CN113832204A - Nmn的制备方法及含nmn的犬猫抗衰老保健品配方 - Google Patents

Nmn的制备方法及含nmn的犬猫抗衰老保健品配方 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NMN的制备方法及含NMN的犬猫抗衰老保健品配方。NMN(β‑烟酰胺单核苷酸)采用含NMN短双岐杆菌生物酶催化法制备，得到纯度99.97%的β‑NMN。一种含NMN的犬猫抗衰老保健品配方，包括60‑85份鱼油、1‑10份β‑NMN、0.05‑0.2份白藜芦醇、5‑20份牛磺酸和1‑15份卵磷脂。本发明能有效修复DNA损伤，延缓犬猫衰老，提高生命活力，增强能量代谢，缓解疲劳，对心脑血管疾病、经退行性病及老化退行性疾病等也具有较好的预防和修复作用。

Description

NMN的制备方法及含NMN的犬猫抗衰老保健品配方
技术领域
本发明属于犬猫抗衰老保健品技术领域，特别是涉及NMN的制备方法及含NMN的犬猫抗衰老保健品配方。
背景技术
近现代以来，随着宠物食品质量的提升，宠物营养水平也随之提高，同时医疗水平也不断提升，使宠物年龄更加延长，近60年数据统计发现，宠物的平均年龄翻了2倍。进入21世纪以来，宠物保健品的科研资源投入不断增加，市面上出现各式各样的宠物保健产品，其中关于延长宠物寿命的保健较为热门。
随着宠物年龄的增长，例如宠物犬猫步入中年以后体内NAD+（中文名烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称为辅酶Ⅰ）水平不断下降，导致线粒体的活性衰退，即出现衰老现象。改善犬猫体内NAD+活性能够有效地增强线粒体的功能，从来缓解衰老，所以补充NAD+是抗衰老的关键之一。补充NAD+的方式主要是补充NAD+的前体物质，目前研究报道发现NAD+有四种前体物质，NMN(β-烟酰胺单核苷酸)与其它的NAD+前体如烟酰胺核糖(NR)、烟酸(NA)和烟酰胺(NAM)在结构上相似，均含有吡啶环结构；但烟酸(NA)和烟酰胺(NAM)在应用方面存在一些缺点，如烟酰胺会引起恶心呕吐以及过敏的风险，而高剂量服用烟酰胺会引起肝脏毒性，四种NAD+前体物质中，NMN是补充效率最高的NAD+前体物质，NMN会被机体高效代谢，不会引起任何明显的有害影响。目前中国市场上NMN产品主要是人用级别的，在宠物市场上，还没有一款含NMN的抗衰老犬猫保健品。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种NMN的制备方法及含NMN的犬猫抗衰老保健品配方。
一种NMN的制备方法，步骤如下：
1）微生物培养
含NMN短双岐杆菌培养基条件为：MRS培养，进行催化NMN的表达；所述的MRS含1%蛋白胨，2%葡萄糖，0.1%吐温80，0.2%K2HPO4，0.5%乙酸钠，0.2% 氢二铵，0.02%MgSO4·7H2O，0.005% MnSO4·4H2O，0.1%微量金属溶解液和0.0076%的尿嘧啶，外源添加催化酶烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase）；
2）NMN培养滤液获取
含NMN的短双岐杆菌用转速2200g进行离心，分别收集每管细胞的上清液，将细胞进重悬浮，再利用超声细胞破碎器在冰浴上进行超声裂解，每次30秒，循环3次，超声进一步裂解之后再行超滤最终得到NMN料液；
3）NMN料液萃取
将含NMN料液与相同体积的质量百分比浓度4% 的NaHCO3混合，用于Bond ElutPBA树脂固相萃取；萃取液用3ml 2%的NaHCO3洗涤后，再用3ml 2%的甲酸进行洗脱，得到β-NMN萃取液；
4）NMN原料制备
用离子交换法进行对NMN萃取液进行除盐处理，然后用醇提水沉法进行脱色处理，脱完色后用蒸发溶剂法进行NMN液体的结晶，结晶样品加水溶解，用转速2200g进行离心过滤，最后对样品进行干燥后得到NMN原料。
所述的短双歧杆菌的编号为bifidobacterium breve K，双歧杆菌属，先准备短双岐杆菌感受态细胞，然后导入含有NMN活性序列的质粒到感受态的短双岐杆菌得到NMN短双岐杆菌。
所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶为外源酶，添加量8g/L。
一种含NMN的犬猫抗衰老保健品配方，按质量份，包括60-85份鱼油、1-10份β-NMN、0.05-0.2份白藜芦醇、5-20份牛磺酸和1-15份卵磷脂。
所述的含NMN的犬猫抗衰老保健品配方，包括冻干、粉剂、胶囊或者液体的形态。
本发明有益效果：
该抗衰老配方制成的产品，有助于通过提升体内NAD+的水平来缓解犬猫的衰老状况，改善犬猫毛发粗糙的状态，此外，该配方产品还能改善犬猫易疲劳的状态，增加生命活力。其中，鱼油是载体，NMN为发挥作用的核心成分。添加白藜芦醇、牛磺酸等是为了让NMN能更持久的发挥作用，单一NMN成分的产品在服用一星期后效果就会显著下降，通过添加这些成分能够让NMN的作用时间延长到2个星期。
表1. 各成分功能
成分 功能
Β-烟酰胺单核苷酸（NMN） NAD+的前提物质，通过增加NAD+的体内表达水平来改善线粒体活性以及修复损伤的DNA等，从而缓解动物衰老状况
鱼油 改善毛发，降低动物胆固醇水平
白藜芦醇 改善机体抗氧化水平，保护心血管功能
牛磺酸 增强犬猫尤其是猫的免疫力
卵磷脂 改善毛发，减少犬猫掉毛
附图说明
图1是NMN抗衰老保健品的实物图。
图2是NMN磷谱检测图。
图3是HPLC分析NMN的纯度。
图4是骨骼肌NAD+水平。
图5是白色脂肪组织（WAT）NAD+水平。
图6是肺部NAD+水平。
图7是不同组别猫平均日采食量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1、NMN提取以及指标检测
NMN的提取过程主要过程如下：
①微生物培养。含NMN短双岐杆菌培养基条件为：MRS培养（含1%蛋白胨，2%葡萄糖，0.1%吐温80，0.2%K2HPO4， 0.5%乙酸钠，0.2% 氢二铵，0.02%MgSO4·7H2O，0.005% MnSO4·4H2O，0.1%微量金属溶解液和0.0076%的尿嘧啶，外源添加催化酶烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase ）进行催化NMN的催化表达。
②NMN培养滤液获取。含NMN的短双岐杆菌用转速2200g进行离心，分别收集每管细胞的上清液，将细胞进重悬浮，再利用超声细胞干扰器在冰上进行超声裂解，每次30秒，循环3次，超声进一步裂解之后再行超滤和纳滤最终得到NMN料液。
③NMN料液萃取。将含NMN的培养滤液(15 ml)与相同体积的4% NaHCO3混合，用于Bond Elut PBA树脂固相萃取。萃取液用3ml 2%的NaHCO3洗涤后，再用3ml 2%的甲酸进行洗脱，得到的萃取液用于HPLC分析。HPLC参数如下：柱型:Hypersil BDS C18，5u，200*4.6；流动相：10%乙腈和pH 6.0缓冲液(V/V) ，流速:1mL/min；检测：UV检测，254nm；柱温:25°C。 ④NMN原料制备。用离子交换法进行对NMN萃取液进行除盐处理，然后用醇提水沉法进行脱色处理，脱完色后用蒸发溶剂法进行NMN液体的结晶，结晶样品加水溶解，用转速2200g进行离心过滤，最后对样品进行干燥后得到NMN原料。
⑤含NMN的抗衰老保健产品制备。预混料按分量（1-10份NMN（β-NMN）、0.05-0.2份白藜芦醇、5-20份牛磺酸和1-15份卵磷脂）称取混合到60-85份鱼油中，最终成品制成软胶囊形态。NMN抗衰老保健品的实物图如图1所示。
⑥含NMN鱼油胶囊的检测。对NMN样品进行微量元素、营养指标、微生物以及重金属等指标检测，检测项目包括，粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、水分、铅、砷、牛磺酸、EPA、DHA、DPA、β-烟酰胺单核苷酸（β-NMN）、卵磷脂、沙门氏菌、大肠杆菌、黄曲霉毒素B1。
表2.NMN犬猫保健品部分指标检测结果
检测指标 计量单位 检测结果 检测方法
粗蛋白 % 8.18 GB/T 6432-2018 7.2
粗脂肪 % 85.2 GB/T 6433-2006（A类）
粗灰分 % 1.2 GB/T 6438-2007
粗纤维 % 0.35 GB/T 6434-2006
水分 % 0.34 GB/T 6434-2006
牛磺酸 mg/100g 7.81*10^3 GB 5009.169-2016第一法
EPA g/100g 41.6 GB/T 21514-2008
DHA g/100g 22.1 GB/T 21514-2008
DPA g/100g 3.22 GB/T 21514-2008
β-烟酰胺单核苷酸（β-NMN） mg/100g 4.67*10^3 GB/T 6434-2006
卵磷脂 mg/100g 6.25*10^3 GB/T 35867-2018
砷 ppm 未检出 GB/T 13079-2006 7
铅 ppm 未检出 GB/T 13080-2018 7.1
大肠杆菌 CFU/g 未检出 GB 4789.3-2016 第二法
沙门氏菌 CFU/g 未检出 GB/T 6434-2006
黄曲霉毒素B1 μg/kg 未检出（定量限1.0） GB/T 30955-2014
试验结果如下，样品的理化生化检测指标结果如表2所示，EPA，DHA和DPA总含量达66%，在添加量范围内，说明经过胶囊包装后，鱼油性状基本稳定，另外牛磺酸、卵磷脂、β-NMN都在添加量范围内。重金属指标方面，砷和铅均未检出，细菌毒素方面，大肠杆菌、沙门氏菌和黄曲霉素B1都低于检测限未检出，说明该产品的安全性较高。以上所有指标的检测方法都严格按照国标进行检测。
实施例2、NMN原料结构分析
①根据实施例1中获取的NMN原料，对NMN结构进行纯度检测，纯度检测使用高效液相色谱仪器进行检测HPLC参数如下：柱型:Hypersil BDS C18，5u，200*4.6；流动相：10%乙腈和pH 6.0缓冲液(V/V) ，流速:1mL/min；检测：UV检测，254nm；柱温:25°C。
②对NMN进行含磷化合物检测，采用磷谱检测方法，磷谱检方法数如下，仪器采用Burker AVANCE-300超导核磁共振仪，溶剂为D2O，重水毛细管锁场，样品浓度稀释到25%，以四甲基硅烷为内标，样品管径为5mm，同核去偶用综合频率发生器，频率为1Hz，测定含磷化合物的31P NMR值。
试验结果如下，核磁共振磷谱中，含磷化合物均会有信号出现，即出现化学位移，磷谱检测结果如图2所示，在化学位移0.00处出现了峰值，即含磷酸基团，其他化学位移均未出现化学位移，该检测结果与NMN结构本身含磷酸基团一致，无其他化学位移说明该NMN样品只含单一磷酸基团，纯度极高。另外，磷谱检测的目的还可以用来证明该原料不是烟酰胺核糖（NR），NR没有磷谱数据，NR也是NAD+的前体补充剂，结构与NMN类似，因此很多声称含NMN产品其实用NR来冒充NMN，而磷谱检测能较快也较准确地判断出是里面的有效成分否为NR。
在核磁共振磷谱的基础上，我们进行了下一步试验，通过HPLC分析NMN纯度发现，如图3所示，图谱中共出现两个峰，电信号强度分别是497毫吸光度单位（m AbsorbanceUnit，mAU）和1595697mAU，总电信号强度为1596194mAU，其中2号峰即2.534处峰的面积占总面积的99.97%，说明该样品中NMN纯度高达99.97%，该结果符合磷谱检测的预期，说明通过生物酶催化法提取的NMN纯度极高，几乎无副产物，相对纯度一般的NMN来说，高纯度NMN的安全性更高。
实施例3、腹腔注射NMN对小鼠体内NAD+水平的影响
小鼠在6个月龄时用高脂饮食（HFD）诱导的二型糖尿病（T2D）模型，将糖尿病定义为空腹血糖水平>120mg /dl小鼠的定义为T2D小鼠。小鼠分组如下：1、对照组，正常饲养的小鼠。2、HFD组，高脂饲喂的小鼠，3、HFD+NMN组，高脂饲喂后注射NMN。对于NMN治疗，采用腹腔内注射NMN，剂量为500 mg/kg体重/天，每4天注射1次，注射4次。注射结束后第4天（即试验开始的第20天）采集小鼠肺部、白色脂肪组织（WAT）、骨骼肌，采集后立即液氮中速冻，然后收集样品放入-20℃冰箱保存。使用HPLC仪器分析样品组织中的NAD+水平。
表3. 试验分组
组别 饲喂方式 注射方式 饲养周期
CON组 饲喂正常饲料 腹腔注射 20天
HFD组 饲喂高脂饲料 腹腔注射 20天
HFD+NMN组 饲喂高脂饲料 腹腔注射 20天
试验结果如下，相比于对照组，高脂饲喂的小鼠，肺部、WAT和骨骼肌的NAD+水平显著性下降，说明出现了一定的衰老现象，而腹腔注射了4次NMN之后，NAD+水平显著性上升，其中骨骼肌和肺部的NAD+水平高于CON组，说明体内的抗氧化能力得到了较大的提升，结果表明腹腔注射NMN能有效增加小鼠体内NAD+水平，如图4、图5和图6所示。
实施例4、饲喂含NMN抗衰老保健品对猫健康水平的影响
选取8只健康状态接近，无疾病史的绝育英短猫，年龄在6年-8年之间，按照公母各半分成两组，CON组每天饲喂H牌猫粮，NMN组每天饲喂H牌猫粮的基础上，饲喂一颗含NMN的鱼油，饲养周期2个月。试验前后分别检测猫粮的消化率、试验后的毛发质量（等级1-5分评分）、平均日采食量、试验前后体重。
表4. 饲养试验结果
组别 平均初体重（kg） 平均末体重（kg） 毛发质量 试验前消化率 试验后消化率
CON组 5.22 5.24 3.3 82.1% 83.2%
NMN组 5.14 5.21 4.1 81.6% 85.2%
试验结果如下，如图7所示，NMN组的平均日采食量随着饲养周期的增加而呈上升趋势，稳定在55-56克之间，表4的结果显示，消化率和平均体重也具有略微提升，毛发质量也具有一定的改善，说明饲喂含NMN抗衰老保健品能在一定程度上改善猫的体质。
上述试验结果和实施例是对本发明的具体描述，但是本发明不仅局限于上述的具体实施方式，上述试验结果仅仅是部分配方的配比和产品形态，并不是限制在这些配比和形态当中，同样的配比可以做成不同形态（冻干、粉剂、胶囊、液体）的产品。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (5)

1.一种NMN的制备方法，其特征在于：步骤如下：
1）微生物培养
含NMN短双岐杆菌培养基条件为：MRS培养，进行催化NMN的表达；所述的MRS含1%蛋白胨，2%葡萄糖，0.1%吐温80，0.2%K2HPO4，0.5%乙酸钠，0.2% 氢二铵，0.02%MgSO4·7H2O，0.005% MnSO4·4H2O，0.1%微量金属溶解液和0.0076%的尿嘧啶，外源添加催化酶烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase）；
2）NMN培养滤液获取
含NMN的短双岐杆菌用转速2200g进行离心，分别收集每管细胞的上清液，将细胞进重悬浮，再利用超声细胞破碎器在冰浴上进行超声裂解，每次30秒，循环3次，超声进一步裂解之后再行超滤最终得到NMN料液；
3）NMN料液萃取
将含NMN料液与相同体积的质量百分比浓度4% 的NaHCO3混合，用于Bond Elut PBA树脂固相萃取；萃取液用3ml 2%的NaHCO3洗涤后，再用3ml 2%的甲酸进行洗脱，得到β-NMN萃取液；
4）NMN原料制备
用离子交换法进行对NMN萃取液进行除盐处理，然后用醇提水沉法进行脱色处理，脱完色后用蒸发溶剂法进行NMN液体的结晶，结晶样品加水溶解，用转速2200g进行离心过滤，最后对样品进行干燥后得到NMN原料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的短双歧杆菌的编号为bifidobacterium breve K，双歧杆菌属，先准备短双岐杆菌感受态细胞，然后导入含有NMN活性序列的质粒到感受态的短双岐杆菌得到NMN短双岐杆菌。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶为外源酶，添加量8g/L。
4.一种含NMN的犬猫抗衰老保健品配方，其特征在于：按质量份，包括60-85份鱼油、1-10份β-NMN、0.05-0.2份白藜芦醇、5-20份牛磺酸和1-15份卵磷脂；所述的β-NMN根据权利要求1所述的制备方法制备得到。
5.根据权利要求4所述的含NMN的犬猫抗衰老保健品配方，其特征在于：包括冻干、粉剂、胶囊或者液体的形态。
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