生检测，确定形成的亮氨酸的量。
在表3，总结了从摇瓶试验获得的关于亮氨酸形成的性能数据。
形成的亮氨酸量除以消耗的右旋糖的量用于计算亮氨酸产量。
表3：孵育24小时后的亮氨酸形成。
图1：质粒pK18mobsacB_leuA_Y553D图谱
使用的缩略语和名称具有如下含义。
oriV:     来自pMB1的ColE1-样起点
sacB:      编码蛋白质果聚糖蔗糖酶的sacB基因
RP4-mob:    RP4迁移位点
Kan:        卡那霉素抗性基因
leuA-3′:    leuA基因的594bp(C末端)

Claims (16)

1.分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％相同，其中SEQ ID NO:2在553位或在所述氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸。
2.权利要求1的核苷酸序列，其中其编码的所述氨基酸序列在553位或相应位置具有选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸，特别优选选自谷氨酸和天冬氨酸。
3.权利要求2的核苷酸序列，其中其编码的所述氨基酸序列在第553位或相应位置具有L-天冬氨酸。
4.权利要求2或3的核苷酸序列，其在1657位或相应位置具有鸟嘌呤，如SEQ ID NO:5所示。
5.载体，其包含权利要求1-3任一项的核苷酸序列，并且任选地适合于在棒杆菌属的微生物中复制。
6.多肽，其包含权利要求1-5任一项的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
7.棒杆菌属微生物，其包含权利要求1-6任一项的核苷酸序列或多肽或权利要求5的载体。
8.权利要求7的微生物，其中权利要求1-5任一项的核苷酸序列以过表达形式存在。
9.权利要求7或8的微生物，特征在于所述核苷酸序列整合进染色体。
10.权利要求7-9任一项的微生物，特征在于其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
11.权利要求7-10任一项的微生物，特征在于所述微生物具有产生精细化学品的能力。
12.权利要求11的微生物，特征在于所述精细化学品是L-亮氨酸或KIC。
13.产生KIC或L-亮氨酸的发酵方法，包括如下步骤：
a)在培养基中发酵权利要求7-12任一项的微生物的一种，
b)在所述培养基中累积所述KIC或L-亮氨酸，其中获得发酵液。
14.权利要求13的方法，特征在于其是选自分批方法、补料分批方法、重复补料分批方法和连续方法的方法。
15.权利要求13或14的方法，特征在于从所述含有精细化学品的发酵液获得所述精细化学品或含有液体或固体精细化学品的产物。
16.权利要求7-12任一项的微生物发酵产生L-亮氨酸或KIC的应用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108884449A (zh) * 2016-12-28 2018-11-23 Cj第制糖株式会社 新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产l-亮氨酸的方法
CN109790554A (zh) * 2016-09-30 2019-05-21 陶氏环球技术有限责任公司 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法
CN110540976A (zh) * 2019-08-29 2019-12-06 天津科技大学 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用
CN113227381A (zh) * 2018-12-13 2021-08-06 大象株式会社 L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法
CN113683666A (zh) * 2021-08-23 2021-11-23 黑龙江伊品生物科技有限公司 Yh66-rs07020基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用
CN115335515A (zh) * 2021-04-07 2022-11-11 Cj第一制糖株式会社 新2-异丙基苹果酸合酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
US11866737B2 (en) 2019-08-29 2024-01-09 Tianjin University Of Science And Technology 2-isopropylmalate synthetase and engineering bacteria and application thereof

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2811028T3 (en) 2013-06-03 2017-05-01 Evonik Degussa Gmbh Process for Preparation of L-Valine Using Recombinant Coryn Bacteria Containing the Propionate Inducible IlvBN Operon
KR102360900B1 (ko) * 2020-05-20 2022-02-09 씨제이제일제당 (주) 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
KR102527102B1 (ko) * 2021-03-05 2023-04-28 씨제이제일제당 주식회사 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
JP2024075803A (ja) * 2021-03-29 2024-06-05 ＧｒｅｅｎＥａｒｔｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ株式会社 改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3865690A (en) * 1969-11-06 1975-02-11 Ajinomoto Kk Fermentative production of L-leucine

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS579796B2 (zh) * 1974-03-15 1982-02-23
US5250434A (en) 1987-03-27 1993-10-05 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms for production of glutamic acid
US5976843A (en) 1992-04-22 1999-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
JP3023615B2 (ja) 1990-08-30 2000-03-21 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法
DE4130867A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Degussa Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeuren
SK283478B6 (sk) 1994-12-09 2003-08-05 Ajinomoto Co., Inc. Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu
GB2304718B (en) 1995-09-05 2000-01-19 Degussa The production of tryptophan by the bacterium escherichia coli
US5990350A (en) 1997-12-16 1999-11-23 Archer Midland Company Process for making granular L-lysine
RU2201454C2 (ru) * 1999-07-09 2003-03-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная альфа-изопропилмалат синтаза (ipms), днк, кодирующая мутантную ipms, способ получения штамма escherichia coli, способ получения l-лейцина
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
BR0211723A (pt) 2001-08-06 2004-09-21 Degussa Bactérias corineformes que produzem compostos quìmicos i
US7160711B2 (en) 2001-08-06 2007-01-09 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
ATE409752T1 (de) 2001-08-06 2008-10-15 Evonik Degussa Gmbh Coryneforme bakterien, die chemische substanzen bilden ii
WO2005021772A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Degussa Ag Process for the preparation of l-lysine
DE102004061846A1 (de) 2004-12-22 2006-07-13 Basf Ag Mehrfachpromotoren
EP1907559A1 (en) 2005-07-18 2008-04-09 Basf Se Methionine producing recombinant microorganisms
EP1860193A1 (en) 2006-05-22 2007-11-28 Evonik Degussa GmbH Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production
PL389665A1 (pl) * 2007-02-09 2010-07-05 The Regents of the University of CaliforniaThe Regents of the University of California Wytwarzanie biopaliwa przez rekombinowane mikroorganizmy
WO2009043372A1 (en) 2007-10-02 2009-04-09 Metabolic Explorer Increasing methionine yield
WO2010139527A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Evonik Degussa Gmbh A method for the preparation of 2-keto carboxylic acid

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3865690A (en) * 1969-11-06 1975-02-11 Ajinomoto Kk Fermentative production of L-leucine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AZUMA T ET AL: "Enzymatic background for the reversion or stabilizatio of an L-leucine producing strain of Corynebacterim glutamicum.", 《AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY,JAPAN SOC.FOR BIOSCIENCE,BIOTECHNOLOGY AND AGROCHEM,TOKYO,JP》 *
PATEK,M.,ET AL,: "C.glutamicum gene leuA for isopropylmalate synthase, GenBank.X70959.1", 《NCBI》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109790554A (zh) * 2016-09-30 2019-05-21 陶氏环球技术有限责任公司 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法
CN109790554B (zh) * 2016-09-30 2023-06-16 陶氏环球技术有限责任公司 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法
CN108884449A (zh) * 2016-12-28 2018-11-23 Cj第制糖株式会社 新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产l-亮氨酸的方法
CN114085800A (zh) * 2016-12-28 2022-02-25 Cj第一制糖株式会社 新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产l-亮氨酸的方法
CN113227381A (zh) * 2018-12-13 2021-08-06 大象株式会社 L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法
CN113227381B (zh) * 2018-12-13 2024-05-24 大象株式会社 L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法
CN110540976A (zh) * 2019-08-29 2019-12-06 天津科技大学 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用
US11866737B2 (en) 2019-08-29 2024-01-09 Tianjin University Of Science And Technology 2-isopropylmalate synthetase and engineering bacteria and application thereof
CN115335515A (zh) * 2021-04-07 2022-11-11 Cj第一制糖株式会社 新2-异丙基苹果酸合酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN115335515B (zh) * 2021-04-07 2023-08-11 Cj第一制糖株式会社 新2-异丙基苹果酸合酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN113683666A (zh) * 2021-08-23 2021-11-23 黑龙江伊品生物科技有限公司 Yh66-rs07020基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用

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