KR20170030824A - 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 cadA2 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 카다베린의 생산방법을 제공한다.

Description

하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법{Gene encoding lysine decarboxylase derived from H. alvei, recombinant vector, host cell and method for producing cadaverine using the same}

본 발명은 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 cadA2 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 카다베린의 생산방법에 관한 것이다.

1,5-디아미노펜탄(1,5-diaminopentane)으로 알려진 카다베린(cadaverine)은 많은 산업적 응용에 있어서 중요한 기반 화학물질로서, 폴리아마이드나 폴리우레탄과 같은 고분자의 구성요소, 킬레이팅제 또는 다른 첨가제로 사용될 수 있다.

특히, 폴리아마이드-5,4는 카다베린이나 숙신산의 중축합으로써 제조되는데, 연간 350만 톤의 세계 시장을 가진 폴리아마이드-5,4는 전통적 석유기반의 폴리아마이드에서 바이오 기반 대체제로부터 생산될 것으로 기대된다 (Mimitsuka et al.,71: 2007, Biosci. Biotechnol. Biochem., Kind et al., 12:2010, Met. Eng.).

이러한 카다베린 생산 공정에는 재생산이 가능한 바이오매스 기반 탄소 공급원이 요구된다. 또한, 그람 음성 박테리아인 대장균에서 카다베린은 L-라이신으로부터 L-라이신 디카르복실라아제를 이용하여 직접 생합성 된다.

L-라이신 디카르복실라아제는 대장균의 경우 유전자 ldcC로 코딩되어 일정수준으로 발현되는 효소와 유전자 cadA로 코딩되어 낮은 pH에서만 발현이 유도되는 효소 2종류가 있다 (Lemonnier et al., 144(3):1998., Microbiology.).

H. alvei는 그람 음성균이고, H. alvei와 E. coli의 ldc의 경우 Corynebacterium glutamicum에서 과발현되어 카다베린 생산에 사용되어진 유전자이다.

하지만, 최근 H. alvei whole genome sequencing을 통해 새롭게 발견된 L-라이신 디카르복실라아제 유전자 cadA2를 사용되었다는 보고는 없었다.

다양한 균주 유래의 라이신 디카르복실라아제 들이 보고되고 있으며, 이러한 단백질을 인코딩하는 유전자들이 상당수 이미 보고되어 있다.

이러한 유전자를 Escherichia coli 나 Corynebacteirum glutamicum과 같은 산업화한 균주에 과발현하여 글루코오스, 헤미셀룰로오스 또는 전분과 같은 탄소원으로부터 카다베린 발효하는 기술이 보고가 되어 있다 (Tateno et al., 82(1):2009, Appl Microbiol Biotechnol).

그러나, 이 기술을 사용하는 경우 부산물의 생산으로 인해 생산 효율이 떨어지거나 생산까지 많은 시간이 소요가 되어 활성이 좋은 효소가 필요하며, 이종 균주들에서의 발현이 필요한 경우가 많아 발현이 잘되는 라이신 디카르복실라아제의 발굴이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 Hafnia alvei 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 신규한 유전자 cadA2가 라이신 디카르복실라아제의 활성을 증가시킴으로써, 고수율의 카다베린을 생산할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 신규한 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어, 상기 유전자의 활성이 내재적 효소 활성보다 증가된 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 숙주세포를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 유래의 유전자로서, 라이신 디카르복실라아제를 코딩하고, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cadA2 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 cadA2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 카다베린의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 의한 신규 H. alvei 유래의 cadA2는 이전에 보고되지 않은 염기 서열을 가지고 있고, 대장균 내에서 발현이 매우 우수하며, 높은 활성과 온도에 대한 안정성을 가지고 있고, 기질 특이성 면에 있어서도 라이신에 집중적인 활성을 가지고 있어 부반응도 적게 일어난다.

따라서, 본 발명에 의한 하프니아속 세균 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 cadA2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는, 라이신으로부터 카다베린으로의 전환률이 증가되어, 카다베린의 생산 효율이 증가될 수 있다.

도 1은 본 발명에 사용된 pET24ma/cadA2 벡터를 나타낸 것이다.
도 2 는 하프니아 알베이 유래 L-라이신 디카르복실라아제의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 하프니아 알베이 유래 L-라이신 디카르복실라아제의 기질특이성을 나타낸 것이다.
도 4은 하프니아 알베이 유래 L-라이신 디카르복실라아제의 반응에 있어서 다양한 온도에 따른 전환률을 나타낸 것이다.

본 발명에서 "벡터 및 플라스미드"라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

본 발명에서 "프로모터"라는 용어는, 폴리머라아제에 대한 결합부위를 포함하고, 프로모터 하류(downstream) 유전자의 mRNA로의 전사개시 활성을 갖는, 코딩 영역의 상류(upstream)의 비해독된 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 카다베린 생합성에 관련된 ldcC, cadA2등과 같이 효소를 코딩하는 목적 유전자의 전사 개시 및 프로모터 서열과 유전자 서열의 기능적 연결, 즉 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.

본 발명에서 "숙주 세포"는 본 발명의 임의의 재조합 벡터(들) 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 수용체일 수 있거나, 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손일 수 있으며, 자손은 자연적, 우발적 또는 인공 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 모 세포와 완전히 동일하지 않아도 된다(형태 또는 총 DNA 상보면에서).

숙주 세포는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포, 재조합 세포, 재조합 미생물 또는 변이 미생물이다.

본 발명에서 "형질전환"이라는 용어는, DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외의 인자로서, 또는 염색체로의 삽입에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 "프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 발명에서, "ldc 프로모터" 라는 용어는, 하프니아형 세균, 바람직하게는 하프니아 알베이의 유래의 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase: ldc)의 프로모터를 의미하는 것으로서, 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 이는 NCBI accession No. AIU71453와 같다.

본 발명에서, 신규한 서열번호 1의 "cadA2"는 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자로서 이미 보고된 H. alvei FB1의 lysine decarboxylase(NCBI accession No. AIU73989)와 핵산 서열이 약 99% 이상의 유사성을 가지고 있다.

본 발명에서 "기능" 및 "기능성" 등은 생물학적 또는 효소적 기능을 의미한다. "증가된" 또는 "증가"라는 것은 비변형 미생물 또는 상이하게 변형된 미생물과 같은 대조 미생물에 비해 주어진 산물 또는 분자(예를 들면, 범용 화학물질, 바이오 연료 또는 이들의 중간체 산물)를 더 많은 양으로 생산할 수 있는 하나 이상의 재조합 미생물의 능력을 의미한다.

본 발명은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여, 특정 효소를 코딩하는 유전자를 기본 벡터에 삽입하여 형질전환 시킨 재조합미생물을 배양함으로써 구현할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이와 관련되는 유전자 클로닝 방법, 재조합 미생물 및 미생물 시스템을 모두 포함한다.

본 발명은 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 유래의 유전자로서, 라이신 디카르복실라아제를 코딩하고, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cadA2 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 상기 cadA2 유전자에서, 상기 cadA2 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 상기 cadA2 유전자에서, 상기 하프니아 알베이는 하프니아 알베이(Hafnia alvei) ATCC13337일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 cadA2 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 상기 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 pET24ma/cadA2 일 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 하프니형 세균 뿐만 아니라, 적합한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 이 때, 상기 적합한 숙주세포는 벡터가 복제가능 한 것으로서, 복제가 개시되는 특정 핵산서열인 복제 원점을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체(숙주세포)를 선별하기 위한 것으로서, 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환된 세포의 선별이 가능하다.

상기 선택 마커의 대표적인 예로서, 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으며, 본 발명에서는 카나마이신을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명의 상기 형질전환 된 숙주세포는 대장균(E. coli ) cadA2 pET24ma일 수 있다.

본 발명의 상기 형질전환된 숙주세포는 세포내의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 활성이 내재적 활성보다 강화된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 카다베린의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 상기 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌(Biotechnol Bioeng., Qian et al.,2011:108(1)93; J.Micobiol.Biotechnol., Kim et al., 2015:25(7)1108)에 기술되어 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 하프니아 알베이 균주에 대한 배양배지는 공지되어 있는데, 예를 들면, Fecker et al., 1986:203,177., Mol Gen Genent; Greipsson et al., 1983:33(3)470., Int'l Syst. Evol. microbiol. 등을 들 수 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 배양에 사용될 수 있는 당원으로는 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 배양에 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두박 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원도 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 배양에 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 배양배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 또한, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 표적 물질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.

또한, 본 발명의 상기 카다베린의 생산방법은 상기 배양하는 단계에서 생성되는 카다베린을 회수하는 방법을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 상기 카다베린을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 L-카다베린을 분리해낼 수 있다.

본 발명의 상기 카다베린의 생산방법에서, 상기 카다베린 회수 방법의 예로서, 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 라이신 디카르복실라아제( cadA2 ) 유전자가 도입된 플라스미드의 구축

라이신 디카르복실라제를 코딩하는 유전자(cadA2)를 증폭하기 위해 Hafnia alvei의 genomic DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 3(정장향) 및 4(역방향)의 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다.

[서열번호 3]: 5'- CGTCGAATTCATGAACGTTATTGCAATATTG-3'

[서열번호 4]: 5'- GCTCGAGCTCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC-3'

이때, 상기 프라이머의 디자인은 CLC Main Workbench 프로그램을 이용하여 수행하였다.

다음으로, pET24a(Novagen's®pET System)에 ori가 p15A 오리진(origin)으로 교체된 pET24ma를 BamHI 과 SacI으로 잘라 5.3kb의 DNA 단편을 얻었다.

상기 단편을 상기의 PCR 산물(2,142bp)을 BamHI 과 SacI으로 자른 것과 결합시킨 후에 E. coli DH5α (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618. Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 도입시키고, 클로닝하여 pET24ma 벡터에 H. alvei 유래의 cadA2 유전자를 삽입한 pET24ma/cadA2 플라스미드를 제작하였다 (도 1 참조).

< 실시예 2> pET24ma / cadA2 가 삽입된 변이 대장균의 제작

라이신 디카르복실라제를 코딩하는 유전자(cadA2)가 들어 있는 플라스미드(pET24ma/cadA2)를 단백질 생산용 대장균인 E. coli BL21(λDE3) (Novagen's®[ompTrBmB(PlacUV5::T7gene1)]) 균주에 형질전환시켰다.

고체 배지에서 성장한 균의 단일 콜로니(single colony)를 따서 카나마이신(50μg/ml)이 들어 있는 LB 5 ml에 접종한 후, 37℃, 200rpm에서 오버 나잇으로 전배양을 하였다.

그런 다음, 카나마이신(50μl/ml)이 들어 있는 LB 50ml에 전배양액 500μl를 접종한 후, 30℃, 200rpm에서 균체량이 OD_600nm 0.6일 때, IPTG의 최종 농도가 0.1 mM이 되게끔 IPTG를 첨가한 후, 30℃, 200rpm에서 오버 나잇으로 본배양을 하였다.

그 후, 증류수로 두 번 세척한 후, 증류수 5 ml에 다시 서스펜션하여 -70℃에 보관하였다.

상기 보관된 균주를 얼음에서 해동한 후 100μl 채취하여, 13000g에서 원심분리한 후 상등액을 버린 뒤, 100μl Bugbuster (Novagen®)를 처리한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.

세포 용해액을 13000g에서 원심분리한 후, 상등액 16μl과 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼 4μl를 섞어준 후, 100℃에서 5분간 끓여 주어 시료 전처리를 하였다.

상기 전처리된 시료를 12% SDS-PAGE에 로딩하여 120V 700mA의 전류를 2시간 동안 흘려 주어 전개를 한 후, SDS-PAGE 겔을 염색 용액 (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% 메탄올 및 10% 빙초산(glacial acetic acid)에 1시간 동안 염색시켰다.

그 후 염색된 SDS-PAGE 겔을 탈색(50% 메탄올 및 10% 빙초산 용액에 2시간 동안 탈색을 하여 80kDa 부근에서 단백질 밴드를 확인하여 상기 균주가 라이신 디카르복실라아제를 과발현하는 것을 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.

이에 상기 균주를 "대장균(Escherichia coli) cadA2 pET24ma"로 명명하였으며, 2015 년 8 월 13 일자로, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC12881BP로 기탁하였다.

< 실시예 3> 카다베린 생산을 위한 전세포 효소반응 및 분석

H. alvei 유래의 유전자 라이신 디카르복실라아제 cadA2가 과발현된 대장균체 용액은 얼음에서 해동한 후 5ml을 사용하고, 각각의 성분의 최종 농도가 0.1mM Pyridoxal 5'-phosphate, 1M lysine, 500mM sodium acetate pH 6.0을 맞춘 후, 250ml Erlenmeyer flask에 최종 부피 50ml을 만들어 주었다.

그런 다음, 37℃, 200rpm에서 2시간 동안 반응을 시켰다. 분석 대상 시료내에 포함된 디아민(diamine)을 정확하게 분석하기 위하여, 유도체화를 수행하였다.

디에틸에톡시메틸말론산 3㎕를 에펜도르프 튜브(ependorf tube)로 옮긴 후, 메탄올 100㎕, 50mM pH9의 보레이트 버퍼(borate buffer) 300㎕, 증류수 47㎕를 혼합한 후, 10mM의 디아민 또는 아미노산 표준용액 50㎕를 혼합물이 들어 있는 1.7ml 에펜도르프 튜브(ependorf tube)로 옮긴 후, 70°C에서 두 시간 동안 반응시켰다.

시료 분리 및 검출의 향상을 위하여, 다음과 같은 HPLC 조건으로 분석을 수행하였다. 컬럼은 Capcell Pack®(5 μ C18 UG 120 , 4.6 x 250 mm; Shiseido Co., Ltd., Japan )을 사용하였고, 컬럼의 온도는 35℃로, 유속은 1 ml/min 조건으로 셋팅하였으며, 다양한 유기용매들 중에서 극성도가 가장 낮은 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용함과 동시에, 25mM 소듐 아세테이트 (sodium acetate)를 완충 용액으로 사용하였고, 초산을 이용하여 pH를 4.8로 조절하였다.

폴리아마이드계 나일론 단량체인 디아민의 성분들의 피크들이 겹치지 않고, 최적으로 분리될 수 있는 조건을 고정상과 이동상 및 성분들의 극성 차이를 고려하여 하기 표 1과 같이 설정하였다.

본 발명에 의한 상기 대장균(Escherichia coli) cadA2 pET24ma을 상기의 방법으로 인덕션(induction) 시켜 냉동 보관되어 있는 대장균체 용액은 얼음에서 해동한 후, 20μl을 사용하였고, 기질은 라이신, 오르니틴, 아르기닌, 2,4-디아미노부틸레이트(2,4-diaminobutyrate), 2,6-디아미노 피멜산(2 6-diaminopimelic acid)을 기질로 사용하여 실험을 진행하였다.

각각의 성분의 최종 농도가 기질 25mM, 0.1mM Pyridoxal 5'-phosphate, 500mM 소디움 아세테이트, pH 6.0을 맞춘 후, 1.7ml Eppendorf tube(Axygen®에 최종 부피 500μl을 만들어 준 다음, 37℃에서 2시간 동안 반응시켜, 기질 특이성을 조사한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3는 하프니아 알베이 유래 L-라이신 디카르복실라아제의 기질 특이성을 나타낸 것으로서, 도 3를 참조하면, 본 발명에 의한 상기 대장균(Escherichia coli) cadA2 pET24ma는 라이신에 집중적인 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.

본 발명에 의한 상기 대장균(Escherichia coli) cadA2 pET24ma을 상기의 방법으로 인덕션시켜 냉동 보관되어 있는 대장균체 용액은 얼음에서 해동한 후, 20μl을 사용하였고, 각각의 성분의 최종 농도가 1M lysine, 0.1mM Pyridoxal 5'-phosphate, 500mM 소디움 아세테이트, pH 6.0을 맞춘 후, 1.7ml Eppendorf tube(Axygen®에 최종 부피 500μl을 만들어 준 후, 20℃, 30℃, 37℃, 45℃, 52℃, 60℃에서 2시간 동안 반응시켜, 온도 변화에 따른 전환률을 조사한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4은 하프니아 알베이 유래 L-라이신 디카르복실라아제의 반응에 있어서 다양한 온도에 따른 전환률을 나타낸 것으로서, 도 4을 참조하면, 본 발명에 의한 상기 대장균(Escherichia coli) cadA2 pET24ma는 라이신으로부터 카다베린으로의 전환률이 온도의 변화에 거의 영향을 받지 않음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 하프니아속 세균 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 cadA2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는, 라이신으로부터 카다베린으로의 전환률이 증가되어, 카다베린의 생산 효율이 증가될 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC12881BP 20150813

<110> Paik Kwang Industrial Co., Ltd. <120> Gene encoding lysine decarboxylase derived from H. alvei, recombinant vector, host cell and method for producing cadaverine using the same <130> 10213 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2142 <212> DNA <213> gene of lysine decarboxylase of Halfnia albei <400> 1 atgaatatta ttgccatctt gaatcacatg ggcgtctact tcaaagaaga gcctatccgt 60 gaactgcaca aggcactgga agcactcgat tttcagattg tttatccaaa cgaccgtgaa 120 gacctgctga aactcatcga caacaacgca cgtctgtgcg gcgttatctt cgactgggat 180 acttacaatc tcgacctgtg cgaagaaatc agcgcgatga acgaacatct gcctgtctat 240 gcgttcgcca acacccactc tactctggat gttagcctga acgatctgcg tctgaacgtt 300 gagttcttcg aatacgcact gggcgccgct caggatatcg cacagaaaat ccgtcagagc 360 accgacgcat acatcgacga aatcctgcct ccgctgacca aagcactgtt caactacgtt 420 aaagaaggta aatacacctt ctgtactccg ggtcacatgg gcggtactgc gttccagaaa 480 tccccagtgg gcagcatctt ctatgatttc ttcggcgcta acgcgatgaa atctgatatc 540 tccatctctg tgggtgaact gggttctctg cttgaccact caggtccaca caaagaagct 600 gaagaataca ttgcgcgtac tttcaacgca gaacgcagct acatggtgac taacggtact 660 tctaccgcga acaaaatcgt tggtatgtac tcagcacccg ctggcagcac cgttctgatt 720 gaccgtaact gccataagtc tctgactcac ctgatgatga tgagcgacat cactcctatt 780 tacttccgtc caacccgtaa cgcttacggt atcttgggtg gtattcctaa gagtgaattc 840 cagcacgaca ccatcgctga acgcgttgca cagactccaa atgcaacctg gccagttcac 900 gccgtagtga ccaactctac ctacgacggt ctgctgtaca acactgatta catcaaagaa 960 gcgctggacg ttaaatccat ccactttgac tctgcatggg ttccttacac caacttcagc 1020 cctatctaca aaggtctgtg tggtatgagc ggtggccgtg tagaaggcaa agttatttat 1080 gaaactcagt ctactcacaa actgctggca gcattctctc aggcttcaat gattcacgtt 1140 aaaggtgaca tcaacgaaga aaccttcaac gaagcctaca tgatgcacac ctctacttct 1200 cctcactacg gcatcgtggc ttccaccgaa accgctgctg caatgatgaa aggtaatgcc 1260 ggtaaacgtc tgatcaacgg ttctatcgaa cgtgcgattc gtttccgtaa agaaatcaaa 1320 cgtctgaact ccgagtctga aggctggttc ttcgacgtat ggcagccaga aggtatcgac 1380 gaagcgaaat gctggccttt ggattccaaa gacagctggc atggctttaa agatatcgat 1440 aacgaccaca tgtatctgga cccaatcaaa gtcactctgt tgactccagg gatgcagaaa 1500 gatggttcaa tggctgatac cggtatccca gcgtctatcg tttctaaata cttagacgaa 1560 cacggcatca tcgttgagaa aactggtcca tacaacttgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgacaaaa ctaaagcact gagcctgctg cgtgcgctga ccgaattcaa acgttcatac 1680 gacttgaacc tgcgcgttaa gaatatgctg ccttcactgt atcgtgaaga tccagagttc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggacttggca cagggcatcc atgcgctgat ccaacaccac 1800 aacctgccgg acctgatgta ccgtgcattt gaagtgttgc caaccatggt aatgaaccca 1860 catgcagcgt tccaaaaaga actgcgtggc cagactgaag aagtttatct ggaagagatg 1920 atcggcaaag ttaatgccaa catgatcctg ccatatcctc caggagttcc tttggtaatg 1980 ccaggtgaaa tgctgaccga agaaagccgc ccagttctgg agttcttgca gatgctgtgc 2040 gaaatcggtg cacattaccc aggctttgaa actgatatcc acggtgcata tcgtcaggct 2100 gacggtcgct acactgttaa agttatcaaa gaccagaagt aa 2142 <210> 2 <211> 713 <212> PRT <213> amino acid sequence of lysine decarboxylase derived from Halfnia albei <400> 2 Met Asn Ile Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Lys Ala Leu Glu Ala Leu Asp Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ile Asp Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Thr Tyr Asn Leu 50 55 60 Asp Leu Cys Glu Glu Ile Ser Ala Met Asn Glu His Leu Pro Val Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr His Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Asn Val Glu Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Gln Asp 100 105 110 Ile Ala Gln Lys Ile Arg Gln Ser Thr Asp Ala Tyr Ile Asp Glu Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Asn Tyr Val Lys Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Ile Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Ala Asn Ala Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Gly Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe 195 200 205 Asn Ala Glu Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Ile Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Lys Ser Glu Phe Gln His Asp Thr Ile Ala Glu Arg 275 280 285 Val Ala Gln Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Val Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Tyr Ile Lys Glu 305 310 315 320 Ala Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Lys Gly Leu Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Ile 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Ser Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Arg Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Asn Ser Glu Ser Glu Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Glu Gly Ile Asp Glu Ala Lys Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Asp Ser Lys Asp Ser Trp His Gly Phe Lys Asp Ile Asp 465 470 475 480 Asn Asp His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Gln Lys Asp Gly Ser Met Ala Asp Thr Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ser Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Ile Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly 580 585 590 Ile His Ala Leu Ile Gln His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Asn Pro His Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu Arg Gly Gln Thr Glu Glu Val Tyr Leu Glu Glu Met 625 630 635 640 Ile Gly Lys Val Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Ile Lys Asp Gln Lys 705 710 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 cgtcgaattc atgaacgtta ttgcaatatt g 31 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gctcgagctc ttattttttg ctttcttctt tc 32

Claims (8)

1. 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 유래의 유전자로서, 라이신 디카르복실라아제를 코딩하고, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cadA2 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 도 1의 개열지도를 갖는 pET24ma/cadA2 인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
3. 제1항 또는 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포
4. 제3항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균(Escherichia coli) cadA2 pET24ma (KCTC12881BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
5. 제3항에 있어서, 상기 숙주세포는 세포내의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자 활성이 내재적 활성보다 강화된 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
6. 제3항의 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 카다베린의 생산방법.
7. 제4항의 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 카다베린의 생산방법.
8. 제5항의 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 카다베린의 생산방법.

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