JP2023553990A - Ｓ－メチルチオリボースキナーゼポリペプチドならびにｓ－メチルチオリボースキナーゼポリペプチドの製造方法および使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、天然に存在する野生型ＭＴＲキナーゼポリペプチドと比較して改善された特性（Ｄ－リボースおよび５’－Ｄ－イソブチリルリボースをリン酸化してアルファ－Ｄ－リボース－１－ホスファートおよびアルファ５’－Ｄ－イソブチリルリボース－１－ホスファートを生成する能力を含む）を有するＭＴＲキナーゼポリペプチドを提供する。ＭＴＲキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＭＴＲキナーゼポリペプチドを発現しうる宿主細胞、ならびにアルファ－Ｄ－リボース－１－ホスファートおよびアルファ５’－Ｄ－イソブチリルリボース－１－ホスファートを合成するためのＭＴＲキナーゼポリペプチドの使用方法も提供する。

Description

本開示は、生体触媒プロセスおよび合成プロセスにおいて有用なＳ－メチルチオリボースキナーゼポリペプチドに関する。そのような酵素は、５’－アシルもしくはアルキル基を含有するリボヌクレオシドの製造の一部として、またはそのようなリボヌクレオシドの製造中に生成される中間体の製造の一部として使用されうる合成プロセスにおいて、特に有用でありうる。

酵素は、生きた細胞の化学反応を（多くの場合、数桁）加速するように働くポリペプチドである。酵素がなければ、ほとんどの生化学反応は遅すぎて、生命過程を行うことすらできないであろう。酵素は大きな特異性を示し、反応へのその関与によって永久的に修飾されることはない。酵素は反応中に変化しないため、所望の化学変換のための触媒として費用効果的に使用されうる。

ＭＴＲキナーゼとしても公知であるＳ－メチルチオリボースキナーゼは、Ｓ－メチル－５－チオリボースの選択的１－リン酸化を触媒する特定のクラスの酵素であるリン酸化触媒である。これらの酵素の合成的応用は学術文献においてこれまでに報告されていない。ＭＴＲキナーゼクラスに属する酵素は、１－リン酸化糖の合成に有用であり、これは次いでヌクレオシドホスホリラーゼの作用によって対応ヌクレオシドに変換されうることが、本明細書において示される。ＭＴＲキナーゼは、ＡＴＰを使用してリボースおよびリボース類似体の１位を選択的にリン酸化しうる。酵素によるリン酸化は、ホスホリル供与体として作用しうる補因子、多くの場合には例えばＡＴＰのようなヌクレオチド三リン酸の関与を要する。

ＭＴＲキナーゼは、これまでのところ、限られた生化学的特徴付けの対象であるに過ぎない。例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ａ．Ｃｏｒｎｅｌｌら，３１７ ＢＩＯＣＨＥＭ．Ｊ．２８５－２９０（１９９６）；Ｔｏｓｈｉｈｉｒｏ Ｎａｋａｎｏら，７７（５）ＢＩＯＳＣＩ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．１１０４－１１０７（２０１３）；Ａｇｎｉｅｓｚｋａ Ｓｅｋｏｗｓｋａら，ＢＭＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ２００１，１：１５；Ａｎｄｒｅｚｅｊ Ｇｕｒａｎｏｗｓｋｉ，７１ ＰＬＡＮＴ ＰＨＹＳＩＯＬ．９３２－９３５（１９８３）；Ｓｈａｏ－Ｙａｎｇ Ｋｕら，ＡＣＴＡ ＣＲＹＳＴ．（２００４）Ｄ６０，１１６－１１９；Ｍａｒｇｒｅｔ Ｓａｕｔｅｒら，１３６ ＰＬＡＮＴ ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ ４０６１－６０７１（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００４）を参照されたい。バイオインフォマティクスによるアラインメントを用いて、この酵素ファミリーの追加的な推定メンバーを特定することが可能である。本明細書においては、合成における使用のためのこれらの酵素の有用性を実証する。

発明の概括
本開示は、特にヌクレオチド合成の一部として、リボースおよび５－イソブチリルリボースを対応１－ホスファートに変換しうるＭＴＲキナーゼであるポリペプチドに関する。実施形態においては、本明細書に記載されている主題のＭＴＲキナーゼは、リボースをリボース－１－ホスファートに、または５－イソブチリルリボースを５－イソブチリルリボース－１－ホスファートに変換しうる。特に、本明細書に記載されている主題のＭＴＲキナーゼは、例えばウリジン４－オキシム５’－（２－メチルプロパノアート）、および特に｛（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－［（４Ｚ）－４－（ヒドロキシイミノ）－２－オキソ－３，４ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル］オキソラン－２－イル｝メチル２－メチルプロパノアートのようなヌクレオシドの製造において有用でありうる。そのようなヌクレオシドは、生物学的に活性な化合物として、またはより複雑な生物学的に活性な化合物の合成の中間体として有用でありうる。

追加的な実施形態は主題のＭＴＲキナーゼの製造方法および主題のＭＴＲキナーゼの使用方法を記載する。

本開示の他の実施形態、態様および特徴は以下の説明、実施例および添付の特許請求の範囲において更に詳細に記載されており、またはそれらから明らかとなるであろう。

発明の詳細な説明
定義
特定の科学技術用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で特に示されていない限り、本明細書で用いる他の全ての科学技術用語は、本開示に関連する当業者によって一般に理解されている意味を有する。すなわち、本明細書中で用いる用語は、その各使用箇所に無関係に、その通常の意味を有する。それでも、特に示されていない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって以下の定義が適用される。化学名、一般名および化学構造は、同一構造を表すために互換的に用いられうる。化学構造と化学名との両方を用いて化合物が示されており、構造と名称との間に不明確さが存在する場合には、構造が優先される。特に示されていない限り、これらの定義は、用語が単独で用いられているか他の用語と組合せて用いられているかに無関係に適用される。したがって、「アルキル」の定義は「アルキル」、および「ヒドロキシアルキル」、「ハロアルキル」、「－Ｏ－アルキル」などの「アルキル」部分に適用される。

本明細書および本開示の全体で用いる以下の用語は、特に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。

添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、対応する複数対象物を含む。特に、単数形の項目（アイテム）のそれぞれは、一覧から選択される単一の項目、および一覧から選択される２以上の項目の混合物を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」に対する言及は複数のポリペプチドを含む。

本明細書中で用いる「少なくとも１つ」の項目または「１以上」の項目なる語のそれぞれは、一覧から選択される単一の項目、および一覧から選択される２以上の項目の混合物を含む。例えば、「少なくとも１つのＳ－メチル－５－チオリボースキナーゼポリペプチド」（あるいは「Ｓ－メチル－５－チオリボースキナーゼポリペプチド」、「少なくとも１つのＳ－メチル－５－チオリボースキナーゼ酵素」、「Ｓ－メチル－５－チオリボースキナーゼ酵素」、「少なくとも１つのＭＴＲキナーゼポリペプチド」、「ＭＴＲポリペプチド」、「少なくとも１つのＭＴＲキナーゼ」、「ＭＴＲキナーゼ」、「少なくとも１つのＭＴＲキナーゼ酵素」または「ＭＴＲキナーゼ酵素」とも称される）は、単一のＭＴＲキナーゼ、および２以上の異なるＭＴＲキナーゼの混合物を意味する。同様に、「少なくとも２つ」の項目および「２以上」の項目なる語のそれぞれは、一覧から選択される２つの項目の混合物、および一覧から選択される３以上の項目の混合物を含む。

本明細書および特許請求の範囲の全体において用いる「から本質的になる」、および「から本質的になり」または「から本質的になっており」のようなその変形は、任意の列挙されている要素または要素群の包含、および特定されている投与レジメン、方法または組成物の基本的または新規な特性を実質的に改変しない、列挙されている要素と類似または異なる性質の他の要素の随意的包含（すなわち、所望により包含されていてもよいこと）を示す。

本明細書および特許請求の範囲に全体における「含む」なる語、または「含み」もしくは「含んでおり」のような変形は、示されている整数または整数群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数群の除外を意味しないと理解される。「含む」、「含み」、「含んでおり」、「包含する」、「包含し」および「包含しており」なる語は交換可能であり、限定的であるとは意図されない。したがって、本明細書中で用いる「含む」およびその同族語はそれらの包括的な意味で用いられる（すなわち、「包含する」なる語およびその対応同族語と同意義である）。文脈によって特に要求されない限り、単数形の語は複数形を含むものとし、複数形の語は単数形を含むものとする。「例：」または「例えば」なる語に続くいずれの具体例も網羅的または限定的であるとは意図されない。本明細書において「含む」なる語で実施形態が記載されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」なる語で記載される、それ以外の点では同様の実施形態も提供されると理解される。

そうでないと明示されていない限り、本明細書中で挙げられている全ての範囲は包括的である。すなわち、範囲は範囲の上限および下限の値ならびにそれらの間の全ての値を含む。全ての範囲は、必ずしも明示的に記載されているわけではない含まれる全ての部分的範囲をも含むと意図される。例えば、本明細書に記載されている温度範囲、比率、当量の範囲などは範囲の上限および下限ならびにそれらの間の連続的な任意の値を含む。本明細書に記載されている数値および「約」なる語の使用は±１％、±２％、±３％、±４％、±５％および±１０％の変動ならびにそれらの数的同等物を含みうる。「約」なる語は特定の値に関する許容誤差を意味し、これは、幾つかの場合には、０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％を意味する。幾つかの場合には、「約」は、与えられた値の１、２、３または４標準偏差内を意味する。数値で定義されたパラメーターを修飾するために用いられる場合の「約」は、該パラメーターが、そのパラメーターに関する示されている数値の上下に１０％も変動しうることを意味し、適切な場合には、示されているパラメーターは最も近い整数に丸められうる。例えば、約５ｍｇの量は４．５ｍｇと５．５ｍｇとの間で変動しうる。また、本明細書中で用いる「または」なる語は、適切な場合に組合されうる選択肢を示す。すなわち、「または」なる語は、列挙されている個別の各選択肢およびそれらの組合せを含む。

「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化など）には無関係に、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸の重合体を示すために本明細書において互換的に用いられる。

本明細書に開示されているポリペプチドに関して用いる「アミノ酸」または「残基」は或る配列位置における特定の単量体を意味する。アミノ酸は、本明細書においては、それらの一般に公知である三文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されている一文字記号のいずれかにより示される。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に受け入れられている一文字コードにより示されうる。

遺伝的にコードされるアミノ酸に関して用いる略語は通常のものであり、以下のとおりである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。

遺伝的にコードされるヌクレオシドに関して用いる略語は通常のものであり、以下のとおりである：アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）およびウリジン（Ｕ）。特に示されていない限り、略記されているヌクレオシドはリボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかでありうる。ヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかとして、個別に又は集合体として特定されうる。核酸配列が一文字略語の文字列として表されている場合、配列は、一般的な慣例に従い、５’から３’への方向で示され、ホスファートは示されない。

ＭＴＲキナーゼポリペプチドに関して本明細書中で用いる「に由来」は、由来する元のＭＴＲキナーゼポリペプチド、および／またはＭＴＲポリペプチドが基づいているそのようなＭＴＲキナーゼポリペプチドをコードする遺伝子を示す。例えば、配列番号７のＭＴＲキナーゼは、配列番号１のＭＴＲポリペプチドをコードする遺伝子を複数世代にわたって人工的に進化させることにより得られた。したがって、この進化したＭＴＲキナーゼポリペプチドは配列番号１のＭＴＲキナーゼ「に由来」する。

「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１７９：１２５－１４２）の標準化コンセンサス疎水性スケールにおいて０未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸には、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ－Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ－Ａｒｇ（Ｒ）が含まれる。

「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチド内に含まれる場合に約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失ゆえに生理的ｐＨにおいて負荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸には、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が含まれる。

「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチド内に含まれる場合に約６より大きいｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合ゆえに生理的ｐＨにおいて正荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸には、Ｌ－Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ－Ｌｙｓ（Ｋ）が含まれる。

「極性アミノ酸または残基」は、２つの原子により共有される電子対がそれらの原子のうちの１つによってより強固に保持されている少なくとも１つの結合を有し生理的ｐＨにおいて非荷電である側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる極性アミノ酸には、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ－Ｔｈｒ（Ｔ）が含まれる。

「無極性アミノ酸または残基」は、２つの原子により共有される電子対がそれらの２つの原子のそれぞれによって概ね同等に保持されている結合を有する側鎖を有し（すなわち、側鎖は極性ではない）生理的ｐＨにおいて非荷電である側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる無極性アミノ酸には、Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ－Ａｌａ（Ａ）が含まれる。

「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１７９：１２５－１４２）の標準化コンセンサス疎水性スケールにおいて０を超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸には、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が含まれる。

「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香環またはヘテロ芳香環を含む側鎖を有する親水性または疎水性のアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸には、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）およびＬ－Ｔｒｐ（Ｗ）が含まれる。Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）ヒスチジンは本明細書においては親水性残基または拘束残基としても分類される。

本明細書中で用いる「拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）アミノ酸または残基」は、拘束された幾何学的形状を有するアミノ酸または残基を意味する。この場合、拘束残基には、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ－Ｈｉｓ（Ｈ）が含まれる。ヒスチジンが拘束幾何学的形状を有するのは、それが比較的小さなイミダゾール環を有するからである。プロリンが拘束幾何学的形状を有するのは、それも５員環を有するからである。

本明細書中で用いる「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸には、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ－Ｉｌｅ（Ｉ）が含まれる。

Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）（およびＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が還元型遊離ＳＨまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれとしてペプチド内に存在しうるかは、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに正味の疎水性を付与するのか親水性を付与するのかに影響を及ぼす。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの標準化コンセンサススケール（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，前掲）において０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的においては、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）はそれ自身の特有のグループに分類されると理解されるべきである。システイン（または「Ｌ－Ｃｙｓ」または「［Ｃ］」）は、それが他のＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成しうる点で、特異であることに注目すべきである。「システイン様残基」には、システイン、およびジスルフィド架橋の形成に利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸が含まれる。

本明細書中で用いる「小さなアミノ酸または残基」は、合計３個以下の炭素および／またはヘテロ原子（α炭素および水素を除く）から構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。小さなアミノ酸または残基は、前記の定義に従い、脂肪族、無極性、極性または酸性の小さなアミノ酸または残基として更に分類されうる。遺伝的にコードされる小さなアミノ酸には、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が含まれる。

「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（－ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を意味する。遺伝的にコードされるヒドロキシル含有アミノ酸には、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が含まれる。

本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互いに共有結合している２以上のヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、全体がリボヌクレオチドから構成されていること（すなわち、ＲＮＡ）、全体が２’デオキシリボヌクレオチドから構成されていること（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオチドと２’デオキシリボヌクレオチドとの混合物から構成されていることが可能である。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル結合により互いに連結されるが、ポリヌクレオチドは１以上の非標準的な結合を含みうる。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であることが可能であり、あるいはポリヌクレオチドは一本鎖領域と二本鎖領域との両方を含むことが可能である。更に、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード化核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、それは１以上の修飾および／または合成核酸塩基、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含みうる。幾つかの実施形態においては、そのような修飾または合成核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。

本明細書中で用いる「ヌクレオシド」は、核酸塩基（すなわち、窒素含有塩基）と５炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）とを含むグリコシルアミンを意味する。ヌクレオシドの非限定的な例には、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが含まれる。これに対して、「ヌクレオチド」なる語は、核酸塩基、５炭素糖および１以上のホスファート基を含むグリコシルアミンを意味する。幾つかの実施形態においては、ヌクレオシドはキナーゼによりリン酸化されて、ヌクレオチドを生成しうる。

本明細書中で用いる「ヌクレオシド二リン酸」は、核酸塩基（すなわち、窒素含有塩基）、５炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）およびジホスファート（二リン酸）（すなわち、ピロホスファート）部分を含むグリコシルアミンを意味する。本明細書における幾つかの実施形態においては、「ヌクレオシド二リン酸」は「ＮＤＰ」と略称される。ヌクレオシド二リン酸の非限定的な例には、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）およびイノシン二リン酸（ＩＤＰ）が含まれる。「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」なる語は幾つかの文脈においては互換的に用いられうる。

本明細書中で用いる「ヌクレオシド三リン酸」は、核酸塩基（すなわち、窒素含有塩基）、５炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）およびトリホスファート（三リン酸）部分を含むグリコシルアミンを意味する。本明細書における幾つかの実施形態においては、「ヌクレオシド三リン酸」は「ＮＴＰ」と略称される。ヌクレオシド三リン酸の非限定的な例には、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）およびイノシン三リン酸（ＩＴＰ）が含まれる。「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」なる語は幾つかの文脈においては互換的に用いられうる。

本明細書中で用いる「保存的アミノ酸置換」は、ある残基を、類似側鎖を有する異なる残基で置換することを意味し、したがって、典型的には、ポリペプチド内のアミノ酸を、同一または類似の定められたアミノ酸クラス内のアミノ酸で置換することを含む。限定的なものではないが例えば、幾つかの実施形態においては、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換され、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）で置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）で置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）で置換され、および／または、疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置換される。

本明細書中で用いる「非保存的置換」は、ポリペプチド内のアミノ酸を、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸で置換することを意味する。非保存的置換は、定められたグループ内ではなく、定められたグループ間のアミノ酸を用いることが可能であり、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンからプロリンへの置換）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。限定的なものではないが例えば、代表的な非保存的置換は、酸性アミノ酸から塩基性または脂肪族アミノ酸への置換、芳香族アミノ酸から小さなアミノ酸への置換、および親水性アミノ酸から疎水性アミノ酸への置換でありうる。

本明細書中で用いる「欠失」は、参照ポリペプチドからの１以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの修飾を意味する。欠失は、酵素活性を保持しつつ及び／又は進化した酵素の改善された特性を保持しつつ、参照酵素を構成する１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸または２０以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の最大１０％またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含みうる。欠失はポリペプチドの内部部分および／または末端部分に導入されうる。種々の実施形態においては、欠失は連続的セグメントを含むことが可能であり、あるいは不連続でありうる。欠失は、典型的には、アミノ酸配列において「－」により示される。

本明細書中で用いる「挿入」は、参照ポリペプチドと比較した場合の１以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの修飾を意味する。挿入はポリペプチドの内部部分またはカルボキシもしくはアミノ末端に存在しうる。本明細書中で用いる挿入は、当技術分野で公知の融合タンパク質を含みうる。挿入はアミノ酸の連続的セグメントであることが可能であり、あるいは、天然に存在するポリペプチドにおけるアミノ酸の１以上により分離されていることが可能である。

「アミノ酸置換セット」または「置換セット」なる語は、参照配列と比較した場合のポリペプチド配列におけるアミノ酸置換の一群を意味する。置換セットは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上のアミノ酸置換を有しうる。

「機能的断片」および「生物活性断片」は本明細書において互換的に用いられ、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端の欠失ならびに／または内部欠失を有するが全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドであって、残りのアミノ酸配列が、それが比較されている配列における対応位置と同一である、ポリペプチドを意味する。

本明細書中で用いる「単離されたポリペプチド」は、それに天然で付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを意味する。この用語は、天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内のもの、またはインビトロ合成によるもの）から取り出された又は精製されたポリペプチドを含む。組換えＭＴＲキナーゼポリペプチドは細胞内に存在すること、細胞培地内に存在することが可能であり、あるいは例えばライセートまたは単離された調製物のような種々の形態で調製されうる。したがって、幾つかの実施形態においては、組換えＭＴＲキナーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドでありうる。

本明細書中で用いる「実質的に純粋なポリペプチド」または「精製されたタンパク質」は、ポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モルまたは重量ベースで、それは組成物中のいずれの他の個々の高分子種よりも豊富に存在する）、組成物を意味し、目的の種が、存在する高分子種の少なくとも約５０％（モルまたは％重量）を構成する場合、概ね実質的に精製された組成物である。しかし、幾つかの実施形態においては、ＭＴＲキナーゼ含有組成物は、５０％未満（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％）の純度のＭＴＲキナーゼを含む。一般に、実質的に純粋なＭＴＲキナーゼ組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上および約９８％以上（モルまたは重量％）を構成する。幾つかの実施形態においては、目的の種は、本質的に均一になる（すなわち、通常の検出方法によっては組成物中で夾雑種が検出され得ない）まで精製され、この場合、組成物は単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）および元素イオン種は高分子種とは見なされない。幾つかの実施形態においては、単離された組換えＭＴＲキナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。

「改善された酵素特性（酵素特性の改善）」は、参照ＭＴＲキナーゼと比較した場合にいずれかの酵素特性の改善を示すＭＴＲキナーゼに関するものである。本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼに関しては、比較は一般に野生型ＭＴＲキナーゼポリペプチドに対して行われるが、幾つかの実施形態においては、参照ＭＴＲキナーゼは別の改善されたＭＴＲキナーゼでありうる。改善が望ましい酵素特性には、酵素活性（これは基質の変換率として表されうる）、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子要求性、インヒビターに対する不応性（例えば、生成物阻害）、立体特異性および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

「増強された酵素活性（酵素活性の増強）」は、参照ＭＴＲキナーゼと比較した場合の、比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質から生成物への変換率（例えば、特定された量のＭＴＲキナーゼを使用した場合の、特定された時間内の出発量の基質から生成物への変換率）の増加により表されうる、ＭＴＲキナーゼの改善された特性を意味する。酵素活性を決定するための代表的な方法は実施例に記載されている。Ｋ_ｍ、Ｖ_ｍａｘまたはｋ_ｃａｔ（それらの変化は酵素活性の増強につながりうる）の古典的な酵素特性を含む、酵素活性に関連するいずれかの特性が影響を受けうる。酵素活性の改善は対応野生型ＭＴＲキナーゼポリペプチドの酵素活性の約１．５倍、ないし、天然に存在するＭＴＲキナーゼの、またはＭＴＲキナーゼポリペプチドが由来する別のＭＴＲキナーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍、３０００倍、５０００倍、７０００倍またはそれ以上の酵素活性でありうる。特定の実施形態においては、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは、親ＭＴＲキナーゼポリペプチドの場合の１５０～３０００倍、３０００～７０００倍、または７０００倍を超える範囲の酵素活性の改善を示す。任意の酵素の活性は拡散によって制限され、触媒代謝回転速度は、要求される補因子を含む基質の拡散速度を超えることができない、と当業者に理解される。拡散限界の理論上の最大値またはｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍは、一般に、約１０^８～１０^９（Ｍ^－１ｓ^－１）である。したがって、ＭＴＲキナーゼの酵素活性における任意の改善は、ＭＴＲキナーゼ酵素が作用する基質の拡散速度に関連する上限を有する。ＭＴＲキナーゼ活性は、キナーゼ活性を測定するために使用される標準アッセイのいずれかにより、またはＭＴＲキナーゼ産物とヌクレオシド塩基との間の反応を触媒してヌクレオシドを生成しうるヌクレオシドホスホリラーゼ酵素を用いた共役アッセイにより、またはＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ－ＭＳ、ＵＰＬＣ、ＵＰＬＣ－ＭＳ、ＴＬＣおよびＮＭＲ（これらに限定されるものではない）を含む、化学反応をアッセイするための伝統的な方法のいずれかにより測定されうる。本明細書に更に詳細に記載されているとおり、酵素活性の比較は、定められた酵素調製物、セット条件下の定められたアッセイおよび１以上の定められた基質を使用して行われる。一般に、ライセートを比較する場合、細胞数と、アッセイしたタンパク質の量とを決定し、同一発現系および同一宿主細胞を使用して、宿主細胞により産生されライセート中に存在する酵素の量の変動を最小限に抑える。

本明細書中で用いる「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞内に導入するためのＤＮＡ構築物である。幾つかの実施形態においては、ベクターは、ＤＮＡ配列においてコードされるポリペプチドの適切な宿主における発現をもたらしうる適切な制御配列に機能的に連結された発現ベクターである。幾つかの実施形態においては、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に機能的に連結されたプロモーター配列を有し、幾つかの実施形態においては、転写ターミネーター配列をも含む。

本明細書中で用いる「発現」なる語は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾（これらに限定されるものではない）を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含む。幾つかの実施形態においては、この用語は細胞からのポリペプチドの分泌をも含む。

本明細書中で用いる「産生」なる語は細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を意味する。この用語は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾（これらに限定されるものではない）を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含むと意図される。幾つかの実施形態においては、この用語は細胞からのポリペプチドの分泌をも含む。

本明細書において、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）が、それが機能的に連結されている別の配列に対して「異種」であると言えるのは、それらの２つの配列が天然において関連していない場合である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技術により宿主細胞内に導入される任意のポリヌクレオチドであり、この用語は、宿主細胞から取り出され、実験操作に付され、次いで宿主細胞内に再導入されるポリヌクレオチドを含む。

本明細書中で用いる「宿主細胞」および「宿主株」なる語は、本明細書において提供されるＤＮＡ（例えば、ＭＴＲキナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターのための適切な宿主を意味する。幾つかの実施形態においては、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞である。

「類似体（アナログ）」なる語は、参照ポリペプチドに対して７０％超（すなわち、７０％を超える）かつ１００％未満の配列同一性（例えば、７５％超、７８％超、８０％超、８３％超、８５％超、８８％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超または９９％超の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。幾つかの実施形態においては、「類似体」は、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリン（これらに限定されるものではない）を含む、天然に存在しない１以上のアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを意味する。幾つかの実施形態においては、類似体は１以上のＤ－アミノ酸残基をも含み、また、２以上のアミノ酸残基間の非ペプチド結合をも含む。

本明細書中で用いる「ＥＣ」番号は国際生化学分子生物学連合の命名委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名を意味する。ＩＵＢＭＢ生化学的分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいた、酵素に関する数的分類系である。

本明細書中で用いる「ＡＴＣＣ」はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を意味し、そのバイオレポジトリーコレクションは遺伝子および株を含む。

本明細書中で用いる「ＮＣＢＩ」は米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）およびそれにおいて提供される配列データベースを意味する。

「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を意味する。

「天然に存在する」または「野生型」は、天然で見出される形態を意味する。例えば、天然に存在する又は野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、生物に存在する配列であって、天然における供給源から単離可能であり、人間による操作によって意図的に修飾されていない配列である。本明細書においては、「野生型」ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は「ＷＴ」と称されうる。

「組換え」は、例えば細胞、核酸またはポリペプチドに関して用いられている場合、組換え以外では天然に存在しない様態で修飾されている物質または該物質の天然もしくは自然形態に対応する物質、あるいはそれと同一であるが、組換え技術を用いる操作により及び／もしくは合成物質から産生もしくは誘導された物質または該物質の天然もしくは自然形態に対応する物質に関するものである。非限定的な例には、とりわけ、細胞の天然（非組換え）形態内で見出されない遺伝子を発現する組換え細胞、またはさもなければ、異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細胞が含まれる。

「配列同一性の割合」、「同一性（％）」および「％同一である」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の比較を示すために本明細書において用いられ、２つの最適にアライメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。割合（％）は、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列内に存在する位置の数、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを伴ってアライメントされた位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り算し、その結果に１００を掛け算して配列同一性の百分率を得ることにより計算される。最適なアラインメントおよび配列同一性の割合の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２１５：４０３－４１０；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９７７，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３３８９－３４０２を参照されたい）を使用して行われる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトから公に入手可能である。

簡潔に説明すると、ＢＬＡＳＴ分析は、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアライメントされた場合に幾らかの正値閾値スコアＴにマッチする又はそれを満足するクエリ配列内の長さＷの短いワードを特定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前掲）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有する更に長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。ついでワードヒットを、累積アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合には、パラメーターＭ（マッチする残基のペアに関する報酬スコア；常に０より大きい）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０より小さい）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの伸長は以下の場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減少する；１以上の負スコア残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）。

２つの配列に関する同一性の割合を得る際にＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば以下のものによって行われうる：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，ＡＤＶ．ＡＰＰＬ．ＭＡＴＨ．２：４８２のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．４８：４４３のホモロジー・アライメント・アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｎ ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）。また、配列アラインメントおよび配列同一性（％）の決定は、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを、提供されるデフォルトのパラメーターを用いて使用する。

「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基の位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には少なくとも３０～５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比較した場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、より一層好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関するものであり、ここで、配列同一性の割合は、比較ウィンドウにわたって参照配列に対して合計２０パーセント以下である欠失または付加を含む配列と参照配列を比較することにより計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態においては、「実質的な同一性」なる語は、例えば、デフォルトのギャップウェイトを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアライメントされた場合に、２つのポリペプチド配列が少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれ以上の配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。

所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で用いられる場合の「に対応する」、「に対する参照（言及）」または「に基づく」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、特定されている参照配列の残基の番号付けに関するものである。換言すれば、所与の重合体の残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数的位置によってではなく、参照配列に基づいて示される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えばＭＴＲキナーゼのアミノ酸配列は、２つの配列の間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することにより、参照配列に対してアライメントされうる。これらの場合、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それがアライメントされた参照配列に基づいて行われる。

「立体選択性」は、化学的または酵素的反応において１つの立体異性体が別の立体異性体よりも優先的に形成されることを意味する。立体選択性は、１つの立体異性体の形成が他の立体異性体より優先される部分的なものであることが可能であり、あるいは、１つの立体異性体のみが形成される完全なものであることが可能である。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性はエナンチオ選択性と称され、両方のエナンチオマーの合計における１つのエナンチオマーの割合（典型的には百分率として示される）である。あるいは、それは一般に、式（主要エナンチオマー－副次的エナンチオマー）／（主要エナンチオマー＋副次的エナンチオマー）に従いそれから計算されるエナンチオマー過剰率（ＥＥ）として（典型的には百分率として）、当技術分野において示される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と称され、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの割合（通常は百分率として示される）であり、あるいは、一般に、ジアステレオマー過剰率（ＤＥ）として示される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率はステレオマー過剰率の一種である。

「高度に立体選択的」は、少なくとも約８５％の立体異性過剰率で基質をその対応生成物に変換しうる化学的または酵素的反応に関するものである。

「化学的選択性」は、化学的または酵素的反応において１つの生成物が別の生成物よりも優先的に形成されることを意味する。

「変換」は基質から対応生成物への酵素的変換を意味する。「変換率」は、特定の条件下で一定時間内に生成物に変換される基質の割合を意味する。したがって、例えば、ＭＴＲキナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は基質から生成物への「変換率」として表されうる。

「キラルアルコール」は、一般式Ｒ^１－ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ^２（ここで、Ｒ^１とＲ^２とは同一ではない）のアミンを意味し、本明細書においてはその最も広い意味で用いられ、例えば、異なる官能型および混合官能型の多種多様な脂肪族化合物および脂環式化合物を包含し、これらは、（ｉ）キラル環状構造を形成する二価基か、または（ｉｉ）構造もしくはキラリティーにおいて互いに異なる２つの置換基（水素以外）かのいずれかを水素原子のほかに含有する第二級炭素原子に結合した第一級ヒドロキシル基の存在により特徴付けられる。キラル環状構造を形成する二価基には、例えば、２－メチルブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，４－ジイル、ヘキサン－１，４－ジイル、ヘキサン－１，５－ジイル、２－メチルペンタン－１，５－ジイルが含まれる。第二級炭素原子上の２つの異なる置換基（前記のＲ^１およびＲ^２）も広範に変動可能であり、アルキル、アラルキル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、シクロアルキル、カルボキシ、カルボアルコキシ、カルバモイル、モノ－およびジ－（低級アルキル）置換カルバモイル、トリフルオロメチル、フェニル、ニトロ、アミノ、モノ－およびジ－（低級アルキル）置換アミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミドなど、ならびに前記のものにより置換されたアルキル、アラルキルまたはアリールを包含する。

固定化酵素調製物は、認められた多数の利点を有する。それらは、例えば、酵素調製物に貯蔵寿命をもたらすことが可能であり、反応安定性を改善することが可能であり、有機溶媒中での安定性を可能にし、反応流からのタンパク質除去を補助することが可能である。「安定」は、有機溶媒を含有する溶媒系において固定化酵素がその構造コンフォメーションおよび／またはその活性を保持しうることを意味する。安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり１０％未満の活性を喪失する。安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり９％未満の活性を喪失する。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり８％未満の活性を喪失する。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり７％未満の活性を喪失する。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり６％未満の活性を喪失する。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり５％未満の活性を喪失する。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり４％未満の活性である。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり３％未満の活性を喪失する。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において、１時間当たり２％未満の活性を喪失する。好ましくは、安定な固定化酵素は、有機溶媒を含有する溶媒系において１時間当たり１％未満の活性を喪失する。

「熱安定（耐熱性）」は、上昇した温度（例えば、４０℃～８０℃）に或る時間（例えば、０．５時間～２４時間）さらされた後、未処理酵素と比較して類似した活性（例えば、６０％～８０％以上）を維持するＭＴＲキナーゼポリペプチドに関するものである。

「溶媒安定」は、種々の濃度（例えば、５％～９９％）の溶媒（イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、ブチルアセタート、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）に或る時間（例えば、０．５時間～２４時間）さらされた後、未処理酵素と比較して類似した活性（例えば、６０％～８０％以上）を維持するＭＴＲキナーゼポリペプチドに関するものである。

「ｐＨ安定」は、高または低ｐＨ（例えば、４．５～６、または８～１２）に或る時間（例えば、０．５時間～２４時間）さらされた後、未処理酵素と比較して類似した活性（例えば、６０％～８０％以上）を維持するＭＴＲキナーゼポリペプチドに関するものである。

「熱および溶媒安定」は、熱安定かつ溶媒安定であるＭＴＲキナーゼポリペプチドに関するものである。

本明細書中で用いる「生体触媒作用」、「生体触媒」、「生体内変換」および「生合成」は、有機化合物に対する化学反応を引き起こすための酵素の使用を意味する。

「有効量」なる語は、所望の結果をもたらすのに十分な量を意味する。当業者は、常套的な実験を用いて有効量を決定しうる。

「単離（単離された）」および「精製（精製された）」なる語は、天然で付随している少なくとも１つの他の成分から取り出された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の成分を示すために用いられる。「精製された」なる語は絶対的な純度を必要とせず、相対的な定義として意図されている。

本明細書中で用いる「Ｓ－メチルチオリボースキナーゼ」または「ＭＴＲキナーゼ」は、Ｓ－メチル－５－チオリボースをリン酸化する酵素能力を有するポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、Ｍｇ２^＋、Ｃａ２^＋、Ｍｎ２^＋またはＣｏ２^＋を含む２価カチオンのような補因子を利用することが可能であり、ＡＴＰまたは別のヌクレオチド三リン酸を、それから基質へとリン酸残基を移動させる補因子として利用する。本明細書中で用いるＭＴＲキナーゼには、天然に存在する（野生型）ＭＴＲキナーゼ、および人間による操作によって生成される天然に存在しないポリペプチドが含まれる。

キラル化合物、特に糖におけるキラル化合物は、同等である多数の異なる様態で描写されうる、と当業者は認識するであろう。更に、リボース上の置換基の種類および位置化学的な位置は広範に変動可能であり、置換基に無関係に、立体化学的同等性の同一原理が適用される、と当業者は認識するであろう。そのような同等性の非限定的な例には、以下に例示されているものが含まれる。

ＭＴＲキナーゼ
本開示は、リボースおよびリボース誘導体を対応α－１－ホスファート糖（またはその塩）へとリン酸化しうるＭＴＲキナーゼポリペプチドに関する。該α－１－ホスファート糖（またはその塩）は別のヌクレオシドホスホリラーゼ酵素の基質であり、該酵素は、後に該１－ホスファートを、ヌクレオシド、特に５－イソブチリルリボースの合成においてヌクレオシドに変換するために使用可能であり、５－イソブチリルリボースは、５’－イソブチリルヌクレオシド、特に５’－イソブチリルウリジンに変換されうる。実施形態においては、ＭＴＲキナーゼは以下の変換が可能である。

特定の実施形態においては、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは以下の変換が可能である。

そのような実施形態においては、リン酸化化合物は塩の形態でありうる。

実施形態においては、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼはリボースおよび５－イソブチリルリボースをアルファ形態へと優先的にリン酸化する。ここでは、Ｄ－リボース１－ホスファートのアルファ形態は例示目的で示されている。

ここでも、Ｄ－リボース１－ホスファートのベータ形態は比較および例示目的で示されている。

実施形態においては、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼポリペプチドは、野生型ＭＴＲキナーゼまたは修飾ＭＴＲキナーゼの参照アミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列を有し、これは、定められた基質に対する該酵素の特性の改善をもたらす。

本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼポリペプチドは、商業的に入手可能な野生型ＭＴＲキナーゼからの定向進化の産物であり、該野生型ＭＴＲキナーゼはＭＴＲキナーゼとして特徴付けられており（Ｋｅｎｎｅｔｈ Ａ．Ｃｏｒｎｅｌｌら，３１７ ＢＩＯＣＨＥＭ．Ｊ．２８５－２９０（１９９６））、以下の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。

ＭＳＱＹＨＴＦＴＡＨＤＡＶＡＹＡＱＱＦＡＧＩＤＮＰＳＥＬＶＳＡＱＥＶＧＤＧＮＬＮＬＶＦＫＶＦＤＲＱＧＶＳＲＡＩＶＫＱＡＬＰＹＶＲＣＶＧＥＳＷＰＬＴＬＤＲＡＲＬＥＡＱＴＬＶＡＨＹＱＨＳＰＱＨＴＶＫＩＨＨＦＤＰＥＬＡＶＭＶＭＥＤＬＳＤＨＲＩＷＲＧＥＬＩＡＮＶＹＹＰＱＡＡＲＱＬＧＤＹＬＡＱＶＬＦＨＴＳＤＦＹＬＨＰＨＥＫＫＡＱＶＡＱＦＩＮＰＡＭＣＥＩＴＥＤＬＦＦＮＤＰＹＱＩＨＥＲＮＮＹＰＡＥＬＥＡＤＶＡＡＬＲＤＤＡＱＬＫＬＡＶＡＡＬＫＨＲＦＦＡＨＡＥＡＬＬＨＧＤＩＨＳＧＳＩＦＶＡＥＧＳＬＫＡＩＤＡＥＦＧＹＦＧＰＩＧＦＤＩＧＴＡＩＧＮＬＬＬＮＹＣＧＬＰＧＱＬＧＩＲＤＡＡＡＡＲＥＱＲＬＮＤＩＨＱＬＷＴＴＦＡＥＲＦＱＡＬＡＡＥＫＴＲＤＡＡＬＡＹＰＧＹＡＳＡＦＬＫＫＶＷＡＤＡＶＧＦＣＧＳＥＬＩＲＲＳＶＧＬＳＨＶＡＤＩＤＴＩＱＤＤＡＭＲＨＥＣＬＲＨＡＩＴＬＧＲＡＬＩＶＬＡＥＲＩＤＳＶＤＥＬＬＡＲＶＲＱＹＳ（配列番号１）。

特定の場合には、野生型ＭＴＲキナーゼは、以下の配列番号２に示すＤＮＡ配列によってコードされうる。

ＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＴＡＣＧＴＧＣＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＴＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＧＴＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＡＡＴＡＣＡＧＣ（配列番号２）。

実施形態においては、本開示のＭＴＲキナーゼポリペプチドは、配列番号１のＭＴＲキナーゼと比較して、例えば酵素活性、立体選択性、立体特異性、熱安定性、溶媒安定性またはリン酸化生成物阻害の増強のような改善を示しうる。

幾つかの実施形態においては、本開示のＭＴＲキナーゼポリペプチドは酵素活性の速度の改善、すなわち、基質を生成物に変換する速度の改善を示しうる。幾つかの実施形態においては、ＭＴＲキナーゼは、配列番号１の酵素により示される速度の少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍または５０倍の速度で基質を生成物に変換しうる。

幾つかの実施形態においては、そのようなＭＴＲキナーゼは、少なくとも約８０％のステレオマー過剰率で基質を生成物に変換することも可能であるポリペプチドである。幾つかの実施形態においては、そのようなＭＴＲキナーゼは、少なくとも約９０％のステレオマー過剰率で基質を生成物に変換することも可能であるポリペプチドである。幾つかの実施形態においては、そのようなＭＴＲキナーゼは、少なくとも約９９％のステレオマー過剰率で基質を生成物に変換することも可能であるポリペプチドである。

幾つかの実施形態においては、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは高度に立体選択的であり、該ポリペプチドは、約９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％を超えるステレオマー過剰率で、基質を生成物へとリン酸化しうる。

実施形態においては、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼには、以下の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

ＭＳＱＹＨＴＦＴＡＨＤＡＶＡＹＡＱＱＦＡＧＩＤＮＰＳＥＬＶＳＡＱＥＶＧＤＧＮＬＮＬＶＦＫＶＦＤＲＱＧＶＳＲＡＩＶＫＱＡＬＰＹＶＲＣＶＧＥＳＷＰＬＴＬＤＲＡＲＨＥＡＱＴＬＶＡＨＹＱＨＳＰＱＨＴＶＫＩＨＨＦＤＰＥＬＡＶＭＶＭＥＤＬＳＤＨＲＩＷＲＧＥＬＩＡＮＶＹＹＰＱＡＡＲＱＬＧＤＹＬＡＱＶＬＦＨＴＳＤＦＹＬＨＰＨＥＫＫＡＱＶＡＱＦＩＮＰＡＭＣＥＩＴＥＤＬＦＦＮＤＰＹＱＩＨＥＲＮＮＹＰＡＥＬＥＡＤＶＡＡＬＲＤＤＡＱＬＫＬＡＶＡＡＬＫＨＲＦＦＡＨＡＥＡＬＬＨＧＤＩＨＳＧＳＩＦＶＡＥＧＳＬＫＡＩＤＡＥＦＧＹＦＧＰＩＧＦＤＩＧＴＡＩＧＮＬＬＬＮＹＣＧＬＰＧＱＬＧＩＲＤＡＡＡＡＲＥＱＲＬＮＤＩＨＱＬＷＴＴＦＡＥＲＦＱＡＬＡＡＥＫＴＲＤＡＡＬＡＹＰＧＹＡＳＡＦＬＫＫＶＷＡＤＡＶＧＦＣＧＳＥＬＩＲＲＳＶＧＬＳＨＶＡＤＩＤＴＩＱＤＤＡＭＲＨＥＣＬＲＨＡＩＴＬＧＲＡＬＩＶＬＡＥＲＩＤＳＶＤＥＬＬＡＲＶＲＱＹＳＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）。

特定の場合には、前記の配列番号３に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドは、以下の配列番号４に示すＤＮＡ配列によってコードされうる。

ＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＴＡＣＧＴＧＣＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＴＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＧＴＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号４）。

追加的な実施形態においては、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼには、以下の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

ＭＳＱＹＨＴＦＴＡＨＤＡＶＡＹＡＱＱＦＡＧＩＤＮＰＳＥＬＶＳＡＱＥＶＧＤＧＮＬＮＬＶＦＫＶＦＤＲＱＧＶＳＲＡＩＶＫＱＡＬＰＹＰＲＣＶＧＥＳＷＰＬＴＬＤＲＡＲＨＥＡＱＴＬＶＡＨＹＱＨＳＰＱＨＴＶＫＩＨＨＦＤＰＥＬＡＶＭＶＭＥＤＬＳＤＨＲＩＷＲＧＥＬＩＡＮＶＹＹＰＱＡＡＲＱＬＧＤＹＬＡＱＶＬＦＨＴＳＤＦＹＬＨＰＨＥＫＫＡＱＶＡＱＦＩＮＰＡＭＣＥＩＳＥＤＬＩＦＮＤＰＹＱＩＨＥＲＮＮＹＰＡＥＬＥＡＤＶＡＡＬＲＤＤＡＱＬＫＬＡＶＡＡＬＫＨＲＦＦＡＨＡＥＡＬＬＨＧＤＬＨＳＧＳＩＦＶＡＥＧＳＬＫＡＩＤＡＥＦＧＹＦＧＰＩＧＦＤＩＧＴＡＩＧＮＬＬＬＮＹＣＧＬＰＧＱＬＧＩＲＤＡＡＡＡＲＥＱＲＬＮＤＩＨＱＬＷＴＴＦＡＥＲＦＱＡＬＡＡＥＫＴＲＤＡＡＬＡＹＰＧＹＡＳＡＦＬＫＫＶＷＡＤＡＶＧＦＣＧＳＥＬＩＲＲＳＶＧＬＳＨＶＡＤＩＤＴＩＱＤＤＡＭＲＨＥＣＬＲＨＡＩＴＬＧＲＡＬＩＶＬＡＥＲＩＤＳＶＤＥＬＬＡＲＶＲＱＹＳＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号５）。

特定の場合には、前記の配列番号５に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドは、以下の配列番号６に示すＤＮＡ配列によってコードされうる。

ＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＴＡＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＴＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＧＴＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号６）。

追加的な実施形態においては、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼには、以下の配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

ＭＳＱＹＨＴＦＴＡＤＤＡＶＡＹＡＱＱＦＡＧＩＤＮＰＳＥＬＶＳＡＱＥＶＧＤＧＮＬＮＬＶＦＫＶＦＤＲＱＧＶＳＲＡＩＶＫＱＡＬＰＹＰＲＲＶＧＰＳＷＰＬＴＬＤＲＡＲＨＥＡＱＴＬＶＡＨＹＱＨＳＰＱＨＴＶＫＩＨＨＦＤＰＥＬＡＶＭＶＭＥＤＬＳＤＨＲＩＷＲＧＥＬＩＡＮＶＹＹＰＱＡＡＲＱＬＧＤＹＬＡＱＶＬＦＨＴＳＤＦＹＬＨＰＨＥＫＫＡＱＶＡＱＦＩＮＰＡＭＣＥＩＳＥＤＬＶＦＮＤＰＹＱＩＨＥＲＮＮＹＰＡＥＬＥＡＤＶＡＡＬＲＤＤＡＱＬＫＬＡＶＡＡＬＫＨＲＦＦＡＨＡＥＡＬＬＨＧＤＬＨＴＧＳＩＦＶＡＥＧＳＬＫＶＩＤＡＥＦＧＹＦＧＰＩＧＦＤＩＧＴＡＩＧＮＬＬＬＮＹＣＧＬＰＧＱＬＧＩＲＤＡＡＡＡＲＥＱＲＬＮＤＩＨＱＬＷＴＴＦＡＥＲＦＱＡＬＡＡＥＫＴＲＤＡＡＬＡＹＰＧＹＡＳＡＦＬＫＫＶＷＡＤＡＶＧＦＣＧＳＥＬＩＲＲＳＶＧＬＡＨＶＡＤＩＤＴＩＱＤＤＡＭＲＨＥＣＬＲＥＡＩＴＬＧＲＡＬＩＶＬＡＥＲＩＤＳＶＤＥＬＬＡＲＶＲＱＹＳＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）。

特定の場合には、前記の配列番号７に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドは、以下の配列番号８に示すＤＮＡ配列によってコードされうる。

ＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＴＡＣＣＣＣＣＧＴＣＧＣＧＴＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＣＡＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＴＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＡＣＧＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号８）。

この最初の例の特定の場合には、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼには、以下の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

ＭＳＱＹＨＴＦＴＡＤＤＡＶＡＹＡＱＱＦＡＧＩＤＮＰＳＥＬＶＳＡＱＥＶＧＤＧＮＬＮＬＶＦＫＶＦＤＲＱＧＶＳＲＡＩＶＫＱＡＬＰＹＰＲＡＶＧＰＳＷＰＬＴＬＤＲＡＲＨＥＡＱＴＬＶＡＨＹＱＨＳＰＱＨＴＶＫＩＨＨＦＤＰＥＬＡＶＭＶＭＥＤＬＳＤＨＲＩＷＲＧＥＬＩＡＮＶＹＹＰＱＡＡＲＱＬＧＤＹＬＡＱＶＬＦＨＴＳＤＦＹＬＨＰＨＥＫＫＡＱＶＡＱＦＩＮＰＧＭＣＥＩＳＥＤＬＳＦＮＤＰＹＱＩＨＥＲＮＮＹＰＡＥＬＥＡＤＶＡＡＬＲＤＤＡＱＬＫＬＡＶＡＡＬＫＨＲＦＦＡＨＡＥＡＬＬＨＧＤＬＨＳＧＳＩＦＶＡＥＧＳＬＫＶＩＤＡＥＦＧＹＦＧＰＩＧＦＤＩＧＴＡＩＧＮＬＬＬＮＹＣＧＬＰＧＱＬＧＩＲＤＡＡＡＡＲＥＱＲＬＮＤＩＨＱＬＷＴＴＦＡＥＲＦＱＡＬＡＡＥＫＴＲＤＡＡＬＡＹＰＧＹＡＳＡＦＬＫＫＶＷＡＤＡＶＧＦＣＧＳＥＬＩＲＲＳＶＧＬＳＨＶＡＤＩＤＴＩＱＤＤＡＭＲＨＥＣＬＲＨＡＩＴＬＧＲＡＬＩＶＬＡＥＴＩＤＳＶＤＥＬＬＡＲＶＲＱＹＳＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号９）。

そのような場合の特定の例においては、前記の配列番号９に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドは、以下の配列番号１０に示すＤＮＡ配列によってコードされうる。

ＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＴＡＣＣＣＣＣＧＴＧＣＧＧＴＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＴＣＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＣＡＣＧＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号１０）。

この最初の例の特定の場合には、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼには、以下の配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

ＭＳＱＹＨＴＦＴＡＤＤＡＶＡＹＡＱＱＦＡＧＩＤＮＰＳＥＬＶＳＡＱＥＶＧＤＧＮＬＮＬＶＦＫＶＦＤＲＱＧＶＳＲＡＩＶＫＱＡＬＰＹＰＲＲＶＧＰＳＷＰＬＴＬＤＲＡＲＨＥＡＱＴＬＶＡＨＹＱＨＳＰＱＨＴＶＫＩＦＨＦＤＰＥＬＡＶＭＶＭＥＤＬＳＤＨＲＩＷＲＧＥＬＩＡＮＶＹＹＰＱＡＡＲＱＬＧＤＹＬＡＱＶＬＦＨＴＳＤＦＹＬＨＰＨＥＫＫＲＱＶＡＱＦＩＮＰＡＭＣＧＩＳＥＤＬＶＦＮＤＰＹＱＩＨＥＲＮＮＹＰＡＥＬＥＡＱＶＡＡＬＲＤＤＡＱＬＫＬＡＶＡＡＬＫＨＲＦＦＡＨＡＥＡＬＬＨＧＤＬＨＴＧＳＩＦＶＫＥＧＳＬＫＶＩＤＡＥＦＧＹＦＧＰＩＧＦＤＩＧＴＡＩＧＮＬＬＬＮＹＣＧＬＰＧＱＬＧＩＲＤＡＡＡＡＲＥＱＲＬＮＤＩＨＱＬＷＴＴＦＡＥＲＦＱＡＬＡＡＥＫＴＲＤＡＡＬＡＹＰＧＹＡＳＡＦＬＫＫＶＷＡＤＡＶＧＦＣＧＳＥＬＩＲＲＳＶＧＬＡＨＶＡＤＩＤＴＩＱＤＤＡＭＲＨＥＣＬＲＥＡＩＴＬＧＲＡＬＩＶＬＡＥＲＩＤＳＶＤＥＬＬＡＲＶＲＱＹＳＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１）。

この最初の例の特定の場合には、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼには、以下の配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

ＭＳＱＹＨＴＦＴＡＤＤＡＶＡＹＡＱＱＦＡＧＩＤＮＰＳＥＬＶＳＡＱＥＶＧＤＧＮＬＮＬＶＦＫＶＦＤＲＱＧＶＳＲＳＩＶＫＱＡＬＰＹＰＲＲＶＧＰＳＷＰＬＴＬＤＲＡＲＨＥＡＱＴＬＶＡＨＹＱＨＳＰＱＨＴＶＫＩＦＨＦＤＰＥＬＡＶＭＶＭＥＤＬＳＤＨＲＩＷＲＧＥＬＩＡＮＶＹＹＰＱＡＡＲＱＬＧＤＹＬＡＱＶＬＦＨＴＳＤＦＹＬＨＰＨＥＫＫＲＱＶＡＱＦＩＮＰＡＭＣＧＩＳＥＤＬＶＦＮＤＰＹＱＩＨＥＲＮＮＹＰＡＥＬＥＡＱＶＡＡＬＲＤＤＡＱＬＫＬＡＶＡＡＬＫＨＲＦＦＡＨＡＥＡＬＬＨＧＤＬＨＴＧＳＩＦＶＫＥＧＳＬＫＶＩＤＡＥＦＧＹＦＧＰＩＧＦＤＩＧＴＡＩＧＮＬＬＬＮＹＣＧＬＰＧＱＬＧＩＲＤＡＡＡＡＲＥＱＲＬＮＤＩＨＱＬＷＴＴＦＡＥＲＦＱＡＬＡＡＥＫＴＲＤＡＡＬＲＹＰＧＹＡＳＡＦＬＫＫＶＷＡＤＡＶＧＦＣＧＳＥＬＩＲＲＳＶＧＬＡＨＶＡＤＩＤＴＩＱＤＤＡＭＲＨＥＣＬＲＥＡＩＴＬＧＲＡＬＩＶＬＡＥＲＩＤＳＶＤＥＬＬＡＲＶＲＱＹＳＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１２）。

幾つかの実施形態においては、本開示の改良されたＭＴＲキナーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１または１２のアミノ酸配列に基づくポリペプチドであり、配列番号１、３、５、７、９、１１または１２の参照配列に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含みうる。これらの差異はアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそのような変化の任意の組合せでありうる。幾つかの場合には、アミノ酸配列の差異は非保存的アミノ酸置換、保存的アミノ酸置換、および非保存的アミノ酸置換と保存的アミノ酸置換との組合せを含みうる。

幾つかの実施形態においては、本開示の改良されたＭＴＲキナーゼは、配列番号２、４、６、８または１０のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドであり、配列番号２、４、６、８または１０の翻訳された参照配列に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含みうる。これらの差異はアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそのような変化の任意の組合せでありうる。幾つかの場合には、配列の差異は非保存的アミノ酸置換、保存的アミノ酸置換、および非保存的アミノ酸置換と保存的アミノ酸置換との組合せを含みうる。

追加的な実施形態は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることが可能であり、あるいは、異なる生物であることが可能である。宿主細胞は、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼの発現および単離に使用可能であり、あるいは、基質を立体異性体生成物に変換するために直接使用可能である。

全細胞、細胞抽出物または精製ＭＴＲキナーゼのいずれを使用して該方法を実施するかにかかわらず、単一のＭＴＲキナーゼが使用可能であり、あるいは２以上のＭＴＲキナーゼの混合物が使用可能である。

実施形態は、ヌクレオシドの合成においてアルファ－１－ホスファート糖を選択的に製造しうるＭＴＲキナーゼポリペプチドに関する。実施形態においては、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは以下の変換が可能である。

特定の実施形態においては、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは以下の変換が可能である。

そのような実施形態においては、アルファ－１－ホスファート糖は塩の形態でありうる。

改善が望ましい酵素特性には、酵素活性、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子要求性、インヒビターに対する不応性（例えば、生成物阻害）、立体特異性、立体選択性および溶媒安定性が含まれるが、これらに限定されるものではない。改善は、酵素活性のような単一の酵素特性、または酵素活性と立体選択性とのような異なる酵素特性の組合せに関するものでありうる。

以下の表１は、本明細書に開示されている配列番号および関連活性の一覧を示す。以下のアミノ酸配列は、特に示されていない限り、配列番号１のＭＴＲキナーゼポリペプチド配列に基づく。以下の表において、各行は配列番号を示す。突然変異（すなわち、残基変化）の数を記載している列は、配列番号１のＭＴＲキナーゼポリペプチド配列と比較した場合のアミノ酸置換の数を示す。表１において、「ｄ．ｒ．」は「ジアステレオマー比」を示すために用いられる。最初の数字は、５’－イソブチリル－アルファ－リボース－１－ホスファート形態である生成物の割合を示し、２番目の数字は、５’－イソブチリル－ベータ－リボース－１－ホスファートである生成物の割合を示す。

ＭＴＲキナーゼをコードするポリヌクレオチド
もう１つの態様においては、本開示は、本明細書に開示されているＭＴＲキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する１以上の異種調節配列に機能的に連結して、該ポリペプチドを発現しうる組換えポリヌクレオチドを得ることが可能である。ＭＴＲキナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞内に導入して、対応するＭＴＲキナーゼポリペプチドを発現させることが可能である。

種々のアミノ酸に対応するコドンが公知であるため、タンパク質配列が入手可能であれば、対象をコードしうる全てのポリヌクレオチドが示される。同一アミノ酸が代替コドンまたは同義コドンによりコードされる遺伝暗号の縮重は、本明細書に開示されている改良されたＭＴＲキナーゼを全てがコードする非常に多数の核酸の作製を可能にする。したがって、特定のアミノ酸配列が特定されたら、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１以上のコドンの配列を単に改変することにより、幾つもの異なる核酸を作製することが可能である。この点に関して、本開示は特に、可能なコドンの選択に基づく組合せを選択することにより作製されうるポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変異（変動）を想定しており、そのような変異は全て、本明細書に開示されている任意のポリペプチドに関して具体的に開示されているとみなされるべきである。

種々の実施形態において、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生される宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌において遺伝子を発現させるために使用され、酵母において使用される好ましいコドンは酵母における発現に使用され、哺乳類において使用される好ましいコドンは哺乳類細胞における発現に使用される。例えば、配列番号２のポリヌクレオチドは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化されている。

特定の実施形態においては、ＭＴＲキナーゼのコドン使用を最適化するために、全てのコドンを置換する必要はない。なぜなら、天然の配列は好ましいコドンを含むからであり、また、好ましいコドンの使用は全てのアミノ酸残基に必要なわけではないからである。結果的に、ＭＴＲキナーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超において、好ましいコドンを含有しうる。

種々の実施形態においては、改良されたＭＴＲキナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすために種々の方法で操作されうる。発現ベクターに応じて、ベクター内への挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作が望ましい又は必要でありうる。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技術は当技術分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８（２００６年までの更新）に指針が記載されている。

幾つかの実施形態においては、本明細書におけるＭＴＲキナーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ＭＴＲキナーゼポリペプチドの発現を促進するために種々の方法で操作される。幾つかの実施形態においては、ＭＴＲキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＭＴＲキナーゼポリペプチドの発現を調節するために１以上の制御配列が存在する発現ベクターを構成する。利用される発現ベクターに応じて、ベクター内への挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作が望ましい又は必要でありうる。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技術は当技術分野で周知である。幾つかの実施形態においては、制御配列には、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれる。幾つかの実施形態においては、適切なプロモーターは、宿主細胞の選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞の場合、本開示の核酸構築物の転写を導くための適切なプロモーターには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合部位およびそれに続くｌａｃ オペレーター配列からなるハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、適切なプロモーターには以下のものが含まれうる：ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース産生性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆら，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１（１９７８）を参照されたい）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８０：２１－２５（１９８３）を参照されたい）。

幾つかの実施形態においては、制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列（すなわち、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列）である。幾つかの実施形態においては、ターミネーター配列は、該酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に機能的に連結される。選択された宿主細胞において機能する任意の適切なターミネーターが本開示において有用である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のための例示的な転写ターミネーターには、Ｔ７ターミネーターが含まれる。

幾つかの実施形態においては、制御配列はまた、適切なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）である。幾つかの実施形態においては、リーダー配列は、ＭＴＲキナーゼをコードする核酸配列の５’末端に機能的に連結される。選択された宿主細胞において機能する任意の適切なリーダー配列が本開示において有用である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための例示的なリーダーはリボソーム結合部位をコードする。

幾つかの実施形態においては、調節配列も使用される。これらの配列は宿主細胞の増殖に対するポリペプチドの発現の調節を促進する。調節系の例としては、調節性化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものが挙げられる。原核宿主細胞においては、適切な調節配列には、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が含まれるが、これらに限定されるものではない。酵母宿主細胞においては、適切な調節系には、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が含まれるが、これらに限定されるものではない。糸状菌においては、適切な調節配列には、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーターおよびアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。

もう１つの態様においては、本発明は、ＭＴＲキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、それが導入される宿主のタイプに応じて１以上の発現調節領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点など）とを含む組換え発現ベクターに関する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている種々の核酸および制御配列を互いに結合させて、１以上の簡便な制限部位（これは、そのような部位における、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする）を含む組換え発現ベクターを得る。あるいは、幾つかの実施形態においては、本開示の核酸配列は、核酸配列または該配列を含む核酸構築物を発現用の適切なベクター内に挿入することにより発現される。発現ベクターの作製を含む幾つかの実施形態においては、コード配列は、発現用の適切な制御配列に機能的に連結されるように、ベクター内に配置される。

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に付され酵素ポリヌクレオチド配列の発現をもたらしうる任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）でありうる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの適合性に左右される。ベクターは線状または閉環状プラスミドでありうる。

幾つかの実施形態においては、発現ベクターは自律複製性ベクター（すなわち、染色体の複製から独立して複製される染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を保証するための手段を含有しうる。幾つかの代替的実施形態においては、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノム内に組み込まれるベクターであって、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターである。更に、幾つかの実施形態においては、トランスポゾンおよび／または宿主細胞のゲノム内に導入される全ＤＮＡを一緒に含む単一のベクターもしくはプラスミドまたは２以上のベクターもしくはプラスミドが使用される。

幾つかの実施形態においては、発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１以上の選択マーカーを含む。「選択マーカー」は遺伝子であり、その産物は殺生物物質またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを付与する。細菌選択マーカーの例には、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を付与するマーカーが含まれるが、これらに限定されるものではない。酵母宿主細胞のための適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が含まれるが、これらに限定されるものではない。糸状菌宿主細胞において使用される選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ［アセトアミダーゼ；例えば、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）に由来するもの］、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ［ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）に由来するもの］、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ［オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）に由来するもの］、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにそれらの同等物が含まれるが、これらに限定されるものではない。

もう１つの態様においては、本開示は、本開示の少なくとも１つのＭＴＲキナーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、該ポリヌクレオチドは該宿主細胞における少なくとも１つのＭＴＲキナーゼの発現のための１以上の制御配列に機能的に連結されている。本開示の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現における使用に適した宿主細胞は当技術分野で周知であり、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞［サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８）］を包含するが、これらに限定されるものではない。代表的な宿主細胞には、種々の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株［例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１］も含まれる。細菌性選択マーカーの例には、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールおよび／もしくはテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を付与するマーカーが含まれるが、これらに限定されるものではない。

幾つかの代替実施形態においては、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内への相同組換えによる組込みを導くための追加的な核酸配列を含有する。追加的な核酸配列は、染色体内の的確な位置でベクターが宿主細胞ゲノム内に組込まれることを可能にする。的確な位置での組込みの可能性を高めるためには、組込みエレメントは、好ましくは、十分な数のヌクレオチド、例えば１００～１０，０００塩基対、好ましくは４００～１０，０００塩基対、最も好ましくは８００～１０，０００塩基対を含有し、これらは、相同組換えの可能性を高めるために対応標的配列に対して高度に相同である。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同な任意の配列でありうる。更に、組込みエレメントはノンコーディング（非コード化）核酸配列またはコーディング（コード化）核酸配列でありうる。一方、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノム内に組み込まれうる。

自律複製の場合、ベクターは、当該宿主細胞内でベクターが自律複製することを可能にする複製起点を更に含みうる。細菌性複製起点の例としては、Ｐ１５Ａ ｏｒｉ、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（これはＰ１５Ａ ｏｒｉを含有する）もしくはｐＡＣＹＣ１８４（これはＰ１５Ａ ｏｒｉを含有する）の複製起点、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４またはｐＴＡ１０６０が挙げられる。酵母宿主細胞において使用される複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せが挙げられる。複製起点は、宿主細胞内でその機能を温度感受性にする突然変異を有するものでありうる（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４３３（１９７８）を参照されたい）。

幾つかの実施形態においては、遺伝子産物の産生を増加させるために、本開示の核酸配列の複数のコピーが宿主細胞内に挿入される。核酸配列のコピー数の増加は、該配列の少なくとも１つの追加的なコピーを宿主細胞ゲノム内に組込むことにより、または増幅可能な選択マーカー遺伝子を該核酸配列と共に含めることにより（この場合、選択マーカー遺伝子の増幅コピーを含有し、それにより該核酸配列の追加的コピーを含有する細胞は、適切な選択剤の存在下で細胞を培養することにより選択されうる）達成されうる。

本開示において使用される多数の発現ベクターは商業的に入手可能である。適切な市販の発現ベクターには、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）のｐＥＴ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７発現ベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）およびｐ３ｘＦＬＡＧ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の適切な発現ベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するプラスミドが含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｌａｔｈｅら，Ｇｅｎｅ ５７：１９３－２０１（１９８７）を参照されたい）。

したがって、幾つかの実施形態においては、ベクターの増殖および変異体ＭＴＲキナーゼの発現を可能にするために、少なくとも１つの変異体ＭＴＲキナーゼをコードする配列を含むベクターを宿主細胞内に形質転換する。幾つかの実施形態においては、前記の形質転換宿主細胞を、変異体ＭＴＲキナーゼの発現を可能にする条件下、適切な栄養培地内で培養する。宿主細胞を培養するのに有用な任意の適切な培地が本開示において使用され、これらには、適切なサプリメントを含有する最少培地または複合培地が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、ＨＴＰ培地内で宿主細胞を増殖させる。適切な培地は種々の商業的供給業者から入手可能であり、あるいは、公開されている調製方法（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）に従い調製されうる。

ＭＴＲキナーゼの発現のための宿主細胞
もう１つの態様においては、本開示は、本開示の改良されたＭＴＲキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるＭＴＲキナーゼ酵素の発現のための１以上の制御配列に機能的に連結されている。本発明の発現ベクターによりコードされるＭＴＲキナーゼポリペプチドの発現に使用される宿主細胞は当技術分野で周知であり、細菌細胞、例えばクレブシエラ・エロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバシラス・ケジル（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｊｉｒ）、ラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバシラス・マイナー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｏｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞、例えば酵母細胞［例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８）］を包含するが、これらに限定されるものではない。前記の宿主細胞のための適切な培地および増殖条件は当技術分野で周知である。

ＭＴＲキナーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の種々の方法により細胞内に導入されうる。技術には、とりわけ、エレクトロポレーション、微粒子銃粒子衝撃、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が含まれる。ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための種々の方法が当業者に明らかであろう。

本開示の幾つかの実施形態においては、糸状菌宿主細胞は、以下のもの（それらに限定されるものではない）を含む任意の適切な属および種のものである：アクリヤ（Ａｃｈｌｙａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ビエルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コクリオボラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリフォネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、ディプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エンドシス（Ｅｎｄｏｔｈｉｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、ミセリオプトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ピリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、ティエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）および／もしくはボルバリエラ（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）、ならびに／またはそれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、ならびにそれらの別名、バシオニムもしくは分類学的同等物。

本開示の幾つかの実施形態においては、宿主細胞は酵母細胞であり、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の細胞を包含するが、これらに限定されるものではない。本開示の幾つかの実施形態においては、酵母細胞はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ジアスタティックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コダマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｄａｍａｅ）、ピキア・メンブランエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・クエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｑｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）またはヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。

幾つかの他の実施形態においては、宿主細胞は原核細胞である。適切な原核細胞には、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞およびグラム可変性細菌細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。以下のもの（それらに限定されるものではない）を含む任意の適切な細菌生物が本開示において有用である：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アリシクロバシラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、アナシスチス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシドテルムス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾバクター（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ブフネラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、カンペストリス（Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、カンプリオバクター（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フェカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ）、サッカロモノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、トロフェリマ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ）、ツラレンシス（Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、テメキュラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）。幾つかの実施形態においては、宿主細胞はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾバクター（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブフネラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、ジオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属種である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主株はヒトに対して非病原性である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主株は工業菌株である。多数の細菌性工業菌株が公知であり、本開示において適している。本開示の幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はアグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）およびアグロバクテリウム・ルビ（Ａ．ｒｕｂｉ）］である。本開示の幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はアルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、アルスロバクター・アウレッセンス（Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アルスロバクター・シトレウス（Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミクス（Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アルスロバクター・マイソレンス（Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アルスロバクター・ニコチアナエネ（Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アルスロバクター・パラフィネウス（Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アルスロバクター・プロトフォンニアエ（Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ）、アルスロバクター・ロセオパルクフィヌス（Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ）、アルスロバクター・スルフレウス（Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）およびアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）］である。本開示の幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はバシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ）、バシラス・アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バシラス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バシラス・ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バシラス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・フィルムス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、バシラス・アルカオフィウス（Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）およびバシラス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）］である。幾つかの実施形態においては、宿主細胞は工業用バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株であり、これらには、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはバシラス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞はバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）および／またはバシラス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はクロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）Ｅ８８、クロストリジウム・リツセブレンセ（Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・ベイジェリンキー（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）］である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はコリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびコリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）］である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はエシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）］である。幾つかの実施形態においては、宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０である。幾つかの実施形態においては、宿主は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１またはＢＬ２１（ＤＥ３）である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はエルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、エルウィニア・ウレドボラ（Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・アナナス（Ｅ．ａｎａｎａｓ）、エルウィニア・ヘルビコーラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルウィニア・プンクタタ（Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ）およびエルウィニア・テレウス（Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）］である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はパンテア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、パンテア・シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）およびパンテア・アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）］である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・メバロニイ（Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）およびシュードモナス属種（Ｐ．ｓｐ．）Ｄ－０１ １０］である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびストレプトコッカス・ウベリス（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）］である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はストレプトマイセス属種［例えば、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンギシディクス（Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・ギリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）］である。幾つかの実施形態においては、細菌宿主細胞はザイモモナス属種（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）［例えば、ザイモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモモナス・リポリティカ（Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）］である。

本開示において有用である多数の原核生物および真核生物の株は、幾つかのカルチャー・コレクション、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）から公的に容易に入手可能である。

幾つかの実施形態においては、宿主細胞は、タンパク質の分泌、タンパク質の安定性、ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌に望ましい他の特性を改善する特徴を有するように遺伝的に修飾される。遺伝的修飾は遺伝子工学技術および／または古典的な微生物学的技術（例えば、化学的またはＵＶ突然変異誘発およびその後の選択）により達成されうる。実際、幾つかの実施形態においては、宿主細胞を作製するために組換え修飾と古典的な選択技術との組合せが用いられる。組換え技術を用いて、宿主細胞内および／または培地内のＭＴＲキナーゼ変異体の収量が増加するように、核酸分子を導入し、欠失させ、抑制し、または修飾することが可能である。１つの遺伝子工学アプローチにおいては、コード化タンパク質の発現を抑制するためにインビボで遺伝子を特異的に標的化することにより、標的化遺伝子修飾を誘導するために、相同組換えを用いる。別のアプローチにおいては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術が遺伝子発現の抑制において有用である。細胞内のタンパク質の発現を低減するための種々の方法が当技術分野で公知であり、それらには、タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊するための部位特異的突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されるものではない［例えば、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅら，ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．，２８：２２ ｅ９７（２０００）；Ｃｈｏら，ＭＯＬＥＣ．ＰＬＡＮＴ ＭＩＣＲＯＢＥ ＩＮＴＥＲＡＣＴ．，１９：７－１５（２００６）；ＭａｒｕｙａｍａおよびＫｉｔａｍｏｔｏ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＬＥＴＴ．，３０：１８１１－１８１７（２００８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，ＭＯＬ．ＧＥＮ．ＧＥＮＯＭ．，２７２：３４４－３５２（２００４）；ならびにＹｏｕら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９１：６１５－６２２（２００９）を参照されたい；それらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする］。ランダム突然変異誘発、およびそれに続く、所望の突然変異のスクリーニングも有用である［例えば、Ｃｏｍｂｉｅｒら，ＦＥＭＳ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＬＥＴＴ．，２２０：１４１－８（２００３）；およびＦｉｒｏｎら，ＥＵＫＡＲＹ．ＣＥＬＬ ２：２４７－５５（２００３）を参照されたい；それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする］。

宿主細胞内へのベクターまたはＤＮＡ構築物の導入は、当技術分野で公知のいずれかの適切な方法を用いて達成可能であり、そのような方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、ＰＥＧ媒介性形質転換、エレクトロポレーションまたは当技術分野で公知の他の一般的な技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。

幾つかの実施形態においては、本開示の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはＭＴＲキナーゼポリヌクレオチドの増幅のために適宜改変された通常の栄養培地内で培養する。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、当業者に周知である。記載されているとおり、細菌、植物、動物（特に哺乳類）および古細菌由来の細胞を含む多数の細胞の培養および作製に関する多数の標準的な参考文献およびテキストが利用可能である。

幾つかの実施形態においては、本開示のＭＴＲキナーゼを発現する細胞をバッチまたは連続発酵条件下で増殖させる。古典的な「バッチ発酵」は閉鎖系であり、この場合、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な変更に付されない。バッチ系の変法は、本開示において同様に有用である「フェドバッチ（流加）発酵」である。この変法においては、発酵が進行するにつれて、基質を徐々に添加する。フェドバッチ系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、および培地内の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。「連続発酵」は開放系であり、この場合、定められた発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に等量の馴化培地を処理のために除去する。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある状態で、一定の高密度で培養を維持する。連続発酵系は定常状態の増殖条件を維持しようとする。連続発酵プロセスのための栄養素および増殖因子を調節するための方法、ならびに産物生成の速度を最大化するための技術は応用微生物学の分野で周知である。

遺伝子産物の産生を増加させるために、本開示の核酸配列の複数のコピーが宿主細胞内に挿入される。核酸配列のコピー数の増加は、該配列の少なくとも１つの追加的なコピーを宿主細胞ゲノム内に組込むことにより、または増幅可能な選択マーカー遺伝子を該核酸配列と共に含めることにより（この場合、選択マーカー遺伝子の増幅コピーを含有し、それにより該核酸配列の追加的コピーを含有する細胞は、適切な選択剤の存在下で細胞を培養することにより選択されうる）達成されうる。

本開示の幾つかの実施形態においては、無細胞転写および翻訳系がＭＴＲキナーゼの製造において有用である。幾つかの系が商業的に入手可能であり、該方法は当業者に周知である。

ＭＴＲキナーゼの進化方法
幾つかの実施形態においては、本開示のＭＴＲキナーゼを製造するために、リボースおよび５－イソブチリルリボースの１－ホスホリル化を触媒するＭＴＲキナーゼを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から得る（または誘導する）。幾つかの実施形態においては、特定の宿主細胞におけるＭＴＲキナーゼの発現を増強するために、親ポリヌクレオチド配列をコドン最適化する。配列番号２として示されている親ポリヌクレオチド配列を大腸菌における発現のためにコドン最適化し、ＭＴＲキナーゼ遺伝子の発現をｔａｃプロモーターの制御下に配置した発現ベクター内に該コドン最適化ポリヌクレオチドをクローニングした。目的の遺伝子を発現するために必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼはｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあり、目的の遺伝子とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとの両方がグルコースによる抑制に付される。ラクトースまたはラクトース類似体、例えばイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの産生を活性化し、抑制を解除して、ＭＴＲキナーゼ遺伝子の産生をもたらす。活性なＭＴＲキナーゼを大腸菌において発現するクローンを特定し、遺伝子を配列決定して、それらの正体（同一性）を確認した。

本開示のＭＴＲキナーゼは、親配列をコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および／または定向進化法に付すことにより得られうる。代表的な定向進化技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１；ＷＯ ９５／２２６２５；ＷＯ ９７／２００７８；ＷＯ ９７／３５９６６；ＷＯ ９８／２７２３０；ＷＯ ００／４２６５１；ＷＯ ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されている突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである。使用されうる他の定向進化法には、とりわけ、スタガード伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（Ｚｈａｏら，１９９８，ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．１６：２５８－２６１）、突然変異誘発性ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら，１９９４，ＰＣＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＰＰＬ．３：Ｓ１３６－Ｓ１４０）およびカセット突然変異誘発（Ｂｌａｃｋら，１９９６，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９３：３５２５－３５２９）が含まれる。

突然変異誘発処理後に得られたクローンを、所望の改善された酵素特性を有するＭＴＲキナーゼに関してスクリーニングする。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、基質および生成物を測定するための標準的な化学分析技術、例えばＵＰＬＣ－ＭＳを用いて行われうる。この反応においては、ＡＴＰのガンマホスファート残基がＭＴＲキナーゼによって基質の１位に転移されて、ＡＤＰおよびリン酸化リボースまたは５－イソブチリルリボースを生成する。この反応は、ＭＴＲキナーゼが収量制限性触媒である条件下でも実施可能であり、その場合、ＭＴＲキナーゼの濃度が２倍または半分になると、所定の時点で観察されるヌクレオシド生成物の収量が２倍または半分になる。所望の改善される酵素特性が熱安定性である場合、酵素調製物を所定温度にさらし、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後、酵素活性が測定されうる。ついで、ＭＴＲキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化を（もしあれば）特定し、宿主細胞において酵素を発現させるために該クローンを使用する。

ポリペプチドの配列が既知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従い、標準的な固相法により製造されうる。幾つかの実施形態においては、最大約１００塩基の断片を個別に合成し、ついで（例えば、酵素的もしくは化学的連結法またはポリメラーゼ媒介法により）連結して、任意の所望の連続的配列を形成させることが可能である。例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えばＢｅａｕｃａｇｅら，１９８１，ＴＥＴ．ＬＥＴＴ．２２：１８５９－６９に記載されている古典的なホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１－０５に記載されている方法（例えば、それは自動合成方法において典型的に実施されている）を用いる化学合成により製造されうる。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置において合成し、精製し、アニーリングし、連結し、適切なベクター内にクローン化する。また、実質的に任意の核酸が、種々の商業的入手元、例えばＴｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘ．、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｍｏｎａ，Ｃａｌｉｆ．、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．およびその他多数から入手可能である。

宿主細胞において発現されたＭＴＲキナーゼポリペプチドは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知の技術のいずれか１以上を用いて、細胞および／または培地から回収されうる。大腸菌のような細菌からのタンパク質の高効率抽出および細胞溶解のための適切な溶液はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商品名Ｂ－ＰＥＲ（商標）として商業的に入手可能である。

ＭＴＲキナーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術には、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティクロマトグラフィーが含まれる。特定の酵素を精製するための条件は正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような要因に部分的に左右され、当業者に明らかであろう。

幾つかの実施形態においては、改良されたＭＴＲキナーゼポリペプチドを単離するためにアフィニティ技術が用いられうる。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合、タンパク質配列が、精製を可能にする認識配列でタグ付けされうる。一般的なタグには、セルロース結合ドメイン、ポリＨｉｓタグ、ジＨｉｓキレート、ＦＬＡＧタグ、および当業者に明らかな他の多数のタグが含まれる。抗体もアフィニティ精製試薬として使用されうる。ＭＴＲキナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用されうる。

ＭＴＲキナーゼの使用方法
本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼは、式Ａ：

の基質化合物から、式Ｂ：

の対応異性体生成物へのリン酸化を触媒しうる。特定の実施形態においては、本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼは、式Ｃ：

の基質化合物から、式Ｄ：

の対応異性体生成物へのリン酸化を触媒しうる。

幾つかの実施形態においては、リン酸化のための方法は、リン酸化に適した反応条件下、基質を、本明細書に開示されているＭＴＲキナーゼと接触させ又はインキュベートすることを含む。幾つかの実施形態においては、生成物は、対応する副次的生成物に対して約９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％を超えるジアステレオマー過剰率を示す。

基質をリン酸化して生成物を得る方法の幾つかの実施形態においては、基質をリン酸化して、約８５％を超えるジアステレオマー過剰率で生成物を得、ここで、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１または１２に対応する配列を含む。基質をリン酸化して生成物を得る方法の幾つかの実施形態においては、基質をリン酸化して、約８５％を超えるジアステレオマー過剰率で生成物を得、ここで、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または１０に対応するＤＮＡ配列によってコードされる。

基質をリン酸化して生成物を得るこの方法のもう１つの実施形態においては、約５０ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満の該ポリペプチドを使用して実施した場合、基質の少なくとも約９５％が約２４時間以内に変換されて生成物を与え、ここで、該ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１または１２に対応するアミノ酸配列を含む。基質をリン酸化して生成物を得る該方法の実施形態においては、約５０ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満の該ポリペプチドを使用して実施した場合、基質の少なくとも約９５％が約２４時間以内に生成物に変換され、ここで、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または１０に対応するＤＮＡ配列によってコードされる。

幾つかの実施形態においては、リン酸化するための方法は、リン酸化リボースもしくはホスファートリボース誘導体またはその塩を製造するプロセスを含み、該プロセスは、配列番号１、３、５、７、９、１１または１２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドの存在下、リボースまたはリボース誘導体をホスファート源と反応させることを含み、ここで、ＭＴＲキナーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または１０に対応するＤＮＡ配列によってコードされる。特定の実施形態においては、リボースまたはリボース誘導体は、

からなる群から選択される。特定の実施形態においては、該プロセスは、配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８もしくは１０に対応するＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの存在下、リボースをホスファート源と反応させることを含む。

他の特定の実施形態においては、該プロセスは、配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８もしくは１０に対応するＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの存在下、リボースをホスファート源と反応させることを含む。

本開示の追加的な実施形態は、

からなる群から選択される化合物を提供する。

当業者に公知のとおり、キナーゼ触媒反応は典型的には補因子を必要とする。本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼポリペプチドによって触媒される反応も典型的には補因子を必要とするが、操作されたＭＴＲキナーゼの多数の実施形態は、野生型ＭＴＲキナーゼによって触媒される反応より遥かに少ない補因子を必要とするに過ぎない。本明細書中で用いる「補因子」なる語は、ＭＴＲキナーゼ酵素と共に作用する非タンパク質化合物を意味する。本明細書に記載されている操作されたＭＴＲキナーゼとの使用に適した補因子には、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋またはＣｏ^２＋を含む２価カチオン、およびＡＴＰを含むヌクレオチド三リン酸であって、ホスファート残基を基質に転移させる補因子として作用するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼ触媒リン酸化反応は、一般に、溶媒中で行われる。幾つかの実施形態においては、水および水性共溶媒系を含む水性溶媒が使用される。

例示的な水性共溶媒系は水および１以上の有機溶媒を含有する。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それがＭＴＲキナーゼ酵素を完全には不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、酵素活性アッセイ、例えば本明細書に記載されているアッセイを用いて、候補溶媒系において、定められた目的基質を使用して特定の操作されたＭＴＲキナーゼの酵素活性を測定することによって容易に特定されうる。

水性共溶媒系の有機溶媒成分は、単一の液相を生成するように水性成分と混和性であることが可能であり、あるいは、２つの液相を生成するように水性成分と非混和性または部分混和性であることが可能である。一般に、水性共溶媒系を使用する場合、それは、有機溶媒中に水が分散した又はその逆の二相系になるように選択される。一般に、水性共溶媒系を使用する場合、水相から容易に分離されうる有機溶媒を選択することが望ましい。一般に、共溶媒系における有機溶媒に対する水の比は、典型的には、約９９：１～約１０：９０（ｖ／ｖ）の有機溶媒対水、そして８０：２０～２０：８０（ｖ／ｖ）の有機溶媒対水の範囲である。共溶媒系は反応混合物への添加の前に予め形成されることが可能であり、あるいは、それは反応容器内でインシトゥで形成されることが可能である。

水性溶媒（水または水性共溶媒系）はｐＨ緩衝化されていても、緩衝化されていなくてもよい。一般に、リン酸化は約５～約９の範囲のｐＨで行われうる。幾つかの実施形態においては、リン酸化は、約８以下、しばしば約５～約８の範囲、通常は約６．５～約８の範囲のｐＨで行われる。

リン酸化反応の過程で、反応混合物のｐＨが変化しうる。反応混合物のｐＨは反応の過程で酸または塩基の添加によって所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲内に維持されうる。あるいは、ｐＨは、バッファーを含む水性溶媒を使用することにより制御されうる。所望のｐＨ範囲を維持するための適切なバッファーは当技術分野で公知であり、例えばリン酸バッファー、トリエタノールアミンバッファーなどを包含する。バッファーと酸または塩基との添加の組合せも用いられうる。

化学量論的なアセチルまたはプロピオニルＡＴＰ再生系を使用する場合、式（１）に示されるとおり、酢酸またはプロピオン酸（ｐＫａ＝３．６）の同時生成は、生じる水性酢酸またはプロピオン酸（ｐＫａ＝４．７）が別の手段で中和されないならば、反応混合物のｐＨを低下させる。達成される緩衝能までバッファーが酢酸またはプロピオン酸を中和する標準的な緩衝化技術により、または変換過程と同時に塩基を添加することにより、反応混合物のｐＨは所望のレベルに維持されうる。緩衝化と塩基添加との組合せも用いられうる。所望のｐＨ範囲を維持するための適切なバッファーは前記に記載されている。酢酸またはプロピオン酸の中和のための適切な塩基としては、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなど、および無機塩基、例えば水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ_３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ_２ＣＯ_３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４）などが挙げられる。変換過程と同時の塩基を添加することは、反応混合物のｐＨをモニターしながら手動で、あるいは、より簡便には、自動滴定装置をｐＨスタットとして使用することによって行われうる。部分緩衝能と塩基添加との組合せもプロセス制御に用いられうる。

ＭＴＲキナーゼ触媒リン酸化反応中に放出された酢酸またはプロピオン酸を中和するために塩基添加を用いる場合、変換の進行は、ｐＨを維持するために添加される塩基の量によりモニターされうる。典型的には、リン酸化の経過にわたって非緩衝化または部分緩衝化反応混合物に添加される塩基は水溶液として添加される。

幾つかの実施形態においては、宿主生物の全細胞を使用して該プロセスを行う場合、全細胞がＡＴＰを自然に提供しうる。代替的にまたは組合せて、ピルビン酸オキシダーゼ、またはＡＴＰの再生利用に必要な他の酵素を、細胞が自然にまたは組換えにより提供しうる。

本明細書に記載されている立体選択的リン酸化反応を行う際に、ＭＴＲキナーゼ酵素、および所望により用いられうるＡＴＰ再生系を含む任意の酵素は、精製された酵素の形態、酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞の形態、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくはライセートの形態で、反応混合物に添加されうる。ＭＴＲキナーゼポリペプチドをコードする遺伝子と、所望により用いられうるＡＴＰ再生酵素をコードする遺伝子とは、宿主細胞内に別々に、または同一宿主細胞内に一緒に形質転換されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、１つのセットの宿主細胞は、ＭＴＲキナーゼをコードする遺伝子で形質転換されることが可能であり、別のセットは、ＡＴＰ再生酵素をコードする遺伝子で形質転換されることが可能である。形質転換細胞の両方のセットは、全細胞の形態で、またはそれに由来する抽出物もしくはライセートの形態で、反応混合物において一緒に使用されうる。他の実施形態においては、宿主細胞は、ＭＴＲキナーゼポリペプチドとＡＴＰ再生酵素との両方をコードする遺伝子で形質転換されうる。

ＭＴＲキナーゼポリペプチドおよび／または所望により使用されうるＡＴＰ再生酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞またはその細胞抽出物および／もしくはライセートは、固体（例えば、凍結乾燥物、噴霧乾燥物など）または半固体（例えば、粗ペースト）を含む種々の異なる形態で使用されうる。

細胞抽出物または細胞ライセートは、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）、およびそれに続く、凍結乾燥前の脱塩操作（例えば、限外濾過、透析など）により、部分的に精製されうる。細胞調製物はいずれも、公知架橋剤を使用して架橋することによって安定化されうる。

本明細書に記載されているＭＴＲキナーゼ触媒反応を行うための適切な条件には、通常の実験によって容易に最適化されうる多種多様な条件が含まれる。そのような実験は、操作されたＭＴＲキナーゼポリペプチドと基質とを実験的なｐＨおよび温度で接触させ、そして、例えば、本明細書で提供される実施例に記載されている方法を使用して、生成物を検出すること含むが、これらに限定されるものではない。

ＭＴＲキナーゼ触媒リン酸化は、典型的には、約２０℃～約５５℃の範囲の温度で行われる。幾つかの実施形態においては、それは約２０℃～約４５℃の範囲の温度で行われる。反応は周囲条件下においても行われうる。

反応は、一般に、実質的に完全な又はほぼ完全な基質リン酸化が達成されるまで、進行させる。基質から生成物へのリン酸化は、基質および／または生成物を検出することによる公知方法を用いてモニターされうる。適切な方法には、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ（荷電エアロゾル検出）、ＨＰＬＣ－ＭＳなどが含まれる。反応混合物中で生成されるリン酸化生成物の変換収率は、一般に、約５０％を超え、また、約６０％を超えることもあり、約７０％を超えることもあり、約８０％を超えることもあり、約９０％を超えることもあり、約９７％を超えることも多い。

実施例
略語
ＡＴＰ： アデノシン５’－三リン酸
ＤＮアーゼＩ： ＤＮＡを非特異的に切断して、５’－リン酸化末端および３’－ヒドロキシル化末端を有するジ、トリおよびオリゴヌクレオチド生成物を遊離させる商業的に入手可能なエンドヌクレアーゼ
ＩＰＴＧ： イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド
ＬＢ寒天： 細菌の培養および増殖のための商業的に入手可能な栄養豊富な培地であるルリア（Ｌｕｒｉａ）－ベルターニ（Ｂｅｒｔａｎｉ）培地
ＬＢブロス： 細菌の培養および増殖のための商業的に入手可能な栄養豊富な培地であるルリア（Ｌｕｒｉａ）－ベルターニ（Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス
ＮｄｅＩ： ナイセリア・デニトリフィカンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）から単離されたエンドヌクレアーゼである商業的に入手可能な制限酵素
ｐＥＴ３０： 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の発現のための商業的に入手可能な系
ＸｈｏＩ： 商業的に入手可能な制限酵素
ＺＹＭ－５０５２： 細菌の培養および増殖のための商業的に入手可能な栄養豊富な培地
ｗ／ｖ： 体積当たりの重量
実施例１：ウェルプレート反応用の酵素製造
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のコドン最適化野生型ＭＴＲキナーゼを合成し、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を介してｐＥＴ３０内にクローニングした。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の野生型ＭＴＲキナーゼを含有するプラスミドをエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）内にエレクトロポレーションにより形質転換した。３７℃で１時間増殖させた後、形質転換体の一部を、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンおよび１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足されたＬＢ寒天上にプレーティングした。翌日、コロニーを採取し、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンおよび１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足された０．２ｍＬ／ウェルのルリア－ベルターニ・ブロス（細胞用培地）を含有する９６ウェルプレートに接種した。該９６ウェルプレートを２５０ＲＰＭ／３０℃で一晩振盪した。翌日、各ウェルからの０．０１ｍＬ／ウェルの培養物を使用して、０．３９ｍＬ／ウェルのＺＹＭ－５０５２培地を含有する新たな９６ウェルプレートの対応ウェルに接種した。この培養物を３０℃／２５０ＲＰＭで１８時間増殖させ、その時間の後、細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を廃棄した。遠心分離後、細胞を凍結し、解凍し、次いで細胞溶解バッファー（０．２ｍＬ／ウェルの５０ｍＭ トリエタノールアミン－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬ 硫酸ポリミキシンＢ、１Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼＩおよび１ｍＭ ＭｇＳＯ_４）に再懸濁させた。次いでプレートを室温で１２００ＲＰＭで２時間振盪した。次いでライセートを遠心分離（４０００×ｇ、１０分間）によって清澄化した。次いでこの工程の後の上清を後続のウェルプレート反応に使用した（実施例３）。

実施例２：バイアルおよび大規模反応用の酵素製造
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のコドン最適化野生型ＭＴＲキナーゼを合成し、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を介してｐＥＴ３０内にクローニングし、Ｔ４リガーゼを使用して連結した。Ｔ７ｆおよびＴ７ＴＲＭ配列決定プライマーを使用して、プラスミドを配列決定した。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の野生型ＭＴＲキナーゼ含むプラスミドをエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）内にエレクトロポレーションにより形質転換した。３７℃で１時間増殖させた後、形質転換体の一部を、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンおよび１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足されたＬＢ寒天上にプレーティングした。翌日、単一コロニーを採取し、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンおよび１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足された５０ｍＬのルリア－ベルターニ・ブロス（細胞用培地）を含有する１２５ｍＬのフラスコ内に接種した。フラスコを２５０ＲＰＭ／３０℃で一晩振盪した。翌日、１ＬのＺＹＭ－５０５２培地を含有する２．８Ｌのフラスコに、飽和した一晩培養物の１００倍希釈物を接種した。この培養物を３０℃／２５０ＲＰＭで１８時間増殖させ、その時間の後、細胞を遠心分離により回収した。遠心分離後、１ｍＬの５０ｍＭ 水性トリエタノールアミン－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）の０．３３グラムの濃度まで細胞を再懸濁させた。この懸濁液を２０℃で３０分間振盪し、その時間の後、細胞を氷上に配置して冷却し、次いで高圧均質化（１６，０００ＰＳＩ）によって破砕した。次いで、得られたライセートを、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって清澄化した。遠心分離後、上清を凍結し、凍結乾燥した。

実施例３：ウェルプレートにおけるＭＴＲキナーゼ反応

９６ウェル丸底ポリプロピレンプレートのウェルに、５’－イソブチリルリボース（水中の１．１４Ｍ、１６μＬ、４ｍｇ）、リン酸プロピオニルモノアンモニウム塩（水中の１Ｍ、ｐＨを７．５に調整、２５μＬ、４．３ｍｇ）、トリエタノールアミン（水中の１Ｍ、ｐＨを７．５に調整、４０μＬ、６．０ｍｇ）、塩化マグネシウム（水中の０．１Ｍ、１０μＬ、０．０９５ｍｇ）、ＡＴＰ（水中の０．１Ｍ、２μＬ、０．１１ｍｇ）、以下の配列番号１３によって特定されるアミノ酸配列を有する酢酸キナーゼ（水中の２０ｇ／Ｌ、４μＬ、０．０８ｍｇ）、配列番号３によって特定されるアミノ酸配列を有するＳ－メチルチオリボースキナーゼ（水中の２ｇ／Ｌ、１００μＬ、０．２ｍｇ）を入れた。プレートを密閉し、２５℃、７００ＲＰＭで一晩振盪した。１０μＬの反応混合物を採取し、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析用の１９０μＬの５０／５０（ｖ／ｖ）アセトニトリル：水で希釈した。９５％のアッセイ収率が得られた。

ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＲＶＬＮＩＮＳＧＳＳＳＩＫＹＱＬＩＥＭＥＧＥＫＶＬＣＫＧＩＡＥＲＩＧＩＥＧＳＲＬＶＨＲＶＧＤＥＫＨＶＩＥＲＥＬＰＤＨＥＥＡＬＫＬＩＬＮＴＬＶＤＥＫＬＧＶＩＫＤＬＫＥＩＤＡＶＧＨＲＶＶＨＧＧＥＲＦＫＥＳＶＬＶＤＥＥＶＬＫＡＩＥＥＶＳＰＬＡＰＬＨＮＰＡＮＬＭＧＩＫＡＡＭＫＬＬＰＧＶＰＮＶＱＶＦＤＴＡＦＨＱＴＩＰＱＫＡＹＬＹＡＩＰＹＥＹＹＥＫＹＫＩＲＲＹＧＦＨＧＩＳＨＲＹＶＳＫＲＡＡＥＩＬＧＫＫＬＥＥＬＫＩＩＴＣＨＩＧＮＧＡＳＶＡＡＶＫＹＧＫＣＶＤＴＳＭＧＦＴＰＬＥＧＬＶＭＧＴＲＳＧＤＬＤＰＡＩＰＦＦＩＭＥＫＥＧＩＳＰＱＥＭＹＤＩＬＮＫＫＳＧＶＹＧＬＳＫＧＦＳＳＤＭＲＤＮＦＥＡＡＬＫＧＤＥＷＣＫＬＶＬＥＩＹＤＹＲＩＡＫＹＩＧＡＹＡＡＡＭＮＧＶＤＡＩＶＦＴＡＧＶＧＥＮＳＰＩＴＲＥＤＶＣＫＹＬＥＦＬＧＶＫＬＤＫＱＫＮＥＥＴＩＬＧＫＥＧＩＩＳＴＰＤＳＲＶＫＶＬＶＶＰＴＮＥＥＬＭＩＡＲＤＴＫＥＩＶＥＫＩＧＲ（配列番号１３）。

実施例４：バイアル内のＭＴＲキナーゼ反応
清潔で乾燥したＦａｌｃｏｎチューブに６０ｍｇのトリエタノールアミン、４ｍｇのＭｇＣｌ六水和物、２００ｍｇのリン酸プロピオニルモノアンモニウム塩および３ｍｇのＡＴＰを４ｍＬの水と共に加えた。溶液のｐＨは約４．０であったため、６Ｍ ＫＯＨ溶液を使用してｐＨを７．５に調整した。次いで２００ｍｇの５’－イソブチリルリボース、および前記の配列番号１３によって特定されるアミノ酸配列を有する４ｍｇの酢酸キナーゼを該ｐＨ調整ストック溶液に加えた。ｐＨは変化しなかった。

２つの清潔で乾燥した２ドラムバイアルに５０ｍｇのＭＴＲキナーゼポリペプチド変異体を加え、次いで他の試薬の１ｍＬストック溶液を加えた。反応が完了したと判断されるまで、反応液を３０℃、５００ｒｐｍで撹拌した。表２に変換を示す。

前記および他の特徴および機能またはそれらの代替物の種々のものは多数の他の異なる系または適用へと望ましく組合されうると理解されるであろう。また、それにおける種々の代替、修飾、変更または改良が当業者によって後に行われうるが、これらもまた、以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。

Claims (23)

1. 配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のいずれかの配列の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する領域を含むポリペプチド。
2. 前記ポリペプチドが、配列番号３の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１記載のポリペプチド。
3. 前記ポリペプチドが、配列番号５の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１記載のポリペプチド。
4. 前記ポリペプチドが、配列番号７の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１記載のポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、配列番号９の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１記載のポリペプチド。
6. 前記ポリペプチドが、配列番号１１の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１記載のポリペプチド。
7. 前記ポリペプチドが、配列番号１２の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１記載のポリペプチド。
8. 配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のいずれかの配列の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド。
9. 前記ポリペプチドが、配列番号４の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる、請求項８記載のポリペプチド。
10. 前記ポリペプチドが、配列番号６の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる、請求項８記載のポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドが、配列番号８の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる、請求項８記載のポリペプチド。
12. 前記ポリペプチドが、配列番号１０の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる、請求項８記載のポリペプチド。
13. 宿主細胞におけるコード化ポリペプチドの発現を導くのに適した１以上の制御配列に機能的に連結された、請求項１～請求項１２のいずれか１項記載のポリペプチドを含む発現ベクター。
14. 制御配列がプロモーターを含む、請求項１３記載の発現ベクター。
15. プロモーターが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターを含む、請求項１４記載の発現ベクター。
16. 請求項１３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
17. 前記宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１６記載の宿主細胞。
18. 請求項１～請求項１２のいずれか１項記載のポリペプチドの存在下、リボースまたはリボース誘導体をホスファート源と反応させることを含む、リン酸化リボースもしくはリン酸化リボース誘導体またはその塩の製造方法。
19. リボースまたはリボース誘導体が、
    

    

    からなる群から選択される、請求項１８記載の製造方法。
20. 請求項１～請求項１２のいずれか１項記載のポリペプチドの存在下、リボースをホスファート源と反応させることを含む、請求項１８記載の製造方法。
    

    
21. 請求項１～請求項１２のいずれか１項記載のポリペプチドの存在下、リボースをホスファート源と反応させることを含む、請求項１８記載の製造方法。
    

    
22. 

    からなる群から選択される化合物。
23. 化合物が
    

    

    である、請求項２２記載の化合物。