KR20230138334A - 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 미생물 배지 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 미생물 배지 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원은 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 레티놀 생산방법; 레티놀 생산을 증가시키는 방법; 레티노이드 생산방법; 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 야로위아 속 미생물 배지 조성물; 상기 미생물 또는 이의 배양물 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 조성물에 관한 것이다.

Description

계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 미생물 배지 조성물 및 이의 용도{A microorganism culture medium composition for retinol production comprising surfactant}
본 출원은 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 레티놀 생산방법; 레티놀 생산을 증가시키는 방법; 레티노이드 생산방법; 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 야로위아 속 미생물 배지 조성물; 및 상기 미생물 또는 이의 배양물 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 조성물에 관한 것이다.
지용성 비타민인 레티놀은 야맹증 개선의 안구건강과 면역력 강화, 피부 건강 등에 관여하는 필수 비타민이다. 하지만 레티놀은 열, 빛, 온도, 수분, 산소, 시간 경과 등에 매우 불안정해 대기 중에 노출되거나 수용액 중에서 산화되기 쉽다. 이로 인해 원료의 역가가 떨어지고 변색, 변취가 일어나는 등 안정성에 큰 문제점이 있으며, 레티놀 생산에서도 부정적인 영향을 미치고 있다.
이를 위하여, 레티놀을 포함하는 조성물 또는 제품에서 레티놀 화합물 자체를 안정시키는 기술은 다수 개발되고 있으나(미국등록특허공보 제6858217호), 레티놀 생산을 안정적으로 증가시키는 방법은 개발이 미미한 실정이다.
본 출원의 하나의 목적은 비이온성 계면활성제를 이용한 레티놀 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 비이온성 계면활성제를 이용하여 레티놀 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 비이온성 계면활성제를 이용한 레티놀 생산용 미생물 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 비이온성 계면활성제를 이용한 레티놀 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 비이온성 계면활성제를 이용한 레티놀 생산 용도를 제공하는 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 아울러, 본 출원에 기재된 문헌은 본원의 참조로 삽입될 수 있다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 일 양태는 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속(Yarrowia sp.) 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 레티놀 생산방법을 제공한다.
본 출원에서 용어 "계면활성제(surfactant)"는 친수성 부분 및 소수성 부분을 동시에 가지고 있는 화합물을 의미한다. 상기 계면활성제는 물에서 해리되었을 때의 친수성 부분 전하에 따라음이온성, 양이온성, 비이온성(polar), 양쪽성, 및 특수 계면활성제로 분류될 수 있다. 본 출원의 계면활성제는 비이온성 계면활성제이며, 이의 화학적 구조에 따라 소르비탄 지방산염 계열(예를 들어, 스판; span), 폴리:옥시에틸 소르비탄 지방산염 계열(예를 들어, 트윈; tween), 및 폴리에틸에테르 지방산염 계열(예를 들어, 트리톤; Triton) 등으로 구분될 수 있다.
일 구현 예로, 상기 계면활성제는 트윈(Tween), 및 트리톤(Triton)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 트윈은 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 및 트윈 80으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 트리톤은 트리톤 X-100일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비이온성 계면활성제는 전체 배지 조성물 대비 0.001% 이상, 0.001 내지 30%, 0.01% 이상, 0.01 내지 30%, 0.01 내지 25%, 0.01 내지 20%, 0.01 내지 15%, 0.01 내지 10%, 0.01 내지 5%, 0.01 내지 2%, 0.01 내지 1%, 0.05 내지 30%, 0.05 내지 25%, 0.05 내지 20%, 0.05 내지 15%, 0.05 내지 10%, 0.05 내지 5%, 0.01 내지 2%, 0.01 내지 1%, 0.1 내지 30%, 0.1 내지 25%, 0.1 내지 20%, 0.1 내지 15%, 0.1 내지 10%, 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.5 내지 30%, 0.5 내지 25%, 0.5 내지 20%, 0.5 내지 15%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 1 내지 30%, 1 내지 25%, 1 내지 20%, 1 내지 15%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 30%, 2 내지 25%, 2 내지 20%, 2 내지 15%, 2 내지 10%, 2 내지 5%, 5 내지 30%, 5 내지 25%, 5 내지 20%, 5 내지 15%, 5 내지 10%, 10 내지 30%, 10 내지 25%, 10 내지 20%, 10 내지 15%(w/v)의 농도로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 비이온성 계면활성제는 레티놀의 세포 외 배출을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하여, 시간 및 노동력 자원의 소모를 최소화하면서도 레티놀을 안정적으로 생산할 수 있다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 야로위아 속 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다.
일 구현 예로, 본 출원의 배지는 레티놀 생산용 배지일 수 있고, 레티놀 생산에 필요한 물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 야로위아 속 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 비이온성 계면활성제를 이미 포함하는 통상의 배지이거나, 비이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있으면서 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다.
본 출원의 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지에서 온도, pH 등이 조절된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 야로위아 속 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "야로위아 속 미생물" 또는 "야로위아 속 균주"는 야생형 야로위아 속 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 야로위아 속 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 레티놀 생산을 위한 유전적 변형(modification)을 포함하는 야로위아 속 미생물 역시 포함할 수 있다.
일 구현 예로, 본 출원의 야로위아 속 미생물은 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 출원의 야로위아 속 미생물은 레티놀 생산용 미생물이다. 상기 레티놀 생산용 미생물 또는 균주는 자연적으로 레티놀 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 레티놀 생산능이 없는 모균주에 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 레티놀 생산능이 강화되거나 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 본 출원의 레티놀 생산용 야로위아 속 미생물은 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제(lycopene cyclase/phytoene synthase, crtYB), 파이토엔 디새튜라아제(phytoene desaturase, crtI) 및 베타카로틴 15, 15'-옥시게나제(beta-carotene 15,15'-oxygenase, BLH) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 변형된 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제(lycopene cyclase/phytoene synthase, crtYB) 및 파이토엔 디새튜라아제(phytoene desaturase, crtI) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하도록 변형되어, 이들 단백질 활성을 나타내는 미생물 또는 이들 단백질 활성이 강화된 미생물일 수 있다. 상기 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제 또는 파이토엔 디새튜라아제는 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous) 유래의 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 구현 예로 상기 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제 또는 파이토엔 디새튜라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)에 등록되어 있는 염기서열(GenBank: AY177204.1 또는 GenBank: AY177424.1)에 근거하여 가지거나 포함하는 것일 수 있다. 일 구현 예로 상기 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제 또는 파이토엔 디새튜라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2를 가지거나 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase; GGPPS) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하도록 변형되어, 이들 단백질 활성을 나타내는 미생물 또는 이들 단백질 활성이 강화된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제는 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) 유래의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현 예로 상기 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)에 등록되어 있는 염기서열(GenBank: APX64485.1)에 근거하여 가지거나 포함하는 것일 수 있다. 일 구현 예로 상기 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33의 서열을 가지거나 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 33의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 베타카로틴 15, 15'-옥시게나제(beta-carotene 15,15'-oxygenase; BLH) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하도록 변형되어, 이들 단백질 활성을 나타내는 미생물 또는 이들 단백질 활성이 강화된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 베타카로틴 15, 15'-옥시게나제는 해양세균 66A03(Uncultured marine bacterium 66A03) 유래의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현 예로 상기 베타카로틴 15, 15'-옥시게나제 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 UniProtKB(UniProt Knowledgebase)에 등록되어 있는 아미노산 서열(Q4PNI0)에 근거하여 가지거나 포함하는 것일 수 있다. 일 구현 예로 상기 베타카로틴 15, 15'-옥시게나제 폴리펩티드는 서열번호 57의 서열을 가지거나 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리펩티드는 서열번호 57의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 57의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 야로위아 속 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서, 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지를 이용하는 한, 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 야로위아 속 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 35℃ 구체적으로는 25 내지 35℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간, 약 20 시간 내지 130 시간, 약 24 시간 내지 120 시간, 약 36 시간 내지 120 시간, 약 48시간 내지 120시간, 약 48 시간 이상, 또는 약 48시간, 약 72 시간, 또는 약 120 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 레티놀은 배지 중으로 분비되거나 미생물 내에 잔류할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "레티놀(retinol)"은 비타민 A로 알려진 물질이다. 상기 레티놀은 그 자체로 사용될 수도 있으나, 당업계에 알려진 방법으로 다른 레티노이드(예를 들어, 레티날, 레티노산, 및 레티닐 에스터 등) 또는 카로티노이드류 화합물로 전환될 수 있다.
본 출원은 레티놀 생산용 미생물 배지에 비이온성 계면활성제를 첨가하여 레티놀 생산능을 현저히 증가시킨 것일 수 있다.
일 구현 예로, 상기 비이온성 계면활성제는 레티놀의 세포 외 배출을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.일 구현 예로, 비이온성 계면활성제를 첨가한 배지에서 미생물을 배양하였을 때 비이온성 계면활성제를 첨가하지 않은 배지에서 미생물을 배양하는 것에 비하여 레티놀 생산능이 약 1% 이상, 구체적으로는 약 3%, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 50% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상, 약 250% 이상, 약 300% 이상, 약 350% 이상, 약 380% 이상, 약 400% 이상, 약 450% 이상, 약 500% 이상, 약 550% 이상, 약 600% 이상, 약 650% 이상, 약 680% 이상 높아진 것일 수 있으나, 비이온성 계면활성제 첨가 전에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 레티놀 생산방법은, 본 출원의 야로위아 속 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
상기 배지는 레티놀 생산 증가를 위해 비이온성 계면활성제를 첨가한 것일 수 있다.
본 출원의 레티놀 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 미생물로부터 레티놀을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 레티놀을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 세포 파쇄, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 레티놀을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 레티놀 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 레티놀 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 이시적(또는 연속적)으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 레티노이드의 생산방법은 본 출원의 미생물이 발현한 레티놀을 레티놀 이외의 레티노이드로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 레티노이드 생산방법에 있어서, 상기 전환하는 단계는 상기 배양하는 단계 또는 상기 회수하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다. 상기 전환하는 단계는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨데, 상기 전환은 레티놀 아실트렌스퍼라아제(retinol acyltransferase)를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 레티노이드는 레티날, 레티노산, 및 레티닐 에스터로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 레티노이드에 포함되는 한 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 레티놀 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 비이온성 계면활성제, 배지, 미생물, 배양, 및 레티놀 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 야로위아 속 미생물 배지 조성물을 제공한다.
일 구현 예로, 상기 배지 조성물은 야로위아 속 미생물의 레티놀 생산을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 배지 조성물은 미생물 생육을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비이온성 계면활성제, 레티놀, 미생물, 및 배지는 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 야로위아 속 미생물 또는 이의 배양물 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 조성물은 레티놀 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물, 비이온성 계면활성제, 및 레티놀 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 비이온성 계면활성제의 레티놀 생산 용도; 비이온성 계면활성제를 포함하는 야로위아 속 미생물 배지 조성물의 레티놀 생산 용도; 및 야로위아 속 미생물 또는 이의 배양물 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물의 레티놀 생산 용도를 제공한다.
상기 비이온성 계면활성제, 미생물, 배지, 및 레티놀 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
본 출원의 배지는 비이온성 계면활성제를 포함함에 따라 레티놀 생산을 효율적으로 증가시킬 수 있다.
도 1a는 계면활성제 유무 및 이의 농도에 따른 베타카로틴 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 OD 값을 나타낸 도이다.
도 1b는 계면활성제 유무 및 이의 농도에 따른 레티놀 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 OD 값을 나타낸 도이다.
도 2a는 계면활성제 유무 및 이의 농도에 따른 베타카로틴 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 베타카로틴 농도를 나타낸 도이다.
도 2b는 계면활성제 유무 및 이의 농도에 따른 레티놀 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 베타카로틴, 레티날, 및 레티놀 농도를 나타낸 도이다.
도 3a는 Tween 계열 계면활성제 유무, 종류, 및 이의 농도에 따른 베타카로틴 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 OD 값을 나타낸 도이다.
도 3b는 Tween 계열 계면활성제 유무, 종류, 및 이의 농도에 따른 레티놀 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 OD 값을 나타낸 도이다.
도 4a는 Tween 계열 계면활성제 유무, 종류, 및 이의 농도에 따른 베타카로틴 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 베타카로틴 농도를 나타낸 도이다
도 4b는 Tween 계열 계면활성제 유무, 종류, 및 이의 농도에 따른 레티놀 생산 균주의 플라스크 배양 평가 결과로서 베타카로틴, 레티날, 및 레티놀 농도를 나타낸 도이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 레티놀 생산용 플랫폼 균주 제작
실시예 1-1. X. dendrorhous 유래 crtYB-crtI 삽입주 제작
레티놀 생산을 위한 야로위아 플랫폼 균주 제작을 위해 야로위아 리폴리티카(Yarrowia liplytica) KCCM12972P 균주의 게놈에 Xanthophyllomyces dendrorhous 유래 lycopene cyclase/phytoene synthase (crtYB)와 phytoene desaturase(crtI) 유전자를 삽입하였다.
crtYB의 경우, NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)에 등록되어 있는 염기서열(GenBank: AY177204.1)에 근거하여 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 확보하였고, crtI의 경우, NCBI에 등록되어 있는 염기서열(GenBank: AY177424.1)에 근거하여 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 확보하였다. crtYB와 crtI의 폴리뉴클레오티드 서열은 마크로젠社를 통해 TEFINtp-crtYB-CYC1t(서열번호 3) 및 TEFINtp-crtI-CYC1t(서열번호 4)의 형태로 유전자를 합성하였으며, 선별 마커로는 Y. lipolytica 의 URA3 유전자(서열번호 5)를 이용하여 MHY1(YALI0B21582g) 유전자 위치에 삽입되는 카세트를 디자인하였다.
합성된 crtYB, crtI 유전자 및 KCCM12972P genomic DNA를 주형으로 하고 표 1에 나타난 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15, 및 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 3분을 35회 반복 수행하였다. 그 결과로 얻어진 DNA 단편들을 overlap extension PCR을 통해 하나의 카세트로 제작하였다.
이렇게 제작된 카세트를 열충격법 (D.-C. Chen et al., Appl Microbiol Biotechnol, 1997)으로 KCCM12972P 균주에 도입한 후, 우라실(uracil)이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1)에서 형성된 콜로니를 획득하였다. 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 게놈 내에 카세트 삽입이 확인된 콜로니들을 5-FOA 고체배지에 도말하여 30°C에서 3일간 배양하였고, 5-FOA 고체 배지에서 형성된 콜로니를 획득함으로써 URA3 마커를 제거하였다.
서열
번호		 서열(5'- 3') PCR 산물
6 GTGCGCTTCTCTCGTCTCGGTAACCCTGTC Homology left arm
7 ATGCGCCGCCAACCCGGTCTCTGGGGTGTGGTGGATGGGGTGTG
8 CACACCCCATCCACCACACCCCAGAGACCGGGTTGGCGGCGCAT TEFINtp-crtYB-CYC1t
9 CGCCGCCAACCCGGTCTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCCG TEFINtp-crtYB-CYC1t
10 CGGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAGACCGGGTTGGCGGCG TEFINtp-crtI-CYC1t
11 GACGAGTCAGACAGGAGGCATCAGACAGATACTCGTCGCG TEFINtp-crtI-CYC1t
12 CGCGACGAGTATCTGTCTGATGCCTCCTGTCTGACTCGTC URA3
13 ATGACGAGTCAGACAGGAGGCATGGTGGTATTGTGACTGGGGAT
14 ATCCCCAGTCACAATACCACCATGCCTCCTGTCTGACTCGTCAT Repeat region
15 CGGCGTCCTTCTCGTAGTCCGCTTTTGGTGGTGAAGAGGAGACT
16 AGTCTCCTCTTCACCACCAAAAGCGGACTACGAGAAGGACGCCG Homology right arm
17 CCACTCGTCACCAACAGTGCCGTGTGTTGC
18 TCGTACGTCTATACCAACAGATGG Forward
19 CGCATACACACACACTGCCGGGGG Reverse
또한, 상기 우라실이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1) 및 5-FOA 배지 조성은 다음과 같다.
< Yarrowia lipolytica minimal media 1 (YLMM1)>
포도당 20 g/L, 아미노산을 포함하지 않는 효모 질소 염기(Yeast nitrogen base without amino acids) 6.7 g/L, 우라실을 포함하지 않는 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충물 (Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil) 2 g/L, 한천(agar) 15 g/L
<5-Fluoroorotic Acid (5-FOA)>
포도당 20 g/L, 아미노산을 포함하지 않는 효모 질소 염기(Yeast nitrogen base without amino acids) 6.7 g/L, 우라실을 포함하지 않는 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충물 (Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil) 2 g/L, 우라실(Uracil) 50 μg/mL, 5-플루오로 오로틴산(5-FOA) 1 g/L, 한천(agar) 15 g/L
실시예 1-2. HMGR 강화주 제작
앞서 실시예 1-1을 통해 제작된 균주의 하이드록시메틸글루타릴 리덕테이즈(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR) 유전자의 native 프로모터(서열번호 20) 부위를 TEFINt 프로모터로 교체하기 위한 카세트를 디자인하였고, KCCM12972P genomic DNA를 주형으로 하고 표 2에 나타난 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28, 및 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 1분 30초를 35회 반복 수행하였다. 그 결과로 얻어진 DNA 단편들은 overlap extension PCR을 통해 하나의 카세트로 제작하였다.
이렇게 제작된 카세트를 열충격법으로 실시예 1-1에서 제작한 균주에 도입한 후, 우라실이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1)에서 형성된 콜로니를 획득하였다. 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머를 이용하여 카세트 삽입이 확인된 콜로니들을 5-FOA 고체배지에 도말하여 30°C에서 3일간 배양하였고, 5-FOA 고체 배지에서 형성된 콜로니를 획득함으로써 URA3 마커를 제거하였다.
서열번호 서열(5'- 3') PCR 산물
21 GACAATGCCTCGAGGAGGTTTAAAAGTAACT Homology left arm
22 GCGCCGCCAACCCGGTCTCTCTGTGTTAGTCGGATGATAGG
23 CCTATCATCCGACTAACACAGAGAGACCGGGTTGGCGGCGC TEFINt promoter
24 GACGAGTCAGACAGGAGGCACTGCGGTTAGTACTGCAAAAAG TEFINt promoter
25 CTTTTTGCAGTACTAACCGCAGTGCCTCCTGTCTGACTCGTC URA3
26 ATGCGCCGCCAACCCGGTCTCTTGGTGGTATTGTGACTGGGGAT
27 ATCCCCAGTCACAATACCACCAAGAGACCGGGTTGGCGGCGCAT Repeat region
28 CTTTCCAATAGCTGCTTGTAGCTGCGGTTAGTACTGCAAAA
29 TTTTGCAGTACTAACCGCAGCTACAAGCAGCTATTGGAAAG Homology right arm
30 GCTTAATGTGATTGATCTCAAACTTGATAG
31 GCTGTCTCTGCGAGAGCACGTCGA Forward
32 GGTTCGCACAACTTCTCGGGTGGC Reverse
실시예 1-3. GGPPS 도입주 제작
앞서 실시예 1-2를 통해 제작된 균주의 게놈에 Haematococcus pluvialis 유래 Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase (GGPPS) 유전자를 삽입하였다.
GGPPS의 경우, NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)에 등록되어 있는 염기서열(GenBank: APX64485.1)에 근거하여 서열번호 33의 폴리뉴클레오티드를 확보하였다. GGPPS의 폴리뉴클레오티드 서열은 http://atgme.org를 통해 Y. lipolytica에 적합하도록 코돈 최적화를 진행하였고, 마크로젠社를 통해 TEFINtp-GGPPS-CYC1t(서열번호 34)의 형태로 유전자를 합성하였으며, 선별 마커로는 Y. lipolytica 의 URA3 유전자(서열번호 5)를 이용하여 LIG4(YALI0D21384g) 유전자 위치에 삽입되는 카세트를 디자인하였다. 합성된 GGPPS 유전자 및 KCCM12972P genomic DNA를 주형으로 하고, 표 3에 나타난 서열번호 35 및 서열번호 36, 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42, 및 서열번호 43 및 서열번호 44의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 2분을 35회 반복 수행하였다. 그 결과로 얻어진 DNA 단편들은 overlap extension PCR을 통해 하나의 카세트로 제작하였다.
이렇게 제작된 카세트를 열충격법으로 실시예 1-2에서 제작한 균주에 도입한 후, 우라실이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1)에서 형성된 콜로니를 획득하였다. 서열번호 45 및 서열번호 46의 프라이머를 이용하여 게놈 내에 카세트 삽입이 확인된 콜로니들을 5-FOA 고체배지에 도말하여 30°C에서 3일간 배양하였고, 5-FOA 고체 배지에서 형성된 콜로니를 획득함으로써 URA3 마커를 제거하였다.
서열번호 서열(5'- 3') PCR 산물
35 AAGACAAGGCTTCGGAAGCGAGAACCGCAA Homology left arm
36 ATGCGCCGCCAACCCGGTCTCTGTGTTTGGCGGTGTGAGTTGTC
37 GACAACTCACACCGCCAAACACAGAGACCGGGTTGGCGGCGCAT Repeat region
38 ATGACGAGTCAGACAGGAGGCACTGCGGTTAGTACTGCAAAAAG
39 CTTTTTGCAGTACTAACCGCAGTGCCTCCTGTCTGACTCGTCAT URA3
40 ATGCGCCGCCAACCCGGTCTCTTGGTGGTATTGTGACTGGGGAT
41 ATCCCCAGTCACAATACCACCAAGAGACCGGGTTGGCGGCGCAT TEFINtp-GGPPS-CYC1t
42 ATATGGAGTGTTATTTGAAGGGGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGT
43 ACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCCCCTTCAAATAACACTCCATAT Homology right arm
44 GTGTCCAAGTACGAACGCCAATGCAAGATT
45 CCAGTTATTTGTACCATGCGGTGG Forward
46 CCATCTTGTGTCGCGACGACGAAA Reverse
실시예 1-4. KU80 결손주 제작
향후 균주 제작의 용이성을 위해 앞서 실시예 1-3를 통해 제작된 균주의 KU80(YALI0E02068g) 유전자를 결손하였다. 이를 위해 선별 마커로는 Y. lipolytica 의 URA3 유전자(서열번호 5)를 이용하여 KU80 유전자 결손 카세트를 디자인하였다. 같이 KCCM12972P genomic DNA를 주형으로 하고 서열번호 47 및 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52, 및 서열번호 53 및 서열번호 54의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 1분 30초를 35회 반복 수행하였다. 그 결과로 얻어진 DNA 단편들은 overlap extension PCR을 통해 하나의 카세트로 제작되었다.
이렇게 제작된 카세트를 열충격법으로 앞서 실시예 1-3을 통해 제작된 균주에 도입한 후, 우라실이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1)에서 형성된 콜로니를 획득하였다. 서열번호 55 및 서열번호 56의 프라이머를 이용하여 게놈 내에 카세트 삽입이 확인된 콜로니들을 5-FOA 고체배지에 도말하여 30°C에서 3일간 배양하였고, 5-FOA 고체 배지에서 형성된 콜로니를 획득함으로써 URA3 마커를 제거하였고, 해당 균주를 CC08-1043이라고 명명하였다.
서열번호 서열(5'- 3') PCR 산물
47 CCCACCTCCTCCTCCTGCTCCCCCGGCAGCCCCTGCCGCCCCTG Homology left arm
48 ATGACGAGTCAGACAGGAGGCACCTAGTTAGTCAGAATTTTTGT
49 ACAAAAATTCTGACTAACTAGGTGCCTCCTGTCTGACTCGTCAT URA3
50 TACCGGTCGGTAGCTACAATACTGGTGGTATTGTGACTGGGGAT
51 ATCCCCAGTCACAATACCACCAGTATTGTAGCTACCGACCGGTA Repeat region
52 CGTGTAGATCCACCACATACACCCTAGTTAGTCAGAATTTTTGT
53 ACAAAAATTCTGACTAACTAGGGTGTATGTGGTGGATCTACACG Homology right arm
54 AAGTAGGAAACATGATGGCCTCTTCTTCCTCTTTTGTAATGTAC
55 CCCAACTCTCGAGGAAATGGCCAT Forward
56 CTGGGGATCTTTTCCATCCTTGTT Reverse
실시예 1-5. BLH 도입주 제작
실시예 1-4를 통해 제작된 균주의 게놈에 해양세균 66A03(Uncultured marine bacterium 66A03) 유래 beta-carotene 15,15'-oxygenase (BLH) 유전자를 삽입하였다. BLH 유전자는 UniProtKB(UniProt Knowledgebase)에 등록되어 있는 아미노산 서열(Q4PNI0)에 근거하여 서열번호 57의 폴리펩티드 서열을 확보하였다. 이를 http://atgme.org를 통해 Yarrowia lipolytica에 적합하도록 코돈 최적화한 후, Macrogen社를 통해 TEFINtp-BLH-CYC1t(서열번호 58)의 형태로 유전자를 합성하였으며, 선별 마커로는 Y. lipolytica의 URA3 유전자(서열번호 5)를 이용하여 KU70(YALI0C08701g) 유전자 위치에 삽입되는 카세트를 디자인하였다. 합성된 BLH 유전자 및 KCCM12972P genomic DNA를 주형으로 하고 표 5에 나타난 서열번호 59 및 서열번호 60, 서열번호 61 및 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66, 서열번호 67 및 서열번호 68의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 2분을 35회 반복 수행하였다. 그 결과로 얻어진 DNA 단편들은 overlap extension PCR을 통해 하나의 카세트로 제작하였다.
이렇게 제작된 카세트를 열충격법으로 실시예 1-4를 통해 제작된 균주에 도입한 후, 우라실이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1)에서 형성된 콜로니를 획득하였다. 서열번호 69 및 서열번호 70의 프라이머를 이용하여 게놈 내에 카세트 삽입이 확인된 콜로니들을 5-FOA 고체배지에 도말하여 30°C에서 3일간 배양하였고, 5-FOA 고체 배지에서 형성된 콜로니를 획득함으로써 URA3 마커를 제거하였고, 해당 균주를 CC08-2163이라고 명명하였다.
서열번호 서열(5'- 3') PCR 산물
59 GTACCCGGGGATCCTCTAGAGGCGTTTCAGGTGGTTGCGTGAGTG Homology left arm
60 GACACAAATGCGCCGCCAACCCGGTCTCTGCGGCGGTTCGTGGTTCGTGTTTC
61 GAAACACGAACCACGAACCGCCGCAGAGACCGGGTTGGCGGCGCATTTGTGTC TEFINtp-BLH-CYC1t
62 GACGAGTCAGACAGATACTCGTCGGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCC
63 GGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCCGACGAGTATCTGTCTGACTCGTC URA3
64 CAGGAAGAAGTAGATGCCGCCGCCGCAAAGGCCTGTTTCTCGGTGTACAG
65 CTGTACACCGAGAAACAGGCCTTTGCGGCGGCGGCATCTACTTCTTCCTG CYC1 terminator
66 GCAGCAGTCATACATGTTCTGAGGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCC
67 GGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCCTCAGAACATGTATGACTGCTGC Homology right arm
68 GCCTGCAGGTCGACTCTAGACTACTTTGTGCAGATTGAGGCCAAG
69 CTTGACCTTGTAGAGCTGACCGGC Forward
70 CACTACTTTCGCCACCAAGATGGG Reverse
실시예 2. 계면활성제 종류별 레티놀 생산능 비교 평가
실시예 2-1. 미생물 배양
계면활성제 종류 및 첨가 유무에 의한 베타카로틴 및 레티놀 생산 정도를 비교하기 위해 CC08-1043과 CC08-2163 균주를 대상으로 플라스크 평가를 진행하였다. CC08-1043 또는 CC08-2163 균주를 YLMM2(Yarrowia lipolytica minimal media2) 배지 20 ㎖을 포함하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 초기 OD=2가 되도록 접종하고, 5 종류의 계면활성제 Tween 20 (TW20, Sigma 社, CAS Number 9005-64-5), Tween 40 (TW40, Sigma 社, CAS Number 9005-66-7), Tween 60 (TW60, Sigma 社, CAS Number 9005-67-8), Tween 80 (TW80, Sigma 社, CAS Number 9005-65-6), 및 Span 80 (SP80, Sigma 社, CAS Number 1338-43-8)은 각각 2% 농도로, 2종류의 계면활성제 Sodium dodecyl sulfate (SDS, Sigma 社, CAS Number 151-21-3) 및 Triton X-100 (TX, Sigma 社, CAS Number 9036-19-5)은 각각 0.05 또는 1% 농도로 배지에 첨가하였다. 배양은 30°C, 200 rpm 조건으로 진행하였다. 첨가한 계면활성제 종류에 따라 당소모 속도가 상이했기에 잔당이 모두 소모된 48시간까지 배양하였다.
실시예 2-2: 미생물 성장 평가
배양 시간에 따른 성장 정도 확인을 위해 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 600nm 파장에서 OD값을 측정하였다.
두 균주에서의 OD값은 표 6에 나타내었으며, 베타카로틴 생산 균주(CC08-1043) 및 레티놀 생산 균주(CC08-2163)의 OD값을 각각 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.
균주 게면활성제 OD (A600)
24hr 48hr
CC08-1043 Control 32.2±0.6 37.0±1.2
2% TW20 37.8±1.7 42.0±3.3
2% TW40 43.3±1.1 53.2±2.1
2% TW60 41.1±2.5 60.1±5.5
2% TW80 39.3±2.2 55.8±4.3
2% SP80 31.2±1.8 53.1±3.5
0.05% SDS 1.1±0.0 1.4±0.0
1% SDS 2.0±0.0 2.2±0.0
0.05% TX 37.0±1.5 47.4±3.0
1% TX 34.8±2.0 54.3±4.0
CC08-2163 Control 31.7±0.5 41.0±1.5
2% TW20 36.1±1.4 43.0±3.1
2% TW40 39.2±1.2 50.6±2.4
2% TW60 37.6±2.4 61.6±4.9
2% TW80 37.3±2.2 51.7±4.0
2% SP80 19.5±7.0 52.8±5.1
0.05% SDS 1.4±0.0 1.5±0.0
1% SDS 2.1±0.0 2.1±0.0
0.05% TX 36.3±1.0 42.6±3.2
1% TX 36.2±1.8 54.1±3.8
그 결과, 본 실험에 사용한 계면활성제 중 음이온성 계면활성제인 SDS 첨가의 경우 모든 농도 조건에서 생육이 되지 않았다. SDS를 제외한 모든 종류의 계면활성제 첨가 조건에서 무첨가 조건 대비 바이오매스(OD)가 전반적으로 높은 경향이 있었다.
48시간 배양하여 당이 전부 소모된 계면활성제 첨가군(Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 80, 및 Triton X-100 첨가군)들에서 레티날, 레티놀, 및 베타카로틴 추출 및 농도 분석을 진행하였다.
실시예 2-3: 베타카로틴, 레티날, 및 레티놀 농도 평가
세포 내 및 세포 외 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날 농도 측정 방법은 다음과 같다.
세포 내(Int.) 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날 측정을 위해, 배양 종료 후의 배양액 0.05 ㎖을 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, DMSO(Dimethyl sulfoxide, sigma 社, Cas Number 67-68-5) 0.5 ㎖을 첨가하고 55 °C에서 10분 동안 진탕(agitation, 2,000rpm)을 하여 세포를 파쇄하였다. 그 다음 4% BHT(sigma 社, Cas Number 128-37-0)를 포함한 아세톤(sigma 社, Cas Number 67-64-1) 0.5 ㎖을 첨가하고 45 °C에서 15 분 동안 진탕(2,000rpm)하였으며, 이렇게 추출된 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날은 HPLC 설비를 이용하여 각각 정량 분석 하였다.
세포 외(Ext.) 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날 측정을 위해, 배양 종료 후의 균체가 제거된 상등액 0.05 ㎖에 4% BHT를 포함한 acetone(sigma 社) 0.95 ㎖을 첨가하고 45 °C에서 15 분 동안 진탕(2,000rpm)하였으며, 이렇게 추출된 베타카로틴, 레티날, 및 레티놀은 HPLC 설비를 이용하여 각각 정량 분석 하였다.
두 균주에서의 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날 농도(mg/L)는 표 7에 나타내었으며, 이의 분석 결과를 베타카로틴 생산 균주(CC08-1043) 배양 시 측정한 베타카로틴 농도는 도 2a에, 레티놀 생산균주(CC08-2163) 배양 시 측정한 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날 농도는 도 2b에 나타내었다.
균주 계면활성제 세포내(Intracellular) 세포외(Extracellular)
Retinol Retinal β-car. Retinol Retinal β-car.
CC08
-1043		 Control - - 53.8±3.1 - - ND
2% TW20 - - 57.4±4.3 - - ND
2% TW40 - - 70.8±2.8 - - ND
2% TW60 - - 76.5±3.0 - - ND
2% TW80 - - 76.1±4.7 - - ND
2% SP80 - - 46.4±8.2 - - ND
0.05% SDS - - ND - - ND
1% SDS - - ND - - ND
0.05% TX - - 45.9±2.8 - - ND
1% TX - - 64.1±3.7 - - ND
CC08
-2163		 Control 7.9±2.1 ND 2.3±0.7 ND ND ND
2% TW20 7.8±1.3 ND ND 20.2±2.1 ND ND
2% TW40 5.9±1.5 ND 1.7±0.4 32.7±1.3 ND ND
2% TW60 ND ND 2.8±1.0 30.4±3.4 ND ND
2% TW80 ND ND 2.6±1.2 33.8±1.5 ND ND
2% SP80 ND ND 2.7±1.5 ND ND ND
0.05% SDS ND ND ND ND ND ND
1% SDS ND ND ND ND ND ND
0.05% TX 16.5±2.2 ND 1.4±0.9 ND ND ND
1% TX 12.1±0.8 ND 1.7±2.1 42.0±2.7 2.8±1.8 ND
그 결과, 베타카로틴을 생산하는 CC08-1043 균주 평가에서, 비 이온성 계면활성제(Nonionic surfactant)로 알려진 Tween 계열의 계면활성제(Tween 20, Tween 40, Tween 60, 및 Tween 80) 첨가군에서는, 무첨가군 대비 베타카로틴 농도가 최대 1.4배 증가하였으나, Span80과 0.05% Triton X-100 첨가군에서는 베타카로틴 농도가 10% 이상 감소됨을 확인하였다(도 2a).
앞선 결과와는 달리, Tween 계열(TW20, 40, 60, 및 80) 및 Triton 계열(Triton X-100)의 계면활성제 모두 레티놀 생산이 증가되었다. 계면활성제 미첨가군(control)에서는 세포 외 레티놀은 확인되지 않고 세포 내 레티놀(Intracellular Retinol)만 측정되었다.
이러한 결과를 바탕으로, 비이온 계면활성제 첨가 시 무첨가 조건 대비 레티놀 생성 농도가 최대 6.8배 이상 증가됨을 확인하였다.
실시예 3. Tween 계열의 계면활성제 농도별 레티놀 생산능 비교 평가
실시예 3-1. 미생물 배양
비이온성 계면활성제인 Tween 계열의 계면활성제 첨가농도에 따른 베타카로틴 및 레티놀 생산 정도를 비교하기 위해 CC08-1043과 CC08-2163 균주를 대상으로 플라스크 평가를 진행하였다. CC08-1043 및 CC08-2163 균주를 각각 YLMM2(Yarrowia lipolytica minimal media2) 배지 20 ㎖을 포함하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 초기 OD=2가 되도록 접종하고, 4 종류의 계면활성제 Tween 20 (TW20), Tween 40 (TW40), Tween 60 (TW60), 및 Tween 80 (TW80)을 각각 5, 10 또는 15% 농도로 배지에 첨가하였다. 배양은 30°C, 200 rpm 조건으로 진행하였다. 계면활성제 농도에 따라 당소모 속도가 상이하기에 당이 모두 소모되는 48시간까지 배양하였다.
실시예 3-2: 미생물 성장 평가
실시예 2-2와 동일한 방법으로 미생물 성장을 평가하였다. 두 균주에서의 OD 값은 하기 표 8에 나타내었으며, 베타카로틴 생산 균주(CC08-1043) 및 레티놀 생산 균주(CC08-2163)의 분석된 OD값은 각각 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
균주 계면활성제 OD (A600)
24hr 48hr
CC08-1043 Control 32.6±1.4 34.5±1.2
5% TW20 34.4±1.8 44.3±3.4
10% TW20 40.7±0.8 47.7±2.1
15% TW20 34.1±2.2 50.8±5.4
5% TW40 42.4±1.9 61.2±4.3
10% TW40 43.3±1.7 63.9±3.7
15% TW40 45.9±0.7 68.5±2.1
5% TW60 40.3±2.4 62.2±1.3
10% TW60 40.7±1.6 63.7±2.8
15% TW60 37.9±2.1 62.2±2.2
5% TW80 31.2±1.0 56.1±2.4
10% TW80 26.7±1.7 54.6±2.1
15% TW80 24.4±2.8 56.1±1.7
CC08-2163 Control 29.2±0.7 39.0±1.1
5% TW20 37.4±1.8 50.7±3.0
10% TW20 35.7±1.0 52.0±1.8
15% TW20 32.9±2.1 51.3±2.7
5% TW40 40.0±2.4 66.4±2.2
10% TW40 41.1±1.8 63.9±1.4
15% TW40 41.4±2.7 66.4±2.5
5% TW60 40.6±1.5 67.6±3.1
10% TW60 41.1±2.4 62.7±3.1
15% TW60 45.5±2.2 64.8±4.4
5% TW80 33.9±1.3 61.1±2.2
10% TW80 25.6±1.4 56.1±2.5
15% TW80 22.4±2.1 56.2±3.2
그 결과, 계면활성제의 농도에 상관없이 모든 Tween 계열의 계면활성제 첨가군에서 무첨가군 대비 바이오매스(OD)가 전반적으로 높은 경향이 나타났으며, Tween40, Tween60, 또는 Tween80 첨가군에서 바이오매스가(OD)가 더 높은 경향이 있었다. 그러나 같은 종류의 Tween 첨가군들 사이에서 농도에 따른 바이오매스(OD) 차이는 크지 않음을 확인하였다(도 3).
실시예 3-3: 베타카로틴, 레티날, 및 레티놀 농도 평가
실시예 2-3과 동일한 방법으로 베타카로틴, 레티날, 및 레티놀 농도를 평가하였다.
두 균주에서의 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날 농도(mg/L)는 표 9에 나타내었으며, 이의 분석 결과를 베타카로틴 생산 균주(CC08-1043) 배양 시 측정한 베타카로틴 농도는 도 4a에, 레티놀 생산균주(CC08-2163) 배양 시 측정한 베타카로틴, 레티놀, 및 레티날 농도는 도 4b에 나타내었다.
균주 계면활성제 세포내(Intracellular) 세포외(Extracelluar)
Retinol Retinal β-car. Retinol Retinal β-car.
CC08-1043 Control - - 51.0±3.2 - - ND
5% TW20 - - 56.7±3.5 - - ND
10% TW20 - - 57.2±4.1 - - ND
15% TW20 - - 59.2±2.0 - - ND
5% TW40 - - 75.2±3.1 - - ND
10% TW40 - - 74.7±3.4 - - ND
15% TW40 - - 74.5±2.7 - - ND
5% TW60 - - 75.2±2.2 - - ND
10% TW60 - - 71.5±3.0 - - ND
15% TW60 - - 66.6±2.1 - - ND
5% TW80 - - 78.3±2.3 - - ND
10% TW80 - - 73.1±5.5 - - ND
15% TW80 - - 68.5±1.9 - - ND
CC08-2163 Control 10.5±1.2 ND ND ND ND ND
5% TW20 ND ND ND 27.2±1.8 2.1±0.3 ND
10% TW20 ND ND ND 27.9±1.2 2.1±0.2 ND
15% TW20 ND ND ND 28.1±2.1 2.1±0.3 ND
5% TW40 ND ND 3.4±0.7 35.4±1.3 2.7±1.1 ND
10% TW40 ND ND 4.7±1.1 39.6±1.0 2.7±0.4 ND
15% TW40 ND ND 4.7±0.4 30.6±1.8 2.6±0.2 ND
5% TW60 ND ND 3.6±0.2 40.0±0.8 2.9±0.7 ND
10% TW60 ND ND 3.4±0.3 34.1±1.4 2.8±1.2 ND
15% TW60 ND ND 3.0±0.3 29.7±0.9 2.5±0.4 ND
5% TW80 ND ND 3.6±0.3 39.8±1.1 3.46±0.2 ND
10% TW80 ND ND 4.4±0.5 33.1±2.7 2.79±0.4 ND
15% TW80 ND ND 3.2±0.3 34.0±1.4 2.7±0.6 ND
그 결과, 베타카로틴을 생산하는 CC08-1043 균주 평가에서는, 계면활성제의 농도 및 종류와 상관없이 모든 농도의 모든 Tween 계열 계면활성제 첨가군에서 무첨가군 대비 세포 내 베타카로틴 생성 농도가 전체적으로 높은 경향이 있었다(도 4a). 결과적으로 Tween 계열의 계면활성제 첨가군은, 무첨가군 대비 베타카로틴 농도가 최대 1.5배 증가하였다.
레티놀을 생산하는 CC08-2163 균주 평가에서는, Tween 계열의 계면활성제 첨가군에서만 세포 외 레티놀이 측정됨을 확인하였다(도 4b).이와 달리 계면활성제 미첨가군에서는 상대적으로 소량의 세포 내 레티놀(Intracellular Retinol)만 측정됨을 확인하였다. 레티놀의 세포 외 배출능은 Tween 종류별 최적 농도가 상이하였다. 그 예로 Tween20은 농도별 레티놀 생성량에 대한 차이가 없었으나, Tween40은 10%, Tween60과 Tween80은 5% 첨가 조건에서 가장 높은 세포 외 레티놀 농도가 측정되었다.
결과를 종합하면, Tween 종류에 따라 레티놀 생산 및 세포 외 배출 정도가 상이하나 무첨가군 대비 레티놀 생성 농도가 특정 Tween 첨가 조건에서 최대 3.8배 이상 증가하였다(도 4b).
상기 결과를 통해 배지에 비이온성 계면활성제를 첨가하면, 레티놀 생산 균주의 생육이 촉진될 뿐만 아니라 레티놀 생산 농도도 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12972P 20210409
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism culture medium composition for retinol production comprising surfactant <130> KPA220050-KR <160> 70 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2022 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtYB derived from X. dendrorhous <400> 1 atgacggctc tcgcatatta ccagatccat ctgatctata ctctcccaat tcttggtctt 60 ctcggcctgc tcacttcccc gattttgaca aaatttgaca tctacaaaat atcgatcctc 120 gtatttattg cgtttagtgc aaccacacca tgggactcat ggatcatcag aaatggcgca 180 tggacatatc catcagcgga gagtggccaa ggcgtgtttg gaacgtttct agatgttcca 240 tatgaagagt acgctttctt tgtcattcaa accgtaatca ccggcttggt ctacgtcttg 300 gcaactaggc accttctccc atctctcgcg cttcccaaga ctagatcgtc cgccctttct 360 ctcgcgctca aggcgctcat ccctctgccc attatctacc tatttaccgc tcaccccagc 420 ccatcgcccg acccgctcgt gacagatcac tacttctaca tgcgggcact ctccttactc 480 atcaccccac ctaccatgct cttggcagca ttatcaggcg aatatgcttt cgattggaaa 540 agtggccgag caaagtcaac tattgcagca atcatgatcc cgacggtgta tctgatttgg 600 gtagattatg ttgctgtcgg tcaagactct tggtcgatca acgatgagaa gattgtaggg 660 tggaggcttg gaggtgtact acccattgag gaagctatgt tcttcttact gacgaatcta 720 atgattgttc tgggtctgtc tgcctgcgat catactcagg ccctatacct gctacacggt 780 cgaactattt atggcaacaa aaagatgcca tcttcatttc ccctcattac accgcctgtg 840 ctctccctgt tttttagcag ccgaccatac tcttctcagc caaaacgtga cttggaactg 900 gcagtcaagt tgttggagga aaagagccgg agcttttttg ttgcctcggc tggatttcct 960 agcgaagtta gggagaggct ggttggacta tacgcattct gccgggtgac tgatgatctt 1020 atcgactctc ctgaagtatc ttccaacccg catgccacaa ttgacatggt ctccgatttt 1080 cttaccctac tatttgggcc cccgctacac ccttcgcaac ctgacaagat cctttcttcg 1140 cctttacttc ctccttcgca cccttcccga cccacgggaa tgtatcccct cccgcctcct 1200 ccttcgctct cgcctgccga gctcgttcaa ttccttaccg aaagggttcc cgttcaatac 1260 catttcgcct tcaggttgct cgctaagttg caagggctga tccctcgata cccactcgac 1320 gaactcctta gaggatacac cactgatctt atctttccct tatcgacaga ggcagtccag 1380 gctcggaaga cgcctatcga gaccacagct gacttgctgg actatggtct atgtgtagca 1440 ggctcagtcg ccgagctatt ggtctatgtc tcttgggcaa gtgcaccaag tcaggtccct 1500 gccaccatag aagaaagaga agctgtgtta gtggcaagcc gagagatggg aactgccctt 1560 cagttggtga acattgctag ggacattaaa ggggacgcaa cagaagggag attttaccta 1620 ccactctcat tctttggtct tcgggatgaa tcaaagcttg cgatcccgac tgattggacg 1680 gaacctcggc ctcaagattt cgacaaactc ctcagtctat ctccttcgtc cacattacca 1740 tcttcaaacg cctcagaaag cttccggttc gaatggaaga cgtactcgct tccattagtc 1800 gcctacgcag aggatcttgc caaacattct tataagggaa ttgaccgact tcctaccgag 1860 gttcaagcgg gaatgcgagc ggcttgcgcg agctacctac tgatcggccg agagatcaaa 1920 gtcgtttgga aaggagacgt cggagagaga aggacagttg ccggatggag gagagtacgg 1980 aaagtcttga gtgtggtcat gagcggatgg gaagggcagt aa 2022 <210> 2 <211> 1749 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtI derived from X. dendrorhous <400> 2 atgggaaaag aacaagatca ggataaaccc acagctatca tcgtgggatg tggtatcggt 60 ggaatcgcca ctgccgctcg tcttgctaaa gaaggtttcc aggtcacggt gttcgagaag 120 aacgactact ccggaggtcg atgctcttta atcgagcgag atggttatcg attcgatcag 180 gggcccagtt tgctgctctt gccagatctc ttcaagcaga cattcgaaga tttgggagag 240 aagatggaag attgggtcga tctcatcaag tgtgaaccca actatgtttg ccacttccac 300 gatgaagaga ctttcactct ttcaaccgac atggcgttgc tcaagcggga agtcgagcgt 360 tttgaaggca aagatggatt tgatcggttc ttgtcgttta tccaagaagc ccacagacat 420 tacgagcttg ctgtcgttca cgtcctgcag aagaacttcc ctggcttcgc agcattctta 480 cggctacagt tcattggcca aatcctggct cttcacccct tcgagtctat ctggacaaga 540 gtttgtcgat atttcaagac cgacagatta cgaagagtct tctcgtttgc agtgatgtac 600 atgggtcaaa gcccatacag tgcgcccgga acatattcct tgctccaata caccgaattg 660 accgagggca tctggtatcc gagaggaggc ttttggcagg ttcctaatac tcttcttcag 720 atcgtcaagc gcaacaatcc ctcagccaag ttcaatttca acgctccagt ttcccaggtt 780 cttctctctc ctgccaagga ccgagcgact ggtgttcgac ttgaatccgg cgaggaacat 840 cacgccgatg ttgtgattgt caatgctgac ctcgtttacg cctccgagca cttgattcct 900 gacgatgcca gaaacaagat tggccaactg ggtgaagtca agagaagttg gtgggctgac 960 ttagttggtg gaaagaagct caagggaagt tgcagtagtt tgagcttcta ctggagcatg 1020 gaccgaatcg tggacggtct gggcggacac aatatcttct tggccgagga cttcaaggga 1080 tcattcgaca caatcttcga ggagttgggt ctcccagccg atccttcctt ttacgtgaac 1140 gttccctcgc gaatcgatcc ttctgccgct cccgaaggca aagatgctat cgtcattctt 1200 gtgccgtgtg gccatatcga cgcttcgaac cctcaagatt acaacaagct tgttgctcgg 1260 gcaaggaagt ttgtgatcca cacgctttcc gccaagcttg gacttcccga ctttgaaaaa 1320 atgattgtgg cagagaaggt tcacgatgct ccctcttggg agaaagaatt caacctcaag 1380 gacggaagca tcttgggact ggctcacaac tttatgcaag ttcttggttt caggccgagc 1440 accagacatc ccaagtatga caagttgttc tttgtcgggg cttcgactca tcccggaact 1500 ggggttccca tcgtcttggc tggagccaag ttaactgcca accaagttct cgaatccttt 1560 gaccgatccc cagctccaga tcccaatatg tcactctccg taccatatgg aaaacctctc 1620 aaatcaaatg gaacgggtat cgattctcag gtccagctga agttcatgga tttggagaga 1680 tgggtatacc ttttggtgtt gttgattggg gccgtgatcg ctcgatccgt tggtgttctt 1740 gctttctga 1749 <210> 3 <211> 2804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFINtp-crtYB-CYC1t <400> 3 agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60 cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120 aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180 cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240 gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300 aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360 cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420 aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480 acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca gacggctctc 540 gcatattacc agatccatct gatctatact ctcccaattc ttggtcttct cggtctgctc 600 acttccccga ttttgacaaa atttgacatc tacaaaatat cgatcctcgt atttattgcg 660 tttagtgcaa ccacaccatg ggactcatgg atcatcagaa atggcgcatg gacatatcca 720 tcagcggaga gtggccaagg cgtgtttgga acgtttctag atgttccata tgaagagtac 780 gctttctttg tcattcaaac cgtaatcacc ggcttggtct acgtcttggc aactaggcac 840 cttctcccat ctctcgcgct tcccaagact agatcgtccg ccctttctct cgcgctcaag 900 gcgctcatcc ctctgcccat tatctaccta tttaccgctc accccagccc atcgcccgac 960 ccgctcgtga cagatcacta cttctacatg cgggcactct ccttactcat caccccacct 1020 accatgctct tggcagcatt atcaggcgaa tatgctttcg attggaaaag tggccgagca 1080 aagtcaacta ttgcagcaat catgatcccg acggtgtatc tgatttgggt agattatgtt 1140 gctgtcggtc aagactcttg gtcgatcaac gatgagaaga ttgtagggtg gaggcttgga 1200 ggtgtactac ccattgagga agctatgttc ttcttactga cgaatctaat gattgttctg 1260 ggtctgtctg cctgcgatca tactcaggcc ctatacctgc tacacggtcg aactatttat 1320 ggcaacaaaa agatgccatc ttcatttccc ctcattacac cgcctgtgct ctccctgttt 1380 tttagcagcc gaccatactc ttctcagcca aaacgtgact tggaactggc agtcaagttg 1440 ttggaggaaa agagccggag cttttttgtt gcctcggctg gatttcctag cgaagttagg 1500 gagaggctgg ttggactata cgcattctgc cgggtgactg atgatcttat cgactctcct 1560 gaagtatctt ccaacccgca tgccacaatt gacatggtct ccgattttct taccctacta 1620 tttgggcccc cgctacaccc ttcgcaacct gacaagatcc tttcttcgcc tttacttcct 1680 ccttcgcacc cttcccgacc cacgggaatg tatcccctcc cgcctcctcc ttcgctctcg 1740 cctgccgagc tcgttcaatt ccttaccgaa agggttcccg ttcaatacca tttcgccttc 1800 aggttgctcg ctaagttgca agggctgatc cctcgatacc cactcgacga actccttaga 1860 ggatacacca ctgatcttat ctttccttta tcgacagagg cagtccaggc tcggaagacg 1920 cctatcgaga ccacagctga cttgctggac tatggtctat gtgtagcagg ctcagtcgcc 1980 gagctattgg tctatgtctc ttgggcaagt gcaccaagtc aggtccctgc caccatagaa 2040 gaaagagaag ctgtgttagt ggcaagccga gagatgggaa ctgcccttca gttggtgaac 2100 attgctaggg acattaaagg ggacgcaaca gaagggagat tttacctacc actctcattc 2160 tttggtcttc gggatgaatc aaagcttgcg atcccgactg attggacgga acctcggcct 2220 caagatttcg acaaactcct cagtctatct ccttcgtcca cattaccatc ttcaaacgcc 2280 tcagaaagct tccggttcga atggaagacg tactcgcttc cattagtcgc ctacgcagag 2340 gatcttgcca aacattctta taagggaatt gaccgacttc ctaccgaggt tcaagcggga 2400 atgcgagcgg cttgcgcgag ctacctactg atcggccgag agatcaaagt cgtttggaaa 2460 ggagacgtcg gagagagaag gacagttgcc ggatggagga gagtacggaa agtcttgagt 2520 gtggtcatga gcggatggga agggcagtaa ctcgagtcat gtaattagtt atgtcacgct 2580 tacattcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg 2640 aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat 2700 ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa 2760 ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgc 2804 <210> 4 <211> 2531 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFINtp-crtI-CYC1t <400> 4 agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60 cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120 aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180 cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240 gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300 aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360 cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420 aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480 acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca gggaaaagaa 540 caagatcagg ataaacccac agctatcatc gtgggatgtg gtatcggtgg aatcgccact 600 gccgctcgtc ttgctaaaga aggtttccag gtcacggtgt tcgagaagaa cgactactcc 660 ggaggtcgat gctctttaat cgagcgagat ggttatcgat tcgatcaggg gcccagtttg 720 ctgctcttgc cagatctctt caagcagaca ttcgaagatt tgggagagaa gatggaagat 780 tgggtcgatc tcatcaagtg tgaacccaac tatgtttgcc acttccacga tgaagagact 840 ttcactcttt caaccgacat ggcgttgctc aagcgggaag tcgagcgttt tgaaggcaaa 900 gatggatttg atcggttctt gtcgtttatc caagaagccc acagacatta cgagcttgct 960 gtcgttcacg tcctgcagaa gaacttccct ggcttcgcag cattcttacg gctacagttc 1020 attggccaaa tcctggctct tcaccccttc gagtctatct ggacaagagt ttgtcgatat 1080 ttcaagaccg acagattacg aagagtcttc tcgtttgcag tgatgtacat gggtcaaagc 1140 ccatacagtg cgcccggaac atattccttg ctccaataca ccgaattgac cgagggcatc 1200 tggtatccga gaggaggctt ttggcaggtt cctaatactc ttcttcagat cgtcaagcgc 1260 aacaatccct cagccaagtt caatttcaac gctccagttt cccaggttct tctctctcct 1320 gccaaggacc gagcgactgg tgttcgactt gaatccggcg aggaacatca cgccgatgtt 1380 gtgattgtca atgctgacct cgtttacgcc tccgagcact tgattcctga cgatgccaga 1440 aacaagattg gccaactggg tgaagtcaag agaagttggt gggctgactt agttggtgga 1500 aagaagctca agggaagttg cagtagtttg agcttctact ggagcatgga ccgaatcgtg 1560 gacggtctgg gcggacacaa tatcttcttg gccgaggact tcaagggatc attcgacaca 1620 atcttcgagg agttgggtct cccagccgat ccttcctttt acgtgaacgt tccctcgcga 1680 atcgatcctt ctgccgctcc cgaaggcaaa gatgctatcg tcattcttgt gccgtgtggc 1740 catatcgacg cttcgaaccc tcaagattac aacaagcttg ttgctcgggc aaggaagttt 1800 gtgatccaca cgctttccgc caagcttgga cttcccgact ttgaaaaaat gattgtggca 1860 gagaaggttc acgatgctcc ctcttgggag aaagaattca acctcaagga cggaagcatc 1920 ttgggactgg ctcacaactt tatgcaagtt cttggtttca ggccgagcac cagacatccc 1980 aagtatgaca agttgttctt tgtcggggct tcgactcatc ccggaactgg ggttcccatc 2040 gtcttggctg gagccaagtt aactgccaac caagttctcg aatcctttga ccgatcccca 2100 gctccagatc ccaatatgtc actctccgta ccatatggaa aacctctcaa atcaaatgga 2160 acgggtatcg attctcaggt ccagctgaag ttcatggatt tggagagatg ggtatacctt 2220 ttggtattgt tgattggggc cgtgatcgct cgatccgttg gtgttcttgc tttctgactc 2280 gagtcatgta attagttatg tcacgcttac attcacgccc tccccccaca tccgctctaa 2340 ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt tttatagtta 2400 tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg tacagacgcg 2460 tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgaagg 2520 ctttaatttg c 2531 <210> 5 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA3 derived from Y. lipolytica <400> 5 tgcctcctgt ctgactcgtc attgccgcct ttggagtacg actccaacta tgagtgtgct 60 tggatcactt tgacgataca ttcttcgttg gaggctgtgg gtctgacagc tgcgttttcg 120 gcgcggttgg ccgacaacaa tatcagctgc aacgtcattg ctggctttca tcatgatcac 180 atttttgtcg gcaaaggcga cgcccagaga gccattgacg ttctttctaa tttggaccga 240 tagccgtata gtccagtcta tctataagtt caactaactc gtaactatta ccataacata 300 tacttcactg ccccagataa ggttccgata aaaagttctg cagactaaat ttatttcagt 360 ctcctcttca ccaccaaaat gccctcctac gaagctcgag ctaacgtcca caagtccgcc 420 tttgccgctc gagtgctcaa gctcgtggca gccaagaaaa ccaacctgtg tgcttctctg 480 gatgttacca ccaccaagga gctcattgag cttgccgata aggtcggacc ttatgtgtgc 540 atgatcaaga cccatatcga catcattgac gacttcacct acgccggcac tgtgctcccc 600 ctcaaggaac ttgctcttaa gcacggtttc ttcctgttcg aggacagaaa gttcgcagat 660 attggcaaca ctgtcaagca ccagtacaag aacggtgtct accgaatcgc cgagtggtcc 720 gatatcacca acgcccacgg tgtacccgga accggaatca ttgctggcct gcgagctggt 780 gccgaggaaa ctgtctctga acagaagaag gaggacgtct ctgactacga gaactcccag 840 tacaaggagt tcctggtccc ctctcccaac gagaagctgg ccagaggtct gctcatgctg 900 gccgagctgt cttgcaaggg ctctctggcc actggcgagt actccaagca gaccattgag 960 cttgcccgat ccgaccccga gtttgtggtt ggcttcattg cccagaaccg acctaagggc 1020 gactctgagg actggcttat tctgaccccc ggggtgggtc ttgacgacaa gggagacgct 1080 ctcggacagc agtaccgaac tgttgaggat gtcatgtcta ccggaacgga tatcataatt 1140 gtcggccgag gtctgtacgg ccagaaccga gatcctattg aggaggccaa gcgataccag 1200 aaggctggct gggaggctta ccagaagatt aactgttaga ggttagacta tggatatgtc 1260 atttaactgt gtatatagag agcgtgcaag tatggagcgc ttgttcagct tgtatgatgg 1320 tcagacgacc tgtctgatcg agtatgtatg atactgcaca acctgtgtat ccgcatgatc 1380 tgtccaatgg ggcatgttgt tgtgtttctc gatacggaga tgctgggtac aagtagctaa 1440 tacgattgaa ctacttatac ttatatgagg cttgaagaaa gctgacttgt gtatgactta 1500 ttctcaacta catccccagt cacaatacca cca 1533 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 6 gtgcgcttct ctcgtctcgg taaccctgtc 30 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 7 atgcgccgcc aacccggtct ctggggtgtg gtggatgggg tgtg 44 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 8 cacaccccat ccaccacacc ccagagaccg ggttggcggc gcat 44 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 9 cgccgccaac ccggtctctt gaagacgaaa gggcctccg 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 10 cggaggccct ttcgtcttca agagaccggg ttggcggcg 39 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 11 gacgagtcag acaggaggca tcagacagat actcgtcgcg 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 12 cgcgacgagt atctgtctga tgcctcctgt ctgactcgtc 40 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 13 atgacgagtc agacaggagg catggtggta ttgtgactgg ggat 44 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 14 atccccagtc acaataccac catgcctcct gtctgactcg tcat 44 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of crtYB-crtI <400> 15 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tatggttcgt tcaattttcg ccaaaaatcg ttttgccttt gtatcttggg 180 aataacatca actgtggttc ttcaacaggc ctaaggaacg aaacaagccg gaccaagatc 240 aggttcaagg tgagtactga gaaggaatag aaggcctaaa ggcgcaaacc gacaggtggc 300 aacagctcca caccgaccac gaaggccacg aaatcaaggg gtcctaaagt tagtctttgt 360 ggcctcgacg gtcagcgaaa acgcgagacc acaacgcgat cagaaccagg acctaaacaa 420 cacaggacgg ggtcacaata ggcttgaaca gcaagtacaa gctgtgatct ctctatattt 480 gattctcaaa ccacccctga ctacttcagc gcctctgtga cacagccccc ctatcatccg 540 actaacacag 550 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 21 gacaatgcct cgaggaggtt taaaagtaac t 31 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 22 gcgccgccaa cccggtctct ctgtgttagt cggatgatag g 41 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 23 cctatcatcc gactaacaca gagagaccgg gttggcggcg c 41 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 24 gacgagtcag acaggaggca ctgcggttag tactgcaaaa ag 42 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 25 ctttttgcag tactaaccgc agtgcctcct gtctgactcg tc 42 <210> 26 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 26 atgcgccgcc aacccggtct cttggtggta ttgtgactgg ggat 44 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 27 atccccagtc acaataccac caagagaccg ggttggcggc gcat 44 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 28 ctttccaata gctgcttgta gctgcggtta gtactgcaaa a 41 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 29 ttttgcagta ctaaccgcag ctacaagcag ctattggaaa g 41 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for enhancement of HMGR <400> 30 gcttaatgtg attgatctca aacttgatag 30 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for HMGR enhancement <400> 31 gctgtctctg cgagagcacg tcga 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for HMGR enhancement <400> 32 ggttcgcaca acttctcggg tggc 24 <210> 33 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase derived from H. pluvialis <400> 33 atgatccgag cgatgcacaa ccgggcgccc acacctcgaa ctcgagtgtc tcatccacgc 60 tcacataggg ctctggcaca tgtctcagcc gtagcaacag cagggcaggt ggcagaggtc 120 cactctgctc ctgcctttga cttcgagatg tacatgagag acagagctga gatggtcaac 180 aaggctcttg atgctgcatt gccatctaga taccctgagg tgctggttga ttccatgagg 240 tactccgtac ttgcgggtgg caagcgcgtg aggcctgccc tgacactggc tgcgtgcgac 300 cttgtaggag gggacatggc cactgcccta cccaccgcat gtgccatgga gatgatccac 360 accatgagcc tcatccatga tgacctgcca gccatggaca atgacgactt caggcgaggt 420 cggcccacaa accataaggt gtatggtgag gacattgcca tccttgctgg tgacgcgctg 480 ctgtcctttg cctttgagca catcgcccgg gacaccaaag gcgtgccggc tgatgcggtg 540 ctgaaggtca tcatggagct gggccgggcc gtgggcgcgc agggcctatc agcaggccag 600 gctgttgaca taaagagcga gggccaggag gtggggctgg aggtgctgga gtacatccac 660 caccacaaga cagctgcact gctggaggcg gcagtggtgt gcggcgcact ggtgggcggg 720 gccgacaccg ccaccgtgga gaagctgcgc aagtacgcgc tgaacattgg gctggccttc 780 caggtgattg atgacatcct ggacgtcact caaaccaccg aaaccttggg caagaccgca 840 gccaaagacc tggcggtgaa caagaccacc tatcccaagc tgctgggtct ggaagccagc 900 aggaaggtgg cggacgactt gatcagggag gctatagcac agttagacga gtttgagcct 960 gcacgcaagg cgcccatggt ggccctggcc cacctcatag ggtaccgcaa gaactga 1017 <210> 34 <211> 1793 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFINtp-GGPPS-CYC1t <400> 34 agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60 cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120 aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180 cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240 gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300 aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360 cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420 aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480 acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca gatccgagcc 540 atgcacaacc gagcccccac cccccgaacc cgagtgtctc acccccgatc tcaccgagcc 600 ctggcccacg tgtctgccgt ggccaccgcc ggccaggtgg ccgaggtgca ctctgccccc 660 gccttcgact tcgagatgta catgcgagac cgagccgaga tggtgaacaa ggccctggac 720 gccgccctgc cctctcgata ccccgaggtg ctggtggact ctatgcgata ctctgtgctg 780 gccggcggca agcgagtgcg acccgccctg accctggccg cctgtgacct ggtgggcggc 840 gacatggcca ccgccctgcc caccgcctgt gccatggaga tgatccacac catgtctctg 900 atccacgacg acctgcccgc catggacaac gacgacttcc gacgaggccg acccaccaac 960 cacaaggtgt acggcgagga catcgccatc ctggccggcg acgccctgct gtctttcgcc 1020 ttcgagcaca tcgcccgaga caccaagggc gtgcccgccg acgccgtgct gaaggtgatc 1080 atggagctgg gccgagccgt gggcgcccag ggcctgtctg ccggccaggc cgtggacatc 1140 aagtctgagg gccaggaggt gggcctggag gtgctggagt acatccacca ccacaagacc 1200 gccgccctgc tggaggccgc cgtggtgtgt ggcgccctgg tgggcggcgc cgacaccgcc 1260 accgtggaga agctgcgaaa gtacgccctg aacatcggcc tggccttcca ggtgatcgac 1320 gacatcctgg acgtgaccca gaccaccgag accctgggca agaccgccgc caaggacctg 1380 gccgtgaaca agaccaccta ccccaagctg ctgggcctgg aggcctctcg aaaggtggcc 1440 gacgacctga tccgagaggc catcgcccag ctggacgagt tcgagcccgc ccgaaaggcc 1500 cccatggtgg ccctggccca cctgatcggc taccgaaaga actagtcatg taattagtta 1560 tgtcacgctt acattcacgc cctccctcca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta 1620 gacaacctga agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt 1680 tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta 1740 tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgc 1793 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 35 aagacaaggc ttcggaagcg agaaccgcaa 30 <210> 36 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 36 atgcgccgcc aacccggtct ctgtgtttgg cggtgtgagt tgtc 44 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 37 gacaactcac accgccaaac acagagaccg ggttggcggc gcat 44 <210> 38 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 38 atgacgagtc agacaggagg cactgcggtt agtactgcaa aaag 44 <210> 39 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 39 ctttttgcag tactaaccgc agtgcctcct gtctgactcg tcat 44 <210> 40 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 40 atgcgccgcc aacccggtct cttggtggta ttgtgactgg ggat 44 <210> 41 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 41 atccccagtc acaataccac caagagaccg ggttggcggc gcat 44 <210> 42 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 42 atatggagtg ttatttgaag gggcaaatta aagccttcga gcgt 44 <210> 43 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 43 acgctcgaag gctttaattt gccccttcaa ataacactcc atat 44 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for insertion of GGPPS <400> 44 gtgtccaagt acgaacgcca atgcaagatt 30 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for GGPPS insertion <400> 45 ccagttattt gtaccatgcg gtgg 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for GGPPS insertion <400> 46 ccatcttgtg tcgcgacgac gaaa 24 <210> 47 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 47 cccacctcct cctcctgctc ccccggcagc ccctgccgcc cctg 44 <210> 48 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 48 atgacgagtc agacaggagg cacctagtta gtcagaattt ttgt 44 <210> 49 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 49 acaaaaattc tgactaacta ggtgcctcct gtctgactcg tcat 44 <210> 50 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 50 taccggtcgg tagctacaat actggtggta ttgtgactgg ggat 44 <210> 51 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 51 atccccagtc acaataccac cagtattgta gctaccgacc ggta 44 <210> 52 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 52 cgtgtagatc caccacatac accctagtta gtcagaattt ttgt 44 <210> 53 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 53 acaaaaattc tgactaacta gggtgtatgt ggtggatcta cacg 44 <210> 54 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for KU80 deletion <400> 54 aagtaggaaa catgatggcc tcttcttcct cttttgtaat gtac 44 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for KU80 deletion <400> 55 cccaactctc gaggaaatgg ccat 24 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for KU80 deletion <400> 56 ctggggatct tttccatcct tgtt 24 <210> 57 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BLH polypeptide <400> 57 Met Gly Leu Met Leu Ile Asp Trp Cys Ala Leu Ala Leu Val Val Phe 1 5 10 15 Ile Gly Leu Pro His Gly Ala Leu Asp Ala Ala Ile Ser Phe Ser Met 20 25 30 Ile Ser Ser Ala Lys Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gly Ile Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Leu Leu Ala Thr Ala Phe Phe Leu Ile Trp Tyr Gln Leu Pro 50 55 60 Ala Phe Ser Leu Leu Ile Phe Leu Leu Ile Ser Ile Ile His Phe Gly 65 70 75 80 Met Ala Asp Phe Asn Ala Ser Pro Ser Lys Leu Lys Trp Pro His Ile 85 90 95 Ile Ala His Gly Gly Val Val Thr Val Trp Leu Pro Leu Ile Gln Lys 100 105 110 Asn Glu Val Thr Lys Leu Phe Ser Ile Leu Thr Asn Gly Pro Thr Pro 115 120 125 Ile Leu Trp Asp Ile Leu Leu Ile Phe Phe Leu Cys Trp Ser Ile Gly 130 135 140 Val Cys Leu His Thr Tyr Glu Thr Leu Arg Ser Lys His Tyr Asn Ile 145 150 155 160 Ala Phe Glu Leu Ile Gly Leu Ile Phe Leu Ala Trp Tyr Ala Pro Pro 165 170 175 Leu Val Thr Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Phe Ile His Ser Arg Arg His 180 185 190 Phe Ser Phe Val Trp Lys Gln Leu Gln His Met Ser Ser Lys Lys Met 195 200 205 Met Ile Gly Ser Ala Ile Ile Leu Ser Cys Thr Ser Trp Leu Ile Gly 210 215 220 Gly Gly Ile Tyr Phe Phe Leu Asn Ser Lys Met Ile Ala Ser Glu Ala 225 230 235 240 Ala Leu Gln Thr Val Phe Ile Gly Leu Ala Ala Leu Thr Val Pro His 245 250 255 Met Ile Leu Ile Asp Phe Ile Phe Arg Pro His Ser Ser Arg Ile Lys 260 265 270 Ile Lys Asn 275 <210> 58 <211> 1604 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEFINtp-BLH-CYC1t <400> 58 agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60 cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120 aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180 cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240 gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300 aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360 cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420 aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480 acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca gggcctgatg 540 ctgatcgact ggtgtgccct ggccctggtg gtgttcatcg gcctgcccca cggcgccctg 600 gacgccgcca tctctttctc tatgatctct tctgccaagc gaatcgcccg actggccggc 660 atcctgctga tctacctgct gctggccacc gccttcttcc tgatctggta ccagctgccc 720 gccttctctc tgctgatctt cctgctgatc tctatcatcc acttcggcat ggccgacttc 780 aacgcctctc cctctaagct gaagtggccc cacatcatcg cccacggcgg cgtggtgacc 840 gtgtggctgc ccctgatcca gaagaacgag gtgaccaagc tgttctctat cctgaccaac 900 ggccccaccc ccatcctgtg ggacatcctg ctgatcttct tcctgtgttg gtctatcggc 960 gtgtgtctgc acacctacga gaccctgcga tctaagcact acaacatcgc cttcgagctg 1020 atcggcctga tcttcctggc ctggtacgcc ccccccctgg tgaccttcgc cacctacttc 1080 tgtttcatcc actctcgacg acacttctct ttcgtgtgga agcagctgca gcacatgtct 1140 tctaagaaga tgatgatcgg ctctgccatc atcctgtctt gtacctcttg gctgatcggc 1200 ggcggcatct acttcttcct gaactctaag atgatcgcct ctgaggccgc cctgcagacc 1260 gtgttcatcg gcctggccgc cctgaccgtg ccccacatga tcctgatcga cttcatcttc 1320 cgaccccact cttctcgaat caagatcaag aactagtcat gtaattagtt atgtcacgct 1380 tacattcacg ccctccctcc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg 1440 aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat 1500 ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa 1560 ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgc 1604 <210> 59 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 59 gtacccgggg atcctctaga ggcgtttcag gtggttgcgt gagtg 45 <210> 60 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 60 gacacaaatg cgccgccaac ccggtctctg cggcggttcg tggttcgtgt ttc 53 <210> 61 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 61 gaaacacgaa ccacgaaccg ccgcagagac cgggttggcg gcgcatttgt gtc 53 <210> 62 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 62 gacgagtcag acagatactc gtcggcaaat taaagccttc gagcgtccc 49 <210> 63 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 63 gggacgctcg aaggctttaa tttgccgacg agtatctgtc tgactcgtc 49 <210> 64 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 64 caggaagaag tagatgccgc cgccgcaaag gcctgtttct cggtgtacag 50 <210> 65 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 65 ctgtacaccg agaaacaggc ctttgcggcg gcggcatcta cttcttcctg 50 <210> 66 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 66 gcagcagtca tacatgttct gaggcaaatt aaagccttcg agcgtccc 48 <210> 67 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 67 gggacgctcg aaggctttaa tttgcctcag aacatgtatg actgctgc 48 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to prepare cassette for BLH insertion <400> 68 gcctgcaggt cgactctaga ctactttgtg cagattgagg ccaag 45 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for BLH insertion <400> 69 cttgaccttg tagagctgac cggc 24 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to confirm insertion of cassette for BLH insertion <400> 70 cactactttc gccaccaaga tggg 24

Claims (15)

  1. 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 레티놀 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 트윈(tween) 및 트리톤(Triton)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 레티놀 생산방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 트윈(Tween)은 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 및 트윈 80으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 레티놀 생산방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 레티놀의 세포 외 배출을 증가시키는 것인, 레티놀 생산방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 레티놀 생산용인 것인, 레티놀 생산방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 전체 배지 조성물 대비 0.01%(w/v) 이상의 농도로 포함되는 것인, 레티놀 생산방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 배지 또는 미생물로부터 레티놀을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 레티놀 생산방법.
  8. 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 레티놀 생산을 증가시키는 방법.
  9. 비이온성 계면활성제를 포함하는 배지에서 야로위아 속 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 미생물이 발현한 레티놀을 레티놀 이외의 레티노이드로 전환하는 단계를 포함하는 레티노이드 생산방법.
  10. 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 야로위아 속 미생물 배지 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 트윈 및 트리톤으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 배지 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 전체 배지 조성물 대비 0.01% 이상의 농도로 포함되는 것인, 배지 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 배지 조성물은 미생물의 레티놀 생산을 증가시키는 것인, 배지 조성물.
  14. 야로위아 속 미생물 또는 이의 배양물 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 레티놀 생산용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 미생물은 레티놀 생산용인 것인, 레티놀 생산용 조성물.
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BR112022006218A2 (pt) * 2019-10-22 2022-06-28 Biophero Aps Método para produzir um composto hidrofóbico, para aumentar o título de um composto hidrofóbico, para aumentar a secreção de um composto hidrofóbico e para monitorar a presença de praga ou romper a reprodução de praga, e, composto hidrofóbico

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