BR112013025624B1 - Microrganismo da espécie corynebacterium glutamicum que produz e/ou secreta um composto orgânico-químico e método para a sua produção fermentativa - Google Patents

Abstract

micro-organismo e processos para produção fermentativa de composto orgânico-químico. a presente invenção refere-se a um micro-organismo que produz e/ou secreta um composto orgânico-químico, em que o micro-organismo aumentou a expressão, em comparação à cepa de partida particular, de uma ou mais subunidades da proteína do transportador de abc que tem a atividade de um importador de trealose, em que o dito micro-organismo tem a capacidade de absorver trealose do meio; e a um método para a produção de um composto orgânico-químico, ao usar o micro-organismo de acordo com a invenção, em que a acumulação de trealose no caldo de fermentação é reduzida ou evitada.

Description

MICRORGANISMO DA ESPÉCIE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM QUE PRODUZ E/OU SECRETA UM COMPOSTO ORGÂNICO-QUÍMICO E MÉTODO PARA A SUA PRODUÇÃO FERMENTATIVA

[0001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo que produz e/ou secreta um composto orgânico-químico, em que o dito micro-organismo aumenta a expressão de um importador de trealose, e a um método de produção de um composto orgânico-químico ao usar o micro-organismo de acordo com a invenção.

Técnica Anterior

[0002] Os L-aminoácidos são usados na medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria de alimentos e muito particularmente na nutrição animal.

[0003] É sabido que os L-aminoácidos tais como, por exemplo, a Llisina, são produzidos pela fermentação de cepas de bactérias corineformes, em particular Corynebacterium glutamicum, ou de cepas da família Enterobacteriaceae, em particular a Escherichia coli. Por causa da grande importância econômica, um trabalho vem sendo feito continuamente no sentido de melhorar os métodos de produção. As melhorias do método podem se relacionar às medidas da tecnologia de fermentação tais como, por exemplo, a agitação e o suprimento de oxigênio, ou à composição dos meios nutrientes, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou a elaboração até formar o produto, por exemplo, por meio de cromatografia de troca de íons ou as propriedades de desempenho intrínseco do próprio microorganismo.

[0004] Os métodos usados para melhorar as propriedades de desempenho desses micro-organismos são aqueles de mutagênese, seleção e escolha de mutantes. As cepas obtidas desta maneira são resistentes aos antimetabólitos ou são auxotróficas para os metabólitos de importância reguladora, e produzem L-aminoácidos. Um antimetabólito conhecido é a (aminoetil)-L-cisteína análoga de lisina (AEC).

[0005] Os métodos da tecnologia de DNA recombinante foram analogamente usados por alguns anos para a melhoria da cepa de cepas produtoras de L-aminoácido do gênero Corynebacterium, em particular Corynebacterium glutamicum, ou do gênero Escherichia, em particular Escherichia coli, ao modificar, ou seja, ao realçar ou atenuar genes da biossíntese de aminoácidos individuais e ao investigar o efeito na produção de aminoácidos.

[0006] As sequências de nucleotídeo dos cromossomas de numerosas bactérias foram apresentadas.

[0007] A sequência de nucleotídeo do genoma ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum é descrita em Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), na patente EP 1 108 790 e em Kalinowski et al. (Journal of Biotechnolgy 104(1-3), (2003)).

[0008] A sequência de nucleotídeo do genoma R de Corynebacterium glutamicum é descrita em Yukawa et al. (Microbiology 153(4):1042-1058 (2007)).

[0009] A sequência de nucleotídeo da genoma de Corynebacterium efficiens é descrita em Nishio et al (Genome Research. 13 (7), 1572- 1579 (2003)).

[00010] A sequência de nucleotídeo do genoma NCTC 13129 de Corynebacterium diphteriae foi descrita por Cerdeno-Tarraga et al. (Nucleic Acids Research 31 (22), 6516-6523 (2003)).

[00011] A sequência de nucleotídeo do genoma de Corynebacterium jeikeum foi descrita por Tauch et al. (Journal of Bacteriology 187 (13), 4671-4682 (2005)).

[00012] Uma revisão de vários aspectos da produção fermentativa de L-aminoácidos pode ser encontrada em R. Faurie e J. Thommel em Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, volume 79 (Springer-Verlag, Berlim, Heidelberg (Germany) 2003).

[00013] Quantidades significativas de trealose secretada são encontradas no sobrenadante de fermentações industriais de C. glutamicum. Essa trealose externamente acumulada não é reciclada metabolicamente pelas células. A dita trealose externamente acumulada representa, portanto, uma perda significativa em fermentações industriais, tanto no que diz respeito à formação máxima que pode ser obtida do produto e no que diz respeito à concentração de biomassa atingida no fermentador.

[00014] O uso de trealose externamente acumulada é o objetivo principal desejado. A concretização desse objetivo teria uma pluralidade de consequências positivas possíveis: (1) a utilização de carbono de substrato que de outro modo permanece não utilizado no final da fermentação, (2) o aumento na biomassa que pode ser obtida na fermentação, (3) o aumento no rendimento do produto em processos de produção biotecnológica, por exemplo, em uma produção de aminoácidos, (4) a prevenção de contaminação indesejada no sobrenadante do produto no final da fermentação.

[00015] Portanto, um objetivo da presente invenção consiste na provisão de micro-organismos aperfeiçoados e métodos para a produção fermentativa de um composto orgânico-químico.

[00016] A presente invenção apresenta um micro-organismo que produz e/ou secreta um composto orgânico-químico, em que o microorganismo tem uma expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de uma ou mais subunidades de proteína do transportador do ABC que tem a atividade de um importador de trealose, em que o dito micro-organismo tem a capacidade de absorver a trealose do meio.

[00017] A invenção também apresenta um método para a produção fermentativa de um composto orgânico-químico, o qual compreende as etapas de:

• a) cultura do micro-organismo descrito acima de acordo com a presente invenção em um meio apropriado, resultando um caldo de fermentação, e
• b) acumulação do composto orgânico-químico no caldo de fermentação de a);

em que a acumulação de trealose no caldo de fermentação é reduzida ou evitada. A preferência é dada aqui à redução da dita acumulação de trealose no caldo de fermentação em 50% ou mais, em 70% ou mais, em 80% ou mais, em 90% ou mais, em 95% ou mais, em 98% ou mais, em 99% ou mais, e com mais preferência em 99,5% ou mais, em comparação à cepa de partida particular do micro-organismo.

[00018] A presente invenção é vantajosa, uma vez que (1) o carbono de substrato na forma de trealose que de outro modo permanece não utilizado no caldo de fermentação no final da fermentação é utilizado; (2) a biomassa que pode ser obtida na fermentação é aumentada; (3) o rendimento do produto nos processos de produção biotecnológica, por exemplo, a produção de aminoácidos, é aumentado, e (4) a contaminação indesejada no sobrenadante do produto no final da fermentação é evitada.

[00019] Surpreendentemente, um sistema de absorção de trealose foi identificado em C. glutamicum. A expressão realçada de todos os genes do operon que codifica o sistema de importação de trealose resultou em um aumento no produto-alvo (o composto orgânico-químico) com o uso de uma cepa do produtor correspondente. Surpreendentemente, uma absorção correspondente de trealose também foi encontrada quando somente uma das subunidades (por exemplo, a subunidade de permease) é expressa. A presente invenção apresenta desse modo microorganismos (cepas do produtor) cujas células absorvem a trealose externamente acumulada através de um sistema de transporte ativo na membrana do plasma. O fato que a C. glutamicum tem a capacidade metabólica de metabolizar a trealose no citoplasma acarreta as vantagens acima da presente invenção. De preferência, o micro-organismo tem a capacidade de reduzir, em comparação à cepa de partida particular do dito micro-organismo, ou, em particular, de evitar, a acumulação de trealose no meio (meio de cultura).

[00020] Em uma modalidade preferida do micro-organismo, o transportador de ABC, que tem a atividade de um importador de trealose, é derivado de Corynebacterium glutamicum.

[00021] As subunidades da proteína do transportador do ABC que têm a atividade de um importador de trealose são tal como segue: proteína de membrana integral (permease), proteína de ligação e hidrolização de ATP (ATPase) e proteína de ligação de substrato periplásmica (ou lipoproteína). A composição de um transportador de ABC é tal como segue: duas permeases, duas ATPases e uma proteína de ligação de substrato periplásmica (ou lipoproteína). As duas permeases e as ATPases podem em cada caso ter sequências de aminoácidos diferentes.

[00022] Uma modalidade preferida do micro-organismo de acordo com a presente invenção tem uma expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de todas as subunidades de proteína do transportador de ABC que têm a atividade de um importador de trealose. Isto significa que, de preferência, a permease, a ATPase e a subunidade periplásmica do transportador de ABC que têm a atividade de um importador de trealose têm uma expressão aumentada, isto é, elas são superexpressas.

[00023] Em uma modalidade alternativa, o micro-organismo de acordo com a presente invenção tem uma expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de uma ou mais subunidades de proteína do transportador de ABC que têm a atividade de um importador de trealose. Além disso, um gene de codificação de operon para as subunidades do transportador de ABC que têm a atividade de um importador de trealose, que (gene) não codificam necessariamente para uma subunidade do próprio transportador de ABC, pode ter uma expressão aumentada.

[00024] A preferência também é dada ao micro-organismo que tem, em comparação à cepa de partida particular, uma expressão aumentada de pelo menos um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em a) a f):
a) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 2 ou 14;
b) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 4 ou 16;
c) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 6 ou 18;
d) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 8 ou 20;
e) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 10 ou 22;
f) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 12 ou 24. A preferência também é dada ao micro-organismo que tem, em comparação à cepa de partida particular, uma expressão aumentada de pelo menos um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em a), b), d), e):
a) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 2 ou 14;
b) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 4 ou 16;
d) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 8 ou 20;
e) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 10 ou 22.

[00025] Em uma outra modalidade preferida, o micro-organismo tem, em comparação à cepa de partida particular, uma expressão aumentada de pelo menos um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em b), d) e e):
b) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 4 ou 16;
d) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 8 ou 20;
e) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 10 ou 22.

[00026] Particularmente de preferência, o micro-organismo tem, em comparação à cepa de partida particular, uma expressão aumentada dos seguintes polinucleotídeos:
d) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 8 ou 20; e/ou
e) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 10 ou 22.

[00027] Em uma outra modalidade preferida, o micro-organismo tem, em comparação à cepa de partida particular, uma expressão aumentada dos polinucleotídeos a) e b):
a) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 2 ou 14;
b) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 4 ou 16;
e dos polinucleotídeos d) e/ou e)
d) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 8 ou 20;
e) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 10 ou 22.

[00028] A preferência também é dada ao micro-organismo que tem, em comparação à cepa de partida particular, uma expressão aumentada dos polinucleotídeos a), b) c), d) e e), e, onde apropriado, f).

[00029] Um composto orgânico-químico, para as finalidades da invenção, refere-se a uma vitamina tal como, por exemplo, tiamina (vitamina B1), riboflavina (vitamina B2), cianocobalamina (vitamina B12), ácido fólico (vitamina M), tocoferol (vitamina E) ou ácido nicotínico/nicotinamida, um nucleosídeo ou um nucleotídeo tal como, por exemplo, S-adenosil-metionina, ácido inosina 5'-monofosfórico e ácido guanosina 5'-monofosfórico, L-aminoácidos, ou ainda uma amina tal como o cadaverina, por exemplo. A preferência é dada à produção de L-aminoácidos e dos produtos que contêm os mesmos.

[00030] O composto orgânico-químico produzido e/ou secretado pelo micro-organismo de acordo com a invenção é selecionado de preferência do grupo que consiste em vitamina, nucleosídeo ou nucleotídeo, L-aminoácidos e amina.

[00031] O termo L-aminoácidos inclui os aminoácidos proteinogênicos e também L-ornitina e L-homoserina. Os L-aminoácidos proteinogênicos devem ser compreendidos como se referindo aos L-aminoácidos presentes em proteínas naturais, ou seja, nas proteínas de micro-organismos, plantas, animais e seres humanos. Os aminoácidos proteinogênicos compreendem o ácido L-aspártico, a L-asparagina, a L-treonina, a L-serina, o ácido L-glutâmico, a L-glutamina, a L-glicina, a L-alanina, a L-cisteína, a L-valina, a L-metionina, a L-isoleucina, a L-leucina, a L-tirosina, a L-fenilalanina, a L-histidina, a L-lisina, o L-triptofano, a L-arginina, a L-prolina e em alguns casos a L-selenocisteína e a L-pirrolisina.

[00032] O composto orgânico-químico é selecionado particularmente de preferência do grupo que consiste em L-aminoácidos proteinogênicos, L-ornitina e L-homoserina. A preferência particular é dada ao L-aminoácido proteinogênico que é selecionado do grupo que consiste em L-lisina, L-metionina, L-valina, L-prolina, L-glutamato e L-isoleucina, em particular a L-lisina.

[00033] O termo aminoácidos ou L-aminoácidos, onde mencionado a seguir, também compreende os seus sais, por exemplo, monocloridreto de lisina ou sulfato de lisina no caso do aminoácido L-lisina.

[00034] O micro-organismo é selecionado de preferência do grupo que consiste em bactérias, levedura e fungos, particularmente de preferência entre as bactérias do grupo que consiste no gênero Corynebacterium e as bactérias da família Enterobacteriaceae, em que uma preferência muito particular é dada à espécia Corynebacterium glutamicum.

[00035] Em uma outra modalidade preferida, a expressão do polinucleotídeo que codifica para uma subunidade de proteína do transportador de ABC que tem a atividade de um importador de trealose é aumentada por um ou mais medidas selecionadas do grupo a seguir:

• a) a expressão do gene está sob o controle de um promotor que é mais forte no micro-organismo usado para o método do que o promotor original do dito gene;
• b) aumento do número de cópia do gene que codifica para um polipeptídeo que tem a atividade de um importador de trealose; de preferência ao inserir o dito gene em plasmídios com um número de cópia aumentado e/ou ao integrar pelo menos uma cópia do dito gene no cromossoma do dito micro-organismo;
• c) o gene é expresso ao usar um sítio de ligação de ribossoma que é mais forte no micro-organismo usado para o método do que o sítio de ligação do ribossoma original do dito gene;
• d) o gene é expresso com otimização do uso do códon do micro-organismo usado para o método;
• e) o gene é expresso com redução de estruturas secundárias do mRNA no mRNA transcrito do dito gene;
• f) o gene é expresso com eliminação de sequências do terminador de polimerase do RNA no mRNA transcrito do dito gene;
• g) o gene é expresso com o uso de sequências estabilizantes de mRNA no mRNA transcrito do dito gene.

[00036] As medidas acima para o aumento da expressão podem ser combinadas de uma maneira apropriada. A preferência é dada à expressão crescente do polinucleotídeo que codifica para uma subunidade de proteína do transportador de ABC que tem a atividade de um importador de trealose ao combinar pelo menos duas das medidas selecionadas do grupo que consiste em a), b) e c), particularmente de preferência ao combinar as medidas a) e b).

[00037] Tal como mencionado acima, a presente invenção também refere-se a um método para a produção fermentativa de um composto orgânico-químico, o qual compreende as etapas de:

• a) cultura do micro-organismo descrito acima de acordo com a presente invenção em um meio apropriado, resultando um caldo de fermentação, e
• b) acumulação do composto orgânico-químico no caldo de fermentação de a);

em que a acumulação de trealose no caldo de fermentação é reduzida ou evitada.

[00038] A preferência é dada aqui à redução da dita acumulação de trealose no caldo de fermentação em 50% ou mais, em 70% ou mais, em 80% ou mais, em 90% ou mais, em 95% ou mais, em 98% ou mais, em 99% ou mais, e com mais preferência em 99,5% ou mais, em comparação à cepa de partida particular do micro-organismo.

[00039] Em um método preferido, o micro-organismo usado para a cultura tem, em comparação à cepa de partida particular, uma expressão aumentada de um ou mais polinucleotídeos de acordo com uma das seguintes definições I a VIII:

[00040] I: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em a) a f):

• a) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 2 ou 14;
• b) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 4 ou 16;
• c) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 6 ou 18;
• d) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 8 ou 20;
• e) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 10 ou 22;
• f) um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 12 ou 24;

II: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em a), b), d) e e);
III: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em b), d) e e);
IV: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, do polinucleotídeo d) e/ou e);
V: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de qualquer um dos polinucleotídeos a), b), d) e e);
VI: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de qualquer um dos polinucleotídeos a), b), d);
VII: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de qualquer um dos polinucleotídeos a), b), e);
VIII: expressão aumentada, em comparação à cepa de partida particular, de qualquer um dos polinucleotídeos a) a e) e, onde apropriado, f).

[00041] A preferência é dada aqui à produção, a partir do caldo de fermentação, de um produto na forma líquida ou sólida.

[00042] Tal como mencionado acima, o termo micro-organismo compreende bactérias, leveduras e fungos. Entre as bactérias, pode ser feita referência em particular ao gênero Corynebacterium e às bactérias da família Enterobacteriaceae.

[00043] Dentro do gênero Corynebacterium, a preferência é dada às cepas baseadas nas espécies a seguir:
Corynebacterium efficiens tal como, por exemplo,
a cepa do tipo DSM44549,
Corynebacterium glutamicum tal como, por exemplo,
a cepa do tipo ATCC13032 ou a cepa R, e
Corynebacterium ammoniagenes tal como, por exemplo,
a cepa ATCC6871,
em que a espécie Corynebacterium glutamicum é muito particularmente preferida.

[00044] Alguns representantes da espécie Corynebacterium glutamicum também são conhecidos na técnica anterior por nomes diferentes. Estes incluem, por exemplo:
a cepa ATCC13870, indicada como Corynebacterium acetoacidophilum,
a cepa DSM20137, indicada como Corynebacterium lilium,
a cepa ATCC17965, indicada como Corynebacterium melassecola,
a cepa ATCC14067, indicada como Brevibacterium flavum,
a cepa ATCC13869, indicada como Brevibacterium lactofermentum, e
a cepa ATCC14020, indicada como Brevibacterium divaricatum.

[00045] O termo "Micrococcus glutamicus" tem sido analogamente usado para Corynebacterium glutamicum.

[00046] Alguns representantes da espácie Corynebacterium efficiens também são indicados como Corynebacterium thermoaminogenes na técnica anterior, por exemplo, a cepa FERM BP-1539.

[00047] Os micro-organismos ou as cepas empregados para as medidas de superexpressão do importador de trealose (cepas de partida) já têm de preferência a capacidade de concentrar os Laminoácidos desejados na célula ou de secretar os mesmos no meio nutriente circunvizinho e ali acumular os mesmos. A expressão "produzir" também é usada para isto a seguir. Mais especificamente, as cepas empregadas para as medidas de superexpressão têm a capacidade de se concentrar na célula ou de acumular no meio nutriente ≥ (pelo menos) ≥ 0,10 g/l, 0,25 g/l, ≥ 0,5 g/l, ≥ 1,0 g/l, ≥ 1,5 g/l, ≥ 2,0 g/l, ≥ 4 g/l ou ≥ 10 g/l do composto desejado dentro de ≤ (não mais do que) 120 horas, ≤ 96 horas, ≤ 48 horas, ≤ 36 horas, ≤ 24 horas ou ≤ 12 horas. As cepas de partida são de preferência as cepas produzidas pela mutagênese e seleção, pela tecnologia de DNA recombinante ou por uma combinação de ambos os métodos.

[00048] Uma pessoa versada na técnica compreende que um microorganismo apropriado para as medidas da invenção também pode ser obtido ao superexpressar primeiramente um importador de trealose em uma cepa selvagem, por exemplo, na cepa tipo ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum ou na cepa ATCC 14067, e então, por meio de medidas genéticas adicionais descritas na técnica anterior, ao fazer com que o micro-organismo produza o(s) L-aminoácido(s) desejado(s). A transformação do tipo selvagem somente com o polinucleotídeo mencionado não constitui uma medida da invenção.

[00049] Os exemplos de cepas da espécie Corynebacterium glutamicum que secretam ou produzem L-lisina são:
Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrito em Menkel et al. (Applied and Emvironmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)) e depositado como DSM16835,
Corynebacterium glutamicum DM1729 descrita em Georgi et al. (Metabolic Engineering 7, 291-301 (2005)) e na patente EP 1 717 616 A2 e depositado como DSM17576,
Corynebacterium glutamicum DSM13994 descrita na patente U.S. 6.783.967, e
Corynebacterium glutamicum DM1933 descrita em Blombach et al. (Appl Environ Microbiol. 2009 Jan; 75(2):419-27).

[00050] Um exemplo de uma cepa da espécie Corynebacterium efficiens que secreta ou produz L-lisina é:
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) descrito n patente U.S. 5.250.423.

[00051] Os micro-organismos produtores de L-lisina têm tipicamente uma aspartato quinase resistente a feedback ou dessensibilizadas. As aspartato quinases resistentes a feedback referem-se às quinases de aspartato (LysC) que, por comparação com a forma selvagem (tipo selvagem), exibem menos sensibilidade à inibição por misturas de lisina e treonina ou misturas de AEC (aminoetil cisteína) e treonina ou lisina sozinhas ou AEC sozinha. Os genes ou os alelos que codificam para essas quinases de aspartato que são dessensibilizadas por comparação com o tipo selvagem também são indicados como alelos de lysCFBR. O tipo selvagem apropriado no caso de quinases de aspartato da espécie Corynebacterium glutamicum é a cepa ATCC13032. Numerosos alelos de lysCFBR que codificam para as variantes de aspartato quinase que têm substituições de aminoácidos por comparação com a proteína do tipo selvage são descritos na técnica anterior. O gene de lysC nas bactérias do gênero Corynebacterium também é conhecido como gene ask. A aspartato quinase codificada pelo gene de lysC em Enterobacteriaceae também é indicada como aspartoquinase III.

[00052] Uma lista extensiva que contém as informações sobre as substituições de aminoácidos na proteína aspartato quinase de Corynebacterium glutamicum que resultam na dessensibilização é incluída, entre outros, na publicação de patente WO2009141330. A preferência é dada às variantes da aspartato quinase que contêm as seguintes substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: L-isoleucina para a L-treonina na posição 380 da sequência de aminoácidos e opcionalmente L-fenilalanina para a L-serina na posição 381, L-isoleucina para a L-treonina na posição 311 e L-treonina para a L-alanina na posição 279.

[00053] Uma lista extensiva que contém as informações sobre as substituições de aminoácidos na proteína aspartato quinase III de Escherichia coli que resultam na dessensibilização para a inibição por L-lisina é incluída, entre outros, na patente EP 0 834 559 A1 na página 3 (linhas 29 a 41). A preferência é dada a uma variante da aspartato quinase que contém o ácido L-aspártico em vez de glicina na posição 323 da sequência de aminoácidos e/ou L-isoleucina em vez de L-metionina na posição 318.

[00054] Um exemplo de uma cepa da espécie Corynebacterium glutamicum que secreta ou produz L-metionina é a Corynebacterium glutamicum DSM 17322 descrita na publicação de patente WO 2007/011939.

[00055] Os exemplos de representantes conhecidos de cepas bacterianas corineformes que produzem ou secretam L-triptofano são:

[00056] Corynebacterium glutamicum K76 (= Ferm BP-1847) descrita na patente U.S. 5.563.052,
Corynebacterium glutamicum BPS13 (= Ferm BP-1777) descrita na patente U.S. 5.605.818, e
Corynebacterium glutamicum Ferm BP-3055 descrita na patente U.S. 5.235.940.

[00057] Os exemplos de representantes conhecidos de cepas bacterianas corineformes que produzem ou secretam L-valina são:

[00058] Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 descrita na patente U.S. 5.188.948,
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 descrita na patente U.S. 5.521.074,
Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 descrita na patente U.S. 5.521.074, e
Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 descrita na patente U.S. 5.188.948.

[00059] Os exemplos de representantes conhecidos de cepas bacterianas corineformes que produzem ou secretam L-isoleucina são:

[00060] Brevibacterium flavum FERM BP-760 descrita na patente U.S. 4.656.135,
Brevibacterium flavum FERM BP-2215 descrita na patente U.S. 5.294.547, e
Corynebacterium glutamicum FERM BP-758 descrita na patente U.S. 4.656.135.

[00061] Os exemplos de representantes conhecidos de cepas bacterianas corineformes que produzem ou secretam L-homoserina são:

[00062] Micrococcus glutamicus ATCC 14296 descrita na patente U.S. 3.189.526 e
Micrococcus glutamicus ATCC 14297 descrita na patente U.S. 3.189.526.

[00063] Micro-organismos que produzem ou secretam cadaverina são descritos, por exemplo, na publicação de patente WO 2007/113127.

[00064] Um transportador de ABC que tem a atividade de um importador de trealose refere-se a uma proteína ou um complexo de proteínas com múltiplas subunidades quem catalisa o transporte da trealose da área circunvizinha para a célula do micro-organismo em questão.

[00065] Os transportadores de ABC constituem uma das maiores famílias de proteínas de membrana, um elemento estrutural comum do qual é um cassete de ligação de ATP e que transporta ativamente substratos específicos através de uma membrana celular. A energia necessária para transportar os substratos de transportadores de ABC contra um gradiente da concentração é produzida pela ligação e pela hidrólise de ATP na unidade de ATPase.

[00066] A estrutura de um transportador de ABC procariótico consiste normalmente em três partes: duas proteínas de membranas integrais (permease), cada uma das quais tem cinco a sete segmentos de transmembrana, duas proteínas adicionais que ligam e hidrolisam ATP (ATPase), e uma proteína de ligação de substrato periplásmica (ou lipoproteína ancorada em membrana). Muitos dos genes para as ditas três partes formam operons. Os transportadores de ABC pertencem desse modo em primeiro lugar aos transportadores primariamente ativos e em segundo lugar a ATPases ligadas a membranas.

[00067] Bancos de dados públicos tais como, por exemplo, o banco de dados UniProtKB (Universal Protein Resource Knowledgebase), contêm descrições de transportadores de ABC de organismos muito diferentes. O banco de dados UniProtKB é mantido pelo consórcio UniProt que inclui o European Bioinformatics Institute (EBI, Wellcome Trust, Hinxton Cambridge, UK), o Swiss Institute of Bioinformatics (SIB, Centre Medical Universitaire, Genebra, Switzerland) e o Protein Informatio Resource (PIR, Georgetown University, Washington, DC, US).

[00068] Os genes para um importador de trealose podem ser isolados dos organismos com o auxílio da reação de cadeia de polimerase (PCR) ao usar primers apropriados. As instruções podem ser encontradas, entre outros, no manual de laboratório "PCR" da autoria de Newton e Graham (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994) e na publicaçãode patente WO 2006/100211, páginas 14 a 17.

[00069] As medidas da invenção podem fazer uso dos genes do importador de trealose de corynebacteria. A preferência é dada ao uso dos genes que codificam para os polipeptídeos que têm a atividade do importador de trealose e cuja sequência de aminoácidos é ≥ (pelo menos) ≥ 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 92%, ≥ 94%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 e, onde apropriado, 12, ou 14, 16, 18, 20, 22, 24. No curso dos estudos que resultaram na presente invenção, o operon que codifica para o importador de trealose de Corynebacterium glutamicum foi identificado. O operon que codifica o importador de trealose em Corynebacterium glutamicum tem múltiplos quadros de leitura ou genes.

[00070] A Tabela 1 resume as informações a respeito dos quadros de leitura do operon que codifica para o importador de trealose de Corynebacterium glutamicum.
Tabela 1: Os genes/quadros de leitura do operon que codificam para o importador de trealose de Corynebacterium glutamicum

[00071] O arranjo genômico dos quadros de leitura é indicado na Figura 1, e a sequência da região é listada sob a SEQ ID NO.: 25.

[00072] De um ponto de vista químico, um gene é um polinucleotídeo. Um polinucleotídeo que codifica uma proteína/um polipeptídeo é aqui usado de modo sinônimo com o termo "gene".

[00073] Uma modalidade preferida do micro-organismo superexpressa um ou mais genes que codificam para um ou mais polipeptídeos selecionados de a) a f) a seguir:
a)

• i) um polipeptídeo que consiste em ou que compreende a sequência de aminoácido indicada na SEQ ID NO.: 2;
• ii) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos de i), em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;
• iii) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que contém uma deleção, uma substituição, uma inserção e/ou uma adição de 1 a 66, 1 a 33, 1 a 17, 1 a 7 resíduos de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 2, em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;

b)

• i) um polipeptídeo que consiste em ou que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 4;
• ii) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos de i), em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;
• iii) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que contém uma deleção, uma substituição, uma inserção e/ou uma adição de 1 a 85, 1 a 42, 1 a 21, 1 a 9 resíduos de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 4, em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;

c)

• i) um polipeptídeo que consiste em ou que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 6;
• ii) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos de i), em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;
• iii) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que contém uma deleção, uma substituição, uma inserção e/ou uma adição de 1 a 30, 1 a 15, 1 a 6, 1 a 3 resíduos de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 6, em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;

d)

• i) um polipeptídeo que consiste em ou que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.:8;
• ii) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos de i), em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;
• iii) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que contém uma deleção, uma substituição, uma inserção e/ou uma adição de 1 a 69, 1 a 34, 1 a 17, 1 a 7 resíduos de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 8, em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;

e)

• i) um polipeptídeo que consiste ou que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.:10;
• ii) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos de i), em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;
• iii) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que contém uma deleção, uma substituição, uma inserção e/ou uma adição de 1 a 56, 1 a 28, 1 a 14, 1 a 6 resíduos de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 10, em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;

f)

• i) um polipeptídeo que consiste em ou que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.:12;
• ii) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácido de i), em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose;
• iii) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que contém uma deleção, uma substituição, uma inserção e/ou uma adição de 1 a 15, 1 a 8, 1 a 4, 1 a 2 resíduos de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO.: 12, em que o dito polipeptídeo é uma subunidade de uma proteína complexa que tem a atividade de um importador de trealose.

[00074] As modalidades preferidas compreendem variantes que são pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas às sequências de aminoácidos descritas acima, isto é, em que pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% das posições de aminoácidos são idênticas àquelas das sequências de aminoácidos descritas acima. A porcentagem de identidade é calculada de preferência em relação a todo o comprimento da região de aminoácido ou ácido nucleico. Uma pessoa versada na técnica tem uma série de programas, baseados em uma multiplicidade de algoritmos, disponível para a comparação das sequências. Neste contexto, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman produzem resultados particularmente confiáveis. O progama PileUp (J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) e Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)) ], que fazem parte do pacote de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], estão disponíveis para o alinhamento de sequências. As porcentagens da identidade de sequências listadas acima são calculadas de preferência para toda a região da sequência ao usar o programa GAP.

[00075] Onde apropriado, é dada preferência às substituições de aminoácidos conservadoras. No caso de aminoácidos aromáticos, as substituições conservadoras são aquelas em que a fenilalanina, o triptofano e a tirosina são substituídos uns pelos outros. No caso de aminoácidos hidrofóbicos, as substituições conservadoras são aquelas em que a leucina, a isoleucina e a valina são substituídas umas pelas outras. No caso de aminoácidos polares, as substituições conservadoras são aquelas em que a glutamina e a asparagina são substituídas uma pela outra. No caso de aminoácidos básicos, as substituições conservadoras são aquelas em que a arginina, a lisina e a histidina são substituídas ums pelas outras. No caso de aminoácidos ácidos, as substituições conservadoras são aquelas em que o ácido aspártico e o ácido glutâmico são substituídos um pelo outro. No caso de aminoácidos que contêm grupos hidroxila, as substituições conservadoras são aquelas em que a serina e a treonina são substituídas uma pela outra.

[00076] Além disso, é possível usar polinucleotídeos que hibridizam sob condições estritas com a sequência de nucleotídeo complementar às SEQ ID NOs.: 1. 3, 5, 7, 9, 11, de preferência para a região de codificação das SEQ ID NOs.: 1. 3, 5, 7, 9, 11, e codificação para um polipeptídeo que faz parte de um importador de trealose.

[00077] As instruções a respeito da hibridização de ácidos nucleicos ou de polinucleotídeos podem ser encontradas pelo elemento versado na técnica, entre outros, no manual "The DIG system Users Guide for Filter Hybridization" da Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) e em Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). A hibridização ocorre sob condições estritas, ou seja, somente híbridos em que a sonda, isto é, um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo complementar às SEQ ID NOs.: 1. 3, 5, 7, 9, 11, de preferência a região de codificação das SEQ ID NOs.: 1. 3, 5, 7, 9, 11, e a sequência-alvo, isto é, os polinucleotídeos tratados com ou identificados pela dita sonda, são pelo menos 70% idênticos são formados. É sabido que a restrição de hibridização, incluindo as etapas de lavagem, é influenciada ou determinada pela variação da concentração da composição de tampão, da temperatura e do sal. A reação de hibridização é em geral executada com uma restrição relativamente baixa em comparação com as etapas de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

[00078] Por exemplo, um tampão de 5 x SSC a uma temperatura de cerca de 50°C - 68°C pode ser empregado para a reação de hibridização. Aqui, as sondas também podem hibridizar com polinucleotídeos que são menos de 70% idênticos à sequência de nucleotídeo da sonda empregada. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos por meio de lavagem sob condições restritas. Isto pode ser conseguido, por exemplo, ao reduzir a concentração de sal para 2 x SSC ou 1 x SSC e, onde apropriado, subsequentemente 0,5 x SSC (The DIG System User’s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), em que é estipulada uma temperatura de cerca de 50°C - 68°C, cerca de 52°C - 68°C, cerca de 54°C - 68°C, cerca de 56°C - 68°C, cerca de 58°C - 68°C, cerca de 60°C - 68°C, cerca de 62°C - 68°C, cerca de 64°C - 68°C, cerca de 66°C - 68°C. É dada preferência às faixas de temperatura de cerca de 64°C - 68°C ou de cerca de 66°C - 68°C. É opcionalmente possível abaixar a concentração de sal até uma concentração que corresponde a 0,2 x SSC ou 0,1 x SSC. O tampão de SSC contém opcionalmente dodecilsulfato de sódio (SDS) a uma concentração de 0,1%. Com o aumento gradual da temperatura de hibridização em etapas de cerca de 1 - 2°C de 50°C a 68°C, é possível isolar os fragmentos de polinucleotídeo que são pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, onde apropriuado 100%, idênticos à sequência ou à sequência complementar da sonda empregada e que codificam para um polipeptídeo que faz parte de um importador de trealose. Outras instruções a respeito da hibridização podem ser obtidas no mercado na forma de "kits" (por exemplo, DIG Easy Hyb da Roche Disgnostics GmbH, Mannheim, Germany, catálogo n°. 1603558).

[00079] Para as medidas da invenção, um gene que codifica para uma parte de um importador de trealose é superexpresso em um microorganismo ou cepa de partida ou paterna produzindo o(s) aminoácido(s) desejado(s).

[00080] Superexpressão significa de modo geral um aumento na concentração ou na atividade intracelular de um ácido ribonucleico, de uma proteína (polipeptídeo) ou de uma enzima por comparação com a cepa de partida (CEP paterna) ou cepa do tipo selvagem, se esta última for a cepa de partida. Uma cepa de partida (cepa paterna) significa a cepa em que à medida que conduz à superexpressão foi executada.

[00081] Para a superexpressão, é dada preferência aos métodos de superexpressão recombinante. Estes incluem todos os métodos em que um micro-organismo é preparado ao usar uma molécula de DNA provida in vitro. Os exemplos de tais moléculas de DNA incluem promotores, cassetes de expressão, genes, alelos, regiões de codificação, etc. Eles são transferidos por métodos de transformação, conjugação, transdução ou métodos similares no micro-organismo desejado.

[00082] As medidas de superexpressão aumentam a atividade ou a concentração dos polipeptídeos correspondentes em geral em pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, de preferência no máximo em 1.000%, 2.000%, 4.000%, 10.000% ou 20.000%, com base na atividade ou na concentração do dito polipeptídeo na cepa antes da medida, resultando na superexpressão.

[00083] A superexpressão é obtida por uma multiplicidade de métodos disponíveis na técnica anterior. Estes incluem o aumento do número de cópia e a modificação das sequências de nucleotídeos que dirigem ou controlam a expressão do gene. A transcrição de um gene é controlada, entre outras, pelo promotor e opcionalmente pelas proteínas que suprimem (proteínas repressoras) ou promovem a transcrição (proteínas ativadoras). A translação do RNA formado é controlada, entre outras, pelo sítio de ligação do ribossoma e pelo códon de partida. Os polinucleotídeos ou as moléculas de DNA que incluem um promotor e um sítio de ligação de ribossoma e opcionalmente um códon de partida também são indicados como cassete de expressão.

[00084] O número de cópia pode ser aumentado por meio de plasmídios que replica no citoplasma do micro-organismo. Para essa finalidade, uma abundância de plasmídios é descrita na técnica anterior para grupos muito diferentes de micro-organismos, em que os plasmídios podem ser usados para ajustando o aumento desejado no número de cópia do gene. Os plasmídios apropriados para o gênero Escherichia são descritos, por exemplo, no manual Molecular Biology, Labfax (Ed.: T. A. Brown, Bios Scientific, Oxford, UK, 1991). Os plasmídios apropriados para o gênero Corynebacterium são descritos, por exemplo, em Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27- 40, (2003)), ou em Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)).

[00085] O número de cópia também pode ser aumentado em pelo menos uma (1) cópia ao introduzir outras cópias no cromossoma do micro-organismo. Os métodos apropriados para o gênero Corynebacterium são descritos, por exemplo, nas patentes WO 03/014330, WO 03/040373 e WO 04/069996. Os exemplos dos métodos apropriados para o gênero Escherichia são a inserção de uma cópia do gene no sítio att do fago (Yu and Court, Gene 223, 77-81 (1998)), amplificação cromossomal com o auxílio do fago Mu, tal como descrito na patente EP 0 332 448, ou os métodos de substituição de gene com o auxílio de plasmídios de replicação condicional, tal como descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617 - 4622 (1989)) ou Link et al. (Journal of Bacteriology 179, 6228-6237 (1997)).

[00086] A expressão do gene também pode ser aumentada ao usar um promotor forte que é ligado funcionalmente ao gene a ser expresso. A preferência é dada ao uso de um promotor que é mais forte do que o promotor natural, isto é, aquele presente na cepa do tipo selvagem ou paterna. Para essa finalidade, a técnica anterior tem uma abundância de métodos disponíveis.

[00087] "Ligação funcional" neste contexto significa o arranjo sequencial de um promotor com um gene, resultando na expressão do dito gene e no controle do mesmo.

[00088] Os promotores apropriados para o gênero Corynebacterium podem ser encontrados, entre outros, em Morinaga et al. (Journal of Biotechnology 5, 305-312, (1987)), nos documentos de patente EP 0 629 699 A2, U.S. 2007/0259408 A1, WO 2006/069711, EP 1 881 076 A1 e EP 1 918 378 A1 e nas revisões tais como o "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling and Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)) ou no livro "Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)). Os exemplos dos promotores que permitem a expressão controlada, isto é, induzível ou repressível, são descritos, por exemplo, em Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428 430 (1988)).

[00089] Tais promotores ou cassetes de expressão são empregados tipicamente a uma distância de 1 a 1.000, de preferência de 1 a 500 nucleotídeos a montante do primeiro nucleotídeo do códon de partida da região de codificação do gene.

[00090] É analogamente possível colocar uma pluralidade de promotores a montante do gene desejado ou ligar funcionalmente os mesmos ao gene a ser expresso e desta maneira obter uma expressão aumentada. Os exemplos disto são descritos na patente WO 2006/069711.

[00091] A estrutura de promotores de Escherichia coli é bem conhecida. Portanto, é possível aumentar a força de um promotor ao modificar a sua sequência por meio de uma ou mais substituições e/ou uma ou mais inserções e/ou uma ou mais deleções dos nucleotídeos. Os exemplos disto podem ser encontrados, entre outros, em "Herder Lexikon der Biologie" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany (1994)).

[00092] Os exemplos da modificação dos promotores para aumentar a expressão nas bactérias corineformes podem ser encontrados na patente U.S. 6.962.805 B2 e em uma publicação de Vasicová et al. (Bacteriol. 1999 Oct;181(19):6188-91.). O realce de um gene-alvo por meio da substituição de um promotor homólogo é descrito, por exemplo, na patente EP 1 697 526 B1.

[00093] A estrutura do sítio de ligação de ribossoma de Corynebacterium glutamicum é analogamente bem conhecida e é descrita, por exemplo, em Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)), e nos manuais e nos livros de genética, por exemplo, "Gene und Klone" (Winnacker, Verlag Chemie, Weinheim, Germany (1990)) ou "Molecular Genetics of Bacteria" (Dale and Park, Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK (2004)).

[00094] A superexpressão pode ser analogamente obtida ao aumentar a expressão de proteínas ativadoras ou ao reduzir ou desativar a expressão de proteínas repressoras.

[00095] As medidas da superexpressão mencionadas podem ser combinadas umas com as outras de uma maneira apropriada. Desse modo é possível, por exemplo, combinar o uso de um cassete de expressão apropriado com o aumento do número de cópia ou, de preferência, o uso de um promotor apropriado com o aumento do número de cópia.

[00096] As instruções a respeito da manipulação de DNA, digestão e ligação de DNA, transformação e seleção de transformantes podem ser encontradas, entre outras, no manual conhecido da autoria de Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição "(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

[00097] A extensão da expressão ou da superexpressão pode ser determinada ao medir a quantidade de mRNA transcrito do gene, ao determinar a quantidade de polipeptídeo e ao determinar a atividade da enzima.

[00098] A quantidade de mRNA pode ser determinada, entre outras, ao usar os métodos de "transferência Northern" e de RT-PCT quantitativa. A RT-PCT quantitativa envolve a transcrição reversa que precede a reação de cadeia de polimerase. Para isto, o sistema LightCyclerTM da Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) pode ser usado, tal como descrito, por exemplo, em Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)). A concentração da proteína pode ser determinada através do fracionamento de gel de proteína uni e bidimensional e da identificação ótica subsequente da concentração de proteína pelo software apropriado de avaliação no gel. Um método habitual de preparação de géis de proteína para as bactérias corineformes e de identificação das ditas proteínas é o procedimento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). A concentração da proteína pode ser analogamente determinada pela hibridização de transferência Western ao usar um anticorpo específico para a proteína a ser detectada (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) e a avaliação ótica subsequente ao usar o software correspondente para a determinação da concentração (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)).

[00099] Os micro-organismos produzidos podem ser cultivados continuamente–tal como descrito, por exemplo, na publicação de patente WO 05/021772 - ou descontinuamente em um processo descontínuo (cultura de bateladas) ou em um processo de batelada alimentada ou um processo de batelada alimentada repetido para a finalidade de produzir o composto orgânico-químico desejado. Um resumo de uma natureza geral sobre métodos de cultura conhecidos está disponível no livro da autoria de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung no dado Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro da autoria de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).

[000100] O meio de cultura ou o meio de fermentação a ser usado deve, de uma maneira apropriada, satisfazer as demandas das respectivas cepas. As descrições de meios de cultura para vários microorganismos estão presentes no "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Os termos meio de cultura e meio de fermentação ou meio são intercambiáveis.

[000101] É possível usar, como fonte de carbono, açúcares e carboidratos tais como, por exemplo, a glicose, a sacarose, a lactose, a frutose, a maltose, melaço, soluções contendo sacarose do processamento de beterraba ou cana de açúcar, amido, hidrolisato de amido e celulose, óleos e gorduras tais como, por exemplo, o óleo de soja, o óleo de girassol, o óleo de amendoim e o óleo de coco, ácidos graxos tais como, por exemplo, o ácido palmítico, o ácido esteárico e o ácido linoleico, álcoois tais como, por exemplo, o glicerol, o metanol e o etanol, e ácidos orgânicos tais como, por exemplo, o ácido acético ou o ácido láctico.

[000102] É possível usar, como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânicos tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho, farinha de soja e ureia, ou compostos inorgânicos tais como o sulfato de amônio, o cloreto de amônio, o fosfato de amônio, o carbonato de amônio e o nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

[000103] É possível usar, como a fonte de fósforo, o ácido fosfórico, o fosfato de potássio di-hidrogenado ou o fosfato de dipotásso dihidrogenado ou os sais contendo sódio correspondentes.

[000104] O meio de cultura também deve compreender sais, por exemplo, na forma de cloretos ou sulfatos de metais tais como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e ferro, tais como, por exemplo, o sulfato de magnésio ou o sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento. Finalmente, fatores do crescimento essenciais tais como aminoácidos, por exemplo, homoserina e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina ou ácido pantotênico, podem ser empregados além das substâncias acima mencionadas.

[000105] Os ditos materiais de partida podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou ser alimentados durante a cultura de uma maneira apropriada.

[000106] O pH da cultura pode ser controlado ao empregar compostos básicos tais como o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos tais como o ácido fosfórico ou o ácido sulfúrico de uma maneira apropriada. O pH é ajustado de modo geral em um valor de 6,0 a 8,5, de preferência de 6,5 a 8. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar supressores de espuma tais como, por exemplo, ésteres de poliglicol de ácido graxo. Para manter a estabilidade dos plasmídios, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas apropriadas tais como, por exemplo, antibióticos. A fermentação é executada de preferência sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gases contendo oxigênio tais como, por exemplo, o ar, são introduzidos na cultura. É analogamente possível usar líquidos enriquecidos com peróxido de hidrogênio. A fermentação é executada, onde apropriado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C e de preferência de 25°C a 40°C, e particularmente de preferência de 30°C a 37°C. Em processos descontínuos, a cultura é continuada de preferência até ser formada uma quantidade do composto orgânicoquímico desejado suficiente para ser recuperado. Esse objetivo é atingido normalmente dentro de 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, tempos mais longos de cultura são possíveis. A atividade dos micro-organismos resulta em uma concentração (acumulação) do composto orgânico-químico no meio de fermentação e/ou nas células dos ditos micro-organismos.

[000107] Os exemplos de meios de fermentação apropriados podem ser encontrados, entre outros, nas patentes U.S. 5.770.409, U.S. 5.990.350, U.S. 5.275.940, WO 2007/012078, U.S. 5.827.698, WO 2009/043803, U.S. 5.756.345 e U.S. 7.138.266.

[000108] A análise dos L-aminoácidos para determinar a concentração em um ou mais momentos durante a fermentação pode ocorrer ao separar os L-aminoácidos por meio de cromatografia de troca de íons, de preferência a cromatografia de troca de cátions, com a derivatização pós-coluna subsequente ao usar niidrina, tal como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído no lugar da niidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo geral sobre a cromatografia de troca de íons pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

[000109] É analogamente possível executar uma derivatização précoluna, por exemplo, ao usar orto-ftalaldeído ou isotiocinato de fenila, e ao fracionar os derivados de aminoácidos resultantes por meio de cromatografia de fase reserva (RP), de preferência na forma de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Um método deste tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

[000110] A detecção é executada fotometricamente (absorção, fluorescência).

[000111] Uma revisão a respeito de uma análise de aminoácido pode ser encontrada, entre outras, no livro "Bioanalytik" da autoria de Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998).

[000112] O desempenho dos métodos ou dos processos de fermentação de acordo com a invenção, nos termos de um ou mais dos parâmetros selecionados do grupo de concentração (composto formado por unidade de volume), de rendimento (composto formado por unidade de fonte de carbono consumida), da formação (composto formado por unidade de volume e tempo) e da formação específica (composto formado por unidade de matéria seca da célula ou biomassa seca e tempo ou composto formado por unidade de proteína celular e tempo) ou então outros parâmetros do processo e suas combinações, é aumentado em pelo menos 0,5%, em pelo menos 1%, em pelo menos 1,5% ou em pelo menos 2%, com base nos métodos ou nos processos de fermentação ao usar micro-organismos que contêm uma maior atividade de importador de trealose.

[000113] A fermentação mede o resultado em um caldo de fermentação que contém o composto orgânico-químico desejado, de preferência o L-aminoácido.

[000114] Um produto que contém o composto orgânico-químico é então provido ou produzido ou recuperado na forma líquida ou sólida.

[000115] Um caldo de fermentação refere-se a um meio de fermentação ou meio nutriente em que um micro-organismo foi cultivado por um certo tempo e a uma determinada temperatura. O meio ou meios de fermentação empregados durante a fermentação compreendem todas as substâncias ou componentes que asseguram a produção do composto desejado e tipicamente a propagação e a viabilidade.

[000116] Quando a fermentação é completada, o caldo de fermentação resultante compreende, por conseguinte:

• a) a biomassa (massa da célula) do micro-organismo, em que a dita biomassa é produzida devido à propagação das células do dito micro-organismo,
• b) o composto orgânico-químico desejado formado durante a fermentação,
• c) os produtos secundários orgânicos formados durante a fermentação, e
• d) os constituintes do meio de fermentação empregado ou dos materiais de partida, tais como, por exemplo, vitaminas tais como a biotina ou sais tais como o sulfato de magnésio, que não foram consumidos na fermentação.

[000117] Os produtos secundários orgânicos incluem as substâncias que são produzidas e secretadas opcionalmente pelos microorganismos empregados na fermentação além do composto desejado particular. Estes também incluem açúcares tais como, por exemplo, a trealose.

[000118] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou do tanque de fermentação, coletado onde apropriado, e usado para obter um produto que contem o composto orgânico-químico, de preferência um produto contendo L-aminoácido, na forma líquida ou sólida. A expressão "recuperação do produto contendo L-aminoácido" também é usada para isto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-aminoácido, que foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[000119] Uma ou mais das medidas selecionadas do grupo que consiste em

• a) remoção parcial (> 0% a < 80%) a total (100%) ou virtualmente total (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) da água,
• b) remoção parcial (> 0% a < 80%) a total (100%) ou virtualmente total (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) da biomassa, em que esta última é opcionalmente inativada antes da remoção,
• c) remoção parcial (> 0% a < 80%) a total (100%) ou virtualmente total (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) dos produtos secundários orgânicos formados durante a fermentação, e
• d) remoção parcial (> 0%) a total (100%) ou virtualmente total (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) dos constituintes do meio de fermentação empregado ou dos materiais de partida, que não foram consumidos na fermentação,

do caldo de fermentação provê a concentração ou a purificação do composto orgânico-químico desejado. Os produtos que têm um teor desejado do dito composto são isolados dessa maneira.

[000120] A remoção parcial (> 0% a < 80%) a total (100%) ou virtualmente total (≥ 80% < 100%) da água (medida a)) também é indicada como secagem.

[000121] Em uma variante do método, a remoção total ou virtualmente total da água, da biomassa, dos produtos secundários orgânicos e dos constituintes não consumidos do meio de fermentação empregado resulta em formas de produto puras (≥ 80% em peso, ≥ 90% em peso) ou altamenta puras (≥ 97% em peso, ≥ 99% em peso, ≥ 90% em peso) do composto orgânico-químico desejado, de preferência L-aminoácidos. Uma abundância de instruções técnicas para as medidas a), b), c) e d) está disponível na técnica anterior.

[000122] No caso do aminoácido L-lisina, quatro formas diferentes do produto são essencialmente conhecidas na técnica anterior.

[000123] Um grupo de produtos contendo L-lisina inclui soluções alcalinas aquosas concentradas de L-lisina purificada (EP-B-0534865). Um outro grupo tal como descrito, por exemplo, nas patentes U.S. 6.340.486 e U.S. 6.465.025, inclui concentrados contendo biomassa ácidos aquosos de caldos de fermentação contendo L-lisina. O grupo mais bem conhecido de produtos sólidos inclui as formas pulverulentas ou cristalinas de L-lisina purificada ou pura, que está tipicamente na forma de um sal tal como, por exemplo, monocloridreto de L-lisina. Um outro grupo de formas sólidas do produto é descrito, por exemplo, na patente EP-B-0533039. A forma do produto ali descrita compreende além de L-lisina a maior parte dos materiais de partida usados durante a produção fermentativa e não consumidos e, onde apropriado, a biomassa do microorganismo empregado com uma proporção de > 0% - 100%.

[000124] Uma ampla variedade de processos apropriados para as várias formas do produto é conhecida para obter o produto contendo L-lisina ou a L-lisina purificada a partir do caldo de fermentação.

[000125] Os métodos usados essencialmente para produzir a L-lisina sólida pura são aqueles de cromatografia de troca de íons, onde apropriado com o uso de carbono ativado, e métodos de cristalização.
A base correspondente ou um sal correspondente tal como, por exemplo, o monocloridreto (Lys-HCl) ou o sulfato de lisina (Lys2-H2SO4) é obtido desta maneira.

[000126] A patente EP-B-0534865 descreve um processo para a produção de soluções contendo L-lisina básicas aquosas a partir de caldos de fermentação. No processo aqui descrito, a biomassa é separada do caldo de fermentação e descartada. Uma base tal como, por exemplo, o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio ou o hidróxido de amônio é usada para ajustar um pH entre 9 e 11. Os constituintes minerais (sais inorgânicos) são removidos do caldo por meio de cristalização após a concentração e o resfriamento e são usados como fertilizante ou descartados.

[000127] Nos processos para a produção de lisina ao usar bactérias do gênero Corynebacterium, os processos preferidos são aqueles que resultam em produtos que compreendem constituintes do caldo de fermentação. Estes são usados em particular como aditivos de ração de animais.

[000128] Dependendo dos requisitos, a biomassa pode ser removida completa ou parcialmente do caldo de fermentação por métodos de separação tais como, por exemplo, a centrifugação, a filtração, a decantação ou uma combinação destas, ou pode ser ali deixada integralmente. Onde apropriado, a biomassa ou o caldo de fermentação contendo biomassa é inativado durante uma etapa do processo apropriada, por exemplo, pelo tratamento térmico (aquecimento) ou pela adição de um ácido.

[000129] Em um procedimento, a biomassa é removida completa ou virtualmente completamente de modo que nenhuma (0%) ou no máximo 30%, no máximo 20%, no máximo 10%, no máximo 5%, no máximo 1% ou no máximo 0,1% de biomassa permanecem no produto preparado. Em um procedimento adicional, a biomassa não é removida, ou então é removida somente em proporções pequenas, de modo que toda (100%) ou mais do que 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 99,9% de biomassa permanecem no produto preparado. Em um método de acordo com a invenção, por conseguinte, a biomassa é removida em proporções de ≥ 0% a ≥ 100%.

[000130] Finalmente, o caldo de fermentação obtido depois da fermentação pode ser ajustado, antes ou depois da remoção completa ou parcial da biomassa, a um pH ácido com um ácido inorgânico tal como, por exemplo, o ácido clorídrico, o ácido sulfúrico ou o ácido fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como, por exemplo, o ácido propiônico (GB 1.439.728 ou EP 1 331 220). É analogamente possível acidificar o caldo de fermentação com o teor completo de biomassa. Finalmente, o caldo também pode ser estabilizado ao adicionar bissulfito de sódio (NaHSO3, GB 1.439.728) ou um outro sal, por exemplo, amônio, um sal de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso de ácido sulfuroso.

[000131] Durante a remoção da biomassa, todos os sólidos orgânicos ou inorgânicos presentes no caldo de fermentação são removidos parcial ou completamente. Os produtos secundários orgânicos dissolvidos no caldo de fermentação, e os constituintes não consumidos dissolvidos do meio de fermentação (materiais de partida), permanecem pelo menos em parte (> 0%), de preferência até uma extensão de pelo menos 25%, em particular de preferência até uma extensão de pelo menos 50% e muito particularmente de preferência até uma extensão de pelo menos 75%, no produto. Onde apropriado, eles também permanecem completamente (100%) ou virtualmente completamente, o que significa > 95% ou > 98% ou mais de 99%, no produto. Se um produto neste sentido compreender pelo menos uma parte dos constituintes do caldo de fermentação, ele também é descrito pelo termo "produto baseado no caldo de fermentação".

[000132] Subsequentemente, a água é removida do caldo, ou é espessada ou concentrada, por métodos conhecidos tal como, por exemplo, ao usar um evaporador giratório, um evaporador de película fina, um evaporador de película cadente, por meio de osmose reversa ou por nanofiltração. Esse caldo de fermentação concentrado pode então ser trabalhado até formar produtos de fluência livre, em particular como um pó fino ou de preferência grânulos graúdos, por métodos de secagem por congelamento, secagem por aspersão, granulação por aspersão ou por outros processos tal como descrito, por exemplo, no leito fluidizado circulante de acordo com a patente PCT/EP2004/006655. Um produto desejado é isolado onde apropriado dos grânulos resultantes por meio de peneiração ou remoção da poeira.

[000133] É analogamente possível secar diretamente o caldo de fermentação, isto é, sem concentração precedente por meio de secagem por aspersão ou pela granulação por aspersão.

[000134] "De fluência livre" refere-se aos pós que, de uma série de vasos de orifícios de vidro com orifícios de tamanhos diferentes, fluem desimpedidos pelo menos fora do vaso com um orifício de 5 mm (milímetro) (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

[000135] "Fino" refere-se a um pó que tem predominantemente (> 50%) um tamanho de partícula com um diâmetro de 20 a 200 µm.

[000136] "Graúdo" refere-se a um produto que tem predominantemente (> 50%) um tamanho de partícula com um diâmetro de 200 a 2.000 µm.

[000137] A determinação do tamanho de partícula pode ser feita por métodos de espectrometria com difração a laser. Os métodos correspondentes são descritos no livro "Teilchengrössenmessung no der Laborpraxis" [Medição do tamanho de partícula na prática de laboratório] da autoria de R. H. Muller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) ou no livro "Introduction to Particle Technology" da autoria de M. Rhodes, publicado por Wiley & Sons (1998).

[000138] O pó de fluência livre fino pode por sua vez ser convertido por processos apropriados de compactação ou de granulação em um produto graúdo de muita fluência livre armazenável e substancialmente livre de poeira.

[000139] O termo "livre de poeira" significa que o produto compreende somente proporções pequenas (< 5%) de tamanhos de partícula com diâmetro abaixo de 100 µm.

[000140] "Armazenável" no sentido da presente invenção refere-se a um produto que pode ser armazenado por pelo menos um (1) ano ou mais, de preferência por pelo menos 1 ano e meio ou mais, em particular de preferência dois (2) anos ou mais, em um ambiente seco e fresco sem a ocorrência de nenhuma perda substancial (no máximo 5%) do respectivo aminoácido.

[000141] A invenção também refere-se a um método descrito em princípio na publicação de patente WO 2007/042363 A1. Para essa finalidade, é praticado um método que usa o caldo de fermentação obtido de acordo com a invenção, do qual a biomassa foi removida completa ou parcialmente, onde apropriado, e em que o método compreende as seguintes etapas:
a) o pH é reduzido até 4,0 a 5,2, em particular até 4,9 a 5,1, ao adicionar ácido sulfúrico, e uma razão molar de sulfato/L-lisina de 0,85 a 1,2, de preferência de 0,9 a 1,0, particularmente de preferência de > 0,9 a < 0,95, é estabelecida no caldo, onde apropriado ao adicionar um ou mais outros compostos contendo sulfato, e
b) a mistura obtida desta maneira é concentrada pela remoção da água, e granulada onde apropriado,
onde uma ou ambas das seguintes medidas são levadas a efeito onde apropriado antes da etapa a):
c) medição da razão molar de sulfato/L-lisina para verificar a quantidade requerida de composto(s) contendo sulfato,
d) adição de um composto contendo sulfato selecionado do grupo de sulfato de amônio, bissulfato de amônio e ácido sulfúrico em relações apropriadas.

[000142] Onde apropriado, além disso, antes da etapa b), um sal de ácido sulfuroso, de preferência o bissulfito do metal alcalino, particularmente de preferência o bissulfito de sódio, é adicionado a uma concentração de 0,01 a 0,5% em peso, de preferência de 0,1 a 0,3% em peso, particularmente de preferência de 0,1 a 0,2% em peso, com base no caldo de fermentação.

[000143] Os compostos contendo sulfato preferidos que devem ser mencionados no contexto das etapas do processo acima mencionadas são em particular o sulfato de amônio e/ou o bissulfato de amônio ou as misturas apropriadas de amônia e ácido sulfúrico e o próprio ácido sulfúrico.

[000144] A razão molar de sulfato/L-lisina V é calculada pela fórmula: V = 2 x [ SO42-]/[L-lisina]. Essa fórmula leva em conta o fato que o ânion de SO42- é duplamente carregado, ou o ácido sulfúrico é dibásico. Uma razão V = 1 significa que uma composição estequiométrica Lys2-(H2SO4) está presente, ao passo que a presença de uma razão V = 0,9 significa um déficit de sulfato de 10% e uma razão V = 1,1 significa um excesso de sulfato de 10%.

[000145] É vantajoso empregar, durante a granulação ou a compactação, os auxiliares usuais ou portadores orgânicos ou inorgânicos tais como o amido, a gelatina, derivados da celulose ou substâncias similares, tal como usado normalmente no processamento de produtos alimentícios ou rações tais como aglutinantes, agentes de gelificação ou espessantes, ou outras substâncias tais como, por exemplo, sílicas, silicatos (EP0743016A) ou estearatos.

[000146] É mais vantajoso tratar a superfície dos grânulos resultantes com óleos ou gorduras tal como descrito na publicação de patente WO 04/054381. Os óleos que podem ser usados são óleos minerais, óleos vegetais ou misturas de óleos vegetais. Os exemplos de tais óleos são o óleo da soja, o azeite de oliva, misturas de óleo de soja/lecitina. Da mesma maneira, óleos de silicone, polietileno glicóis ou a hidróxi etil celulose também são apropriados. O tratamento das superfícies com os ditos óleos propicia uma maior resistência à abrasão do produto e uma redução no teor de poeira. O teor de óleo no produto é de 0,02 a 2,0% em peso, de preferência de 0,02 a 1,0% em peso, e muito particularmente de preferência de 0,2 a 1,0% em peso, com base na quantidade total do aditivo de ração.

[000147] Os produtos preferidos têm uma proporção de ≥ 97% em peso com um tamanho de partícula de 100 a 1.800 µm, ou uma proporção de ≥ 95% em peso com um tamanho de partícula de 300 a 1.800 µm, no diâmetro. A proporção de poeira, isto é, as partículas com um tamanho de partícula < 100 µm, é de preferência > 0 a 1% em peso, e particularmente de preferência não excede 0,5% em peso.

[000148] No entanto, alternativamente, o produto também pode ser absorvido em um portador orgânico ou inorgânico conhecido e habitual no processamento das rações, tais como, por exemplo, sílicas, silicatos, farinhas grossas, farelos, farinhas, amidos, açúcares ou outros ainda, e/ou é misturado e estabilizado com os espessantes ou aglutinantes habituais. Os exemplos do uso e dos processos para o mesmo são descritos na literatura (Die Muhle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, página 817).

[000149] Finalmente, o produto também pode ser tratado com processos de revestimento com formadores de película tais como, por exemplo, carbonatos de metal, sílicas, silicatos, alginatos, estearatos, amidos, gomas e éteres de celulose, tal como descrito na patende DE-C-4100920, em um estado que é estável para a digestão pelos estômagos animais, especialmente o estômago dos ruminantes.

[000150] Para estabelecer uma concentração desejada de L-lisina no produto é possível, dependendo dos requisitos, adicionar a L-lisina durante o processo na forma de um concentrado ou, onde apropriado, de uma substância substancialmente pura ou seu sal na forma líquida ou sólida. Estes podem ser adicionados sozinhos ou como misturas ao caldo de fermentação resultante ou concentrado, ou então durante o processo de secagem ou de granulação.

[000151] A invenção também se refere a um método para a preparação de um produto contendo lisina sólido, em que o método é descrito em princípio na patente U.S. 20050220933. Isto envolve a prática de um método que usa o caldo de fermentação obtido de acordo com a invenção e que compreende as seguintes etapas:

• a) filtração do caldo de fermentação, de preferência com um filtro de membrana, para resultar em uma pasta contendo biomassa e um material filtrado,
• b) concentração do material filtrado, para resultar de preferência em um teor de sólidos de 48 a 52% em peso,
• c) granulação do concentrado obtido na etapa b), de preferência a uma temperatura de 50°C a 62°C, e
• d) revestimento dos grânulos obtidos em c) com um ou mais agentes de revestimento.

[000152] A concentração do material filtrado na etapa b) também pode ser realizada de uma maneira tal que um teor de sólidos de > 52 a ≤ 55% em peso, de > 55 a ≤ 58% em peso ou de > 58 a ≤ 61% em peso é obtido.

[000153] Os agentes de revestimento usados de preferência para o revestimento na etapa d) são selecionados do grupo que consiste em

• d1) a biomassa obtida na etapa a),
• d2) um composto contendo L-lisina, selecionado de preferência do grupo de cloridreto de L-lisina ou sulfato de L-lisina,
• d3) uma substância essencialmente livre de L-lisina com um teor de L-lisina de < 1% em peso, de preferência de < 0,5% em peso, de preferência selecionado do grupo de amido, carragenina, ágar, sílicas, silicatos, rações, farelos e farinhas, e
• d4) uma substância repelente à água, de preferência selecionada do grupo de óleos, polietileno glicóis e parafinas líquidas.

[000154] O teor de L-lisina é ajustado a um valor desejado pelas medidas que correspondem às etapas d1) a d4), em particular d1) a d3).

[000155] Na produção de produtos contendo L-lisina, a razão dos íons é ajustada de preferência de modo que a razão molar do íon que corresponde à seguinte fórmula
2x[SO42-]+[Cl-]-[NH4+]-[Na+]-[K+]-2x[Mg2+]-2x[Ca2+]/[L-Lys]
seja de 0,68 a 0,95, de preferência de 0,68 a 0,90, particularmente de preferência de 0,68 a 0,86, tal como descrito por Kushiki et al. na patente U.S. 20030152633.

[000156] No caso da L-lisina, o produto sólido produzido desta maneira tem, com base no caldo de fermentação, um teor de lisina (como base de lisina) de 10% em peso a 70% em peso ou de 20% em peso a 70% em peso, de preferência de 30% em peso a 70% em peso e muito particularmente de preferência de 40% em peso a 70% em peso, com base na matéria seca do produto. Os teores máximos da base de lisina de 71% em peso, 72% em peso, 73% em peso também são possíveis.

[000157] O teor de água do produto sólido contendo L-lisina é de até 5% em peso, de preferência de até 4% em peso, e particularmente de preferência de menos de 3% em peso.

[000158] A cepa DM1729 foi depositada junto à coleção alemã de micro-organismos e culturas de células sob o número de acesso DSM17576 em 16 de setembro de 2005.

Breve Descrição dos Desenhos

[000159] A Figura 1 ilustra o arranjo dos quadros de leitura abertos cg0835 a cg0830. Os quadros de leitura codificam para as seguintes proteínas putativas: cg0835: ATPase; proteína de ligação de substrato periplásmica cg0834; cg0832: subunidade de permease; subunidade de permease cg0831.

[000160] A Figura 2 é uma representação esquemática do construto de expressão pXMJ19-cg0831. A Tabela 2 a seguir resume as abreviaturas e os nomes usados e também o seu significado. Os números pares base indicados são aproximações obtidos dentro dos limites de reproducibilidade das medições.

[000161] A Figura 3 é uma representação esquemática do plasmídio pK18mobsacB_Pgap_cg0832 usado para a ligação funcional de ORF cg0832 ao promotor de Pgap.

[000162] A Tabela 3 a seguir resume as abreviaturas e os nomes usados e também o seu signifcado. As abreviaturas e os nomes usados têm os seguintes significados. Os números pares base indicados são aproximações obtidas dentro dos limites de reproducibilidade das medições.

Exemplos Exemplo 1: Identificação de um sistema de absorção de trealose

[000163] Para as bactérias da ordem Actinomycetales, que também inclui C. glutamicum, a metabolização de trealose era descrita até agora somente para as bactérias da família Streptomycetaceae: Streptomyces coelicolor e Streptomyces reticuli utilizam a trealose como fonte de carbono. As análises da expressão do gene indicaram uma participação na absorção de trealose dos componentes de um sistema de transporte de ABC, codificados por agl3E, agl3F e agl3G, em S. coelicolor e da subunidade MsiK de aTPase em S. reticuli. Uma análise Blast da sequência genêmica de C. glutamicum identificou dois quadros de leitura abertos (cg2708 e cg0835) com elevada homologia a msiK de S. reticuli (n°. de acesso no GenBank. CAA70125): a proteína de C. glutamicum codificada por cg2708 é 59% idêntica a MsiK de S. reticuli (e-valor 7e-125), mas é a proteína de ligação de ATP MusE do transportador de maltose MusEFGK2, cuja deleção não afeta a utilização de trealose. A segunda proteína, codificada por cg0835, é, a 58%, analogamente altamente idêntica a MsiK de S. reticuli (e-valor 8e112). As comparações de sequências de agl3E, agl3F e agl3G de S. coelicolor (n°. de acesso NP_631226, NP_631225, NP_631224) com a sequência genômica de C. glutamicum não resultaram em nenhum outro resultado significativo (por exemplo 25% a 32% de identidade aos genes do sistema de absorção de ABC UgpAEBC que catalisa a absorção de 3-fosfato de glicerol, e genes do sistemade absorção de maltose MusEFGK2).

[000164] A análise comparativa das sequências, portanto, acarreta como um possível sistema de absorção de trealose em C. glutamicum, o quadro de leitura aberto cg0835 os quadros de leitura abertos cg0834, cg0832 e cg0831 que ficam situados na vizinhança imediata na sequência genômica e que codificam para uma proteína de ligação de substrato e dois componentes do permease de um transportador de ABC ainda não caracterizado (vide a Figura 1 quanto ao arranjo).

Exemplo 2: Construção do vetor pXMJ19_cg0831

[000165] O construto de expressão que contém os quadros de leitura cg0832, cg0834, cg0833, cg0832 e cg0831 foi preparado ao amplificar a região do gene correspondente por meio de uma polimerase de revisão (PRECISOR High-Fidelity DNA Polymerase, Biocat, Heidelberg, Germany) e a sua ligação ao vetor de clonagem pJet (Fermentas, St. Leon-Roth, Germany).

[000166] Para essa finalidade, os seguintes oligonucleotídeos sintéticos (primers) foram usados:
PRIMER CG0831FOR (SEQ ID NO.: 30):
5' GCTCTAGATGCGTTCTGCTCCTGACCTT 3'
PRIMER CG0831REV (SEQ ID NO.: 31):
5' CGGGATCCTTTGCGTTGCGATTCGGATT 3'

[000167] Os primers mostrados foram sintetizados pela MWG Biotech (Ebersberg, Germany). Em cada caso, a sequência de reconhecimento para as enzimas de restrição XbaI e BamHI, respectivamente, é sublinhada.

[000168] O fragmento obtido então é excisado pelas enzimas de restrição XbaI e BamHI (New England Biolabs, Schwalbach, Germany) do vetor pJet e ligado ao vetor de expressão pXMJ19 (Jakoby et al., 1999), que foi previamente linearizado com XbaI e BamHI e então desfosforilado ao usar Antarctic Phosphatase (New England Biolabs, Schwalbach, Germany). Isto foi seguido pela transformação de células competentes DH5αmcr de E. coli com 5 µl da mistura de ligação. Os clones obtidos foram selecionados pela restrição dos plasmídios preparados para aqueles que contêm a inserção desejada. O plasmídio foi nomeado pXMJ19_cg0831 (vide a Figura 2).

Exemplo 3: Preparação de cepas de C. glutamicum DM1933/pXMJ19 e DM1933/pXMJ19_cg0831

[000169] Os plasmídios descritos no Exemplo 2, pXMJ19 e pXMJ19_cg0831, foram submetidos à eletroporação em DM1933 de Corynebacterium glutamicum, ao usar o método de eletroporação de Liebl et al. (FEMS Microbiological Letters, 53:299-303 (1989)).

[000170] A cepa DM1933 é um mutante resistente à amino etil cisteína de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e foi descrita em uma publicação (Blombach et al., 2009, Appl. and Env. Microbiol., p. 419-427).

[000171] Células contendo plasmídios foram selecionadas ao chapear a mistura de eletroporação em LB ágar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) suplementado com 7,5 mg/l de cloranfenicol. O DNA do plasmídio foi isolado em cada caso de um transformante pelos métodos usuais (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927) e verificado por meio de clivagem de restrição com a eletroforese com gel de agarose subsequente.

[000172] As cepas obtidas foram nomeadas DM1933/pXMJ19 e DM1933/pXMJ19_cg0831. O construto pXMJ19_cg0831 contém os quadros de leitura cg0832, cg0834, cg0833, cg0832 e cg0831.

Exemplo 4: Produção de L-lisina

[000173] As cepas de C. glutamicum obtidas no Exemplo 3, DM1933/pXMJ19 e DM1933/pXMJ19_cg0831, foram cultivadas em um meio nutriente apropriado para a produção de lisina, e o teor de lisina no sobrenadante da cultura foi determinado.

[000174] Para esta finalidade, as cepas foram em primeiro lugar incubadas em uma placa de ágar contendo o antibiótico apropriado (ágar do cérebro-coração com cloranfenicol (7,5 mg/l)) a 33°C por 24 horas. A partir dessa cultura da placa de ágar, uma pré-cultura foi inoculada (10 ml do meio em um frasco cônico de 100 ml). O meio usado para a pré-cultura e a cultura principal era o meio MM, ao qual foi adicionado cloranfenicol (7,5 mg/l).

[000175] A Tabela 4 fornece uma vista geral da composição do meio de cultura usado.
Tabela 4: Meio MM

[000176] CSL, MOPS e a solução de sal foram ajustados a um pH 7 com amônia aquosa e submetidos à autoclave. As soluções estéreis do substrato e da vitamina e o CaCO3 submetido à autoclave seco foram então adicionados.

[000177] A pré-cultura foi incubada em um agitador a 250 rpm e a 33°C por 24 horas. Uma cultura principal foi inoculada dessa pré-cultura de maneira tal que o OD de partida (660 nm) da cultura principal era um OD de 0,1.

[000178] A cultura foi executada em volumes de 10 ml em um frasco cônico de 100 ml com defletores a uma temperatura de 33°C e uma umidade de 80%.

[000179] Depois de 20 e 40 horas (h), o OD a um comprimento de onda de medição de 660 nm foi determinado ao usar um aparelho Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). A quantidade de lisina produzida foi determinada por meio de cromatografia de troca de íons e pela derivatização com detecção de ninidrina, ao usar um analisador de aminoácidos pós-coluna Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany). A concentração de trealose foi determinada por meio de HPLC, ao usar um analisador da Dionex GmbH (65510 Idstein, Germany). A Tabela 5 indica o resultado da experiência.
Tabela 5: Produção da medição da concentração de L-lisina e trealose. Todos os valores são médias de 3 experiências independentes com as cepas listadas; n.d. = não determinado.

[000180] O resultado indica que a trealose é não mais produzida como um produto secundário quando a lisina é produzida a partir da trealose ao usar uma cepa que expressa importador de trealose. Além disso, é evidente que o rendimento do produto desejado (L-lisina) é aumentado.

Exemplo 5: Construção do vetor pK18mobsacB_Pgap_cg0832

[000181] Um fragmento de DNA de 1701 bp que corresponde à sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO.: 26) para a superexpressão dos genes cg0831 e cg0832 foi preparado pela síntese do gene de novo na GENEART AG (Regensburg, Germany).

[000182] As posições dos nucleotídeos 613 a 1095 descrevem um fragmento do promotor do pedido de patente US20080050786 (SEQ ID NO.: 20), em que um sítio de clivagem para a enzima de restrição NruI foi gerado ao mutar a timina da nucleobase na posição 1079 em guanina da nucleobase, a timina da nucleobase na posição 1080 em citosina da nucleobase e a timina da nucleobase na posição 1081 em guanina da nucleobase. Além disso, um sítio de clivagem para a enzima de restrição ScaI foi gerado ao adicionar uma sequência de ligante (SEQ ID NO.: 28) à extremidade 5' da sequência de promotor e fica situado nas posições 607 a 612. O fragmento do promotor de 489 bp obtido a partir deste foi ligado funcionalmente ao códon de partida do gene cg0832.

[000183] O construto tem uma sequência de flanqueamento de 600 bp na região a jusante (posições 1096 a 1695) e uma sequência de flanqueamento de 600 bp na região a montante (posições 7 a 606) do promotor, para a integração do promotor por meio de recombinação homóloga.

[000184] As sequências que contêm sítios de clivagem para as enzimas de restrição XbaI (posições 1 a 6) e HindIII (posições 1696 a 1701) foram adicionadas às regiões de flanqueamento, permitindo desse modo que o construto fosse clonado no vetor de troca pK18mobsacB.

[000185] O fragmento de 1701 bp foi digerido com as enzimas de restrição XbaI e HindIII e então subclonado no vetor pK18mobsacB mobilizável descrito por Schäfer et al. (Gene, 145, 69-73 (1994)), a fim de permitir que o promotor se integre a montante do gene cg0832. Para essa finalidade, pK18mobsacB foi digerido com as enzimas de restrição XbaI e HindIII. O vetor preparado desta maneira foi misturado com o fragmento, e a mistura foi tratada com o kit de ligase de DNA Ready-T-Go T4 T4 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany).

[000186] Subsequentemente, a cepa S17-1 de E. coli (Simon et al., Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) foi transformada com a mistura de ligação (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Vol.1. ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). As células contendo plasmídios foram selecionadas ao chapear a mistura de transformação em LB ágar (Sambrock et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2a Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989) suplementada com 50 mg/l de canamicina.

[000187] O DNA do plasmídio foi isolado de um transformante com o auxílio de um kit QIAprep Spin Miniprep da Qiagen e verificado por meio de clivagem de restrição com as enzimas de XbaI e HindIII e a eletroforese com gel de agarose subsequente. O plasmídio é indicado como pK18mobsacB_Pgap_cg0832 e está ilustrado na Figura 3.

Exemplo 6: Preparação da cepa DM1933 _ Pgap_cg0832 de C. glutamicum

[000188] O objetivo era a introdução da mutação Pgap_cg0832 na cepa DM1933 de Corynebacterium glutamicum. A cepa DM1933 é um mutante resistente à amino etil cisteína de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e foi descrita em uma publicação (Blombach et al., 2009, Appl. and Env. Microbiol., p. 419-427).

[000189] O vetor pK18mobsacB_Pgap_cg0832 descrito no Exemplo 5 foi transferido por meio de conjugação de acordo com o protocolo de Schäfer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) na cepa DM1933 de C. glutamicum. O dito vetor não pode se autorreplicar em DM1933 e é retido na célula somente se foi integrado no cromossoma em consequência de um evento de recombinação. Os transconjugantes, isto é, os clones com pK18mobsacB_Pgap_cg0832 integrado, foram selecionados ao chapear a mistura de conjugação em LB ágar suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. Os transconjugantes resistentes à canamicina foram traçados fora nas placas de LB ágar suplementadas com canamicina (25 mg/l) e incubados a 33°C por 24 horas. Os mutantes em que o plasmídio tinha sido excisado em consequência de um segundo evento de recombinação foram selecionados ao cultivar os clones de maneira não seletiva no meio LB líquido 30 horas, e então foram traçados em LB ágar suplementado com 10% de sacarose e incubados a 33°C por 24 horas.

[000190] O plasmídio pK18mobsacB_Pgap_cg0832, tal como o plasmídio de partida pK18mobsacB, contém uma cópia do gene sacB que codifica para a levansucrase de Bacillus subtilis, além do gene de resistência à canamicina. A expressão induzível por sacarose do gene sacB conduz à formação de levansucrase que catalisa a síntese do produto levana que é tóxico a C. glutamicum. Consequentemente, somente os clones em que o pK18mobsacB_Pgap_cg0832 integrado foi excisado em consequência de um segundo evento de recombinação crescem no LB ágar suplementado com sacarose. Dependendo da posição do segundo evento de recombinação com relação ao sítio de mutação, a mutação é incorporada durante a excisão ou o cromossoma hospedeiro permanece no estado original.

[000191] Subsequentemente, um clone foi identificado em que a troca desejada, isto é, a incorporação do cassete Pgap_cg0832 no cromossoma, tinha ocorrido.

[000192] Para essa finalidade, foram verificados 50 clones com o fenótipo "crescimento na presença de sacarose" e "nenhum crescimento na presença de canamicina" para ver se há a integração do cassete Pgap_cg0832 ao usar a reação de cadeia de polimerase (PCR).

[000193] Para isto, os seguintes oligonucleotídeos sintéticos (primers) foram usados:
PRIMER CG0832_1.P (SEQ ID NO.: 28):
5' GCTGGAATACGGAGTGAACC 3'
PRIMER CG0832_2.P (SEQ ID NO.: 29):
5' GGGATTGCCCAAGGGATAAG 3'

[000194] Os primers mostrados foram sintetizados pela MWG Biotech (Ebersberg, Germany). Os primers cg0832_1.p e cg0832_2.p permitem que um fragmento de DNA de 570 bp seja amplificado no caso do arranjo do tipo selvagem. O tamanho do amplicon é de 1059 bp no caso da integração do construto Pgap_cg0832 no cromossoma.

[000195] As reações de PCR foram executadas ao usar o kit de núcleo Taq PCR da Quiagen (Hilden, Germany), que compreende a polimerase de DNA de Taq de Thermus aquaticus, em um aparelho Eppendorf Mastercycler (Hamburg, Germany). As condições na mistura de reação foram ajustadas de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de PCR foi sujeitada em primeiro lugar a uma desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos. Isto foi seguido por 35 repetições de uma etapa de desnaturação a 94°C por 30 segundos, uma etapa de ligação dos primers ao DNA a 57°C por 30 segundos, e uma etapa de extensão para estender os primers a 72°C por 60s. Após a etapa final de extensão a 72°C por 5 minutos, os produtos amplificados desta maneira foram examinados por meio de eletroforese em um gel de agarose.

[000196] Desta maneira, foram identificados mutantes que contêm o cassete Pgap_cg0832 em uma forma integrada, com uma das cepas obtidas sendo nomeada DM1933_Pgap_cg0832 de C. glutamicum.

Exemplo 7: Produção de L-lisina

[000197] A cepa DM1933_Pgap_cg0832 de C. glutamicum obtida no Exemplo 6 e a cepa de partida DM1933 foram cultivadas em um meio nutriente apropriado para a produção de lisina, e o teor de lisina no sobrenadante da cultura foi determinado.

[000198] Para esta finalidade, as cepas foram em primeiro lugar incubadas em uma placa de ágar (ágar do cérebro-coração) a 33°C por 24 horas. A partir dessa cultura da placa de ágar, uma pré-cultura foi inoculada (10 ml do meio em um frasco cônico de 100 ml). O meio usado para a pré-cultura e a cultura principal era o meio MM (vide a Tabela 4).

[000199] CSL, MOPS e a solução de sal foram ajustados a um pH 7 com amônia aquosa e aubmetidos à autoclave. As soluções estéreis de substrato e vitamina e o CaCO3 submetido à autoclave seco foram então adicionados.

[000200] A pré-cultura foi incubada em um agitador a 250 rpm e a 33°C por 24 horas. Uma cultura principal foi inoculada dessa pré-cultura de maneira tal que o OD de partida (660 nm) da cultura principal fosse um OD de 0,1.

[000201] A cultura foi executada em volumes de 10 ml em um frasco cônico de 100 ml com defletores a uma temperatura de 33°C e uma umidade de 80%.

[000202] Depois de 20 e 40 horas (h) o OD a um comprimento de onda de medição de 660 nm foi determinado ao usar um instrumento Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). A quantidade de lisina produzida foi determinada por meio de cromatografia de troca de íons e pela derivatização com detecção de ninidrina, ao usar um analisador de aminoácido pós-coluna da Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany). A concentração de trealose foi determinada por meio de HPLC, ao usar um analisador da Dionex GmbH (65510 Idstein, Germany). A Tabela 6 indica o resultado da experiência.
Tabela 6: Produção da medição da concentração de L-lisina e trealose. Todos os valores são médias de 3 experiências independentes com as cepas listadas; n.d. = não determinado.

[000203] O resultado indica que a trealose não é mais produzida como um produto secundário quando a lisina é produzida a partir da trealose ao usar uma cepa em que somente a expressão das subunidades do importador de trealose codificadas por cg0832 e por cg0831 (em ambos os casos uma subunidade de permease) é realçada. Além disso, é evidente que o rendimento do produto desejado (L-lisina) é aumentado.

Claims (9)

1. Microrganismo da espécie Corynebacterium glutamicum que produz e/ou secreta um composto orgânico-químico, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é transformado com um construto que compreende a sequência codificante da SEQ ID NO: 7 ou 19 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam um polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 8 ou 20,
   em que o construto compreende uma ou mais das seguintes características:

   • a) a sequência codificante está sob o controle de um promotor mais forte no microrganismo usado para o método que o promotor original do gene;
   • b) o construto é um plasmídeo com número de cópias aumentado;
   • c) o construto compreende um sítio de ligação ao ribossomo que é mais forte no microrganismo utilizado para o método do que o sítio original de ligação ao ribossomo do gene;
   • d) a sequência codificante é otimizada para Corynebacterium glutamicum;
   • e) o construto é otimizado para reduzir estruturas secundárias de mRNA no mRNA transcrito do construto;
   • f) o construto é otimizado para reduzir terminadores de RNA polimerase no mRNA transcrito do construto;
   • g) o construto compreende sequências estabilizadoras de mRNA;

   e em que o polipeptídeo codificado pela sequência codificante é uma subunidade de um complexo proteico, com a atividade de um importador de trealose, tem a atividade de uma permease e em que o microrganismo é capaz de absorver a trealose do meio.
2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo ter, em comparação com a cepa de partida particular, não apenas a expressão aumentada de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 7, 19, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 8 ou 20, mas também uma expressão aumentada de pelo menos um polinucleotídeo selecionado do grupo (a) a (e):

   • a) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou 13 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 2 ou 14;
   • b) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 3 ou 15 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 4 ou 16;
   • c) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 5 ou 17 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 6 ou 18;
   • d) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 9 ou 21 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 10 ou 22;
   • e) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 11 ou 23 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 12 ou 24.
3. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o microrganismo tem, em comparação com o cepa de partida particular, não apenas a expressão aumentada de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 7, 19, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 8 ou 20, mas também uma expressão aumentada de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 9, 21, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 10 ou 22.
4. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o microrganismo tem, em comparação com a cepa de partida particular, não apenas a expressão aumentada de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 7, 19, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam um polipeptídeo com uma sequência aminoácidos representada na SEQ ID NO: 8 ou 20, mas também uma expressão aumentada dos polinucleotídeos (a) e (b):

   • a) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1, 13, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 2 ou 14;
   • b) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 3, 15 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo representada na SEQ ID NO: 4 ou 16;

   e também do polinucleotídeo (d) um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 9, 21, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas, que codificam um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 10 ou 22.
5. Microrganismo, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microrganismo tem, em comparação com a cepa de partida particular, não apenas a expressão aumentada de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 7, 19, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 8 ou 20, mas também um aumento da expressão dos polinucleotídeos a), b), c), d) e e) como definido na reivindicação 2.
6. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o composto orgânico-químico é selecionado do grupo que consiste em L-aminoácidos proteinogênicos, L-ornitina e L-homoserina.
7. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido proteinogênico é selecionado do grupo que consiste em L-lisina, L-metionina, L-valina, L-prolina, L-glutamato e L-isoleucina, de preferência a L-lisina.
8. Método para a produção fermentativa de um composto orgânico-químico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   • (a) cultivar o microrganismo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em um meio apropriado, resultando em um caldo de fermentação, e
   • (b) enriquecer o composto orgânico-químico no caldo de fermentação de (a).
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento de trealose no caldo de fermentação é reduzido ou evitado.

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