CN103459412A

CN103459412A - 发酵制备有机化合物的微生物和方法

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Publication number: CN103459412A
Application number: CN2012800163883A
Authority: CN
Inventors: S·汉斯; B·巴特; A·雷特; W·克莱斯; R·克雷默; G·赛博尔德; A·亨里希
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2011-04-04
Filing date: 2012-03-27
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-03-27
Also published as: MX2013011452A; US20160244490A1; EP2694536B1; MX342758B; WO2012136506A2; CN103459412B; US9359413B2; WO2012136506A3; RU2013148820A; BR112013025624A2; DE102011006716A1; EP2694536A2; BR112013025624B1; US20120252075A1

Abstract

本发明涉及产生和/或分泌有机化合物的微生物，其中所述微生物与特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的一或多个蛋白质亚基表达增加，所述微生物能从培养基中摄取海藻糖；本发明还涉及使用本发明的微生物制备有机化合物的方法，其中海藻糖在发酵液中的积累被降低或避免。

Description

发酵制备有机化合物的微生物和方法

本发明涉及产生和/或分泌有机化合物的微生物，所述微生物的海藻糖输入蛋白(importer)表达增加，本发明还涉及使用本发明的微生物制备有机化合物的方法。

现有技术

L-氨基酸用于人用药物、制药工业、食品工业，特别用于动物营养。

已知L-氨基酸如L-赖氨酸是通过棒杆菌、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株或者肠杆菌科菌株、特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的发酵产生的。由于巨大的经济重要性，持续进行着关于改良生产方法的工作。方法的改良涉及发酵技术措施如搅拌和供氧，或者涉及营养培养基的组成成分，例如发酵期间的糖浓度，或者涉及产物形式的加工，例如离子交换层析，或者涉及微生物自身的固有性质。

用于改良这些微生物的生产性质的方法是诱变、选择及突变体选择等方法。以此方式获得对抗代谢物有抗性或对重要调控代谢物是营养缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。已知的抗代谢物是赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也已经用于棒杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌或者肠杆菌属、特别是大肠杆菌的生产L－氨基酸的菌株改良，通过修饰、即增强或弱化各个氨基酸生物合成基因及研究对氨基酸生产的作用而进行改良。

许多细菌的染色体的核苷酸序列已经被公开。

谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组的核苷酸序列在Ikeda and Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology62,99-109(2003))、EP1108790及Kalinowski et al.(Journal of Biotechnolgy104(1-3),(2003))中描述。

谷氨酸棒杆菌R基因组的核苷酸序列在Yukawa et al.(Microbiology153(4):1042-1058(2007))中描述。

Corynebacterium efficiens基因组的核苷酸序列在Nishio et al(GenomeResearch.13(7),1572-1579(2003))中描述。

白喉棒杆菌（Corynebacterium diphteriae）NCTC13129基因组的核苷酸序列由Cerdeno-Tarraga et al.(Nucleic Acids Research31(22),6516-6523(2003))描述。

Corynebacterium jeikeum基因组的核苷酸序列由Tauch et al.(Journal ofBacteriology187(13),4671-4682(2005))描述。

关于发酵生产L-氨基酸的各个方面的综述可见于R.Faurie and J.Thommel in Advances in Biochemical Engineering Biotechnology,volume79(Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg(Germany)2003)描述。

在谷氨酸棒杆菌的工业发酵上清中发现大量分泌的海藻糖。这种外部积累的海藻糖不被细胞代谢再循环。因此，就工业发酵中的最大可实现的产物形成及在发酵罐中达到的生物量浓度而言，所述外部积累的海藻糖均代表显著的损失。

外部积累的海藻糖的利用是期望的主要目标。实现这个目标具有多个可能的正面结果：(1)在发酵结束时保持未使用的底物碳的利用，(2)增加发酵中可实现的生物量，(3)增加在生物技术生产过程中的产物产量，即氨基酸的产生，(4)在发酵结束时避免产物上清中不希望的污染。

因此，本发明的一个目的是提供发酵制备有机化合物的改良的微生物和方法。

本发明提供了产生和/或分泌有机化合物的微生物，其中所述微生物与特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖输入蛋白(importer)活性的ABC转运蛋白的一或多个蛋白质亚基的表达增加，所述微生物能从培养基中摄取海藻糖。

本发明进一步提供了发酵制备有机化合物的方法，包括如下步骤：

a)将上述本发明的微生物在合适的培养基中培养，获得发酵液，及

b)积累步骤a)的发酵液中的所述有机化合物；

其中所述发酵液中海藻糖的积累被降低或避免。优选使所述发酵液中海藻糖的积累与特定微生物起始菌株相比降低50%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，95%或更多，98%或更多，99%或更多，最优选99.5%或更多。

本发明在如下方面是有利的，即(1)海藻糖形式的底物碳在本发明中被利用，而若在其他情况中，海藻糖形式的底物碳在发酵结束时在发酵液中保持未被利用；(2)发酵中可达到的生物量是增加的；(3)生物技术生产过程中的产物产量即氨基酸的生产增加；及(4)避免了在发酵结束时产物上清中不希望的污染。

令人惊奇地，已经在谷氨酸棒杆菌中鉴定了海藻糖摄取系统。使用相应的生产菌株，编码海藻糖输入系统的操纵子的所有基因的增强表达导致靶产物(有机化合物)增加。令人惊奇地，当仅一个亚基(例如通透酶亚基)被表达时也发现相应的海藻糖摄取。本发明因此提供了这样的微生物，其细胞通过质膜中的活性转运系统摄取外部积累的海藻糖。事实是谷氨酸棒杆菌具有代谢细胞质中海藻糖的代谢能力，导致本发明的上述优势。优选地，所述微生物与所述微生物的特定起始菌株相比能降低、特别是避免介质(培养基)中海藻糖的积累。

在所述微生物的一个优选实施方案中，具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白衍生自谷氨酸棒杆菌。

具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的蛋白质亚基如下：整合膜蛋白(通透酶)，ATP-结合及水解(ATPase)蛋白，及周质(或脂蛋白)底物结合蛋白。ABC转运蛋白的组成如下：两个通透酶，两个ATPase及一个周质(或脂蛋白)底物结合蛋白。所述两个通透酶和ATPase在每种情况中可具有不同的氨基酸序列。

本发明的微生物的一个优选实施方案与特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的所有蛋白质亚基的表达均增加。这意味着优选具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的通透酶、ATPase和周质亚基的表达均增加，即是过表达的。

在另一实施方案中，本发明的微生物与特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的一或多个蛋白质亚基的表达增加。此外，编码具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的亚基的操纵子的基因的表达可增加，所述基因不一定编码ABC转运蛋白亚基本身。

更加优选地提供了这样的微生物，所述微生物与特定的起始菌株相比，其中选自a)-f)中的至少一种多核苷酸的表达增加：

a)编码具有与SEQ ID NO:2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

b)编码具有与SEQ ID NO:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

c)编码具有与SEQ ID NO:6或18所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

d)编码具有与SEQ ID NO:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

e)编码具有与SEQ ID NO:10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

f)编码具有与SEQ ID NO:12或24所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。

优选地进一步提供了这样的微生物，所述微生物与特定的起始菌株相比，其中选自a)、b)、d)、e)中的至少一种多核苷酸的表达增加：

e)编码具有与SEQ ID NO:10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。

在进一步优选的实施方案中，所述微生物与特定的起始菌株相比，其中选自b)、d)和e)中的至少一种多核苷酸的表达增加：

特别优选地，所述微生物与特定的起始菌株相比，其中如下多核苷酸的表达增加：

d)编码具有与SEQ ID NO:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和/或

进一步地，所述微生物的优选的实施方案与特定起始菌株相比，其中多核苷酸a)和b)的表达增加：

及多核苷酸d)和/或e)的表达增加：

进一步优选地，本发明提供了这样的微生物，其与特定的起始菌株相比，其中多核苷酸a)、b)、c)、d)和e)及适当时f)的表达增加。

有机化合物在本发明中是指维生素，如硫胺(维生素B1)，核黄素(维生素B2)，氰钴胺(维生素B12)，叶酸(维生素M)，生育酚(维生素E)或者烟酸/烟碱，核苷或核苷酸如S-腺苷-甲硫氨酸，肌苷5’-一磷酸和鸟苷5’-一磷酸，L-氨基酸，或者胺如尸胺。优选产生L-氨基酸及含有其的产物。

由本发明的微生物产生和/或分泌的有机化合物优选选自维生素，核苷或核苷酸，L-氨基酸和胺。

术语L-氨基酸包括蛋白质氨基酸及L-鸟氨酸和L-高丝氨酸。蛋白质L-氨基酸是指在天然蛋白质中存在的L-氨基酸，即在微生物、植物、动物和人的蛋白质中。蛋白质氨基酸包括L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-精氨酸，L-脯氨酸，及在一些情况中L-硒代半胱氨酸和L-吡咯赖氨酸。

所述有机化合物特别优选选自蛋白质L-氨基酸，L-鸟氨酸和L-高丝氨酸。特别优选选自L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-异亮氨酸，特别是L-赖氨酸的蛋白质L-氨基酸。

在下文提及的术语氨基酸或L-氨基酸也包含其盐，例如在L-赖氨酸的情况中的赖氨酸一盐酸盐或者赖氨酸硫酸盐。

所述微生物优选选自细菌、酵母和真菌，特别优选棒杆菌属细菌和肠杆菌科细菌，特别优选的是谷氨酸棒杆菌。

在进一步优选的实施方案中，编码具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的蛋白质亚基的多核苷酸的表达通过选自如下的一或多种措施而增加：

a)所述基因的表达在启动子控制下，所述启动子与所述基因的原始启动子相比在用于所述方法的微生物中的作用强；

b)增加编码具有海藻糖输入蛋白活性的多肽的基因的拷贝数，优选通过将所述基因以增加的拷贝数插入质粒中和/或通过将所述基因的至少一个拷贝整合进所述微生物的染色体中而进行；

c)使用核糖体结合位点表达所述基因，所述核糖体结合位点与所述基因的原始核糖体结合位点相比在用于所述方法的微生物中作用强；

d)所述基因的表达通过优化用于所述方法的微生物密码子选择而实现；

e)所述基因的表达通过降低由所述基因转录的mRNA中的mRNA二级结构而实现；

f)所述基因的表达通过消除由所述基因转录的mRNA中的RNA聚合酶终止子序列而实现；

g)所述基因的表达通过在由所述基因转录的mRNA中使用mRNA稳定化序列而实现。

上述增加表达的措施可以合适方式组合。优选通过组合选自a)、b)和c)的至少两种措施、特别优选组合措施a)和b)，以增加编码具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白的蛋白质亚基的多核苷酸的表达。

如上所述，本发明还涉及发酵制备有机化合物的方法，包括如下步骤：

a)将上述本发明微生物在合适培养基中培养，获得发酵液，及

b)积累步骤a)的发酵液中的所述有机化合物；

其中所述发酵液中海藻糖的积累被降低或避免。

优选地，与特定的微生物起始菌株相比，本发明的微生物使所述发酵液中海藻糖的积累降低50%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，95%或更多，98%或更多，99%或更多，及最优选99.5%或更多。

在优选的方法中，根据如下I-VIII的定义之一，用于培养的微生物与特定起始菌株相比一或多个多核苷酸的表达增加：

I：与特定起始菌株相比选自a)-f)中的多核苷酸的表达增加：

f)编码具有与SEQ ID NO:12或24所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

II：与特定起始菌株相比选自a)、b)、d)和e)中的多核苷酸的表达增加；

III：与特定起始菌株相比选自b)、d)和e)中的多核苷酸的表达增加；

IV：与特定起始菌株相比多核苷酸d)和/或e)的表达增加；

V：与特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、d)和e)的表达增加；

VI：与特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、d)的表达增加；

VII：与特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、e)的表达增加；

VIII：与特定起始菌株相比多核苷酸a)-e)及适当时f)的表达增加。

本发明优选从所述发酵液中产生液体或固体形式产物。

如上所述，术语微生物包括细菌、酵母和真菌。在细菌中，可以特别提及的是棒杆菌属和肠杆菌科细菌。

在棒杆菌属中，优选基于如下物种的菌株：

Corynebacterium efficiens，例如模式菌株DSM44549，

谷氨酸棒杆菌，例如模式菌株ATCC13032或者菌株R，及

产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes），例如菌株ATCC6871，

特别优选谷氨酸棒杆菌物种。

本领域已知一些代表性谷氨酸棒杆菌物种，其也有不同的名称。这些菌株包括如：

菌株ATCC13870，称作嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacteriumacetoacidophilum），

菌株DSM20137，称作百合棒杆菌（Corynebacterium lilium），

菌株ATCC17965，称作Corynebacterium melassecola，

菌株ATCC14067，称作黄色短杆菌（Brevibacterium flavum），

菌株ATCC13869，称作乳发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum），及

菌株ATCC14020，称作Brevibacterium divaricatum。

术语“产谷氨酸小球菌（Micrococcus glutamicus）”同样用于谷氨酸棒杆菌。

Corynebacterium efficiens的一些代表性物种在本领域也称作嗜热产氨棒杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes），例如菌株FERM BP-1539。

用于过表达海藻糖输入蛋白的微生物或菌株(起始菌株)优选已经具有在细胞中浓缩希望的L-氨基酸或者将其分泌进周围营养培养基中并在此积累其的能力。在下文也使用“产生”这个词语。更特别地，用于过表达的菌株具有在≤(不超过)120小时、≤96小时、≤48小时、≤36小时、≤24小时或者≤12小时内在细胞中浓缩或者在营养培养基中积累≥(至少)0.10g/l、≥0.25g/l、≥0.5g/l、≥1.0g/l、≥1.5g/l、≥2.0g/l、≥4g/l或者≥10g/l希望的化合物的能力。起始菌株优选是通过诱变和选择、通过重组DNA技术或者通过组合这两种方法产生的菌株。

本领域技术人员理解适于本发明的微生物也可以这样获得，即首先在野生型菌株中如在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032中或者在菌株ATCC14067中过表达海藻糖输入蛋白，然后通过本领域描述的进一步遗传措施使得所述微生物产生希望的L-氨基酸。仅用提及的多核苷酸转化野生型菌株不构成本发明的措施。

举例的分泌或产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株是：

谷氨酸棒杆菌MH20-22B(=DSM16835)，在Menkel et al.(Applied andEnvironmental Microbiology55(3),684-688(1989))中描述，保藏号为DSM16835；

谷氨酸棒杆菌DM1729，在Georgi et al.(Metabolic Engineering7,291-301(2005))和EP1717616A2中描述，保藏号为DSM17576；

谷氨酸棒杆菌DSM13994，在US6,783,967中描述；及

谷氨酸棒杆菌DM1933，在Blombach et al.(Appl Environ Microbiol.2009Jan;75(2):419-27)中描述。

举例的分泌或产生L-赖氨酸的Corynebacterium efficiens物种菌株是：

嗜热产氨棒杆菌AJ12521(=FERM BP-3304)，在US5,250,423中描述。

产生L-赖氨酸的微生物典型具有反馈抗性或者去敏感的天冬氨酸激酶。反馈抗性天冬氨酸激酶是指这样的天冬氨酸激酶(LysC)，其与野生形式(野生型)对比示出对赖氨酸与苏氨酸的混合物或者AEC(氨乙基半胱氨酸)与苏氨酸的混合物或者单独的赖氨酸或者单独的AEC的抑制作用具有较低的敏感性。编码与野生型相比去敏感的这些天冬氨酸激酶的基因或等位基因也称作lysC^FBR等位基因。在谷氨酸棒杆菌物种的天冬氨酸激酶的情况中，合适的野生型是菌株ATCC13032。本领域描述了编码与野生型蛋白质相比具有氨基酸取代的天冬氨酸激酶变体的许多lysC^FBR等位基因。棒杆菌属细菌中的lysC基因也被称作ask基因。由肠杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶也称作天冬氨酸激酶III。

含有关于谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶蛋白质中氨基酸取代导致去敏感化的信息的详细列表在WO2009141330中描述。优选的天冬氨酸激酶变体携带选自如下的氨基酸取代：在第380位氨基酸位置的L-异亮氨酸取代为L-苏氨酸，及任选在第381位置的L-苯丙氨酸取代为L-丝氨酸，在第311位的L-异亮氨酸取代为L-苏氨酸，及在第279位的L-苏氨酸取代为L-丙氨酸。

含有关于大肠杆菌天冬氨酸激酶III蛋白质中氨基酸取代导致对L-赖氨酸抑制作用去敏感化的信息的详细列表在EP0834559A1第三页(第29-41行)描述。优选的天冬氨酸激酶变体含有在氨基酸序列第323位L-天冬氨酸代替甘氨酸，和/或第318位L-异亮氨酸代替L-甲硫氨酸。

举例的分泌或产生L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌物种的菌株是：

谷氨酸棒杆菌DSM17322，在WO2007/011939中描述。

举例的产生或分泌L-色氨酸的已知代表性棒杆菌细菌菌株是：

谷氨酸棒杆菌K76(=Ferm BP-1847)，在US5,563,052中描述；

谷氨酸棒杆菌BPS13(=Ferm BP-1777)，在US5,605,818中描述；及

谷氨酸棒杆菌Ferm BP-3055，在US5,235,940中描述。

举例的产生或分泌L-缬氨酸的已知代表性棒杆菌细菌菌株是：

乳发酵短杆菌FERM BP-1763，在US5,188,948中描述；

乳发酵短杆菌FERM BP-3007，在US5,521,074中描述；

谷氨酸棒杆菌FERM BP-3006，在US5,521,074中描述；及

谷氨酸棒杆菌FERM BP-1764，在US5,188,948中描述。

举例的产生或分泌L-异亮氨酸的已知代表性棒杆菌细菌菌株是：

黄色短杆菌FERM BP-760，在US4,656,135中描述；

黄色短杆菌FERM BP-2215，在US5,294,547中描述；及

谷氨酸棒杆菌FERM BP-758，在US4,656,135中描述。

举例的产生或分泌L-高丝氨酸的已知代表性棒杆菌细菌菌株是：

产谷氨酸小球菌ATCC14296，在US3,189,526中描述；

产谷氨酸小球菌ATCC14297，在US3,189,526中描述。

产生或分泌尸胺的微生物在例如WO2007/113127中描述。

具有海藻糖输入蛋白活性的ABC转运蛋白是指具有多个亚基的蛋白质或蛋白质复合物，其催化海藻糖从周围环境中转运至微生物的细胞中。

ABC转运蛋白构成最大的膜蛋白家族之一，其共同的结构元件是ATP-结合盒，及其主动转运特定底物穿过细胞膜。转运ABC转运蛋白的对抗浓度梯度需要的能量通过结合并水解ATPase单位上的ATP而产生。

原核ABC转运蛋白的结构通常由三部分组成：两个整合膜蛋白(通透酶)，每个蛋白均具有5-7个跨膜节段，两个结合并水解ATP(ATPase)的另外的蛋白质，及一个周质底物结合蛋白(或者锚定膜的脂蛋白)。所述三部分的一些基因构成操纵子。因此ABC转运蛋白首先属于初级主动转运蛋白(primarily active transporters)，其次属于膜结合的ATPase。

公开的数据库如UniProtKB(Universal Protein Resource Knowledgebase)数据库含有极为不同的生物体的ABC转运蛋白的描述。UniProtKB数据库由UniProt consortium维护，其包括European Bioinformatics Institute(EBI,Wellcome Trust,Hinxton Cambridge,United Kingdom)、Swiss Institute ofBioinformatics(SIB,Centre Medical Universitaire,Geneva,Switzerland)及Protein Information Resource(PIR,Georgetown University,Washington,DC,US)。

海藻糖输入蛋白的基因可以借助于聚合酶链反应(PCR)使用合适的引物自生物体分离。操作指南可见于Newton and Graham(SpektrumAkademischer Verlag,Heidelberg,Germany,1994)的“PCR”实验室手册及在WO2006/100211中第14-17页描述。

本发明利用来自棒杆菌的海藻糖输入蛋白的基因。优选使用编码具有海藻糖输入蛋白活性的多肽的基因，其氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10及适当时SEQ ID NO:12或14、16、18、20、22、24的氨基酸序列≥(至少)50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%、≥92%、≥94%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%相同。在本发明的研究中，鉴定了编码谷氨酸棒杆菌的海藻糖输入蛋白的操纵子。编码谷氨酸棒杆菌中海藻糖输入蛋白的操纵子具有多个读框或基因。

表1概括了关于编码谷氨酸棒杆菌海藻糖输入蛋白的操纵子的读框的信息。

表1：编码谷氨酸棒杆菌海藻糖输入蛋白的操纵子的基因/读框

操纵子中读框的名称	编码	长度(氨基酸残基数)	SEQ ID NO:
				cg0835(msik2)	ATPase	332	2
cg0834	周质底物结合蛋白	424	4
				cg0833	未知	151	6
cg0832	通透酶	344	8
				cg0831	通透酶	278	10
cg0830	假定的读框	74	12

读框的基因组排列在图1中示出，该区域的序列以SEQ ID NO:25表示。

从化学的观点上看，基因是多核苷酸。编码蛋白质/多肽的多核苷酸在本文与术语“基因”同义使用。

一个优选的微生物实施方案过表达编码选自如下a)-f)的一或多种多肽的一或多个基因：

a)

i)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成或包含其的多肽；

ii)具有与i)所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽，所述多肽是具有海藻糖输入蛋白活性的蛋白质复合物的亚基；

iii)具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比缺失、取代、插入和/或添加1-66、1-33、1-17、1-7个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，所述多肽是具有海藻糖输入蛋白活性的蛋白质复合物的亚基；

b)

i)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成或包含其的多肽；

iii)具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相比缺失、取代、插入和/或添加1-85、1-42、1-21、1-9个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，所述多肽是具有海藻糖输入蛋白活性的蛋白质复合物的亚基；

c)

i)由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成或包含其的多肽；

iii)具有与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列相比缺失、取代、插入和/或添加1-30、1-15、1-6、1-3个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，所述多肽是具有海藻糖输入蛋白活性的蛋白质复合物的亚基；

d)

i)由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成或包含其的多肽；

iii)具有与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列相比缺失、取代、插入和/或添加1-69、1-34、1-17、1-7个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，所述多肽是具有海藻糖输入蛋白活性的蛋白质复合物的亚基；

e)

i)由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成或包含其的多肽；

iii)具有与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列相比缺失、取代、插入和/或添加1-56、1-28、1-14、1-6个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，所述多肽是具有海藻糖输入蛋白活性的蛋白质复合物的亚基；

f)

i)由SEQ ID NO:12所示氨基酸序列组成或包含其的多肽；

iii)具有与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列相比缺失、取代、插入和/或添加1-15、1-8、1-4、1-2个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，所述多肽是具有海藻糖输入蛋白活性的蛋白质复合物的亚基。

优选的实施方案包括与上述氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同性的变体，即至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的氨基酸位置与上述氨基酸序列的那些位置是相同的。相同性百分比优选在氨基酸或核酸全长计算。本领域技术人员有许多基于算法多样性的程序，用于序列对比。在本文中，Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法产生特别可靠的结果。程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351-360,1987,Higgins et al.,CABIOS,51989:151-153)或者程序Gap和BestFit[Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970))及Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))]，其是GCG软件包的一部分[Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)]，可用于序列的排列对比。上文列出的序列相同性百分比优选是使用GAP程序对完整序列计算的。

在适当的情况中，优选保守氨基酸取代。在芳香族氨基酸的情况中，保守取代是其中苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此取代。在疏水性氨基酸的情况中，保守取代是其中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此取代。在极性氨基酸的情况中，保守取代是其中谷氨酰胺和天冬酰胺彼此取代。在碱性氨基酸的情况中，保守取代是其中精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此取代。在酸性氨基酸的情况中，保守取代是其中天冬氨酸和谷氨酸彼此取代。在含有羟基的氨基酸的情况中，保守取代是其中丝氨酸和苏氨酸彼此取代。

此外可以使用这样的多核苷酸，其在严格条件下与和SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11互补的核苷酸序列杂交，优选与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11的编码区杂交，且编码是海藻糖输入蛋白一部分的多肽。

关于核酸或多核苷酸杂交的指导可见于来自Boehringer MannheimGmbH(Mannheim,Germany,1993)的手册“The DIG System Users Guide forFilter Hybridization”及在Liebl et al.(International Journal of SystematicBacteriology41:255-260(1991))中描述。杂交在严格条件下发生，是指仅在这样的情况下形成杂交体，即其中探针即包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、优选SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11的编码区互补的核苷酸序列的多核苷酸与靶序列即由所述探针处理或鉴定的多核苷酸具有至少70%的相同性。已知杂交、包括洗涤步骤的严格性受改变缓冲液成分、温度和盐浓度的影响或由这些条件决定。杂交反应通常用与洗涤步骤相比相对较低的严格条件进行(Hybaid Hybridisation Guide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。

例如，可将温度为大约50℃-68℃的5×SSC缓冲液用于杂交反应。在此，探针也可以与和所用探针的核苷酸序列具有低于70%相同性的多核苷酸杂交。这种杂交体不太稳定，可通过在严格条件下洗涤除去。这可以例如通过将盐浓度降低至2×SSC或1×SSC及在适当情况中随后降低至0.5×SSC而实现(The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation,Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany,1995)，温度为大约50℃–68℃，大约52℃–68℃，大约54℃–68℃，大约56℃–68℃，大约58℃–68℃，大约60℃–68℃，大约62℃–68℃，大约64℃–68℃，大约66℃–68℃。优选温度范围是大约64℃–68℃或者大约66℃–68℃。任选可以降低盐浓度至相应于0.2×SSC或0.1×SSC的浓度。所述SSC缓冲液任选含有十二烷基硫酸钠(SDS)，浓度为0.1%。通过以大约1–2℃的梯度从50℃至68℃逐步增加杂交温度，可以分离与所用探针的序列或互补序列至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%及适当时100%相同及编码是海藻糖输入蛋白一部分的多肽的多核苷酸片段。关于杂交的进一步的操作指南可以在市场上以“试剂盒”形式获得(例如来自Roche Diagnostics GmbH的DIG Easy Hyb，Mannheim,Germany,Catalogue No.1603558)。

对于本发明，将编码海藻糖输入蛋白的一部分的基因在产生希望的氨基酸的微生物或者起始或亲代菌株中过表达。

过表达通常是指与起始菌株（亲代菌株）或野生型菌株(如果是起始菌株的话)相比核糖核酸、蛋白质(多肽)或者酶的胞内浓度或活性的增加。起始菌株(亲代菌株)是指对其已经进行了导致过表达的菌株。

对于过表达，优选重组过表达方法。这些方法包括其中使用在体外提供的DNA分子制备微生物的所有方法。举例的这种DNA分子包括启动子、表达盒、基因、编码区等。其通过转化、缀合、转导或细丝的方法转移进希望的微生物中。

过表达使相应多肽的活性或浓度基于在导致过表达的措施实施之前的菌株中所述多肽的活性或浓度通常增加至少10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%，优选至多1000%、2000%、4000%、10000%或20000%。

过表达是通过本领域可利用的多种方法实现的。这些方法包括增加拷贝数或者修饰指导或控制基因表达的核苷酸序列。基因的转录由启动子控制，任选由抑制(阻抑物蛋白)或促进(激活物蛋白)转录的蛋白质控制。形成的RNA的翻译由核糖体结合位点和起始密码子控制。包含启动子和核糖体结合位点及任选起始密码子的多核苷酸或DNA分子也称作表达盒。

可以通过在微生物的细胞质中复制的质粒来增加拷贝数。为此，本领域针对极为不同的微生物类别描述了许多质粒，所述质粒可用于设定希望的基因拷贝数的增加。适于肠杆菌属的质粒在例如Molecular Biology,Labfax(Ed.:T.A.Brown,Bios Scientific,Oxford,UK,1991)中描述。适于棒杆菌属的质粒在例如Tauch et al.(Journal of Biotechnology104(1-3),27-40,(2003))或者Stansen et al.(Applied and Environmental Microbiology71,5920-5928(2005))中描述。

拷贝数可以通过将进一步的拷贝导入微生物的染色体中而增加至少一个(1)拷贝。适于棒杆菌的方法在例如专利WO03/014330、WO03/040373和WO04/069996中描述。举例的适于肠杆菌属的方法是将基因拷贝插入噬菌体的att位点中(Yu and Court,Gene223,77-81(1998))，借助于噬菌体Mu的染色体扩增，如EP0332448所述，或者借助于条件复制的质粒的基因置换方法，如Hamilton et al.(Journal of Bacteriology174,4617–4622(1989))或Link et al.(Journal of Bacteriology179,6228-6237(1997))所述。

基因表达可通过使用强启动子进一步增加，所述启动子与被表达的基因功能性连接。优选使用比天然启动子即存在于野生型或亲代菌株中的启动子强的启动子。为此，本领域有许多可利用的方法。

“功能性连接”在本文中是指启动子与基因的相继排列，导致所述基因表达并控制其表达。

适于棒杆菌属的启动子可以见于Morinaga et al.(Journal ofBiotechnology5,305-312,(1987))、专利文献EP0629699A2、US2007/0259408A1、WO2006/069711、EP1881076A1和EP1918378A1，及参见如"Handbook of Corynebacterium glutamicum"(Eds.:Lothar Eggelingand Michael Bott,CRC Press,Boca Raton,US(2005))或者"Corynebacteria,Genomics and Molecular Biology"(Ed.:Andreas Burkovski,Caister AcademicPress,Norfolk,UK(2008))的综述。举例的使得可以受控的即可诱导或可抑制的表达的启动子在例如Tsuchiya and Morinaga(Bio/Technology6,428-430(1988))中描述。

这种启动子或表达盒典型以与基因编码区的起始密码子的第一个核苷酸上游相隔1-1000个、优选1-500个核酸应用。

另外可以将多个启动子置于希望的基因的上游或者将其与被表达的基因功能性连接，以此方式实现增加的表达。见例如专利WO2006/069711所述。

大肠杆菌启动子的结构为本领域熟知。因此可以通过核苷酸的一或多个取代和/或一或多个插入和/或一或多个缺失而修饰其序列以增加启动子的强度。例如可见"Herder Lexikon der Biologie"(Spektrum AkademischerVerlag,Heidelberg,Germany(1994))所述。

举例的增加在棒杆菌中表达的启动子的修饰可见于US6,962,805B2及出版物Vasicováet al.(Bacteriol.1999Oct;181(19):6188-91.)所述。通过取代同源启动子增强靶基因在例如EP1697526B1中描述。

谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点的结构也为本领域熟知，在例如Amador(Microbiology145,915-924(1999))及在遗传学手册和教科书如"Gene undKlone"(Winnacker,Verlag Chemie,Weinheim,Germany(1990))或者"Molecular Genetics of Bacteria"(Dale and Park,Wiley and Sons Ltd.,Chichester,UK(2004))中描述。

过表达可另外通过增加激活物蛋白的表达或者降低或关闭阻抑物蛋白的表达而实现。

提及的过表达措施可以合适的方式互相组合。因此，例如可以组合使用合适的表达盒与增加拷贝数，或者优选使用合适的启动子组合增加拷贝数。

关于DNA的操作、DNA的消化和连接、转化体的转化和选择的指导可见于已知的手册Sambrook et al.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition”(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。

表达或过表达的程度可以通过确定多肽的量及确定酶活性测量从所述基因中转录的mRNA的量而确定。

mRNA的量可以通过使用“Northern印迹”和定量RT-PCR方法确定。定量RT-PCR包括在聚合酶链反应之前的逆转录。为此，可以使用来自RocheDiagnostics(Boehringer Mannheim GmbH,Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany)的LightCycler^TM系统，如在Jungwirth et al.(FEMSMicrobiology Letters281,190-197(2008))中描述。蛋白质的浓度可以通过一维和二维蛋白质凝胶分级分离及随后通过合适的评估软件在凝胶中光学鉴定蛋白质浓度而确定。常用的制备棒杆菌的蛋白质凝胶及鉴定所述蛋白质的方法是由Hermann et al.(Electrophoresis,22:1712-23(2001))所述的方法。蛋白质浓度可另外通过Western印迹杂交确定，使用特异于被检测的蛋白质的抗体(Sambrook et al.,Molecular cloning:a laboratory manual.2^nd Ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)，及随后使用相应软件光学评估进行浓度确定(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum5:32-39;Lottspeich,Angewandte Chemie321:2630-2647(1999))。

产生的微生物可以连续培养，如WO05/021772所述；或者间断分批培养(分批培养)或者补料分批培养或者重复补料分批培养，以产生希望的有机化合物。关于已知的培养方法的一般性质的概述在Chmiel(Bioprozesstechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1991))教科书或者在Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))教科书中描述。

使用的培养基或者发酵培养基必须以合适方式满足各个菌株的需要。关于各种微生物的培养基的描述见American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)的“Manual of Methods for GeneralBacteriology”所述。术语培养基和发酵培养基可互换使用。

糖和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜或蔗糖生产的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素、油和脂肪如大豆油、葵花油、花生油和椰子油、脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸、醇如甘油、甲醇和乙醇以及有机酸如乙酸或乳酸可以用作碳源。

有机含氮化合物如蛋白胨、酵母膏、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，可以用作氮源。氮源可以单独使用或作为混合物使用。

磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾或者相应的含钠盐可以用作磷源。

培养基必须进一步含有生长所需的盐，例如金属如钠、钾、镁、钙和铁氯化物或硫酸盐形式，例如硫酸镁或硫酸铁。最终，除了上述物质以外还可以采用必需生长因子如氨基酸例如高丝氨酸和维生素，例如硫胺素、生物素或泛酸。

所述起始物质可以以单批形式加入到培养物中，或者可以在培养期间以合适方式补料。

可以以合适方式采用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或者酸性化合物如磷酸或硫酸以控制培养物的pH。pH通常调节至6.0-9.0，优选6.5-8。可以采用防沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫产生。为了保持质粒稳定性，可以在培养基中加入合适的选择性作用的物质例如抗生素。发酵优选在需氧条件下进行。为维持这些条件，氧气或含氧气体混合物如空气被引入培养物中。使用富含过氧化氢的液体也是可以的。发酵任选地在增压下进行，例如在0.03-0.2MPa的增压压力下。培养温度通常是20℃-45℃，优选25℃-40℃，特别优选30℃-37℃。在分批方法中，优选培养持续直至形成足以回收量的希望的有机化合物。这个目标通常在10小时至160小时内达到。在连续方法中，更长培养时间是可能的。微生物的活性导致发酵培养基和/或所述微生物的细胞中有机化合物的浓缩(积累)。

合适的发酵培养基的实例可见于专利US5,770,409、US5,990,350、US5,275,940、WO2007/012078、US5,827,698、WO2009/043803、US5,756,345和US7,138,266。

确定在发酵期间一或多个时间L-氨基酸浓度的分析可以通过利用离子交换层析分离L-氨基酸，优选阳离子交换层析，及随后使用茚三酮的柱后衍生化进行，如Spackman et al.(Analytical Chemistry30:1190-1206(1958))所述。也可以应用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。关于离子交换层析的综述可见于Pickering(LC·GC(Magazine of ChromatographicScience)7(6),484-487(1989))。

也可以进行柱前衍生化，例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯，及通过反相层析(RP)、优选高效液相层析(HPLC)形式分级分离所得氨基酸衍生物。这种类型的方法在例如Lindroth et al.(Analytical Chemistry51:1167-1174(1979))中描述。

使用光度学进行检测(吸光度，荧光性)。

关于氨基酸分析的综述可见于Lottspeich and Zorbas的教科书“Bioanalytik”(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany1998)。

本发明的方法或发酵过程关于选自如下一或多个参数方面的性能，基于使用含有增加的海藻糖输入蛋白活性的微生物的方法或发酵过程增加至少0.5%、至少1%、至少1.5%或至少2%，所述参数为：浓度(每单位体积形成的化合物)，产量(消耗的每单位碳源形成的化合物)，形成（formation）(每单位体积和时间形成的化合物)及比形成（specific formation）(每单位干细胞物质或干生物量形成的化合物，或者每单位细胞蛋白质和时间形成的化合物)，或者其它参数及这些参数的组合。

所述发酵措施导致发酵液中含有希望的有机化合物，优选L-氨基酸。

然后提供或产生或回收液体或固体形式的含有有机化合物的产物。

发酵液是指发酵培养基或营养培养基，微生物在其中在一定温度培养一定时间。在发酵期间使用的发酵培养基或培养基包含保证希望的化合物产生及典型地保证其增殖和存活力的所有物质或成分。

当发酵完成时，所得发酵液因此包含：

a)微生物的生物量(细胞量)，所述生物量由于所述微生物细胞的增殖而产生，

b)在发酵期间形成的希望的有机化合物，

c)在发酵期间形成的有机副产物，及

d)使用的发酵培养基或者起始物质的组成成分，如维生素如生物素或盐如硫酸镁，其在发酵中未被消耗。

所述有机副产物包括由发酵中所用微生物除了特定的希望的化合物之外产生及任选分泌的物质。这些物质也包括糖，如海藻糖。

从培养容器或发酵罐中取出发酵液，适当收集，并用于提供液体或固体形式的含有有机化合物的产物，优选含有L-氨基酸的产物。短语“回收含有L-氨基酸的产物”也用于描述这个行为。在最简便的情况中，已经从发酵罐中取出的含有L-氨基酸的发酵液自身组成回收的产物。

从发酵液中进行选自如下的一或多项措施实现希望的有机化合物的浓缩和纯化，以此方式分离具有希望含量的所述化合物的产物：

a)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或者几乎完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%)除去水，

b)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或者几乎完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%)除去生物量，后者任选在除去之前是失活的，

c)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或几乎完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥99.3%、≥99.7%)除去在发酵期间形成的有机副产物，及

d)部分(>0%)至完全(100%)或几乎完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥99.3%、≥99.7%)除去在发酵中未被消耗的所用发酵培养基或起始物质的组成成分。

部分(>0%至<80%)至完全(100%)或者几乎完全(≥80%至<100%)除去水(a措施)也称作干燥。

在所述方法的一个变化中，完全或几乎完全除去水、生物量、有机副产物和未消耗的所用发酵培养基的组成成分导致纯的(≥80%重量、≥90%重量)或高纯度(≥95%重量、≥97%重量、≥99%重量)的希望的有机化合物的产物形式，优选L-氨基酸。本领域可获得关于措施a)、b)、c)和d)的大量技术指导。

在L-氨基酸的情况中，本领域已知四种不同的产物形式。

一组含有L-赖氨酸的产物包括纯化的L-赖氨酸(EP-B-0534865)的浓缩的碱性水溶液。另一组如US6,340,486和US6,465,025所述，包括含有L-赖氨酸发酵液的含有生物量浓缩物的酸性水溶液。众所周知的固体产物包括粉状或结晶形式的纯化的纯L-赖氨酸，其典型是盐形式，如L-赖氨酸单盐酸盐。另一组固体产物形式在例如EP-B-0533039中描述。其中描述的产物形式除了L-赖氨酸之外包含在发酵生产期间使用及未消耗的大多数起始物质，及在适当时所用微生物的生物量比例为>0%-100%。

已知各种适于不同产物形式的加工方法以从发酵液中制备含有L-赖氨酸的产物或者纯化的L-赖氨酸。

用于产生纯的固体L-赖氨酸的方法是离子交换层析，在适当时使用活性炭，以及结晶化方法。以此方式获得相应的碱或相应的盐如单盐酸盐(Lys-HCl)或者硫酸赖氨酸(Lys₂-H₂SO₄)。

EP-B-0534865描述了从发酵液中产生含有L-赖氨酸的碱性水溶液的方法。在其中所述的方法中，从发酵液中分离生物量并弃去。碱如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵用于将pH设定为9-11。在浓缩后通过结晶化从发酵液中除去最小组成成分(无机盐)并冷却，用作肥料或弃去。

在通过使用棒杆菌属细菌产生赖氨酸的方法中，优选的方法是获得包含发酵液的组成成分的产物的那些方法。这些物质特别用作动物饲料添加剂。

根据需要可以将生物量从发酵液中完全或部分除去，通过分离方法如离心、过滤、倾析或者组合这些方法进行，或者完全留在其中。在适当时，所述生物量或含有生物量的发酵液在合适的加工步骤中被失活，例如通过热处理(加热)或者添加酸处理。

在一种方法中，生物量被完全或几乎完全除去，以便在制备的产物中不剩余(0%)或至多剩余30%、至多20%、至多10%、至多5%、至多1%或至多0.1%的生物量。在另一种方法中，生物量不被除去，或者仅小部分被除去，以便制备的产物中剩余所有(100%)或多于70%、80%、90%、95%、99%或99.9%的生物量。因此，在本发明的一种方法中，生物量除去的比例是≥0%至≤100%。

最后，在发酵后获得的发酵液在完全或部分除去生物量之前或之后可以调节为酸性pH，使用无机酸如盐酸、硫酸或磷酸，或者用有机酸如丙酸(GB1,439,728或EP1331220)。也可以酸化具有完全含量生物量的发酵液。最后，发酵液可以通过加入硫酸氢钠(NaHSO₃，GB1,439,728)或者另外的盐如亚硫酸的铵、碱金属或碱土金属的盐而稳定化。

在除去生物量期间，发酵液中存在的任何有机或无机固体被部分或完全除去。溶解于发酵液中的有机副产物及溶解的未消耗的发酵培养基的组成成分(起始物质)，在产物中至少部分剩余(>0%)，优选剩余至少25%、特别优选至少50%及极特别优选至少75%。在适当时其在产物中完全(100%)或几乎完全即>95%或>98%或＞99%剩余。在这个意义上，如果产物包含至少一部分发酵液的组成成分，这也被术语“基于发酵液的产物”所描述。

随后，从发酵液中除去水，或者将发酵液增稠或浓缩，通过已知方法如使用旋转式蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、通过反渗透或者通过纳米过滤进行。然后将此浓缩的发酵液渐渐达到自由流动产物，特别是细粉末或优选粗颗粒，通过冻干、喷雾干燥、喷雾粒化或者通过如PCT/EP2004/006655所述循环流化床中举例的其它方法进行。适当时从所得颗粒中通过筛选或除尘法分离希望的产物。

也可以直接干燥发酵液，即不通过喷雾干燥或喷雾粒化而预先浓缩。

“自由流动”是指粉末在一系列不同孔径的玻璃孔容器中至少无障碍地从具有5mm(毫米)孔径的容器中流出(Klein:Seifen,

Fette,Wachse94,12(1968))。

“细”是指粉末大多数(>50%)具有颗粒直径为20-200μm。

“粗”是指产物大多数(>50%)具有颗粒直径为200-2000μm。

颗粒大小可以通过激光衍射光谱学确定。相应的方法在教科书

in der Laborpraxis”[particle size measurement inlaboratory practice]by R.H.Müller and R.Schuhmann,WissenschaftlicheVerlagsgesellschaft Stuttgart(1996)或者在教科书“Introduction to ParticleTechnology”by M.Rhodes,published by Wiley&Sons(1998)中描述。

自由流动的细粉末随后可以通过合适的压实或粒化方法转变为粗的、非常自由流动的、耐贮存的及基本无尘的产物。

术语“无尘”是指产物仅包含小比例(<5%)的直径低于100μm的颗粒。

在本发明中“耐贮存的”是指产物在干燥和冷却环境中可以贮存至少1年或更长时间，优选至少1.5年或更长时间，特别优选2年或更长时间，而基本不出现(至多5%)相应氨基酸的丧失。

本发明进一步涉及基本如WO2007/042363A1所述方法。为此，使用根据本发明获得的发酵液进行该方法，从中已经完全或部分除去的生物量，所述方法包括如下步骤：

a)通过加入硫酸使发酵液中pH降低至4.0-5.2，特别是4.9-5.1，硫酸盐/L-赖氨酸的摩尔比率为0.85-1.2，优选0.9-1.0，特别优选>0.9至<0.95，在适当时加入一或多种进一步的含有硫酸盐的化合物，及

b)将以此方式获得的混合物通过除去水而浓缩，适当时粒化，

在适当时在步骤a)之前进行如下一或两种措施：

c)测量硫酸盐/L-赖氨酸的摩尔比率，以确定含有硫酸盐的化合物的需要量，

d)加入适当比率的选自硫酸铵、重硫酸铵和硫酸的含有硫酸盐的化合物。

在适当时，在步骤b)之前，加入硫酸盐，优选碱金属亚硫酸氢盐，特别优选亚硫酸氢钠，浓度为基于发酵液的0.01-0.5%重量，优选0.1-0.3%重量，特别优选0.1-0.2%重量。

在上述步骤中应提及的优选的含有硫酸盐的化合物特别是硫酸铵和/或重硫酸铵，或者氨水与硫酸的适当的混合物及硫酸自身。

硫酸盐/L-赖氨酸的摩尔比率V是通过下式计算的：V=2x[SO₄ ^2-]/[L-赖氨酸]。这个化学式考虑到这样的事实，即SO₄ ^2-阴离子是双电荷的，或者硫酸是二元酸(dibasic)。比率V=1是指存在化学当量组合物Lys₂-(H₂SO₄)，而V=0.9是指10%硫酸盐不足，V=1.1是指10%硫酸盐超量。

有利的是在粒化或压实期间使用常用的有机或无机辅助剂或载体，如淀粉、明胶、纤维素衍生物或相似物质，如通常用于加工食物或饲料中作为结合剂、胶凝剂或增稠剂，或者进一步的物质如二氧化硅、硅酸盐(EP0743016A)或硬脂酸盐。

进一步的优势是用油或脂肪处理所得颗粒的表面，如WO04/054381所述。可以使用的油是矿物质油，植物油或植物油混合物。举例的这种油是大豆油、橄榄油、大豆油/卵磷脂混合物。同样，硅酮油、聚乙二醇或羟基纤维素也是合适的。用所述油处理表面实现产物的磨耗抗性增加及尘粒含量降低。产物中油含量基于饲料添加剂总量为0.02-2.0%重量，优选0.02-1.0%重量，特别优选0.2-1.0%重量。

优选的产物≥97%重量比例的颗粒直径大小为100-1800μm，或者≥95%重量比率的颗粒直径大小为300-1800μm。尘粒比例，即颗粒直径大小<100μm的颗粒，优选>0至1%重量，特别优选不超过0.5%重量。

然而，或者，产物也可以吸附于饲料加工中已知及常用的有机或无机载体上，如二氧化硅、硅酸盐、谷物粗粉、麦麸、面粉、淀粉、糖或其他物质，和/或与常用的增稠剂和结合剂混合并稳定化。为此举例的应用和方法在文献(Die Mühle+Mischfuttertechnik132(1995)49,page817)中描述。

最后，产物也可以通过用成膜剂包被为对于动物胃、特别是反刍动物的胃消化稳定的状态，如用金属碳酸盐、二氧化硅、硅酸盐、藻酸盐、硬脂酸盐、淀粉、树胶和纤维素醚包被，如DE-C-4100920所述。

为了确定产物中希望的L-赖氨酸浓度，可以根据需求在加工期间加入浓缩物形式的L-赖氨酸，或者适当时加入液体或固体形式的基本纯的物质或者其盐。这些物质可以单独或者作为混合物加入所得或浓缩的发酵液中，或者在干燥或粒化期间加入。

本发明进一步涉及制备固体含有赖氨酸的产物，所述方法基本上如US20050220933所述。所述方法包括使用根据本发明获得的发酵液，及包括如下步骤：

a)优选用薄膜滤器过滤所述发酵液，获得含有生物量的滤浆和过滤物，

b)浓缩过滤物，优选以获得48-52%重量的固体含量，

c)使步骤b)获得的浓缩物粒化，优选在50℃-62℃温度进行，及

d)用一或多种包被剂包被在步骤c)中获得的颗粒。

步骤b)中过滤物的浓缩也可以这样进行，由此获得的固体含量>52至≤55%重量，>55至≤58%重量，或者>58至≤61%重量。

优选用于步骤d)中包被的包被剂选自如下一组：

d1)在步骤a)中获得的生物量，

d2)含有L-赖氨酸的化合物，优选选自盐酸L-赖氨酸或者硫酸L-赖氨酸，

d3)基本无L-赖氨酸的物质，L-赖氨酸含量<1%重量，优选<0.5%重量，优选选自淀粉、卡拉胶、琼脂、二氧化硅、硅酸盐、谷物粗粉、麦麸和面粉(flour)，及，

d4)防水物质，优选选自油、聚乙二醇和液体石蜡。

将L-赖氨酸含量通过相应于步骤d1)-d4)、特别是d1)-d3)的措施调节为希望数值。

在含有L-赖氨酸的产物的制备中，优选调节离子比率以便摩尔离子比率相应于如下化学式：

2x[SO₄ ^2-]+[Cl-]-[NH₄ ⁺]-[Na⁺]-[K⁺]-2x[Mg²⁺]-2x[Ca²⁺]/[L-Lys]

比率为0.68-0.95，优选0.68-0.90，特别优选0.68-0.86，如Kushiki et al.在US20030152633中描述。

在L-赖氨酸的情况中，以此方式产生的固体产物基于发酵液具有赖氨酸(赖氨酸碱的形式)含量为基于产物干重10%重量至70%重量，或者20%重量至70%重量，优选30%重量至70%重量，及特别优选40%重量至70%重量。最大赖氨酸碱基含量为71%重量，72%重量，73%重量也是可能的。

含有L-赖氨酸的固体产物的水含量为直至5%重量，优选直至4%重量，特别优选低于3%重量。

菌株DM1729保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏号为2005年9月16日DSM17576。

附图简述

图1描述了开放读框cg0835-cg0830的排列对比。所述读框编码如下推定的蛋白质：cg0835:ATPase；cg0834:周质底物结合蛋白；cg0832:通透酶亚基；cg0831:通透酶亚基。

图2是表达构建体pXMJ19-cg0831的示意图。下表2概括了使用的缩写和名称及其含义。碱基对数表示在测量再现限制内获得的近似值。

表2

cat	氯霉素抗性基因
		lacI	编码Lac阻抑物
Ptac	Tac启动子
		oriCg	谷氨酸棒杆菌质粒pBL1的起源
ori pUC	大肠杆菌质粒pUC的起源
		TrrnB	rrnB终止子
cg0831	编码通透酶亚基
		cg0832	编码通透酶亚基
cg0833	编码未知蛋白质
		cg0834	编码周质底物结合蛋白
cg0835	编码ATPase

图3是用于功能性连接ORF cg0832与Pgap启动子的质粒pK18mobsacB_Pgap_cg0832的示意图。

下表3概括了所用缩写和名称及其含义。所用缩写和名称具有如下含义。碱基对数表示在测量再现性限制内获得的近似值。

表3

Kan:	卡那霉素抗性基因
		NruI	限制酶NruI的裂解位点
HindIII	限制酶HindIII的裂解位点
		ScaI	限制酶ScaI的裂解位点
XbaI	限制酶XbaI的裂解位点
		Pgap_cg0832	建立ORF cg0832与Pgap启动子功能性连接的DNA盒
sacB:	sacB-基因
		RP4-mob:	含有转移复制起点(oriT)的mob区
oriV:	复制起点V

实施例

实施例1：海藻糖摄取系统的鉴定

对于放线菌目细菌(其也包括谷氨酸棒杆菌)，迄今为止仅针对链霉菌科细菌描述了海藻糖代谢：天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和Streptomyces reticuli利用海藻糖作为碳源。基因表达分析表明由agl3E、agl3F和agl3G编码的ABC转运系统的成分在天蓝色链霉菌中及ATPase亚基MsiK在S.reticuli中参与海藻糖摄取。对谷氨酸棒杆菌基因组序列进行的Blast分析鉴定了与S.reticuli msiK(GenBank accession no.CAA70125)高度同源的两个开放读框(cg2708和cg0835)：由cg2708编码的谷氨酸棒杆菌蛋白质与S.reticuli MsiK具有59%相同性(e-值7e-125)，但是是MusEFGK₂麦芽糖转运蛋白的ATP结合蛋白MusE，其缺失不影响海藻糖的利用。由cg0835编码的第二种蛋白质与S.reticuli MsiK(e-值8e-112)同样具有58%的高度相同性。天蓝色链霉菌agl3E、agl3F和agl3G(登记号NP_631226、NP_631225、NP_631224)与谷氨酸棒杆菌基因组序列的序列对比未产生任何进一步有意义的结果(例如与催化甘油3-磷酸摄取的ABC摄取系统UgpAEBC的基因及麦芽糖摄取系统MusEFGK₂的基因的25%-32%相同性)。

作为在谷氨酸棒杆菌中可能的海藻糖摄取系统，序列对比分析因此产生了开放读框cg0835和开放读框cg0834、cg0832和cg0831，其在基因组序列中的位置紧密相邻，编码底物结合蛋白和仍未鉴定的ABC转运蛋白的两个通透酶成分(见图1排列)。

实施例2：载体pXMJ19_cg0831的构建

含有读框cg0832、cg0834、cg0833、cg0832和cg0831的表达构建体是利用校正(proof-reading)聚合酶(PRECISOR High-Fidelity DNA Polymerase,Biocat,Heidelberg,Germany)通过扩增相应基因区并且将其连接进pJet克隆载体(Fermentas,St.Leon-Roth,Germany)中而制备的。

为此，使用如下合成的寡核苷酸(引物)：

引物cg0831for(SEQ ID NO:30):

5`GCTCTAGATGCGTTCTGCTCCTGACCTT3`

引物cg0831rev(SEQ ID NO:31):

5`CGGGATCCTTTGCGTTGCGATTCGGATT3`

所示引物是由MWG Biotech(Ebersberg,Germany)合成的。在每种情况中，下划线处是限制酶XbaI和BamHI的识别序列。

然后将获得的片段通过限制酶XbaI和BamHI(New England Biolabs,Schwalbach,Germany)从pJet载体中切除，连接进预先用XbaI和BamHI线性化的pXMJ19表达载体(Jakoby et al.,1999)中，然后用Antarctic磷酸酶(New England Biolabs,Schwalbach,Germany)去磷酸化。之后用5μl所述连接混合物转化感受态大肠杆菌DH5αmcr细胞。通过对制备的质粒进行限制酶切而筛选所获得的克隆以得到含有希望的插入体的那些克隆。该质粒被命名为pXMJ19_cg0831(见图2)。

实施例3：谷氨酸棒杆菌菌株DM1933/pXMJ19和DM1933/pXMJ19_cg0831的制备

使用Liebl et al.(FEMS Microbiological Letters,53:299-303(1989))所述电穿孔方法，将实施例2中描述的质粒pXMJ19和pXMJ19_cg0831电穿孔进谷氨酸棒杆菌DM1933中。

DM1933菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的氨基乙基半胱氨酸抗性突变体，已经在出版物中描述(Blombach et al.,2009,Appl.and Env.Microbiol.,p.419-427)。

携带质粒的细胞通过将电穿孔混合物铺板于补加7.5mg/l氯霉素的LB琼脂(Sambrook et al.,Molecular cloning:a laboratory manual.2^nd Ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)上进行选择。在每种情况中，通过常用的方法从一个转化体中分离质粒DNA(Peters-Wendisch et al.,1998,Microbiology,144,915-927)，随后用琼脂糖凝胶电泳通过限制裂解检测。

获得的菌株称作DM1933/pXMJ19和DM1933/pXMJ19_cg0831。所述pXMJ19_cg0831构建体含有读框cg0832、cg0834、cg0833、cg0832和cg0831。实施例4：L-赖氨酸的产生

将在实施例3中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DM1933/pXMJ19和DM1933/pXMJ19_cg0831在适于赖氨酸产生的营养培养基中培养，确定培养上清中赖氨酸含量。

为此，首先将菌株在含有合适抗生素的琼脂平板(具有氯霉素(7.5mg/l)的脑-心琼脂)上在33℃保温24小时。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。用于预培养和主培养的培养基是加入了氯霉素(7.5mg/l)的MM培养基。

表4示出了使用的培养基成分的概况。

表4：MM培养基

使用氨水将CSL、MOPS和盐溶液调节为pH7并高压灭菌。然后加入灭菌的底物和维生素溶液及干燥的高压灭菌的CaCO₃。

将预培养物在摇床上在250rpm和33℃保温24小时。从这个预培养物中接种主要培养物，由此主要培养物的起始OD(660nm)为0.1OD。

在具有隔板的100ml锥形瓶中以10ml体积在33℃和80%湿度进行培养。

在20和40小时后，使用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH,Munich)测量660nm波长的OD。使用来自Eppendorf-BioTronik(Hamburg,Germany)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和柱后衍生化及茚三酮检测确定产生的赖氨酸的量。使用来自Dionex GmbH(65510Idstein,Germany)的分析仪通过HPLC确定海藻糖浓度。表5示出实验结果。

表5：L-赖氨酸的产生和海藻糖浓度的测量。所有数值均是用列出的菌株进行的3个独立实验的平均值；n.d.=未确定。

结果表明当使用海藻糖输入蛋白表达菌株从海藻糖中产生赖氨酸时，海藻糖不再作为副产物而产生。

实施例5：载体pK18mobsacB_Pgap_cg0832的构建

相应于过表达基因cg0831和cg0832的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)的一个1701bp DNA片段在GENEART AG(Regensburg,Germany)通过从头基因合成而制备。

第613-1095位置的核苷酸描述了来自申请US20080050786(SEQ IDNO:20)的启动子片段，其中NruI限制酶的裂解位点通过将位置1079的核碱基胸腺嘧啶突变为核碱基鸟嘌呤、位置1080的核碱基胸腺嘧啶突变为核碱基胞嘧啶、位置1081的核碱基胸腺嘧啶突变为核碱基鸟嘌呤而产生。此外，ScaI限制酶的裂解位点是通过在启动子序列的5’末端加入接头序列(SEQ ID NO:28)产生的，位于第607-612位置。将以此方式获得的489bp启动子片段与基因cg0832的起始密码子功能性连接。

所述构建体在启动子下游区具有600bp侧翼序列(位置1096-1695)，及在上游区的600bp侧翼序列(位置7-606)，以通过同源重组整合启动子。

将含有限制酶XbaI(位置1-6)和HindIII(位置1696-1701)裂解位点的序列加入两侧区域，从而使得该构建体被克隆进置换载体pK18mobsacB中。

将所述1701bp片段用XbaI和HindIII限制酶消化，然后亚克隆进如

(Gene,145,69-73(1994))所述可动员的载体pK18mobsacB中，以使得所述启动子整合在基因cg0832的上游。为此，将pK18mobsacB用XbaI和HindIII限制酶消化。将以此方式制备的载体与所述片段混合，将混合物用Ready-To-Go T4DNA连接酶试剂盒(Amersham-Pharmacia,Freiburg,Germany)处理。

随后，将大肠杆菌菌株S17-1(Simon et al.,Bio/Technologie1:784-791,1993)用连接混合物转化(Hanahan,In.DNA cloning.A practical approach.Vol.1.ILR-Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)。携带质粒的细胞通过将转化混合物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上进行选择(Sambrocket al.,Molecular Cloning:a laboratory manual.2^nd Ed.Cold Spring Habor,NewYork,1989)。

借助于来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过用XbaI和HindIII酶限制性裂解及随后的琼脂糖凝胶电泳进行检测。该质粒被称作pK18mobsacB_Pgap_cg0832，在图3中示出。

实施例6：谷氨酸棒杆菌菌株DM1933_Pgap_cg0832的制备

目的是将突变Pgap_cg0832导入菌株谷氨酸棒杆菌DM1933中。菌株DM1933是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的氨基乙基半胱氨酸抗性突变体，已经在出版物中描述(Blombach et al.,2009,Appl.and Env.Microbiol.,p.419-427)。

将实施例5中所述的载体pK18mobsacB_Pgap_cg0832根据

(Journal of Microbiology172:1663-1666(1990))所述方案通过缀合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DM1933中。所述载体在DM1933中不能自主复制，只有在其由于重组而已经被整合进染色体中时才保留在细胞中。选择转接合子，即具有整合的pK18mobsacB_Pgap_cg0832的克隆，通过将所述缀合混合物铺板于补加25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸的LB琼脂上进行选择。然后将卡那霉素抗性转接合子在补加卡那霉素(25mg/l)的LB琼脂平板上划线，在33℃保温24小时。选择其中质粒由于二次重组事件已经被切除的突变体，通过将克隆在液体LB培养基中非选择性培养30小时，然后将其在补加10%蔗糖的LB琼脂上划线，在33℃保温24小时。

质粒pK18mobsacB_Pgap_cg0832，与起始质粒pK18mobsacB一样，除了卡那霉素抗性基因之外还含有编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因的一个拷贝。蔗糖可诱导的sacB基因的表达导致果聚糖蔗糖酶形成，其催化对谷氨酸棒杆菌毒性的产物果聚糖合成。因此，仅其中由于二次重组事件的结果而已经切除整合的pK18mobsacB_Pgap_cg0832的那些克隆在补加蔗糖的LB琼脂上生长。根据二次重组事件相对于突变位点的位置，突变在切除期间掺入或者宿主染色体保持初始状态。

随后，鉴定其中发生希望的置换的克隆，即Pgap_cg0832表达盒掺入染色体中。

为此，使用聚合酶链反应(PCR)检测50个克隆的Pgap_cg0832表达盒整合情况，所述克隆具有“在存在蔗糖条件下生长”及“在存在卡那霉素条件下不生长”表型。

为此，使用如下合成的寡核苷酸(引物)：

引物cg0832_1.p(SEQ ID NO:28):

5`GCTGGAATACGGAGTGAACC3`

引物cg0832_2.p(SEQ ID NO:29):

5`GGGATTGCCCAAGGGATAAG3`

所示引物是由MWG Biotech(Ebersberg,Germany)合成的。在野生型排列情况中，引物cg0832_1.p和cg0832_2.p使得570bp DNA片段扩增。在将Pgap_cg0832构建体整合进染色体中的情况中，扩增子的大小为1059bp。

使用来自Quiagen(Hilden,Germany)的Taq PCR核心试剂盒在Eppendorf Mastercycler(Hamburg,Germany)中进行PCR反应，所述试剂盒包含Thermus aquaticus Taq DNA聚合酶。反应混合物条件根据厂商指导调节。首先将PCR混合物进行最初的变性，在94℃进行2分钟。随后进行35次重复如下步骤：在94℃进行30秒变性步骤，引物与DNA在57℃结合30秒的结合步骤，及使引物在72℃延伸60秒的延伸步骤。在最终的在72℃进行5分钟的延伸步骤后，以此方式扩增的产物通过电泳在琼脂糖凝胶中检测。

以此方式鉴定了含有整合形式的Pgap_cg0832表达盒的突变体，获得的菌株之一被命名为谷氨酸棒杆菌DM1933_Pgap_cg0832。

实施例7：L-赖氨酸的产生

将在实施例6中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DM1933_Pgap_cg0832与起始菌株DM1933在适于赖氨酸产生的营养培养基中培养，确定培养上清中的赖氨酸含量。

为此，首先将菌株在琼脂(脑-心琼脂)平板上在33℃保温24小时。从这个琼脂平板培养物可是，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。用于预培养和主要培养物的培养基是MM培养基(见表4)。

使用氨水将CSL、MOPS和盐溶液调节为pH7并高压蒸汽灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液及干燥高压蒸汽灭菌的CaCO₃。

将预培养物在摇床上以250rpm在33℃保温24小时。用这个预培养物接种主培养物，由此主培养物起始OD(660nm)为0.1OD。

在具有隔板的100ml锥形瓶中在10ml体积进行培养，温度为33℃，湿度为80%。

在20和40小时(h)后，使用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH,Munich)确定测量波长为660nm的OD。使用来自Eppendorf-BioTronik(Hamburg,Germany)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析及柱后衍生化与茚三酮检测确定产生的赖氨酸的量。使用来自Dionex GmbH(65510Idstein,Germany)的分析仪通过HPLC确定海藻糖浓度。表6描述了实验结果。

表6：L-赖氨酸的生产及海藻糖浓度测量。所有数值均是使用列出的菌株的3个独立实验的平均值；n.d.=未确定。

结果表明当使用其中仅由cg0832和cg0831编码的海藻糖输入蛋白亚基(在这两种情况中为通透酶亚基)的表达被增强的菌株从海藻糖中产生赖氨酸时，海藻糖不再作为副产物产生。这是希望的产物(L-赖氨酸)的产量增加的进一步的迹象。