JP2019501638A - ニコチンアミドリボシドの微生物生産 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ニコチンアミドリボシドの生成をもたらす経路を調節することによってニコチンアミドリボシドを生産するための新規方法、発現ベクター、および宿主細胞に関する。【選択図】図１
Description
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２３３，６９６号および２０１５年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／２５４，７３６号の出願日の優先権を主張し、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０１５年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２３３，６９６号および２０１５年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／２５４，７３６号の出願日の優先権を主張し、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
［技術分野］
本開示の実施形態は、ニコチンアミドリボシドの新規製造方法と、そのような方法において有用な発現ベクターおよび宿主細胞とに関する。
本開示の実施形態は、ニコチンアミドリボシドの新規製造方法と、そのような方法において有用な発現ベクターおよび宿主細胞とに関する。
［発明の背景］
ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはＮＡＤ＋の前駆体として機能する、ビタミンＢ３のピリジン−ヌクレオシド形態である。高用量のニコチン酸は、その機序は完全に理解されてはいないが、高密度リポタンパク質コレステロールを上昇させ、低密度リポタンパク質コレステロールを低下させ、遊離脂肪酸を低下させるのを助け得ると考えられている。ニコチンアミドリボシドは、従来、化学的に合成されている。ニコチンアミドリボシドの合成をもたらす生物学的経路は知られているが、生物学的にニコチンアミドリボシドを生産することは依然として難題である。したがって、ニコチンアミドリボシドをより効率的に生産するための新しい方法を同定することが望ましい。
ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはＮＡＤ＋の前駆体として機能する、ビタミンＢ３のピリジン−ヌクレオシド形態である。高用量のニコチン酸は、その機序は完全に理解されてはいないが、高密度リポタンパク質コレステロールを上昇させ、低密度リポタンパク質コレステロールを低下させ、遊離脂肪酸を低下させるのを助け得ると考えられている。ニコチンアミドリボシドは、従来、化学的に合成されている。ニコチンアミドリボシドの合成をもたらす生物学的経路は知られているが、生物学的にニコチンアミドリボシドを生産することは依然として難題である。したがって、ニコチンアミドリボシドをより効率的に生産するための新しい方法を同定することが望ましい。
細菌におけるＮＡＤ＋の生合成は、１９９０年代に初めて解明され、真核生物には見られない、ＦＡＤ依存性Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ（ＮａｄＢ、ＥＣ１．４．３．１６）；およびキノラートシンターゼ（ＮａｄＡ、ＥＣ２．５．１．７２）の２つの重要な酵素活性に依存することが示された（Ｆｌａｃｈｍａｎｎ，１９８８，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７５（２），２２１−２２８）。ＮａｄＢは、Ｌ−アスパラギン酸のイミノコハク酸への酸化を触媒し、電子受容体として分子酸素を利用して過酸化水素を生成し、緩く結合したフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子がそれに関与する（Ｓｅｉｆｅｒｔ，１９９０，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，３７１（１），２３９−２４８）。大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中の酵素は、下流産物ＮＡＤ＋を阻害することが知られている（Ｎａｓｕ Ｓ，１９８２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５７（２），６２６−３２）が、フィードバック耐性変異株が作製されている（Ｈｕｇｈｅｓ，１９８３，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５４（３），１１２６−３６）。鉄−硫黄クラスターを含有するＮａｄＡが、引き続いて、イミノコハク酸とジヒドロキシアセトンリン酸との縮合および環化を行い、キノラートを生成する（Ｆｌａｃｈｍａｎｎ，１９８８）。これらの２つの酵素を合わせた活性は、１モルのアスパラギン酸と１モルのジヒドロキシアセトンリン酸から１モルのキノラートを生成する。
３つのさらなる酵素活性が、ＮＡＤ＋合成の２つの標準的な新生経路に共通している：キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮａｄＣ、ＥＣ２．４．２．１９）；ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（ＮａｄＤ、ＥＣ２．７．７．１８）；およびＮＡＤ＋シンセターゼ（ＮａｄＥ、ＥＣ６．３．１．５）。ＮａｄＣは、ホスホリボシル部分をホスホリボシルピロリン酸（ｐｈｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からキノラート窒素に移動させ、引き続く中間体の脱炭酸を触媒し、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）、ピロリン酸、および二酸化炭素を生成する（Ｂｅｇｌｅｙ，２００１，Ｖｉｔａｍｉｎｓ ＆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，６１，１０３−１１９）。ＮａｄＤはアデニン三リン酸（ＡＴＰ）を使用してＮａＭＮをアデニル化し、ニコチン酸ジヌクレオチド（ＮａＡＤ）およびピロリン酸を生成する（Ｂｅｇｌｅｙ，２００１）。ＮａｄＤはまた、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＭＮ）もアデニル化できるが、基質としてＮａＭＮを使用する場合よりも、より低い親和性（より高いＫｍ）およびより低い代謝回転（Ｖｍａｘ）を有する。例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の酵素は、ＮａＭＮに対するＶｍａｘ／Ｋｍが、ＮＭＮに対するＶｍａｘ／Ｋｍの１０４倍である（Ｏｌｌａｎｄ，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７（５），３６９８−３７０７）。ＮＡＤ＋生合成の最終段階は、アンモニアまたはグルタミンのどちらかを窒素供与体として利用してＮａＡＤをＮＡＤ＋にアミド化し、１モルのＡＴＰをＡＭＰとピロリン酸に加水分解する、ＮａｄＥによって触媒される（Ｂｅｇｌｅｙ，２００１）。ＮａｄＤの基質の融通性に類似して、この酵素は、ＮａＡＤの代わりにＮａＭＮに作用してＮＭＮを生成できるが、この場合も基質の選択性は強く、バチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）では、Ｖｍａｘ／Ｋｍの差は＞１０３倍である（Ｓｏｒｃｉ，２００９，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７（５），３６９８−３７０７）。
上記のカノニカル経路とは対照的に、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）の経路は、中間体としてＮＭＮを介して進行する（Ｓｏｒｃｉ，２００９）。ＮａＭＮの形成に続いて、ＦｔＮａｄＥ＊酵素は、典型的なＮａｄＥ酵素と明らかに類似した機序において、すなわち、同時の１モルのＡＴＰの加水分解を伴う機序において、ＮＨ３を使用してそのアミド化を触媒する（本明細書ではＮａｄＥ＊活性と称する）。ＦｔＮａｄＥ＊酵素もまたＮａＡＤをアミド化するが、それはＮａＭＮに対してより特異的であり、Ｖｍａｘ／Ｋｍの相対値において６０倍の差異がある。最終段階は、ＮＭＮのアデニル化を触媒するＮａｄＭ酵素によって触媒される。
新たな経路に加えて、ＮＭＮ、ＮＲ、ニコチンアミド（Ｎａｍ）またはニコチン酸（ＮＡ）の回収のための複数の経路が存在する（Ｇａｚｚａｎｉｇａ，２００９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ，７３（３），５２９−５４１）。ＮＭＮは、ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｎｃＣ、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣｉｎＡ、ＥＣ３．５．１．４２）の作用によってＮａＭＮに再循環され；ＮＲは、ニコチンアミドリボシドキナーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮａｄＲ、ＥＣ２．７．１．２２）によってＮＭＮにリン酸化されるか、または可逆反応（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｅｏＤ、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｅｏＤ、ＰｕｐＧ、Ｐｄｐ、ＥＣ２．４．２．１）において、プリンヌクレオシドホスホリラーゼによってＮａｍおよびホスホリボースに分解され；Ｎａｍは、ＤｅｏＤによってＮＭＮにホスホリボシル化され得るか、またはニコチンアミダーゼ（ＰｎｃＡ、ＥＣ３．５．１．１９）によってＮＡに脱アミドされ得て；ＮＡまたはＮａｍは、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｎｃＢ、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＹｕｅＫ ＥＣ ６．３．４．２１）によって、それぞれＮａＭＮまたはＮＭＮに変換される。細胞外ＮＭＮは、ペリプラズム酸ホスファターゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＵｓｈＡ、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＹｆｋＮ、ＥＣ３．１．３．５）によってＮＲに脱リン酸化され、細胞外ＮＲは、ＮＲ輸送体（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｎｕＣ、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮｕｐＧ）によって移入され得る。ＮＡＤ＋それ自体は、ピリミジンヌクレオチド源として使用され得る。ＮＡＤ＋は、ＮＡＤ＋ジホスファターゼ（ＮｕｄＣ、ＥＣ３．６．１．２２）の活性によって、ＮＭＮおよびアデノシン一リン酸に切断される。
ｎａｄ遺伝子の発現は、細菌において典型的に転写リプレッサーによって同時制御される。大腸菌では、ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、およびｐｎｃＢの転写は、再利用経路に寄与する触媒活性もまた有する、ＮａｄＲタンパク質によって抑制される（Ｒａｆｆａｅｌｌｉ，１９９９，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，７５７（１７），５５０９−５５１１）。ＮａｄＲは、ＮＡＤ＋の存在下において、保存モチーフに結合することによって転写をブロックする。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、ＹｒｘＡと命名される異なるタンパク質が、ＮＡの存在下で２つの発散的に転写されたオペロン、ｎａｄＢ−ｎａｄＡ−ｎａｄＣおよびｎｉｆ／Ｓ−ｙｒｘＡの転写をブロックすることによって、同様の役割を果たす（Ｒｏｓｓｏｌｉｌｌｏ，２００５，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，７５７（２０），７１５５−７１６０）。
本発明者らは、今や驚くべきことに、ニコチンアミドリボースの生成速度を有意に増加させる新規方法を見いだし、そのような方法において有用な発現ベクターおよび宿主細胞を作製した。
［発明の概要］
本発明は、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）を産生できる遺伝子修飾細菌を対象とし、その中で、細菌は、ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなり、その中で、前記少なくとも１つの修飾を有する細菌は、前記修飾のいずれも有しない細菌よりも増加した量のＮＲを産生する。
本発明は、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）を産生できる遺伝子修飾細菌を対象とし、その中で、細菌は、ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなり、その中で、前記少なくとも１つの修飾を有する細菌は、前記修飾のいずれも有しない細菌よりも増加した量のＮＲを産生する。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細菌は、ａ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣ遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでＮＡＤ＋生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｂ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｃ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｄ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｅ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；およびｇ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、シンターゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子の転写を付加しまたは増加させることからなる群から選択される、１つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなってもよい。
本発明はまた、ＮＲを生産するのに効果的な条件下で細菌細胞を培養して培地からＮＲを回収し、それによってＮＲを生産するステップを含んでなる、ＮＲを生産する方法を対象とし、その中で、宿主微生物は、ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質の活性を添加しまたは増加させること；ｃ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣまたはそれらの組み合わせ転写の負の調節因子として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｄ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｅ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｇ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｈ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；およびｉ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、シンターゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子の転写を付加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる。
本発明は、ＮＲを生産するのに効果的な条件下で細菌細胞を培養して培地からＮＲを回収し、それによってＮＲを生産するステップを含んでなる、ＮＲを生産する別の方法を対象とし、その中で、宿主微生物は、ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質ＮａｄＥ＊の活性を添加すること；ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる。この方法では、細菌細胞は、ａ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣ遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでＮＡＤ＋生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｂ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｃ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｄ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｅ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；およびｇ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、シンターゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子の転写を付加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも１つの修飾をさらに含んでなってもよい。
いくつかの実施形態では、ＮａｄＥ＊タンパク質は、配列番号１および３〜１８のいずれかと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、その中で前記ポリペプチドは、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチドに変換するニコチン酸アミド化活性を有する。
いくつかの実施形態では、上記のＮａｄＥ＊タンパク質は、配列番号１の標準アミノ酸配列と比較すると、ａ）ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズを用いて配列番号１および３〜１８と比較した際に、アライメントのＣｌｕｓｔａｌＷ法に基づく、２８７位のチロシン、ｂ）１３３位のグルタミン、およびｃ）２３６位のアルギニンの保存アミノ酸の１つまたは複数をさらに有する。
いくつかの実施形態では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質は、配列番号６６〜７０のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、その中で前記ポリペプチドは、ＮＡＤ＋をニコチンアミドモノヌクレオチドとアデニンに変換するＮＡＤ＋加水分解活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＡＤ＋生合成の負の調節因子は、配列番号５１、５２、または５３のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドはＮＡＤ＋生合成を抑制する活性を有する。
いくつかの実施形態では、ニコチンアミドリボシド輸送体は、配列番号５４、５５、５６、または７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、その中で、前記ポリペプチドは、ニコチンアミドリボシドを移入するニコチンアミドリボシド輸送活性を有する。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドヒドロラーゼは、配列番号５７、５８、または５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、ニコチンアミドモノヌクレオチドをニコチンアミドリボシドに変換するヌクレオシドヒドロラーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態では、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号６３、６４、または６５のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチン酸アデニンジヌクレオチドに変換するニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態では、ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼタンパク質は、配列番号６０、６１、または６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、ニコチンアミドモノヌクレオチドをニコチン酸モノヌクレオチドに変換するニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；タンパク質は、配列番号７２〜７６のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、その中で前記ポリペプチドは、ニコチンアミドリボシドおよびリン酸をニコチンアミドおよびリボース−１−リン酸に変換するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、キノリン酸シンターゼは、配列番号７７、７８、または７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、イミノコハク酸およびジヒドロキシアセトンリン酸をキノリン酸およびリン酸に変換する活性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼは、配列番号８０または８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、ＦＡＤ依存性反応中でアスパラギン酸をイミノコハク酸に変換する活性を有する。
いくつかの実施形態では、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号８２、８３、または８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、キノリン酸およびホスホリボシルピロリン酸をニコチンアミドモノヌクレオチドおよび二酸化炭素に変換する活性を有する。
本発明はまた、遺伝子修飾の結果としてＮＲを産生し、その中で細菌が培養される発酵ブロス中に、産生されたＮＲを少なくとも１００ｍｇ／Ｌまで蓄積し得ることによって特徴付けられる、遺伝子修飾細菌を対象とする。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細菌において、遺伝子修飾は、ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される。いくつかの実施形態（ｓｏｍｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）では遺伝子修飾は、ａ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣ遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでＮＡＤ＋生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｂ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｃ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｄ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｅ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；およびｇ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される、１つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、上記遺伝的に修飾された細菌において、ＮａｄＥ＊タンパク質は、配列番号１および３〜１８のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、その中で前記ポリペプチドは、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチドに変換するニコチン酸アミド化活性を有する。一実施形態では、ＮａｄＥ＊タンパク質は、配列番号１の標準アミノ酸配列と比較すると、ａ）ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズを用いて配列番号１および３〜１８と比較した際に、アライメントのＣｌｕｓｔａｌＷ法に基づく、２７位のチロシン、ｂ）１３４３位のグルタミン、およびｃ）２３７６位のアルギニンの保存アミノ酸の１つまたは複数を有する。
一実施形態では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質は、配列番号６６〜７０のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、その中で前記ポリペプチドは、ＮＡＤ＋をニコチンアミドモノヌクレオチドおよびアデニンに変換するＮＡＤ＋加水分解活性を有する。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）またはＲ．オイトロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）であってもよい。
本発明はまた、前述の遺伝子修飾細菌のいずれかから得られるニコチンアミドリボシド化合物を対象とする。
本発明はまた、上述の遺伝子修飾細菌から得られるニコチンアミドリボシド化合物を含んでなる組成物を対象とする。
本発明はまた、上述の遺伝子修飾細菌から得られるニコチンアミドリボシド化合物を含んでなる食品または飼料を対象とする。
［配列表の概要］
添付の配列表に列挙される核酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を用いて示される。各核酸配列のうちの１つの鎖だけが示されるが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれるものと理解される。添付の配列表中：
添付の配列表に列挙される核酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を用いて示される。各核酸配列のうちの１つの鎖だけが示されるが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれるものと理解される。添付の配列表中：
配列番号１は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｔＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号２は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｔＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＦＳＣ１００６ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＦＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号４は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・グアングズホウエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｇＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＴＸ０７７３０８ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＴＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）亜株フィロミラギア（ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）ＡＴＣＣ２５０１７ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｐｈＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７は、予測されたニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）株０＃３１９−０３６［ＦＳＣ７５３７ ＮａｄＥ＊酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号８は、予測されたニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・ノアツネンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏａｔｕｎｅｎｓｉｓ）亜株（ｓｕｐｂｓｐ．）オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）株Ｔｏｂａ ０４ ＮａｄＥ＊酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号９は、予測されたニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）株ＧＡ０１−２７９４ ＮａｄＥ＊酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・ペルシカ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｅｒｓｉｃａ）ＡＴＣＣ ＶＲ−３３１ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｐｅＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ｃｆ．ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）３５２３ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｎＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１２は、予測されたニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｄ９８７６ＮａｄＥ＊酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１３は、予測されたニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｆ６１６８ ＮａｄＥ＊酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１４は、予測されたニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ツラレンシス（ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）株ＮＩＨ Ｂ−３８ ＮａｄＥ＊酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１５は、予測されたニコチン酸アミド化タンパク質である、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ホラルクチカ（ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ）Ｆ９２ ＮａｄＥ＊酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、ディケロバクター・ノドサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ）ＶＣＳ１７０３ＡＮａｄＥ＊酵素（ＤｎＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、マンヘイミア・スクシニシプロズセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｏｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＭＢＥＬ５５Ｅ ＮａｄＥ＊酵素（ＭｎＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ニコチン酸アミド化タンパク質である、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＡｓＮａｄＥ＊）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１９は、マンヘイミア・スクシニシプロズセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｏｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＭＢＥＬ５５Ｅ ＮａｄＥ＊酵素（ＭｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、ディケロバクター・ノドサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ）ＶＣＳ１７０３Ａ ＮａｄＥ＊酵素（ＤｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＡｓＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２２は、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）亜株フィロミラギア（ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）ＡＴＣＣ２５０１７ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｐｈＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ｃｆ．ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）３５２３ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＴＸ０７７３０８ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＴＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＦＳＣ１００６ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＦＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、フランシセラ・グアングズホウエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｇＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、フランシセラ・ペルシカ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｅｒｓｉｃａ）ＡＴＣＣ ＶＲ−３３１ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｐｅＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、マンヘイミア・スクシニシプロズセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｏｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＭＢＥＬ５５Ｅ ＮａｄＥ＊酵素（ＭｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、ディケロバクター・ノドサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ）ＶＣＳ１７０３Ａ ＮａｄＥ＊酵素（ＤｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＡｓＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）亜株フィロミラギア（ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）ＡＴＣＣ ２５０１７ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｐｈＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ｃｆ．ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）３５２３ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＴＸ０７７３０８ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＴＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＦＳＣ１００６ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＦＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、フランシセラ・グアングズホウエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｇＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、フランシセラ・ペルシカ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｅｒｓｉｃａ）ＡＴＣＣ ＶＲ−３３１ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｐｅＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｔＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３８は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現のために最適化された、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｔＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現のために最適化された、マンヘイミア・スクシニシプロズセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｏｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＭＢＥＬ５５Ｅ ＮａｄＥ＊酵素（ＭｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現のために最適化された、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ｃｆ．ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）３５２３ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現のために最適化された、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＴＸ０７７３０８ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＴＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化され、変異体Ｙ２７Ｔ、Ｑ１３３Ｇ、およびＲ２３６Ｖをコードする、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＮａｄＥ＊酵素（ＦｔＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化され、変異体Ｙ２２Ｔ、Ｑ１２８Ｇ、およびＲ２３ＩＶをコードする、マンヘイミア・スクシニシプロズセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｏｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＭＢＥＬ５５Ｅ ＮａｄＥ＊酵素（ＭｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化され、変異体Ｙ２７Ｔ、Ｑ１３３Ｇ、およびＲ２３６Ｖをコードする、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ｃｆ．ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）３５２３ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化され、変異体Ｙ２７Ｔ、Ｑ１３３Ｇ、およびＲ２３６Ｖをコードする、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＴＸ０７７３０８ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｓｐＴＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４６は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドアミド化活性をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮａｄＥ酵素（ＥｃＮａｄＥ）をコードする、ヌクレオチド配列である。
配列番号４７は、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）における発現のために最適化された、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ｃｆ．ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）３５２３ ＮａｄＥ＊酵素（ＦｎＮａｄＥ＊）オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４８は、テトラサイクリン抵抗性をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４９は、ネオマイシン抵抗性をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５０は、スペクチノマイシン抵抗性をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５１は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮａｄＲ酵素（ＮＭＮシンセターゼ、ＮＲキナーゼ、ＮＡＤ＋生合成の負の調節因子）をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５２は、リプレッサータンパク質である、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮａｄＲ（ＹｘｒＡとしても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５３は、リプレッサータンパク質である、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＮａｄＲ（ＣｇＲ＿１５３としても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５４は、ＮＲ輸送タンパク質である、アシネトバクター・バイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ）ＰｎｕＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５５は、ＮＲ輸送タンパク質である、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＰｎｕＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５６は、ＮＲ輸送タンパク質である、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰｎｕＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５７は、ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼである、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＵｓｈＡ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５８は、ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼである、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＵｓｈＡ（ＹｆｋＮとしても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５９は、ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼである、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＵｓｈＡ（Ｃｇ０３９７としても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６０は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼである、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰｎｃＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６１は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼである、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰｎｃＣ（ＣｉｎＡとしても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６２は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼである、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＰｎｃＣ（Ｃｇ２１５３としても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６３は、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼである、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮａｄＤ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６４は、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼである、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮａｄＤ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６５は、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼである、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＮａｄＤ（Ｃｇ２５８４としても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６６は、ＮＡＤ＋ジホスファターゼである、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ＮｕｄＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６７は、ＮＡＤ＋ジホスファターゼである、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮｕｄＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６８は、ＮＡＤ＋ジホスファターゼである、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＮｕｄＣ（Ｃｇ０８８８としても知られている）酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６９は、ＮＡＤ＋ジホスファターゼである、バークホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）ＮｕｄＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号：７０は、ＮＡＤ＋ジホスファターゼである、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＮｕｄＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７１は、ＮＲ輸送タンパク質である、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮｕｐＧタンパク質をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７２は、ヌクレオシドホスホリラーゼである、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｅｏＤ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７３は、ヌクレオシドホスホリラーゼである、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｄｐ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７４は、ヌクレオシドホスホリラーゼである、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰｕｐＧ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７５は、ヌクレオシドホスホリラーゼである、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｅｏＤ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７６は、ヌクレオシドホスホリラーゼである、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｇ１８ＮＧ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７７は、キノリン酸シンターゼである、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮａｄＡ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７８は、キノリン酸シンターゼである、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮａｄＡ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号７９は、キノリン酸シンターゼである、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＮａｄＡ酵素コードするアミノ酸配列である。
配列番号８０は、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼである、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮａｄＢ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号８１は、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼである、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮａｄＢ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号８２は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮａｄＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号８３は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼである、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮａｄＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号８４は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼである、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＮａｄＣ酵素をコードするアミノ酸配列である。
配列番号８５は、プライマー１０４４４である。
配列番号８６は、プライマー１０４４７である。
配列番号８７は、プライマー１１２２２である。
配列番号８８は、プライマー１１２２３である。
配列番号８９は、プライマー１１２２６である。
配列番号９０は、プライマー１１２２７である。
配列番号９１は、プライマー１１２３０である。
配列番号９２は、プライマー１１２３１である。
配列番号９３は、プライマー１１２３２である。
配列番号９４は、プライマー１１２３３である。
配列番号９５は、プライマー１１２３４である。
配列番号９６は、プライマー１１２３５である。
配列番号９７は、プライマー１１３４１である。
配列番号９８は、プライマー１１３４２である。
配列番号９９は、プライマー１１３５１である。
配列番号１００は、プライマー１１３５２である。
配列番号１０１は、プライマー１１３５３である。
配列番号１０２は、プライマー１１３５４である。
配列番号１０３は、プライマー１１１５９である。
配列番号１０４は、プライマー１１１６０である。
本発明の実施形態を、単なる例として、図１〜図４を参照して以下に示す。
［発明を実施するための形態］
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
「ニコチン酸アミド化タンパク質」という用語は、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）への変換を触媒できる酵素を指す。酵素は、本明細書で「ＮａｄＥ＊」と称される。ニコチン酸アミド化タンパク質の例は、アミノ酸配列配列番号１および３〜１８を有する、ポリペプチドである。配列番号１は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）に由来し、ＦｔＮａｄＥ＊として知られている。ＦｔＮａｄＥ＊タンパク質配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＹＰ＿１７０２１７の下に提供される。配列番号３は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＦＳＣ１００６に由来し、ＦｓｐＦＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０４０００８４２７．１の下に入手できる。配列番号４は、フランシセラ・グアングズホウエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｉｓ）株０８ＨＬ０１０３２に由来し、ＦｇＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号：ＷＰ＿０３９１２４３３２．１の下に入手できる。配列番号５は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種ＴＸ０７７３０８に由来し、ＦｓｐＴＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０１３９２２８１０．１の下に入手できる。配列番号６は、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）亜株フィロミラギア（ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）ＡＴＣＣ ２５０１７に由来し、ＦｐｈＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿００４２８７４２９．１の下に入手できる。配列番号７は、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）株Ｏ＃３１９−０３６［ＦＳＣ１５３］に由来し、ＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０４２５１７８９６．１の下に入手できる。配列番号８は、フランシセラ・ノアツネンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏａｔｕｎｅｎｓｉｓ）亜株オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）株Ｔｏｂａ ０４に由来し、ＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０１４７１４５５６．１の下に入手できる。配列番号９は、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）株ＧＡ０１−２７９４に由来し、ＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号：ＷＰ＿０４４５２６５３９．１の下に入手できる。配列番号１０は、フランシセラ・ペルシカ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｅｒｓｉｃａ）ＡＴＣＣ ＶＲ−３３１に由来し、ＦｐｅＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０６４４６１３０７．１の下に入手できる。配列番号１１は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ｃｆ．ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）３５２３に由来し、ＦｎＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０１４５４８６４０．１の下に入手できる。配列番号１２は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｄ９８７６に由来し、ＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿００３０３７０８１．１の下に入手できる。配列番号１３は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｆ６１６８に由来し、ＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿００３０３４４４４．１の下に入手できる。配列番号１４は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ツラレンシス（ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）株ＮＩＨ Ｂ−３８に由来し、ＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿００３０２５７１２．１の下に入手できる。配列番号１５は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜株ホラルクチカ（ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ）Ｆ９２に由来し、ＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０１００３２８１１．１の下に入手できる。配列番号１６は、ディケロバクター・ノドサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ）ＶＣＳ１７０３Ａに由来し、ＤｎＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０１１９２７９４５．１の下に入手できる。配列番号１７は、マンヘイミア・スクシニシプロズセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＭＢＥＬ５５Ｅに由来し、ＭｓＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０１１２０１０４８．１の下に入手できる。配列番号１８は、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）１３０Ｚに由来し、ＡｓＮａｄＥ＊として知られ；タンパク質受入番号は、受入番号ＷＰ＿０１２０７２３９３．１の下に入手できる。
「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド加水分解タンパク質」または「ＮＡＤ＋ジホスファターゼ」という用語は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）およびアデニンへの変換を触媒できる酵素を指す。酵素は、一般にＮｕｄＣとして知られている。本発明で使用されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド加水分解タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）などの様々な生物に由来し得る。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド加水分解タンパク質の例としては、アミノ酸配列配列番号６６〜７０を有するポリペプチドが挙げられる。ＮＡＤ＋ジホスファターゼ活性をコードする例示的遺伝子は、受入番号ＷＰ＿００４９２１４４９（Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ））、ＣＡＦ１９４８３（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、ＹＰ＿０２６２８０（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、およびＷＰ＿０１０８１３６７０（Ｒ．オイトロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ））の下に提供される。
「ＮＡＤ＋生合成の負の調節因子」という用語は、キノリン酸シンターゼ（ＮａｄＡ）、ＦＡＤ依存性Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ（ＮａｄＢ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮａｄＣ）、またはそれらの任意の組み合わせの転写を抑制することにより、ＮＡＤ＋生合成活性を抑制できる酵素を指す。ＮＡＤ＋生合成の負の調節因子（ｒｅｇｕｌａｒｔｏｒｓ）をコードする例示的遺伝子は、受入番号ＷＰ＿００４３９８５８２．１（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ＷＰ＿００００９３８１４．１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、およびＷＰ＿０１１０１４０９７．１（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の下に提供される。「キノリン酸シンターゼ」という用語は、イミノコハク酸およびジヒドロキシアセトンリン酸をキノリン酸およびリン酸に変換できる酵素を指す。本発明で使用されるキノリン酸シンターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの様々な生物に由来し得る。キノリン酸シンターゼタンパク質の例としては、アミノ酸配列配列番号７７、７８、または７９を有するポリペプチドが挙げられる。キノリン酸合成活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＡＣＸ４０５２５（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＮＰ３９０６６３（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、およびＣＡＦ１９７７４（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の下に提供される。定義されるキノリン酸シンターゼは、前述のキノリン酸シンターゼの機能的変異型を含む。
「Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ」という用語は、ＦＡＤ依存性反応において、アスパラギン酸をイミノコハク酸に変換できる酵素を指す。本発明で使用されるＬ−アスパラギン酸オキシダーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの様々な生物に由来し得る。ヌクレオシドヒの例としては、アミノ酸配列配列番号８０または８１を有するポリペプチドが挙げられる。Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＡＣＸ３８７６８（大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ））およびＮＰ３９０６６５（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））の下に提供される。定義されるＬ−アスパラギン酸オキシダーゼは、前述のＬ−アスパラギン酸オキシダーゼの機能的変異型を含む。
「キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ」という用語は、キノリン酸およびホスホリボシルピロリン酸をニコチンアミドモノヌクレオチドおよび二酸化炭素に変換できる酵素を指す。本発明で使用されるキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの様々な生物に由来し得る。ヌクレオシドヒドロラーゼタンパク質の例としては、アミノ酸配列配列番号８２、８３、または８４を有するポリペプチドが挙げられる。キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＡＣＸ４１１０８（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＮＰ＿３９０６６４（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、およびＣＡＦ１９７７３（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の下に提供される。定義されるキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、前述のキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの機能的変異型を含む。
「ニコチンアミドリボシド輸送タンパク質」という用語は、ぺリプラズムから細胞質にニコチンアミドリボシドを移入するためのニコチンアミドリボシドの輸送を触媒できる酵素を指す。酵素は、一般にＰｎｕＣとして知られている。本発明に記載されるニコチンアミドリボシド輸送タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの宿主生物の天然ポリペプチドである。ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質の例としては、アミノ酸配列配列番号５４、５５、５６、または７１を有するポリペプチドが挙げられる。ＮＲ輸送活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＣＡＧ６７９２３（Ａ．バイリイ（ｂａｙｌｙｉ））、ＮＰ＿５９９３１６（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、ＮＰ＿４１５２７２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、およびＷＰ＿００３２２７２１６．１（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））の下に提供される。
「ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼ」という用語は、ニコチンアミドモノヌクレオチドのニコチンアミドリボシドへの加水分解を触媒できる酵素を指す。酵素は、一般にＵｓｈＡとして知られている。本発明で使用されるヌクレオシドヒドロラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの様々な生物に由来し得る。ヌクレオシドヒドロラーゼタンパク質の例としては、アミノ酸配列配列番号５７、５８または５９を有するポリペプチドが挙げられる。ヌクレオシドヒドロラーゼ活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＮＰ＿４１５０１３（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＮＰ＿３８８６６５（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、およびＣＡＦ１８８９９（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の下に提供される。
「ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ」という用語は、ニコチンアミドモノヌクレオチドのニコチン酸モノヌクレオチドへの変換を触媒できる酵素を指す。酵素は、一般にＰｎｃＣとして知られている。本発明に記載されるニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの宿主生物の天然ポリペプチドである。ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼタンパク質の例としては、配列番号６０、６１、または６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＮＰ＿４１７１８０（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＡＡＢ００５６８（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、およびＣＡＦ２０３０４（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の下に提供される。
「ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ」という用語は、ニコチン酸モノヌクレオチドのニコチン酸アデニンジヌクレオチドへの変換を触媒できる酵素を指す。酵素は、一般にＮａｄＤとして知られている。本発明に記載されるニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの宿主生物の天然ポリペプチドである。ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼタンパク質の例としては、配列番号６３、６４、または６５のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＮＰ＿４１５１７２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＮＰ＿３９０４４２（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、およびＣＡＦ２１０１７（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の下に提供される。
「プリンヌクレオシドホスホリラーゼ」という用語は、ニコチンアミドリボシドおよびリン酸のニコチンアミドおよびリボース−１−リン酸への変換を触媒できる酵素を指す。酵素の一般的な名称は、ＤｅｏＤ、ＰｕｐＧ、およびＰｄｐである。本発明に記載されるプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの宿主生物の天然ポリペプチドである。プリンヌクレオシドホスホリラーゼタンパク質の例としては、配列番号７２〜７５のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性をコードする遺伝子は、例えば、受入番号ＷＰ＿００３２３１１７６．１（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ＷＰ＿００３２４３９５２．１（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＷＰ＿００３２３００４４７．１（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ＷＰ＿０００２２４８７７．１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、およびＢＡＣ００１９６．１（Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の下に提供される。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって記述される。
本開示の目的で、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）において実装される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。使用される任意選択のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリックスである。「最長同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得）は、パーセント同一性として使用され、次のように計算される：（同一残基×１００）／（アラインメント長さ−アラインメント中のギャップ総数）。
核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離された、またはさもなければ天然に存在しないはずの核酸断片を含有するように修飾された、または合成された、一本鎖または二本鎖のどちらかの核酸分子を意味する。核酸コンストラクトが本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、核酸コンストラクトという用語は、「発現カセット」という用語と同義である。
制御配列：「制御配列」という用語は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって天然または外来性であってもよく、互いに天然または外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、ペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、および転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列と、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的で、制御配列にリンカーが提供されてもよい。
作動可能に連結された：「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列の発現を誘導するように、制御配列が、ポリヌクレオチドのコード配列に対して妥当な位置に配置される立体配置を意味する。
発現：「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌などであるが、これに限定されるものではない、ポリペプチドの生成に関与するあらゆるステップを含む。
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、その発現を提供する追加的なヌクレオチドに作動可能に連結された線状または環状ＤＮＡ分子を意味する。
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本開示のポリペプチド配列のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸コンストラクトまたは発現ベクターによる、形質転換、形質移入、形質導入などを受け易い任意の細菌細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に生じた変異のために親細胞と同一ではない、親細胞のあらゆる子孫を包含する。
本発明は、ニコチンアミドリボシド生産のための遺伝子操作された特徴を有する、細菌株を特徴とする。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびほとんどの特性決定された細菌種、ならびに全ての特性決定された真核生物種由来のｎａｄＥ遺伝子産物は、ＮＡＤ＋を産生するアミド化反応の基質として、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドを利用する。この天然経路によって、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は、以前に記載された研究のように、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の分解によって得られる（米国特許第８，１１４，６２６Ｂ２号明細書）。図２を参照されたい。
生物フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）は、ＮＭＮが、Ｆ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＮＭＮシンセターゼ（ＦｔＮａｄＥ＊）の作用によってＮａＭＮから生成される、代替経路を通じてＮＡＤ＋を合成する。
予期しないことに、本発明の発明者は、ニコチン酸モノヌクレオチドのＮＭＮへのアミド化と、それに続くＮＲへの脱リン酸化からなる、細菌におけるＮＲへの代替経路を創出した。図３を参照されたい。例えば、本発明の発明者は、大腸菌におけるＦｔＮａｄＥ＊遺伝子またはその機能的相同体の発現が、過剰なＮＭＮの産生をもたらすことを発見した。過剰なＮＭＮは、天然のペリプラズム酸性ホスファターゼによって移出され、ＮＲに変換され得る。
本発明の発明者は、ＦｔＮａｄＥ＊がＮＲを産生するための上記の代替経路で使用され得る、唯一のタンパク質ではないことをさらに発見した。本発明の発明者は、同一機能を果たす多様なγ−プロテオバクテリア株に由来する、一群のＮａｄＥ＊タンパク質を同定した。例えば、配列番号３〜１８のニコチン酸アミド化タンパク質をコードするＮａｄＥ＊遺伝子またはその機能的同族体の発現もまた、ＮＲの産生をもたらす。
したがって、本発明の第１の実施形態では、１つまたは複数のニコチン酸アミド化遺伝子を宿主細胞に導入することが望ましい。このような遺伝子は、ＮａＭＮからＮＭＮへの変換を触媒する、ニコチン酸アミド化タンパク質をコードする。一実施形態では、ニコチン酸アミド化タンパク質は、ＮＭＮシンセターゼ（ＮａｄＥ＊）である。特定の実施形態では、ニコチン酸アミド化タンパク質は、Ｆ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＮＭＮシンセターゼ（ＦｔＮａｄＥ＊）である。本明細書の実施形態によるニコチン酸アミド化タンパク質は、例えば、限定されるものではないが、配列番号１または３〜１８と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを含んでもよく、その中で、上記のポリペプチドは、ニコチン酸アミド化活性またはＮａｄＥ＊活性を有する。
本出願の発明者は、配列番号１および３〜１８のうちの保存的ポリペプチドを同定した。配列アライメントの結果は、図５に示される。さらに、２７位のチロシン、１３３位のグルタミン、および２３６位のアルギニンの３つのアミノ酸が、ＮａｄＥ＊タンパク質活性を維持する上で非常に重要であると考えられる。上記の位置は、配列番号１に基づいて番号付与される。図５の配列番号１および３〜１８のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを参照されたい。
したがって、いくつかの実施形態では、ＮａｄＥ＊タンパク質は、配列番号１の標準アミノ酸配列と比較すると、ａ）ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズを用いて配列番号１および３〜１８と比較した際に、アライメントのＣｌｕｓｔａｌＷ法に基づく、２７位のチロシン、ｂ）１３３位のグルタミン、およびｃ）２３６位のアルギニンの保存アミノ酸の１つまたは複数をさらに含有してもよい。配列番号１は、２７位にチロシン、１３３位にグルタミン、２３６位にアルギニンを有する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌種では、ｎｕｄＣ遺伝子産物は、ＮＡＤＨのＮＭＮおよびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）への加水分解を触媒する。ｎｕｄＣ遺伝子は、ほとんどの成長条件下において、非常に低いレベで発現される。予期しないことに、本発明の発明者は、天然ｎｕｄＣ遺伝子含有または非含有の異種ｎｕｄＣ遺伝子を宿主細胞に添加することで、または天然ｎｕｄＣ遺伝子を強力な構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことで、ＮＡＤＨからのＮＭＮ生成を駆動する代替経路を創出した。図３を参照されたい。生産条件下におけるｎｕｄＣの発現は、過剰なＮＭＮの生成をもたらす。過剰なＮＭＮは、天然のペリプラズム酸性ホスファターゼによって移出され、ＮＲに変換され得る。
したがって、本発明の第２の実施形態では、ｎｕｄＣ遺伝子の発現レベルを増加させ、ひいては宿主細胞に過剰なＮＭＮを産生させることが望ましい。一実施形態では、本発明は、ＮＡＤ＋ジホスファターゼの活性増大を有する細菌株を対象とする。本明細書の実施形態によるＮＡＤ＋ジホスファターゼは、例えば、限定されるものではないが、配列番号６６〜７０のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを含んでもよく、その中で、上記のポリペプチドは、ＮＡＤ＋をＮＭＮに変換するＮＡＤ＋ジホスファターゼ活性を有する。
より高い濃度のＮａＭＮが細胞内で利用できるように、ＮＲ産生のために宿主生物を修飾することが望ましい。したがって、本発明のさらなる実施形態では、１つまたは複数の遺伝子修飾を導入し、宿主細胞内におけるニコチン酸モノヌクレオチドの生成速度の増加をもたらすことが望ましい。修飾としては、新生ＮＡＤ＋バイオ合成経路、ｎａｄＡ、ｎａｄＢおよび／またはｎａｄＣの遺伝子の全てまたは一部の転写を抑制する遺伝子の発現の欠失または減少が挙げられる。修飾はさらに、または代案として、例えば、ｎａｄＢ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｎａｄＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、またはｎａｄＣ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））によってコードされる、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ遺伝子、キノリン酸シンターゼ遺伝子、キノリン酸ホスホリボシルピロリン酸遺伝子、またはそれらの組み合わせの発現を増加させることを含んでもよい。修飾はさらに、または代案として、下流の代謝産物であるＮＡＤ＋による阻害に対して遺伝子を抵抗性にする、ｎａｄＢ遺伝子の修飾を含んでもよい。
本発明は、ニコチンアミドリボシドの移入経路および再利用経路が欠損している、遺伝子操作された細菌株をさらに包含する。図４を参照されたい。細菌におけるＮＡＤ＋再利用経路の破壊は、細胞外ＮＲの蓄積をもたらすと予想されるが、これはそのような株が、ニコチンアミドリボシドを細胞質に移入できず、またニコチンアミドリボシド（ＮＲ）をニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）をリン酸化することも、ＮＭＮをニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）にさらに分解することもできないためである。３つの酵素活性は、細菌のＮＲ産生を遺伝子操作するために特に重要である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐｎｃＣ遺伝子産物およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｃｉｎＡ遺伝子産物は細菌におけるサルベージ酵素であり、それはＮａｄＥ＊によって触媒される反応とは逆の反応である、ＮＭＮのＮａＭＮへの脱アミドを行う。この遺伝子の欠失は、ＮＭＮのＮａＭＮへの変換を妨げ、ＮＭＮの細胞内濃度を増加させる。ヌクレオシドホスホリラーゼ活性によるＮＲのＮａｍおよびリボースリン酸への分解は、生成物を除去し、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｄｅｏＤまたは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｐｄｐなどのこの活性をコードする遺伝子の欠失または発現の減少は、生成物形成速度を増加させる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の多くの細菌では、ｐｎｕＣ遺伝子産物はＮＲを移入し、欠失は細胞外ＮＲを増加させ；Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＲの搬入はｎｕｐＧ遺伝子産物によって達成され、欠失は細胞外ＮＲを増加させる。
したがって、本発明の第３の実施形態では、ニコチンアミドリボシドの搬入経路およびサルベージ経路を減少またはブロックし、それによって宿主細胞に、生成したニコチンアミドリボシドを保存させることが望ましい。特定の実施形態では、本発明の細菌株は、以下の特徴の１つまたは複数を有する：ｉ）ニコチンアミド取り込み輸送体活性のブロックまたは減少、ｉｉ）ニコチン酸リボシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質のブロックまたは減少、およびｉｉｉ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ活性のブロックまたは減少、ｉｖ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、およびキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などのＮＡＤ＋生合成タンパク質の負の調節因子として機能するタンパク質のブロックまたは減少、ｖ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質のブロックまたは減少、およびｖｉ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質のブロックまたは減少。
本明細書の実施形態によるＮＡＤ＋生合成の負の調節因子としては、例えば、限定されるものではないが、配列番号５１、５２、または５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型が挙げられ、その中で、上記のポリペプチドは、ＮＡＤ＋生合成に必要な遺伝子を抑制する活性を有する。
いくつかの実施形態では、キノリン酸シンターゼは、配列番号７７、７８、または７９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、イミノコハク酸およびジヒドロキシアセトンリン酸からキノリン酸を形成する活性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼは、配列番号８０または８１のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、アスパラギン酸からイミノコハク酸を形成する活性を有する。
いくつかの実施形態では、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号８２、８３、または８４のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、キノリン酸およびホスホリボシルピロリン酸からニコチン酸モノヌクレオチドを形成する活性を有する。
本明細書の実施形態によるニコチンアミド取り込み輸送体（ＰｎｕＣまたはＮｕｐＧ）は、例えば、限定されるものではないが、配列番号５４、５５、５６、または７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型を含んでもよく、その中で、上記のポリペプチドは、ニコチンアミドリボース移入活性を有する。
本明細書の実施形態によるニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ（ＰｎｃＣ）は、例えばおよび限定されるものではないが、配列番号１５、１６、または１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型を含んでもよく、その中で、上記のポリペプチドはニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼの活性を有する。
本明細書の実施形態によるニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（ＮａｄＤ）は、例えば、限定されるものではないが、配列番号１８または配列番号１９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型を含んでもよく、その中で、上記のポリペプチドは、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチン酸アデニンジヌクレオチドに変換するためのニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼの活性を有する。
本明細書の実施形態によるプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＤｅｏＤ、ＰｕｐＧ、Ｐｄｐ）は、例えば、限定されるものではないが、配列番号７２〜７６のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型を含んでもよく、その中で、上記のポリペプチドは、ニコチンアミドリボシドおよびリン酸をニコチンアミドおよびリボース−１−リン酸に変換するためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を有する。
本発明の第４の実施形態では、ｕｓｈＡ遺伝子の発現レベルを増加させ、ひいては宿主細胞に、ＮＭＮから過剰な細胞外ＮＲを産生させることが望ましい。一実施形態では、本発明は、ヌクレオシドヒドロラーゼの活性増大を有する細菌株を対象とする。本明細書の実施形態によるニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼ（ＵｓｈＡ）は、例えば、限定されるものではないが、配列番号５７、５８、または５９のいずれか１つを含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型を含んでもよく、その中で、上記のポリペプチドは、ニコチンアミドモノヌクレオチドをニコチンアミドリボシドに変換するためのヌクレオシドヒドロラーゼの活性を有する。
Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、およびキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などのＮＡＤ＋生合成タンパク質の発現レベルを増加させることもまた望ましい。一実施形態では、本発明は、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、およびキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の１つまたは複数のタンパク質の活性増大を有する、細菌株を対象とする。
いくつかの実施形態では、キノリン酸シンターゼは、配列番号７７、７８、または７９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、イミノコハク酸およびジヒドロキシアセトンリン酸からキノリン酸を形成する活性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼは、配列番号８０または８１のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、アスパラギン酸からイミノコハク酸を形成する活性を有する。
いくつかの実施形態では、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号８２、８３、または８４のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、その中で、前記ポリペプチドは、キノリン酸およびホスホリボシルピロリン酸からニコチン酸モノヌクレオチドを形成する活性を有する。
その他の実施形態では、上記の第１または第２の実施形態に記載される細菌株は、上記の第３の実施形態または第４の実施形態に記載される、１つまたは複数の修飾をさらに含んでなる。
例えば、一実施形態では、本発明は、ニコチンアミドリボシドを産生できる遺伝子修飾細菌を対象とし、その中で、細菌は、ｉ）付加された異種ニコチン酸アミド化タンパク質ＮａｄＥ＊、およびｉｉ）ａ）活性がブロックまたは減少された改変ＮＡＤ＋生合成の負の制御因子；ｂ）活性がブロックまたは減少された改変ニコチンアミドリボシド取り込み輸送体；ｃ）活性がブロックまたは減少された改変ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ；ｄ）活性がブロックまたは減少された改変ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ、ｅ）活性がブロックまたは減少された改変プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；ｆ）活性が追加または増加された改変ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼ；およびｇ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、シンターゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子の転写の付加または増加からなる群から選択される１つまたは複数の追加的な修飾を含んでなり、その中で、前記少なくとも１つの修飾を有する細菌は、前記修飾のいずれも有しない細菌よりも増加した量のＮＲを産生する。
別の実施形態では、本発明は、ニコチンアミドリボシをド産生できる遺伝子修飾細菌を対象とし、その中で、細菌は、以下ｉ）活性が追加または増加された改変ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質ＮｕｄＣ、およびｉｉ）ａ）活性がブロックまたは減少された改変ＮＡＤ＋生合成の負の制御因子；ｂ）活性がブロックまたは減少された改変ニコチンアミドリボシド取り込み輸送体；ｃ）活性がブロックまたは減少された改変ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ；ｄ）活性がブロックまたは減少された改変ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ、ｅ）活性がブロックまたは減少された改変プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；ｆ）活性が追加または増加された改変ニコチンアミドモノヌクレオシドヒドロラーゼ；およびｇ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、シンターゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子の転写の付加または増加からなる群から選択される１つまたは複数の追加的な修飾を含んでなり、その中で、前記少なくとも１つの修飾を有する細菌は、前記修飾のいずれも有しない細菌よりも増加した量のＮＲを産生する。
一実施形態では、ニコチン酸アミド化タンパク質ＮａｄＥ＊は、宿主細菌に外因性であり、すなわち、本明細書に記載されるような組換え法を用いて導入される修飾前に、細胞に存在しない。
別の実施形態では、上記のその他のタンパク質は、タンパク質の発現レベルを増加または減少させるために交互に行われる（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｍａｄｅ）が、宿主細菌に対して内因性であり、すなわち修飾前の細胞に存在する。本発明において、それに対して発現レベルが変更される内因性タンパク質の例としては、ＮＡＤ＋ジホスファターゼ、ＮＡＤ＋生合成の負の調節因子、ニコチンアミドリボシド取り込み輸送体、ニコチンアミドモノヌクレオシドヒドロラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、およびニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
宿主細菌細胞は、当業者によってこの目的に適することが知られている、任意の方法によって遺伝子修飾されてもよい。これとしては、ニコチン酸アミド化タンパク質ＮａｄＥ＊をコードする遺伝子などの目的の遺伝子の、プラスミドまたはコスミドまたは他の発現ベクターへの導入が挙げられ、これらは宿主細胞内で自己複製できる。代案としては、例えば、相同組換えまたはランダム組み込みによって、プラスミドまたはコスミドＤＮＡまたはプラスミド、またはコスミドＤＮＡの一部、または直鎖ＤＮＡ配列が、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。遺伝子修飾を行うために、ＤＮＡは、天然取り込みによって、または電気穿孔などの周知の方法によって、細胞に導入または形質転換され得る。遺伝子修飾は、導入されたプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を伴い得る。導入されたＤＮＡは、酵素として作用し得るかまたはさらなる遺伝子の発現を調節し得る、タンパク質をコードしてもよい。
微生物の遺伝子修飾は、古典的な株発達および／または分子遺伝子技術術を用いて達成され得る。当技術分野で公知のこのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓなどで、一般に微生物について開示されている。同上のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，の参考文献は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
適切なポリヌクレオチドが、組み込み、相同組換えによって細胞に導入されてもよく、および／または遺伝子の組み合わせを含んでなる、発現ベクターの一部を形成してもよい。このような発現ベクターは、本発明のもう一つの態様を形成する。
このような発現ベクターの構築に適したベクターは、当技術分野で周知であり、例えば上記のような細菌などの主細胞中で必要とされる酵素を発現させるのに有用であるように、１つまたは複数の発現制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを構成するように配置されてもよい。例えば、標的遺伝子の発現パターンの修飾のために、Ｔ７プロモーター、ｐＬａｃプロモーター、ｎｕｄＣプロモーター、ｕｓｈＡプロモーター、ｐＶｅｇプロモーターをはじめとするが、これに限定されるものではないプロモーターが、内因性遺伝子および／または異種遺伝子と併用され得る。同様に、例示的なターミネーター配列としては、ＸＰＲ１、ＸＰＲ２、ＣＰＣ１ターミネーター配列の使用が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、本明細書全体を通じて言及される組換えまたは遺伝子修飾細菌細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）などであるが、これに限定されるものではない、任意のグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。特定の実施形態では、例示的な細菌種としては、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アシネトバクター・バイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ）、およびラルストニア・オイトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの実施形態は特定の種に限定されず、むしろ細菌の全ての主要な門を包含する（図７）。
本開示の遺伝子修飾細菌はまた、本明細書で定義されるポリペプチドの変異型を含んでなる細菌を包含する。本明細書の用法では、「変種」は、アミノ酸配列が、それが由来する基本配列と異なるポリペプチドを意味し、１つまたは複数の（いくつかの）位置において、１つまたは複数の（いくつかの）アミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失がある。置換は、配置を占めるアミノ酸の様々なアミノ酸による置換を意味し；欠失は、配置を占めるアミノ酸の除去を意味し；挿入は、配置を占めるアミノ酸に隣接する１〜３個のアミノ酸の付加を意味する。
変異型は、変異配列が、本明細書で特定される天然のアミノ酸配列を有する酵素と同様または同一の機能的酵素活性特性を有する点で、機能的変異型である。
例えば、配列番号１および３〜１８の機能的変異型は、それぞれ、配列番号１および３〜１８と同様または同一のニコチン酸アミド化タンパク質ＦｔＮａｄＥ＊活性特性を有する。一例として、配列番号１および３〜１８の機能的変異型によるニコチン酸モノヌクレオチドからニコチンアミドモノヌクレオチドへの変換速度は、同一でもまたは同様であってもよいが、前記機能的変異型は、その他の利点も提供してもよい。例えば、それぞれ、配列番号１および３〜１８の機能的変異型である酵素を使用した際に、速度の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が達成されるであろう。
したがって、上記配列番号のアミノ酸配列のいずれかの機能的変異型または断片は、同じ酵素のカテゴリー内に留まる（すなわち、同じＥＣ番号を有する）任意のアミノ酸配列である。酵素が特定のカテゴリーに含まれるかどうかを判定する方法は、発明の技能を用いることなく酵素カテゴリーを判定し得る当業者に周知でありる。適切な方法は、例えば、国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）から入手されてもよい。
アミノ酸置換は、アミノ酸が概して同様の特性を有する異なるアミノ酸で置換されている場合、「保存的」と見なされてもよい。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸で置換されている場合である。
「保存的置換」は、同じクラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味し、クラスは以下のように定義される：
クラスアミノ酸の例：
非極性：Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
非電荷極性：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性：Ｄ、Ｅ
塩基性：Ｋ、Ｒ、Ｈ。
クラスアミノ酸の例：
非極性：Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
非電荷極性：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性：Ｄ、Ｅ
塩基性：Ｋ、Ｒ、Ｈ。
本開示に従って生産されたニコチンアミドリボース化合物は、例えば、それらの生物学的特性または治療的特性を利用する、様々な用途のいずれかで利用され得る（例えば、低密度リポタンパク質コレステロールの制御、高密度リポタンパク質コレステロールの増加など）。例えば、本開示によれば、ニコチンアミドリボースは、医薬品、食料品、および栄養補助食品などで使用されてもよい。
本発明に開示された方法により生産されたニコチンアミドリボシドは、血漿脂質プロフィールの改善、脳卒中の予防、化学療法による神経保護の提供、真菌感染症の治療、神経変性の予防または減少、または健康および福利の延長において、治療上の価値がある。したがって、本発明は、有効量のニコチンアミドリボシド組成物を投与することで、ＮＡＤ＋生合成のニコチンアミドリボシドキナーゼ経路に関連する疾患または状態を治療するための、上記の遺伝子修飾細菌細胞から得られたニコチンアミドリボシド化合物もさらに対象とする。典型的に、変化したＮＡＤ＋またはＮＡＤ＋前駆体レベルを有する、またはニコチンアミドリボシドによる治療によりＮＡＤ＋生合成の増加から恩恵を受け得る、疾患または病状としては、脂質障害（例えば、異脂肪血症、高コレステロール血症または高脂血症）、脳卒中、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症）、化学療法で観察される神経毒性、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）感染症、および老化に関連する総体的な健康低下が挙げられるが、これに限定されるものではない。そのような疾患および病状は、ニコチンアミドリボシド組成物による食餌補給または治療的処置計画の提供によって、予防または治療され得る。
本発明の遺伝子修飾細菌から単離されたニコチンアミドリボシド化合物が、最終生成物に再配合され得ることは理解されよう。本開示のいくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の操作された宿主細胞によって産生されるニコチンアミドリボシド化合物は、宿主細胞の状況で最終産物（例えば、食品または栄養補助食品、医薬品など）に組み込まれる。例えば、宿主細胞は、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｉｅｄ）、凍結またはその他の方法で不活性化された後、全細胞が最終製品に組み込まれまたは最終製品として使用されてもよい。宿主細胞は、製品に組み込む前に処理することで（例えば溶解を通じて）、生物学的利用能を増加させてもよい。
本開示のいくつかの実施形態では、生成されたニコチンアミドリボシド化合物は、食品または飼料（例えば栄養補助食品）の構成成分に組み込まれる。本発明のニコチンアミドリボシド化合物を組み込み得る食品の種類は特に限定されず、例えば、ミルク、水、清涼飲料、エネルギー飲料、茶、およびジュースなどの飲料；ゼリーやビスケットなどの砂糖菓子；乳製品などの脂肪含有食品および飲料；米、パン、朝食用シリアルなどの加工食品が挙げられる。いくつかの実施形態では、生産されたニコチンアミドリボシド化合物は、例えば、総合ビタミン剤などの健康補助食品に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明を説明することが意図され、本発明の範囲をどのようにも限定するものではない。
［実施例］
［実施例１］
［ＮａＭＮアミド化活性をコードする配列の同定（ＮａｄＥ＊）］
Ｓｏｒｃｉおよび共同研究者は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（配列番号１）のゲノムにコードされるＦｔＮａｄＥ＊酵素を同定し、生体内および生体外の双方でニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮａＭＮ）アミド化酵素として機能する能力を実証した（Ｓｏｒｃｉ Ｌ．ｅ．，２００９）。さらに、彼らは、３つのアミノ酸残基が、ＮａＡＤ：Ｙ２７；Ｑ１３３；およびＲ２３６よりもＮａＭＮに対しての酵素の基質選択性の原因であることを提案した。この機能をコードする追的な配列を同定するために、ＦｔＮａｄＥ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するｔＢｌａｓｔｎのデフォルトパラメータを使用して、２０１６年９月１４にＮＣＢＩｎｒ／ｎｔデータベースのＢＬＡＳＴ検索から導かれた５０個のユニークなヌクレオチド配列をＧｅｎｅｉａｓアラインメントアルゴリズム（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，ＬＬＬＣ）を用いて翻訳し整列させた。これらの配列のうちの１６個は、保存されたチロシン、グルタミン、およびアルギニンを有し、それぞれＹ２７、Ｑ１３３およびＲ２３６と整列して（すなわち、「ＹＱ Ｒモチーフ」を含有した）、ＮａＭＮアミド化酵素をコードすることが予測された（配列番号３〜１８および図５）。
［実施例１］
［ＮａＭＮアミド化活性をコードする配列の同定（ＮａｄＥ＊）］
Ｓｏｒｃｉおよび共同研究者は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（配列番号１）のゲノムにコードされるＦｔＮａｄＥ＊酵素を同定し、生体内および生体外の双方でニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮａＭＮ）アミド化酵素として機能する能力を実証した（Ｓｏｒｃｉ Ｌ．ｅ．，２００９）。さらに、彼らは、３つのアミノ酸残基が、ＮａＡＤ：Ｙ２７；Ｑ１３３；およびＲ２３６よりもＮａＭＮに対しての酵素の基質選択性の原因であることを提案した。この機能をコードする追的な配列を同定するために、ＦｔＮａｄＥ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するｔＢｌａｓｔｎのデフォルトパラメータを使用して、２０１６年９月１４にＮＣＢＩｎｒ／ｎｔデータベースのＢＬＡＳＴ検索から導かれた５０個のユニークなヌクレオチド配列をＧｅｎｅｉａｓアラインメントアルゴリズム（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，ＬＬＬＣ）を用いて翻訳し整列させた。これらの配列のうちの１６個は、保存されたチロシン、グルタミン、およびアルギニンを有し、それぞれＹ２７、Ｑ１３３およびＲ２３６と整列して（すなわち、「ＹＱ Ｒモチーフ」を含有した）、ＮａＭＮアミド化酵素をコードすることが予測された（配列番号３〜１８および図５）。
［実施例２］
［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＮａＭＮアミド化活性（ＮａｄＥ＊）の発現のための遺伝子構築物］
１６の予測されたｎａｄＥ＊遺伝子セット中で、統学的距離を最大化することに基づいて、予測されたｎａｄＥ＊読み取り枠（配列番号２および１９〜２７）をコードする１０個の配列が選択され（図６）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２コドン使用頻度表によって、閾値の希少度を０．４に設定し、Ｇｅｎｅｉｏｕｓコドン最適化アルゴリズムを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化した。最適化された配列（配列番号２８〜３７）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．によって新規合成され、これもまたＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってＸｈｏＩ／ＮｄｅＩ消化ｐＥＴ２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローン化されて、表１のプラスミドを得た。ＮＲ合成を誘導し、ＭＥ４０７、ＭＥ６４４、ＭＥ６４５、ＭＥ６４６、ＭＥ６４７、ＭＥ６４８、ＭＥ６４９、ＭＥ６５０、ＭＥ６５１、ＭＥ６５２株を得るために、プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、ｎａｄＥ＊遺伝子のＩＰＴＧ誘導を可能にした（表２）。
［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＮａＭＮアミド化活性（ＮａｄＥ＊）の発現のための遺伝子構築物］
１６の予測されたｎａｄＥ＊遺伝子セット中で、統学的距離を最大化することに基づいて、予測されたｎａｄＥ＊読み取り枠（配列番号２および１９〜２７）をコードする１０個の配列が選択され（図６）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２コドン使用頻度表によって、閾値の希少度を０．４に設定し、Ｇｅｎｅｉｏｕｓコドン最適化アルゴリズムを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化した。最適化された配列（配列番号２８〜３７）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．によって新規合成され、これもまたＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってＸｈｏＩ／ＮｄｅＩ消化ｐＥＴ２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローン化されて、表１のプラスミドを得た。ＮＲ合成を誘導し、ＭＥ４０７、ＭＥ６４４、ＭＥ６４５、ＭＥ６４６、ＭＥ６４７、ＭＥ６４８、ＭＥ６４９、ＭＥ６５０、ＭＥ６５１、ＭＥ６５２株を得るために、プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、ｎａｄＥ＊遺伝子のＩＰＴＧ誘導を可能にした（表２）。
本明細書に記載される全ての基本的な分子生物学およびＤＮＡ操作手順は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ）．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（ｅｄｓ．）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：ＮｅｗＹｏｒｋ）に従って実施した。
［実施例３］
［ＮａｄＥ＊酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の特性決定］
ＮＲ産生に対するＮａｄＥ＊発現の効果を試験するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を単一コロニーからＬＢ培地に接種して、一晩増殖させた（２ｍＬ、３７°Ｃ、１５ｍＬ試験管、２５０ｒｐｍ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）。前培養（２００μＬ）を使用して、２５μＭのＩＰＴＧ含有または非含有の２ｍＬのＭ９ｎＣ培地に接種し、ＡｉｒＰｏｒｅテープシート（Ｑｉａｇｅｎ）で密封した２４ウェル深型ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ Ｕｎｉｐｌａｔｅ、丸底１０ｍＬ）内で３日間増殖させた（Ｉｎｖｅｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｓｈａｋｅｒ、８００ｒｐｍ、８０％湿度）。サンプルは、本明細書に記載されるように、ＬＣ−ＭＳによって分析した。プラスミドなしでは、ＮＲ産生は、２５μＭのＩＰＴＧの誘導の存在下および非存在下において、定量限界以下であった。ＮａｄＥ＊酵素の発現のためのプラスミドを保有する菌株は、誘導時に最大２．７ｍｇ／ＬのＮＲを産生した（表３）。
［ＮａｄＥ＊酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の特性決定］
ＮＲ産生に対するＮａｄＥ＊発現の効果を試験するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を単一コロニーからＬＢ培地に接種して、一晩増殖させた（２ｍＬ、３７°Ｃ、１５ｍＬ試験管、２５０ｒｐｍ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）。前培養（２００μＬ）を使用して、２５μＭのＩＰＴＧ含有または非含有の２ｍＬのＭ９ｎＣ培地に接種し、ＡｉｒＰｏｒｅテープシート（Ｑｉａｇｅｎ）で密封した２４ウェル深型ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ Ｕｎｉｐｌａｔｅ、丸底１０ｍＬ）内で３日間増殖させた（Ｉｎｖｅｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｓｈａｋｅｒ、８００ｒｐｍ、８０％湿度）。サンプルは、本明細書に記載されるように、ＬＣ−ＭＳによって分析した。プラスミドなしでは、ＮＲ産生は、２５μＭのＩＰＴＧの誘導の存在下および非存在下において、定量限界以下であった。ＮａｄＥ＊酵素の発現のためのプラスミドを保有する菌株は、誘導時に最大２．７ｍｇ／ＬのＮＲを産生した（表３）。
［実施例４］
［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＮＲ産生の増加はＹ２７、Ｑ１３３、およびＲ２３６を有するＮａｄＥ＊を必要とする］
ＮＲ産生のためのＹＱＲモチーフの重要性を実証するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）最適化されたＮａｄＥ＊配列のうち４つを改変して、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）Ｙ２７、Ｑ１３３、Ｒ２３６残基と整列する残基を除去し、バチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ＮａｄＥ（それぞれＴ、Ｇ、およびＶ；配列番号４２〜４５）でコードされるアミノ酸残基で置換した。対応するｐＥＴ２４ａ（＋）プラスミドの部位特異的変異誘発がＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃによって実施され、表１のプラスミドを得た。プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ｎａｄＥ−ＴＧＶ遺伝子のＩＰＴＧ誘導を可能にし、菌株ＭＥ７０８、ＭＥ７１０、ＭＥ７１２、およびＭＥ７１４を得た（表２）。ＮａｄＥ−ＴＧＶを有するこれらの株は、ＮＲ産生において、ＮａｄＥ＊を有する株と同様のＩＰＴＧ依存性増加を示さなかった（表４）。
［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＮＲ産生の増加はＹ２７、Ｑ１３３、およびＲ２３６を有するＮａｄＥ＊を必要とする］
ＮＲ産生のためのＹＱＲモチーフの重要性を実証するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）最適化されたＮａｄＥ＊配列のうち４つを改変して、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）Ｙ２７、Ｑ１３３、Ｒ２３６残基と整列する残基を除去し、バチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ＮａｄＥ（それぞれＴ、Ｇ、およびＶ；配列番号４２〜４５）でコードされるアミノ酸残基で置換した。対応するｐＥＴ２４ａ（＋）プラスミドの部位特異的変異誘発がＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃによって実施され、表１のプラスミドを得た。プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ｎａｄＥ−ＴＧＶ遺伝子のＩＰＴＧ誘導を可能にし、菌株ＭＥ７０８、ＭＥ７１０、ＭＥ７１２、およびＭＥ７１４を得た（表２）。ＮａｄＥ−ＴＧＶを有するこれらの株は、ＮＲ産生において、ＮａｄＥ＊を有する株と同様のＩＰＴＧ依存性増加を示さなかった（表４）。
［実施例５］
［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮａｄＥの過剰発現は増加したＮＲ産生を観察するには十分でない］
高レベルのＮａＡＤアミド化活性（ＮａｄＥ）が、増加したＮＲ蓄積を生じるには十分でないことを実証するために、それぞれ開始コドンおよび停止コドンにＸｈｏＩ／Ｎｄｅｌ制限部位を付加するプライマーＭ０１１１５９およびＭＯ１１１６０を有するＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムから（表５）、ＰＣＲによって野生型ｎａｄＥ読み取り（配列番号４６）枠を増幅した。ＰＣＲ断片を同様に消化したｐＥＴ２４ａ（＋）にライゲートさせ、プラスミドｐＥＴ２４ｂ＋ｎａｄＥＢＬ２１を得た。このプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ｎａｄＥのＩＰＴＧ誘導を可能にし、株ＭＥ６８３を得た。ＮａｄＥ＊配列を発現する株と共にＮＲ産生について試験した際、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮａｄＥの追加的な発現を有するこの株は、ＮＲ濃度のＩＰＴＧ依存性増加を示さなかった。（表４）。
［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮａｄＥの過剰発現は増加したＮＲ産生を観察するには十分でない］
高レベルのＮａＡＤアミド化活性（ＮａｄＥ）が、増加したＮＲ蓄積を生じるには十分でないことを実証するために、それぞれ開始コドンおよび停止コドンにＸｈｏＩ／Ｎｄｅｌ制限部位を付加するプライマーＭ０１１１５９およびＭＯ１１１６０を有するＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムから（表５）、ＰＣＲによって野生型ｎａｄＥ読み取り（配列番号４６）枠を増幅した。ＰＣＲ断片を同様に消化したｐＥＴ２４ａ（＋）にライゲートさせ、プラスミドｐＥＴ２４ｂ＋ｎａｄＥＢＬ２１を得た。このプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ｎａｄＥのＩＰＴＧ誘導を可能にし、株ＭＥ６８３を得た。ＮａｄＥ＊配列を発現する株と共にＮＲ産生について試験した際、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮａｄＥの追加的な発現を有するこの株は、ＮＲ濃度のＩＰＴＧ依存性増加を示さなかった。（表４）。
［実施例６］
［ＮＲ蓄積の基礎レベルが増加したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の構築］
より高い産物蓄積の状況においてＮＲ蓄積を促進するＮａｄＥ＊酵素の有効性を実証するために、ＮＲ蓄積の基礎レベルの増加のために宿主株を遺伝子操作した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａ、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＡＴＣＣ１３０３２、およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８を富栄養培地（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではＬＢ、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｕｃｍ）およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ではＢＨＩ）中で一晩培養し、２ｍＬのＭ９ｎＣ培地に１：１０で接種した。２４時間後、培養物をＭＳのために試料採取し、相対ＮＲレベルを調べた。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＮＲ産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｕｃｍ）よりも高く、さらなる遺伝子操作のための宿主として選択された。
［ＮＲ蓄積の基礎レベルが増加したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の構築］
より高い産物蓄積の状況においてＮＲ蓄積を促進するＮａｄＥ＊酵素の有効性を実証するために、ＮＲ蓄積の基礎レベルの増加のために宿主株を遺伝子操作した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａ、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＡＴＣＣ１３０３２、およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８を富栄養培地（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではＬＢ、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｕｃｍ）およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ではＢＨＩ）中で一晩培養し、２ｍＬのＭ９ｎＣ培地に１：１０で接種した。２４時間後、培養物をＭＳのために試料採取し、相対ＮＲレベルを調べた。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＮＲ産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｕｃｍ）よりも高く、さらなる遺伝子操作のための宿主として選択された。
ｎａｄＲ、ｄｅｏＤ、およびｐｕｐＧの正確な欠失のためのカセットは長い隣接ＰＣＲ（ＬＦ−ＰＣＲ）によって構築した。各遺伝子の隣接領域は、適切な抗生物質耐性遺伝子の５’または３’領域に相同的な配列（それぞれ、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、およびネオマイシン、配列番号４８〜５０）が、ＰＣＲ産物に組み込まれるようにデザインされた表５のプライマーを用いて、ＢＳ１６８ゲノムＤＮＡの増幅（Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲテンプレート調製キット）によって得た（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭの各プライマー、９５℃で２分間の初期変性、９５℃で３０秒と５０℃で２０秒と７２℃で６０秒を３０サイクル、７２℃で７分間の最終保持）。抗生物質耐性遺伝子を同様にプライマーで増幅して、５’および３’隣接領域に相同な配列を組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切なプライマーを用いてＬＦ−ＰＣＲに使用した（表５）（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭの各プライマー、１５０ｎｇの各ＰＣＲ産物、９８℃で３０秒の初期変性、９８℃で３０秒と５５℃で３０秒と７２℃で３６０秒を３５サイクル）。ＬＦ−ＰＣＲ産物を精製し、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の形質転換のために使用した。
ＢＳ１６８は、自然形質転換によりＬＦ−ＰＣＲ産物で形質転換し（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ”．１９９０．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃ．Ｒ Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｃｕｔｔｉｎｇ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ＢＳ６２０９（ｎａｄＲ：：ｓｐｅ）、ＭＥ４７９（ｄｅｏＤ：：ｔｅｔ）、およびＭＥ４９２（ｐｕｐＧ：：ｎｅｏ）を得た。ＭＥ４９２由来のゲノムＤＮＡ（上記のように調製された）を使用してＢＳ６２０９を形質転換し、ＭＥ４９６（ｎａｄＲ：：ｓｐｅ ｐｕｐＧ：：ｎｅｏ）を得た。ＭＥ４７９由来のゲノムＤＮＡ（上記のように調製された）を使用してＭＥ４９６を形質転換し、ＭＥ５１７（ｎａｄＲ：：ｓｐｅ ｐｕｐＧ：：ｎｅｏ ｄｅｏＤ：：ｔｅｔ）を得た。
［実施例７］
［ＮａｄＥ＊を発現するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築および特性決定］
ＮａｄＥ＊活性をコードする４つの配列は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現のためにコドン最適化され（Ｇｅｎｅｉｏｕｓコドン最適化アルゴリズムＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８コドン使用頻度表、０．４で希少であると設定される閾値）、最適化配列（配列番号３８〜４１）は、ＩＤＴによってｇＢｌｏｃｋｓとして合成された。最適化されたＮａｄＥ＊配列の発現のためのカセットを、ＬＦ−ＰＣＲによって作製した。適切なプライマー（表５）およびｐＤＧ１６６２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）およびｇＢｌｏｃｋｓをテンプレートとして使用して、ａｍｙＥ５’領域、ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）、ｐＶｅｇｌプロモーターを含む隣接領域と、ａｍｙＥ３’領域を含む隣接領域とを上記のように増幅した。ゲル精製された隣接領域およびｇＢｌｏｃｋｓ（上記）を上記のようにＬＦ−ＰＣＲのために使用して、生成物をゲル精製した。
［ＮａｄＥ＊を発現するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築および特性決定］
ＮａｄＥ＊活性をコードする４つの配列は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現のためにコドン最適化され（Ｇｅｎｅｉｏｕｓコドン最適化アルゴリズムＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８コドン使用頻度表、０．４で希少であると設定される閾値）、最適化配列（配列番号３８〜４１）は、ＩＤＴによってｇＢｌｏｃｋｓとして合成された。最適化されたＮａｄＥ＊配列の発現のためのカセットを、ＬＦ−ＰＣＲによって作製した。適切なプライマー（表５）およびｐＤＧ１６６２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）およびｇＢｌｏｃｋｓをテンプレートとして使用して、ａｍｙＥ５’領域、ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）、ｐＶｅｇｌプロモーターを含む隣接領域と、ａｍｙＥ３’領域を含む隣接領域とを上記のように増幅した。ゲル精製された隣接領域およびｇＢｌｏｃｋｓ（上記）を上記のようにＬＦ−ＰＣＲのために使用して、生成物をゲル精製した。
ＭＥ５１７を精製ＤＮＡで上記のように形質転換し、形質転換体をコロニー精製して、株ＭＥ７９５（ＭｓＮａｄＥ＊）、ＭＥ８０５（ＦｎＮａｄＥ＊）、ＭＥ８２０（ＦｓｐＮａｄＥ＊）、およびＭＥ８２４（ＦｔＮａｄＥ＊）を得た。株を使用して、ＢＨＩ培地の１ｍＬ培養液に二連で接種し、ＭＥ５１７を２４ウェル振盪プレートに四連で接種し、（上記の通り）３７℃で一晩培養した。１７時間後に、プレートを遠心分離して、上清を廃棄し、ペレットを２ｍＬのＭ９ｎＣ培地に再懸濁した。プレートをインキュベーターに戻し、さらに２４時間培養した。ＮＲが測定され、ＮａｄＥ＊過剰発現コンストラクトを保有する株は、平均して親株より７２〜１３３％多いＮＲを産生した（表６）。
［実施例８］
［ＮａｄＥ＊を発現するコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株の構築および特性決定］
細菌におけるＮＲの生産のためのこれらの配列の一般的有用性をさらに実証するために、ＦｎＮａｄＥ＊をコードする配列をＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）における発現のためにコドン最適化（Ｇｅｎｅｉｏｕｓコドン最適化アルゴリズムＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）コドン使用頻度表、０．４で希少であると設定される閾値）し、最適化配列（配列番号４７）を、ＥｃｏＲＩ制限部位およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）コンセンサスＲＢＳをコードするオープンリーディングフレームの上流の追加的な配列と、Ｓｍａｌ制限部位をコードする下流の追加的な配列と共に、ＩＤＴによってｇＢｌｏｃｋとして合成した。ｇＢｌｏｃｋをＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで消化して７６０ｂｐのフラグメントを得て、これを同様に消化されたＭＢ４１２４にライゲートし、プラスミドＭＢ４１２４−ＦｎＮａｄＥ＊を得た。ＭＢ４１２４は、ＭＢ４０９４（米国特許出願公開第６０／６９２，０３７号明細書に記載される）をｐＴｒｃ９９ａに由来するＩＰＴＧ誘導性プロモーター（Ｇｅｎｅ．１９８８ Ｓｅｐ ３０；６９（２）：３０１−１５）と組み合わせることによって、潜在的Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）低コピーｐＢＬｌプラスミド（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３０：２２３７−２２４６，１９８４を参照されたい）から誘導した。Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＡＴＣＣ １３０３２は、ＦｎＮａｄＥ＊のＩＰＴＧ誘導性発現のために、プラスミドで形質転換した（Ｆｏｌｉｅｔｔｉｅ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔａｌ．ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．１６７：６９５−７０２，１９９３）。
［ＮａｄＥ＊を発現するコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株の構築および特性決定］
細菌におけるＮＲの生産のためのこれらの配列の一般的有用性をさらに実証するために、ＦｎＮａｄＥ＊をコードする配列をＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）における発現のためにコドン最適化（Ｇｅｎｅｉｏｕｓコドン最適化アルゴリズムＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）コドン使用頻度表、０．４で希少であると設定される閾値）し、最適化配列（配列番号４７）を、ＥｃｏＲＩ制限部位およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）コンセンサスＲＢＳをコードするオープンリーディングフレームの上流の追加的な配列と、Ｓｍａｌ制限部位をコードする下流の追加的な配列と共に、ＩＤＴによってｇＢｌｏｃｋとして合成した。ｇＢｌｏｃｋをＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで消化して７６０ｂｐのフラグメントを得て、これを同様に消化されたＭＢ４１２４にライゲートし、プラスミドＭＢ４１２４−ＦｎＮａｄＥ＊を得た。ＭＢ４１２４は、ＭＢ４０９４（米国特許出願公開第６０／６９２，０３７号明細書に記載される）をｐＴｒｃ９９ａに由来するＩＰＴＧ誘導性プロモーター（Ｇｅｎｅ．１９８８ Ｓｅｐ ３０；６９（２）：３０１−１５）と組み合わせることによって、潜在的Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）低コピーｐＢＬｌプラスミド（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３０：２２３７−２２４６，１９８４を参照されたい）から誘導した。Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＡＴＣＣ １３０３２は、ＦｎＮａｄＥ＊のＩＰＴＧ誘導性発現のために、プラスミドで形質転換した（Ｆｏｌｉｅｔｔｉｅ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔａｌ．ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．１６７：６９５−７０２，１９９３）。
単一のコロニーを２ｍＬのＶＹ培地（適切な場合は＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン）に接種し、３０℃で一晩培養した。この培養物の２００ｍＬを使用して、２％グルコース（適切な場合は＋１０μｇ／ｍＬカナマイシン）と種々のレベルのＩＰＴＧを含む２ｍＬのＡＺ培地に接種した。ＮＲが測定され、ＦｎＮａｄＥ＊過剰発現コンストラクトを保有する株は、ＩＰＴＧ依存性のＮＲ産生増加を示した（表７）。
［実施例９］
［生産培養におけるニコチンアミドリボシドの検出］
ＮＲを液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣＭＳ）によって分析した。培養後、１００μＬを９６ウェル深型ウェルプレート内の９００μＬのＭＳ希釈剤（１０％水、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ９．０、９０％アセトニトリル）中に希釈した。プレートを遠心分離し（１０分間、３０００ｒｐｍ）、上清を特性決定のために新しいプレートに移し入れた。上清を５μｌ部分で、ＨＩＬＩＣＵＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ、２．１×７５ｍｍ、製品番号１８６０００５６５７）に注入した。１分間の保持後に、９９．９％（９５％アセトニトリル／５％水を含むｐＨ９．０の１０ｍＭ酢酸アンモニウム）移動相Ｄから７０％移動相Ｃ（５０／５０アセトニトリル／水を含むｐＨ９．０の１０ｍＭ酢酸アンモニウム）への直線勾配を使用して、１２分間かけて４００μＬ／分の流速で化合物を溶出し、移動相Ｃ中での１分間の保持と、移動相Ｄ中での５分間の再平衡がそれに続いた（表８）。溶出化合物は、陽性エレクトロスプレーイオン化を用いて三重四極（ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）質量分析計で検出した。装置をＭＲＭモードで操作し、遷移ｍ／ｚ１２３＞８０を用いてＮＲを検出した。同一条件下で注入された標準物質（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ）と比較して、ＮＲを定量化した。
［生産培養におけるニコチンアミドリボシドの検出］
ＮＲを液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣＭＳ）によって分析した。培養後、１００μＬを９６ウェル深型ウェルプレート内の９００μＬのＭＳ希釈剤（１０％水、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ９．０、９０％アセトニトリル）中に希釈した。プレートを遠心分離し（１０分間、３０００ｒｐｍ）、上清を特性決定のために新しいプレートに移し入れた。上清を５μｌ部分で、ＨＩＬＩＣＵＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ、２．１×７５ｍｍ、製品番号１８６０００５６５７）に注入した。１分間の保持後に、９９．９％（９５％アセトニトリル／５％水を含むｐＨ９．０の１０ｍＭ酢酸アンモニウム）移動相Ｄから７０％移動相Ｃ（５０／５０アセトニトリル／水を含むｐＨ９．０の１０ｍＭ酢酸アンモニウム）への直線勾配を使用して、１２分間かけて４００μＬ／分の流速で化合物を溶出し、移動相Ｃ中での１分間の保持と、移動相Ｄ中での５分間の再平衡がそれに続いた（表８）。溶出化合物は、陽性エレクトロスプレーイオン化を用いて三重四極（ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）質量分析計で検出した。装置をＭＲＭモードで操作し、遷移ｍ／ｚ１２３＞８０を用いてＮＲを検出した。同一条件下で注入された標準物質（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ）と比較して、ＮＲを定量化した。
［実施例１０］
［細菌増殖および産生アッセイで使用される培地］
１リットルのＶＹ培地は、２５ｇの子牛肉浸出液（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇのバクト酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）を含有する。
［細菌増殖および産生アッセイで使用される培地］
１リットルのＶＹ培地は、２５ｇの子牛肉浸出液（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇのバクト酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）を含有する。
１リットルのＭ９ｎＣ培地は、５０ｇグルコース、６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＮａＣｌ、１ｇのＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、１５ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ、４．５ｍｇのＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇのＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＭｎＣｌ２ ＊４Ｈ２Ｏ、４．５ｍｇのＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＨ３ＢＯ３、および０．１ｍｇのＫＩを含有する。
１リットルのＡＺ培地は、２０ｇグルコース、２ｇのＮａＣｌ、３ｇクエン酸ナトリウム、０．１ｇのＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ、４ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＫＨ２ＰＯ４、７．５ｇのＨ４ＳＯ４、３．７５ｇ尿素、０．５ｇのＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、４５０μｇチアミン、４５０μｇビオチン、４ｍｇパントテン酸、１５ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ、４．５ｍｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇのＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＭｎＣｌ２ ＊４Ｈ２Ｏ、４．５ｍｇのＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＨ３ＢＯ３、および０．１ｍｇのＫＩを含有する。
Claims (26)
- ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）を産生できる遺伝子修飾細菌であって、前記細菌が、
ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；
ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなり、前記少なくとも１つの修飾を有する細菌が、前記修飾のいずれも有しない細菌よりも増加した量のＮＲを産生する、遺伝子修飾細菌。 - 前記細菌が、
ａ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣ遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することで、ＮＡＤ＋生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｂ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｃ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｄ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｅ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；および
ｇ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される１つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなる、請求項１に記載の細菌。 - 前記ＮａｄＥ＊タンパク質が、配列番号１および３〜１８のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチドに変換するためのニコチン酸アミド化活性を有する、請求項１または請求項２に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質が、配列番号６６〜７０のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＮＡＤ＋をニコチンアミドモノヌクレオチドおよびアデニンに変換するためのＮＡＤ＋加水分解活性を有する、請求項に１または請求項２に記載の細菌。
- 前記ＮＡＤ＋生合成の負の調節因子が、配列番号５１、５２、または５３のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドがＮＡＤ＋生合成を抑制する活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドリボシド輸送体が、配列番号５４、５５、または５６のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドリボシドを移入するためのニコチンアミドリボシド輸送活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドモノヌクレオシドヒドロラーゼが、配列番号５７、５８、または５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドモノヌクレオチドをニコチンアミドリボシドに変換するためのヌクレオシドヒドロラーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号６３、６４、または６５のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチン酸アデニンジヌクレオチドに変換するためのニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼタンパク質が、配列番号６０、６１、または６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドモノヌクレオチドをニコチン酸モノヌクレオチドに変換するためのニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼタンパク質が、配列番号７２〜７６のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、ニコチンアミドリボシドおよびリン酸をニコチンアミドおよびリボース−１−リン酸に変換するためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌であって、前記キノリン酸シンターゼが、配列番号７７、７８、または７９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、イミノコハク酸およびジヒドロキシアセトンリン酸からキノリン酸を形成する活性を有し、または前記Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼが、配列番号８０または８１のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、アスパラギン酸からイミノコハク酸を形成する活性を有し、または前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、配列番号８２、８３、または８４のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異型であり、前記ポリペプチドが、キノリン酸およびホスホリボシルピロリン酸からニコチン酸モノヌクレオチドを形成する活性を有する、細菌。
- 前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、およびＲ．オイトロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記ＮａｄＥ＊タンパク質が、配列番号１の標準アミノ酸配列と比較すると、ａ）ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０． １のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズを用いて配列番号１および３〜１８と比較した際に、アライメントのＣｌｕｓｔａｌＷ法に基づく、２７位のチロシン、ｂ）１３３位のグルタミン、およびｃ）２３６位のアルギニンの保存アミノ酸の１つまたは複数を有する、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の細菌。
- ＮＲを生産してＮＲを培地から回収するのに効果的な条件下で菌細胞を培養し、それによってＮＲを生産するステップを含んでなる、ＮＲを生産する方法であって、前記宿主微生物が、
ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；
ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質の活性を添加しまたは増加させること；
ｃ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣ遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでＮＡＤ＋生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｄ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｅ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｇ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｈ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；および
ｉ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる、方法。 - ＮＲを生産してＮＲを培地から回収するのに効果的な条件下で菌細胞を培養し、それによってＮＲを生産するステップを含んでなる、ＮＲを生産する方法であって、前記宿主微生物が、
ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；
ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含んでなる、方法。 - 細菌細胞が、
ａ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣ遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでＮＡＤ＋生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｂ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｃ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｄ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｅ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；および
ｉ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される少なくとも１つの修飾をさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。 - 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子修飾細菌から得られる、ニコチンアミドリボシド化合物。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細菌から得られるニコチンアミドリボシド化合物を含んでなる、組成物。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細菌から得られるニコチンアミドリボシド化合物を含んでなる、食品または飼料。
- 遺伝子修飾の結果としてＮＲを産生し、その中で細菌が培養される発酵ブロス中に、産生されたＮＲを少なくとも１００ｍｇ／Ｌまで蓄積し得ることによって特徴付けられる、遺伝子修飾細菌。
- 前記遺伝子修飾が、ａ）異種性ニコチン酸アミド化タンパク質（ＮａｄＥ＊）の活性を添加すること；ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質活性を添加しまたは増加させることからなる群から選択される、請求項２０に記載の遺伝子修飾細菌。
- 前記遺伝子修飾が、
ａ）ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｎａｄＣ遺伝子またはそれらの組み合わせ転写を抑制することでＮＡＤ＋生合成を抑制するように機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｂ）ニコチンアミドリボシド輸送体タンパク質として機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｃ）ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｄ）ニコチンアミドモノヌクレオチドアミドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｅ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼとして機能するタンパク質の活性をブロックしまたは減少させること；
ｆ）ニコチンアミドモノヌクレオチドヒドロラーゼとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること；および
ｇ）Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、またはそれらの組み合わせとして機能するタンパク質の活性を添加しまたは増加させること
からなる群から選択される、１つまたは複数の追加的な修飾をさらに含んでなる、請求項２１に記載の遺伝子修飾細菌。 - 前記ＮａｄＥ＊タンパク質が、配列番号１および３〜１８のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、ニコチン酸モノヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチド変換するためのニコチン酸アミド化活性を有する、請求項２２に記載の遺伝子修飾細菌。
- 前記ＮａｄＥ＊タンパク質が、配列番号１の標準アミノ酸配列と比較すると、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０． １のデフォルトパラメータ、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズを用いて配列番号１および３〜１８と比較した際に、アライメントのＣｌｕｓｔａｌＷ法に基づく、ａ）２７位のチロシン、ｂ）１３３位のグルタミン、およびｃ）２３６位のアルギニンの保存アミノ酸の１つまたは複数を有する、請求項２３に記載の細菌。
- 前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）加水分解タンパク質が、配列番号６６〜７０のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、ＮＡＤ＋をニコチンアミドモノヌクレオチドおよびアデニンに変換するためのＮＡＤ＋加水分解活性を有する、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、およびＲ．オイトロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択される、請求項１〜１３および２０〜２５のいずれか一項に記載の細菌。
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