JP2019501638A - ニコチンアミドリボシドの微生物生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年9月28日に出願された米国仮特許出願第62/233,696号および2015年11月13日に出願された米国仮特許出願第62/254,736号の出願日の優先権を主張し、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本開示の実施形態は、ニコチンアミドリボシドの新規製造方法と、そのような方法において有用な発現ベクターおよび宿主細胞とに関する。
ニコチンアミドリボシド(NR)は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはNAD+の前駆体として機能する、ビタミンB3のピリジン−ヌクレオシド形態である。高用量のニコチン酸は、その機序は完全に理解されてはいないが、高密度リポタンパク質コレステロールを上昇させ、低密度リポタンパク質コレステロールを低下させ、遊離脂肪酸を低下させるのを助け得ると考えられている。ニコチンアミドリボシドは、従来、化学的に合成されている。ニコチンアミドリボシドの合成をもたらす生物学的経路は知られているが、生物学的にニコチンアミドリボシドを生産することは依然として難題である。したがって、ニコチンアミドリボシドをより効率的に生産するための新しい方法を同定することが望ましい。
本発明は、ニコチンアミドリボシド(NR)を産生できる遺伝子修飾細菌を対象とし、その中で、細菌は、a)異種性ニコチン酸アミド化タンパク質(NadE*)の活性を添加すること;b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含んでなり、その中で、前記少なくとも1つの修飾を有する細菌は、前記修飾のいずれも有しない細菌よりも増加した量のNRを産生する。
添付の配列表に列挙される核酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を用いて示される。各核酸配列のうちの1つの鎖だけが示されるが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれるものと理解される。添付の配列表中:
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
クラスアミノ酸の例:
非極性:A、V、L、I、P、M、F、W
非電荷極性:G、S、T、C、Y、N、Q
酸性:D、E
塩基性:K、R、H。
[実施例1]
[NaMNアミド化活性をコードする配列の同定(NadE*)]
Sorciおよび共同研究者は、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)(配列番号1)のゲノムにコードされるFtNadE*酵素を同定し、生体内および生体外の双方でニコチンアミドモノヌクレオチド(NaMN)アミド化酵素として機能する能力を実証した(Sorci L.e.,2009)。さらに、彼らは、3つのアミノ酸残基が、NaAD:Y27;Q133;およびR236よりもNaMNに対しての酵素の基質選択性の原因であることを提案した。この機能をコードする追的な配列を同定するために、FtNadE(配列番号2)のアミノ酸配列を有するtBlastnのデフォルトパラメータを使用して、2016年9月14にNCBInr/ntデータベースのBLAST検索から導かれた50個のユニークなヌクレオチド配列をGeneiasアラインメントアルゴリズム(Biomatters,LLLC)を用いて翻訳し整列させた。これらの配列のうちの16個は、保存されたチロシン、グルタミン、およびアルギニンを有し、それぞれY27、Q133およびR236と整列して(すなわち、「YQ Rモチーフ」を含有した)、NaMNアミド化酵素をコードすることが予測された(配列番号3〜18および図5)。
[大腸菌(E.coli)におけるNaMNアミド化活性(NadE*)の発現のための遺伝子構築物]
16の予測されたnadE*遺伝子セット中で、統学的距離を最大化することに基づいて、予測されたnadE*読み取り枠(配列番号2および19〜27)をコードする10個の配列が選択され(図6)、大腸菌(E.coli)K−12コドン使用頻度表によって、閾値の希少度を0.4に設定し、Geneiousコドン最適化アルゴリズムを用いて、大腸菌(E.coli)における発現のためにコドン最適化した。最適化された配列(配列番号28〜37)は、GenScript,Inc.によって新規合成され、これもまたGenScriptによってXhoI/NdeI消化pET24a(+)(Novagen,Inc.)にクローン化されて、表1のプラスミドを得た。NR合成を誘導し、ME407、ME644、ME645、ME646、ME647、ME648、ME649、ME650、ME651、ME652株を得るために、プラスミドをBL21(DE3)に形質転換して、nadE*遺伝子のIPTG誘導を可能にした(表2)。
[NadE*酵素を発現する大腸菌(E.coli)株の特性決定]
NR産生に対するNadE*発現の効果を試験するために、大腸菌(E.coli)株を単一コロニーからLB培地に接種して、一晩増殖させた(2mL、37°C、15mL試験管、250rpm、50μg/mLのカナマイシン)。前培養(200μL)を使用して、25μMのIPTG含有または非含有の2mLのM9nC培地に接種し、AirPoreテープシート(Qiagen)で密封した24ウェル深型ウェルプレート(Whatman Uniplate、丸底10mL)内で3日間増殖させた(Invers Multitron Shaker、800rpm、80%湿度)。サンプルは、本明細書に記載されるように、LC−MSによって分析した。プラスミドなしでは、NR産生は、25μMのIPTGの誘導の存在下および非存在下において、定量限界以下であった。NadE*酵素の発現のためのプラスミドを保有する菌株は、誘導時に最大2.7mg/LのNRを産生した(表3)。
[大腸菌(E.coli)におけるNR産生の増加はY27、Q133、およびR236を有するNadE*を必要とする]
NR産生のためのYQRモチーフの重要性を実証するために、大腸菌(E.coli)最適化されたNadE*配列のうち4つを改変して、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)Y27、Q133、R236残基と整列する残基を除去し、バチルス・アンシラシス(Bacillus anthracis)NadE(それぞれT、G、およびV;配列番号42〜45)でコードされるアミノ酸残基で置換した。対応するpET24a(+)プラスミドの部位特異的変異誘発がGenScript,Incによって実施され、表1のプラスミドを得た。プラスミドをBL21(DE3)に形質転換し、nadE−TGV遺伝子のIPTG誘導を可能にし、菌株ME708、ME710、ME712、およびME714を得た(表2)。NadE−TGVを有するこれらの株は、NR産生において、NadE*を有する株と同様のIPTG依存性増加を示さなかった(表4)。
[大腸菌(E.coli)NadEの過剰発現は増加したNR産生を観察するには十分でない]
高レベルのNaADアミド化活性(NadE)が、増加したNR蓄積を生じるには十分でないことを実証するために、それぞれ開始コドンおよび停止コドンにXhoI/Ndel制限部位を付加するプライマーM011159およびMO11160を有するBL21(DE3)のゲノムから(表5)、PCRによって野生型nadE読み取り(配列番号46)枠を増幅した。PCR断片を同様に消化したpET24a(+)にライゲートさせ、プラスミドpET24b+nadEBL21を得た。このプラスミドをBL21(DE3)に形質転換し、nadEのIPTG誘導を可能にし、株ME683を得た。NadE*配列を発現する株と共にNR産生について試験した際、大腸菌(E.coli)NadEの追加的な発現を有するこの株は、NR濃度のIPTG依存性増加を示さなかった。(表4)。
[NR蓄積の基礎レベルが増加したB.サブチリス(B.subtilis)の構築]
より高い産物蓄積の状況においてNR蓄積を促進するNadE*酵素の有効性を実証するために、NR蓄積の基礎レベルの増加のために宿主株を遺伝子操作した。大腸菌(E.coli)株DH5a、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)株ATCC13032、およびB.サブチリス(B.subtilis)株168を富栄養培地(大腸菌(E.coli)ではLB、C.グルタミカム(C.glutamiucm)およびB.サブチリス(B.subtilis)ではBHI)中で一晩培養し、2mLのM9nC培地に1:10で接種した。24時間後、培養物をMSのために試料採取し、相対NRレベルを調べた。B.サブチリス(B.subtilis)のNR産生は、大腸菌(E.coli)またはC.グルタミカム(C.glutamiucm)よりも高く、さらなる遺伝子操作のための宿主として選択された。
[NadE*を発現するB.サブチリス(B.subtilis)株の構築および特性決定]
NadE*活性をコードする4つの配列は、B.サブチリス(B.subtilis)における発現のためにコドン最適化され(Geneiousコドン最適化アルゴリズムB.サブチリス(B.subtilis)168コドン使用頻度表、0.4で希少であると設定される閾値)、最適化配列(配列番号38〜41)は、IDTによってgBlocksとして合成された。最適化されたNadE*配列の発現のためのカセットを、LF−PCRによって作製した。適切なプライマー(表5)およびpDG1662(Bacillus Genetic Stock Center)およびgBlocksをテンプレートとして使用して、amyE5’領域、cat(クロラムフェニコール耐性)、pVeglプロモーターを含む隣接領域と、amyE3’領域を含む隣接領域とを上記のように増幅した。ゲル精製された隣接領域およびgBlocks(上記)を上記のようにLF−PCRのために使用して、生成物をゲル精製した。
[NadE*を発現するコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)株の構築および特性決定]
細菌におけるNRの生産のためのこれらの配列の一般的有用性をさらに実証するために、FnNadE*をコードする配列をC.グルタミカム(C.glutamicum)における発現のためにコドン最適化(Geneiousコドン最適化アルゴリズムC.グルタミカム(C.glutamicum)コドン使用頻度表、0.4で希少であると設定される閾値)し、最適化配列(配列番号47)を、EcoRI制限部位およびコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)コンセンサスRBSをコードするオープンリーディングフレームの上流の追加的な配列と、Smal制限部位をコードする下流の追加的な配列と共に、IDTによってgBlockとして合成した。gBlockをEcoRI/SmaIで消化して760bpのフラグメントを得て、これを同様に消化されたMB4124にライゲートし、プラスミドMB4124−FnNadE*を得た。MB4124は、MB4094(米国特許出願公開第60/692,037号明細書に記載される)をpTrc99aに由来するIPTG誘導性プロモーター(Gene.1988 Sep 30;69(2):301−15)と組み合わせることによって、潜在的C.グルタミカム(C.glutamicum)低コピーpBLlプラスミド(Santamaria et al.J.Gen.Microbiol,130:2237−2246,1984を参照されたい)から誘導した。C.グルタミカム(C.glutamicum)株ATCC 13032は、FnNadE*のIPTG誘導性発現のために、プラスミドで形質転換した(Foliettie,M.T.,etal.j.Bacterid.167:695−702,1993)。
[生産培養におけるニコチンアミドリボシドの検出]
NRを液体クロマトグラフィー/質量分析(LCMS)によって分析した。培養後、100μLを96ウェル深型ウェルプレート内の900μLのMS希釈剤(10%水、10mM酢酸アンモニウム、pH9.0、90%アセトニトリル)中に希釈した。プレートを遠心分離し(10分間、3000rpm)、上清を特性決定のために新しいプレートに移し入れた。上清を5μl部分で、HILICUPLCカラム(Waters BEH Amide、2.1×75mm、製品番号1860005657)に注入した。1分間の保持後に、99.9%(95%アセトニトリル/5%水を含むpH9.0の10mM酢酸アンモニウム)移動相Dから70%移動相C(50/50アセトニトリル/水を含むpH9.0の10mM酢酸アンモニウム)への直線勾配を使用して、12分間かけて400μL/分の流速で化合物を溶出し、移動相C中での1分間の保持と、移動相D中での5分間の再平衡がそれに続いた(表8)。溶出化合物は、陽性エレクトロスプレーイオン化を用いて三重四極(quadropole)質量分析計で検出した。装置をMRMモードで操作し、遷移m/z123>80を用いてNRを検出した。同一条件下で注入された標準物質(Chromadex)と比較して、NRを定量化した。
[細菌増殖および産生アッセイで使用される培地]
1リットルのVY培地は、25gの子牛肉浸出液(Difco)、5gのバクト酵母抽出物(Difco)を含有する。
Claims (26)
- ニコチンアミドリボシド(NR)を産生できる遺伝子修飾細菌であって、前記細菌が、
a)異種性ニコチン酸アミド化タンパク質(NadE*)の活性を添加すること;
b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含んでなり、前記少なくとも1つの修飾を有する細菌が、前記修飾のいずれも有しない細菌よりも増加した量のNRを産生する、遺伝子修飾細菌。 - 前記細菌が、
a)nadA、nadB、nadC遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することで、NAD+生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
b)ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
c)ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
d)ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
e)プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
f)ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること;および
g)L−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(phoshoribosyltransferase)、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される1つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなる、請求項1に記載の細菌。 - 前記NadE*タンパク質が、配列番号1および3〜18のいずれか1つと、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチドに変換するためのニコチン酸アミド化活性を有する、請求項1または請求項2に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)加水分解タンパク質が、配列番号66〜70のいずれか1つと、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、NAD+をニコチンアミドモノヌクレオチドおよびアデニンに変換するためのNAD+加水分解活性を有する、請求項に1または請求項2に記載の細菌。
- 前記NAD+生合成の負の調節因子が、配列番号51、52、または53のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドがNAD+生合成を抑制する活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドリボシド輸送体が、配列番号54、55、または56のいずれか1つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドリボシドを移入するためのニコチンアミドリボシド輸送活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドモノヌクレオシドヒドロラーゼが、配列番号57、58、または59のいずれか1つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドモノヌクレオチドをニコチンアミドリボシドに変換するためのヌクレオシドヒドロラーゼ活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号63、64、または65のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチン酸アデニンジヌクレオチドに変換するためのニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼタンパク質が、配列番号60、61、または62のいずれか1つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドモノヌクレオチドをニコチン酸モノヌクレオチドに変換するためのニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼタンパク質が、配列番号72〜76のいずれか1つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドリボシドおよびリン酸をニコチンアミドおよびリボース−1−リン酸に変換するためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌であって、前記キノリン酸シンターゼが、配列番号77、78、または79のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、イミノコハク酸およびジヒドロキシアセトンリン酸からキノリン酸を形成する活性を有し、または前記L−アスパラギン酸オキシダーゼが、配列番号80または81のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、アスパラギン酸からイミノコハク酸を形成する活性を有し、または前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、配列番号82、83、または84のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、キノリン酸およびホスホリボシルピロリン酸からニコチン酸モノヌクレオチドを形成する活性を有する、細菌。
- 前記細菌が、大腸菌(E.coli)、B.サブチリス(B.subtilis)、C.グルタミカム(C.glutamicum)、A.バイリイ(A.baylyi)、およびR.オイトロファ(R.eutropha)からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記NadE*タンパク質が、配列番号1の標準アミノ酸配列と比較すると、a)GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0. 1のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのGonnet 250シリーズを用いて配列番号1および3〜18と比較した際に、アライメントのClustalW法に基づく、27位のチロシン、b)133位のグルタミン、およびc)236位のアルギニンの保存アミノ酸の1つまたは複数を有する、請求項3〜12のいずれか一項に記載の細菌。
- NRを生産してNRを培地から回収するのに効果的な条件下で菌細胞を培養し、それによってNRを生産するステップを含んでなる、NRを生産する方法であって、前記宿主微生物が、
a)異種性ニコチン酸アミド化タンパク質(NadE*)の活性を添加すること;
b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)加水分解タンパク質の活性を添加しまたは増加させること;
c)nadA、nadB、nadC遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでNAD+生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
d)ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
e)ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
f)ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
g)プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
h)ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること;および
i)L−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(phoshoribosyltransferase)、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含んでなる、方法。 - NRを生産してNRを培地から回収するのに効果的な条件下で菌細胞を培養し、それによってNRを生産するステップを含んでなる、NRを生産する方法であって、前記宿主微生物が、
a)異種性ニコチン酸アミド化タンパク質(NadE*)の活性を添加すること;
b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含んでなる、方法。 - 細菌細胞が、
a)nadA、nadB、nadC遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでNAD+生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
b)ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
c)ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
d)ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
e)プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
f)ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること;および
i)L−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(phoshoribosyltransferase)、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも1つの修飾をさらに含んでなる、請求項15に記載の方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の遺伝子修飾細菌から得られる、ニコチンアミドリボシド化合物。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細菌から得られるニコチンアミドリボシド化合物を含んでなる、組成物。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細菌から得られるニコチンアミドリボシド化合物を含んでなる、食品または飼料。
- 遺伝子修飾の結果としてNRを産生し、その中で細菌が培養される発酵ブロス中に、産生されたNRを少なくとも100mg/Lまで蓄積し得ることによって特徴付けられる、遺伝子修飾細菌。
- 前記遺伝子修飾が、a)異種性ニコチン酸アミド化タンパク質(NadE*)の活性を添加すること;b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される、請求項20に記載の遺伝子修飾細菌。
- 前記遺伝子修飾が、
a)nadA、nadB、nadC遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでNAD+生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
b)ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
c)ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
d)ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
e)プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること;
f)ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること;および
g)L−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(phoshoribosyltransferase)、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される、1つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなる、請求項21に記載の遺伝子修飾細菌。 - 前記NadE*タンパク質が、配列番号1および3〜18のいずれか1つと、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチド変換するためのニコチン酸アミド化活性を有する、請求項22に記載の遺伝子修飾細菌。
- 前記NadE*タンパク質が、配列番号1の標準アミノ酸配列と比較すると、GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0. 1のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのGonnet 250シリーズを用いて配列番号1および3〜18と比較した際に、アライメントのClustalW法に基づく、a)27位のチロシン、b)133位のグルタミン、およびc)236位のアルギニンの保存アミノ酸の1つまたは複数を有する、請求項23に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)加水分解タンパク質が、配列番号66〜70のいずれか1つと、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、NAD+をニコチンアミドモノヌクレオチドおよびアデニンに変換するためのNAD+加水分解活性を有する、請求項20〜24のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記細菌が、大腸菌(E.coli)、B.サブチリス(B.subtilis)、C.グルタミカム(C.glutamicum)、A.バイリイ(A.baylyi)、およびR.オイトロファ(R.eutropha)からなる群から選択される、請求項1〜13および20〜25のいずれか一項に記載の細菌。
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