KR20180083350A - 니코틴아미드 리보시드의 미생물학적 제조 - Google Patents

니코틴아미드 리보시드의 미생물학적 제조 Download PDF

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KR20180083350A
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은 니코틴아미드 리보시드의 생산을 야기하도록 경로를 조절함에 의한 니코틴아미드 리보시드의 신규 제조 방법, 상기 방법에 유용한 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

니코틴아미드 리보시드의 미생물학적 제조
본 발명의 양태는 니코틴아미드 리보시드의 신규 제조 방법, 상기 방법에 유용한 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 9월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 62/233,696 및 2015년 11월 13일에 출원된 미국 특허 가출원 62/254,736을 우선권 주장하고, 따라서 이의 개시는 그 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
니코틴아미드 리보시드(NR)는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 또는 NAD+에 대한 전구체로서 기능을 하는 비타민 B3의 피리딘-뉴클레오시드 형태이다. 기작이 완전히 이해되진 않았지만, 고 용량의 니코틴산은 고밀도 지단백질 콜레스테롤을 증가시키고, 저밀도 지단백질 콜레스테롤을 감소시키고, 유리 지방산을 감소시키는데에 도움이 될 수 있는 것으로 여겨진다. 과거에, 니코틴아미드 리보시드는 화학적으로 합성되어 왔다. 니코틴아미드 리보시드의 합성을 야기하는 생물학적 경로가 공지되어 있으나, 니코틴아미드 리보시드를 생물학적으로 제조하는 것은 난제로 남아있다. 따라서, 니코틴아미드 리보시드를 보다 효율적으로 제조하기 위한 신규 방법을 찾아내는 것이 바람직하다.
세균에서 NAD+의 생합성은 1990년대에 처음 밝혀졌고 진핵생물에서는 발견되지 않은 2개의 주요한 효소적 활성에 의존하는 것으로 나타났다: FAD 의존성 L-아스파테이트 산화효소(NadB, EC 1.4.3.16); 및 퀴놀레이트 합성효소(NadA, EC 2.5.1.72)(문헌[Flachmann, 1988, European Journal of Biochemistry, 175(2), 221-228] 참고). NadB는 느슨하게 결합된 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드(FAD) 보조인자의 관여에 의해 산소 분자를 전자 수용체로서 이용하고 과산화수소를 생성하여 L-아스페테이트의 이미노숙시네이트로의 산화를 촉매한다(문헌[Seifert, 1990, Biological chemistry Hoppe - Seyler , 371(1), 239-248] 참고). 에시리키어 콜라이(Escherichia coli)에서 효소는 다운스트림 생성물 NAD+에 의해 억제되는 것으로 공지되어 있으나(문헌[Nasu S, 1982, J Biol Chem , 257(2), 626-32] 참고), 피드백 내성 돌연변이체가 생성된 바 있다(문헌[Hughes, 1983, J Bacteriol , 154(3), 1126-36] 참고). 철-황 클러스터를 함유하는 NadA는 다이하이드록시아세톤 포스페이트에 의해 이미노숙시네이트의 축합 및 고리화를 후속적으로 수행하여 퀴놀레이트를 생성한다(문헌[Flachmann, 1988] 참고). 상기 2개의 효소의 조합된 활성은 1 몰의 퀴놀레이트를 1 몰의 아스파테이트 및 1 몰의 다이하이드록시아세톤 포스페이트로부터 생성할 수 있다.
3개의 추가적인 효소적 활성은 2개의 표준적인 신규 NAD+ 합성 경로에 대하여 통상적이다: 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소(NadC, EC 2.4.2.19); 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소(NadD, EC 2.7.7.18); 및 NAD+ 합성효소(NadE, EC 6.3.1.5). NadC는 포스포리보실 잔기를 포스포리보실파이로포스페이트로부터 퀴놀레이트 질소로 수송하고 중간체의 후속 탈카복시화를 촉매하여 니코틴산 모노뉴클레오티드(NaMN), 파이로포스페이트 및 이산화탄소를 생성한다(문헌[Begley, 2001, Vitamins & Hormones, 61, 103-119] 참고). NadD는 아데닌 트라이포스페이트(ATP)를 사용하여 NaMN을 아데닐화하여 니코틴산 다이뉴클레오티드(NaAD) 및 파이로포스페이트(문헌[Begley, 2001] 참고)를 생성한다. NadD는 또한 니코틴아미드 다이뉴클레오티드(NMN)을 아데닐화시킬수 있으나, NaMN을 기질로서 사용할 때보다 낮은 친화도(높은 Km) 및 낮은 회전율(Vmax)을 갖는다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 효소는 NaMN에 대하여 NMN에 대한 Vmax/Km보다 104배 높은 Vmax/Km을 갖는다(문헌[Olland, 2002, J Biol Chem , 277(5), 3698-3707] 참고). NAD+ 생합성의 최종 단계는 NadE에 의해 촉매되고, 이는 암모니아 또는 글루타민을 질소 공여체로서 이용하여 NaAD를 NAD+로 아미드화하여 1몰의 ATP를 AMP 및 파이로포스페이트로 가수분해한다(문헌[Begley, 2001] 참고). NadD의 기질 적응성과 유사하게, 상기 효소는 NaAD 대신에 NaMN에 작용하여 NMN을 생성할 수 있으나, 기질 선호도가 강하고; 바실러스 안트락시스(Bacillus anthracis)에서 Vmax/Km의 차이는 103배 미만이다(문헌[Sorci, 2009, J Biol Chem, 277(5), 3698-3707] 참고).
전술된 표준적인 경로에 비해, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)에서의 경로는 중간체인 NMN을 통해 진행된다(문헌[Sorci, 2009] 참고). NaMN의 형성 후, FtNadE* 효소는 이의 아미드화를 NH3을 사용하여 전형적인 NadE 효소와 명백히 유사한, 즉 ATP 1 몰의 가수분해 수반되는(본원에서 NadE* 활성으로 지칭됨) 기작으로 촉매한다. FtNadE* 효소는 또한 NaAD를 아미드화할 수 있으나, NaMN에 대하여 Vmax/Km에 대한 상대적 값이 60배 차이로 보다 더 특이적이다. 최종 단계는 NMN의 아데닐화를 촉매하는 NadM 효소에 의해 촉매된다.
상기 신규 경로에 이외에도, NMN, NR, 니코틴아미드(Nam) 또는 니코틴산(NA)를 수거하기 위한 다양한 경로가 존재한다(문헌[Gazzaniga, 2009, Microbiol Mol Biol Rev, 73(3), 529-541] 참고). NMN은 니코틴아미드 뉴클레오티드 아미다제(E. coli PncC, B. subtilis CinA, EC 3.5.1.42)의 작용에 의해 NaMN으로 재활용되고; NR은 니코틴아미드 리보시드 키나제(E. coli NadR, EC 2.7.1.22)에 의해 NMN으로 인산화되거나 가역 반응에서 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소(E. coli DeoD, B. subtilis DeoD, PupG, Pdp, EC 2.4.2.1)에 의해 Nam 및 포스포리보스로 분해되고; Nam은 DeoD에 의해 NMN으로 포스포리보실화되거나 니코틴아미드화효소에 의해 NA로 탈아미드화되고; NA 또는 Nam 각각은 니코티네이트 포스포리보실 전이효소(E. coli PncB, B. subtilis YueK EC 6.3.4.21)에 의해 NaMN 또는 NMN으로 전환된다. 세포외 NMN은 주변 세포질 산 인산분해효소(E. coli UshA, B. subtilis YfkN, EC 3.1.3.5)에 의해 NR로 탈인산화될 수 있고, 세포외 NR은 NR 수송체(E. coli PnuC, B. subtilis NupG)에 의해 함입될 수 있다. NAD+ 그 자체는 피리미딘 뉴클레오티드를 위한 공급원으로서 사용될 수 있다. NAD+는 NAD+ 이인산분해효소(NudC, EC 3.6.1.22)의 활성에 의해 NMN 및 아데노신 모노포스페이트로 절단된다.
nad 유전자의 발현은 세균에서 전형적으로 전사 억제자에 의해 공동-조절된다. 에시리키어 콜라이에서, nadA, nadB 및 pncB의 전사는 NadR 단백질에 의해 억제되고, 이는 또한 회수 경로에 기여하는 촉매적 활성을 갖는다(문헌[Raffaelli, 1999, J Bacteriol , 181(17), 5509-5511] 참고). NadR은 NAD+의 존재하에 보존된 모티프에 결합함으로써 전사를 차단한다. 바실러스 서브틸리스에서, YrxA로 명명된 상이한 단백질은 2개의 상이하게 전사된 오페론인 nadB-nadA-nadC 및 nifS-yrxA의 전사를 NA의 존재하에 차단함으로써 유사한 기능을 수행한다(문헌[Rossolillo, 2005, J Bacteriol , 187(20), 7155-7160] 참고).
놀랍게도 현재, 본 발명자들은 니코틴아미드 리보스의 생성 속도를 상당히 증가시키는 신규 방법을 발견하였고, 상기 방법에 유용한 발현 벡터 및 숙주 세포를 제조하였다.
본 발명은 니코틴아미드 리보시드(NR)를 생성할 수 있는 유전자 변형 세균에 관한 것으로서, 상기 세균은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하고, 하나 이상의 전술된 변형을 갖는 세균은 임의의 전술된 변형을 포함하지 않는 세균보다 증가된 양의 NR을 생산한다:
(a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함; 및
(b) 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
일부 양태에서, 유전자 변형 세균은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 변형을 추가로 포함할 수 있다:
(a) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(b) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(c) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(d) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(e) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
(g) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 NR의 제조 방법에 관한 것이다:
세균 세포를 니코틴아미드 리보시드를 생산하기에 효과적인 조건하에 배양하는 단계 및 니코틴아미드 리보시드를 배지로부터 회수하여 NR을 생산하는 단계를 포함하되, 상기 숙주 미생물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
(a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함;
(b) 니코틴아미드 아네닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴;
(c) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(d) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(e) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(g) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(h) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
(i) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
본 발명은 하기를 포함하는 NR의 또 다른 제조 방법에 관한 것이다:
세균 세포를 니코틴아미드 리보시드를 생산하기에 효과적인 조건하에 배양하는 단계 및 니코틴아미드 리보시드를 배지로부터 회수하여 NR을 생산하는 단계를 포함하되, 상기 숙주 미생물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
(a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함; 및
(b) 니코틴아미드 아네닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
상기 방법에서, 세균 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다:
(a) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(b) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(c) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(d) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(e) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
(g) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
일부 양태에서, NadE* 단백질은 서열번호 1, 및 3 내지 18 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴산 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드로 전환하는 니코틴산 아미드화 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 NadE* 단백질은 10의 갭 페널티(GAP PENEALTY), 0.1의 갭 길이 페널티 및 단백질 중량 행렬의 곤넷 250 급수(Gonnet 250 series)를 사용하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 참조로 하여 비교될 때, 클러스탈W(ClustalW) 정렬법을 기준으로 하여 서열번호 1, 및 3 내지 18에 비해 위치 27에서의 티로신, 위치 133에서의 글루타민 및 위치 236에서의 아르기닌의 보존되는 아미노산 중 하나 이상을 추가로 갖는다.
일부 양태에서, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질은 서열번호 66 내지 70 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드는 NAD+를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 아데닌으로 전환하는 NAD+ 가수분해 활성을 갖는다.
일부 양태에서, NAD+ 생합성의 음성 조절제는 서열번호 51, 52 또는 53 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 NAD+ 생합성을 억제하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 니코틴아미드 리보시드 수송체는 서열번호 54, 55, 56 또는 71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴아미드 리보시드를 함입하는 니코틴아미드 리보시드 수송 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 뉴클레오시드 가수분해효소는 서열번호 57, 58 또는 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 리보시드로 전환하는 뉴클레오시드 가수분해효소 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 단백질은 서열번호 63, 34 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴산 모노뉴클레오티드를 니코틴산 아데닌 다이뉴클레오티드를 전환하는 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소 단백질은 서열번호 60, 61 또는 62 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 니코틴산 모노뉴클레오티드로 전환하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소 단백질은 서열번호 72 내지 76 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴아미드 리보시드 및 포스페이트를 니코틴아미드 및 리보스-1-포스페이트로 전환하는 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 퀴놀레이트 합성효소는 서열번호 77, 78 또는 79 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 이미노숙신산 및 다이하이드록시아세톤 포스페이트를 퀴놀레이트 및 포스페이트로 전환하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, L-아스파테이트 산화효소는 서열번호 80 또는 81 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 FAD 의존성 반응에서 아스파트산을 이미노숙신산으로 전환하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소는 서열번호 82, 83 또는 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 퀴놀레이트 및 포스포리보시파이로포스페이트를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 이산화탄소로 전환하는 활성을 갖는다.
또한, 본 발명은 유전자 변형의 결과로서, 세균이 NR을 생산하고 생산된 NR을 세균이 자라는 발효액 중 100 mg/L 이상으로 축적할 수 있는 것으로 특성화되는 유전자 변형 세균에 관한 것이다.
일부 양태에서, 유전자 변형 세균에서 유전자 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함; 및
(b) 니코틴아미드 아네닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
일부 양태에서, 유전자 변형 세균에서 유전자 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 변형을 추가로 포함한다:
(a) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(b) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(c) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(d) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(e) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
(f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
(g) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
일부 양태에서, 상기 유전자 변형 세균에서 NadE* 단백질은 서열번호 1, 및 3 내지 18 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴산 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드로 전환하는 니코틴산 아미드화 활성을 갖는다.
일부 양태에서, NadE* 단백질은 10의 갭 페널티, 0.1의 갭 길이 페널티 및 단백질 중량 행렬의 곤넷 250 급수를 사용하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 참조로 하여 비교될 때, 클러스탈W 정렬법을 기준으로 하여 서열번호 1, 및 3 내지 18에 비해 위치 27에서의 티로신, 위치 133에서의 글루타민 및 위치 236에서의 아르기닌의 보존되는 아미노산 중 하나 이상을 갖는다.
일부 양태에서, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질은 서열번호 66 내지 70 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드는 NAD+를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 아데닌으로 전환하는 NAD+ 가수분해 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 유전자 변형 세균은 에시리키어 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아시네토박터 바일이(Acinetobacter baylyi) 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)일 수 있다.
또한, 본 발명은 임의의 전술된 유전자 변형 세균으로부터 수득되는 니코틴아미드 리보시드 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 임의의 전술된 유전자 변형 세균으로부터 수득되는 니코틴아미드 리보시드 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전술된 유전자 변형 세균으로부터 수득되는 니코틴아미드 리보시드 화합물을 포함하는 식품 또는 사료에 관한 것이다.
서열목록 개요
첨부된 서열목록에 나목된 핵산 서열은 뉴클레오티드 염기에 대한 표준적인 문자 약어를 사용하여 나타낸다. 각각의 핵산 서열의 단 하나의 가닥만을 나타내되, 상보적 가닥은 나타낸 가닥에 대한 임의의 참조로 포함되는 것으로 이해된다.
첨부된 서열목록에서,
서열번호 1은 니코틴산 아미드화 단백질인 프란시셀라 툴라렌시스 NadE* 효소(FtNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 프란시셀라 툴라렌시스 NadE* 효소(FtNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 3은 니코틴산 아미드화 단백질인 프란시셀라 종 FSC1006 NadE* 효소(FspFNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 니코틴산 아미드화 단백질인 프란시셀라 광저우엔시스(guangzhouensis) 효소(FgNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 니코틴산 아미드화 단백질인 프란시셀라 종 TX077308 NadE* 효소(FspTNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 니코틴산 아미드화 단백질인 프란시셀라 필로미라지아(philomiragia) 아종 필로미라지아 ATCC 25017 NadE* 효소(FphNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 니코틴산 아미드화 단백질로 예측되는 프란시셀라 필로미라지아 균주 O#319-036 [ FSC 153] NadE* 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 니코틴산 아미드화 단백질로 예측되는 프란시셀라 노아투엔시스(noatunensis) 아종 오리엔탈리스(orientalis) 균주 토바(Toba) 04 NadE* 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다..
서열번호 9는 니코틴산 아미드화 단백질로 예측되는 프란시셀라 필로미라지아 균주 GA01-2794 NadE* 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 니코틴산 아미드화 단백질인 프란시셀라 페르시카(persica) ATCC VR-331 NadE* 효소(FpeNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 니코틴산 아미드화 단백질인 프란시셀라 추정종(cf.) 노비시다(novicida) 3523 NadE* 효소(FnNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 니코틴산 아미드화 단백질로 예측되는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다 D9876 NadE* 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 니코틴산 아미드화 단백질로 예측되는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다 F6168 NadE* 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 14는 니코틴산 아미드화 단백질로 예측되는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 툴라렌시스 균주 NIH B-38 NadE* 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 15는 니코틴산 아미드화 단백질로 예측되는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 홀아크티카(holarctica) F92 NadE* 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 16은 니코틴산 아미드화 단백질인 다이켈로박터 노도서스(Dichelobacter nodosus) VCS1703A NadE* 효소(DnNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 17은 니코틴산 아미드화 단백질인 만헤이미아 숙시노프로듀센스(Mannheimia succinoproducens) MBEL55E NadE* 효소(MnNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 18은 니코틴산 아미드화 단백질인 액티노바실러스 숙시노진스(Actinobacillus succinogenes) NadE* 효소(AsNadE*)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 19는 만헤이미아 숙시노프로듀센스 MBEL55E NadE* 효소(MnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 20은 다이켈로박터 노도서스 VCS1703A NadE* 효소(DnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 21은 액티노바실러스 숙시노진스 NadE* 효소(AsNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 22는 프란시셀라 필로미라지아 아종 필로미라지아 ATCC 25017 NadE* 효소(FphNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 23은 프란시셀라 추정종 노비시다 3523 NadE* 효소(FnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 24는 프란시셀라 종 TX077308 NadE* 효소(FspTNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 25는 프란시셀라 종 FSC1006 NadE* 효소(FspFNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 26은 프란시셀라 광저우엔시스 NadE* 효소(FgNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 27은 프란시셀라 페르시카 ATCC VR-331 NadE* 효소(FpeNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 28은 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 숙시노프로듀엔스 MBEL55E NadE* 효소(MnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 29는 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 다이켈로박터 노도서스 VCS1703A NadE* 효소(DnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 30은 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 액티노바실러스 숙시노진스 NadE* 효소(AsNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 31은 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 필로미라지아 아종 필로미라지아 ATCC 25017 NadE* 효소(FphNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 32는 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 추정종 노비시다 3523 NadE* 효소(FnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 33은 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 종 TX077308 NadE* 효소(FspTNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 34는 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 종 FSC1006 NadE* 효소(FspFNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 35는 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 광저우엔시스 NadE* 효소(FgNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 36은 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 페르시카 ATCC VR-331 NadE* 효소(FpeNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 37은 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 툴라렌시스 NadE* 효소(FtNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 38은 바실러스 서브틸리스에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 툴라렌시스 NadE* 효소(FtNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 39는 바실러스 서브틸리스에서의 발현에 최적화된 만헤이미아 숙시노프로듀엔스 MBEL55E NadE* 효소(MnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 40은 바실러스 서브틸리스에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 추정종 노비시다 3523 NadE* 효소(FnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 41은 바실러스 서브틸리스에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 종 TX077308 NadE* 효소(FspTNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 42는 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 툴라렌시스 NadE* 효소(FtNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하고 돌연변이 Y27T, Q133G 및 R236V를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 43은 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 숙시노프로듀엔스 MBEL55E NadE* 효소(MnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하고 돌연변이 Y22T, Q128G 및 R231V를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 44는 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 추정종 노비시다 3523 NadE* 효소(FnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하고 돌연변이 Y27T, Q133G 및 R236V를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 45는 에시리키어 콜라이에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 종 TX077308 NadE* 효소(FspTNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하고 돌연변이 Y27T, Q133G 및 R236V를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 46은 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 아미드화 활성을 인코딩하는 에시리키어 콜라이 NadE 효소(EcNadE)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 47은 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 발현에 최적화된 프란시셀라 추정종 노비시다 3523 NadE* 효소(FnNadE*) 개방형 해독틀을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 48은 테트사이클린 내성을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 49는 네오마이신 내성을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 50은 스펙티노마이신 내성을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 51은 에시리키어 콜라이 NadR 효소(NMN 합성효소, NR 키나제, NAD+ 생합성의 음성 조절제)를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 52는 억제제 단백질인 바실러스 서브틸리스 NadR(즉 YxrA) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 53은 억제제 단백질인 코리네박테리움 글루타미쿰(즉 CgR_1153) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 54는 NR 수송체 단백질인 아시네토박터 바일이 PnuC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 55는 NR 수송체 단백질인 코리네박테리움 글루타미쿰 PnuC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 56은 NR 수송체 단백질인 에시리키어 콜라이 PnuC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 57은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소인 에시리키어 콜라이 UshA 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 58은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소인 바실러스 서브틸리스 UshA(즉 YfkN) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 59는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소인 코리네박테리움 글루타미쿰UshA(즉 Cg0397) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 60은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소인 에시리키어 콜라이 PncC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 61은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소인 바실러스 서브틸리스 PncC(즉 CinA) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 62는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소인 코리네박테리움 글루타미쿰 PncC(즉 Cg2153) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 63은 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소인 에시리키어 콜라이 NadD 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 64는 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소인 바실러스 서브틸리스 NadD 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 65는 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소인 코리네박테리움 글루타미쿰 NadD(즉 Cg2584) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 66은 NAD+ 이인산분해효소인 아시네토박터 NudC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 67은 NAD+ 이인산분해효소인 에시리키어 콜라이 NudC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 68은 NAD+ 이인산분해효소인 코리네박테리움 글루타미쿰 NudC(즉 Cg0888) 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 69는 NAD+ 이인산분해효소인 버크홀더리아시에(Burkholderiaceae) NudC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 70은 NAD+ 이인산분해효소인 헤모필러스 인플루엔재(Haemophilus influenzae) NudC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 71은 NR 수송체 단백질인 바실러스 서브틸리스 NupG 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 72는 뉴클레오시드 가인산분해효소인 바실러스 서브틸리스 DeoD 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 73은 뉴클레오시드 가인산분해효소인 바실러스 서브틸리스 Pdp 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 74는 뉴클레오시드 가인산분해효소인 바실러스 서브틸리스 PupG 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 75는 뉴클레오시드 가인산분해효소인 에시리키어 콜라이 DeoD 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 76은 뉴클레오시드 가인산분해효소인 코리네박테리움 글루타미쿰 G18NG 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 77은 퀴놀레이트 합성효소인 에시리키어 콜라이 NadA 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 78은 퀴놀레이트 합성효소인 바실러스 서브틸리스 NadA 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 79는 퀴놀레이트 합성효소인 코리네박테리움 글루타미쿰 NadA 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 80은 L-아스파테이트 산화효소인 에시리키어 콜라이 NadB 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 81은 L-아스파테이트 산화효소인 바실러스 서브틸리스 NadB 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 82는 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소인 에시리키어 콜라이 NadC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 83은 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소인 바실러스 서브틸리스 NadC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 84는 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소인 코리네박테리움 글루타미쿰 NadC 효소를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 85는 프라이머 10444이다.
서열번호 86은 프라이머 10447이다.
서열번호 87은 프라이머 11222이다.
서열번호 88은 프라이머 11223이다.
서열번호 89는 프라이머 11226이다.
서열번호 90은 프라이머 11227이다.
서열번호 91은 프라이머 11230이다.
서열번호 92는 프라이머 11231이다.
서열번호 93은 프라이머 11232이다.
서열번호 94는 프라이머 11233이다.
서열번호 95는 프라이머 11234이다.
서열번호 96은 프라이머 11235이다.
서열번호 97은 프라이머 11341이다.
서열번호 98은 프라이머 11342이다.
서열번호 99는 프라이머 11351이다.
서열번호 100은 프라이머 11352이다.
서열번호 101은 프라이머 11353이다.
서열번호 102는 프라이머 11354이다.
서열번호 103은 프라이머 11159이다.
서열번호 104는 프라이머 11160이다.
본 발명의 양태를 도 1 내지 4를 참조로 하여 단지 예시로만 나타낼 것이다.
도 1은 NadA 및 NadB 효소의 존재하에 퀴놀레이트를 아스파테이트 및 다이하이드록시아세톤 포스페이트로부터 합성하는 생화학적 경로를 도시한다.
도 2는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드를 합성하는 생화학적 경로 및 효소를 도시한다.
도 3은 니코틴아미드 리보시드를 NAD+ 또는 NAD+생합성의 중간체로부터 제조하는데에 유용한 생화학적 경로를 도시한다.
도 4는 니코틴아미드 리보시드 생산에 바람직하지 않은 생화학적 경로를 도시한다.
도 5는 강조된 Y-Q-R 모티프를 갖는 NadE* 서열의 클러스탈W 정렬을 도시한다.
도 6은 Y-Q-R 모티프를 갖는 독특한 서열의 인접-연관 일치 수형도를 도시한다.
도 7은 본 연구에 사용된 균주들간의 진화적 거리를 나타내는 세균의 공통조상 계통수(rooted phylogenetic tree)를 도시한 것이다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 과학적 용어 및 기술적 용어는 본원에서 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
용어 "니코틴산 아미드화 단백질"은 니코틴산 모노뉴클레오티드(NaMN)를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)로 전환할 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 효소는 본원에서 "NadE*"로 지칭된다. 니코틴산 아미드화 단백질의 예는 서열번호 1, 및 3 내지 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 서열번호 1은 프란시셀라 툴라렌시스로부터 유래되고, FtNadE*로서 공지되어 있다. FtNadE* 단백질 서열은 진뱅크(GENBAK) 승인번호 YP_170217하에 제공된다. 서열번호 3은 프란시셀라 종 FSC1006으로부터 유래된다. FSC1006은 FspFNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_040008427.1하에 이용가능하다. 서열번호 4는 프란시셀라 광저우엔시스 균주 08HL01032로부터 유래되고, FgNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_039124332.1하에 이용가능하다. 서열번호 5는 프란시셀라 종 TX077308로부터 유래하고 FspTNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_013922810.1하에 이용가능하다. 서열번호 6은 프란시셀라 필로미라지아 아종 필로피라지아 ATCC 25017로부터 유래하고 FphNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_004287429.1하에 이용가능하다. 서열번호 7은 프란시셀라 필로미라지아 균주 O#319-036 [ FSC 153]으로부터 유래하고 NadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_042517896.1하에 이용가능하다. 서열번호 8은 프란시셀라 노아투넨시스(noatunensis) 아종 오리엔탈리스 균주 토바 04로부터 유래하고 NadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_014714556.1하에 이용가능하다. 서열번호 9는 프란시셀라 필로미라지아 균주 GA01-2794로부터 유래하고 NadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_044526539.1하에 이용가능하다. 서열번호 10은 프란시셀라 페르시카 ATCC VR-331로부터 유래하고 FpeNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_064461307.1하에 이용가능하다. 서열번호 11은 프란시셀라 추정종 노비시다 3523으로부터 유래하고 FnNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_014548640.1하에 이용가능하다. 서열번호 12는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다 D9876으로부터 유래하고 NadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_003037081.1하에 이용가능하다. 서열번호 13은 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다 F6168로부터 유래하고 NadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_003034444.1하에 이용가능하다. 서열번호 14는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 툴라렌시스 균주 NIH B-38로부터 유래하고 NadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_003025712.1하에 이용가능하다. 서열번호 15는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 홀아크티카 F92로부터 유래하고 NadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_010032811.1하에 이용가능하다. 서열번호 16은 다이켈로박터 노도서스 VCS1703A로부터 유래하고 DnNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_011927945.1하에 이용가능하다. 서열번호 17은 만헤이미아 숙신시프로듀센스(succiniciproducens) MBEL55E로부터 유래하고 MsNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_011201048.1하에 이용가능하다. 서열번호 18은 액티노바실러스 숙시노진스 130Z로부터 유래하고 AsNadE*로서 공지되어 있고; 단백질 승인번호는 승인번호 WP_012072393.1하에 이용가능하다.
용어 "니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 가수분해 단백질" 또는 "NAD+ 다이포스페이트"는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+)의 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 및 아데닌으로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 효소는 통상적으로 NudC로서 공지되어 있다. 본 발명에 사용되는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 가수분해 단백질은 다양한 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 코리네박테리움 글루타미쿰, 아시네토박터 바일이 등으로부터의 것일 수 있다. 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 가수분해 단백질의 예는 서열번호 66 내지 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. NAD+ 이인산분해효소 활성을 인코딩하는 예시적인 유전자는 승인번호 WP_004921449(아시네토박터 바일이), CAF19483(코리네박테리움 글루타미쿰), YP_026280(에시리키어 콜라이) 및 WP_010813670(랄스토니아 유트로파)하에 제공된다.
용어 "NAD+ 생합성의 음성 조절제"는 퀴놀레이트 합성효소(NadA), FAD 의존성 L-아스파테이트 산화효소(NadB), 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소(NadC) 또는 이의 임의의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성 활성을 억제할 수 있는 효소를 지칭한다. NAD+ 생합성의 음성 조절제를 인코딩하는 예시적인 유전자는 승인번호 WP_004398582.1(바실러스 서브틸리스), WP_000093814.1(에시리키어 콜라이) 및 WP_011014097.1(코리네박테리움 글루타미쿰)하에 제공된다.
용어 "퀴놀레이트 합성효소"는 이미노숙신산 및 다이하이드록시아세톤 포스페이트를 퀴놀레이트 및 포스페이트로 전환할 수 있는 효소를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 퀴놀레이트 합성효소는 다양한 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등으로부터의 것일 수 있다. 퀴놀레이트 합성효소 단백질의 예는 서열번호 77, 78 또는 79의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 퀴놀레이트 합성효소 활성을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 ACX40525(에시리키어 콜라이), NP_390663(바실러스 서브틸리스) 및 CAF19774(코리네박테리움 글루타미쿰)하에 제공된다. 정의된 퀴놀레이트 합성효소는 전술된 퀴놀레이트 합성효소의 기능적 변이체를 포함한다.
용어 "L-아스파테이트 산화효소"는 FAD 의존성 반응에서 아스파트산을 이미노숙신산으로 전환할 수 있는 효소를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 L-아스파테이트 산화효소는 다양한 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등으로부터의 것일 수 있다. 뉴클레오시드 가수분해효소 단백질의 예는 서열번호 80 또는 81을 갖는 아미노산을 포함한다. L-아스파테이트 산화효소를 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 ACX38768(에시리키어 콜라이) 및 NP_390665(바실러스 서브틸리스)하에 제공된다. 정의된 L-아스파테이트 산화효소는 전술된 L-아스파테이트 산화효소의 기능적 변이체를 포함한다.
용어 "퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소"는 퀴놀레이트 및 포스포리보실파이로포스페이트를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 이산화탄소로 전환할 수 있는 효소를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소는 다양한 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등의 것일 수 있다. 뉴클레오시드 가수분해효소 단백질의 예는 서열번호 82, 83 또는 84의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 활성을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 ACX41108(에시리키어 콜라이), NP_390664(바실러스 서브틸리스) 및 CAF19773(코리네박테리움 글루타미쿰)하에 제공된다. 정의된 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소는 전술된 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소의 기능적 변이체를 포함한다.
용어 "니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질"은 니코틴아미드 리보시드를 주변 세포질로부터 세포질로 함입하는 니코틴아미드 리보시드의 수송을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 효소는 통상적으로 PnuC로서 공지되어 있다. 본원에 기술되어 있는 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질은 숙주 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등의 고유 폴리펩티드이다. 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질의 예는 서열번호 54, 55, 56 또는 71의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. NR 수송체 활성을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 CAG67923(아시네토박터 바일이), NP_599316(코리네박테리움 글루타미쿰), NP_415272(에시리키어 콜라이) 및 WP_003227216.1(바실러스 서브틸리스)하에 제공된다.
용어 "니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소"는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 리보시드로의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 효소는 통상적으로 UshA로서 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 뉴클레오시드 가수분해효소는 다양한 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등으로부터의 것일 수 있다. 뉴클레오티드 가수분해 단백질의 예는 서열번호 57, 58 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 뉴클레오시드 가수분해효소 활성을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 NP_415013(에시리키어 콜라이), NP_388665(바실러스 서브틸리스) 및 CAF18899(코리네박테리움 글루타미쿰)하에 제공된다.
용어 "니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소"는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 니코틴산 모노뉴클레오티드로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 효소는 통상적으로 PncC로서 공지되어 있다. 본원에 기술되어 있는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소는 숙주 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등의 고유 폴리펩티드이다. 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소의 예는 서열번호 60, 61 또는 62의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 활성을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 NP_417180(에시리키어 콜라이), AAB00568(바실러스 서브틸리스) 및 CAF20304(코리네박테리움 글루타미쿰)하에 제공된다.
용어 "니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소"는 니코틴산 모노뉴클레오티드의 니코틴산 아데딘 다이뉴클레오티드로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 효소는 통상적으로 NadD로서 공지되어 있다. 본원에 기술되어 있는 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 단백질은 숙주 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등의 고유 폴리펩티드이다. 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 단백질의 예는 서열번호 63, 64 또는 65의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 활성을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 NP_415172(에시리키어 콜라이), NP_390442(바실러스 서브틸리스) 및 CAF21017(코리네박테리움 글루타미쿰)하에 제공된다.
용어 "퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소"는 니코틴아미드 리보시드 및 포스페이트의 니코틴아미드 및 리보스-1-포스페이트로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 의미한다. 상기 효소의 통상적인 명칭은 DeoD, PupG 및 Pdp이다. 본원에 기술되어 있는 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소는 숙주 생물, 예컨대 에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 등의 고유 폴리펩티드이다. 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소 단백질의 예는 서열번호 72 내지 75의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소 활성을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 승인번호 WP_003231176.1(바실러스 서브틸리스), WP_003243952.1(바실러스 서브틸리스), WP_0032300447.1(바실러스 서브틸리스), WP_000224877.1(에시리키어 콜라이) 및 BAC00196.1(코리네박테리움 글루타미쿰)하에 제공된다.
서열 동일성: 2개의 아미노산 서열간, 또는 2개의 뉴클레오티드 서열간 연관성은 매개변수 "서열 동일성"에 의해 기술된다.
본 개시의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열간의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지(The European Molecular Biology Open Software Suite; 문헌[Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277] 참고)의 니들 프로그램(바람직하게는 버전 3.0.0 또는 더 최신 버전) 내에서 실행되는 니들맨-뷘슈 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453])을 사용하여 측정된다. 사용되는 임의적 매개변수는 10의 갭 개방 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티, 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 행렬이다. "최장 동일성"으로 표지되는 니들 출력(간단 설정 없이 사용하여 수득됨)은 %동일성으로서 사용되고 하기와 같이 계산된다: (동일 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬에서 갭의 총 수).
핵산 구조물: 용어 "핵산 구조물"은 자연 발생 유전자로부터 단리되거나, 합성된 것이 아니라면 자연에 존재할 수 없는 핵산의 단편을 함유하도록 변형된 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 의미한다. 용어 핵산 구조물은 핵산 구조물이 본 개시의 코딩 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유할 때 "발현 카세트(cassette)"와 동의어이다.
제어 서열: 용어 "제어 서열"은 본 개시의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 모든 성분을 의미한다. 각각의 제어 서열은 폴리뉴클레오티드가 인코딩하는 폴리펩티드에 고유하거나 외래이거나, 서로 고유하거나 외래일 수 있다. 이러한 제어 서열은 비제한적으로 선도자(leader), 폴리아데닐화 서열, 펩티드 서열, 촉진자(promoter), 신호 펩티드 서열 및 전사 종결자를 포함한다. 제어 서열은 적어도 촉진자, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 제어 서열은 제어 서열과 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역의 결찰(ligation)을 이용하는 제한 부위를 도입하기 위해 연결자(linker)를 제공할 수 있다.
작동가능하게 연결된: 용어 "작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 코딩 서열의 발현을 유도(directing)하도록 제어 서열이 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 대하여 적절한 위치에 놓이는, 배열을 의미한다.
발현: 용어 "발현"은 폴리펩티드의 생산에 관련되는 임의의 단계, 예컨대 비제한적으로 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비를 포함한다.
발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 발현을 위해 제공되는 추가적인 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 선형 또는 환형 DNA를 의미한다.
숙주 세포: 용어 "숙주 세포"는 본 개시의 폴리펩티드 서열 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물 또는 발현 벡터에 의한 형질 전환, 형질 감염 및 형질 도입 등을 받아들일 수 있는 임의의 세균 세포를 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 중 발생한 돌연변이에 기인하여 부모 세포와 동일하지 않은 부모 세포의 자손을 포함한다.
본 발명은 니코틴아미드 리보시드의 생산을 위한 유전자 조작 특성을 갖는 세균 균주의 특성을 다룬다.
에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스 및 특징화된 세균, 및 모든 특징화된 진핵 생물종으로부터의 nadE 유전자 생성물은 니코틴산 아데닌 다이뉴클레오티드를, NAD+ 생산을 위한 아미드화 반응에 대한 기질로서 이용한다. 이러한 고유 경로에 의해, 니코틴아미드 리보시드(NR)는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+)의 분해에 의해 수득되고, 이는 문헌[U.S. Patent No. 8,114,626 B2]에 앞서 기술된 바 있다. 도 2를 참고한다.
생물 프란시셀라 툴라렌시스는 NAD+를 NaMN이 프란시렐라 툴라렌시스 NMN 합성효소(FtNadE*)의 작용에 의해 생성되는, 대체 경로를 통해 합성한다.
예상치 못하게도, 본 발명의 발명자들은 니코틴산 모노뉴클레오티드의 NMN으로의 아미드화 후 NR로의 탈인산화로 이루어진 NR로의 대체 경로를 세균에서 발견하였다. 도 3을 참고한다. 예를 들어, 본 발명의 발명자들은 FtNadE* 유전자의 발현 또는 이의 기능적 동족체의 에시리키어 콜라이에서의 발현이 과량의 NMN의 생산을 야기한다는 것을 발견하였다. 과량의 NMN은 방출되고 고유 주변 세포질 산성 인산분해효소에 의해 NR로 전환된다.
또한, 본 발명의 발명자들은 FtNadE*가 NR을 생산하기 위한 상기 대체 경로에 사용될 수 있는 유일한 단백질이 아님을 발견하였다. 본 발명의 발명자들은 동일한 기능을 수행하는 감마-프로테오세균의 다양한 균주로부터의 NadE* 단백질의 군을 동정하였다. 예를 들어, 서열번호 3 내지 18의 니코틴산 아미드화 단백질을 인코딩하는 NadE* 유전자 또는 이의 기능적 동족체의 발현 또한 NR의 생산을 야기한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, 하나 이상의 이코틴산 아미드화 유전자를 숙주 세포 내로 도입하는 것이 바람직하다. 이러한 유전자는 NaMN의 NMN으로의 전환을 촉매하는 니코틴산 아미드화 단백질을 인코딩한다. 하나의 양태에서, 니코틴산 아미드화 단백질은 NMN 합성효소(NadE*)이다. 구체적인 양태에서, 니코틴산 아미드화 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 NMN 합성효소(FtNadE*)이다. 본원에서의 양태에 따른 니코틴산 아미드화 단백질은, 예를 들어 비제한적으로 50% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열번호 1 또는 3 내지 18과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 니코틴산 아미드화 활성 또는 NadE* 활성을 갖는다.
본 출원의 발명자들은 서열번호 1, 및 3 내지 18 중에서 보존된 폴리펩티드를 동정하였다. 서열 정렬의 결과를 도 5에 나타내었다. 추가적으로, 하기 3개의 아미노산은 NadE* 단백질 활성을 유지하는데에 있어서 매우 중요한 것으로 고려된다: 위치 27에서의 티로신, 위치 133에서의 글루타민, 및 위치 236에서의 아르기닌. 상기 위치는 서열번호 1을 기준으로 하여 번호가 부여된다. 도 5의 서열변호 1, 및 3 내지 18의 클러스탈W 정렬을 참고한다.
일부 양태에서, NadE* 단백질은 서열번호 1의 참조 아미노산 서열과 비교하여 하기 보존된 아미노산 중 하나 이상을 추가로 함유한다(10의 갭 페널티, 0.1의 갭 길이 페널티, 및 단백질 중량 행렬의 곤넷 250 급수의 기본값 매개변수를 사용하여 서열번호 1, 및 3 내지 8과 비교하여 클러스탈W 정렬법을 기반으로 함): (a) 서열번호 27에서의 티로신; (b) 서열번호 133에서의 글루타민; 및 (c) 서열번호 236에서의 아르기닌. 서열번호 1은 위치 27에서의 티로신, 위치 133에서의 글루타민, 및 위치 236에서의 아르기닌을 갖는다.
에시리키어 콜라이 및 기타 세균종에서, nudC 유전자 생성물은 NADH의 NMN 및 아데노신 모노포스페이트(AMP)로의 가수분해를 촉매한다. nudC 유전자는 대부분의 배양 조건하에 매우 낮은 수준으로 발현된다. 예상치 못하게도, 본 발명의 발명자들은 이형 nudC 유전자를 고유 nudC 유전자를 갖거나 갖지 않는 숙주 세포에 첨가하거나 강한 구조성 또는 유도성 촉진자에 의해 nudC 유전자를 제어함으로써 NADH로부터의 NMN의 생산을 촉진하는 대체 경로를 발명하였다. 도 3을 참고한다. 생산 조건하에서 nudC 유전자의 발현은 과량의 NMN의 생산을 야기한다. 과량의 NMN은 방출되고 고유 주변 세포질 산성 인산분해효소에 의해 NR로 전환된다.
따라서, 본 발명의 제2 양태에서, nudC 유전자의 발현 수준을 증가시킴으로써 숙주 세포가 과량의 NMN을 생산하도록 야기하는 것이 바람직하다. 하나의 양태에서, 본 발명은 NAD+ 이인산분해효소의 증가된 활성을 갖는 세균 균주에 관한것이다. 본원에서의 양태에 따른 NAD+ 이인산분해효소는 이상, 예를 들어 비제한적으로 50% 이상 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이 서열번호 66 내지 70과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드 NAD+를 NMN으로 전환하는 NAD+ 이인산분해효소 활성을 갖는다.
NR 생산에 있어서, 보다 높은 농도의 NaMN가 세포 내에서 이용가능하도록 숙주 세포를 변형하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 추가적인 양태에서, 숙주 세포 내에서 니코틴산 아미드 모노뉴클레오티드의 생산률을 증가시킴을 야기하는 하나 이상의 유전자 변형을 도입하는 것이 바람직하다. 상기 변형은 신규 NAD+ 유전자의 생합성 경로, nadA, nadB 및/또는 nadC 전부 또는 일부의 전사를 억제하는 유전자 발현의 제거 또는 감소를 포함할 수 있다. 상기 변형은 추가적으로, 또는 다르게는, 예를 들어 nadB(에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스), nadA(에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰), 또는 nadC(에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰)에 의해 인코딩된 L-아스파테이트 산화효소 유전자, 퀴놀레이트 합성효소 유전자, 퀴놀레이트 포스포리보실파이로포스페이트 유전자 또는 이의 조합의 발현을 증가시킴을 포함할 수 있다. 상기 변형은 추가적으로, 또는 다르게는 다운스트림 대사 산물 NAD+에 의한 유전자 내성에 대한 저항을 야기하는 nadB 유전자에 대한 변형을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 니코틴아미드 리보시드 함입 및 수거 경로가 결여된 유전자 조작 세균 균주를 포함한다. 도 4를 참고한다. 세균에서 NAD+ 수거 경로의 붕괴는 세포외 NR의 축적을 야기할 것으로 예상되는데, 이는 이러한 균주는 니코틴아미드 리보시드를 세포질 내로 도입하지 못하고, 또한 니코틴아미드 리보시드(NR)를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)로 가인산분해하지 못하거나, NMN을 니코틴산 모노뉴클레오티드(NaMN)로 추가적으로 분해하지 못하기 때문이다. 3개의 효소 활성은 조작 세균 NR 생산에 있어서 특히 중요하다. 에시리키어 콜라이에서의 pncC 유전자 생성물 및 바실러스 서브틸리스에서의 cinA 유전자 생성물은 세균의 수거 효소이고, 이는 NMN의 NaMN으로의 탈아미드화, 즉 NadE*에 의해 촉매되는 반대 반응을 수행한다. 이러한 유전자의 삭제는 NMN의 NaMN으로의 전환을 방지하고 NMN의 세포내 농도를 증가시킨다. 뉴클레오시드 가인산분해효소 활성에 의한 NR의 Nam 및 리보스 포스페이트로의 분해는 생성물을 제거하고, 이러한 활성, 예를 들어 에시리키어 콜라이의 deoD, 바실러스 서브틸리스의 pdp를 인코딩하는 유전자의 삭제 또는 감소된 발현은 생성물의 형성률을 증가시킬 것이다. 에시리키어 콜라이 및 다수의 기타 세균에서, pnuC 세균 생성물은 NR을 함입하고, 삭제는 세포외 NR을 증가시킬 것이고; 바실러스 서브틸리스에서 NR 함입은 nupG 유전자 생성물에 의해 성취되고, 삭제는 세포외 NR을 증가시킬 것이다.
따라서, 본 발명의 제3 양태에서, 니코틴아미드 리보시드 함입 및 수거 경로를 차단하여 숙주 세포가 생산된 니코틴아미드 리보시드를 보존하도록 야기하는 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 본 발명의 세균 균주는 하기 특성 중 하나 이상을 보유한다: (i) 니코틴아미드 함입 수송체의 활성의 차단 또는 감소; (ii) 니코틴산 리보시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 차단 또는 감소; (iii) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소의 활성의 차단 또는 감소; (iv) NAD+ 생합성 단백질, 예컨대 L-아스페테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소 및 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소의 음성 억제제로서 기능을 하는 단백질의 차단 또는 감소; (v) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 차단 또는 감소; 및 (vi) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 차단 또는 감소.
본원에서의 양태에 따른 NAD+ 생합성의 음성 조절제는, 예를 들어 비제한적으로 서열번호 51, 52 또는 53 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 NAD+ 생합성에 필요한 유전자를 억제하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 퀴놀레이트 합성효소는 서열번호 77, 78 또는 79의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체이되, 전술된 폴리펩티드 퀴놀레이트를 이미노숙신산 및 다이하이드록시아세톤 포스페이트로부터 형성하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, L-아스파테이트 산화효소는 서열번호 80 또는 81의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체이되, 전술된 폴리펩티드는 이미노숙신산을 아스파트산으로부터 형성하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소는 서열번호 82, 83 또는 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴산 모노뉴클레오티드를 퀴놀레이트 및 포스포리보실파이로포스페이트로부터 형성하는 활성을 갖는다.
본원에서의 양태에 따른 니코틴아미드 함입 수송체(PnuC 또는 NupG)는, 예를 들어 비제한적으로 서열번호 54, 55, 56 또는 71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 폴리펩티드 니코틴아미드 리보시드 함입 활성을 갖는다.
본원에서의 양태에 따른 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소(PncC)는, 예를 들어 비제한적으로 서열번호 15, 16 또는 17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 폴리펩티드는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소의 활성을 갖는다.
본원에서의 양태에 따른 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소(NadD)는, 예를 들어 비제한적으로 서열번호 18 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 폴리펩티드 니코틴산 모노뉴클레오티드를 니코틴산 아데닌 다이뉴클레오티드로 전환하는 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소의 활성을 갖는다.
본원에서의 양태에 따른 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소(DeoD, PupG, Pdp)는, 예를 들어 비제한적으로 서열번호 72 내지 76 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 폴리펩티드는 니코틴아미드 리보시드 및 포스페이트를 니코틴아미드 및 리보스-1-포스페이트로 전환하는 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소의 활성을 갖는다.
본 발명의 제4 양태에서, ushA 유전자의 발현 수준이 증가하여 숙주 세포가 과량의 세포외 NR을 NMN으로부터 생산하는 것을 야기함이 바람직하다. 하나의 양태에서, 본 발명은 뉴클레오시드 가수분해효소의 증가된 활성을 갖는 세균 균주에 관한 것이다. 본원에서의 양태에 따른 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효(UshA)는, 예를 들어 비제한적으로 서열번호 57, 58 또는 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 리보시드로 전환하는 뉴클레오시드 가수분해효소의 활성을 갖는다.
또한, NAD+ 합성효소 단백질, 예컨대 L-아스파테이트 합성효소, 및 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소의 발현 수준을 증가시키는 것이 바람직하다. 하나의 양태에서, 본 발명은 증가된 활성의 하기 단백질 중 하나 이상을 갖는 세균 균주에 관한 것이다: L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소 및 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소.
일부 양태에서, 퀴놀레이트 합성효소는 서열번호 77, 78 또는 79의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 퀴놀레이트를 이미노숙신산 및 다이하이드록시아세톤 포스페이트로부터 형성하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, L-아스파테이트 산화효소는 서열번호 80 또는 81의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드 이미노숙신산을 아스파트산으로부터 형성하는 활성을 갖는다.
일부 양태에서, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소는 서열번호 82, 83 또는 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드는 니코틴산 모노뉴클레오티드를 퀴놀레이트 및 포스포리보실파이로포스페이트로부터 형성하는 활성을 갖는다.
다른 양태에서, 상기 제1 또는 제2 양태에서 기술되어 있는 세균 균주는 상기 제3 또는 제4 양태에 기술되어 있는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다.
예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은 니코틴아미드 리보시드를 생산할 수 있는 유전자 변형 세균에 관한 것으로서, 상기 세균은 하기 변형을 포함한다: (i) 부가된 이형 니코틴산 아미드화 단백질 NadE*; 및 (ii) 하기로 이루어진 군으로분터 선택된 하나 이상의 추가적인 변형: (a) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 NAD+ 생합성의 변경된 음성 조절제; (b) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 니코틴아미드 리보시드 함입 수송체; (c) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소; (d) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소; (e) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소; (f) 부가되거나 증가된 활성을 갖는 변경된 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소; (g) L-아스페테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합을 인코딩하는 유전자의 부가되거나 증가된 전사. 하나 이상의 전술된 변형을 갖는 세균은 임의의 전술된 변형을 갖지 않는 세균보다 증가된 양의 NR을 생산한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 니코틴아미드 리보시드를 생산할 수 있는 유전자 변형 세균에 관한 것으로서, 상기 세균은 하기 변형을 포함한다: (i) 부가되거나 증가된 활성을 갖는 변경된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질 NudC; 및 (ii) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 변형: (a) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 NAD+ 생합성의 변경된 음성 조절제; (b) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 니코틴아미드 리보시드 함입 수송체; (c) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소; (d) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소; (e) 차단되거나 감소된 활성을 갖는 변경된 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소; (f) 부가되거나 증가된 활성을 갖는 변경된 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소; (g) L-아스페테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합을 인코딩하는 유전자의 부가되거나 증가된 전사. 하나 이상의 전술된 변형을 갖는 세균은 임의의 전술된 변형을 갖지 않는 세균보다 증가된 양의 NR을 생산한다.
하나의 양태에서, 본원에 기술되어 있는 재조합법을 사용하여 도입된 니코틴산 아미드화 단백질 NadE*은 숙주 세균에 대하여 외인성으로서, 즉 변형 전에 세포내에 존재하지 않는다.
또 다른 양태에서, 전술된 기타 단백질은 변형이 단백질의 발현 수준이 증가되거나 감소되도록 성취되긴 하지만 숙주 세균에 대하여 내인성으로서, 즉 변형 전에 세포내에 존재한다. 발현 수준이 본 발명에서 변경되는 내인성 단백질의 예는 비제한적으로 NAD+ 이인산분해효소, NAD+ 생합성의 음성 조절제, 니코틴아미드 리보시드 함입 수송체, 니코틴아미드 모노뉴클레오시드 가수분해효소, 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 및 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소이다.
숙주 세균 세포는 상기 목적에 적합한 공지되어 있는 임의의 방법으로써 당업자에 의해 유전자 변형될 수 있다. 이는 관심 유전자, 예컨대 니코틴산 아미드화 단백질 NadE*을 인코딩하는 유전자의 숙주 세포 내에서 증식할 수 있는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 기타 발현 벡터로의 도입을 포함한다. 다르게는, 플라스미드 또는 코스미드 DNA, 또는 플라스미드 또는 코스미드 DNA의 부분, 또는 선형 DNA 서열은 호스트 게놈에, 예를 들어 동형 재조합 또는 무작위 통합에 의해 통합될 수 있다. 유전자 변형을 수행하기 위해, DNA는 세포내로 자연적 함입 또는 주지되어 있는 처리, 예컨대 전기천공에 의해 도입되거나 형질 전환될 수 있다. 유전자 변형은 도입된 촉진자의 제어하에 유전자의 발현을 수반할 수 있다. 도입된 DNA는 효소로서 작용할 수 있거나 추가적인 유전자의 발현을 조절할 수 있는 단백질을 인코딩할 수 있다.
미생물의 유전자 변형은 고전적인 균주 개발법 및/또는 분자 유전학적 기법을 사용하여 성취될 수 있다. 이러한 기법은 당분야에 공지되어 있고, 미생물에 대하여, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press]에 일반적으로 개시되어 있다. 참조 문헌[Sambrook et al., ibid.]는 그 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
적합한 폴리뉴클레오티드는 무작위 통합, 동형 재조합에 의해 세포로 도입될 수 있고/거나 유전자의 조합을 포함하는 발현 벡터의 부분을 형성할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 또 다른 양상을 형성한다.
이러한 발현 벡터 구조물에 적합한 벡터는 당분야에 주지되어 있고, 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 정렬될 수 있기에 숙주 세포, 예를 들어 전술된 세균에 필요한 효소를 발현하는데에 유용하다. 예를 들어, 비제한적으로 T7 촉진자, pLac 촉진자, nudC 촉진자, ushA 촉진자 및 pVeg를 비롯한 촉진자는 내인성 유전자 및/또는 이형 유전자와 연계되어 표적이 되는 유전자의 발현 패턴 변형에 사용될 수 있다. 유사하게는, 예시적인 종결자 서열은 비제한적으로 XPR1, XPR2 및 CPC1 종결자 서열의 사용을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서 전반에 걸쳐 언급된 재조합 또는 유전자 변형 세균 세포는 임의의 그람-양성 세균 또는 그람-음성 세균, 예컨대 비제한적으로 바실러스, 코리네박테리움, 에시리키어, 아시네토박터, 락토바실러스, 마이코박테리움(Mycobacterium), 슈도모나스(Psuedomnas) 및 랄스토니아 속일 수 있다. 특정 양태에서, 세균의 예시적인 종은 비제한적으로 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 에시리키어 콜라이, 아시네토박터 바일이 및 랄스토니아 유트로파이다. 상기 양태는 특정 종으로 제한되지 않고 오히려 세균의 모든 주요 문을 포괄한다(도 7).
본 개시의 유전자 변형 박테리아는 또한 본원에 정의된 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 세균을 포괄한다. 본원에 사용된, "변이체"는 하나 이상(몇몇)의 위치에서 하나 이상(몇몇)의 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 및/또는 삭제가 성취되었다는 점에서 아미노산 서열이 이것이 유래된 염기 서열과 상이한, 폴리펩티드를 의미한다. 치환은 위치를 점유하는 아미노산의 상이한 아미노산에 의한 대체를 의미하고; 삭제는 위치를 점유하는 아미노산의 제거를 의미하고; 삽입은 위치를 점유하는 아미노산에 인접한 1 내지 3개의 아미노산의 첨가를 의미한다.
변이체는 변이체 서열이 본원에서 구체화된 고유한 아미노산 서열을 갖는 효소와 유사하거나 동일한 기능적 효소 활성 특징을 갖는다는 점에서 기능적 변이체이다.
예를 들어, 서열번호 1, 및 3 내지 18의 기능적 변이체는 서열번호 1, 및 3 내지 18 각각으로서 유사하거나 동일한 니코틴산 아미드화 단백질 FtNadE* 활성 특징을 갖는다. 전술된 기능적 변이체가 다른 장점 또한 제공할 수 있음에도, 서열번호 1, 및 3 내지 18의 기능적 변이체에 의한 니코틴산 모노뉴클레오티드의 니코틴아미드 모노뉴클레오티드로의 전환율이 동일하거나 유사할 수 있다는 점이 하나의 예일 수 있다. 예를 들어, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 또는 약 100% 이상의 전환율이 서열번호 1, 및 3 내지 18 각각의 기능적 변이체인 효소가 사용될 때 성취될 것이다.
따라서, 임의의 상기 서열번호의 아미노산 서열의 기능적 변이체 또는 단편은 동일한 효소 분류체계내에 존재하는 임의의 아미노산 서열이다(즉 동일한 EC 번호를 가짐). 효소가 특정 분류 체계에 포함되는가를 결정하는 방법은 발명적 기량의 사용없이 효소를 결정할 수 있는 당업자에게 주지되어 있다. 적합한 방법은, 예를 들어 국제 생화학 및 분자생물학 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)으로부터 수득될 수 있다.
아미노산이 광범위한 유사 특성을 갖는 상이한 아미노산으로 대체되는 경우, 아미노산 치환기는 "보존적"으로 간주될 수 있다. 비-보존적 치환은 아미노산이 상이한 유형의 아미노산으로 치환되는 경우이다.
"보존적 치환"은 동일한 부류의 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 의미하되, 상기 부류는 하기와 같이 정의된다:
아미노산 부류의 예:
무극성: A, V, L, I, P, M, F, W.
비-하전 극성: G, S, T, C, Y, N, Q.
산성: D, E.
염기성: K, R, H.
본 개시에 따라 제조된 니코틴아미드 리보시드 화합물은 임의의 다양한 적용례에서, 예를 들어 이의 생물학적 또는 치료적 특성(예를 들어 저밀도 지단백질 콜레스테롤의 조절, 고밀도 지단백질 콜레스테롤의 증가 등)을 활용함으로써 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시에 따라 니코틴아미드 리보시드는 제약, 식품 및 식이 보충제 등에 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 방법에 의해 제조된 니코틴아미드 리보시드는 혈장 지질 프로파일(profile)을 향상시키거나, 뇌졸중을 예방하거나, 화학요법적 치료에 의한 신경보호를 제공하거나, 진균 감염을 치료하거나, 신경변성을 예방 또는 감소시키거나, 보건 및 건강 유지에 치료적 가치를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 효과량의 니코틴아미드 리보시드 조성물을 투여함으로써 NAD+ 생합성의 니코틴아미드 리보시드 키나제 경로와 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 전술된 유전자 변형 세균으로부터 수득된 니코틴아미드 리보시드 화합물에 관한 것이다. 전형적으로 변경된 수준의 NAD+ 또는 NAD+ 전구체를 갖거나 니코틴아미드 리보시드에 의한 치료로써 증가된 NAD+ 생합성으로부터 유익함을 얻을 수 있는 질환 또는 병태는 비제한적으로 지질 장애(예컨대 이상지질혈증, 고-콜레스테롤혈증 또는 고지혈증), 뇌졸중, 신경변성 질환(예컨대 알츠하이머, 파킨슨 및 다발경화증), 화학요법에 의해 관찰되는 신경독성, 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 감염, 및 노화와 관련된 일반적인 건강 약화를 포함한다. 이러한 질환 및 병태는 니코틴아미드 리보시드 화합물을 사용한 식이 보충 또는 치료법 제공에 의해 예방되거나 치료될 수 있다.
본 발명의 유전자 변형 세균으로부터 단리된 니코틴아미드 리보시드 화합물이 최종 제품으로 재-제형화될 수 있음이 이해될 것이다. 본 개시의 일부 다른 양태에서, 본원에 기술되어 있는 숙주 세포를 조작함으로써 제조되는 니코틴아미드 리보시드 화합물은 숙주 세포와 관련하여 최종 제품(예컨대 식품 또는 사료 보충제, 제약 등)으로 혼입된다. 예를 들어, 숙주 세포는 료필라징(lyophilizing)되거나, 동결건조되거나, 동결되거나 다르게는 비활성화된 후, 세포 전체가 최종 제품으로 혼입되거나 최종 제품으로서 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 (용해(lysis)를 통한) 생체이용성을 증가시키기 위해 제품으로의 혼입 전에 가공될 수 있다.
본 개시의 일부 양태에서, 제조된 니코틴아미드 리보시드 화합물은 식품 또는 사료(예컨대 식품 보충제)의 성분으로 혼입된다. 본 개시에 따라 니코틴아미드 리보시드 화합물이 혼입될 수 있는 식품의 유형은 특히 제한되지 않고 음료, 예컨대 우유, 물, 청량 음료, 에너지 음료, 차 및 주스; 제과류, 예컨대 젤리 및 비스킷; 지방-함유 식품 및 지방-함유 음료, 예컨대 유제품; 가공 식품, 예컨대 쌀, 빵, 아침식사용 시리얼 등을 포함한다. 일부 양태에서, 제조된 니코틴아미드 리보시드 화합물은 유제품 보충제, 예컨대 멀티비타민에 혼입된다.
하기 예는 본 발명을 그의 범주를 임의의 수단으로 제한함 없이 설명하도록 의도된다.
실시예
실시예 1
NaMN 아미드화 활성( NadE *)을 코딩하는 서열의 동정
소르시(Sorci) 및 동료들은 프란시셀라 툴라렌시스의 게놈(서열번호 1)에 의해 인코딩되는 효소 FtNadE*를 동정하고 체내 및 체외 둘다에서 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NaMN) 아미드화 효소(문헌[Sorci L. e., 2009] 참고)로서 기능을 하는 능력을 입증하였다. 추가적으로, 이들은 3개의 아미노산 잔기가 NaAD: Y27; Q133; 및 R236을 능가하는 상기 효소의 NaMN에 대한 기질 선호도의 원인이 됨을 제안하였다. 상기 기능을 인코딩하는 추가적인 서열을 동정하기 위해, 2016년 9월 14일에 NCBI nr/nt 데이터베이스의 BLAST 검색으로부터 FtNadE에 대한 아미노산 서열(서열번호 2)에 의한 tBlastn 기본값 매개변수를 사용하여 유도된 50개의 고유 뉴클레오티드 서열을 번역하고 지네이우스 정렬 알고리즘(Geneious alignment algorithm, 바이오매터스 유한회사(Biomatters, LLC.))을 사용하여 정렬하였다. 상기 서열 중 16개는 각각 Y27, Q133 및 R236으로 정렬된(즉 Y-Q-R 모티프를 함유함) 보존된 티로신, 글루타민 및 아르기닌을 갖고, NaMN 아미드화 효소(서열번호 3 내지 18, 및 도 5)를 인코딩하는 것으로 추측되었다.
실시예 2
에시리키어 콜라이에서 NaMN 아미드화 활성( NadE *)의 발현을 위한 유전자 구축
에측된 nadE * 개방형 판독틀을 인코딩하는 10개의 서열(서열번호 2, 및 19 내지 27)을 계통적 거리 최대화(도 6)를 기준으로 하여 16개의 예측된 nadE * 유전자 세트 중에서 선택하고 지네이우스 코돈 최적화 알고리즘을 사용하여 에시리키어 콜라이 k-12 코돈 사용빈도 표를 사용하고 임계값이 0.4에서 희귀 세트(rare set)가 되도록 하여 에시리키어 콜라이에서의 발현에 대하여 코돈 최적화하였다. 최적화된 서열(서열번호 28 내지 37)을 겐스크립트 인코포레이티드(GenScript, Inc.)에 의해 신규 합성하고 XhoI / NdeI 절단된(digested) pET24a(+)(노바겐 인코포레이티드(Novagen, Inc.))로 또한 진스크립트에 의해 클로닝하여 하기 표 1의 플라스미드를 수득하였다. 플라스미드를 BL21(DE3)로 형질 전환하고 NR 합성을 유도하기 위해 IPTG 유도를 허용하여 균주 ME407, ME644, ME645, ME646, ME647, ME648, ME649, ME650, ME651, ME652를 수득하였다(표 2).
본 연구에 사용된 플라스미드
플라스미드 설명
pET24Ft SEQ ID No. 37 ( FtNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24Dn SEQ ID No. 29 (DnNadE*)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24As SEQ ID No. 30 (AsNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24Fph SEQ ID No. 31 (FphNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24Fn SEQ ID No. 32 (FnNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24FspT SEQ ID No. 33 (FspTNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24FspF SEQ ID No. 34 (FspFNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24Fg SEQ ID No. 35 (FgNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24Fpe SEQ ID No. 36 (FpeNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24Mn SEQ ID No. 28 (MnNadE *)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET24Ft-TGV SEQ ID No. 42 (FtNadE *-TGV)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pETMn-TGV SEQ ID No. 43 (MnNadE *-TGV)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pETFn-TGV SEQ ID No. 44 (FnNadE *-TGV)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pETFspT-TGV SEQ ID No. 45 (FspTNadE *-TGV)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pET-EcNadE SEQ ID No. 46 (EcNadE)(pET24a(+)에 클로닝됨)
pBS-FnNadE SEQ ID No. 38 (pUC57에 클로닝됨)
pBS-FtNadE SEQ ID No. 40 (pUC57에 클로닝됨)
pBS-FspNadE SEQ ID No. 41 (pUC57에 클로닝됨)
pBS-MnNadE SEQ ID No. 39 (pUC57에 클로닝됨)
MB4124-FnNadE SEQ ID No. 47 (MB4124에 클로닝됨)
도 6에서의 서열의 색인표(look up table)
도 6 서열 식별자 서열번호
DQ682092.1 번역 4
CP010115.1 번역 5
CP003932.1 번역 3
CP009607.1 번역 8
CP009353.1 번역 9
CP002558.1 번역 7
CP013022.1 번역 6
CP010427.1 번역 15
CP009574.1 번역 1
CP000513.1 번역 17
AE016827.1 번역 18
CP000746.1 번역 16
CP002872.1 번역 14
CP003402.1 번역 11
CP009440.1 번역 10
CP000937.1 번역 12
CP009442.1 번역 13
본 연구에 사용되거나 기술된 균주
균주 종 Genotype
BL21(DE3) 에시리키어 콜라이 fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdS
λ DE3 = λ sBamHIo Δ EcoRI -B int::(lacI::PlacUV5::T7　gene1) i21 Δ nin5
ME407 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24Ft
ME409 에시리키어 콜라이 BL21(DE3)
ME644 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24Dn
ME645 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24As
ME646 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pETFph
ME647 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24 Fn
ME648 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24FspT
ME649 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24FspF
ME650 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24Fg
ME651 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24Fpe
ME652 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24Mn
ME708 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pETFn-rev
ME710 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pETFspT-rev
ME712 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pET24Ft-rev
ME714 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pETMn-rev
ME683 에시리키어 콜라이 BL21(DE3) pETEcNadE
BS168 바실러스 서브틸리스 Wildtype strain
BS6209 바실러스 서브틸리스 BS168 nadR ::spec
ME479 바실러스 서브틸리스 BS168 deoD :: tet
ME492 바실러스 서브틸리스 BS168 pupG ::neo
ME496 바실러스 서브틸리스 BS168 nadR ::spec deoD :: tet
ME517 바실러스 서브틸리스 BS168 nadR ::spec deoD :: tet pupG ::neo
ME795 바실러스 서브틸리스 ME517 amyE ::cat pVeg - MsNadE *
ME805 바실러스 서브틸리스 ME517 amyE ::cat pVeg - rbs4 - FnNadE *
ME820 바실러스 서브틸리스 ME517 amyE ::cat pVeg - FspNadE *
ME824 바실러스 서브틸리스 ME517 amyE ::cat pVeg - rbs4 - FtNadE *
ATCC13032 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 균주
ME763 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 MB4124-FnNadE
본원에 기술된 모든 기본적인 분자생물학 및 DNA 조작 절차를 문헌[Sambrook et al.] 또는 문헌[Ausubel et al.](문헌[J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York]; 및 문헌[F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl (eds.). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York] 참고)에 따라 일반적으로 수행하였다.
실시예 3
NadE* 효소를 발현하는 에시리키어 콜라이 균주의 특성규명
NadE* 발현의 NR 생산에 대한 효과를 시험하기 위해, 에시리키어 콜라이 균주를 단일 콜로니로부터 LB 배지로 접종하고 밤새 배양하였다(2 mL, 37°C, 15 mL 시험관, 250 rpm, 50 ug/mL 카나마이신(kanamycin)). 예비-배양물(200 ㎕)을 사용하여 2 mL M9nC 배지에 25 μM IPTG로 접종하거나 접종하지 않고, 에어포어(AirPore) 테이프 시트(키아겐(Qiagen))로 밀봉된 24 웰 깊은 웰-플레이트(왓맨 유니플레이트(Whatman Uniplate), 10 mL, 둥근 바닥)에서 3일 동안 배양하였다. 샘플을 본원에 기술되어 있는 바와 같이 LC-MS에 의해 분석하였다. 플라스미드 없이는, NR 생산이 25 μM IPTG에 의한 유도의 존재 및 부재하에서의 정량 한계치 이하였다. NadE* 효소의 발현에 대한 플라스미드를 보유하는 균주는 유도시 2.7 mg/L까지 NR을 생산하였다.
IPTG 유도시 에시리키어 콜라이 진탕 플레이트 배양물에서의 니코틴아미드 리보시드 농도(mg/L)(2개의 배양물의 평균)
균주 효소 IPTG 부재 25 uM IPTG
ME407 FtNadE* <LOQ 0.11
ME409 부재 <LOQ <LOQ
ME644 DnNadE* <LOQ 0.28
ME645 AsNadE* 0.08 0.31
ME646 FphNadE* 0.02 <LOQ
ME647 FnNadE* <LOQ 1.91
ME648 FspTNadE* 0.03 1.29
ME649 FspFNadE* <LOQ 0.82
ME650 FgNadE* <LOQ 0.64
ME651 FpeNadE* 0.14 1.09
ME652 MnNadE* 0.1 2.73
실시예 4
에시리키어 콜라이에서의 증가된 NR 생산에는 Y27, Q133 및 R236을 갖는 NadE*를 필요하다.
NR 생산에 대한 YQR 모티프의 중요성을 입증하기 위해, 에시리키어 콜라이에 최적화된 4개의 NadE* 서열을 변형하여 프란시셀라 툴라렌시스 Y27, Q133 및 R236 잔기에 대하여 정렬된 잔기를 제거하고 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) NadE에 대하여 코딩된 아미노산 잔기(T, G 및 V 각각; 서열번호 42 내지 45)로 대체하였다. 상응하는 pET24a(+) 플라스미드의 위치에 의해 유도된 돌연변이 생성을 진스크립트 인코포레이티드에 의해 수행하여 표 1의 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드를 BL21(DE3)으로 형질전화하고 nadE -TGV 유전자를 도입하여 균주 ME708, ME710, ME712 및 ME714(Table 2)를 수득하였다. NadE-TGV를 상기 균주는 NR 생산에 있어서 NadE*를 갖는 균주와 유사한 IPTG 의존성 증가를 나타내는데에 실패하였다(표 4).
IPTG 도입시, 에시리키어 콜라이 진탕 플레이트 배양물에서의 니코틴아미드 리보시드 농도(mg/L)
균주 효소 IPTG 부재 50 uM IPTG
BL21(DE3) 부재 <LOQ <LOQ
BL21(DE3) 부재 <LOQ <LOQ
ME683 EcNadE <LOQ <LOQ
ME683 EcNadE <LOQ 0.01
ME647 FnNadE* 0.04 0.92
ME647 FnNadE* 0.02 0.75
ME708 FnNadE-TGV <LOQ 0.05
ME708 FnNadE-TGV <LOQ 0.07
ME648 FspTNadE* <LOQ 0.09
ME648 FspTNadE* <LOQ 0.16
ME710 FspTNadE-TGV 0.01 0.01
ME710 FspTNadE-TGV 0.02 0.01
ME407 FtNadE* <LOQ 0.1
ME407 FtNadE* 0.02 0.12
ME714 FtNadE-TGV 0.01 <LOQ
ME714 FtNadE-TGV <LOQ <LOQ
ME652 MsNadE* 0.07 1.11
ME652 MsNadE* <LOQ 0.96
ME712 MsNadE-TGV <LOQ 0.1
ME712 MsNadE-TGV <LOQ <LOQ
실시예 5
에시리키어 콜라이 NadE의 과발현은 NR 생산을 관찰하기에 불충분하다.
높은 수준의 NaAD 아미드화 활성(NadE)가 증가된 NR 축적을 생성하기에 불충분함을 입증하기 위해, 야생형 nadE 개방형 해독틀(서열번호 46)을 프라이머 MO11159 및 MO11160(이는 XhoI / NdeI 제한 위치에 시작 코돈 및 정지 코돈을 각각 추가함)을 갖는 Bl21(DE3)의 게놈으로부터 PCR을 통해 증폭하였다(표 5). PCR 단편을 유사하게 절단된 pET24a(+)에 결찰하여 플라스미드 pET24b+nadEBL21을 수득하였다. 상기 플라스미드를 BL21(DE3)로 형질 전환함으로써, nadE를 IPTG 유도하여 균주 ME683을 수득하였다. NadE* 서열을 발현하는 균주와 함께 NR 생산에 대하여 시험될 때, 에시리키어 콜라이 NadE의 추가적인 발현을 갖는 균주는 NR 농도에 있어서 IPTG 의존성 증가를 나타내는데에 실패하였다(표 4).
프라이머 명칭 서열(5' - 3') 용도
10444 pDG1662_Pveg-I_pdxP
카피 추출(역방향)		 CGGTAAGTCCCGTCTAGCCT 모든 3'측방향의 증폭
10447 amyE::nadEstar 5'(역위됨)(정방향) ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCT 모든 5'측방향의 증폭
11222 amyE-FnNadE 3' 정방향 TTACACCGAATTTCTAATAATAACCGGGCAGGCCATG
11223 amyE-FnNadE 3' 역방향 GGCCTGCCCGGTTATTATTAGAAATTCGGTGTAAGAG
11226 amyE-FspNadE 3' 정방향 CTTTTACACCGAATTTTTAATAATAACCGGGCAGGCCATG
11227 amyE-FspNadE 3' 역방향 GGCCTGCCCGGTTATTATTAAAAATTCGGTGTAAAAG
11230 amyE-MsNadE 3' 정방향 CGGATGAAGCGGAATGTTAATAATAACCGGGCAGGCCATG
11231 amyE-MsNadE 3' 역방향 GGCCTGCCCGGTTATTATTAACATTCCGCTTCATCCG MsNadE g블럭의 증폭
11232 PvegI MsNadE 5' amyE 정방향 GAAAGGTGGTGAACTACTATGAAAACAGCAGCATACGC MsNadE g블럭의 증폭
11233 PvegI MsNadE 5' amyE 역방향 GCGTATGCTGCTGTTTTCATAGTAGTTCACCACCTTTCTC MsNadE 5' 측면의 증폭
11234 amyE-FtNadE 3' 정방향 CACTTACACCGAACTTCTAATAATAACCGGGCAGGCCATG
11235 amyE-FtNadE 3' 역방향 GGCCTGCCCGGTTATTATTAGAAGTTCGGTGTAAGTG
11341 rbs4 FnNadE 역방향 AAGGGAGGTTTCATATGAAAATTGTTAAAGATT
11342 rbs4 FnNadE 정방향 TTTAACAATTTTCATATGAAACCTCCCTTAATTCTCG
11351 pVegI-FspNadE 역방향 GTGAACTACTATGAAAATTGTAAAAAACTTTATTG
11352 pVegI-FspNadE 정방향 TTACAATTTTCATAGTAGTTCACCACCTTTCTCTA
11353 rbs4 FtNadE 역방향 AAGGGAGGTTTCATATGAAAATCGTTAAAGACTTC
11354 rbs4 FtNadE 정방향 TAACGATTTTCATATGAAACCTCCCTTAATTCTCG
11159 XhoI-3' NadE BL21 GCTACTTACTCTCGAGTTACTTTTTCCAGAAATCAT EcNadE의 증폭
11160 NdeI 5'-NadE-BL21 GCTAACTTAGCATATGATGACATTGCAACAACA EcNadE의 증폭
실시예 6
증가된 기저 수준의 NR 축적을 갖는 바실러스 서브틸리스 균주 구축
보다 높은 수준의 생성물 축적과 연관하여, NR 축적에 있어서 NadE*의 효능을 입증하기 위해, 숙주 균주를 증가된 기저 수준의 NR 축적에 대하여 조작하였다. 에시리키어 콜라이 균주 DH5α, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032 및 바실러스 서브틸리스 균주 168을 밤새 풍부한 배지(에시리키어 콜라이에 대하여 LB, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 바실러스 서브틸리스에 대하여 BHI)에서 배양하고 2 mL M9nC 배지에 1:10 접종하였다. 24시간 후, 배양물을 MS에 대하여 샘플링하고 상대적인 NR 수준을 시험하였다. 바실러스 서브틸리스 NR 생산은 에시리키어 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰보다 높았고, 이를 추가적인 조작을 위한 숙주로서 선택하였다.
nadR, deoD 및 pupG 정밀 삭제를 위한 카세트를 장-측방향 PCR(long flanking PCR(LF-PCR))에 의해 구축하였다. 각각의 유전자에 대한 측방향 영역을 적절한 항생제 내성 유전자(각각 스펙티노마이신, 테트라사이클린 및 네오마이신; 서열번호 48 내지 50)의 5' 또는 3' 영역에 동형인 서열이 PCR 생성물(퓨전 핫 스타트 플렉스 DNA 중합효소(Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase)), 프라이머 각각 200 nM, 초기 변성 95℃에서 2분, 30 사이클: 95℃에서 30초; 50℃에서 20초; 72℃에서 60초, 72℃에서 최종적으로 유지)에 혼입되도록 설계된 표 5의 프라이머를 사용하여 BS168 게놈 DNA(로슈 고순도 PCR 주형 표본 키트(Roche High Pure PCR template preparation kit))의 증폭에 의해 수득하였다. 항생제 내성 유전자를 프라이머를 사용하여 유사하게 증폭하여 5' 및 3' 측방향 영역에 동형인 서열을 혼입하였다. PCR 생성물을 겔 정제(gel purification)하고 적절한 프라이머(표5)를 사용하여 LF-PCR에 사용하였다(퓨전 핫 스타트 플렉스 DNA 중합효소, 프라이머 각각 200 nM, 초기 변성 98℃에서 30초, 35 사이클: 98℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 360초). LF-PCR 생성물을 정제하고 바실러스 서브틸리스 균주의 형질 전환에 사용하였다.
BS168을 LF-PCR 생성물에 의해 자연적 형질 전환(문헌["Molecular Biological Methods for Bacillus". 1990. Edited by C.R Harwood and S.M.Cutting. John Wiley and Sons] 참고)를 통해 형질 전환하여 BS6209(nadR::spe), ME479(deoD :: tet) 및 ME492(pupG ::neo)을 수득하였다. ME492로부터의 게놈 DNA(상기와 같이 제조됨)를 BS6209을 형질 전환에 사용하여 ME496(nadR::spe pupG ::neo)을 수득하였다. ME479로부터의 게놈 DNA(상기와 같이 제조됨)를 ME496을 형질 전환에 사용하여 ME517(nadR :: spe pupG ::neo deoD :: tet)을 수득하였다.
실시예 7
NadE*을 발현하는 바실러스 서브틸리스 균주의 구축 및 특성규명
NadE* 활성을 인코딩하는 4개의 서열을 바실러스 서브틸리스에서의 발현에 대해 코돈 최적화하고(지네이우스 코돈 최적화 알고리즘 바실러스 서브틸리스 168 코돈 용법 표, 0.4에서 희귀 세트가 되는 임계값), 최적화된 서열(서열번호 38 내지 41)을 IDT에 의해 g블럭으로서 합성하였다. 최적화된 NadE* 서열의 발현을 위한 카세트를 LF-PCR에 의해 생성하였다. amyE 5' 영역을 함유하는 측방향 영역, cat(클로르암페니콜 내성(chloramphenicol resistance)), pVegI 촉진자 및 amyE 3' 영역을 함유하는 측방향 영역을 적절한 프라이머(표 5) 및 pDG1662(바실러스 유전자 보관 센터(Bacillus Genetic Stock Center)), 및 주형인 g블럭을 사용하여 상기와 같이 증폭하였다. 측방향 영역을 겔 정제하고, g블럭(상기)을 LF-PCR에 상기와 같이 사용하여고, 생성물을 겔 정제하였다.
ME517을 상기와 같이 정제된 DNA에 의해 형질 전환하고, 형질 전환체를 콜로니 정제하여 균주 ME795(MsNadE*), ME805(FnNadE*), ME820(FspNadE*) 및 ME824(FtNadE*)를 수득하였다. 24 웰 진탕 플레이트에, 상기 균주를 사용하여 BHI 배지의 1 mL 배양물을 2배수 접종하고, ME517을 4배수 접종하고 37℃에서 밤새(상기와 같이) 인큐베이팅하였다. 17시간 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 버리고, 펠릿(pellet)을 2 mL M9nC 배지 중에 재현탁하였다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 위치시키고 추가적으로 24시간 동안 배양하였다. NR을 측정하였고, NadE* 과발현 구조물을 보유하는 균주는 부모 균주보다 평균적으로 72 내지 133% 더 많은 NR을 생산하였다(표 6).
바실러스 서브틸리스 진탕 플레이트 배양물에서의 니코틴아미드 리보시드 농도
균주 효소 NR(mg/L)
ME517 부재 53.2
ME517 부재 42.2
ME517 부재 38.8
ME517 부재 37.6
ME795 MsNadE* 72.3
ME795 MsNadE* 75.5
ME814 FnNadE* 102.9
ME814 FnNadE* 98.0
ME820 FspNadE* 99.1
ME820 FspNadE* 94.8
ME824 FtNadE* 76.8
ME824 FtNadE* 79.9
실시예 8
NadE *을 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 구축 및 특성규명
세균에서의 NR의 생산을 위한 상기 서열의 일반적인 이용성을 추가로 입증하기 위해, FnNadE*을 인코딩하는 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 발현에 대하여 코돈 최적화하고(지네이우스 코돈 최적화 알고리즘 코리네 박테리움 글루타미쿰 168 코돈 용법 표, 0.4에서 희귀 세트가 되는 임계값), 최적화된 서열(서열번호 47)을 EcoRI 제한 부위를 인코딩하는 개방형 해독틀의 추가적인 서열 업스트림, 코리네박테리움 글루타미쿰 공통 RBS, 및 SmaI 제한 부위를 인코딩하는 추가적인 서열 다운스트림을 사용하여 IDT에 의해 g블럭으로서 합성하였다. 상기 g블럭을 EcoRI/SmaI에 의해 절단하여 760 bp의 단편을 수득하고, 이를 유사하게 절단된 MB4124에 결찰하여 플라스미드 MB4124-FnNadE*를 수득하였다. MB4094(미국 특허 출원 60/692,037에 기술되어 있음)를 pTrc99a(문헌[Gene. 1988 Sep 30;69(2):301-15] 참고)로부터의 IPTG 유도가능 촉진자와 조합함으로써, MB4124를 잠재성 코리네박테리움 글루타미쿰 저-카피(low-copy) pBLl 플라스미드(문헌[Santamaria et al. J. Gen. Microbiol, 130:2237-2246, 1984] 참고)로부터 유도하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032를 FnNadE*의 IPTG 유도가능 발현을 위한 플라스미드를 사용하여 형질 전환하였다(문헌[Follettie, M.T., et al. J. Bacteriol. 167:695-702, 1993] 참고).
단일 콜로니를 2 mL VY 배지(적절한 경우에 + 50 ㎍/mL 카나마이신)에 접종하고 30℃에서 밤새 교반하였다. 200 ㎕의 상기 배양물을 사용하여 2% 글루코스를 갖는 2 mL의 AZ 배지(적절한 경우에 + 10 ㎍/mL 카나마이신)에 IPTG의 수준을 다르게하여 접종하였다. NR을 측정하였고, FnNadE* 과발현 구조물을 보유하는 균주는 NR 생산에 있어서 IPTG 의존성의 증가를 나타냈다(표 7).
균주 0 mM IPTG 0.25 mM IPTG
ATCC13032 0.02 0.03
ME763 0.03 0.16
ME763 0.01 0.11
실시예 9
생산 배양물에서의 니코틴아미드 리보시드 검출
NR을 액체 크로마토그래피/질량 스펙트럼분석(LCMS)에 의해 분석하였다. 배양 후, 100 ㎕를 96 웰 깊은 웰 플레이트 내에서 900 ㎕ MS 희석액(10% 물 10 mM 암모늄 아세테이트, pH 9.0, 90% 아세토니트릴) 중에 희석하였다. 플레이트를 원심분리(10분, 3000 rpm)하고, 상청액을 특징화를 위한 신규 플레이트로 옮겼다. 상청액을 5 ㎕ 분획으로 HILIC UPLC 컬럼(워터스 BEH 아미드, 2.1x75 mm P/N 1860005657)로 주입하였다. 1분의 억류 후, 화합물을 400 ㎕ 분-1의 유동 속도로 99.9%(10 mM 암모늄 아세테이트, pH 9.0, 95% 아세토니트릴/5% 물) 이동상 D로부터 70%(10 mM 암모늄 아세테이트, pH 9.0, 50/50 아세토니트릴/물) 이동상 C로의 선형 구배를 사용하여 12분에 걸쳐 용리시킨 후, 이동상 C에서 1분 동안 억류하고, 5분 동안 이동상 D에서 다시 평형에 도달하도록 하였다(표 8). 용리하는 화합물을 양성 전자분사 이온화를 사용하여 3중 4극자 질량 스펙트럼계에 의해 검출하였다. 기기를 MRM 모드에서 가동하였고, NR을 전이 m/z 123 > 80를 사용하여 검출하였다. NR을 동일한 조건하에 주입된 표준(크로마덱스(Chromadex))과 비교하여 정량화하였다.
NR의 LCMS 정량화에 대한 구배 계획
시간 유동
(mL/분)		 % A % B % C % D 곡률
초기 0.400 -0.0 0.0 0.1 99.9 초기
1.00 0.400 -0.0 0.0 0.1 99.9 6
12.00 0.400 0.0 0.0 70.0 30.0 6
13.00 0.400 0.0 0.0 70.0 30.0 6
13.1 0.400 -0.0 0.0 0.1 99.9 6
18.00 0.400 -0.0 0.0 0.1 99.9 6
실시예 10
세균 증식 및 생산 분석에 사용된 매질
25 g 주입용 송아지 육수(veal infusion broth)(디프코(Difco)) 및 5 g 백토 효모 추출물(Bacto yeast extract)(디프코)을 함유하는 VY 배지 1 L.
50 g 글루코스, 6 g Na2HPO4, 3 g KH-2-PO4, 0.5 g NaCl, 1 g NH4Cl, 2 mM MgSO4, 15 mg Na2EDTA, 4.5 mg ZnSO4*7H2O, 0.3 mg CoCl2*6H2O, 1 mg MnCl2*4H2O, 4.5 mg CaCl2*2H2O, 0.4 mg Na2MoO4*2H2O, 1 mg H3BO3 및 0.1 mg KI를 함유하는 M9nC 배지 1 L.
20 g 글루코스, 2 g NaCl, 3 g 나트륨시트레이트, 0.1 g CaCl2*2H2O, 4 g K2HPO4, 2 g KH2PO4, 7.5 g NH4SO4, 3.75 g 우레아, 0.5 g MgSO4*7H2O, 450 μg 티아민, 450 μg 비오틴, 4 mg 판토테네이트, 15 mg Na2EDTA, 4.5 mg ZnSO4*7H2O, 0.3 mg CoCl2*6H2O, 1 mg MnCl2*4H2O, 4.5 mg CaCl2*2H2O, 0.4 mg Na2MoO4*2H2O, 1 mg H3BO3 및 0.1 mg KI를 함유하는 AZ 배지 1 L.
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP ASSETS B.V. <120> MICROBIAL PRODUCTION OF NICOTINAMIDE RIBOSIDE <130> 31313-WO-PCT <140> PCT/US2016/061905 <141> 2016-11-14 <150> US 62/254,736 <151> 2015-11-13 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella tularensis <400> 1 Met Lys Ile Val Lys Asp Phe Ser Pro Lys Glu Tyr Ser Gln Lys Leu 1 5 10 15 Val Asn Trp Leu Ser Asp Ser Cys Met Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Leu Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Asp 50 55 60 Asn Asn Gln His Gln Asp Met Gln Asp Ala Leu Glu Leu Ile Glu Met 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu His Tyr Thr Ile Ser Ile Gln Pro Ala Tyr Glu Ala 85 90 95 Phe Leu Ala Ser Thr Gln Ser Phe Thr Asn Leu Gln Asn Asn Arg Gln 100 105 110 Leu Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Tyr Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Asp Val Pro Lys Asn Ile Leu Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Gln Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Leu Ala Leu Thr Pro Asn Phe 245 <210> 2 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella tularensis <400> 2 atgaaaatag ttaaagattt tagtcctaaa gaatattcac aaaagttagt taattggcta 60 agtgatagtt gtatgaatta tcctgctgaa ggatttgtga ttggtcttag tggcggtata 120 gattcagcag ttgcggcttc tttagctgtc aaaactggat taccaactac agctttaata 180 ctaccttcag ataataatca acaccaagat atgcaagatg ctctagagct tattgaaatg 240 cttaatattg aacattatac catttcgatt caaccagctt atgaggcttt tcttgcttca 300 acgcaaagct ttacaaatct acaaaacaat agacaacttg tgatcaaggg aaatgctcaa 360 gcacgtttaa ggatgatgta tttgtatgcc tatgcgcaac aatataacag aatagttata 420 ggtactgata atgcttgtga gtggtatatg ggatatttta caaaattcgg tgatggggct 480 gccgatatac ttccactagt taatctcaaa aaatctcaag tttttgaatt aggcaaatac 540 ctagatgtcc ctaaaaacat acttgataaa gctccatctg caggactatg gcaaggacaa 600 actgatgagg atgaaatggg tgtaacttat caagaaattg atgatttctt agatggtaaa 660 caagtttcag caaaagctct agaaagaata aatttctggc ataatcgtag tcaccataag 720 agaaaattag ctttaactcc taatttctag 750 <210> 3 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella sp. FSC1006 <400> 3 Met Ser Val Val Lys Asn Phe Lys Pro Asn Glu Tyr Ala Asn Lys Ile 1 5 10 15 Thr Glu Trp Leu Lys Asp Ser Cys Leu Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Val Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Val Ser Leu 35 40 45 Ala Val Asn Thr Gly Leu Pro Val Thr Gly Leu Ile Met Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Asp Asp Lys Asp Thr Leu Asp Ala Ile Glu Leu Ala Lys Lys 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu Tyr His Leu Ile Pro Ile Gln Pro Val Tyr Glu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Ser Ala Glu Asp Ile Lys Asn Ser Ala Asn Asp Arg Gln 100 105 110 His Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Phe Arg Met Ile Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Asn Arg Met Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Ile Lys Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Ser Tyr Leu Asn Val Pro Asn Asn Ile Leu Thr Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Leu Gly Gln Thr Asp Glu Ala Glu Met Gly Val 195 200 205 Ser Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys His Val Ser Asp 210 215 220 Tyr Ala Leu Asn Gln Ile Lys Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Ile Met Ala Lys Ala Pro Asp Phe 245 <210> 4 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella guangzhouensis strain 08HL01032 <400> 4 Met Asn Val Val Lys Asn Phe Thr Pro Glu Lys Tyr Ser Glu Lys Leu 1 5 10 15 Ile Gln Trp Leu Thr Asn Ser Cys Ile Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Val Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Cys Ala Ser Leu 35 40 45 Leu Ser Lys Thr Asp Leu Pro Thr Thr Ala Phe Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Ser Asp Gln Asp Met Ile Asp Ala Leu Glu Leu Ile Asn Lys 65 70 75 80 Leu Asn Ile Pro Tyr His Ile Ile Pro Ile Gln Pro Val Tyr Glu Ser 85 90 95 Phe Leu Lys Ser Thr Gln Leu Phe Thr Asn Pro Gln Asn Asp Arg Gln 100 105 110 Asn Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Phe Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Asn Arg Ile Val Val Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Ile Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Asp Val Pro Arg Asn Ile Leu Thr Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Gly Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asn Phe Leu Asp Gly Lys Glu Val Ser Pro 210 215 220 Ala Thr Phe Glu Lys Ile Ser Tyr Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Met Ala Leu Thr Pro Asp Phe 245 <210> 5 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella sp. TX077308 <400> 5 Met Lys Ile Val Lys Asn Phe Ile Val Glu Gln Tyr Ser Asn Asn Leu 1 5 10 15 Ile Lys Trp Leu Lys Glu Asn Cys Ile Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Gln Asp Gln Asp Met Arg Asp Gly Ile Glu Leu Ile Glu Asn 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu Tyr His Thr Val Ser Ile Gln Pro Ala Tyr Asp Thr 85 90 95 Phe Ile Glu Ser Thr Phe Asn Phe Thr Asn Ser Gln Asn Asp Arg Gln 100 105 110 His Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Ile Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Lys Val Pro Lys Asn Ile Ile Gln Lys Asp Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Lys Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Glu Val Ser Glu 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Ser Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Ser Met Ala Phe Thr Pro Asn Phe 245 <210> 6 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella philomiragia subsp. philomiragia ATCC 25017 <400> 6 Met Lys Ile Ile Lys Asn Phe Ile Ala Glu Glu Tyr Ser Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Glu Trp Leu Lys Lys Ile Cys Ile Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Gln Asp Gln Asp Met Lys Asp Gly Leu Glu Leu Ile Lys Asn 65 70 75 80 Leu Asp Ile Glu His His Ile Val Pro Ile Gln Pro Ala Tyr Asp Thr 85 90 95 Phe Ile Glu Ser Thr Leu Asn Phe Thr Asn Ser Gln Asn Asp Arg Gln 100 105 110 His Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Met Gly Lys Tyr Leu Lys Val Pro Gln Asn Ile Ile Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asn Phe Leu Asp Gly Lys Glu Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Ser Met Ala Phe Thr Pro Asn Phe 245 <210> 7 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella philomiragia strain O#319-036 [FSC 153 <400> 7 Met Lys Ile Ile Lys Asn Phe Ile Ala Glu Glu Tyr Ser Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Glu Trp Leu Lys Lys Ile Cys Ile Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Gln Asp Gln Asp Met Lys Asp Gly Leu Glu Leu Ile Lys Asn 65 70 75 80 Leu Asp Ile Glu His His Ile Val Pro Ile Gln Pro Ala Tyr Asp Thr 85 90 95 Phe Ile Glu Ser Thr Leu Asn Phe Thr Asn Ser Gln Asn Asp Arg Gln 100 105 110 His Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Met Gly Glu Tyr Leu Lys Val Pro Gln Asn Ile Ile Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asn Phe Leu Asp Gly Lys Glu Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Ser Met Ala Phe Thr Pro Asn Phe 245 <210> 8 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella noatunensis subsp. orientalis str. Toba 04 <400> 8 Met Lys Ile Ile Lys Asn Phe Ile Ala Lys Glu Tyr Ser Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Glu Trp Leu Lys Lys Ile Cys Ile Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Gln Asp Gln Asp Met Lys Asp Gly Leu Glu Leu Ile Lys Asn 65 70 75 80 Leu Asp Ile Glu His His Ile Val Pro Ile Gln Pro Ala Tyr Asp Thr 85 90 95 Phe Ile Glu Ser Thr Phe Asn Phe Thr Asn Ala Gln Asn Asn Arg Gln 100 105 110 His Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Lys Val Pro Gln Asn Ile Ile Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Ser Tyr Lys Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Glu Val Ser Glu 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Ser Ile Ala Phe Thr Pro Asp Phe 245 <210> 9 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella philomiragia strain GA01-2794 <400> 9 Met Lys Ile Ile Lys Asn Phe Ile Val Glu Lys Tyr Ser Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Glu Trp Leu Lys Lys Ile Cys Ile Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Gln Asp Gln Asp Met Lys Asp Gly Leu Glu Leu Ile Lys Asn 65 70 75 80 Leu Asp Ile Glu His His Ile Val Pro Ile Gln Pro Ala Tyr Asp Thr 85 90 95 Phe Ile Glu Ser Thr Phe Asn Phe Thr Asn Ala Gln Asn Asn Arg Gln 100 105 110 His Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Lys Val Pro Gln Asn Ile Ile Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Ser Tyr Lys Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Glu Val Ser Glu 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Ser Ile Ala Phe Thr Pro Asp Phe 245 <210> 10 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella persica ATCC VR-331 <400> 10 Met Lys Ile Val Lys Asp Phe Asn Ile Lys Glu Tyr Ser Gln Lys Leu 1 5 10 15 Ile Asp Trp Leu Ser Asp Thr Cys Met Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Leu Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Ser Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Gln His Gln Asp Ile Gln Asp Ala Leu Glu Leu Ala Asp Lys 65 70 75 80 Ile Asn Ile Glu His His Thr Ile Thr Ile Gln Thr Val Tyr Glu Thr 85 90 95 Phe Leu Ala Ser Ile Lys Lys Ile Thr Asn Thr Glu Arg Asp Arg Gln 100 105 110 Leu Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Tyr Asn Arg Val Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser His Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Gly Val Pro Lys Asn Ile Leu Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Gln Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Leu Ala Leu Ile Pro Asn Phe 245 <210> 11 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella cf. novicida 3523 <400> 11 Met Lys Ile Val Lys Asp Phe Ser Pro Lys Glu Tyr Ser Gln Asn Leu 1 5 10 15 Val Asn Trp Leu Ser Asp Thr Cys Ile Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Lys 50 55 60 Asn Asn Gln His Gln Asp Ile Gln Asp Ala Leu Glu Leu Val Glu Lys 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu His His Ile Val Thr Ile Gln Pro Ala Tyr Glu Asn 85 90 95 Phe Leu Ala Ser Thr Gln Glu Phe Ile Asn Thr Asp Asn Asn Arg Gln 100 105 110 Leu Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Tyr Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ile Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Asp Val Pro Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Gln Ile Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Leu Ala Leu Thr Pro Asn Phe 245 <210> 12 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella tularensis subsp. novicida D9876 <400> 12 Met Lys Ile Val Lys Asp Phe Ser Pro Lys Glu Tyr Ser Gln Lys Leu 1 5 10 15 Val Asn Trp Leu Ser Asp Ser Cys Met Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Leu Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Asp 50 55 60 Asn Asn Gln His Gln Asp Met Gln Asp Ala Leu Asp Leu Ile Glu Met 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu His Tyr Thr Ile Ser Ile Gln Pro Ala Tyr Glu Ala 85 90 95 Phe Leu Ala Ser Thr Gln Arg Phe Thr Asn Leu Gln Asn Asn Arg Gln 100 105 110 Leu Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Tyr Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Asp Val Pro Lys Asn Ile Leu Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Gln Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Leu Ala Leu Thr Pro Asn Phe 245 <210> 13 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella tularensis subsp. novicida F6168 <400> 13 Met Lys Ile Val Lys Asp Phe Ser Pro Lys Glu Tyr Ser Gln Lys Leu 1 5 10 15 Val Asn Trp Leu Ser Asp Ser Cys Met Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Leu Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Ile Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Asp 50 55 60 Asn Asn Gln His Gln Asp Met Gln Asp Ala Leu Asp Leu Ile Glu Met 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu His Tyr Thr Ile Ser Ile Gln Pro Ala Tyr Glu Ala 85 90 95 Phe Leu Ala Ser Thr Gln Ser Phe Thr Asn Leu Gln Asn Asn Arg Gln 100 105 110 Leu Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Tyr Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Asp Val Pro Lys Asn Ile Leu Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Gln Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Leu Ala Leu Thr Pro Asn Phe 245 <210> 14 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella tularensis subsp. tularensis strain NIH B-38 <400> 14 Met Lys Ile Val Lys Asp Phe Ser Pro Lys Glu Tyr Ser Gln Lys Leu 1 5 10 15 Val Asn Trp Leu Ser Asp Ser Cys Met Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Leu Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Asp 50 55 60 Asn Asn Gln His Gln Asp Met Gln Asp Ala Leu Glu Leu Ile Glu Met 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu His Tyr Thr Ile Ser Ile Gln Leu Ala Tyr Glu Ala 85 90 95 Phe Leu Ala Ser Thr Gln Ser Phe Thr Asn Leu Gln Asn Asn Arg Gln 100 105 110 Leu Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Ala Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Tyr Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Asp Val Pro Lys Asn Ile Leu Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Gln Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Ile Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Leu Ala Leu Thr Pro Asn Phe 245 <210> 15 <211> 249 <212> PRT <213> Francisella tularensis subsp. holarctica F92 <400> 15 Met Lys Ile Val Lys Asp Phe Ser Pro Lys Glu Tyr Ser Gln Lys Leu 1 5 10 15 Val Asn Trp Leu Ser Asp Ser Cys Met Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Val Ile Gly Leu Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Ala Val Lys Thr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Leu Ile Leu Pro Ser Asp 50 55 60 Asn Asn Gln His Gln Asp Met Gln Asp Ala Leu Glu Leu Ile Glu Met 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu His Tyr Thr Ile Ser Ile Gln Pro Ala Tyr Glu Ala 85 90 95 Phe Leu Ala Ser Thr Gln Ser Phe Thr Asn Leu Gln Asn Asn Arg Gln 100 105 110 Leu Val Ile Lys Gly Asn Ala Gln Thr Arg Leu Arg Met Met Tyr Leu 115 120 125 Tyr Ala Tyr Ala Gln Gln Tyr Asn Arg Ile Val Ile Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Ala Cys Glu Trp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ile Leu Pro Leu Val Asn Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Lys Tyr Leu Asp Val Pro Lys Asn Ile Leu Asp Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp Glu Asp Glu Met Gly Val 195 200 205 Thr Tyr Gln Glu Ile Asp Asp Phe Leu Asp Gly Lys Gln Val Ser Ala 210 215 220 Lys Ala Leu Glu Arg Ile Asn Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys 225 230 235 240 Arg Lys Leu Ala Leu Thr Pro Asn Phe 245 <210> 16 <211> 239 <212> PRT <213> Dichelobacter nodosus VCS1703A <400> 16 Gln Tyr Ile Asp Tyr Leu Leu Val Trp Leu Glu Glu Gln Arg Ala His 1 5 10 15 Leu Tyr Ala Ser Asp Gly Tyr Thr Leu Gly Val Ser Gly Gly Ile Asp 20 25 30 Ser Ala Val Cys Leu His Leu Leu Ala Lys Thr Gly Lys Pro Val Gln 35 40 45 Ala Leu Val Leu Pro Ile Asn Ala Asn Ala Asn Asp Cys Glu Asp Ala 50 55 60 Glu Leu Val Leu Lys Asn Ala Asn Ile Ser Gly Asn Ile Ile Ala Leu 65 70 75 80 Asp Asp Val Tyr Thr Ala Ala Gln Asn Thr Leu Ala Pro Val Leu Asn 85 90 95 Arg Asp Tyr Glu Arg Met Pro Val Leu Asn Gly Asn Leu Met Ala Arg 100 105 110 Leu Arg Met Val Met Leu Tyr Thr Val Ala Gln Ser His Arg Ser Val 115 120 125 Val Val Gly Thr Asp Asn Ala Val Glu Tyr Tyr Leu Gly Tyr Phe Thr 130 135 140 Lys Phe Gly Asp Gly Ala Cys Asp Ile Leu Pro Leu Ala Lys Leu Thr 145 150 155 160 Lys Ser Glu Val Gly Gln Leu Ala Lys Ala Leu Gly Val Pro Lys Lys 165 170 175 Ile Arg Glu Lys Ala Pro Ser Ala Gly Leu Trp Gln Gly Gln Thr Asp 180 185 190 Glu Asn Glu Ile Gly Val Ser Tyr Ala Asp Leu Asp Ala Phe Leu Cys 195 200 205 Gly Lys Thr Val Asp Asp Ala Val Arg Glu Lys Ile Ala Tyr Trp His 210 215 220 Gln Arg Ser His His Lys Arg Met Leu Pro Pro Met Pro Glu Ile 225 230 235 <210> 17 <211> 245 <212> PRT <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E <400> 17 Lys Arg Met Lys Thr Ala Ala Tyr Ala Asp Tyr Leu Ile Gln Trp Leu 1 5 10 15 Glu Asn Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Gly Met Asp Gly Tyr Thr Leu Gly 20 25 30 Val Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Cys Ala His Leu Ala Ala Arg 35 40 45 Thr Gly Ala Pro Val Gln Ala Leu Ile Leu Pro Ala Glu Val Thr Ser 50 55 60 Pro Ser Asp Val Ala Asp Ala Gln Ala Thr Leu Glu Ser Ala Gly Ile 65 70 75 80 Asp Gly Gln Ile Ile Ser Ile Ala Pro Trp Tyr Asp Leu Ile Met Gln 85 90 95 Gln Leu Ser Pro Val Leu Asn Ser Glu Pro Glu Arg Val Asn Val Leu 100 105 110 Lys Gly Asn Leu Met Ala Arg Leu Arg Met Ile Ala Leu Phe Thr Thr 115 120 125 Ala Gln Ser His Arg Ser Ile Val Leu Gly Thr Asp Asn Ala Ala Glu 130 135 140 Trp Leu Thr Gly Tyr Phe Thr Lys Phe Gly Asp Gly Ala Ala Asp Val 145 150 155 160 Leu Pro Leu Ala Gly Leu Arg Lys Glu Gln Val Phe Glu Leu Gly Arg 165 170 175 Tyr Leu Gly Val Pro Gln Ser Val Leu Asp Lys Lys Pro Ser Ala Gly 180 185 190 Leu Trp Ala Gly Gln Thr Asp Glu Ala Glu Met Gly Val Thr Tyr Ala 195 200 205 Glu Ile Asp Ala Tyr Leu Arg Gly Glu Thr Val Ser Pro Gln Ala Leu 210 215 220 Gln Gln Ile Arg Phe Trp His Asn Arg Ser His His Lys Arg Met Leu 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys 245 <210> 18 <211> 238 <212> PRT <213> Actinobacillus succinogenes 130Z <400> 18 Tyr Val Asp Tyr Leu Val Arg Trp Leu Glu Thr Gln Arg Thr Glu Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Met Asp Gly Tyr Thr Leu Gly Val Ser Gly Gly Ile Asp Ser 20 25 30 Ala Val Cys Ala His Leu Ala Ala Arg Thr Gly Ala Pro Val Gln Ala 35 40 45 Leu Ile Leu Pro Ala Glu Val Thr Ser Pro Glu Asp Val Ala Asp Ala 50 55 60 Gln Ile Thr Leu Glu Ser Ala Gly Ile Asp Gly Arg Ile Ile Ser Ile 65 70 75 80 Ala Pro Trp Tyr Asp Leu Ile Met Leu Gln Leu Thr Pro Ala Leu Asn 85 90 95 Ala Glu Ser Glu Arg Ile Asn Val Leu Lys Gly Asn Leu Met Ala Arg 100 105 110 Leu Arg Met Ile Ala Leu Phe Thr Thr Ala Gln Ser His Arg Ser Ile 115 120 125 Val Leu Gly Thr Asp Asn Ala Ala Glu Met Leu Thr Gly Tyr Phe Thr 130 135 140 Lys Phe Gly Asp Gly Ala Ala Asp Val Leu Pro Leu Ala Arg Leu Arg 145 150 155 160 Lys Glu Gln Val Phe Glu Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Val Pro Lys Ser 165 170 175 Val Leu Glu Lys Lys Pro Ser Ala Gly Leu Trp Ala Gly Gln Thr Asp 180 185 190 Glu Gly Glu Met Gly Val Ser Tyr Ala Glu Ile Asp Ala Tyr Leu Arg 195 200 205 Gly Glu Thr Val Ser Pro Gln Ala Leu Lys Gln Ile Gln Phe Trp His 210 215 220 Asn Arg Ser His His Lys Arg Met Leu Pro Pro Thr Pro Glu 225 230 235 <210> 19 <211> 753 <212> DNA <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E <400> 19 atgaaaacgg cagcatacgc agattattta attcaatggc tggaaaacca acgaaccgaa 60 ctttacggga tggacggcta tacactgggc gtcagcggcg gtattgacag cgccgtctgc 120 gctcatttgg cagcgcgcac cggcgcaccg gtacaagcct taattttgcc cgccgaagta 180 accagtccgt cagatgtggc ggatgcgcaa gccacactgg aaagcgccgg tattgacgga 240 caaataattt ccattgcacc ttggtacgat ttaattatgc aacaactttc cccggtatta 300 aattccgaac cggagcgcgt taacgtatta aagggtaatt taatggcaag actgcgtatg 360 attgcgctgt ttaccacggc acaaagccat cgttctattg tgttaggcac cgataatgcg 420 gcggaatggc tgacgggtta ttttaccaaa ttcggcgacg gcgcagcgga cgtactgcct 480 ttagcgggat tgcgcaaaga gcaggtattt gaactcggac gttatcttgg cgtaccgcaa 540 agcgtgctgg ataaaaaacc gagcgccggt ttatgggcag gacaaacgga cgaagctgaa 600 atgggtgtta cttatgcgga aatcgacgct tatctgcgcg gcgaaaccgt tagcccgcag 660 gcattgcaac aaatccgttt ctggcacaac cgttctcatc acaaacgtat gttgccacct 720 aaaccgaaat cacccgatga agcggagtgt taa 753 <210> 20 <211> 747 <212> DNA <213> Dichelobacter nodosus VCS1703A <400> 20 atgaccgttc atcaatacat cgattattta ctcgtgtggt tagaagagca gcgcgctcat 60 ctttatgcat cagatggtta tacgttgggc gtcagcggcg gcatcgattc cgccgtttgt 120 ctgcatttac tcgccaaaac gggaaaaccc gtgcaagcgt tagttttgcc gatcaatgcg 180 aacgcgaacg attgtgaaga tgccgaatta gtgttaaaaa atgctaatat ttccggcaat 240 attatcgcgc tcgatgatgt ttataccgcc gcacaaaaca ccttggcgcc tgttttaaat 300 cgcgattatg aacgtatgcc cgtattaaac ggcaatttaa tggcgcggct gcgtatggtt 360 atgctttata ccgtggcgca aagtcatcgt tcggtggtcg tgggaacgga taacgcggtg 420 gaatattatt taggttactt tacaaaattt ggcgacggcg cctgcgatat tttgccgctg 480 gcaaaactga caaaatcaga agtaggacaa ttggcaaaag cgttaggcgt tccgaaaaaa 540 atccgagaaa aagcgccgag cgcaggcttg tggcaagggc aaaccgatga aaacgaaatc 600 ggcgtatcgt acgcggattt agatgctttt ttgtgcggta aaaccgttga tgatgccgtc 660 agagaaaaaa ttgcttattg gcatcaacgc tcgcatcata aaagaatgtt gccgccgatg 720 ccggaaatcg gattatcttt ggcgtaa 747 <210> 21 <211> 750 <212> DNA <213> Actinobacillus succinogenes 130Z <400> 21 atgagaacgg cagcatacgt agattattta gtgcgatggc tggaaaccca gcgtaccgaa 60 ttatacggta tggacggcta cacgctgggg gtcagcggcg gtatcgacag tgccgtttgc 120 gcccatttag cggcacgcac cggcgccccc gtacaggcat tgattttacc cgccgaagtc 180 accagccctg aagatgtggc ggatgctcag attaccttgg aaagtgcagg tattgacggg 240 cggattattt ctatcgctcc ttggtacgat ttaattatgc tacaacttac ccccgcatta 300 aatgcggaat ctgaacgcat taacgtattg aaaggtaact taatggcgcg cttacgtatg 360 atcgcattat ttaccacggc gcaaagccac cgttctatcg tattgggtac ggataacgcc 420 gccgaaatgt taacgggcta tttcaccaaa ttcggcgacg gtgcggcgga cgtattgccg 480 ttagcgaggt tgcgcaaaga acaggtattc gaattagggc gttatcttgg cgtaccgaaa 540 tccgtgctgg agaaaaaacc gagtgcgggc ttatgggcgg ggcaaacgga cgagggggaa 600 atgggtgtca gttatgcgga aatcgacgcc tatctgcgcg gcgaaaccgt cagtccgcag 660 gcgttaaagc agattcaatt ctggcacaac cgttctcatc acaaacgtat gctgccgccg 720 acgccagaac cgccggatga aatcgattaa 750 <210> 22 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella philomiragia subsp. philomiragia <400> 22 atgaaaataa taaaaaattt tattgcagaa gagtattcta aaaaattaat agaatggtta 60 aaaaaaattt gtataaacta tcctgcagaa ggttttgtta ttggtattag tggtggcata 120 gattcagcag tagcggcatc tttagcggtt aaaactggat tacctacaac agcactaata 180 ctaccatcaa aaaataatca agatcaagat atgaaagatg gactagagct cattaaaaat 240 cttgatatag aacatcatat tgttccaata caacctgctt atgatacatt tatagagtca 300 actcttaact ttacaaactc acaaaatgac cgccaacatg tcatcaaagg taatgctcaa 360 gctcgtctta ggatgatgta tctatatgcc tatgctcaac aaaataacag aattgtaata 420 ggcacagata atgcctgcga atggtatatg ggttatttca caaaatttgg cgatggtgca 480 gcagatatac taccccttgt taatctaaag aaatcacaag tctttgaaat gggcaagtat 540 ctcaaagtgc cgcaaaatat tatagataaa gctccatctg ctggtctatg gcaaggtcaa 600 actgatgaag atgaaatggg tgtcacatat caagaaattg ataacttttt agatggtaaa 660 gaagtctcag ccaaagctct tgagagaata aacttttggc ataatcgtag tcatcacaaa 720 agatctatgg cttttactcc aaacttttaa 750 <210> 23 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella cf. novicida 3523 <400> 23 atgaaaatag ttaaagattt tagtcctaaa gaatattcac aaaatttagt taattggcta 60 agtgatactt gtataaatta tcctgctgaa ggatttgtaa tcggcattag cggtggtata 120 gattcagctg ttgcagcttc tttagctgtc aaaactggat taccaactac agctttaata 180 ctaccttcaa aaaacaatca acaccaagat atccaagatg ctctagaact tgttgagaaa 240 cttaatattg aacatcatat tgttacaatt caaccagcat acgaaaattt tctagcatca 300 acacaggaat ttataaatac agataataat agacaacttg tgatcaaggg aaatgctcaa 360 gcacgtttaa ggatgatgta tttatatgcc tatgcccaac aatataacag aatagttata 420 ggtactgata atgcttgtga gtggtatatg ggatatttta caaaatttgg tgatggcgct 480 gctgatatat ttccgctaat taatcttaaa aaatcacaag tttttgaatt aggtaaatac 540 ttagatgttc cgaaaaatat aattgataaa gctccgtctg ctggactatg gcaaggacaa 600 actgatgagg atgaaatggg cgtaacttat caagaaattg atgatttctt agatggtaaa 660 caaatttcag caaaagccct agaaagaata aacttctggc ataatcgtag tcatcataag 720 agaaaactag ctttaactcc taatttctaa 750 <210> 24 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella sp. TX077308 <400> 24 atgaaaatag taaaaaactt tattgtagaa cagtattcta ataatttaat aaaatggtta 60 aaagagaatt gcataaaata tcctgctgaa ggttttgtga ttggtattag tggtggtatc 120 gattcggcag tagccgcatc tttagcagtc aaaacaggat tacctacaac tgctctaata 180 ttgccatcga agaacaatca agaccaagat atgcgagatg gaatagaact aatcgaaaat 240 cttaatatag agtatcatac tgtttcaata caacctgctt atgacacgtt tatagagtca 300 acatttaact ttacaaactc acaaaatgat cgccaacatg ttatcaaagg aaatgcccaa 360 gcgcgtctta gaatgatgta tttatatgct tatgctcagc aaaataatag aattgttata 420 ggtacagata acgcatgtga atggtacatg ggatatttca ctaaatttgg tgatggtgca 480 gcagatatat taccacttat taatctcaaa aaatctcaag tttttgaact aggtaaatac 540 ttaaaagtgc caaaaaacat tatccaaaaa gatccttctg ccggtctatg gcaaggtcaa 600 actgatgagg atgaaatggg tgtcacatac aaagaaattg atgacttctt agacggtaaa 660 gaagtctcag aaaaagctct cgaaagaata agcttctggc ataatcgtag tcaccataaa 720 agatccatgg cttttacccc taatttttaa 750 <210> 25 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella sp. FSC1006 <400> 25 atgagtgtag taaaaaattt taaacctaat gaatatgcca ataaaattac tgaatggctg 60 aaagactctt gtttaaatta tcccgctgaa ggttttgtgg taggtattag tggaggtata 120 gattcagcag tagcagtctc tttagcagta aatactggac tacctgttac agggctaata 180 atgccatcaa aaaataatga tgataaagat accttagatg ctatagaatt agctaaaaaa 240 ttaaatatag aatatcatct catacccatt caaccagtat atgaaacatt tctagattca 300 gctgaagata tcaaaaacag tgctaatgac cgtcaacatg taatcaaagg aaatgcacaa 360 gctcgtttta gaatgatata cttgtatgct tacgctcagc aaaataatag aatggtaatt 420 ggtacagata atgcttgtga atggtatatg ggctatttta caaaatttgg agatggagcc 480 gctgatatac tgcctcttat aaaattaaaa aaatcacaag tttttgaatt aggtagctat 540 cttaatgtac ccaataacat cctcacaaaa gctccttccg caggactttg gcttggacaa 600 actgatgaag cagagatggg ggtttcatat caagaaatag atgatttcct tgatggtaaa 660 catgtctcag attatgctct taatcaaata aaattctggc ataaccgtag tcatcataaa 720 agaatcatgg ctaaggctcc agatttttaa 750 <210> 26 <211> 753 <212> DNA <213> Francisella guangzhouensis strain 08HL01032 <400> 26 atgaacgtag taaaaaattt cactcctgaa aaatattcag aaaaacttat acaatggctc 60 actaatagct gtataaaata tcctgcagaa ggtttcgtaa ttggtgtaag tggtggtata 120 gattctgcag tatgtgcatc acttttatcc aaaactgatc ttcctacaac agcttttata 180 ctaccatcaa aaaataactc tgatcaagat atgatcgatg cattagaact tataaataaa 240 ttaaatattc cataccatat aataccaatc cagccagttt atgaaagttt tctaaagtcc 300 acacagctat ttacaaatcc acaaaatgac agacaaaatg tcataaaagg taacgctcaa 360 gctcgtttta gaatgatgta tttatatgct tatgcacaac aaaataatcg tatagtagtt 420 ggaacagata atgcttgtga atggtatatg ggttatttca ccaaatttgg cgatggagct 480 gctgatatac taccattaat aaatcttaaa aagtcccagg tatttgagtt aggtaaatac 540 ttagatgttc caaggaatat cctaactaag gcaccctctg ctggtctttg gcaaggccaa 600 actgatgaag gtgaaatggg agttacttat caggaaatag ataattttct cgacggtaaa 660 gaagtatcgc cagcaacttt tgaaaaaata agctactggc ataatcgctc tcaccacaaa 720 agaaagatgg ctttaacgcc agattttaac taa 753 <210> 27 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella persica ATCC VR-331 <400> 27 atgaaaatag ttaaagattt caacatcaaa gaatattcac aaaagttaat tgattggcta 60 agtgatactt gtatgaatta ccctgctgaa ggatttgtca ttggtcttag cggtggtata 120 gattcggcag ttgcagcttc tttagctgtc aaaactggat tatcaactac agctttaata 180 ttaccatcaa aaaacaatca acaccaagat atacaagatg ctctagaact tgcagataaa 240 attaatattg aacatcatac tattacaatt caaacagtat acgaaacttt tcttgcgtca 300 ataaaaaaaa ttacaaatac cgaacgtgat agacaacttg tcattaaagg aaatgctcaa 360 gctcgtttga ggatgatgta tttatatgcc tatgctcaac aatataatag agtggttatt 420 ggtactgata atgcttgtga atggtatatg ggatatttta caaagtttgg tgatggtgct 480 gctgatattc ttccactagt taatctcaaa aaatctcacg tttttgaatt aggtaaatac 540 ttaggtgttc ctaaaaatat acttgataaa gctccatctg ctgggctatg gcaaggacaa 600 actgatgaag atgaaatggg cgtaacttat caagaaattg atgatttctt agatggtaag 660 caagtttcag cgaaagctct agaaagaata aatttctggc ataatcgtag tcatcataag 720 agaaaactag ctttaattcc taatttctaa 750 <210> 28 <211> 753 <212> DNA <213> Mannheimia succiniciproducens <400> 28 atgaaaacgg cagcatacgc agattatctg attcaatggc tggaaaacca acgcaccgaa 60 ctgtacggca tggacggcta taccctgggc gtcagcggcg gtattgacag cgccgtctgc 120 gctcatctgg cagcgcgcac cggcgcgccg gtacaagccc tgattctgcc ggcggaagta 180 accagtccgt cagatgtggc ggatgcgcaa gccaccctgg aaagcgccgg tattgacggc 240 caaattattt ccattgcacc gtggtacgat ctgattatgc aacaactgtc cccggtactg 300 aatagcgaac cggagcgcgt taacgtactg aaaggtaatc tgatggcacg cctgcgtatg 360 attgcgctgt ttaccacggc acaaagccat cgttctattg tgctgggcac cgataatgcg 420 gcggaatggc tgacgggtta ttttaccaaa ttcggcgacg gcgcagcgga cgtactgccg 480 ctggcgggcc tgcgcaaaga gcaggtattt gaactgggcc gttatctggg cgtaccgcaa 540 agcgtgctgg ataaaaaacc gagcgccggt ctgtgggcag gccaaacgga cgaagctgaa 600 atgggtgtta cctatgcgga aatcgacgct tatctgcgcg gcgaaaccgt tagcccgcag 660 gcactgcaac aaatccgttt ctggcacaac cgttctcatc acaaacgtat gctgccgccg 720 aaaccgaaat caccggatga agcggagtgt taa 753 <210> 29 <211> 747 <212> DNA <213> Dichelobacter nodosus VCS1703A <400> 29 atgaccgttc atcaatacat tgattatctg ctggtgtggc tggaagagca gcgcgctcat 60 ctgtatgcat cagatggtta tacgctgggc gtcagcggcg gcattgattc cgccgtttgt 120 ctgcatctgc tggccaaaac gggcaaacca gtgcaagcgc tggttctgcc gatcaatgcg 180 aacgcgaacg attgtgaaga tgccgaactg gtgctgaaaa atgctaatat ttccggcaat 240 attatcgcgc tggatgatgt ttataccgcc gcacaaaaca ccctggcgcc ggttctgaat 300 cgcgattatg aacgtatgcc ggtactgaac ggcaatctga tggcgcgcct gcgtatggtt 360 atgctgtata ccgtggcgca aagtcatcgt tcggtggtcg tgggcacgga taacgcggtg 420 gaatattatc tgggttactt taccaaattt ggcgacggcg cctgcgatat tctgccgctg 480 gcaaaactga ccaaatcaga agtaggccaa ctggcaaaag cgctgggcgt tccgaaaaaa 540 atccgcgaaa aagcgccgag cgcgggcctg tggcaaggcc aaaccgatga aaacgaaatc 600 ggcgtatcgt acgcggatct ggatgctttt ctgtgcggta aaaccgttga tgatgccgtc 660 cgcgaaaaaa ttgcttattg gcatcaacgc tcgcatcata aacgtatgct gccgccgatg 720 ccggaaatcg gcctgtctct ggcgtaa 747 <210> 30 <211> 750 <212> DNA <213> Actinobacillus succinogenes 130Z <400> 30 atgcgcacgg cagcatacgt agattatctg gtgcgctggc tggaaaccca gcgtaccgaa 60 ctgtacggta tggacggcta cacgctgggc gtcagcggcg gtatcgacag tgccgtttgc 120 gcccatctgg cggcacgcac cggcgccccg gtacaggcac tgattctgcc ggcggaagtc 180 accagcccgg aagatgtggc ggatgctcag attaccctgg aaagtgcagg tattgatggc 240 cgcattattt ctatcgctcc gtggtacgat ctgattatgc tgcaactgac cccggcactg 300 aatgcggaat ctgaacgcat taacgtactg aaaggtaacc tgatggcgcg cctgcgtatg 360 atcgcactgt ttaccacggc gcaaagccac cgttctatcg tactgggtac ggataacgcc 420 gccgaaatgc tgacgggcta tttcaccaaa ttcggcgacg gtgcggcgga cgtactgccg 480 ctggcgcgcc tgcgcaaaga acaggtattc gaactgggcc gttatctggg cgtaccgaaa 540 tccgtgctgg agaaaaaacc gagtgcgggc ctgtgggcgg gccaaacgga cgagggcgaa 600 atgggtgtca gttatgcgga aatcgacgcc tatctgcgcg gcgaaaccgt cagtccgcag 660 gcgctgaaac agattcaatt ctggcacaac cgttctcatc acaaacgtat gctgccgccg 720 acgccggaac cgccggatga aattgattaa 750 <210> 31 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella philomiragia subsp. philomiragia <400> 31 atgaaaatta ttaaaaattt tattgcagaa gagtattcta aaaaactgat tgaatggctg 60 aaaaaaattt gtattaacta tccggcagaa ggttttgtta ttggtattag tggtggcatt 120 gattcagcag tagcggcatc tctggcggtt aaaaccggcc tgccgaccac cgcactgatt 180 ctgccgtcaa aaaataatca agatcaagat atgaaagatg gcctggagct gattaaaaat 240 ctggatattg aacatcatat tgttccgatt caaccggctt atgatacctt tattgagtca 300 accctgaact ttaccaactc acaaaatgac cgccaacatg tcatcaaagg taatgctcaa 360 gctcgtctgc gcatgatgta tctgtatgcc tatgctcaac aaaataaccg cattgtaatt 420 ggcaccgata atgcctgcga atggtatatg ggttatttca ccaaatttgg cgatggtgca 480 gcagatattc tgccgctggt taatctgaaa aaatcacaag tctttgaaat gggcaaatat 540 ctgaaagtgc cgcaaaatat tattgataaa gctccgtctg ctggtctgtg gcaaggtcaa 600 accgatgaag atgaaatggg tgtcacctat caagaaattg ataactttct ggatggtaaa 660 gaagtctcag ccaaagctct ggagcgcatt aacttttggc ataatcgtag tcatcacaaa 720 cgctctatgg cttttacccc gaacttttaa 750 <210> 32 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella cf. novicida 3523 <400> 32 atgaaaattg ttaaagattt tagtccgaaa gaatattcac aaaatctggt taattggctg 60 agtgatacct gtattaatta tccggctgaa ggctttgtaa tcggcattag cggtggtatt 120 gattcagcgg ttgcagcttc tctggctgtc aaaaccggcc tgccgaccac cgctctgatt 180 ctgccgtcaa aaaacaatca acaccaagat attcaagatg ctctggaact ggttgagaaa 240 ctgaatattg aacatcatat tgttaccatt caaccggcat acgaaaattt tctggcatca 300 acccaggaat ttattaatac cgataataat cgccaactgg tgatcaaagg caatgctcaa 360 gcacgtctgc gcatgatgta tctgtatgcc tatgcccaac aatataaccg cattgttatt 420 ggtaccgata atgcttgtga gtggtatatg ggctatttta ccaaatttgg tgatggcgct 480 gctgatattt ttccgctgat taatctgaaa aaatcacaag tttttgaact gggtaaatac 540 ctggatgttc cgaaaaatat tattgataaa gctccgtctg ctggcctgtg gcaaggccaa 600 accgatgagg atgaaatggg cgtaacctat caagaaattg atgatttcct ggatggtaaa 660 caaatttcag caaaagccct ggaacgcatt aacttctggc ataatcgtag tcatcataaa 720 cgcaaactgg ctctgacccc gaatttctaa 750 <210> 33 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella sp. TX077308 <400> 33 atgaaaattg taaaaaactt tattgtagaa cagtattcta ataatctgat taaatggctg 60 aaagagaatt gcattaaata tccggctgaa ggttttgtga ttggtattag tggtggtatt 120 gattcggcag tagccgcatc tctggcagtc aaaaccggcc tgccgaccac cgctctgatt 180 ctgccgtcga aaaacaatca agaccaagat atgcgcgatg gcattgaact gatcgaaaat 240 ctgaatattg agtatcatac cgtttcaatt caaccggctt atgacacgtt tattgagtca 300 acctttaact ttaccaactc acaaaatgat cgccaacatg ttatcaaagg caatgcccaa 360 gcgcgtctgc gcatgatgta tctgtatgct tatgctcagc aaaataatcg cattgttatt 420 ggtaccgata acgcatgtga atggtacatg ggctatttca ccaaatttgg tgatggtgca 480 gcagatattc tgccgctgat taatctgaaa aaatctcaag tttttgaact gggtaaatac 540 ctgaaagtgc cgaaaaacat tatccaaaaa gatccgtctg ccggtctgtg gcaaggtcaa 600 accgatgagg atgaaatggg tgtcacctac aaagaaattg atgacttcct ggacggtaaa 660 gaagtctcag aaaaagctct ggaacgcatt agcttctggc ataatcgtag tcaccataaa 720 cgcagcatgg cttttacccc gaatttttaa 750 <210> 34 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella sp. FSC <400> 34 atgagtgtag taaaaaattt taaaccgaat gaatatgcca ataaaattac cgaatggctg 60 aaagactctt gtctgaatta tccggctgaa ggttttgtgg taggtattag tggcggtatt 120 gattcagcag tagcagtctc tctggcagta aataccggcc tgccggttac cggcctgatt 180 atgccgtcaa aaaataatga tgataaagat accctggatg ctattgaact ggctaaaaaa 240 ctgaatattg aatatcatct gattccgatt cagccggtat atgaaacctt tctggattca 300 gcggaagata ttaaaaacag tgctaatgac cgtcaacatg taatcaaagg caatgcacaa 360 gctcgttttc gcatgattta cctgtatgct tacgctcagc aaaataatcg catggtaatt 420 ggtaccgata atgcttgtga atggtatatg ggctatttta ccaaatttgg cgatggcgcc 480 gctgatattc tgccgctgat taaactgaaa aaatcacaag tttttgaact gggtagctat 540 ctgaatgtac cgaataacat cctgaccaaa gctccgagcg cgggcctgtg gctgggccaa 600 accgatgaag cagagatggg cgtttcatat caagaaattg atgatttcct ggatggtaaa 660 catgtctcag attatgctct gaatcaaatt aaattctggc ataaccgtag tcatcataaa 720 cgcatcatgg ctaaagctcc ggatttttaa 750 <210> 35 <211> 753 <212> DNA <213> Francisella guangzhouensis strain 08HL01032 <400> 35 atgaacgtag taaaaaattt caccccggaa aaatattcag aaaaactgat tcaatggctg 60 accaatagct gtattaaata tccggcagaa ggtttcgtaa ttggtgtaag tggtggtatt 120 gattctgcgg tatgtgcatc actgctgtcc aaaaccgatc tgccgaccac cgcttttatt 180 ctgccgtcaa aaaataactc tgatcaagat atgattgatg cactggaact gattaataaa 240 ctgaatattc cgtaccatat tattccgatc cagccggttt atgaaagttt tctgaaatcc 300 acccaactgt ttaccaatcc gcaaaatgac cgccaaaatg tcattaaagg taacgctcaa 360 gctcgttttc gcatgatgta tctgtatgct tatgcacaac aaaataatcg tattgtagtt 420 ggcaccgata atgcttgtga atggtatatg ggttatttca ccaaatttgg cgatggcgct 480 gctgatattc tgccgctgat taatctgaaa aaatcccagg tatttgagct gggtaaatac 540 ctggatgttc cgcgcaatat cctgaccaaa gcaccgtctg ctggtctgtg gcaaggccaa 600 accgatgaag gtgaaatggg cgttacctat caggaaattg ataattttct ggacggtaaa 660 gaagtatcgc cggcaacctt tgaaaaaatt agctactggc ataatcgctc tcaccacaaa 720 cgcaaaatgg ctctgacgcc ggattttaac taa 753 <210> 36 <211> 750 <212> DNA <213> Francisella persica ATCC VR-331 <400> 36 atgaaaattg ttaaagattt caacatcaaa gaatattcac aaaaactgat tgattggctg 60 agtgatacct gtatgaatta cccggctgaa ggctttgtca ttggtctgag cggtggtatt 120 gattcggcag ttgcagcttc tctggctgtc aaaaccggcc tgtcaaccac cgctctgatt 180 ctgccgtcaa aaaacaatca acaccaagat attcaagatg ctctggaact ggcagataaa 240 attaatattg aacatcatac cattaccatt caaaccgtat acgaaacctt tctggcgtca 300 attaaaaaaa ttaccaatac cgaacgtgat cgccaactgg tcattaaagg caatgctcaa 360 gctcgtctgc gcatgatgta tctgtatgcc tatgctcaac aatataatcg cgtggttatt 420 ggtaccgata atgcttgtga atggtatatg ggctatttta ccaaatttgg tgatggtgct 480 gctgatattc tgccgctggt taatctgaaa aaatctcacg tttttgaact gggtaaatac 540 ctgggtgttc cgaaaaatat tctggataaa gctccgtctg ctggcctgtg gcaaggccaa 600 accgatgaag atgaaatggg cgtaacctat caagaaattg atgatttcct ggatggtaaa 660 caagtttcag cgaaagctct ggaacgcatt aatttctggc ataatcgtag tcatcataaa 720 cgcaaactgg ctctgattcc gaatttctaa 750 <210> 37 <211> 750 <212> DNA <213> FtNadE_star_optimized <400> 37 atgaaaatcg tcaaagactt ctccccgaaa gaatattccc aaaaactggt gaactggctg 60 agcgactcgt gtatgaacta tccggcagaa ggctttgtca ttggtctgag tggcggtatc 120 gattccgctg tggcggcctc actggccgtt aaaaccggcc tgccgaccac ggcactgatt 180 ctgccgtctg acaacaatca gcatcaagat atgcaggacg cgctggaact gattgaaatg 240 ctgaacatcg aacactacac catttccatc cagccggcgt atgaagcgtt tctggcgagc 300 acccaatctt tcacgaacct gcagaacaat cgtcaactgg tgatcaaagg caatgcgcag 360 gcccgtctgc gcatgatgta tctgtacgcg tatgcgcagc aatacaaccg cattgttatc 420 ggcaccgata atgcctgcga atggtacatg ggttatttta cgaaattcgg cgatggtgca 480 gctgacattc tgccgctggt caacctgaaa aaatcgcagg tgtttgaact gggtaaatac 540 ctggatgttc cgaaaaatat cctggacaaa gcaccgagcg caggtctgtg gcagggtcaa 600 accgatgaag acgaaatggg cgttacgtat caggaaattg atgacttcct ggatggtaaa 660 caagtcagcg cgaaagccct ggaacgtatc aacttctggc acaaccgctc acatcataaa 720 cgcaaactgg cactgacccc gaacttctaa 750 <210> 38 <211> 782 <212> DNA <213> Optimized_FtNadE_star_Bacillus <400> 38 gctacctgag aagcttatga aaatcgttaa agacttctct ccgaaagaat attctcaaaa 60 acttgtgaac tggcttagcg actcttgtat gaactatccg gcagaaggct ttgttattgg 120 tctttctggc ggtatcgact ctgctgtggc ggcttcactt gctgttaaaa caggtcttcc 180 gacaacagca cttattcttc cgtctgacaa caatcagcat caagatatgc aggacgcgct 240 tgaacttatt gaaatgctta acatcgaaca ctacacaatt tctatccagc cggcgtatga 300 agcgtttctt gcgagcacac aatctttcac aaaccttcag aacaatcgtc aacttgtgat 360 caaaggcaat gcgcaggctc gtcttcgcat gatgtatctt tacgcgtatg cgcagcaata 420 caaccgcatt gttatcggca cagataatgc ttgcgaatgg tacatgggtt attttacaaa 480 attcggcgat ggtgctgctg acattcttcc gcttgttaac cttaaaaaat ctcaggtgtt 540 tgaacttggt aaataccttg atgttccgaa aaatatcctt gacaaagcac cgagcgcagg 600 tctttggcag ggtcaaacag atgaagacga aatgggcgtt acatatcagg aaattgatga 660 cttccttgat ggtaaacaag ttagcgcgaa agctcttgaa cgtatcaact tctggcacaa 720 ccgctcacat cataaacgca aacttgcact tacaccgaac ttctaagcat gcagtaagta 780 gc 782 <210> 39 <211> 785 <212> DNA <213> Optimized_AE016827_Bacillus Mannheimia succiniciproducens MBEL55E <400> 39 gctacctgag aagcttatga aaacagcagc atacgcagat tatcttattc aatggcttga 60 aaaccaacgc acagaacttt acggcatgga cggctataca cttggcgtta gcggcggtat 120 tgacagcgct gtttgcgctc atcttgcagc gcgcacaggc gcgccggtac aagctcttat 180 tcttccggcg gaagtaacat ctccgtcaga tgtggcggat gcgcaagcta cacttgaaag 240 cgctggtatt gacggccaaa ttatttctat tgcaccgtgg tacgatctta ttatgcaaca 300 actttctccg gtacttaata gcgaaccgga acgcgttaac gtacttaaag gtaatcttat 360 ggcacgcctt cgtatgattg cgctttttac aacagcacaa agccatcgtt ctattgtgct 420 tggcacagat aatgcggcgg aatggcttac aggttatttt acaaaattcg gcgacggcgc 480 agcggacgta cttccgcttg cgggccttcg caaagaacag gtatttgaac ttggccgtta 540 tcttggcgta ccgcaaagcg tgcttgataa aaaaccgagc gctggtcttt gggcaggcca 600 aacagacgaa gctgaaatgg gtgttacata cgcggaaatc gacgcttatc ttcgcggcga 660 aacagttagc ccgcaggcac ttcaacaaat ccgtttctgg cacaaccgtt ctcatcacaa 720 acgtatgctt ccgccgaaac cgaaatcacc ggatgaagcg gaatgttaag catgcagtaa 780 gtagc 785 <210> 40 <211> 782 <212> DNA <213> Optimized_CP002558_Bacillus Francisella cf. novicida 3523 <400> 40 gctacctgag aagcttatga aaattgttaa agatttttct ccgaaagaat attcacaaaa 60 tcttgttaat tggctttctg atacatgtat taattatccg gctgaaggct ttgtaatcgg 120 cattagcggt ggtattgatt cagcggttgc agcttctctt gctgttaaaa caggccttcc 180 gacaacagct cttattcttc cgtcaaaaaa caatcaacac caagatattc aagatgctct 240 tgaacttgtt gaaaaactta atattgaaca tcatattgtt acaattcaac cggcatacga 300 aaattttctt gcatcaacac aggaatttat taatacagat aataatcgcc aacttgtgat 360 caaaggcaat gctcaagcac gtcttcgcat gatgtatctt tatgcttatg ctcaacaata 420 taaccgcatt gttattggta cagataatgc ttgtgaatgg tatatgggct attttacaaa 480 atttggtgat ggcgctgctg atatttttcc gcttattaat cttaaaaaat cacaagtttt 540 tgaacttggt aaataccttg atgttccgaa aaatattatt gataaagctc cgtctgctgg 600 cctttggcaa ggccaaacag atgaagatga aatgggcgta acatatcaag aaattgatga 660 tttccttgat ggtaaacaaa tttcagcaaa agctcttgaa cgcattaact tctggcataa 720 tcgttctcat cataaacgca aacttgctct tacaccgaat ttctaagcat gcagtaagta 780 gc 782 <210> 41 <211> 782 <212> DNA <213> Optimized_CP002872_Bacillus Francisella sp. TX077308 <400> 41 gctacctgag aagcttatga aaattgtaaa aaactttatt gtagaacagt attctaataa 60 tcttattaaa tggcttaaag aaaattgcat taaatatccg gctgaaggtt ttgtgattgg 120 tatttctggt ggtattgatt ctgcagtagc tgcatctctt gcagttaaaa caggccttcc 180 gacaacagct cttattcttc cgtctaaaaa caatcaagac caagatatgc gcgatggcat 240 tgaacttatc gaaaatctta atattgaata tcatacagtt tcaattcaac cggcttatga 300 cacatttatt gaatcaacat ttaactttac aaactcacaa aatgatcgcc aacatgttat 360 caaaggcaat gctcaagcgc gtcttcgcat gatgtatctt tatgcttatg ctcagcaaaa 420 taatcgcatt gttattggta cagataacgc atgtgaatgg tacatgggct atttcacaaa 480 atttggtgat ggtgcagcag atattcttcc gcttattaat cttaaaaaat ctcaagtttt 540 tgaacttggt aaatacctta aagtgccgaa aaacattatc caaaaagatc cgtctgctgg 600 tctttggcaa ggtcaaacag atgaagatga aatgggtgtt acatacaaag aaattgatga 660 cttccttgac ggtaaagaag tttcagaaaa agctcttgaa cgcattagct tctggcataa 720 tcgttctcac cataaacgca gcatggcttt tacaccgaat ttttaagcat gcagtaagta 780 gc 782 <210> 42 <211> 750 <212> DNA <213> Reverted FtNadE_star <400> 42 atgaaaatcg tcaaagactt ctccccgaaa gaatattccc aaaaactggt gaactggctg 60 agcgactcgt gtatgaacac tccggcagaa ggctttgtca ttggtctgag tggcggtatc 120 gattccgctg tggcggcctc actggccgtt aaaaccggcc tgccgaccac ggcactgatt 180 ctgccgtctg acaacaatca gcatcaagat atgcaggacg cgctggaact gattgaaatg 240 ctgaacatcg aacactacac catttccatc cagccggcgt atgaagcgtt tctggcgagc 300 acccaatctt tcacgaacct gcagaacaat cgtcaactgg tgatcaaagg caatgcgcag 360 gcccgtctgc gcatgatgta tctgtacgcg tatgcgggtc aatacaaccg cattgttatc 420 ggcaccgata atgcctgcga atggtacatg ggttatttta cgaaattcgg cgatggtgca 480 gctgacattc tgccgctggt caacctgaaa aaatcgcagg tgtttgaact gggtaaatac 540 ctggatgttc cgaaaaatat cctggacaaa gcaccgagcg caggtctgtg gcagggtcaa 600 accgatgaag acgaaatggg cgttacgtat caggaaattg atgacttcct ggatggtaaa 660 caagtcagcg cgaaagccct ggaacgtatc aacttctggc acaacgtctc acatcataaa 720 cgcaaactgg cactgacccc gaacttctaa 750 <210> 43 <211> 753 <212> DNA <213> Optimized_AE016827_Reverted Mannheimia succiniciproducens MBEL55E <400> 43 atgaaaacgg cagcatacgc agattatctg attcaatggc tggaaaacca acgcaccgaa 60 ctgaccggca tggacggcta taccctgggc gtcagcggcg gtattgacag cgccgtctgc 120 gctcatctgg cagcgcgcac cggcgcgccg gtacaagccc tgattctgcc ggcggaagta 180 accagtccgt cagatgtggc ggatgcgcaa gccaccctgg aaagcgccgg tattgacggc 240 caaattattt ccattgcacc gtggtacgat ctgattatgc aacaactgtc cccggtactg 300 aatagcgaac cggagcgcgt taacgtactg aaaggtaatc tgatggcacg cctgcgtatg 360 attgcgctgt ttaccacggc aggcagccat cgttctattg tgctgggcac cgataatgcg 420 gcggaatggc tgacgggtta ttttaccaaa ttcggcgacg gcgcagcgga cgtactgccg 480 ctggcgggcc tgcgcaaaga gcaggtattt gaactgggcc gttatctggg cgtaccgcaa 540 agcgtgctgg ataaaaaacc gagcgccggt ctgtgggcag gccaaacgga cgaagctgaa 600 atgggtgtta cctatgcgga aatcgacgct tatctgcgcg gcgaaaccgt tagcccgcag 660 gcactgcaac aaatccgttt ctggcacaac gtttctcatc acaaacgtat gctgccgccg 720 aaaccgaaat caccggatga agcggagtgt taa 753 <210> 44 <211> 750 <212> DNA <213> Optimized_CP002558_Reverted Francisella cf. novicida 3523 <400> 44 atgaaaattg ttaaagattt tagtccgaaa gaatattcac aaaatctggt taattggctg 60 agtgatacct gtattaatac tccggctgaa ggctttgtaa tcggcattag cggtggtatt 120 gattcagcgg ttgcagcttc tctggctgtc aaaaccggcc tgccgaccac cgctctgatt 180 ctgccgtcaa aaaacaatca acaccaagat attcaagatg ctctggaact ggttgagaaa 240 ctgaatattg aacatcatat tgttaccatt caaccggcat acgaaaattt tctggcatca 300 acccaggaat ttattaatac cgataataat cgccaactgg tgatcaaagg caatgctcaa 360 gcacgtctgc gcatgatgta tctgtatgcc tatgccggcc aatataaccg cattgttatt 420 ggtaccgata atgcttgtga gtggtatatg ggctatttta ccaaatttgg tgatggcgct 480 gctgatattt ttccgctgat taatctgaaa aaatcacaag tttttgaact gggtaaatac 540 ctggatgttc cgaaaaatat tattgataaa gctccgtctg ctggcctgtg gcaaggccaa 600 accgatgagg atgaaatggg cgtaacctat caagaaattg atgatttcct ggatggtaaa 660 caaatttcag caaaagccct ggaacgcatt aacttctggc ataatgttag tcatcataaa 720 cgcaaactgg ctctgacccc gaatttctaa 750 <210> 45 <211> 750 <212> DNA <213> Optimized_CP002872_Reverted Francisella sp. TX077308 <400> 45 atgaaaattg taaaaaactt tattgtagaa cagtattcta ataatctgat taaatggctg 60 aaagagaatt gcattaaaac tccggctgaa ggttttgtga ttggtattag tggtggtatt 120 gattcggcag tagccgcatc tctggcagtc aaaaccggcc tgccgaccac cgctctgatt 180 ctgccgtcga aaaacaatca agaccaagat atgcgcgatg gcattgaact gatcgaaaat 240 ctgaatattg agtatcatac cgtttcaatt caaccggctt atgacacgtt tattgagtca 300 acctttaact ttaccaactc acaaaatgat cgccaacatg ttatcaaagg caatgcccaa 360 gcgcgtctgc gcatgatgta tctgtatgct tatgctgggc aaaataatcg cattgttatt 420 ggtaccgata acgcatgtga atggtacatg ggctatttca ccaaatttgg tgatggtgca 480 gcagatattc tgccgctgat taatctgaaa aaatctcaag tttttgaact gggtaaatac 540 ctgaaagtgc cgaaaaacat tatccaaaaa gatccgtctg ccggtctgtg gcaaggtcaa 600 accgatgagg atgaaatggg tgtcacctac aaagaaattg atgacttcct ggacggtaaa 660 gaagtctcag aaaaagctct ggaacgcatt agcttctggc ataatgttag tcaccataaa 720 cgcagcatgg cttttacccc gaatttttaa 750 <210> 46 <211> 828 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 46 atgacattgc aacaacaaat aataaaggcg ctgggcgcaa aaccgcagat taatgccgaa 60 gaggaaattc gtcgtagtgt cgattttctg aaaagctacc tgcgaactta tccgttcatt 120 aaatcactgg tgctcgggat cagcggcggt caggactcca cgcttgccgg aaagctgtgc 180 cagatggcga ttaatgagct gcgccaggaa accggcaacg aatcactgca atttattgcc 240 gtacgcctgc cctatggtgt tcaggccgac gaacaagatt gccaggatgc cattgccttt 300 attcaaccgg atcgcgtatt aaccgttaat atcaagggcg cggtattggc tagcgagcag 360 gcattgcggg aagcaggcat tgaactgagc gattttgtcc gtggcaatga aaaagcgcgt 420 gagcggatga aagcacaata tagcattgcg ggtatgacca gcggtgtcgt ggtgggcacc 480 gatcatgcag cagaagccat taccggattc ttcactaaat atggtgacgg cggtacggat 540 attaatccgc tgtatcgtct caacaaacgt cagggtaaac agttactggc ggcattaggt 600 tgcccggaac acctttataa gaaagcgcca acggccgatc tggaagatga tcgcccttct 660 ctgccagatg aagtggcact cggcgtgacc tatgacaata tcgacgacta tctggaaggg 720 aaaaacgtac ctcaacaggt cgccagaaca atagagaact ggtatctgaa aaccgaacat 780 aaacgccgtc cgccaattac cgttttcgat gatttctgga aaaagtaa 828 <210> 47 <211> 789 <212> DNA <213> Optimized_CP002558_Corynebacterium Francisella cf. novicida 3523 <400> 47 cagagaattc aaaggaggac aaccatggat gaaaattgtg aaagattttt ccccaaaaga 60 atattcccaa aatctggtga attggctgtc cgatacctgt attaattatc cagcagaagg 120 ctttgtgatc ggcatttccg gtggtattga ttccgcagtg gcagcatccc tggcagtgaa 180 aaccggcctg ccaaccaccg cactgattct gccatccaaa aacaatcaac accaagatat 240 tcaagatgca ctggaactgg tggaaaaact gaatattgaa catcatattg tgaccattca 300 accagcatac gaaaattttc tggcatccac ccaggaattt attaataccg ataataatcg 360 ccaactggtg atcaaaggca atgcacaagc acgcctgcgc atgatgtatc tgtatgcata 420 tgcacaacaa tataaccgca ttgtgattgg caccgataat gcatgtgaat ggtatatggg 480 ctattttacc aaatttggtg atggcgcagc agatattttt ccactgatta atctgaaaaa 540 atcccaagtg tttgaactgg gtaaatacct ggatgtgcca aaaaatatta ttgataaagc 600 accatccgca ggcctgtggc aaggccaaac cgatgaagat gaaatgggcg tgacctatca 660 agaaattgat gatttcctgg atggtaaaca aatttccgca aaagcactgg aacgcattaa 720 cttctggcat aatcgctccc atcataaacg caaactggca ctgaccccaa atttctaagg 780 tacccgggg 789 <210> 48 <211> 1611 <212> DNA <213> B. subtilis Tetracyclin cassette 1611bp <400> 48 aaagagtagt tcaacaaacg ggccatattg ttgtataagt gatgaaatac tgaatttaaa 60 acttagttta tatgtggtaa aatgttttaa tcaagtttag gaggaattaa ttatgaagtg 120 taatgaatgt aacagggttc aattaaaaga gggaagcgta tcattaaccc tataaactac 180 gtctgccctc attattggag ggtgaaatgt gaatacatcc tattcacaat cgaatttacg 240 acacaaccaa attttaattt ggctttgcat tttatctttt tttagcgtat taaatgaaat 300 ggttttgaac gtctcattac ctgatattgc aaatgatttt aataaaccac ctgcgagtac 360 aaactgggtg aacacagcct ttatgttaac cttttccatt ggaacagctg tatatggaaa 420 gctatctgat caattaggca tcaaaaggtt actcctattt ggaattataa taaattgttt 480 cgggtcggta attgggtttg ttggccattc tttcttttcc ttacttatta tggctcgttt 540 tattcaaggg gctggtgcag ctgcatttcc agcactcgta atggttgtag ttgcgcgcta 600 tattccaaag gaaaataggg gtaaagcatt tggtcttatt ggatcgatag tagccatggg 660 agaaggagtc ggtccagcga ttggtggaat gatagcccat tatattcatt ggtcctatct 720 tctactcatt cctatgataa caattatcac tgttccgttt cttatgaaat tattaaagaa 780 agaagtaagg ataaaaggtc attttgatat caaaggaatt atactaatgt ctgtaggcat 840 tgtatttttt atgttgttta caacatcata tagcatttct tttcttatcg ttagcgtgct 900 gtcattcctg atatttgtaa aacatatcag gaaagtaaca gatccttttg ttgatcccgg 960 attagggaaa aatatacctt ttatgattgg agttctttgt gggggaatta tatttggaac 1020 agtagcaggg tttgtctcta tggttcctta tatgatgaaa gatgttcacc agctaagtac 1080 tgccgaaatc ggaagtgtaa ttattttccc tggaacaatg agtgtcatta ttttcggcta 1140 cattggtggg atacttgttg atagaagagg tcctttatac gtgttaaaca tcggagttac 1200 atttctttct gttagctttt taactgcttc ctttctttta gaaacaacat catggttcat 1260 gacaattata atcgtatttg ttttaggtgg gctttcgttc accaaaacag ttatatcaac 1320 aattgtttca agtagcttga aacagcagga agctggtgct ggaatgagtt tgcttaactt 1380 taccagcttt ttatcagagg gaacaggtat tgcaattgta ggtggtttat tatccatacc 1440 cttacttgat caaaggttgt tacctatgga agttgatcag tcaacttatc tgtatagtaa 1500 tttgttatta cttttttcag gaatcattgt cattagttgg ctggttacct tgaatgtata 1560 taaacattct caaagggatt tctaaatcgt taagggatca actttgggag a 1611 <210> 49 <211> 1430 <212> DNA <213> B. subtilis Neomycin 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840 aatcggtaga agcccaaaag ttccacgatg cgatttgtgc ccttatcgta gaagagctgt 900 ttgaatatgc aggcaaatgg cgtaatattc gtgtgcaagg accgacaaca tttctaccat 960 ccttgactgt acaggtagca atggcaggtg ccatgttgat tggtctgcat catcgcatct 1020 gttatacgac gagcgcttcg gtcttaactg aagcagttaa gcaatcagat cttccttcag 1080 gttatgacca tctgtgccag ttcgtaatgt ctggtcaact ttccgactct gagaaacttc 1140 tggaatcgct agagaatttc tggaatggga ttcaggagtg gacagaacga cacggatata 1200 tagtggatgt gtcaaaacgc ataccatttt gaacgatgac ctctaataat tgttaatcat 1260 gttggttacg tatttattaa cttctcctag tattagtaat tatcatggct gtcatggcgc 1320 attaacggaa taaagggtgt gcttaaatcg ggccattttg cgtaataaga aaaaggatta 1380 attatgagcg aattgaatta ataataaggt aatagattta cattagaaaa 1430 <210> 50 <211> 1158 <212> DNA <213> B. subtilis Spectinomycin cassette 1158 bp <400> 50 catatgcaag ggtttattgt tttctaaaat ctgattacca attagaatga atatttccca 60 aatattaaat aataaaacaa aaaaattgaa aaaagtgttt ccaccatttt ttcaattttt 120 ttataatttt tttaatctgt tatttaaata gtttatagtt aaatttacat tttcattagt 180 ccattcaata ttctctccaa gataactacg aactgctaac aaaattctct ccctatgttc 240 taatggagaa gattcagcca ctgcatttcc cgcaatatct tttggtatga ttttacccgt 300 gtccatagtt aaaatcatac ggcataaagt taatatagag ttggtttcat catcctgata 360 attatctatt aattcctctg acgaatccat aatggctctt ctcacatcag aaaatggaat 420 atcaggtagt aattcctcta agtcataatt tccgtatatt cttttatttt ttcgttttgc 480 ttggtaaagc attatggtta aatctgaatt taattccttc tgaggaatgt atccttgttc 540 ataaagctct tgtaaccatt ctccataaat aaattcttgt ttgggaggat gattccacgg 600 taccatttct tgctgaataa taattgttaa ttcaatatat cgtaagttgc ttttatctcc 660 tatttttttt gaaataggtc taattttttg tataagtatt tctttacttt gatctgtcaa 720 tggttcagat acgacgacta aaaagtcaag atcactattt ggttttagtc cactctcaac 780 tcctgatcca aacatgtaag taccaataag gttatttttt aaatgtttcc gaagtatttt 840 tttcacttta ttaatttgtt cgtatgtatt caaatatatc ctcctcacta ttttgattag 900 tacctatttt atatccatag ttgttaatta aataaactta atttagttta tttatagatt 960 tcattggctt ctaaattttt tatctagata ataattattt tagttaattt tattctagat 1020 tatatatgat atgatctttc atttccataa aactaaagta agtgtaaacc tattcattgt 1080 tttaaaaata tctcttgcca gtcacgttac gttattagtt atagttatta taacatgtat 1140 tcacgaacga aaatcgat 1158 <210> 51 <211> 410 <212> PRT <213> Escherichia coli NadR <400> 51 Met Ser Ser Phe Asp Tyr Leu Lys Thr Ala Ile Lys Gln Gln Gly Cys 1 5 10 15 Thr Leu Gln Gln Val Ala Asp Ala Ser Gly Met Thr Lys Gly Tyr Leu 20 25 30 Ser Gln Leu Leu Asn Ala Lys Ile Lys Ser Pro Ser Ala Gln Lys Leu 35 40 45 Glu Ala Leu His Arg Phe Leu Gly Leu Glu Phe Pro Arg Gln Lys Lys 50 55 60 Thr Ile Gly Val Val Phe Gly Lys Phe Tyr Pro Leu His Thr Gly His 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Ile Gln Arg Ala Cys Ser Gln Val Asp Glu Leu His Ile 85 90 95 Ile Met Gly Phe Asp Asp Thr Arg Asp Arg Ala Leu Phe Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Met Ser Gln Gln Pro Thr Val Pro Asp Arg Leu Arg Trp Leu Leu 115 120 125 Gln Thr Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Ile Arg Ile His Ala Phe Asn Glu 130 135 140 Glu Gly Met Glu Pro Tyr Pro His Gly Trp Asp Val Trp Ser Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Lys Phe Met Ala Glu 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10 15 Tyr Gly His Leu Lys Pro Val Glu Thr Leu Ala Asn Leu Ile Gly Leu 20 25 30 Thr Arg Val Thr Ile Ile Pro Asn Asn Val Pro Pro His Arg Pro Gln 35 40 45 Pro Glu Ala Asn Ser Val Gln Arg Lys His Met Leu Glu Leu Ala Ile 50 55 60 Ala Asp Lys Pro Leu Phe Thr Leu Asp Glu Arg Glu Leu Lys Arg Asn 65 70 75 80 Ala Pro Ser Tyr Thr Ala Gln Thr Leu Lys Glu Trp Arg Gln Glu Gln 85 90 95 Gly Pro Asp Val Pro Leu Ala Phe Ile Ile Gly Gln Asp Ser Leu Leu 100 105 110 Thr Phe Pro Thr Trp Tyr Glu Tyr Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ala His 115 120 125 Leu Ile Val Cys Arg Arg Pro Gly Tyr Pro Leu Glu Met Ala Gln Pro 130 135 140 Gln Tyr Gln Gln Trp Leu Glu Asp His Leu Thr His Asn Pro Glu Asp 145 150 155 160 Leu His Leu Gln Pro Ala Gly Lys Ile Tyr Leu Ala Glu Thr Pro Trp 165 170 175 Phe Asn Ile Ser Ala Thr Ile Ile Arg Glu Arg Leu Gln Asn Gly Glu 180 185 190 Ser Cys Glu Asp Leu Leu Pro Glu Pro Val Leu Thr Tyr Ile Asn Gln 195 200 205 Gln Gly Leu Tyr Arg 210 <210> 64 <211> 189 <212> PRT <213> Bacillus subtilis NadD (nicotinic acid mononucleotide adenyltransferase) <400> 64 Met Lys Lys Ile Gly Ile Phe Gly Gly Thr Phe Asp Pro Pro His Asn 1 5 10 15 Gly His Leu Leu Met Ala Asn Glu Val Leu Tyr Gln Ala Gly Leu Asp 20 25 30 Glu Ile Trp Phe Met Pro Asn Gln Ile Pro Pro His Lys Gln Asn Glu 35 40 45 Asp Tyr Thr Asp Ser Phe His Arg Val Glu Met Leu Lys Leu Ala Ile 50 55 60 Gln Ser Asn Pro Ser Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Met Glu Arg Glu 65 70 75 80 Gly Pro Ser Tyr Thr Phe Asp Thr Val Ser Leu Leu Lys Gln Arg Tyr 85 90 95 Pro Asn Asp Gln Leu Phe Phe Ile Ile Gly Ala Asp Met Ile Glu Tyr 100 105 110 Leu Pro Lys Trp Tyr Lys Leu Asp Glu Leu Leu Asn Leu Ile Gln Phe 115 120 125 Ile Gly Val Lys Arg Pro Gly Phe His Val Glu Thr Pro Tyr Pro Leu 130 135 140 Leu Phe Ala Asp Val Pro Glu Phe Glu Val Ser Ser Thr Met Ile Arg 145 150 155 160 Glu Arg Phe Lys Ser Lys Lys Pro Thr Asp Tyr Leu Ile Pro Asp Lys 165 170 175 Val Lys Lys Tyr Val Glu Glu Asn Gly Leu Tyr Glu Ser 180 185 <210> 65 <211> 226 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum Cg2584 (nicotinic acid mononucleotide adenyltransferase) <400> 65 Met Arg Thr Leu Tyr Cys Pro Leu Met Thr Thr Thr Val Lys Arg Arg 1 5 10 15 Ala Arg Ile Gly Ile Met Gly Gly Thr Phe Asp Pro Ile His Asn Gly 20 25 30 His Leu Val Ala Gly Ser Glu Val Ala Asp Arg Phe Asp Leu Asp Leu 35 40 45 Val Val Tyr Val Pro Thr Gly Gln Pro Trp Gln Lys Ala Asn Lys Lys 50 55 60 Val Ser Pro Ala Glu Asp Arg Tyr Leu Met Thr Val Ile Ala Thr Ala 65 70 75 80 Ser Asn Pro Arg Phe Met Val Ser Arg Val Asp Ile Asp Arg Gly Gly 85 90 95 Asp Thr Tyr Thr Ile Asp Thr Leu Gln Asp Leu Ser Lys Gln Tyr Pro 100 105 110 Asp Ala Gln Leu Tyr Phe Ile Thr Gly Ala Asp Ala Leu Ala Gln Ile 115 120 125 Val Thr Trp Arg Asp Trp Glu Lys Thr Phe Glu Leu Ala His Phe Val 130 135 140 Gly Val Thr Arg Pro Gly Tyr Glu Leu Asp Gly Asn Ile Ile Pro Glu 145 150 155 160 Met His Gln Asp Arg Val Ser Leu Val Asp Ile Pro Ala Met Ala Ile 165 170 175 Ser Ser Thr Asp Cys Arg Glu Arg Ser Ser Glu Glu Arg Pro Val Trp 180 185 190 Tyr Leu Val Pro Asp Gly Val Val Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gln Leu 195 200 205 Tyr Arg Pro Glu Gly Ser Asp Lys Asp Met Asp Pro Lys Gly Gln Asn 210 215 220 Gln Ala 225 <210> 66 <211> 249 <212> PRT <213> Acinetobacter NudC enzyme, (NAD+ diphosphatase) <400> 66 Met Ser Glu Leu Ser Leu Ala Tyr Ile Phe His Asn Gln Gln Leu Leu 1 5 10 15 Val Asn Glu Lys Leu Glu Leu Pro Lys Val Glu Thr Leu Ala Ser Asp 20 25 30 Leu Gln Phe Gly Ser Gly Asp Asn Val Ile Ala Arg Asp Leu Gly Ala 35 40 45 Asp Glu Thr Ile Pro Glu Gly Trp His Leu Val Ser Ile Arg Gln Leu 50 55 60 Ile Ser Ser Trp Ser Thr Glu Glu Phe Met Arg Ala Ser Arg Ala Val 65 70 75 80 Gln Leu Leu Glu Trp Arg Arg Asn His Lys Phe Cys Ser His Cys Gly 85 90 95 His Glu Thr Glu Ile His Pro Thr Glu Tyr Ala Met Val Cys Pro Ala 100 105 110 Cys Gln Tyr Arg Gln Tyr Pro Arg Val Gln Pro Cys Val Ile Thr Val 115 120 125 Ile Thr Arg Gly Asp Asn Glu Ile Leu Leu Ala Lys Asn Ala Asn Asn 130 135 140 Lys Ser Asn Met Tyr Gly Leu Ile Ala Gly Phe Val Glu Val Ala Glu 145 150 155 160 Thr Leu Glu Glu Ala Val Gln Arg Glu Thr Leu Glu Glu Val Gly Leu 165 170 175 Lys Leu Lys Asn Ile Arg Tyr Leu Ala Ser Gln Pro Trp Pro Phe Pro 180 185 190 Ser Asn Leu Met Leu Ala Phe His Ala Glu Tyr Glu Ser Gly Asp Ile 195 200 205 Lys Leu Gln Glu Glu Glu Ile Ser Asp Ala Gln Phe Phe Lys Phe Asp 210 215 220 Gln Leu Pro Glu Ile Pro Phe Lys Gly Ser Ile Ala His Ala Met Ile 225 230 235 240 Met His Val Ile Gln Lys Gln Pro Ile 245 <210> 67 <211> 257 <212> PRT <213> Escherichia coli NudC enzyme, (NAD+ diphosphatase) <400> 67 Met Asp Arg Ile Ile Glu Lys Leu Asp His Gly Trp Trp Val Val Ser 1 5 10 15 His Glu Gln Lys Leu Trp Leu Pro Lys Gly Glu Leu Pro Tyr Gly Glu 20 25 30 Ala Ala Asn Phe Asp Leu Val Gly Gln Arg Ala Leu Gln Ile Gly Glu 35 40 45 Trp Gln Gly Glu Pro Val Trp Leu Val Gln Gln Gln Arg Arg His Asp 50 55 60 Met Gly Ser Val Arg Gln Val Ile Asp Leu Asp Val Gly Leu Phe Gln 65 70 75 80 Leu Ala Gly Arg Gly Val Gln Leu Ala Glu Phe Tyr Arg Ser His Lys 85 90 95 Tyr Cys Gly Tyr Cys Gly His Glu Met Tyr Pro Ser Lys 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Cg0888) enzyme, (NAD+ diphosphatase) <400> 68 Met Arg Ile Leu Pro Ile Gly Pro His Asp Glu Ile Ala Val Asn Gly 1 5 10 15 Ser Ile Val Leu Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Ile Val Ser Val Gly 20 25 30 Pro Asp Leu Gly Thr Val Arg Val Thr Leu Glu Glu Ile Glu Ser Leu 35 40 45 Gly Thr Pro Thr Ala Pro Arg Asp Leu Gly Ser Arg Glu Val Asp Ala 50 55 60 Cys Val Ser Leu Leu Arg Asn Arg Glu Leu Val Arg Phe Asp Pro His 65 70 75 80 Asp Gly Ser Glu Leu Thr Tyr Arg Glu His Ser Val Ala Tyr Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Lys Pro Leu Phe Pro Arg Leu Asp Pro Ala Val Ile Gly Ile 100 105 110 Val Glu Leu Arg Gly Glu Asp Arg Leu Leu Leu Gly Met Asn Ala Gln 115 120 125 Lys Arg Gln Arg Tyr Ser Leu Ile Ala Gly Tyr Val Ser His Gly Glu 130 135 140 Ser Leu Glu Asp Ala Phe Thr Arg Glu Val Phe Glu Glu Ala Ala Arg 145 150 155 160 Arg Val Ser Glu Ile Ser Tyr Val Ser Ser Gln Pro Trp Pro Ile Ser 165 170 175 Gly Ser Leu Met Leu Gly Met Lys Gly Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro 180 185 190 Gln Gly Glu Thr Asp Gly Glu Leu Ala Glu Thr Ile Trp 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145 150 155 160 Tyr Asn Lys Trp Lys Pro Tyr Asp Ile Phe Thr Val Asp Gly Glu Lys 165 170 175 Ile Ala Ile Ile Gly Leu Asp Thr Val Asn Lys Thr Val Asn Ser Ser 180 185 190 Ser Pro Gly Lys Asp Val Lys Phe Tyr Asp Glu Ile Ala Thr Ala Gln 195 200 205 Ile Met Ala Asn Ala Leu Lys Gln Gln Gly Ile Asn Lys Ile Ile Leu 210 215 220 Leu Ser His Ala Gly Ser Glu Lys Asn Ile Glu Ile Ala Gln Lys Val 225 230 235 240 Asn Asp Ile Asp Val Ile Val Thr Gly Asp Ser His Tyr Leu Tyr Gly 245 250 255 Asn Asp Glu Leu Arg Gly Leu Lys Leu Pro Val Ile Tyr Glu Tyr Pro 260 265 270 Leu Glu Phe Lys Asn Pro Asn Gly Glu Pro Val Phe Val Met Glu Gly 275 280 285 Trp Ala Tyr Ser Ala Val Val Gly Asp Leu Gly Val Lys Phe Ser Pro 290 295 300 Gln Gly Ile Ala Ser Ile Thr Arg Lys Ile Pro His Val Leu Met Ser 305 310 315 320 Ser His Lys Leu Gln Val Lys Asn Ser Glu Gly Lys Trp Ala Glu Leu 325 330 335 Ala Gly Asp Glu Arg Lys Lys Ala Leu Asp Thr Leu Lys Ser Met Lys 340 345 350 Ser Ile Ser Leu Asp Asp His Asp Ala Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala 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565 570 575 Met Lys Lys His Pro His Phe Glu Ala Tyr Thr Ser Ser Asn Val Lys 580 585 590 Phe Asn Ala Ser Thr Asp Ala Leu Pro Lys Lys 595 600 <210> 71 <211> 397 <212> PRT <213> Bs168|nupG_purine_nucleoside_transport_protein <400> 71 Met Tyr Phe Leu Leu Asn Leu Val Gly Leu Ile Val Ile Met Ala Val 1 5 10 15 Val Phe Leu Cys Ser Pro Gln Lys Lys Lys Ile Lys Trp Arg Pro Ile 20 25 30 Ile Thr Leu Ile Val Leu Glu Leu Leu Ile Thr Trp Phe Met Leu Gly 35 40 45 Thr Lys Val Gly Ser Trp Ala Ile Gly Lys Ile Gly Asp Phe Phe Thr 50 55 60 Trp Leu Ile Ala Cys Ala Ser Asp Gly Ile Ala Phe Ala Phe Pro Ser 65 70 75 80 Val Met Ala Asn Glu Thr Val Asp Phe Phe Phe Ser Ala Leu Leu Pro 85 90 95 Ile Ile Phe Ile Val Thr Phe Phe Asp Ile Leu Thr Tyr Phe Gly Ile 100 105 110 Leu Pro Trp Leu Ile Asp Lys Ile Gly Trp Val Ile Ser Lys Ala Ser 115 120 125 Arg Leu Pro Lys Leu Glu Ser Phe Phe Ser Ile Gln Met Met Phe Leu 130 135 140 Gly Asn Thr Glu Ala Leu Ala Val Ile Arg Gln Gln Leu Thr Val Leu 145 150 155 160 Ser Asn Asn Arg Leu 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Ala Ala Ile Ala Ser Gln Gly Leu Ser 165 170 175 Ile Thr Glu Ala Leu Ser Asn Met Lys Ala Lys Leu Pro His Thr Thr 180 185 190 His Val Glu Val Glu Val Asp His Ile Glu Gln Ile Glu Pro Val Leu 195 200 205 Ala Ala Gly Val Asp Thr Ile Met Leu Asp Asn Phe Thr Ile Asp Gln 210 215 220 Leu Ile Glu Gly Val Asp Leu Ile Gly Gly Arg Ala Leu Val Glu Ala 225 230 235 240 Ser Gly Gly Val Asn Leu Asn Thr Ala Gly Lys Ile Ala Ser Thr Gly 245 250 255 Val Asp Val Ile Ser Val Gly Ala Leu Thr His Ser Val His Ala Leu 260 265 270 Asp Leu Gly Leu Asp Ile Phe 275 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Primer 10444 <400> 85 cggtaagtcc cgtctagcct 20 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Primer 10447 <400> 86 atgtttgcaa aacgattcaa aacct 25 <210> 87 <211> 37 <212> DNA <213> Primer 11222 <400> 87 ttacaccgaa tttctaataa taaccgggca ggccatg 37 <210> 88 <211> 37 <212> DNA <213> Primer 11223 <400> 88 ggcctgcccg gttattatta gaaattcggt gtaagag 37 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Primer 11226 <400> 89 cttttacacc gaatttttaa taataaccgg gcaggccatg 40 <210> 90 <211> 37 <212> DNA <213> Primer 11227 <400> 90 ggcctgcccg gttattatta aaaattcggt gtaaaag 37 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Primer 11230 <400> 91 cggatgaagc ggaatgttaa taataaccgg gcaggccatg 40 <210> 92 <211> 37 <212> DNA <213> Primer 11231 <400> 92 ggcctgcccg gttattatta acattccgct tcatccg 37 <210> 93 <211> 38 <212> DNA <213> Primer 11232 <400> 93 gaaaggtggt gaactactat gaaaacagca gcatacgc 38 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Primer 11233 <400> 94 gcgtatgctg ctgttttcat agtagttcac cacctttctc 40 <210> 95 <211> 40 <212> DNA <213> Primer 11234 <400> 95 cacttacacc gaacttctaa taataaccgg gcaggccatg 40 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Primer 11235 <400> 96 ggcctgcccg gttattatta gaagttcggt gtaagtg 37 <210> 97 <211> 33 <212> DNA <213> Primer 11341 <400> 97 aagggaggtt tcatatgaaa attgttaaag att 33 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Primer 11342 <400> 98 tttaacaatt ttcatatgaa acctccctta attctcg 37 <210> 99 <211> 35 <212> DNA <213> Primer 11351 <400> 99 gtgaactact atgaaaattg taaaaaactt tattg 35 <210> 100 <211> 35 <212> DNA <213> Primer 11352 <400> 100 ttacaatttt catagtagtt caccaccttt ctcta 35 <210> 101 <211> 35 <212> DNA <213> Primer 11353 <400> 101 aagggaggtt tcatatgaaa atcgttaaag acttc 35 <210> 102 <211> 35 <212> DNA <213> Primer 11354 <400> 102 taacgatttt catatgaaac ctcccttaat tctcg 35 <210> 103 <211> 36 <212> DNA <213> Primer 11159 <400> 103 gctacttact ctcgagttac tttttccaga aatcat 36 <210> 104 <211> 33 <212> DNA <213> Primer 11160 <400> 104 gctaacttag catatgatga cattgcaaca aca 33

Claims (26)

  1. (a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함; 및
    (b) 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 세균으로서, 하나 이상의 전술된 변형을 포함하는 세균이 임의의 전술된 변형을 포함하지 않는 세균보다 증가된 양의 니코틴아미드 리보시드(NR)를 생산하는, 니코틴아미드 리보시드를 생산할 수 있는 유전자 변형 세균.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (b) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (c) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (d) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (e) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
    (g) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 변형을 추가로 포함하는 세균.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)이 서열번호 1, 및 3 내지 18 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴산 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드로 전환하는 니코틴산 아미드화 활성을 갖는, 세균.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질이 서열번호 66 내지 70 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드가 NAD+를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 아데닌으로 전환하는 NAD+ 가수분해 활성을 갖는, 세균.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    NAD+ 생합성의 음성 조절제가 서열번호 51, 52 또는 53 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 NAD+ 생합성을 억제하는 활성을 갖는, 세균.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    니코틴아미드 리보시드 수송체가 서열번호 54, 55 또는 56 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴아미드 리보시드를 함입하는 니코틴아미드 리보시드 수송 활성을 갖는, 세균.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    니코틴아미드 모노뉴클레오시드 가수분해효소가 서열번호 57, 58 또는 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 리보시드로 전환하는 뉴클레오시드 가수분해 활성을 갖는, 세균.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 단백질이 서열번호 63, 64 또는 65 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴산 모노뉴클레오티드를 니코틴산 아데닌 다이뉴클레오티드로 전환하는 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소 활성을 갖는, 세균.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소 단백질이 서열번호 60, 61, 또는 62 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 니코틴산 모노뉴클레오티드로 전환하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 활성을 갖는, 세균.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소 단백질이 서열번호 72 내지 76 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴아미드 리보시드 및 포스페이트를 니코틴아미드 및 리보스-1-포스페이트로 전환하는 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소 활성을 갖는, 세균.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    퀴놀레이트 합성효소가 서열번호 77, 78 또는 79의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 퀴놀레이트를 이미노숙신산 및 다이하이드록시아세톤 포스페이트로부터 형성하는 활성을 갖거나;
    L-아스파테이트 산화효소가 서열번호 80 또는 81의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 이미노숙신산을 아스파트산으로부터 형성하는 활성을 갖거나;
    퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소가 서열번호 82, 83 또는 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 전술된 폴리펩티드의 변이체로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴산 모노뉴클레오티드를 퀴놀레이트 및 포스포리보실파이로포스페이트로부터 형성하는 활성을 갖는, 세균.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    에시리키어 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아시네토박터 바일이(Acinetobacter baylyi) 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로 이루어진 군으로부터 선택된 세균.
  13. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    NadE* 단백질이 10의 갭 페널티(GAP PENEALTY), 0.1의 갭 길이 페널티 및 단백질 중량 행렬의 곤넷 250 급수(Gonnet 250 series)를 사용하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 참조로 하여 비교될 때, 클러스탈W(ClustalW) 정렬법을 기준으로 하여 서열번호 1, 및 3 내지 18에 비해 위치 27에서의 티로신, 위치 133에서의 글루타민 및 위치 236에서의 아르기닌의 보존되는 아미노산 중 하나 이상을 갖는, 세균.
  14. 세균 세포를 니코틴아미드 리보시드를 생산하기에 효과적인 조건하에 배양하는 단계 및 니코틴아미드 리보시드를 배지로부터 회수하여 니코틴아미드 리보시드를 생산하는 단계를 포함하되, 숙주 미생물이 하기 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는, 니코틴아미드 리보시드의 제조 방법:
    (a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함;
    (b) 니코틴아미드 아네닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴;
    (c) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (d) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (e) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (g) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (h) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
    (i) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
  15. 세균 세포를 니코틴아미드 리보시드를 생산하기에 효과적인 조건하에 배양하는 단계 및 니코틴아미드 리보시드를 배지로부터 회수하여 니코틴아미드 리보시드를 생산하는 단계를 포함하되, 숙주 미생물이 하기 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는, 니코틴아미드 리보시드의 제조 방법:
    (a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함; 및
    (b) 니코틴아미드 아네닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
  16. 제15항에 있어서,
    세균 세포가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는 제조 방법:
    (a) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (b) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (c) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (d) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (e) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
    (g) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 변형 세균으로부터 수득된 니코틴아미드 리보시드 화합물.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 변형 세균으로부터 수득된 니코틴아미드 리보시드 화합물을 포함하는 조성물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 변형 세균으로부터 수득된 니코틴아미드 리보시드 화합물을 포함하는 식품 또는 사료.
  20. 유전자 변형의 결과로서, 세균이 니코틴아미드 리보시드를 생산하고, 생산된 니코틴아미드 리보시드를 세균이 배양되는 발효액 중 100 mg/L 이상으로 축적할 수 있는 유전자 변형 세균.
  21. 제20항에 있어서,
    유전자 변형이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 변형 세균:
    (a) 이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)의 활성을 부가함; 및
    (b) 니코틴아미드 아네닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
  22. 제21항에 있어서,
    유전자 변형이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 변형을 추가로 포함하는, 유전자 변형 세균:
    (a) nadA, nadB, nadC 유전자 또는 이의 조합의 전사를 억제함으로써 NAD+ 생합성을 억제하는 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (b) 니코틴아미드 리보시드 수송체 단백질로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (c) 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 전이효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (d) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아미도 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (e) 퓨린 뉴클레오시드 가인산분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시킴;
    (f) 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 가수분해효소로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴; 및
    (g) L-아스파테이트 산화효소, 퀴놀레이트 합성효소, 퀴놀레이트 포스포리보실 전이효소 또는 이의 조합으로서 기능을 하는 단백질의 활성을 부가하거나 증가시킴.
  23. 제22항에 있어서,
    이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)이 서열번호 1, 및 3 내지 18 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드가 니코틴산 모노뉴클레오티드를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드로 전환하는 니코틴산 아미드화 활성을 갖는, 세균.
  24. 제23항에 있어서,
    이형 니코틴산 아미드화 단백질(NadE*)이 10의 갭 페널티, 0.1의 갭 길이 페널티 및 단백질 중량 행렬의 곤넷 250 급수를 사용하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 참조로 하여 비교될 때, 클러스탈W 정렬법을 기준으로 하여 서열번호 1, 및 3 내지 18에 비해 위치 27에서의 티로신, 위치 133에서의 글루타민 및 위치 236에서의 아르기닌의 보존되는 아미노산 중 하나 이상을 갖는, 세균.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 가수분해 단백질이 서열번호 66 내지 70 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 전술된 폴리펩티드가 NAD+를 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 아데닌으로 전환하는 NAD+ 가수분해 활성을 갖는, 세균.
  26. 제1항 내지 제13항, 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    에시리키어 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 아시네토박터 바일이 및 랄스토니아 유트로파로 이루어진 군으로부터 선택된 세균.
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