CN117187320A - 烟酰胺单核苷酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供生产效率优异的烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法。本发明涉及的NMN的制造方法包括下述工序：在焦磷酸酶(PPase)的存在下，使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体、表达所述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与烟酰胺(NAM)及磷酸核糖焦磷酸(PRPP)接触。

Description

烟酰胺单核苷酸的制造方法
本申请是原申请、申请日为2018年9月27日，申请号为201880054836.6，发明名称为“烟酰胺单核苷酸的制造方法及该方法所使用的转化体”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及烟酰胺单核苷酸等核酸系化合物的制造方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(NMN)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成中间体。近年来，明确了NMN通过向NAD+的转变来控制长寿基因“Sirtuin”的活性，如果将NMN施与至小鼠则显示抗衰老作用。进一步，还报道了NMN对于糖尿病、阿尔茨海默症、心力衰竭等疾病的预防、症状的改善有效果。期待这样的NMN作为功能性食品、药品、化妆品等的成分的用途，以生产性的提高为目标，高效的制造方法的研究开发正在进行着。
专利文献1中记载了NMN的制造方法(权利要求1、13、15等)，其为将使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)过表达了的细胞(酵母、细菌等)分离，在烟酰胺(NAM)的存在下培养该细胞。Nampt是由NAM和细胞内被生物合成的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)来生成NMN的酶。专利文献1中还记载了为了促进PRPP的生物合成，对于上述细胞使磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)进一步过表达(权利要求3等)。Prs为由核糖-5-磷酸(R5P)和ATP来生成PRPP和AMP的酶。专利文献1中，在有效利用过表达特定酶的细胞的状态下，一边用含有碳源、氮源等的培养基进行培养，一边通过生物体内的酶反应来生成NMN等目标化合物。
专利文献2中记载了使用了相对于反应生成物的感受性被减弱(即，由于难以经受利用Prs生成的PRPP带来的负反馈，因此能够增加PRPP向体系内的供给量)的Prs突变体的NAD前体合成系统(权利要求1，第0068段等)。还记载了该Prs突变体可以是在重组体中生成、并且被分离、精制而得(权利要求6等)。专利文献2中还记载了系统可以进一步包含Nampt、ATP、R5P、PRPP(权利要求10、20、21、23等)。
另一方面，非专利文献1中记载了使用核糖激酶(Rbk，该文献中被表述为RK)、Prs(同样地被表述为PPS)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(8B3)这三种酶，由核糖合成肌苷一磷酸(IMP)的方法。Rbk参与由核糖和ATP生成R5P和ADP的反应(i)，Prs参与由R5P和ATP生成PRPP和AMP的反应(ii)，8B3参与(iii)由PRPP和肌苷酸生成IMP和焦磷酸(PPi)的反应。上述非专利文献1记载的方法中，利用腺苷酸激酶由反应(ii)所生成的AMP来再生ADP。此外，由该被再生的ADP和反应(i)所生成的ADP，利用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶来再生ATP。
专利文献3中记载了ATP的制造方法，其为使作为单独能够由AMP来合成ATP的酶的多磷酸激酶(Ppk)2型与多磷酸及AMP发生反应。作为这样的多磷酸激酶2型，公开了来源于嗜热菌(细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)等)的具有特定氨基酸序列的多磷酸激酶。专利文献3中进一步还记载了在利用ATP来制造物质(目标化合物)的方法中，通过同时实施上述ATP的制造方法，从而使目标化合物的合成反应与ATP的再生反应结合，由AMP再生的ATP被用于目标化合物的合成。
专利文献4中记载了将大肠杆菌在60～80℃进行加热，在大肠杆菌的细胞膜被破坏的状态下，进行ATP的再生反应的方法，其中，大肠杆菌包含来源于即使在70℃、10分钟的热处理时也不失活的嗜热菌的Ppk的基因，此外，在60～80℃时该大肠杆菌的通常的酶丧失活性并且获得多磷酸的细胞透过性。
专利文献5中记载了烟酰胺单核苷酸的制造方法，其为将NAM、ATP和核糖作为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和核糖激酶的催化剂作用下进行反应。
非专利文献2中记载了利用来源于嗜热菌的Ppk和利用该Ppk的ATP再生体系的甘油三磷酸合成方法。在该方法中，使用包含甘油、ADP、多磷酸、甘油激酶(GK)、Ppk等的缓冲液作为起始反应液，一边逐次添加多磷酸，一边进行反应。
非专利文献3中记载了谷胱甘肽的制造方法，其为使来源于血链球菌(Streptococcus sanguinis)的谷胱甘肽合成酶(GshF)和由具有与专利文献3所记载的物质同样活性的来源于嗜热菌即细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongates)BP-1的Ppk得到的ATP再生体系结合，利用级联反应进行。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2015/069860号
专利文献2：国际公开2016/198948号
专利文献3：日本特开2013-021967号
专利文献4：日本特开2007-143463号
专利文献5：国际公开2017/185549号
非专利文献
非专利文献1：Scism,Robert A.和Bachmann,Brian O.“Five-component cascadesynthesis of nucleotide analogues in an engineeredself-immobilizedenzymeaggregate.”ChemBioChem 11.1(2010):67-70.
非专利文献2：Restiawaty,Elvi等人“Feasibility ofthermophilic adenosinetriphosphate-regeneration system using Thermusthermophilus polyphosphatekinase.”Process Biochemistry 46.9(2011):1747-1752.
非专利文献3：Zhang,Xing等人“One-pot synthesis ofglutathione by atwo-enzyme cascade using a thermophilic ATP regenerationsystem.”Journal ofBiotechnology 241(2017):163-169.
发明内容
发明所要解决的课题
然而，专利文献1～5和非专利文献1～3所公开的方法在有效率地制造NMN方面存在问题，不能说是优异的方法。具体而言，专利文献1中，在有效利用过表达特定酶的细胞的状态下，一边利用含有碳源、氮源等的培养基进行培养，一边通过生物体内的酶反应来生成NMN，但其生成量为300nmol-NMN/g-酵母湿菌体重量(实施例1)。如果酵母干燥菌体重量/酵母湿菌体重量之比假定为0.2，则成为约0.5g-NMN/kg-酵母干燥菌体重量，存在生成量低这样的问题。
专利文献2中记载了使用了相对于反应生成物的感受性被减弱的Prs突变体的NAD前体合成系统。然而，没有记载显示NMN生成的实施例，没有显示具体的NMN的制造方法、生成量。
专利文献3中记载了将ATP的制造方法与目标化合物的合成反应结合的物质制造方法，其中，ATP的制造方法是使作为单独能够由AMP来合成ATP的酶的多磷酸激酶(Ppk)2型与多磷酸及AMP发生反应。然而，没有显示具体的NMN的制造方法、生成量。
专利文献4中记载了将包含来源于嗜热菌Ppk的基因的大肠杆菌进行加热，在大肠杆菌的细胞膜被破坏的状态下，进行ATP的再生反应的方法，但没有显示具体的NMN的制造方法、生成量。
专利文献5中记载了将烟酰胺、ATP和核糖作为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和核糖激酶的催化剂作用下进行反应的烟酰胺单核苷酸的制造方法。然而，专利文献5中，NMN的制造使用了大量的ATP。具体而言，为了制造NMN而在反应体系中添加的ATP的摩尔数成为生成的NMN的摩尔数的2倍以上。由于ATP为昂贵的原料，因此不能说是成本上有效率的制造方法。
因此，迄今为止虽然示出了多种NMN的制造法，但从为了NMN的生成量和NMN的制造而言所需要的ATP的量的观点考虑，这些方法都不充分。
本发明的课题在于提供生产效率优异的烟酰胺单核苷酸的制造方法。
用于解决课题的方法
本发明人等发现，在使Nampt、Prs和Ppk这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与R5P、NAM、ATP和多磷酸接触来进行酶反应的情况下(参照图1)，与以往的方法相比，能够有效率并且低价地生产NMN。进一步发现，在使Rbk和Ppk这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖、ATP和多磷酸接触来制造上述R5P的情况下，能够更加有效率并且低价地生产NMN，由此完成第一发明组。
此外，本发明人等发现，在焦磷酸酶(PPase)的存在下，使Nampt的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液或它们的处理物与NAM和PRPP接触来进行酶反应的情况下，与以往的方法相比，能够有效率地生产NMN，由此完成第二发明组。
进一步，本发明人等发现，使转化体或它们的处理物至少与烟酰胺(NAM)接触，从而能够在显著抑制NMN分解的同时有效率地生产NMN，其中，该转化体是对分类为(d)EC3.5.1.42所示的EC编号的酶进行编码的基因和对分类为以下(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上EC编号的酶进行编码的基因被破坏或缺失、并且烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体，由此完成第三发明组。
(a)EC 3.1.3.5
(c)EC 2.4.2.1
(g)EC 3.2.2.1
(h)EC 3.2.2.3
(i)EC 3.2.2.14
进一步，本发明人等发现，通过单独或多个手段的组合，能够使为了NMN的制造而在反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和成为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下，由此完成第四发明组。
即，本发明涉及下述[项目1]～[项目17]。
[项目1]
一种烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，其包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)及多磷酸激酶(Ppk)这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(R5P)、烟酰胺(NAM)、ATP及多磷酸接触。
[项目2]
根据项目1所述的NMN的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(Rbk)及多磷酸激酶(Ppk)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖、ATP及多磷酸接触来制造上述R5P。
[项目3]
根据项目1或项目2所述的NMN的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。
[项目4]
根据项目1～3中任一项所述的NMN的制造方法，上述Nampt来源于细菌。
[项目5]
根据项目1～4中任一项所述的NMN的制造方法，上述Ppk为多磷酸激酶2型家族。
[项目6]
根据项目1～5中任一项所述的NMN的制造方法，上述Ppk为多磷酸激酶2型家族的类别(class)3亚家族(Ppk2类别3)。
[项目7]
根据项目1～6中任一项所述的NMN的制造方法，上述转化体的宿主为大肠杆菌、棒状杆菌属细菌、红球菌属细菌或酵母。
[项目8]
一种转化体，其是烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)及多磷酸激酶(Ppk)这三种酶的表达被强化而得的转化体。
[项目9]
一种转化体，其是核糖激酶(Rbk)及多磷酸激酶(Ppk)这两种酶的表达被强化而得的转化体。
[项目10]
一种烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，其包括下述工序：在焦磷酸酶(PPase)的存在下，使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与烟酰胺(NAM)及磷酸核糖焦磷酸(PRPP)接触。
[项目11]
根据项目10所述的NMN的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。
[项目12]
根据项目10或11所述的NMN的制造方法，上述处理物为精制酶。
[项目13]
根据项目10～12中任一项所述的NMN的制造方法，上述Nampt来源于细菌。
[项目14]
一种NMN的制造方法，其包括下述工序：使转化体或它们的处理物至少与烟酰胺(NAM)接触，该转化体是对分类为(d)EC 3.5.1.42所示的EC编号的酶进行编码的基因及对分类为以下(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上EC编号的酶进行编码的基因被破坏或缺失、并且烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体。
(a)EC 3.1.3.5
(c)EC 2.4.2.1
(g)EC 3.2.2.1
(h)EC 3.2.2.3
(i)EC 3.2.2.14
[项目15]
根据项目1～14中任一项所述的NMN的制造方法，反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下。
[项目16]
一种NMN的制造方法，其是烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)及磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(R5P)、烟酰胺(NAM)及ATP接触，反应体系中添加的ATP、ADP及AMP各摩尔数的总和为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下。
[项目17]
根据项目16所述的NMN的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(Rbk)的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖及ATP接触来制造上述R5P。
发明的效果
通过利用本发明的第一发明组的NMN的制造方法，从而与以往相比飞跃性地提高NMN的生产量(例如，成为专利文献1所记载的生产量的10倍以上)成为可能。此外，通过利用ATP再生反应的本发明的制造方法，从而即使不大量地投入PRPP那样的昂贵的中间体、ATP，也能够将更低价的R5P或核糖作为原料来生产NMN，因此生产成本的抑制也成为可能。
通过利用本发明的第二发明组的NMN的制造方法，从而能够有效率地进行第3反应。由此，提高NMN的生产量、生成速度成为可能，能够抑制NMN的生产成本。
通过利用本发明的第三发明组的NMN的制造方法，从而在使用转化体、由转化体调制的休止菌体、膜透过性提高菌体、灭活菌体、破碎菌体、由破碎菌体调制的无细胞提取物以及对于它们进行了稳定化处理的稳定化处理物来进行NMN的生成反应时，能够抑制作为生成物的NMN的分解。由此，使用作为低价催化剂形态的菌体、无细胞提取物等，以高收率生产NMN成为可能，能够抑制NMN的生产成本。
通过利用本发明的第四发明组的NMN的制造方法，从而能够减少为了制造NMN而添加的ATP的量。由于ATP昂贵，由此，能够抑制NMN的生产成本。
附图说明
[图1]图1为表示本发明的NMN的制造方法中进行的反应的概略图。
[图2]图2为表示实施例1和比较例2中的NMN的生成浓度的图表。
[图3]图3为表示实施例3中的NMN的生成浓度的图表。
[图4]图4为表示实施例4中的NMN的生成浓度的图表。
[图5]图5为表示实施例5中的NMN的生成浓度的图表。
[图6]图6为表示实施例6和比较例2中的NMN的生成浓度的图表。
[图7]图7为表示实施例7中的NMN的生成浓度的图表。
[图8]图8为表示实施例8中的NMN的生成浓度的图表。
[图9]图9为表示NMN的分解路径的图。
具体实施方式
本说明书所使用的缩写的定义分别如下所示。
Nampt(Nicotinamide phosphoribosyltransferase)：烟酰胺磷酸核糖转移酶Prs(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase)：磷酸核糖焦磷酸合成酶
Rbk(Ribokinase)：核糖激酶
Ppk(Polyphosphate kinase)：多磷酸激酶
PPase(Pyrophosphatase)：焦磷酸酶
NMN(Nicotinamide mononucleotide)：烟酰胺单核苷酸
PRPP(Phosphoribosyl pyrophosphate)：磷酸核糖焦磷酸
NAM(Nicotinamide)：烟酰胺
R5P(Ribose-5-phosphate)：核糖-5-磷酸
NR(Nicotinamide riboside)：烟酰胺核糖
NaMN(Nicotinic acid mononucleotide)：烟酸单核苷酸
NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide)：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
PPi(Pyrophosphate)：焦磷酸
PolyP(Polyphosphate)：多磷酸
-第一发明组-
本发明的NMN的制造方法中，第一发明组包括下述工序：使Nampt、Prs和Ppk这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与R5P、NAM、ATP和多磷酸接触。优选本发明的NMN的制造方法中，作为上述R5P的制造工序，进一步包括下述工序：使Rbk和Ppk这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与包含核糖、ATP和多磷酸的混合物接触。即，本发明中，通过一边利用ATP再生反应，一边进行规定的酶反应，从而制造NMN。
这样的第一发明组的NMN的制造方法中，典型地，通过依次进行下述(1)～(3)的工序(在本说明书中，分别称为第1工序、第2工序和第3工序)来实施。这些工序可以为同一人实施，也可以为不同的人实施。此外，这些工序可以连续地进行，也可以在各工序之间设置规定的时期来阶段性地进行。
(1)制作包含对Nampt、Prs、Rbk和Ppk的各种酶进行编码的基因的转化体并培养，或者利用包含对该各种酶进行编码的基因的无细胞蛋白质合成反应液来进行蛋白质合成反应，使该各种酶表达的工序(第1工序)；
(2)根据需要，由经过了第1工序的转化体或无细胞蛋白质合成反应液来调制处理物的工序(第2工序)；以及
(3)使经过了第1、第2工序的转化体、无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与各基质化合物接触的工序(第3工序，参照图1)。
以下，对于本发明的NMN的制造方法，按照进行第1工序、第2工序和第3工序的实施方式，进一步详细地说明。然而，本发明的NMN的制造方法在不脱离本发明的宗旨的范围内，也可以按照对以下具体记载的第1工序、第2工序和第3工序进行了适当改变的实施方式来进行。
[第1工序]
第1工序为制作包含对Nampt、Prs、Rbk和Ppk的各种酶进行编码的基因的转化体并培养，或者利用包含对该各种酶进行编码的基因的无细胞蛋白质合成反应液来进行蛋白质合成反应，使该各种酶表达的工序。
(酶)
本发明中，利用Nampt、Prs和Ppk、以及根据需要的进一步的Rbk这四种酶。Nampt、Prs、Ppk和Rbk都是已知的酶，其氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的基因的碱基序列只要是本领域技术人员，都能够容易获得。上述规定这四种酶只要能够催化各自的目标反应，就可以是天然型的酶，也可以是通过改变天然型的酶的氨基酸序列来制作而成的、优选为提高了表达量、酶活性的突变型的酶。此外，以简化精制、促进可溶性表达、利用抗体进行检测等作为目的，各种酶可以带有各种标签(蛋白质或肽)。作为标签的种类，可举出His标签(组氨酸标签)、Strep(II)-tag、GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶标签)、MBP标签(麦芽糖结合蛋白质标签)、GFP标签(绿色荧光蛋白质标签)、SUMO标签(小泛素相关(类)修饰物(SmallUbiquitin-related(like)Modifier)标签)FLAG标签、HA标签、myc标签等。进一步，四种酶可以彼此作为融合蛋白质被表达。
·Nampt
Nampt(EC编号:2.4.2.12)已知通常参与NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)补救途径，在本发明中，是为了由PRPP和NAM来生成NMN的反应(第3反应)而使用的酶。在利用Nampt进行的由PRPP和NAM合成NMN的反应中，原本，ATP不是必须的。然而，报道了Nampt具有ATP水解活性，通过ATP的水解而Nampt被自磷酸化，从而酶学的参数、化学平衡在对于NMN生成而言有利的方向上发生变化(Biochemistry 2008,47,11086-11096)。
作为Nampt，可举出例如来源于智人(Homo sapiens)的Nampt(NP_005737)、来源于小鼠(Mus musculus)的Nampt(NP_067499)、来源于大鼠(Rattus norvegicus)的Nampt(NP_808789)、来源于斑马鱼(Danio rerio)的Nampt(NP_997833)、来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(AAR87771)、抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)(AE001890)、酒酒球菌(Oenococcus oeni)(KZD13878)、奥萘达湖希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)(NP_717588)等细菌的Nampt。本发明中，第3反应中的酶活性优异，因此优选使用来源于细菌的Nampt。这里，所谓细菌，为不具有核膜的原核生物的一组，是包含大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等的生物组。
·Prs
Prs(EC编号:2.4.2.17)在本发明中，是用于由R5P和ATP来生成PRPP和AMP的反应(第2反应)的酶。
作为Prs，可举出例如来源于智人(Homo sapiens)的Prs(NP_002755)、来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的Prs(BAA05286)、来源于热容芽孢杆菌(Bacilluscaldolyticus)的Prs(CAA58682)、来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的Prs(Q680A5)、来源于詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的Prs(Q58761)。在经过长时间、特别是制造体系内的基质浓度高的情况下，还可以以能够使利用第2反应进行的PRPP的生成以及接着由第3反应进行的NMN的生成继续(即，持续使作为最终产物的NMN的制造体系内的浓度上升)的方式，使用专利文献2所记载的那样的突变型Prs。作为突变型Prs，例如，可举出关于来源于人的Prs的Asp51His(对于51位的ASP向His的取代，以下同样)、Asn113Ser、Leu128Ile、Aspl82His、Ala189Val和Hisl92Gln等突变型，以及来源于它们所对应的其它生物的Prs中的突变型，例如关于来源于枯草杆菌的Prs，可举出Asn120Ser(与上述Asn113Ser对应)、Leu135Ile(与上述Leu128Ile对应)等突变型。
·Rbk
Rbk(EC编号:2.7.1.15)在本发明中，是用于由核糖和ATP来生成R5P和ADP的反应(第1反应)的酶。作为Rbk，能够使用来源于各种生物的天然型Rbk，或改变其氨基酸序列来制作而成的突变型Rbk，可举出例如来源于智人(Homo sapiens)的Rbk(NP_002755)，来源于酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的Rbk(P25332)，来源于枯草杆菌(Bacillussubtilis)的Rbk(P36945)，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的Rbk(AAA51476)，来源于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的Rbk(P44331)。
·Ppk
Ppk(EC编号:2.7.4.1)在本发明中，是用于由第1反应所生成的ADP或第2反应所生成的AMP，以及多磷酸，来再生ATP的反应(ATP再生反应)的酶。
Ppk根据氨基酸序列和动力学的不同能够分为2个家族，即多磷酸激酶1型家族(Ppk1)和多磷酸激酶2型家族(Ppk2)。作为将多磷酸作为基质来再生ATP的活性，Ppk2比Ppk1高。因此，作为本发明中的Ppk，优选使用Ppk2。
Ppk2能够进一步分为3个亚家族，即类别1、类别2和类别3。类别1和类别2的Ppk2分别催化将ADP磷酸化来生成ATP的反应，以及将AMP磷酸化来生成ADP的反应。与此相对，类别3的Ppk2能够催化AMP的磷酸化反应和ADP的磷酸化反应这两者，因此单独就能够由AMP来生成ATP。
作为本发明中的Ppk，能够使用用于由ADP来再生ATP的Ppk2类别1、与用于由AMP来再生ADP的Ppk2类别2的组合。或者在为了由AMP来再生ADP而并用腺苷酸激酶(催化AMP+ATP→2ADP这样的反应)的情况下，也能够仅将用于由ADP来再生ATP的Ppk2类别1或Ppk1用作本发明中的Ppk。然而，从能够将由ADP来再生ATP、以及由AMP来再生ATP这两者的反应单独进行催化这样的效率性良好出发，优选使用Ppk2类别3。在使用这样的PpK的情况下，能够将第1反应的Ppk和第2反应的Ppk共同化。
作为Ppk2类别3，可举出例如来源于抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)的Ppk2类别3(NP_293858)、来源于金黄类节杆菌(Paenarthrobacter aurescens)的Ppk2类别3(ABM08865)、来源于红色亚栖热菌(Meiothermus rube)的Ppk2类别3(ADD29239)、来源于地热奇异球菌(Deinococcus geothermalis)的Ppk2类别3(WP_011531362)、来源于细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)的Ppk2类别3(NP_682498)。另一方面，作为Ppk2类别1，可举出例如来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的Ppk2类别1(CS253628)、来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的Ppk2类别1(NP_384613)、来源于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PA0141(NP_248831)、来源于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PA2428(NP_251118)、来源于土拉弗菌(Francisellatularensis)的Ppk2类别1(AJI69883)。作为Ppk2类别2，可举出例如来源于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PA3455(NP_252145)。此外，作为腺苷酸激酶，可举出例如来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的腺苷酸激酶(AAP07232)。
(转化体)
本发明所使用的转化体与进行转化之前的(野生型的)细胞或菌体相比，是规定的各种酶的表达被强化而得的转化体。所谓“表达被强化”，并不能笼统地确定意味着各种酶的表达量被怎样程度地强化，如后述那样，以使各种酶在反应溶剂中(制造体系内)的浓度处于适当范围的方式，能够调节转化体中的表达量，只要是至少通过人工操作，与进行转化之前的(野生型的)细胞或菌体相比表达被强化即可。作为人工操作，没有特别限定，可举出如接下来所描述的那样，利用表达载体，将基因组上编码规定的酶的基因表达单元进行大量复制导入，将原始基因组上存在的编码规定的酶的基因的启动子取代为强有力的物质等操作。
本发明所使用的转化体可以(i)仅由包含编码规定的各种酶的全部基因的转化体来构成，作为(ii)分开地包含编码规定的各种酶的基因的转化体彼此的组合，例如，可以通过由Nampt和Prs的表达被强化而得的转化体和Ppk的表达被强化而得的转化体形成的组合来构成。
转化体的宿主只要是通过利用表达载体等的蛋白质表达系统能够表达规定的酶的细胞，就不受特别限定。可举出例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、放线菌(例如红球菌属(Rhodococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等细菌；酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)；丝状菌；植物细胞；昆虫细胞、哺乳类细胞等动物细胞。其中，优选为大肠杆菌、棒状杆菌属细菌和红球菌属细菌、以及酵母属酵母、假丝酵母属酵母和毕赤酵母属酵母，更优选为大肠杆菌。
作为大肠杆菌，可举出例如大肠杆菌K12株和B株，以及作为来源于这些野生株的衍生株的W3110株、JM109株、XL1-Blue株(例如，XL1-BlueMRF’)、K802株、C600株、BL21株、BL21(DE3)株等。
在使用表达载体的情况下，只要是以能够表达本发明所使用的规定的各种酶的基因的状态来包含的表达载体，就没有特别限定，能够使用适于各自宿主的载体。对于表达载体的构成的详细情况进行后述。
向宿主导入表达载体的方法只要是适于宿主的方法，就不受特别限定。作为能够利用的方法，可举出例如电穿孔法、使用钙离子的方法、球形体法、乙酸锂法、磷酸钙法、脂质转染法。
导入有表达载体的转化体只要用适于作为宿主使用的细胞(菌体)的方法进行培养，表达规定的各种酶即可。如上述那样，在将分开地包含编码规定的各种酶的基因的转化体彼此进行组合的情况下，例如，在制作Nampt和Prs的表达被强化而得的转化体与Ppk的表达被强化而得的转化体并组合的情况下，可以将各个转化体利用相同的培养基进行培养，也可以利用分开的培养基进行培养之后并混合。
在使用转化体、由转化体调制的休止菌体、膜透过性提高菌体、灭活菌体、破碎菌体、由破碎菌体调制的无细胞提取物和对于它们进行了稳定化处理的稳定化处理物(详细参照后述第2工序相关的事项)来进行NMN的生成反应的情况下，有时发生作为反应物(基质)的核糖、NAM、作为生成物的NMN的分解或副反应，不能有效率地制造NMN。在该情况下，能够使用使成为分解、副反应的原因的基因被破坏或缺失的宿主。具体而言，能够使用对分类为以下(a)～(i)所示的任意一个以上EC编号的酶进行编码的基因被缺损或破坏的宿主。
(a)EC 3.1.3.5
(b)EC 3.5.1.19
(c)EC 2.4.2.1
(d)EC 3.5.1.42
(e)EC 1.17.2.1
(f)EC 1.17.1.5
(g)EC 3.2.2.1
(h)EC 3.2.2.3
(i)EC 3.2.2.14
分类为(a)EC 3.1.3.5的酶为5’-核苷酸酶，包含将NMN水解而生成烟酰胺核糖(NR)和磷酸的反应进行催化的酶。作为编码5’-核苷酸酶的基因，可举出例如大肠杆菌的ushA、surE、yrfG、yjjG等。例如，Enzyme and Microbial Technology,58-59(2014),75-79中，作为承担大肠杆菌中的NAD分解的主要作用的酶，报道了作为5’-核苷酸酶的UshA，公开了同一酶具有NMN分解活性。在本发明中，作为破坏或缺失的编码5’-核苷酸酶的基因，特别优选为ushA或其同源基因。
分类为(b)EC 3.5.1.19的酶为烟碱酰胺酶，其参与NAM的分解。作为编码烟碱酰胺酶的基因，可举出例如大肠杆菌的pncA。
分类为(c)EC 2.4.2.1的酶为嘌呤核苷磷酸化酶，包含将NR加磷酸分解，将生成NAM和核糖-1-磷酸(R1P)的反应进行催化的酶。作为编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因，可举出例如大肠杆菌的deoD。Molecular and General Genetics,104(1969),351-359中，作为与核苷的代谢相关的基因组之一，公开了deoD。在本发明中，作为破坏或缺失的嘌呤核苷磷酸化酶，优选为deoD或其同源基因。
分类为(d)EC 3.5.1.42的酶为烟酰胺单核苷酸脱酰胺酶，为将NMN水解，生成NaMN和氨的酶。作为编码烟酰胺单核苷酸脱酰胺酶的基因，可举出例如大肠杆菌的pncC。THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,286(2011),40365-40375中公开了与奥萘达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)和大肠杆菌的pncC相关的见解。在本发明中，作为破坏或缺失的编码烟酰胺单核苷酸脱酰胺酶的基因，优选为pncC或其同源基因。
分类为(e)EC 1.17.2.1和(f)EC 1.17.1.5的酶为烟酸脱氢酶，认为有参与从NAM副产生羟基烟酸的可能性。
分类为(g)EC 3.2.2.1的酶为嘌呤核苷酸酶，包含将NR水解，将生成NAM和核糖的反应进行催化的酶。作为编码嘌呤核苷酸酶的基因，可举出例如人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)的Pu-N(Applied and Environmental Microbiology,67(2001),1783-1787)。在本发明中，作为破坏或缺失的编码嘌呤核苷酸酶的基因，优选为Pu-N或其同源基因。
分类为(h)EC 3.2.2.3的酶为尿嘧啶核苷酸酶，包含能够将NR水解，将生成NAM和核糖的反应进行催化的酶。作为编码尿嘧啶核苷酸酶的基因，可举出例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)的URH1(Plant Cell,21(2009),876-91)。在本发明中，作为破坏或缺失的编码尿嘧啶核苷酸酶的基因，优选为URH1或其同源基因。
分类为(i)EC 3.2.2.14的酶为NMN核苷酸酶，为将NMN水解，将生成NAM和R5P的反应进行催化的酶。Biochem.Biophys.Res.Commun.,49(1972),264-9中公开了大肠杆菌的NMN核苷酸酶活性。在本发明中，优选使编码具有NMN核苷酸酶活性的酶的基因被破坏或缺失。
缺损或破坏优选为对分类为(d)所示的EC编号的酶进行编码的基因，以及对分类为(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上EC编号的酶进行编码的基因，更优选为对分类为(d)所示的EC编号的酶进行编码的基因，以及对分类为(a)所示的EC编号的酶进行编码的基因。详细情况记载于后述第三发明组的说明中。
使基因破坏或缺失的方法不受特别限定，能够利用公知的基因破坏或缺失方法来进行。可举出例如使用成为线型的基因破坏或缺失用片段的方法，使用不含复制起点的环状的基因破坏或缺失质粒的方法，使用组II内含子的方法，Red-ET同源重组法，使用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑的方法等。
(表达载体)
关于本发明所使用的、编码规定的各种酶的基因，典型地，在包含于表达载体的状态下被导入至转化体的宿主。在一个转化体中使2种以上的酶表达的情况下，1个表达载体中，可以是对所表达的各种酶进行编码的基因全部被包含在内，也可以是在宿主内能够共存的2个以上表达载体中，被表达的编码各种酶的基因被适当分开而包含在内。例如，在制作Nampt、Prs和Ppk的表达被强化而得的转化体的情况下，可以使用编码Nampt、Prs和Ppk的基因全部被包含在内的1个表达载体，也可以由包含编码Nampt和Prs的基因的表达载体与包含编码Ppk的基因的表达载体这2个载体的组合来构成。
本发明所使用的表达载体能够通过公知的方法来制作。一般而言，只要在编码规定的酶的基因的上游插入转录启动子、根据情况在下游插入终止子来构建表达盒，将该盒插入至表达载体即可。或者在表达载体中已经存在转录启动子和/或终止子的情况下，不构建表达盒，只要利用该载体的转录启动子和/或终止子，在其间插入编码规定的酶的基因即可。如上述那样，在1个表达载体中包含编码2种以上酶的基因的情况下，这些基因可以全部在相同的启动子下被插入，也可以在不同的启动子下被插入。关于启动子的种类，只要能够在宿主中适当的表达，就不受特别限定，例如，作为大肠杆菌宿主中能够利用的启动子，可举出T7启动子、trp启动子、lac启动子、来源于λ噬菌体的PL启动子和PR启动子、tac启动子、trc启动子。
关于编码规定的各种酶的基因(核酸)，例如，(i)也能够按照碱基序列信息，制作引物，将基因组等作为模板进行扩增从而获得，(ii)也能够按照酶的氨基酸序列信息，有机合成地合成DNA从而获得。可以根据作为转化体的宿主的细胞，将基因优化。
为了向表达载体插入编码规定的酶的基因，能够利用使用限制性酶的方法、使用拓扑异构酶的方法等。插入时如果有必要，可以带有适当的接头。此外，作为对于向氨基酸的翻译而言重要的碱基序列，已知SD序列、Kozak序列等核糖体结合序列，可以将这些序列插入至基因的上游。也可以随着插入，取代基因所编码的氨基酸序列的一部分。此外，载体优选包含用于挑选目标转化体的因子(选择标记)。作为选择标记，可举出耐药性基因、营养缺陷型互补基因、同化性赋予基因等，能够根据目的、宿主来选择。作为在大肠杆菌中作为选择标记来使用的耐药性基因，可举出例如氨苄西林抗性基因、卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因。
关于表达载体，只要根据宿主，使用选自质粒DNA、噬菌体DNA、反转录转座子DNA、人工染色体DNA等中的适当的表达载体即可。例如，在将大肠杆菌作为宿主的情况下，可举出pTrc99A(GE Healthcare Bio-Sciences)、pACYC184(Nippongene)、pMW118(Nippongene)、pET系列载体(Novagen)等。此外作为具有2个以上插入位置的载体，可举出pETDuet-1(Novagen)等。还能够根据需要使用改变了这些载体而得的物质。
作为强化规定酶的表达的方法，典型的是使用上述那样的表达载体的方法，但也能够利用除此以外的方法。例如，可以通过在宿主的基因组上插入在编码规定的酶的基因中连接有适当的启动子、终止子、标记基因等的表达盒，从而强化规定的酶的表达。作为取得表达盒被插入至基因组上的转化体的方法，能够使用公知的方法。例如，能够在通过同源重组将表达盒插入至基因组上的情况下，通过具有规定的酶的表达盒和任意的基因组区域的序列，使用在宿主内不可能复制的质粒进行转化，从而获得该质粒整体或表达盒被插入而得的转化体。此时，通过使用搭载有SacB基因(编码果聚糖蔗糖酶(Levansucrase))等负选择标记的质粒、复制机构具有温度敏感性(ts)的质粒，从而也能够通过两次同源重组，有效率地取得仅表达盒被插入基因组上的转化体。此外，通过使用仅包含表达盒的DNA片段来进行转化，也能够获得基因组上的任意位置插入有表达盒的转化体。
此外，也能够通过在作为规定的酶而利用宿主在基因组上原本具有的酶(内源性酶)的情况下，将基因组上的该酶基因的启动子取代为强有力的物质，从而强化其表达。作为启动子，能够同样地利用上述表达载体中所使用的启动子。
(无细胞蛋白质合成反应液)
无细胞蛋白质合成体系是并非通过活着的微生物、细胞等，而是通过无细胞蛋白质合成反应液将蛋白质在试管内(in vitro)进行合成的系统，该无细胞蛋白质合成反应液是在由各种生物提取的无细胞提取物中添加了氨基酸、ATP等能量分子、能量再生体系、镁离子等盐类、以及对想要表达的蛋白质进行编码的基因(DNA或RNA)而得的溶液。无细胞提取物包含核糖体、tRNA、氨基酰基化tRNA合成酶、翻译起始因子、翻译延伸因子、翻译终止因子等翻译成分。本说明书中，包含反应的前后在内，将用于进行利用无细胞蛋白质合成体系的蛋白质合成反应的溶液称为无细胞蛋白质合成反应液。
作为本发明所使用的无细胞蛋白质合成体系，只要是规定的各种酶能够以具有原本的功能的状态进行表达，则任何体系都可以，例如，能够使用来源于小麦胚芽的合成体系、来源于大肠杆菌的合成体系、来源于家兔网状红血球的体系、来源于昆虫细胞的合成体系、来源于人细胞的合成体系。此外，可以使用将需要的可溶性蛋白质因子作为重组蛋白质来调制的PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements，使用重组因子的蛋白质合成)体系等。作为利用无细胞系的蛋白质合成反应工艺，能够使用分批法、CFCF(Continuous-Flow Cell-Free，连续流动无细胞)法、CECF(Continuous Exchange Cell-Free，连续交换无细胞)法、重叠法等。此外，作为表达的酶的基因的模板，可以为RNA也可以为DNA。在使用RNA作为模板的情况下，能够使用总RNA、mRNA、体外(in vitro)转录产物等。
[第2工序]
第2工序是根据需要，由经过了第1工序的转化体或无细胞蛋白质合成反应液来调制处理物的工序。作为转化体的处理物，可举出由转化体调制的休止菌体、膜透过性提高菌体、灭活菌体、破碎菌体等。此外，由破碎菌体调制的无细胞提取物和精制酶也包含在本发明的处理物中。作为无细胞蛋白质合成反应液的处理物，可举出由无细胞蛋白质合成反应液调制的精制酶。进一步，对于转化体、无细胞蛋白质合成反应液和它们的处理物进行了稳定化处理的稳定化处理物也包含在本发明的处理物中。
休止菌体的调制能够使用公知的方法来进行。所谓休止菌体，是指其增殖处于实质上停止的状态的菌体。具体而言，能够通过从培养基进行回收通过培养而增殖的转化体之后，悬浮于不含转化体可容易利用的碳源等的缓冲液等中、或使回收的转化体冷冻、或使其干燥并粉末化从而调制。从培养基回收转化体的方法可以为任意方法，可举出例如使用了离心分离的方法、使用了膜过滤的方法等。离心分离只要能够供给使转化体沉降的离心力，就不受特别限定，能够利用圆筒型、分离板型等。作为离心力，例如，能够在500G～20,000G左右进行。膜过滤只要能够从培养基回收转化体，则可以使用精密过滤(MF)膜、超滤(UF)膜的任一者来进行。作为悬浮转化体的缓冲液，只要是转化体的增殖实质上停止、并且保持规定的各种酶的功能的缓冲液，则任意缓冲液都可以，能够使用例如，磷酸缓冲液、丙烯酸缓冲液、三(三(羟基甲基)氨基甲烷)-盐酸缓冲液、HEPES(2-(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)乙烷磺酸)、其它两性离子(good)的缓冲液(Good’s buffers)等。在将转化体进行冷冻的情况下，只要在通过上述离心分离等操作除去大部分的水分的状态、或被悬浮于适当的缓冲液中的状态下进行冷冻即可。冷冻的温度根据悬浮转化体的缓冲液的成分不同而不同，但只要是转化体实质上冷冻的温度，则任何温度都可以，例如，只要在-210℃～0℃等范围内进行即可。此外，在将转化体干燥的情况下，作为其干燥方法，只要是转化体的增殖实质上停止、并且保持了规定的各种酶的功能的方法，则任何方法都可以，可举出冷冻干燥法、喷雾干燥法等。
膜透过性提高菌体的调制能够使用公知的方法来进行。例如，通过利用有机溶剂、表面活性剂来处理转化体，从而基质、生成物变得易于通过转化体的细胞膜、细胞壁。作为所使用的有机溶剂、表面活性剂的种类，只要膜透过性提高，并且保持规定的各种酶的功能，就不受特别限定，如果为有机溶剂，则可举出甲苯、甲醇等，如果为表面活性剂，则可举出Triton-X 100、苄索氯铵等。
灭活菌体的调制能够使用公知的方法来进行。例如能够通过药剂处理、加热处理来进行。利用药剂进行的处理能够使用例如苄索氯铵、氯化鲸蜡基吡啶甲基硬脂酰氯、溴化鲸蜡基三甲基铵等阳离子系表面活性剂、盐酸烷基二氨基乙基甘氨酸等两性离子系表面活性剂等。此外，也可举出乙醇等醇类、2-巯基乙醇等硫醇类、乙二胺等胺类、半胱氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸等氨基酸类等。利用加热进行的处理只要以目标的酶不失活的温度和时间进行热处理即可。
破碎菌体的调制能够使用公知的方法来进行。可以单独地或根据需要组合地采取例如超声波处理、利用弗氏压碎器、均化器进行的高压处理、利用珠磨机进行的磨碎处理、利用冲击破碎装置进行的碰撞处理、使用溶菌酶、纤维素酶、果胶酶等的酶处理、冷冻熔化处理、低张溶液处理、利用噬菌体进行的溶菌诱导处理等中的任一方法。在以工业的规模进行细胞的破碎的情况下，考虑到操作性、回收率、成本等，例如，优选进行高压处理、磨碎处理、碰撞处理或将酶处理等与这些处理进行组合的处理。
在利用珠磨机进行磨碎处理的情况下，能够将所使用的珠例如密度2.5～6.0g/cm3、尺寸0.1～1.0mm的珠以通常80～85％左右填充从而进行破碎，作为运转方式，能够采用间歇式、连续式的任一种。
在进行高压处理的情况下，处理压力只要来自细胞的目标蛋白质回收率充分高，就不受特别限定，例如，能够以40～200MPa左右、优选为60～150MPa左右、更优选为80～120MPa左右的压力进行破碎。也能够根据需要，通过将装置串联地配置，或者使用多个平台结构的装置，从而进行多阶段处理，提高破碎和操作效率。通常，每10MPa处理压力产生2～3℃的温度上升，因此优选根据需要进行冷却处理。
在碰撞处理的情况下，例如，能够将细胞浆料预先通过喷雾急速冷冻处理(冷冻速度：例如每1分钟数千℃)等制成冷冻微细粒子(例如50μm以下)，使其通过高速(例如约300m/s)的输送气体与碰撞板碰撞，从而有效率地将细胞进行破碎。
无细胞提取物能够通过从破碎菌体除去破碎残渣(包含细胞膜、细胞壁等的不溶性成分)来调制。破碎残渣的除去能够通过公知的方法来进行，例如，能够利用离心分离、膜过滤、滤布过滤等。离心分离操作能够如上述那样进行，在转化体的破碎残渣微细、难以容易地沉降的情况下，还能够根据需要使用凝聚剂等来提高残渣沉淀效率。膜过滤也能够如上述那样进行，在转化体的破碎残渣微细的情况下，特别是能够使用超滤(UF)膜。在进行滤布过滤的情况下，能够并用过滤助剂、凝聚剂来进行。作为过滤助剂，可举出硅藻土、纤维素粉末、活性炭等。作为凝聚剂，可举出阳离子系凝聚剂、阴离子系凝聚剂、两性系凝聚剂、非离子系凝聚剂等。能够通过利用上述任一操作，回收不存在菌体的上清液，进行无细胞化(使其无细胞)，从而调制包含规定的各种酶的无细胞提取物。
精制酶的调制能够通过将一般的生物化学方法单独或适当组合使用来进行，一般的生物化学方法为例如硫酸铵沉淀、各种色谱(例如，凝胶过滤色谱(Sephadex柱等)、离子交换色谱(DEAE-Toyopearl等)、亲和色谱(TALON金属亲和树脂等)、疏水性色谱(butylToyopearl等)、阴离子色谱(MonoQ柱等))、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
在本发明中，还能够使用对于上述转化体、无细胞蛋白质合成反应液和它们的处理物进行了稳定化处理的产物(稳定化处理物)。稳定化处理只要是与未处理的状态相比，相对于环境因素(温度、pH、化学物质浓度等)而言规定的各种酶的稳定性、或保存时的稳定性提高的处理，则怎样的处理都可以。可举出例如在凝胶中包含丙烯酰胺等、利用戊二醛等醛类进行的处理(包含CLEA：交联酶聚集体)、对于无机载体(氧化铝、二氧化硅、沸石、硅藻土等)的担载处理等。
本发明所使用的基质、生成物具有极性比较高，细胞膜、细胞壁成为物质移动的速度限制的可能性。因此，从基质、生成物的透过性的观点考虑，本发明中，特别优选使用破碎菌体、无细胞提取物、精制酶、或它们的稳定化处理物。
上述转化体、无细胞蛋白质合成反应液或它们的处理物只要保持其酶活性，则可以利用任何的条件保存。可以根据需要在适当的条件下(例如-80℃～-20℃，1天～1年)将它们的溶液冷冻，进行保存直至使用时(第3工序的实施时)。
如上述那样，在将分开地包含编码规定的各种酶的基因的转化体彼此组合的情况下，例如，在制作Nampt和Prs的表达被强化而得的转化体和Ppk的表达被强化而得的转化体并组合的情况下，(i)可以在对于各个转化体分别进行各处理之后，将它们的处理物进行混合，(ii)可以将它们的转化体混合之后，一并进行该各处理。
[第3工序]
第3工序为使经过了第1工序的转化体或无细胞蛋白质合成反应液、或根据需要进一步经过了第2工序的它们的处理物与作为酶反应的各种原料的基质接触的工序。在该工序中，利用Prs进行的第2反应和利用Nampt进行的第3反应与利用Ppk进行的ATP再生反应结合来进行。由于在利用Prs进行的第2反应中，将ATP作为磷酸源而基质被磷酸化，此外，在利用Nampt进行的第3反应中，通过Nampt本身所具有的ATP水解活性而被自磷酸化，因此消耗ATP。因此，通过将两反应与ATP再生反应结合来进行，从而能够一边补充被消耗的ATP一边有效率地进行反应。此外，作为利用Prs进行的第2反应的生成物的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)是较不稳定的化合物，因此通过将第2反应和第3反应在同一体系内进行，从而能够在PRPP生成后，迅速地进行利用Nampt进行的第3反应。在本发明中，通过ATP再生反应由ADP和/或AMP而ATP被再生，因此ATP没有枯竭，但需要根据反应中要维持的ATP浓度，将适度的量的ATP添加至反应溶剂中。此时，可以根据需要代替ATP而将ADP或AMP添加至反应溶剂中。这是因为添加的ADP、AMP通过ATP再生体系在体系内立即被再生为ATP，因此实质上处于与添加有适度的量的ATP的情况相同的状态。此外，可以添加以任意比例含有它们的混合物。
第2反应和第3反应可以根据需要与结合了利用Ppk进行的ATP再生反应的、利用Rbk进行的第1反应进行组合。在将两者组合的情况下，可以首先实施利用Rbk进行的第1反应，将该反应液作为原料，进行利用Prs进行的第2反应和利用Nampt进行的第3反应；也可以将利用Rbk进行的第1反应、利用Prs进行的第2反应和利用Nampt进行的第3反应在相同反应体系进行。
利用Prs进行的第2反应和利用Nampt进行的第3反应通过使Nampt、Prs和Ppk这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与R5P、NAM、ATP和多磷酸接触来进行。
利用Rbk进行的第1反应通过使Rbk和Ppk这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖、ATP和多磷酸接触来进行。
第3工序所使用的上述原料能够使用从一般的供应商购入的原料，也能够使用自身进行反应而合成的原料。例如，R5P能够使用市售品，但从原料成本的观点考虑，优选使用通过利用Rbk进行的第1反应也就是使Rbk和Ppk这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖和多磷酸接触来合成的产物。
已知作为上述原料之一的多磷酸为各种链长的多磷酸。在本发明中所使用的多磷酸的链长只要能够有效率地进行ATP再生反应，则怎样链长的多磷酸都可以，从溶解时的溶液的粘度、成本的观点考虑，链长优选为3～100左右，进一步优选为3～30左右。
第3工序中，可以根据需要使上述原料以外的化合物与规定的各种酶的表达被强化而得的转化体、表达规定的各种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物接触，或者包含于反应溶剂中(制造体系内)。例如，作为用于各种酶发挥功能的成分，包含镁离子等金属离子是适当的。此外，还优选包含缓冲成分。
实质上产生所使用的转化体的情况下、即维持细胞增殖能力的情况下，优选在转化体实质上不增殖的条件下进行反应。通过在这样的条件下进行反应，从而本反应中的基质、生成物不会被用于转化体的增殖、或被分解，能够期待以高收率作为目标生成物被生产出来。所谓转化体实质上不增殖的条件，只要是实质上反应体系内的转化体的数目没有增加的条件，则怎样的条件都可以。可举出例如在不含转化体能够容易利用的碳源(葡萄糖等)的溶液中进行反应。
反应溶剂中(制造体系内)所包含的、规定的各种酶的表达被强化而得的转化体、表达规定的各种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物的量，即，更具体而言Nampt、Prs、Rbk和Ppk各自的量能够适当调节。同样地，反应介质中所包含的R5P、NAM、ATP、多磷酸、核糖、进一步根据需要所使用的其它原料的量也能够适当调节。反应溶剂中(制造体系内)的上述各物质的浓度如下所述。
Nampt的浓度为例如1μg/L～10g/L。Prs的浓度为例如1μg/L～10g/L。Rbk的浓度为例如1μg/L～10g/L。Ppk的浓度为例如1μg/L～10g/L。通过适当调整规定的各种酶的表达被强化而得的转化体、表达规定的各种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物在反应溶剂中的添加量，从而能够将各种酶在反应溶剂中的浓度调节至上述范围内。
R5P的浓度为例如1μg/L～100g/L。核糖的浓度为例如1μg/L～100g/L。NAM的浓度为例如1μg/L～500g/L。ATP的浓度为例如1μg/L～100g/L。多磷酸的浓度为例如1μg/L～200g/L。通过这些原料在反应溶剂中的添加量等的调整，从而能够将各原料在反应溶剂中的浓度调节至上述范围内。在反应溶剂中的添加可以根据原料，在第3工序的最初一并加入规定量，也可以在第3工序的最初和/或中途的适当的阶段，依次添加规定量。
上述那样的各物质的浓度以外的、用于使酶反应进行的条件例如温度、时间等，也能够适当调节。反应温度优选在使各种酶的催化剂效率成为最佳的范围内进行调节。能够设置反应时间直至作为目标化合物的NMN的生成量达到规定的量。
生成的NMN能够根据常规方法，由制造体系回收，适当浓缩并精制。回收、精制的方法如果是能够提高NMN的纯度，并且有效率地回收NMN的方法，则怎样的方法都能够使用，可举出例如以下那样的方法。在NMN合成反应后，使用菌体进行反应的情况下，能够通过离心分离、膜过滤等手段，来除去菌体。或者在使用无细胞提取物、精制酶来进行反应的情况下，能够通过利用超滤膜进行的过滤、添加高氯酸等使其沉淀之后进行离心分离等来除去蛋白质等。在进行利用高氯酸的处理的情况下，利用氢氧化钾等将pH恢复至弱酸性，将产生的高氯酸钾的沉淀通过再次离心分离来除去。能够在除去菌体或蛋白质之后，根据需要进行利用活性炭吸附的洗涤处理。使包含NMN的水溶液与活性炭接触，使NMN吸附。能够使用滤纸等将吸附有NMN的活性炭进行过滤之后，利用异戊醇等溶剂进行洗涤，从而除去一定的杂质。接着，通过利用阴离子交换树脂进行处理，从而能够进一步进行精制。能够将包含NMN的溶液通过Dowex等阴离子交换树脂，将被吸附的NMN用水溶出。进一步，能够使所得的NMN水溶液的pH成酸性，添加大量的丙酮，从而将NMN以沉淀来获得。通过将该沉淀进行干燥，从而能够获得被精制的NMN。
本发明中，能够以使反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和成为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下的方式来进行。作为用于进行该过程的手段，作为结果，只要能够减少用于制造NMN所添加的ATP等的使用量，则怎样的方法都能够使用，例如，能够将以下所示的手段单独或适当组合，进行实施。这些手段的详细情况记载于后述第四发明组的说明中。
(1)ATP再生体系的结合
(2)PPase的共存
(3)来源于细菌的Nampt的利用
(4)使无用基因破坏或缺失的宿主的利用
(5)适当的基质浓度
-第二发明组-
本发明的NMN的制造方法中，第二发明组包括下述工序：在PPase的存在下，使Nampt的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与NAM和PRPP接触。
第二发明组的NMN的制造方法除了以下方面以外，与第一发明组同样地，通过依次进行第1工序、第2工序和第3工序来实施。即为以下方面：第1工序和第2工序为用于进行下述操作的工序，即至少调制Nampt的表达被强化而得的转化体、表达该酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物，并且用于调制PPase的表达被强化而得的转化体或虽然表达未被特别强化但作为内在性酶而表达PPase的微生物等、表达该酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物；在第3工序中，使经过了这样的第1工序和第2工序的转化体、无细胞蛋白质合成反应液或它们的处理物至少与NAM和PRPP接触即可。
·PPase
PPase(EC编号:3.6.1.1)为将焦磷酸水解成2分子的磷酸的酶。在本发明的NMN的制造方法中，第二发明组中，通过在PPase的存在下，进行第3反应，从而能够极其有效率地进行第3反应。
利用Nampt进行的第3反应中，与NMN一起副生焦磷酸。从一般的酶反应的观点出发，预测到通过向第3反应体系中添加PPase，从而作为副产物的焦磷酸被分解成磷酸，NMN生成方向的反应被促进。然而，在Nampt的情况下，该状况并不一定是显而易见的。原因在于如果分解焦磷酸，则存在Nampt反应不连续进行的可能性。已知Nampt水解ATP，通过自磷酸化而被活化。为了使利用Nampt进行的第3反应继续，每个反应中被自磷酸化的Nampt都需要脱磷酸化，焦磷酸被看作该脱磷酸化的触发物质(Biochemistry 47,11086-11096(2008))。因此，足以认为如果通过PPase除去焦磷酸，则不发生Nampt的脱磷酸化，反应可能不会继续。然而，第二发明组中，通过在PPase的存在下进行第3反应，从而能够显著促进第3反应。
作为PPase，可举出例如来源于酵母的PPase(P00817)、来源于大肠杆菌的PPase(NP_418647)、来源于枯草杆菌的PPase(P37487)、来源于嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的PPase(P38576)、来源于戈登氏链球菌(streptococcus gordonii)的PPase(P95765)、来源于变形链球菌(Strep tococcus mutans)的PPase(O68579)等。
PPase只要能够添加至第3反应体系中，则怎样的形态都可以，此外利用怎样的方法调制都可以。具体而言，首先，与第一发明组中的第1工序同样地，制作包含编码PPase的基因的转化体进行培养，或利用包含编码该各种酶的基因的无细胞蛋白质合成反应液进行蛋白质合成反应，使该各种酶进行表达。此外，PPase在通常的微生物等中，作为生存所需要的酶而表达一定量，因此能够培养表达未被特别强化的微生物等，直接使用。接着，能够与第一发明组中的第2工序同样地，由经过了第1工序的转化体、表达未被特别强化的微生物等或无细胞蛋白质合成反应液来调制处理物。或者也能够作为处理物的一方式利用市售的PPase精制酶。作为市售的PPase精制酶，可举出Sigma-Aldrich公司的来源于酵母的PPase精制酶(制品编号10108987001)等。
通过在上述那样操作而获得的PPase的存在下，使Nampt的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与NAM和PRPP接触，从而能够实施第二发明组的NMN的制造方法。通过第二发明组，能够极其有效率地进行第3反应，能够有效率地制造NMN。第二发明组中的第3反应能够单独以第3反应来进行，也能够与第1反应、第2反应和ATP再生反应的一个以上反应进行组合，在相同的反应体系中进行。换句话说，能够使本发明的第一发明组中的第3反应的实施方式为本发明的第二发明组中规定的第3反应，从而实施整合了第一发明组和第二发明组的NMN的制造方法。
实质上产生所使用的转化体的情况下、即维持了细胞增殖能力的情况下，优选在转化体实质上不增殖的条件下进行反应。通过在这样的条件下进行反应，本反应中的基质、生成物不会被用于转化体的增殖、或者被分解，能够期待以高收率作为目标生成物被生产。所谓转化体实质上不增殖的条件，只要是实质上反应体系内的转化体的数目没有增加的条件，则怎样的条件都可以。可举出例如在不含转化体能够容易利用的碳源(葡萄糖等)的溶液中进行反应。
作为本发明中的第2工序的方式，特别优选处理物为精制酶。通过使用精制酶，从而能够抑制反应物(基质)、生成物的分解或副反应，由此能够进一步享有本发明的第3反应的促进效果。
-第三发明组-
本发明的NMN的制造方法中，第三发明组包括下述工序：使转化体或它们的处理物至少与烟酰胺(NAM)接触，该转化体是对分类为(d)EC 3.5.1.42所示的EC编号的酶进行编码的基因、对分类为以下的(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上EC编号的酶进行编码的基因被破坏或缺失、并且烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体。
(a)EC 3.1.3.5
(c)EC 2.4.2.1
(g)EC 3.2.2.1
(h)EC 3.2.2.3
(i)EC 3.2.2.14
第三发明组的NMN的制造方法除了以下方面以外，与第一发明组同样地，通过依次进行第1工序、第2工序和第3工序来实施。即为以下方面：第1工序和第2工序为用于进行下述操作的工序，即用于调制对分类为各种EC编号的酶进行编码的基因被破坏或缺失、并且烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体或它们的处理物的工序；在第3工序中，使经过了这样的第1工序和第2工序的转化体或它们的处理物至少与NAM接触即可。
关于分类为各种EC编号的酶，如上所述。在使用大肠杆菌等的转化体或它们的处理物来合成NMN的情况下，这些酶成为将生成的NMN分解，结果使NMN的生产量降低的原因。作为宿主所具有的NMN的分解路径，已知产生NAM的分解路径、以及产生烟酸单核苷酸(NaMN)的分解路径这两条(图9)。本发明人等发现通过弱化这两条路径(将路径上编码某一个以上的酶的基因破坏或缺失)，从而与弱化一条路径相比，能够飞跃性地抑制NMN的分解，由此完成第三发明组。
为了弱化由NMN产生NaMN的分解路径，如图9所示那样，只要使对分类为(d)EC3.5.1.42所示的EC编号的酶进行编码的基因破坏或缺失即可。
为了弱化由NMN产生NAM的分解路径，如图9所示那样，只要使对分类为以下(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上EC编号的酶进行编码的基因破坏或缺失即可。
(a)EC 3.1.3.5
(c)EC 2.4.2.1
(g)EC 3.2.2.1
(h)EC 3.2.2.3
(i)EC 3.2.2.14
由于是与NMN的分解直接相关的酶，因此优选使对分类为(a)EC 3.1.3.5或(i)EC3.2.2.14所示的EC编号的酶进行编码的基因破坏或缺失，更优选使对分类为(a)EC3.1.3.5所示的EC编号的酶进行编码的基因破坏或缺失。
使基因破坏或缺失的方法不受特别限定，如第一发明组的说明所记载那样。本发明的第三发明组也能够与本发明的第一和第二发明组的一者或两者整合，实施NMN的制造方法。
-第四发明组-
本发明的NMN的制造方法中，第四发明组中，能够使用于NMN的制造而在反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和成为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下。
迄今为止所描述的第1反应、第2反应和第3反应中的NMN的制造时需要ATP。即，第1反应中，伴随着由核糖生成R5P，ATP转变为ADP，因此每生成1摩尔的R5P，使用1摩尔的ATP。第2反应中，伴随着由R5P生成PRPP，ATP转变为AMP，因此每生成1摩尔的PRPP，使用1摩尔的ATP。第3反应中，由PRPP生成NMN时，其反应本身并不需要ATP。然而，如上述那样，Nampt具有ATP水解活性，通过ATP的水解Nampt被自磷酸化，酶学的参数、化学平衡在对于NMN生成而言有利的方向上发生变化。因此，在第3反应体系内充分地存在ATP的情况下，伴随着由PRPP生成NMN，实质上，每生成1摩尔的PRPP，使用1摩尔以上的ATP。即，在将R5P作为原料的第2反应和第3反应中的NMN的制造时，每生成1摩尔的NMN，使用合计2摩尔以上的ATP，在将核糖作为原料的第1反应、第2反应和第3反应中的NMN的制造时，每生成1摩尔的NMN，使用合计3摩尔以上的ATP。
由于ATP是昂贵的化合物，因此在要廉价地制造NMN的情况下，期望其使用量尽量少。在本发明的NMN的制造方法中，通过利用第四发明组，从而能够使用于NMN的制造而在反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和成为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下。
第四发明组的NMN的制造方法只要能够减少用于NMN制造而添加的ATP等的使用量，则能够使用任何方法来进行，例如，能够将以下所示的手段单独或适当组合来实施。
(1)ATP再生体系的结合
通过使能够将副生的ADP或AMP再生为ATP的体系至少与包含第2反应和第3反应的NMN生成反应体系进行结合，从而能够减少用于NMN制造而在反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和。作为ATP再生体系，只要是能够由AMP和ADP再生ATP的体系，则怎样的体系都可以，可举出例如将多磷酸作为磷酸源的使用Ppk的体系、将磷酸烯醇丙酮酸作为磷酸源的使用丙酮酸激酶的体系、将磷酸肌酸作为磷酸源的使用磷酸肌酸激酶的体系等，从磷酸源的成本的观点考虑，优选为将多磷酸作为磷酸源的使用Ppk的体系。结合有使用了多磷酸和Ppk的ATP再生体系的NMN生成反应具体而言，能够如第一发明组中的第3工序所记载那样来实施。
(2)PPase的共存
通过使PPase共存于NMN生成反应体系中，从而作为副产物的焦磷酸分解为磷酸，NMN生成方向的反应被促进，由此作为结果，能够减少用于NMN制造而在反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和。使PPase共存的NMN生成反应具体而言，能够如第二发明组所记载那样来实施。
(3)来源于细菌的Nampt的利用
作为催化第3反应的酶Nampt，通过使用来源于细菌的Nampt，从而有效率地进行NMN的生成，作为结果，能够减少用于NMN制造而在反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和。作为来源于细菌的Nampt，能够利用第一发明组中的第1工序中所记载的Nampt。
(4)使无用基因破坏或缺失的宿主的利用
在使用转化体、由转化体调制的休止菌体、膜透过性提高菌体、灭活菌体、破碎菌体、由破碎菌体调制的无细胞提取物以及对于它们进行了稳定化处理的稳定化处理物进行NMN的生成反应的情况下，能够使用使反应物(基质)、生成物的分解、或使成为副反应的原因的基因破坏或缺失了的宿主。具体而言，能够使用使第一发明组中的第1工序所记载的基因的任意一个以上破坏或缺失了的宿主。优选能够使用使第三发明组所记载的基因破坏或缺失了的宿主。
(5)适当的基质浓度
从化学平衡、酶的基质亲和性的观点考虑，通过提高反应体系内的核糖、NAM浓度，从而能够期待NMN生成速度、生成量的提高，作为结果，能够减少用于NMN制造而在反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和。另一方面，ATP也通过提高反应体系内的浓度，从而能够期待同样的效果，但即使将ATP添加至需要以上，如果没有与其相称的NMN生成量的增加，则用于生成1摩尔NMN的ATP的摩尔数会增加。即，通过在反应体系中添加适当的量的ATP，从而能够有效率地制造NMN。反应体系中添加的ATP的摩尔数优选为生成的NMN的摩尔数的1当量以下，更优选为0.5当量以下，进一步优选为0.1当量以下。
本发明的第四发明组也能够整合本发明的第一、第二和第三发明组的一种或两种以上，实施NMN的制造方法。
实施例
[实施例1]＜利用ATP再生体系由核糖合成NMN＞
本实施例中，作为规定的各种酶，使用下述酶。
Nampt：来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(AAR87771)
Prs：来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)(BAA05286)、来源于智人(Homosapiens)(NP_002755)
Ppk(Ppk2类别3)：来源于抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)(NP293858)
Rbk：来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(P25332)
(1)表达质粒的制作
将各种酶的表达质粒如以下那样进行制作。关于来源于表1的“来源”所记载的生物种类的各种酶，合成编码各种酶蛋白质的DNA(由表1的“碱基序列”所记载的各序列号所示的碱基序列形成)，该各种酶蛋白质由同表中的“氨基酸序列”所记载的各序列号所示的氨基酸序列形成，将该DNA分别克隆至表达载体pET-26b(+)(Novagen)的NdeI-XhoI位点(基因合成用GenScript Japan来实施，对于大肠杆菌表达用途将密码子优化)。将所得的各质粒如表1的“表达质粒”所示那样进行命名。
[表1]
(2)各种酶的表达被强化而得的转化体的制作
将大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)株的感受态细胞(Zip Competent Cell BL21(DE3)，Funakoshi)在冰上熔化，将由(1)制作的各质粒DNA溶液进行混合并在冰上静置10分钟。在42℃施加45秒热休克之后，再次用冰冷却，添加SOC培养基。在37℃进行振荡培养1小时之后，涂布于LB琼脂培养基(含有卡那霉素硫酸盐50mg/L)，在37℃进行静置培养一晚。将所得的菌落设为各种酶的表达被强化而得的重组体。
(3)重组体的培养
将各种酶的表达被强化而得的重组体的菌落接种于按照附带的实验方法添加有过夜表达自诱导系统(Overnight Express Autoinduction system)1(Merck)的LB培养基(包含卡那霉素硫酸盐50mg/L)2ml。在温度37℃，以振荡转数200rpm进行3小时培养之后，变更为温度17℃，振荡转数200rpm，进一步进行18小时培养。
(4)无细胞提取物的调制
将由(3)获得的培养液进行离心分离(5,000×g，10分钟)，将上清液废弃。向沉淀的菌体中，添加50mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)，进行调整以使波长630nm的浊度成为10。然而，对于Prs表达菌体，使用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)来进行。将缓冲菌体悬浮液0.5ml用Bioruptor(COSMO BIO)破碎15分钟。将破碎液进行离心分离(5,000×g，10分钟)，将所得的上清液设为无细胞提取物。无细胞提取物的蛋白质浓度是以BSA(牛血清白蛋白，Bio-Rad)作为标准蛋白质、使用Bio-Rad蛋白质分析(Bio-Rad protein assay)(Bio-Rad)进行测定。
(5)NMN合成反应
使用由(4)调制的无细胞提取物进行NMN合成反应。将反应液量设为100μL，以表2(No.1-2、1-4)所示的组成调制各反应液，在37℃进行静置反应。
[表2]
反应刚开始后(0小时后)、3小时后和6小时后，取样反应液各10μL。将取样的反应液与(6)所记载的HPLC流动相90μL进行混合，立即用冰冷却，从而停止反应。将稀释液用超滤膜(Centricut Ultramini，截留分子量10,000，Kurabo)过滤(5,000×g，10分钟)，将滤液用HPLC进行分析。
(6)NMN的分析
NMN合成反应样品的分析通过HPLC按照以下的条件来进行。
柱：SUPELCOSIL LC-18-T(Sigma-Aldrich)
流动相：0.05M KH2PO4/K2HPO4(pH 7)
流速：1ml/min
检测：UV261nm
柱温度：30℃
(7)实验结果
将实验结果示于图2中。添加有Ppk的样品No.1-2和No.1-4中，分别确认到0.5mM、0.6mM的NMN的生成。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)是生成的NMN的摩尔数(0.05μmol，0.06μmol)的分别0.2当量、0.17当量。此外，确认到Prs即使为来源于枯草杆菌的Prs(BsPrs)、来源于智人的Prs(HsPrs)的任一者都生成NMN。由以上结果表明，通过使作为ATP再生酶的Ppk共存，从而能够由核糖有效率地合成NMN。
[比较例1]＜不利用ATP再生体系而由核糖合成NMN＞
(1)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
本比较例中，通过与实施例1(2)～(4)同样的操作，从而调制各种酶的无细胞提取物。
(2)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(1)获得的无细胞提取物，进行NMN合成反应和分析。使反应液量为100μL，以表2(No.1-1、1-3)所示的组成调制各反应液，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
(3)实验结果
将实验结果示于图2中。未添加Ppk的样品No.1-1和No.1-3中，NMN的生成为检测限以下。
[实施例2]＜利用冷冻保存的无细胞提取物进行的NMN的合成＞
(1)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
本实施例中，仅使用来源于枯草杆菌的Prs(BsPrs)作为Prs，除此以外，通过与实施例1(2)～(4)同样的操作，调制出各种酶的无细胞提取物。刚调制后，进行(2)中后述的NMN合成反应。此外，将所得的各无细胞提取物在-20℃保存。1个月后，使用保存的无细胞提取物，再次进行NMN合成反应。
(2)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(1)获得的刚调制后和保存1个月后(-20℃保存)的无细胞提取物，进行NMN合成反应和分析。将各反应液以表3所示的组成进行调制，以及在反应开始后6小时进行取样，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
[表3]
(3)实验结果
将无细胞提取物在-20℃保存而得的No.2-2与无细胞提取物刚调制后的样品No.2-1同样，反应6小时后确认到0.5mM的NMN生成。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.05μmol)的0.2当量。因此表明，通过冷冻保存，能够以具有NMN合成能力的状态，保存无细胞提取物。
[实施例3]＜利用Prs突变体的NMN的合成＞
本实施例中，作为规定的各种酶，使用下述酶。
Nampt：来源于杜克雷嗜血杆菌(AAR87771)
Prs：来源于枯草杆菌(BAA05286)Asn120Ser突变体(BsPrsN120S)和Leu135Ile突变体(BsPrsL135I)
Ppk(Ppk2类别3)：来源于抗辐射奇异球菌(NP_293858)
Rbk：来源于酿酒酵母(P25332)
BsPrsN120S和BsPrsL135I分别是第120号的天冬酰胺被取代成丝氨酸，第135号的亮氨酸被取代成异亮氨酸而成的。将来源于两突变体的生物种类、表示氨基酸序列的序列号、表示DNA的碱基序列的序列号、表达质粒名分别示于表4中。
[表4]
(1)Prs突变体表达质粒的制作
将表达Prs突变体的质粒如以下那样进行制作。将表1所记载的pEBsPrs作为模板，进行突变导入PCR反应。将突变导入用引物名以及表示该碱基序列的序列号、Prs突变体名示于表5中。
[表5]
突变导入PCR反应以表6所示的反应液组成和表7所示的反应条件来进行。
[表6]
[表7]
PCR反应结束后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)(QIAGEN)，按照附带的实验方法来精制PCR产物。使用将生成的PCR产物用DpnI(NewEngland Biolabs)进行了消化的反应液，转化大肠杆菌HST08(takara-bio)。由出现的菌落进行质粒提取，使用引物T7-PP(序列号19)和T7-TP(序列号20)来进行碱基序列的确认。将正确地导入有突变的各质粒设为表4所记载的各突变体Prs表达质粒。
(2)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
作为Prs，使用BsPrsN120S和BsPrsL135I，除此以外，通过与实施例1
(2)～(4)同样的操作，调制出各种酶的无细胞提取物。
(3)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(1)获得的无细胞提取物，进行NMN合成反应和分析。将各反应液以表8所示的组成进行调制，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
[表8]
(4)实验结果
将实验结果示于图3中。在使用BsPrsN120S和BsPrsL135I的情况下，显示反应6小时后比野生型高的NMN生成量。在没有添加Prs的情况下，没有确认到NMN的生成。由以上结果表明，通过使用Prs突变体，能够有效率地合成NMN。
[实施例4]＜基质浓度的研究＞
(1)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
本实施例中，作为Prs，使用实施例3记载的BsPrsN120S，除此以外，通过与实施例1(2)～(4)同样的操作，调制出各种酶的无细胞提取物。
(2)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(1)获得的无细胞提取物，进行NMN合成反应和分析。将各反应液以表9所示的组成进行调制，并且在反应开始后18小时进行取样，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
[表9]
*R表示核糖，N表示烟酰胺，数字表示终浓度(mM)。
(3)实验结果
将实验结果示于图4中。确认到多磷酸(Poly-P)浓度设定为5mM时与设定为10mM时相比，整体上NMN的生成量多。确认到在多磷酸浓度为5mM，且基质核糖浓度为30mM的情况下，与作为另一基质的烟酰胺浓度为6mM的情况(样品No.4-1、4-4)相比，浓度为20mM的情况下(样品No.4-2、4-5)，NMN生成量提高1.7倍以上。然而，几乎没有观察到由镁浓度带来的影响。另一方面，在将两基质以相同比率设为2倍浓度的情况下(样品No.4-3、4-6)，镁浓度10mM(样品No.4-3)时，NMN生成量限于稍微增加，而镁浓度20mM(样品No.4-6)时，NMN生成量增加，生成2.6mM。样品No.4-6中，添加的ATP的摩尔数(0.1μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.26μmol)的0.38当量。由以上结果表明，对于NMN的有效率的生成而言，适当地设定核糖、烟酰胺、多磷酸、镁的浓度是重要的。
[实施例5]＜使用了来源于细菌和来源于人的Nampt精制酶的NMN合成＞
本实施例中，作为规定的各种酶，使用下述酶。
Nampt：来源于杜克雷嗜血杆菌(AAR87771)的Nampt上带有His标签的Nampt(HdNampt-His)、来源于抗辐射奇异球菌(AE001890)的Nampt上带有His标签的Nampt(DrNampt-His)，来源于奥萘达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)(NP_717588)的Nampt上带有His标签的Nampt(SoNampt-His)和来源于智人(Homo sapiens)(NP_005737)的Nampt上带有His标签的Nampt(HsNampt-His)
Prs：来源于枯草杆菌(BAA05286)的Prs的Asn120Ser突变体(BsPrsN120S)
Ppk(Ppk2类别3)：来源于抗辐射奇异球菌(NP_293858)Ppk
Rbk：来源于酿酒酵母(P25332)Rbk
(1)带有His标签的Nampt表达质粒的制作
将表达来源于细菌的各种在Nampt上带有His标签的蛋白质的质粒如以下那样制作。首先，对于来源于抗辐射奇异球菌(AE001890)和来源于奥萘达湖希瓦氏菌(NP_717588)的各种酶，将对由表10中的“氨基酸序列”所记载的各序列号所示的氨基酸序列形成的各种酶蛋白质进行编码的DNA(由表10的“碱基序列”所记载的各序列号所示的碱基序列形成)进行合成，分别克隆至表达载体pET-26b(+)(Novagen)的NdeI-XhoI位点(基因合成用GenScript Japan来实施)。将所得的各质粒如表10的“表达质粒”所示那样进行命名。
[表10]
接着，将制作的pEDrNampt、pESoNampt和pEHdNampt(实施例1记载)作为模板，进行用于在Nampt上带有His标签的突变导入PCR反应。将模板质粒名、突变导入用引物名以及表示该碱基序列的序列号、带有His标签的Nampt表达质粒名示于表11中。
[表11]
带有His标签的Nampt表达质粒的制作使用表11所示的各种模板质粒和突变导入引物，除此以外，通过与实施例3(1)同样的操作，进行从突变导入PCR反应直至碱基序列的确认。将正确带有His标签的质粒设为表11所记载的各质粒。
(2)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
通过与实施例4(1)同样的操作，进行表达各种酶的重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制。然而，关于来源于细菌的Nampt，使用由(1)制作的带有His标签的表达质粒进行重组体的制作和培养，调制出包含带有His标签的Nampt的无细胞提取物。此时，作为将菌体进行悬浮的缓冲液，使用了50mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 8.0)。
(3)Nampt精制酶的调制
使用由(2)调制的包含来源于细菌的带有His标签的Nampt的无细胞提取物，通过固定化金属亲和色谱，进行带有His标签的Nampt的精制。将TALON金属亲和树脂(takara-bio)200μL采集至1.5ml管中，通过离心分离(5000g，2分钟)使树脂沉淀。丢弃上清液，添加蒸馏水1ml并进行悬浮之后，再次进行离心分离。将该一系列的洗涤操作合计进行两次之后，使用50mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 8.0)同样地进行两次洗涤。向洗涤后的树脂添加各个来源于细菌的带有His标签的Nampt的无细胞提取物1ml，在4℃平稳地振荡1小时。通过离心分离除去无细胞提取物之后，使用洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，pH7.0)进行两次洗涤。通过离心分离除去洗涤缓冲液之后，添加洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，150mM咪唑，pH7.0)100μL。通过离心分离回收上清液之后，再次添加洗脱缓冲液100μL。将该一系列的操作进行3次，混合所得的溶出液。将混合的溶出液加入至经煮沸洗涤的透析管(三光纯药)中，使用50mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)进行透析。将透析后的溶液回收，制成各个来源于细菌的带有His标签的Nampt的精制酶溶液。
(4)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(2)获得的Nampt以外的各种酶的无细胞提取物、以及Nampt精制酶进行NMN合成反应和分析。作为来源于细菌的Nampt精制酶，使用了由(3)调制的3种带有His标签的Nampt精制酶。作为来源于人的Nampt精制酶(HsNampt-His)，使用了市售的来源于人的带有His标签的Nampt精制酶(CY-E1251，MBL)。将各反应液以表12所示的组成进行调制，反应开始后12小时进行取样，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
[表12]
(5)实验结果
将实验结果示于图5中。在使用来源于细菌的Nampt(HdNampt-His，DrNampt-His，SoNampt-His)的情况下，由1.4mM生成2.4mM的NMN。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.14～0.24μmol)的0.042～0.071当量。另一方面，在使用来源于人的Nampt(HsNampt-His)的情况下，NMN的生成量为0.6mM。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.06μmol)的0.17当量。由以上结果表明，即使是来源于细菌或来源于人的Nampt，也能够进行NMN的合成，特别是通过使用来源于细菌的Nampt，能够有效率地合成NMN。
[实施例6]＜利用ATP再生体系由R5P合成NMN＞
(1)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
本实施例中，通过与实施例1(2)～(4)同样的操作，调制出各种酶的无细胞提取物。
(2)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(1)获得的无细胞提取物，进行NMN合成反应和分析。使反应液量为100μL，以表13(No.6-2)所示的组成调制各反应液，并且在反应刚开始后(0小时后)和6小时后进行取样，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
[表13]
(3)实验结果
将实验结果示于图6中。添加有Ppk的样品No.6-2中，确认到2.4mM的NMN的生成。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.24μmol)的0.042当量。由以上结果表明，通过使作为ATP再生酶的Ppk共存，能够由R5P有效率地合成NMN。
[比较例2]＜不利用ATP再生体系而由R5P合成NMN＞
(1)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
本比较例中，通过与实施例1(2)～(4)同样的操作，调制出各种酶的无细胞提取物。
(2)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(1)获得的无细胞提取物，进行NMN合成反应和分析。反应中将反应液量设为100μL，以表13(No.6-1)所示的组成调制各反应液，并且在反应刚开始后(0小时后)和6小时后进行取样，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
(3)实验结果
将实验结果示于图6中。未添加Ppk的样品No.6-1中，NMN的生成为检测限以下。
[实施例7]＜使用利用无用基因破坏宿主调制的无细胞提取液的NMN合成＞
(1)无用基因破坏宿主的制作
为了抑制作为反应物(基质)的NAM和作为生成物的NMN的分解或副反应，制作将编码成为分解、副反应原因的各种酶的基因破坏后的表14的宿主。
[表14]
无用基因破坏宿主的制作使用TargeTron基因敲除系统(Sigma-Aldrich)，基本上按照附带的实验方法进行。
·BN1株的制作
最初，将大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主，如以下那样进行制作ushA基因被破坏的BN1株。首先，使用序列号31(IBS引物)、序列号32(EBS1d引物)和序列号33(EBS2引物)所示的各引物和TargeTron基因敲除系统附带的EBS通用引物，以表15所示的反应液组成和表16所示的反应条件进行PCR。
[表15]
[表16]
PCR反应结束后，将反应液的3μL利用4％琼脂糖凝胶进行电泳，确认约350bpDNA片段的扩增。将剩余的PCR反应液通过QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行精制。向精制的PCR反应液8μL中添加103限制酶缓冲液(附带试剂盒)2μL，HindIII 1μL，BsrGI 1μL，灭菌水8μL。在37℃进行30分钟消化，接着在60℃进行30分钟消化，然后在80℃进行10分钟处理。将所得的消化产物3μL在60℃热处理30秒之后，在冰上冷却1分钟。添加pACD4K-C线性化载体(附带试剂盒)1μL、DNA连接试剂盒(Ligation Kit)＜Mighty Mix＞(takara-bio)4μL并混合之后，在16℃进行1小时连接反应。将连接反应液5μL与大肠杆菌JM109感受态细胞(Competent Cells)(takara-bio)50μL进行混合，在冰上静置30分钟。在42℃孵育45秒之后，再次在冰上静置5分钟。添加SOC培养基500μL，在37℃，以200rpm进行振荡培养1小时之后，适量涂布于LB琼脂培养基(含有氯霉素25μg/mL)。在37℃进行一晚培养之后，将生长的菌落接种于LB液体培养基(含有氯霉素25μg/mL)，在37℃、以200rpm进行振荡培养16小时。将培养液离心来回收菌体，使用QIAprep质粒小量提取试剂盒(QIAprep Spin MiniprepKit)(Qiagen)，按照附带的实验方法进行质粒提取。将所得的质粒DNA用HindIII进行消化后，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将确认到约7.7kbp的谱带的质粒作为pACD4K-C-ushA。
接着，为了制作不含卡那霉素抗性基因的ushA基因破坏用质粒，将pACD4K-C-ushA作为模板，使用序列号34(pACD4K-C-dKm-F2)和序列号35(pACD4K-C-dKm-R)所示的引物，以表17所示的反应液组成和表18所示的反应条件，进行PCR反应。另外，序列号34所示的引物使用了5’末端上被磷酸化修饰的引物。
[表17]
[表18]
PCR反应结束后，向反应液中添加1μL的DpnI(takara-bio)，在37℃进行1小时反应。在通过QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)精制得到的反应液2μL中，添加DNA连接试剂盒＜Mighty Mix＞(takara-bio)2μL进行混合之后，在16℃进行连接反应1小时。将连接反应液与大肠杆菌JM109感受态细胞(takara-bio)40μL进行混合，在冰上静置30分钟。在42℃孵育45秒之后，再次在冰上静置5分钟。添加SOC培养基500μL，在37℃、以200rpm进行振荡培养1小时，然后适量涂布于LB琼脂培养基(含有氯霉素25μg/mL)。在37℃进行培养一晚之后，将生长的菌落接种于LB液体培养基(含有氯霉素25μg/mL)，在37℃、以200rpm进行振荡培养16小时。将培养液进行离心以回收菌体，使用QIAprep质粒小量提取试剂盒(QIAprep SpinMiniprep Kit)(Qiagen)，按照附带的实验方法进行质粒提取。将所得的质粒DNA利用MluI消化后，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将确认到约6.3kbp的谱带的质粒设为pACD4K-C-ushAΔKm。
将1μL的pACD4K-C-ushAΔKm质粒溶液添加至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Biodynamics研究所)50μL中，在冰上静置10分钟。在42℃进行45秒热休克，再次在冰上静置5分钟。添加成为室温的SOC培养基450μL，在37℃、以200rpm进行振荡培养1小时。将振荡后的培养液100μL添加至3mL的LB液体培养基(含有1％葡萄糖、25μg/ml氯霉素)中，在37℃、以200rpm进行振荡培养一晚。将所得的培养液40μL添加至2mL的LB液体培养基(含有1％葡萄糖、25μg/ml氯霉素)中，在37℃继续培养直至OD600成为约0.2。在OD600成为约0.2之后，将10μL的100mM IPTG溶液添加至培养液中，在30℃、以200rpm进行振荡培养30分钟。然后，使用微离心机，以最大速度进行1分钟离心分离，将菌体再悬浮于1mL的LB液体培养基(含有1％葡萄糖，不含有氯霉素)。在30℃、以20rpm进行振荡培养1小时，然后，将100μL的培养液涂布于预先涂布有100μL的100mM IPTG溶液的LB琼脂平板，在30℃进行培养3天。对于出现的多个菌落，使用正向引物(序列号36)和反向引物(序列号37)，进行菌落PCR。反应液组成设为表19，反应条件设为表18。与原来的宿主(BL21(DE3))中约1.1kbp的谱带扩增相比，获得约1.8kbp的谱带扩增了的克隆。将该克隆作为ushA基因被破坏的宿主，设为BN1株。使用E.coli转化试剂盒，Mix&Go(ZYMO RESEARCH)，按照附带的实验方法，制作出BN1株的感受态细胞。
[表19]
·BN3株的制作
接着，将BN1株作为宿主，如以下那样制作pncA基因被破坏的BN3株。使用序列号38(IBS引物)、序列号39(EBS1d引物)和序列号40(EBS2引物)所示的各引物以及TargeTron基因敲除系统附带的EBS通用引物，以表15所示的反应液组成和表16所示的反应条件进行PCR。与BN1株制作时同样地，进行PCR反应液的精制、利用HindIII和BsrGI的限制性酶处理、与载体pACD4K-C的连接反应、大肠杆菌JM109的转化和质粒提取。将所得的质粒DNA用HindIII进行消化后，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将确认到约7.7kbp的谱带的质粒设为pACD4K-C-pncA。
制作不含卡那霉素抗性基因的pncA基因破坏用质粒。作为PCR反应时的模板，使用pACD4K-C-pncA，除此以外，通过与pACD4K-C-ushAΔKm制作时同样的操作来进行。将所得的质粒设为pACD4K-C-pncAΔKm。
将BN1株作为宿主，制作pncA基因被破坏的BN3株。作为基因破坏质粒，使用pACD4K-C-pncAΔKm，并且作为感受态细胞，使用BN1株感受态细胞，除此以外，通过与上述BN1株的制作同样的操作来制作。对于出现的多个菌落，使用正向引物(序列号41)和反向引物(序列号42)，进行菌落PCR。反应液组成设为表19，反应条件设为表18。
与原来的宿主(BL21(DE3))中约2.2kbp的谱带扩增相比，获得约2.9kbp的谱带扩增了的克隆。将该克隆作为ushA基因和pncA基因被破坏的宿主，设为BN3株。使用E.coli转化试剂盒，Mix&Go(ZYMO RESEARCH)，按照附带的实验方法，制作出BN3株的感受态细胞。
·BN6株的制作
接着，将BN3株作为宿主，如以下那样制作pncC基因被破坏的BN6株。使用序列号43(IBS引物)、序列号44(EBS1d引物)和序列号45(EBS2引物)所示的各引物、以及TargeTron基因敲除系统附带的EBS通用引物，以表15所示的反应液组成和表16所示的反应条件进行PCR。与BN1株制作时同样地，进行PCR反应液的精制、利用HindIII和BsrGI的限制性酶处理、与载体pACD4K-C的连接反应、大肠杆菌JM109的转化和质粒提取。将所得的质粒DNA用HindIII进行消化后，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将确认到约7.7kbp的谱带的质粒设为pACD4K-C-pncC。
制作出不含卡那霉素抗性基因的pncC基因破坏用质粒。作为PCR反应时的模板，使用pACD4K-C-pncC，除此以外，通过与pACD4K-C-ushAΔKm制作时同样的操作来进行。将所得的质粒设为pACD4K-C-pncCΔKm。
将BN3株作为宿主，制作出pncC基因被破坏的BN6株。作为基因破坏质粒，使用pACD4K-C-pncCΔKm，除此以外，通过与上述BN1株的制作同样的操作来制作。对于出现的多个菌落，使用正向引物(序列号46)和反向引物(序列号47)，进行菌落PCR。反应液组成设为表19，反应条件设为表18。
与原来的宿主(BL21(DE3))中约0.5kbp的谱带扩增相比，获得约1.2kbp的谱带扩增了的克隆。将该克隆作为ushA基因、pncA基因和pncC基因被破坏的宿主，制成BN6株。使用E.coli转化试剂盒，Mix&Go(ZYMO RESEARCH)，按照附带的实验方法，制作出BN6株的感受态细胞。
·BN8株的制作
接着，将BN6株作为宿主，如以下那样制作yrfG基因被破坏的BN8株。使用序列号48(IBS引物)、序列号49(EBS1d引物)和序列号50(EBS2引物)所示的各引物、以及TargeTron基因敲除系统附带的EBS通用引物，以表15所示的反应液组成和表16所示的反应条件进行PCR。与BN1株制作时同样地，进行PCR反应液的精制、利用HindIII和BsrGI的限制性酶处理、与载体pACD4K-C的连接反应、大肠杆菌JM109的转化和质粒提取。将所得的质粒DNA用HindIII进行消化后，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，将确认到约7.7kbp的谱带的质粒设为pACD4K-C-yrfG。
制作出不含卡那霉素抗性基因的yrfG基因破坏用质粒。作为PCR反应时的模板，使用pACD4K-C-yrfG，除此以外，通过与pACD4K-C-ushAΔKm制作时同样的操作来进行。将所得的质粒设为pACD4K-C-yrfGΔKm。
将BN6株作为宿主，制作出yrfG基因被破坏的BN8株。作为基因破坏质粒，使用pACD4K-C-yrfGΔKm，并且作为感受态细胞，使用BN6株感受态细胞，除此以外，通过与上述BN1株的制作同样的操作来制作。对于出现的多个菌落，使用正向引物(序列号51)和反向引物(序列号52)，进行菌落PCR。反应液组成设为表19，反应条件设为表18。
与原来的宿主(BL21(DE3))中约0.4kbp的谱带扩增相比，获得约1.1kbp的谱带扩增了的克隆。将该克隆作为ushA基因、pncA基因、pncC基因和yrfG基因被破坏的宿主，设为BN8株。使用E.coli转化试剂盒，Mix&Go(ZYMO RESEARCH)，按照附带的实验方法，制作出BN8株的感受态细胞。
(2)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
本实施例中，作为Prs，使用实施例3记载的BsPrsN120S，并且作为酶表达的宿主，使用本实施例(1)记载的BN3株和BN8株，除此以外，通过与实施例1(2)～(4)同样的操作，调制出各种酶的无细胞提取物。
(3)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(1)获得的无细胞提取物，进行NMN合成反应和分析。将各反应液以表20所示的组成进行调制，并且在反应刚开始后(0小时后)、6小时后以及24小时后进行取样，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
[表20]
(4)实验结果
将实验结果示于图7中。在反应6小时的时刻，在使用将通常的BL21(DE3)作为宿主而调制的无细胞提取液的情况下(样品No.7-1)，确认到1.9mM的NMN的生成。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.19μmol)的0.052当量。另一方面，在使用将破坏了ushA基因和pncA基因的BN3株作为宿主而调制的无细胞提取液的情况下(样品No.7-2)，确认到2.3mM的NMN的生成。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.23μmol)的0.043当量。在使用将破坏了ushA基因、pncA基因、pncC基因和yrfG基因的BN8株作为宿主而调制的无细胞提取液的情况下(样品No.7-3)，也同样地确认到2.3mM的NMN的生成。添加的ATP的摩尔数(0.01μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.23μmol)的0.043当量。即，可知在NMN的生成进行的阶段，使用将BN3株和BN8株作为宿主而调制的无细胞提取液的情况与使用将BL21(DE3)作为宿主而调制的无细胞提取液的情况相比，NMN的生产量提高。
进一步，在反应24小时的时刻，在使用将BL21(DE3)和BN3株作为宿主而调制的无细胞提取液的情况下(样品No.7-1、No.7-2)，不能检测到NMN。在使用将BN8株作为宿主而调制的无细胞提取液的情况下(样品No.7-3)，残存2.0mM的NMN。即，可知在NMN一定量生成之后的阶段，与将BL21(DE3)和BN3株作为宿主而调制的无细胞提取液相比，使用将BN8作为宿主而调制的无细胞提取液的情况下，生成的NMN的分解被显著地抑制。然而，在NMN的分解进行之前的时刻(例如6小时)，如果进行适当地回收生成的NMN的工序，则即使在使用来源于任一宿主的无细胞提取液的情况下，也能够适当地取得生成的NMN。
[实施例8]＜使用PPase的精制酶的NMN合成＞
本实施例中，作为规定的各种酶，使用下述酶。
Nampt：来源于杜克雷嗜血杆菌(AAR87771)的Nampt上带有His标签的Nampt(HdNampt-His)
Prs：来源于枯草杆菌(BAA05286)Prs的Asn120Ser突变体上带有His标签的Prs(BsPrsN120S-His)
Ppk(Ppk2类别3)：来源于抗辐射奇异球菌(NP_293858)的Ppk上带有His标签的Ppk(DrPpk-His)
Rbk：来源于酿酒酵母(P25332)的Rbk上带有His标签的Rbk(ScRbk-His)
(1)带有His标签的Prs、Ppk和Rbk表达质粒的制作
如以下那样制作表达Prs、Ppk和Rbk上带有His标签的蛋白质的质粒。将由实施例3制作的pEBsPrsN120S、由实施例1制作的pEDrPpk和pEScRbk作为模板，进行用于在各种酶上添加His标签的突变导入PCR反应。将模板质粒名、突变导入用引物名以及表示该碱基序列的序列号、带有His标签的酶表达质粒名示于表21中。
[表21]
带有His标签的酶表达质粒的制作使用表21所示的各种模板质粒和突变导入引物，除此以外，通过与实施例3(1)同样的操作，进行从突变导入PCR反应直至碱基序列的确认。将正确带有His标签的质粒设为表21所记载的各质粒。
(2)重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制
使用上述(1)中带有His标签的酶表达质粒，通过与实施例4(1)同样的操作，进行重组体的制作、培养和无细胞提取物的调制。此时，作为将菌体进行悬浮的缓冲液，除了BsPrsN120S-His以外，使用了50mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 8.0)。然而，关于BsPrsN120S-His，使用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)来进行。
(3)精制酶的调制
使用由(2)调制的包含带有His标签的酶的无细胞提取物，与实施例5
(3)同样地，通过固定化金属亲和色谱，进行各个带有His标签的酶的精制。然而，关于BsPrsN120S-His，使用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)进行透析。
(4)NMN合成反应、NMN的分析
使用由(3)获得的各种精制酶，在PPase(来源于酵母，Sigma-Aldrich公司，制品编号10108987001)的存在下或不存在下，进行NMN合成反应和分析。将各反应液以表22所示的组成进行调制，在反应刚开始后(0小时后)、6小时后、24小时后和48小时后进行取样，除此以外，与实施例1(5)和(6)同样地进行。
[表22]
(5)实验结果
将实验结果示于图8中。在仅第3反应的情况下，添加有PPase时(样品No.8-1)，反应48小时生成4.0mM的NMN。添加的ATP的摩尔数(0.1μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.40μmol)的0.25当量。另一方面，在没有添加PPase的情况下(样品No.8-2)，生成0.52mM的NMN。添加的ATP的摩尔数(0.1μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.052μmol)的1.9当量。在第2反应+第3反应的情况下，添加有PPase时(样品No.8-3)，反应48小时生成4.1mM的NMN。添加的ATP的摩尔数(0.1μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.41μmol)的0.24当量。另一方面，在没有添加PPase的情况下(样品No.8-4)，生成0.34mM的NMN。添加的ATP的摩尔数(0.1μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.034μmol)的2.9当量。进一步，在第1反应+第2反应+第3反应的情况下，添加有PPase时(样品No.8-5)，反应48小时生成3.6mM的NMN。添加的ATP的摩尔数(0.1μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.36μmol)的0.28当量。另一方面，在没有添加PPase的情况下(样品No.8-6)，生成0.25mM的NMN。添加的ATP的摩尔数(0.1μmol)为生成的NMN的摩尔数(0.025μmol)的4.0当量。由以上结果表明，通过向精制酶反应体系中添加PPase，从而能够有效率地合成NMN。
序列表自由文本
序列号15：Prs突变体BsPrsN120S的突变导入用引物(正向)
序列号16：Prs突变体BsPrsN120S的突变导入用引物(反向)
序列号17：Prs突变体BsPrsL135I的突变导入用引物(正向)
序列号18：Prs突变体BsPrsL135I的突变导入用引物(反向)
序列号19：引物T7-PP
序列号20：引物T7-TP
序列号25：带有His标签的Nampt表达质粒pEHdNampt-His的突变导入用引物(正向)
序列号26：带有His标签的Nampt表达质粒pEHdNampt-His的突变导入用引物(反向)
序列号27：带有His标签的Nampt表达质粒pEDrNampt-His的突变导入用引物(正向)
序列号28：带有His标签的Nampt表达质粒pEDrNampt-His的突变导入用引物(反向)
序列号29：带有His标签的Nampt表达质粒pESoNampt-His的突变导入用引物(正向)
序列号30：带有His标签的Nampt表达质粒pESoNampt-His的突变导入用引物(反向)
序列号31：ushA用IBS引物
序列号32：ushA用EBS1d引物
序列号33：ushA用EBS2引物
序列号34：pACD4K-C-ushAΔKm调制用引物(正向)
序列号35：pACD4K-C-ushAΔKm调制用引物(反向)
序列号36：ushA基因破坏检测用引物(正向)
序列号37：ushA基因破坏检测用引物(反向)
序列号38：pncA用IBS引物
序列号39：pncA用EBS1d引物
序列号40：pncA用EBS2引物
序列号41：pncA基因破坏检测用引物(正向)
序列号42：pncA基因破坏检测用引物(反向)
序列号43：pncC用IBS引物
序列号44：pncC用EBS1d引物
序列号45：pncC用EBS2引物
序列号46：pncC基因破坏检测用引物(正向)
序列号47：pncC基因破坏检测用引物(反向)
序列号48：yrfG用IBS引物
序列号49：yrfG用EBS1d引物
序列号50：yrfG用EBS2引物
序列号51：yrfG基因破坏检测用引物(正向)
序列号52：yrfG基因破坏检测用引物(反向)
序列号53：带有His标签的Nampt表达质粒pEBsPrsN120S-His的突变导入用引物(正向)
序列号54：带有His标签的Nampt表达质粒pEBsPrsN120S-His的突变导入用引物(反向)
序列号55：带有His标签的Nampt表达质粒pEDrPpk-His的突变导入用引物(正向)
序列号56：带有His标签的Nampt表达质粒pEDrPpk-His的突变导入用引物(反向)
序列号57：带有His标签的Nampt表达质粒pEScRbk-His的突变导入用引物(正向)
序列号58：带有His标签的Nampt表达质粒pEScRbk-His的突变导入用引物(反向)。

Claims (7)

1.一种烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，其包括下述工序：在焦磷酸酶(PPase)的存在下，使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体、表达所述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与烟酰胺(NAM)及磷酸核糖焦磷酸(PRPP)接触。
2.根据权利要求1所述的NMN的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。
3.根据权利要求1或2所述的NMN的制造方法，所述处理物为精制酶。
4.一种NMN的制造方法，其包括下述工序：
使转化体或它们的处理物至少与烟酰胺(NAM)接触，所述转化体是对分类为(d)EC3.5.1.42所示的EC编号的酶进行编码的基因和对分类为以下(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上EC编号的酶进行编码的基因被破坏或缺失、并且烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体，
(a)EC 3.1.3.5
(c)EC 2.4.2.1
(g)EC 3.2.2.1
(h)EC 3.2.2.3
(i)EC 3.2.2.14。
5.根据权利要求1或4中任一项所述的NMN的制造方法，反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下。
6.一种NMN的制造方法，其是烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)及磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达所述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(R5P)、烟酰胺(NAM)及ATP接触，
反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下。
7.根据权利要求6所述的NMN的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(Rbk)的表达被强化而得的转化体、表达所述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液或它们的处理物与核糖及ATP接触来制造所述R5P。
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