KR20200061374A - 니코틴아미드모노뉴클레오티드의 제조 방법 및 그 방법에 사용하는 형질 전환체 - Google Patents

니코틴아미드모노뉴클레오티드의 제조 방법 및 그 방법에 사용하는 형질 전환체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생산 효율이 우수한 니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명(제1 발명군)에 관계되는 NMN의 제조 방법은, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt), 포스포리보실피로인산신타아제(Prs), 폴리인산키나아제(Ppk)의 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스-5-인산(R5P), 니코틴아미드(NAM), ATP, 및 폴리인산을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 공정을 포함한다.

Description

니코틴아미드모노뉴클레오티드의 제조 방법 및 그 방법에 사용하는 형질 전환체
본 발명은 니코틴아미드모노뉴클레오티드 등의 핵산계 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NAD+)의 합성 중간체이다. 근년, NMN은 NAD+로의 변환을 통하여 장수 유전자 「시르투인」의 활성을 컨트롤하는 것, NMN을 마우스에 투여하면 항노화 작용이 나타나는 것이 밝혀졌다. 또한, NMN은 당뇨병, 알츠하이머병, 심부전 등의 질환의 예방이나 증상의 개선에 효과가 있는 것도 보고되어 있다. 이러한 NMN에는, 기능성 식품, 의약품, 화장품 등의 성분으로서의 용도가 기대되고 있고, 생산성의 향상을 목표로 하여, 효율적인 제조 방법의 연구 개발이 진행되고 있다.
특허문헌 1에는, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)를 과잉 발현시킨 세포(효모, 세균 등)를 단리하고, 그 세포를 니코틴아미드(NAM)의 존재화로 배양하는, NMN의 제조 방법이 기재되어 있다(청구항 1, 13, 15 등). Nampt는, NAM과 세포 내에서 생합성되는 포스포리보실피로인산(PRPP)으로부터 NMN을 생성하는 효소이다. 특허문헌 1에는, PRPP의 생합성을 촉진하기 위해서, 상기 세포에 또한 포스포리보실피로인산신타아제(Prs)를 과잉 발현시키는 것도 기재되어 있다(청구항 3 등). Prs는, 리보오스-5-인산(R5P) 및 ATP로부터, PRPP 및 AMP를 생성하는 효소이다. 특허문헌 1에서는, 특정한 효소를 과잉 발현하는 세포를 살린 상태에서, 탄소원, 질소원 등을 함유하는 배지에서 배양시키면서, 생체 내에서의 효소 반응에 의해 NMN 등의 목적 화합물을 생성시키고 있다.
특허문헌 2에는, 반응 생성물에 대한 감수성이 약화된(즉, Prs에 의해 생성하는 PRPP에 의한 부의 피드백을 받기 어렵기 때문에, 계 내에의 PRPP의 공급량을 증가시킬 수 있는) Prs 변이체를 사용한, NAD 전구체의 합성 시스템이 기재되어 있다(청구항 1, 단락 0068 등). 이 Prs 변이체는, 재조합체에 있어서 생성되어, 단리, 정제된 것이어도 되는 것도 기재되어 있다(청구항 6 등). 특허문헌 2에는, 시스템이 또한 Nampt, ATP, R5P, PRPP을 포함하고 있어도 되는 것도 기재되어 있다(청구항 10, 20, 21, 23 등).
한편, 비특허문헌 1에는, 리보키나아제(Rbk, 당해 문헌에서는 RK라고 표기되어 있다), Prs(동일하게 PPS라고 표기되어 있다) 및 히포크산틴포스포리보실트랜스퍼라아제(8B3)의 3개의 효소를 사용하여, 리보오스로부터 이노신1인산(IMP)을 합성하는 방법이 기재되어 있다. Rbk는, 리보오스 및 ATP로부터 R5P 및 ADP를 생성하는 반응 (i)에 관여하고, Prs는, R5P 및 ATP로부터 PRPP 및 AMP를 생성하는 반응 (ii)에 관여하고, 8B3은 (iii) PRPP 및 이노신산으로 IMP 및 피로인산(PPi)을 생성하는 반응에 관여한다. 상기 비특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 반응 (ii)에서 생성하는 AMP로부터, 아데닐산키나아제에 의해 ADP가 재생된다. 또한, 그 재생된 ADP 및 반응 (i)에서 생성하는 ADP로부터, 포스포에놀피루브산 및 피루브산키나아제에 의해 ATP가 재생된다.
특허문헌 3에는, 단독으로 AMP로부터 ATP를 합성 가능한 효소인 폴리인산키나아제(Ppk) 2형을, 폴리인산 및 AMP와 반응시키는, ATP의 제조 방법이 기재되어 있다. 그러한 폴리인산키나아제 2형으로서, 호열균(Thermosynechococcus elongatus 등)에서 유래되는, 특정한 아미노산 서열을 갖는 폴리인산키나아제가 개시되어 있다. 특허문헌 3에는 또한, ATP를 이용하여 물질(목적 화합물)을 제조하는 방법에 있어서, 상기 ATP의 제조 방법을 동시에 실시함으로써, 목적 화합물의 합성 반응과 ATP의 재생 반응을 공액시켜, AMP로부터 재생된 ATP가 목적 화합물의 합성에 이용되도록 하는 것도 기재되어 있다.
특허문헌 4에는, 70℃, 10분간의 열처리여도 실활하지 않는 호열균 유래의 Ppk의 유전자를 포함하는 대장균을, 대장균의 통상 효소가 활성을 상실하고, 또한 폴리인산의 세포 투과성이 얻어지는, 60 내지 80℃에서 가열하고, 대장균의 세포막이 파괴된 상태에서, ATP의 재생 반응을 행하는 방법이 기재되어 있다.
특허문헌 5에는, NAM, ATP 및 리보오스를 원료로 하여, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제, 리보오스인산피로인산키나아제 및 리보오스키나아제의 촉매 작용 하에서 반응시키는 니코틴아미드모노뉴클레오티드의 제조 방법이 기재되어 있다.
비특허문헌 2에는, 호열균 유래의 Ppk 및 그에 의한 ATP 재생계를 이용한, 글리세롤3인산의 합성 방법이 기재되어 있다. 그 방법에서는, 글리세롤, ADP, 폴리인산, 글리세롤키나아제(GK), Ppk 등을 포함하는 완충액을 초발 반응액으로서 사용하고, 축차 폴리인산을 첨가하면서, 반응을 진행시키고 있다.
비특허문헌 3에는, Streptococcus sanguinis(스트렙토코쿠스 상퀴니스) 유래의 글루타티온신타아제(GshF)와, 특허문헌 3에 기재되어 있는 것과 마찬가지의 활성을 갖는 호열균 Thermosynechococcus elongates(테르모시네초코커스 일롱가테스) BP-1 유래의 Ppk에 의한 ATP 재생계를 공액시킨, 캐스케이드 반응에 의한 글루타티온의 제조 방법이 기재되어 있다.
국제 공개 2015/069860호 국제 공개 2016/198948호 일본 특허 공개 제2013-021967호 일본 특허 공개 제2007-143463호 국제 공개 2017/185549호
그러나, 특허문헌 1 내지 5 및 비특허문헌 1 내지 3에 개시된 방법은, NMN을 효율적으로 제조함에 있어서 문제가 있어, 우수한 방법이라고는 할 수 없다. 구체적으로는, 특허문헌 1에서는, 특정한 효소를 과잉 발현하는 세포를 살린 상태에서, 탄소원, 질소원 등을 함유하는 배지에서 배양시키면서, 생체 내에서의 효소 반응에 의해 NMN을 생성시키고 있는데, 그 생성량은 300㎚ol-NMN/g-효모 습균체 중량(실시예 1)이다. 가령, 효모 건조 균체 중량/효모 습균체 중량의 비가 0.2라고 가정하면, 약 0.5g-NMN/kg-효모 건조 균체 중량이 되고, 생성량이 낮다는 문제가 있다.
특허문헌 2에는, 반응 생성물에 대한 감수성이 약화된 Prs 변이체를 사용한, NAD 전구체의 합성 시스템이 기재되어 있다. 그러나, NMN의 생성을 나타내는 실시예는 기재되어 있지 않아, 구체적인 NMN의 제조 방법이나 생성량은 나타나 있지 않다.
특허문헌 3에는, 단독으로 AMP로부터 ATP를 합성 가능한 효소인 폴리인산키나아제(Ppk) 2형을 폴리인산 및 AMP와 반응시키는 ATP의 제조 방법과, 목적 화합물의 합성 반응을 공액시키는, 물질의 제조 방법이 기재되어 있다. 그러나, 구체적인 NMN의 제조 방법이나 생성량은 나타나 있지 않다.
특허문헌 4에는, 호열균 유래의 Ppk의 유전자를 포함하는 대장균을 가열하고, 대장균의 세포막이 파괴된 상태에서, ATP의 재생 반응을 행하는 방법이 기재되어 있지만, 구체적인 NMN의 제조 방법이나 생성량은 나타나 있지 않다.
특허문헌 5에는, 니코틴아미드, ATP 및 리보오스를 원료로 하여, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제, 리보오스인산피로인산키나아제 및 리보오스키나아제의 촉매 작용 하에서 반응시키는 니코틴아미드모노뉴클레오티드의 제조 방법이 기재되어 있다. 그러나, 특허문헌 5에서는, NMN의 제조에 다량의 ATP를 사용하고 있다. 구체적으로는, NMN 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP의 몰수가, 생성하는 NMN의 몰수의 2배 이상으로 되어 있다. ATP는 고가의 원료이기 때문에, 비용적으로 효율적인 제조 방법이라고는 할 수 없다.
따라서, 지금까지도 많은 NMN의 제조법은 나타나 있지만, NMN의 생성량 및 NMN의 제조를 위해 필요해지는 ATP의 양의 관점에서, 모두 충분한 것은 아니었다.
본 발명은 생산 효율이 우수한 니코틴아미드모노뉴클레오티드의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, Nampt, Prs 및 Ppk의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, R5P, NAM, ATP, 및 폴리인산과 접촉시켜서 효소 반응을 진행시킨 경우(도 1 참조), 종래의 방법보다도 효율적으로, 또한 저렴하게 NMN을 생산할 수 있음을 알아냈다. 또한, 상기 R5P를, Rbk 및 Ppk의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스, ATP, 및 폴리인산과 접촉시켜서 제조하는 경우에는, 더한층 효율적으로 또한 저렴하게 NMN을 생산할 수 있음을 알아내고, 제1 발명군을 완성시키기에 이르렀다.
또한, 본 발명자들은, 피로포스파타아제(PPase)의 존재 하에서, Nampt의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을 NAM 및 PRPP와 접촉시켜서 효소 반응을 진행시킨 경우, 종래의 방법보다도 효율적으로 NMN을 생산할 수 있음을 알아내고, 제2 발명군을 완성시키기에 이르렀다.
또한, 본 발명자들은, (d) EC 3.5.1.42에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자와, 이하의 (a)(c)(g)(h)(i)에 나타나는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자가 파괴 또는 결실되고, 또한, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화되어 있는 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 적어도 니코틴아미드(NAM)와 접촉시킴으로써, NMN의 분해를 현저하게 억제하면서, 효율적으로 NMN을 생산할 수 있음을 알아내고, 제3 발명군을 완성시키기에 이르렀다.
(a) EC 3.1.3.5
(c) EC 2.4.2.1
(g) EC 3.2.2.1
(h) EC 3.2.2.3
(i) EC 3.2.2.14
또한, 본 발명자들은, 단독 또는 복수의 수단의 조합에 의해, NMN의 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하로 할 수 있음을 알아내고, 제4 발명군을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기 [항 1] 내지 [항 17]에 관한 것이다.
[항 1]
니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt), 포스포리보실피로인산신타아제(Prs) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스-5-인산(R5P), 니코틴아미드(NAM), ATP, 및 폴리인산과 접촉시키는 공정을 포함하는, 니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)의 제조 방법.
[항 2]
리보키나아제(Rbk) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스, ATP, 및 폴리인산과 접촉시켜서 상기 R5P를 제조하는 공정을 더 포함하는, 항 1에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 3]
실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 행하는, 항 1 또는 2에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 4]
상기 Nampt가 박테리아 유래의 것인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 5]
상기 Ppk가, 폴리인산키나아제 2형 패밀리인, 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 6]
상기 Ppk가, 폴리인산키나아제 2형 패밀리의 클래스 3 서브패밀리(Ppk2 클래스 3)인, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 7]
상기 형질 전환체의 숙주가, 대장균, 코리네박테리움속 세균, 로도코커스속 세균, 또는 효모인, 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 8]
니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt), 포스포리보실피로인산신타아제(Prs) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체.
[항 9]
리보키나아제(Rbk) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체.
[항 10]
피로포스파타아제(PPase)의 존재 하에서, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 니코틴아미드(NAM) 및 포스포리보실피로인산(PRPP)과 접촉시키는 공정을 포함하는, 니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)의 제조 방법.
[항 11]
실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 행하는, 항 10에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 12]
상기 처리물이 정제 효소인, 항 10 또는 11에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 13]
상기 Nampt가 박테리아 유래의 것인, 항 10 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 14]
(d) EC 3.5.1.42에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자와, 이하의 (a)(c)(g)(h)(i)에 나타나는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자가 파괴 또는 결실되고, 또한, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화되어 있는 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 적어도 니코틴아미드(NAM)와 접촉시키는 공정을 포함하는, NMN의 제조 방법.
(a) EC 3.1.3.5
(c) EC 2.4.2.1
(g) EC 3.2.2.1
(h) EC 3.2.2.3
(i) EC 3.2.2.14
[항 15]
반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합이, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하인, 항 1 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 NMN의 제조 방법.
[항 16]
니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt) 및 포스포리보실피로인산신타아제(Prs)의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스-5-인산(R5P), 니코틴아미드(NAM) 및 ATP와 접촉시키는 공정을 포함하는, 니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)의 제조 방법이며, 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합이, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하인, NMN의 제조 방법.
[항 17]
리보키나아제(Rbk)의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스 및 ATP와 접촉시켜서 상기 R5P를 제조하는 공정을 더 포함하는, 항 16에 기재된 NMN의 제조 방법.
본 발명의 제1 발명군에 의한 NMN의 제조 방법을 이용함으로써, NMN의 생산량을 종래보다도 비약적으로 향상시키는(예를 들어, 특허문헌 1에 기재된 생산량에 10배 이상으로 하는) 것이 가능하게 된다. 또한, ATP 재생 반응을 이용하는 본 발명의 제조 방법에 의해, PRPP와 같이 고가의 중간체나 ATP를 다량으로 투입하지 않더라도, 보다 저렴한 R5P 또는 리보오스를 원료로 하여 NMN을 생산할 수 있기 때문에, 생산 비용의 억제도 가능하게 된다.
본 발명의 제2 발명군에 의한 NMN의 제조 방법을 이용함으로써, 제3 반응을 효율적으로 진행시킬 수 있다. 이에 의해, NMN의 생산량이나 생성 속도를 향상시키는 것이 가능해져서, NMN의 생산 비용을 억제할 수 있다.
본 발명의 제3 발명군에 의한 NMN의 제조 방법을 이용함으로써, 형질 전환체, 형질 전환체로부터 조제한 휴지 균체, 막투과성 향상 균체, 불활성화 균체, 파쇄 균체, 파쇄 균체로부터 조제한 무세포 추출물 및 이들에 대하여 안정화 처리를 행한 안정화 처리물을 사용하여 NMN의 생성 반응을 행할 때, 생성물인 NMN의 분해를 억제할 수 있다. 이에 의해, 저렴한 촉매 형태인 균체나 무세포 추출물 등을 사용하여, 높은 수율로 NMN을 생산하는 것이 가능해져서, NMN의 생산 비용을 억제할 수 있다.
본 발명의 제4 발명군에 의한 NMN의 제조 방법을 이용함으로써, NMN의 제조를 위하여 첨가하는 ATP의 양을 삭감할 수 있다. ATP는 고가이기 때문에, 이에 의해, NMN의 생산 비용을 억제할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 NMN의 제조 방법에 있어서 진행하는 반응을 도시한 개략도이다.
도 2는, 실시예 1 및 비교예 2에 있어서의 NMN의 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 실시예 3에 있어서의 NMN의 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 실시예 4에 있어서의 NMN의 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 실시예 5에 있어서의 NMN의 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 실시예 6 및 비교예 2에 있어서의 NMN의 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 실시예 7에 있어서의 NMN의 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 실시예 8에 있어서의 NMN의 생성 농도를 나타내는 그래프이다.
도 9는, NMN의 분해 경로를 도시하는 도면이다.
본 명세서에서 사용되는 약어의 정의는 각각 다음과 같다.
Nampt(Nicotinamide phosphoribosyltransferase): 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제
Prs(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase): 포스포리보실피로인산신타아제
Rbk(Ribokinase): 리보키나아제
Ppk(Polyphosphate kinase): 폴리인산키나아제
PPase(Pyrophosphatase): 피로포스파타아제
NMN(Nicotinamide mononucleotide): 니코틴아미드모노뉴클레오티드
PRPP(Phosphoribosyl pyrophosphate): 포스포리보실피로인산
NAM(Nicotinamide): 니코틴아미드
R5P(Ribose-5-phosphate): 리보오스-5-인산
NR(Nicotinamide riboside): 니코틴아미드리보시드
NaMN(Nicotinic acid mononucleotide): 니코틴산모노뉴클레오티드
NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide): 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드
PPi(Pyrophosphate): 피로인산
PolyP(Polyphosphate): 폴리인산
-제1 발명군-
본 발명의 NMN의 제조 방법 중, 제1 발명군은, Nampt, Prs 및 Ppk의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, R5P, NAM, ATP, 및 폴리인산과 접촉시키는 공정을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 NMN의 제조 방법은, 상기 R5P의 제조 공정으로서, Rbk 및 Ppk의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스, ATP, 및 폴리인산을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 공정을 더 포함한다. 즉, 본 발명에서는, ATP 재생 반응을 이용하면서, 소정의 효소 반응을 진행시킴으로써 NMN을 제조한다.
이러한 제1 발명군의 NMN의 제조 방법은, 전형적으로는, 하기 (1) 내지 (3)의 공정(본 명세서에 있어서, 각각 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정이라고 칭한다)을 순차 행함으로써 실시된다. 이들 공정은, 동일한 사람이 실시해도 되고, 다른 사람이 실시해도 된다. 또한, 이들 공정은, 연속적으로 행해도 되고, 각 공정의 사이에 소정의 기간을 두고 단계적으로 행해도 된다.
(1) Nampt, Prs, Rbk 및 Ppk의 각 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 형질 전환체를 제작하여 배양하거나, 또는 당해 각 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액으로 단백질 합성 반응을 행하여, 당해 각 효소를 발현시키는 공정(제1 공정);
(2) 필요에 따라, 제1 공정을 거친 형질 전환체 또는 무세포 단백질 합성 반응액으로부터 처리물을 조제하는 공정(제2 공정); 및
(3) 제1, 제2 공정을 거친 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을 각 기질 화합물과 접촉시키는 공정(제3 공정, 도 1 참조).
이하, 본 발명의 NMN의 제조 방법에 대해서, 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 행하는 실시 형태를 따라 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명의 NMN의 제조 방법은, 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 범위에서, 이하에 구체적으로 기재하는 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 적절히 개변한 실시 형태에서 행하는 것도 가능하다.
[제1 공정]
제1 공정은, Nampt, Prs, Rbk 및 Ppk의 각 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 형질 전환체를 제작하여 배양하거나, 또는 당해 각 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액으로 단백질 합성 반응을 행하여, 당해 각 효소를 발현시키는 공정이다.
(효소)
본 발명에서는, Nampt, Prs 및 Ppk와, 필요에 따라 또한 Rbk의 4 효소를 이용한다. Nampt, Prs, Ppk 및 Rbk는 모두 기지의 효소이며, 그 아미노산 서열 및 그것을 코드하는 유전자의 염기 서열은 당업자이면 용이하게 입수 가능하다. 상기 소정의 4 효소는, 각각의 목적 반응을 촉매할 수 있는 것이면, 천연형의 효소여도 되고, 천연형의 효소의 아미노산 서열을 개변함으로써 제작된, 바람직하게는 발현량이나 효소 활성이 향상된, 변이형의 효소여도 된다. 또한, 정제의 간략화나 가용성 발현의 촉진, 항체에 의한 검출 등을 목적으로 하여, 각 효소에는 여러가지 태그(단백질 또는 펩티드)가 부가되어 있어도 된다. 태그의 종류로서는, His 태그(히스티딘 태그), Strep(II)-tag, GST 태그(글루타티온-S-트랜스퍼라아제 태그), MBP 태그(말토오스 결합 단백질 태그), GFP 태그(녹색 형광 단백질 태그), SUMO 태그(Small Ubiquitin-related(like) Modifier 태그) FLAG 태그, HA 태그, myc 태그 등을 들 수 있다. 또한, 4 효소는, 서로 융합 단백질로서 발현되어 있어도 된다.
·Nampt
Nampt(EC number: 2.4.2.12)는 일반적으로 NAD(니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드) 솔베이지 경로에 관여하는 것이 알려져 있고, 본 발명에 있어서, PRPP 및 NAM으로부터 NMN을 생성시키는 반응(제3 반응)을 위하여 이용되는 효소이다. Nampt에 의한 PRPP와 NAM으로부터의 NMN 합성 반응에 있어서, 원래, ATP는 필수는 아니다. 그러나, Nampt에는 ATP 가수분해 활성이 있고, ATP의 가수분해에 의해 Nampt가 자기 인산화됨으로써, NMN 생성에 유리한 방향으로 효소학적 파라미터나 화학 평형이 변화하는 것이 보고되어 있다(Biochemistry 2008, 47, 11086-11096).
Nampt로서는, 예를 들어, 인간(Homo sapiens) 유래의 것(NP_005737), 마우스(Mus musculus) 유래의 것(NP_067499), 래트(Rattus norvegicus) 유래의 것(NP_808789), 제브라피시(Danio rerio) 유래의 것(NP_997833), Haemophilus ducreyi(헤모필루스 듀크레이)(AAR87771), Deinococcus radiodurans(데이노코쿠스 라디오두란스)(AE001890), Oenococcus oeni(오에노코쿠스 오에니)(KZD13878), Shewanella oneidensis(쉬와넬라 오네이덴시스)(NP_717588) 등 박테리아 유래의 것을 들 수 있다. 본 발명에서는, 제3 반응에 있어서의 효소 활성이 우수하다는 점에서, 박테리아 유래의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 박테리아란, 핵막을 갖지 않는 원핵생물의 한 무리이며, 대장균, 고초균, 시아노박테리아 등을 포함하는 생물 군이다.
·Prs
Prs(EC number: 2.4.2.17)는 본 발명에 있어서, R5P 및 ATP로부터 PRPP 및 AMP를 생성시키는 반응(제2 반응)을 위하여 이용되는 효소이다.
Prs로서는, 예를 들어, 인간(Homo sapiens) 유래의 것(NP_002755), 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 것(BAA05286), Bacillus caldolyticus(바실러스 칼돌리쿠스) 유래의 것(CAA58682), Arabidopsis thaliana(아라비돕시스 탈리아나) 유래의 것(Q680A5), Methanocaldococcus jannaschii(메타노칼도코쿠스 야나시) 유래의 것(Q58761)을 들 수 있다. 장시간에 걸쳐, 특히 제조계 내의 기질 농도가 높은 경우에, 제2 반응에 의한 PRPP의 생성 및 그에 이어지는 제3 반응에 의한 NMN의 생성을 계속시킬(즉 최종 산물인 NMN의 제조계 내의 농도를 계속하여 상승시킬) 수 있도록, 특허문헌 2에 기재되어 있는 변이형 Prs를 사용할 수도 있다. 변이형 Prs로서는, 예를 들어, 인간 유래의 Prs에 관한, Asp51His(51위치의 ASP의 His로의 치환, 이하 마찬가지), Asn113Ser, Leu128Ile, Aspl82His, Ala189Val, 및 Hisl92Gln 등의 변이형, 그리고 그들에 대응하는 다른 생물 유래의 Prs에 있어서의 변이형, 예를 들어, 고초균 유래의 Prs에 대해서, Asn120Ser(상기 Asn113Ser에 대응), Leu135Ile(상기 Leu128Ile에 대응) 등의 변이형을 들 수 있다.
·Rbk
Rbk(EC number: 2.7.1.15)는 본 발명에 있어서, 리보오스 및 ATP로부터 R5P 및 ADP를 생성시키는 반응(제1 반응)을 위하여 이용되는 효소이다. Rbk로서는, 각종 생물에서 유래되는 천연형 Rbk, 또는 그 아미노산 서열을 개변하여 제작된 변이형 Rbk를 사용할 수 있고, 예를 들어, 인간(Homo sapiens) 유래의 것(NP_002755), 효모(Saccharomyces cerevisiae(사카로마이세스 세레비지애)) 유래의 것(P25332), 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 것(P36945), 대장균(Escherichia coli) 유래의 것(AAA51476), Haemophilus influenzae(헤모필루스 인플루엔자) 유래의 것(P44331)을 들 수 있다.
·Ppk
Ppk(EC number: 2.7.4.1)는 본 발명에 있어서, 제1 반응에서 생성되는 ADP 또는 제2 반응에서 생성되는 AMP와, 폴리인산으로부터, ATP를 재생하는 반응(ATP 재생 반응)을 위하여 이용되는 효소이다.
Ppk는 아미노산 서열 및 키네틱스의 차이에 의해 2개의 패밀리, 폴리인산키나아제 1형 패밀리(Ppk1) 및 폴리인산키나아제 2형 패밀리(Ppk2)로 분류할 수 있다. 폴리인산을 기질로 하여 ATP를 재생하는 활성으로서는, Ppk1보다도 Ppk2 쪽이 높다. 따라서, 본 발명에 있어서의 Ppk로서는, Ppk2를 사용하는 것이 바람직하다.
Ppk2는 또한, 3개의 서브패밀리, 클래스 1, 클래스 2 및 클래스 3으로 분류할 수 있다. 클래스 1 및 클래스 2의 Ppk2는 각각, ADP를 인산화하여 ATP를 생성하는 반응, 및 AMP를 인산화하여 ADP를 생성하는 반응을 촉매한다. 이에 반해클래스 3의 Ppk2는, AMP의 인산화 반응 및 ADP의 인산화 반응의 양쪽을 촉매할 수 있기 때문에, 단독으로 AMP로부터 ATP를 생성할 수 있다.
본 발명에 있어서의 Ppk로서는, ADP로부터 ATP를 재생하기 위한 Ppk2 클래스 1과, AMP로부터의 ADP를 재생하기 위한 Ppk2 클래스 2의 조합을 사용할 수 있다. 또는, AMP로부터의 ADP를 재생하기 위하여 아데닐산키나아제(AMP+ATP→2ADP라고 하는 반응을 촉매한다)를 병용하는 경우에는, ADP로부터 ATP를 재생하기 위한 Ppk2 클래스 1 또는 Ppk1만을 본 발명에 있어서의 Ppk로서 사용하는 것도 가능하다. 그러나, ADP로부터의 ATP의 재생과, AMP로부터의 ATP의 재생의, 양쪽 반응을 단독으로 촉매할 수 있다는 효율성의 좋음으로부터, Ppk2 클래스 3을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 PpK를 사용하는 경우에는, 제1 반응의 Ppk와 제2 반응의 Ppk를 공통화할 수 있다.
Ppk2 클래스 3으로서는, 예를 들어, Deinococcus radiodurans 유래의 것(NP_293858), Paenarthrobacter aurescens(파나르스로박터 아우레센스) 유래의 것(ABM08865), Meiothermus rube(메이오테무스 루브) 유래의 것(ADD29239), Deinococcus geothermalis (데이노코쿠스 지오서말리스) 유래의 것(WP_011531362), Thermosynechococcus elongatus(테르모시네초코쿠스 일롱가투스) 유래의 것(NP_682498)을 들 수 있다. 한편, Ppk2 클래스 1로서는, 예를 들어 Rhodobacter sphaeroides(로도박터 스페로이데스) 유래의 것(CS253628), Sinorhizobium meliloti(시노르히조비움 멜릴로티) 유래의 것(NP_384613), Pseudomonas aeruginosa(슈도모나스 에루지노사) 유래의 PA0141(NP_248831), Pseudomonas aeruginosa 유래의 PA2428(NP_251118), Francisella tularensis(프란시셀라 툴라렌시스) 유래의 것(AJI69883)을 들 수 있다. Ppk2 클래스 2로서는, 예를 들어 Pseudomonas aeruginosa 유래의 PA3455(NP_252145)를 들 수 있다. 또한, 아데닐산키나아제로서는, 예를 들어 Bacillus cereus(바실러스 세레우스) 유래의 것(AAP07232)을 들 수 있다.
(형질 전환체)
본 발명에서 사용되는 형질 전환체는, 형질 전환을 행하기 전의 (야생형의) 세포 내지 균체와 비교하여, 소정의 각 효소의 발현이 강화된 것이다. 「발현이 강화된」이란, 각 효소의 발현량이 어느 정도 강화되었는지를 의미하는지는 일률적으로 결정되는 것은 아니고, 후술하는 바와 같이 각 효소의 반응 용매 중(제조계 내)의 농도가 적절한 범위가 되도록, 형질 전환체에 있어서의 발현량은 조절할 수 있지만, 적어도, 인위적인 조작에 의해, 형질 전환을 행하기 전의(야생형의) 세포 내지 균체보다도 발현이 강화되어 있으면 된다. 인위적인 조작으로서는, 특별히 한정되지 않고 다음에 설명하는 바와 같이 발현 벡터를 이용하고, 게놈 상에 소정의 효소를 코드하는 유전자 발현 유닛을 다(多)카피 도입하고, 원래 게놈 상에 존재하는 소정의 효소를 코드하는 유전자의 프로모터를 강력한 것으로 치환하는 등의 조작을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 형질 전환체는, (i) 소정의 각 효소를 코드하는 유전자의 모두를 포함하는 형질 전환체만으로 구성되어 있어도 되고, (ii) 소정의 각 효소를 코드하는 유전자를 별개로 포함하는 형질 전환체끼리의 조합으로서, 예를 들어, Nampt와 Prs의 발현이 강화된 형질 전환체 및 Ppk의 발현이 강화된 형질 전환체를 포함하는 조합에 의해 구성되어 있어도 된다.
형질 전환체의 숙주는, 발현 벡터 등을 이용한 단백질 발현 시스템에 의해 소정의 효소를 발현할 수 있는 세포이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtilis), 방선균(예를 들어 로도코커스속(Rhodococcus), 코리네박테리움속(Corynebacterium)) 등의 세균; 효모(예를 들어 사카로마이세스속(Saccharomyces), 칸디다속(Candida), 피키아속(Pichia)); 사상균; 식물 세포; 곤충 세포, 포유류 세포 등의 동물 세포를 들 수 있다. 이들 중에서도, 대장균, 코리네박테리움속 세균 및 로도코커스속 세균, 그리고 사카로마이세스속 효모, 칸디다속 효모 및 피키아속 효모가 바람직하고, 대장균이 보다 바람직하다.
대장균으로서는, 예를 들어, 대장균 K12주 및 B주, 그리고 그들 야생주 유래의 파생주인 W3110주, JM109주, XL1-Blue주(예를 들어, XL1-BlueMRF'), K802주, C600주, BL21주, BL21(DE3)주 등을 들 수 있다.
발현 벡터를 사용하는 경우에는, 본 발명에서 사용하는 소정의 각 효소의 유전자를 발현 가능한 상태에서 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않고 각각의 숙주에 적합한 벡터를 사용할 수 있다. 발현 벡터의 구성의 상세에 대해서는 후술한다.
숙주에의 발현 벡터의 도입 방법은, 숙주에 적합한 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 이용 가능한 방법으로서는, 예를 들어, 일렉트로포레이션법, 칼슘 이온을 사용하는 방법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법, 인산칼슘법, 리포펙션법을 들 수 있다.
발현 벡터가 도입된 형질 전환체는, 숙주로서 사용한 세포(균체)에 적합한 방법으로 배양하고, 소정의 각 효소를 발현시키면 된다. 전술한 바와 같이, 소정의 각 효소를 코드하는 유전자를 별개로 포함하는 형질 전환체끼리를 조합하는 경우, 예를 들어, Nampt와 Prs의 발현이 강화된 형질 전환체와 Ppk의 발현이 강화된 형질 전환체를 제작하여 조합시키는 경우에는, 각각의 형질 전환체를 동일한 배지에서 배양해도 되고, 별도의 배지에서 배양한 후에 혼합해도 된다.
형질 전환체, 형질 전환체로부터 조제한 휴지 균체, 막투과성 향상 균체, 불활성화 균체, 파쇄 균체, 파쇄 균체로부터 조제한 무세포 추출물 및 이들에 대하여 안정화 처리를 행한 안정화 처리물(상세는 후기 제2 공정에 관한 사항을 참조)을 사용하여 NMN의 생성 반응을 행하는 경우, 반응물(기질)인 리보오스나 NAM, 생성물인 NMN의 분해 또는 부반응이 일어나서, NMN을 효율적으로 제조할 수 없는 경우가 있다. 그 경우, 분해나 부반응의 원인이 되는 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 이하의 (a) 내지 (i)에 나타나는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자가, 결손 또는 파괴되어 있는 숙주를 사용할 수 있다.
(a) EC 3.1.3.5
(b) EC 3.5.1.19
(c) EC 2.4.2.1
(d) EC 3.5.1.42
(e) EC 1.17.2.1
(f) EC 1.17.1.5
(g) EC 3.2.2.1
(h) EC 3.2.2.3
(i) EC 3.2.2.14
(a) EC 3.1.3.5로 분류되는 효소는, 5'-nucleotidase(뉴클레오티다아제)이며, NMN을 가수분해하여 니코틴아미드리보시드(NR)와 인산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 포함한다. 5'-nucleotidase를 코드하는 유전자로서는, 예를 들어, 대장균의 ushA, surE, yrfG, yjjG 등을 들 수 있다. 예를 들어, Enzyme and Microbial Technology, 58-59(2014), 75-79에는, 대장균에 있어서의 NAD 분해의 주요한 역할을 담당하는 효소로서, 5'-nucleotidase인 UshA가 보고되어 있고, 동 효소가 NMN 분해 활성을 갖는 것이 개시되어 있다. 본 발명에 있어서 파괴 또는 결실시키는 5'-nucleotidase로서는, 특히 ushA 또는 그 호몰로그 유전자가 바람직하다.
(b) EC 3.5.1.19로 분류되는 효소는, nicotinamidase(니코틴아미다아제)이며, NAM의 분해에 관여한다. nicotinamidase를 코드하는 유전자로서는, 예를 들어, 대장균의 pncA를 들 수 있다.
(c) EC 2.4.2.1로 분류되는 효소는, purine-nucleoside phosphorylase(퓨린-뉴클레오사이드 포스포릴라아제)이며, NR을 캐나다 인산 분해하고, NAM과 리보오스-1-인산(R1P)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 포함한다. purine-nucleoside phosphorylase를 코드하는 유전자로서는, 예를 들어, 대장균의 deoD를 들 수 있다. Molecular and General Genetics, 104(1969), 351-359에는, 뉴클레오시드의 대사에 관한 유전자군의 하나로서, deoD가 개시되어 있다. 본 발명에 있어서 파괴 또는 결실시키는 purine-nucleoside phosphorylase로서는, deoD 또는 그 호몰로그 유전자가 바람직하다.
(d) EC 3.5.1.42로 분류되는 효소는, nicotinamide mononucleotide deamidase(니코틴아미드 모노뉴클레오티드 데아미다아제)이며, NMN을 가수분해하여, NaMN과 암모니아를 생성하는 효소이다. nicotinamide mononucleotide deamidase를 코드하는 유전자로서는, 예를 들어, 대장균의 pncC을 들 수 있다. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 286(2011), 40365-40375에는, Shewanella oneidensis 및 대장균의 pncC에 관한 지견이 개시되어 있다. 본 발명에 있어서 파괴 또는 결실시키는 nicotinamide mononucleotide deamidase로서는, pncC 또는 그 호몰로그 유전자가 바람직하다.
(e) EC 1.17.2.1 및 (f) EC 1.17.1.5로 분류되는 효소는, nicotinate dehydrogenase(니코틴 탈수소 효소)이며, NAM으로부터의 히드록시니코틴산의 부생에 관여할 가능성이 생각된다.
(g) EC 3.2.2.1로 분류되는 효소는, purine nucleosidase(퓨린 뉴클레오시다아제)이며, NR을 가수분해하여, NAM과 리보오스를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 포함한다. purine nucleosidase를 코드하는 유전자로서는, 예를 들어, Ochrobactrum anthropi의 Pu-N을 들 수 있다(Applied and Enviro㎚ental Microbiology, 67(2001), 1783-1787). 본 발명에 있어서 파괴 또는 결실시키는 purine nucleosidase로서는, Pu-N 또는 그 호몰로그 유전자가 바람직하다.
(h) EC 3.2.2.3로 분류되는 효소는, uridine nucleosidase(우리딘 뉴클레오시다아제)이며, NR을 가수분해하여, NAM과 리보오스를 생성하는 반응을 촉매할 수 있는 효소를 포함한다. uridine nucleosidase를 코드하는 유전자로서는, 예를 들어, Arabidopsis thaliana의 URH1을 들 수 있다(Plant Cell, 21(2009), 876-91). 본 발명에 있어서 파괴 또는 결실시키는 uridine nucleosidase로서는, URH1 또는 그 호몰로그 유전자가 바람직하다.
(i) EC 3.2.2.14로 분류되는 효소는, NMN nucleosidase(뉴클레오시다아제)이며, NMN을 가수분해하여, NAM과 R5P를 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. Biochem. Biophys. Res. Commun., 49(1972), 264-9에는, 대장균의 NMN nucleosidase 활성이 개시되어 있다. 본 발명에 있어서는, NMN nucleosidase 활성을 갖는 효소를 코드하는 유전자를 파괴 또는 결실시키는 것이 바람직하다.
결손 또는 파괴되는 것은, (d)에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자와, (a)(c)(g)(h)(i)에 나타나는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자인 것이 바람직하고, (d)에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자와, (a)에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자인 것이 보다 바람직하다. 상세는, 후술하는 제3 발명군의 설명에 기재한다.
유전자를 파괴 또는 결실시키는 방법은, 특별 한정되는 것은 아니며, 공지된 유전자 파괴 또는 결실 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 선상으로 한 유전자 파괴 또는 결실용 단편을 사용하는 방법, 복제 기점을 포함하지 않는 환상의 유전자 파괴 또는 결실 플라스미드를 사용하는 방법, 그룹 II 인트론을 사용하는 방법, Red-ET 상동 재조합법, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 등의 게놈 편집을 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
(발현 벡터)
본 발명에서 사용되는, 소정의 각 효소를 코드하는 유전자는, 전형적으로는, 발현 벡터에 포함된 상태에서 형질 전환체의 숙주에 도입된다. 하나의 형질 전환체에 있어서 2개 이상의 효소를 발현시키는 경우, 하나의 발현 벡터에, 발현시키는 각 효소를 코드하는 유전자의 모두가 포함되어 있어도 되고, 숙주 내에서 공존 가능한 2 이상의 발현 벡터에, 발현시키는 각 효소를 코드하는 유전자가 적절히 할당되어서 포함되어 있어도 된다. 예를 들어, Nampt, Prs 및 Ppk의 발현이 강화된 형질 전환체를 제작하는 경우, Nampt, Prs 및 Ppk를 코드하는 유전자 모두가 포함되는 하나의 발현 벡터를 사용해도 되고, Nampt와 Prs를 코드하는 유전자를 포함하는 발현 벡터와 Ppk를 코드하는 유전자를 포함하는 발현 벡터의 2개의 벡터의 조합에 의해 구성되어 있어도 된다.
본 발명에서 사용되는 발현 벡터는 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다. 일반적으로는, 소정의 효소를 코드하는 유전자의 상류에 전사 프로모터, 경우에 따라서는 하류에 터미네이터를 삽입하여 발현 카세트를 구축하고, 이 카세트를 발현 벡터에 삽입하면 된다. 혹은, 발현 벡터에 전사 프로모터 및/또는 터미네이터가 이미 존재하는 경우에는, 발현 카세트를 구축하지 않고, 그 벡터의 전사 프로모터 및/또는 터미네이터를 이용하여, 그 사이에 소정의 효소를 코드하는 유전자를 삽입하면 된다. 상술한 바와 같이, 하나의 발현 벡터에 2개 이상의 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 경우, 그들 유전자는 모두 동일한 프로모터 하에 삽입되어 있어도 되고, 다른 프로모터 하에 삽입되어 있어도 된다. 프로모터의 종류는 숙주에 있어서 적절한 발현을 가능하게 하는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 대장균 숙주에 있어서 이용할 수 있는 것으로서는, T7 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, 람다 파지 유래 PL 프로모터 및 PR 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터를 들 수 있다.
소정의 각 효소를 코드하는 유전자(핵산)는 예를 들어, (i) 염기 서열 정보에 따라서, 프라이머를 제작하고, 게놈 등을 주형으로 하여 증폭함으로써 얻을 수도 있고, (ii) 효소의 아미노산 서열 정보에 따라서, 유기 합성적으로 DNA를 합성함으로써 얻을 수도 있다. 형질 전환체의 숙주가 되는 세포에 따라, 유전자는 최적화되어 있어도 된다.
발현 벡터에 소정의 효소를 코드하는 유전자를 삽입하기 위해서는, 제한 효소를 사용하는 방법, 토포이소메라아제를 사용하는 방법 등을 이용할 수 있다. 삽입 시에 필요하다면, 적당한 링커를 부가해도 된다. 또한, 아미노산에의 번역에 있어서 중요한 염기 서열로서, SD 서열이나 Kozak 서열 등의 리보솜 결합 서열이 알려져 있고, 이들 서열을 유전자의 상류에 삽입해도 된다. 삽입에 수반하여, 유전자가 코드하는 아미노산 서열의 일부를 치환해도 된다. 또한, 벡터에는 목적으로 하는 형질 전환체를 선별하기 위한 인자(선택 마커)가 포함하는 것이 바람직하다. 선택 마커로서는, 약제 내성 유전자나 영양 요구성 상보 유전자, 자화성 부여 유전자 등을 들 수 있고, 목적이나 숙주에 따라서 선택될 수 있다. 대장균에서 선택 마커로서 사용되는 약제 내성 유전자로서는, 예를 들어 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 유전자, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자를 들 수 있다.
발현 벡터는, 숙주에 따라, 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA, 레트로트랜스포존 DNA, 인공 염색체 DNA 등으로부터 선택되는 적절한 것을 사용하면 된다. 예를 들어, 대장균을 숙주로 하는 경우에는, pTrc99A(GE 헬스케어 바이오사이언스), pACYC184(닛폰 진), pMW118(닛폰 진), pET 시리즈 벡터(Novagen) 등을 들 수 있다. 또한 2 이상의 삽입 개소를 갖는 벡터로서는 pETDuet-1(Novagen) 등을 들 수 있다. 필요에 따라, 이들 벡터를 개변한 것을 사용할 수도 있다.
소정의 효소의 발현을 강화하는 방법으로서는, 상술한 바와 같은 발현 벡터를 사용하는 방법이 전형적이지만, 그 이외의 방법을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 소정의 효소를 코드하는 유전자에, 적절한 프로모터나 터미네이터, 마커 유전자 등을 연결시킨 발현 카세트를 숙주의 게놈 상에 삽입함으로써, 소정의 효소의 발현을 강화할 수 있다. 발현 카세트가 게놈 상에 삽입된 형질 전환체를 취득하는 방법으로서는, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상동 재조합에 의해 발현 카세트를 게놈 상에 삽입하는 경우에는, 소정의 효소의 발현 카세트와 임의의 게놈 영역의 서열을 갖고, 숙주 내에서 복제 불가능한 플라스미드를 사용하여 형질 전환을 행함으로써, 당해 플라스미드 전체 또는 발현 카세트가 삽입된 형질 전환체를 얻을 수 있다. 그 때, SacB 유전자(레반수크라아제를 코드) 등의 네거티브 선택 마커를 탑재한 플라스미드나, 복제 기구가 온도 감수성(ts)의 플라스미드를 사용함으로써 2회의 상동 재조합에 의해 발현 카세트만이 게놈 상으로 된 형질 전환체를 효율적으로 취득할 수도 있다. 또한, 발현 카세트만으로 이루어지는 DNA 단편을 사용하여 형질 전환을 행함으로써, 게놈 상의 랜덤한 위치에 발현 카세트가 삽입된 형질 전환체를 얻을 수도 있다.
또한, 소정의 효소로서 숙주가 게놈 상에 원래 갖는 효소(내인성 효소)를 이용하는 경우에는, 게놈 상의 당해 효소 유전자의 프로모터를 강력한 것으로 치환함으로써, 그 발현을 강화할 수도 있다. 프로모터로서는, 상술한 발현 벡터에 있어서 사용하는 프로모터를 마찬가지로 이용할 수 있다.
(무세포 단백질 합성 반응액)
무세포 단백질 합성계는, 생생한 미생물이나 세포 등이 아니라, 여러가지 생물로부터 추출한 무세포 추출물에, 아미노산, ATP 등의 에너지 분자, 에너지 재생계, 마그네슘 이온 등의 염류, 그리고, 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 유전자(DNA 혹은 RNA)를 첨가한 무세포 단백질 합성 반응액에 의해, 단백질을 시험관 내(in vitro)에서 합성하는 시스템이다. 무세포 추출물에는, 리보솜, tRNA, 아미노아실화 tRNA 합성 효소, 번역 개시 인자, 번역 신장 인자, 번역 종결 인자 등의 번역 성분이 포함된다. 본 명세서 중에서는, 무세포 단백질 합성계에 의한 단백질 합성 반응을 행하기 위한 용액을, 반응의 전후를 포함하여, 무세포 단백질 합성 반응액이라고 칭한다.
본 발명에서 사용하는 무세포 단백질 합성계로서는, 소정의 각 효소가 본래의 기능을 갖는 상태에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 계여도 되지만, 예를 들어, 소맥 배아 유래 합성계, 대장균 유래 합성계, 토끼 망상 적혈구 유래계, 곤충 세포 유래 합성계, 인간 세포 유래 합성계를 사용할 수 있다. 또한, 필요한 가용성 단백질 인자를 재조합 단백질로서 조제하는 PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements) System 등을 사용해도 된다. 무세포계로의 단백질 합성 반응 프로세스로서는, 배치법(batch method), CFCF(Continuous-Flow Cell-Free)법, CECF(Continuous Exchange Cell-Free)법, 중층법 등을 사용할 수 있다. 또한, 발현시키는 효소 유전자의 주형으로서는, RNA여도 되고, DNA여도 된다. 주형으로서 RNA를 사용하는 경우에는, Total RNA, mRNA, in vitro 전사 산물 등을 사용할 수 있다.
[제2 공정]
제2 공정은, 필요에 따라, 제1 공정을 거친 형질 전환체 또는 무세포 단백질 합성 반응액으로부터 처리물을 조제하는 공정이다. 형질 전환체의 처리물로서는, 형질 전환체로부터 조제한 휴지 균체, 막투과성 향상 균체, 불활성화 균체, 파쇄 균체 등을 들 수 있다. 또한, 파쇄 균체로부터 조제한 무세포 추출물 및 정제 효소도 본 발명의 처리물에 포함된다. 무세포 단백질 합성 반응액의 처리물로서는, 무세포 단백질 합성 반응액으로부터 조제한 정제 효소를 들 수 있다. 나아가, 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액 및 이들 처리물에 대하여 안정화 처리를 행한 안정화 처리물도 본 발명의 처리물에 포함된다.
휴지 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 휴지 균체란, 그 증식이 실질적으로 정지한 상태에 놓인 균체를 의미한다. 구체적으로는, 배양에 의해 증식시킨 형질 전환체를 배지로부터 회수한 후, 형질 전환체가 용이하게 이용 가능한 탄소원 등을 포함하지 않는 완충액 등에 현탁하거나, 회수한 형질 전환체를 동결시키거나, 건조시켜서 분말화하거나 함으로써 조제할 수 있다. 형질 전환체를 배지로부터 회수하는 방법은 어떠한 방법이어도 되고, 예를 들어, 원심 분리를 사용한 방법, 막 여과를 사용한 방법 등을 들 수 있다. 원심 분리는, 형질 전환체를 침강시키는 원심력을 공급할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 원통형이나 분리판형 등을 이용할 수 있다. 원심력으로서는, 예를 들어, 500G 내지 20,000G 정도로 행할 수 있다. 막 여과는, 형질 전환체를 배지로부터 회수할 수 있으면, 정밀 여과(MF)막, 한외 여과(UF)막 어느 것을 사용하여 행해도 된다. 형질 전환체를 현탁하는 완충액으로서는, 형질 전환체의 증식이 실질적으로 정지하고, 또한, 소정의 각 효소의 기능이 유지되는 것이면 어떠한 것이어도 되고, 예를 들어, 인산 완충액, 아크릴산 완충액, 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노메탄)-염산 완충액, HEPES(2-(4-(2-Hydroxyethyl(히드록시에틸))-1-piperazinyl(피페라지닐))ethanesulfonic acid(에탄술폰산))나 기타 굿의 완충액(Good's buffers) 등을 사용할 수 있다. 형질 전환체를 동결하는 경우에는, 상기 원심 분리 등의 조작에 의해 대부분의 수분을 제거한 상태, 또는 적당한 완충액에 현탁된 상태에서 동결하면 된다. 동결하는 온도는, 형질 전환체를 현탁하는 완충액의 성분에 따라서도 상이한데, 실질적으로 형질 전환체가 동결하는 온도이면 어떠한 온도여도 되고, 예를 들어, -210℃ 내지 0℃ 등의 범위에서 행하면 된다. 또한, 형질 전환체를 건조하는 경우, 그 건조 방법으로서는, 형질 전환체의 증식이 실질적으로 정지하고, 또한, 소정의 각 효소의 기능이 유지되는 방법이면 어떠한 방법이어도 되고, 동결 건조법이나 분무 건조법 등을 들 수 있다.
막투과성 향상 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매나 계면 활성제로 형질 전환체를 처리함으로써, 기질이나 생성물이, 형질 전환체의 세포막이나 세포벽을 통과하기 쉬워진다. 사용하는 유기 용매나 계면 활성제의 종류로서는, 막투과성이 향상되고, 또한, 소정의 각 효소의 기능이 유지되는 것이면 특별 한정되지 않고, 유기 용매이면 톨루엔이나 메탄올 등, 계면 활성제이면 Triton-X 100이나 염화벤제토늄 등을 들 수 있다.
불활성화 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어 약제 처리나 가열 처리에 의해 행할 수 있다. 약제에 의한 처리는, 예를 들어, 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 염화메틸스테아로일, 브롬화세틸트리메틸암모늄 등의 양이온계 계면 활성제, 염산알킬디아미노에틸글리신 등의 양성 이온계 계면 활성제 등을 사용할 수 있다. 또한, 에탄올 등의 알코올류, 2-머캅토에탄올 등의 티올류, 에틸렌디아민 등의 아민류, 시스테인, 오르니틴, 시트룰린 등의 아미노산류 등도 들 수 있다. 가열에 의한 처리는, 목적으로 하는 효소가 실활하지 않는 온도와 시간에서 열처리를 행하면 된다.
파쇄 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 초음파 처리, 프렌치 프레스나 균질기에 의한 고압 처리, 비즈 밀에 의한 마쇄 처리, 충격 파쇄 장치에 의한 충돌 처리, 리소자임, 셀룰라아제, 펙티나아제 등을 사용하는 효소 처리, 동결 융해 처리, 저장액 처리, 파지에 의한 용균 유도 처리 등을 들 수 있고, 어느 방법을 단독 또는 필요에 따라 조합하여 이용할 수 있다. 공업적 규모로 세포의 파쇄를 행하는 경우에는, 조작성, 회수율, 비용 등을 감안하여, 예를 들어, 고압 처리나 마쇄 처리, 충돌 처리 혹은 이들 처리에 효소 처리 등을 조합한 처리를 행하는 것이 바람직하다.
비즈 밀에 의한 마쇄 처리를 행하는 경우, 사용되는 비즈는, 예를 들어, 밀도 2.5 내지 6.0g/㎤, 사이즈 0.1 내지 1.0㎜의 것을 통상 80 내지 85％ 정도 충전함으로써 파쇄를 행할 수 있고, 운전 방식으로서는 회분식, 연속식 어느 것이든 채용할 수 있다.
고압 처리를 행하는 경우, 처리 압력은, 세포로부터의 목적 단백질 회수율이 충분히 높은 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 40 내지 200MPa 정도, 바람직하게는 60 내지 150MPa 정도, 보다 바람직하게는 80 내지 120MPa 정도의 압력에서 파쇄를 행할 수 있다. 필요에 따라, 장치를 직렬로 배치하거나, 복수 스테이지 구조의 장치를 사용하거나 함으로써, 다단계 처리를 행하여, 파쇄 및 조작 효율을 향상시키는 것도 가능하다. 통상, 처리 압력 10MPa당 2 내지 3℃의 온도 상승이 발생하는 점에서, 필요에 따라 냉각 처리를 행하는 것이 바람직하다.
충돌 처리의 경우, 예를 들어, 세포 슬러리를 미리 분무 급속 동결 처리(동결 속도: 예를 들어 1분간당 수천℃) 등에 의해 동결 미세 입자(예를 들어 50㎛ 이하)로 해 두고, 이것을 고속(예를 들어 약 300m/s)의 반송 가스에 의해 충돌판에 충돌시킴으로써 효율적으로 세포를 파쇄할 수 있다.
무세포 추출물은, 파쇄 균체로 파쇄 잔사(세포막이나 세포벽 등을 포함하는 불용성 분획)를 제거함으로써 조제할 수 있다. 파쇄 잔사의 제거는, 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들어, 원심 분리나 막 여과, 여과포 여과 등을 이용할 수 있다. 원심 분리 조작은, 상술한 바와 같이 행할 수 있지만, 형질 전환체의 파쇄 잔사가 미세해서, 용이하게 침강하기 어려울 경우에는, 필요에 따라 응집제 등을 사용하여 잔사 침전 효율을 높일 수도 있다. 막 여과도, 상술한 바와 같이 행할 수 있지만, 형질 전환체의 파쇄 잔사가 미세한 경우에는, 특별히 한외 여과(UF)막을 사용할 수 있다. 여과포 여과를 행하는 경우에는, 여과 보조제나 응집제를 병용하여 행할 수 있다. 여과 보조제로서는, 규조토나 셀룰로오스 파우더, 활성탄 등을 들 수 있다. 응집제로서는, 양이온 응집제, 어니온계 응집제, 양성계 응집제, 바이온계 응집제 등을 들 수 있다. 상기 어느 조작에 의해, 균체가 존재하지 않는 상청을 회수하고, 무세포화함(셀 프리로 함)으로써, 소정의 각 효소를 포함하는 무세포 추출물을 조제할 수 있다.
정제 효소의 조제는, 일반적인 생화학적 방법, 예를 들어 황산암모늄 침전, 각종 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피(Sephadex 칼럼 등), 이온 교환 크로마토그래피(DEAE-Toyopearl 등), 친화성 크로마토그래피(TALON Metal Affinity Resin 등), 소수성 크로마토그래피(butyl Toyopearl 등), 음이온 크로마토그래피(MonoQ 칼럼 등)), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 등을, 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써 행할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상술한 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액, 및 그들의 처리물에 대하여 안정화 처리를 행한 것(안정화 처리물)을 사용할 수도 있다. 안정화 처리는, 미처리의 상태보다도, 환경 인자(온도, pH, 화학 물질 농도 등)에 대한 소정의 각 효소의 안정성, 혹은 보존 시의 안정성이 향상되는 처리이면 어떠한 처리여도 된다. 예를 들어 아크릴아미드 등의 겔에의 포함, 글루타르알데히드 등의 알데히드류에 의한 처리(CLEA: Cross-linked enzyme aggregate를 포함한다), 무기 담체(알루미나, 실리카, 제올라이트, 규조토 등)에의 담지 처리 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 기질이나 생성물은, 극성이 비교적 높고, 세포막이나 세포벽이 물질 이동의 율속이 될 가능성이 있다. 따라서, 기질이나 생성물의 투과성의 관점에서, 본 발명에서는, 특히, 파쇄 균체, 무세포 추출물, 정제 효소, 또는 그들의 안정화 처리물을 사용하는 것이 바람직하다.
상술한 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물은, 그 효소 활성이 유지되는 한, 어떠한 조건에서 보존할 수도 있다. 원한다면 적절한 조건 하에서(예를 들어 -80℃ 내지 -20℃, 1일 내지 1년) 그들 용액을 동결하고, 사용 시(제3 공정의 실시 시)까지 보존하게 해도 된다.
전술한 바와 같이, 소정의 각 효소를 코드하는 유전자를 별개로 포함하는 형질 전환체끼리를 조합하는 경우, 예를 들어, Nampt와 Prs의 발현이 강화된 형질 전환체 및 Ppk의 발현이 강화된 형질 전환체를 제작하여 조합하는 경우에는, (i) 각각의 형질 전환체에 대하여 따로따로 각 처리를 행한 후, 그들의 처리물을 혼합하게 해도 되고, (ii) 그들 형질 전환체를 혼합한 후, 일괄하여 당해 각 처리를 행해도 된다.
[제3 공정]
제3 공정은, 제1 공정을 거친 형질 전환체 또는 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 필요에 따라서 추가로 제2 공정을 거친 그들의 처리물을, 효소 반응의 각종 원료가 되는 기질과 접촉시키는 공정이다. 이 공정에 있어서는, Prs에 의한 제2 반응과 Nampt에 의한 제3 반응이 Ppk에 의한 ATP 재생 반응과 공액하여 행하여진다. Prs에 의한 제2 반응에서는, ATP를 인산원으로 하여 기질이 인산화되기 때문에, 또한, Nampt에 의한 제3 반응에서는, Nampt 자체가 갖는 ATP 가수분해 활성에 의해 자기 인산화되기 때문에, ATP가 소비된다. 따라서, 양쪽 반응을 ATP 재생 반응과 공액하여 행함으로써, 소비된 ATP를 보충하면서 효율적으로 반응을 진행시킬 수 있다. 또한, Prs에 의한 제2 반응의 생성물인 포스포리보실피로인산(PRPP)은 비교적 불안정한 화합물이기 때문에, 제2 반응과 제3 반응을 동일계 내에서 행함으로써, PRPP 생성 후, 빠르게 Nampt에 의한 제3 반응을 행할 수 있다. 본 발명에 있어서는, ATP 재생 반응에 의해 ADP 및/또는 AMP로부터 ATP가 재생되므로, ATP는 고갈될 일은 없지만, 반응 중에 유지하고자 하는 ATP 농도에 따라, 적당한 양의 ATP를 반응 용매 중에 첨가할 필요가 있게 된다. 이때, 필요에 따라, ATP 대신에 ADP 또는 AMP를 반응 용매 중에 첨가해도 된다. 첨가한 ADP나 AMP는, ATP 재생계에 의해 계 내에서 바로 ATP로 재생되기 때문에, 실질적으로 적당한 양의 ATP를 첨가한 것과 동일한 상태로 되기 때문이다. 또한, 이들을 임의의 비율로 함유하는 혼합물을 첨가해도 된다.
제2 반응 및 제3 반응은, 필요에 따라, Ppk에 의한 ATP 재생 반응을 공액시킨 Rbk에 의한 제1 반응과 조합해도 된다. 양자를 조합하는 경우, Rbk에 의한 제1 반응을 먼저 행하고, 그 반응액을 원료로 하여, Prs에 의한 제2 반응과 Nampt에 의한 제3 반응을 행해도 되고, Rbk에 의한 제1 반응과, Prs에 의한 제2 반응 및 Nampt에 의한 제3 반응을 동일한 반응계에서 행해도 된다.
Prs에 의한 제2 반응과 Nampt에 의한 제3 반응은, Nampt, Prs 및 Ppk의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, R5P, NAM, ATP, 및 폴리인산과 접촉시킴으로써 행하여진다.
Rbk에 의한 제1 반응은, Rbk 및 Ppk의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스, ATP, 및 폴리인산과 접촉시킴으로써 행하여진다.
제3 공정에서 사용하는 상기 원료는, 일반적인 공급 업자에게서 구입한 것을 사용할 수도 있고, 스스로 반응을 행하여 합성한 것을 사용할 수도 있다. 예를 들어, R5P는, 시판품을 사용할 수도 있지만, 원료 비용의 관점에서, Rbk에 의한 제1 반응, 즉, Rbk 및 Ppk의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스 및 폴리인산과 접촉시킴으로써 합성한 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 원료의 하나인 폴리인산은, 여러가지 쇄 길이의 것이 알려져 있다. 본 발명에 있어서 사용하는 폴리인산의 쇄 길이는, ATP 재생 반응을 효율적으로 행할 수 있는 것이면 어떠한 쇄 길이의 것이어도 되지만, 용해했을 때의 용액 점도나 비용의 관점에서, 쇄 길이는 3 내지 100 정도가 바람직하고, 3 내지 30 정도가 더욱 바람직하다.
제3 공정에서는, 필요에 따라, 상기 원료 이외의 화합물을, 소정의 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 소정의 각 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물과 접촉시키거나, 혹은 반응 용매 중(제조계 내)에 포함하게 해도 된다. 예를 들어, 각 효소가 기능을 발휘하기 위한 성분으로서, 마그네슘 이온 등의 금속 이온을 포함하는 것이 적절하다. 또한, 버퍼 성분을 포함하는 것도 바람직하다.
사용하는 형질 전환체가 실질적으로 살아 있는 경우, 즉, 세포 증식능을 유지하고 있는 경우, 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 반응을 행하는 것이 바람직하다. 그러한 조건에서 반응을 행함으로써, 본 반응에 있어서의 기질이나 생성물이, 형질 전환체의 증식에 이용되거나, 분해되거나 하지 않고, 높은 수율로 목적 생성물로서 생산되는 것을 기대할 수 있다. 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건이란, 실질적으로 반응계 내의 형질 전환체의 수가 증가하지 않는 조건이면 어떠한 조건이어도 된다. 예를 들어, 형질 전환체가 용이하게 이용 가능한 탄소원(글루코오스 등)을 포함하지 않는 용액 중에서 반응을 행하는 것을 들 수 있다.
반응 용매 중(제조계 내)에 포함되는, 소정의 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 소정의 각 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물의 양, 즉, 보다 구체적으로는 Nampt, Prs, Rbk 및 Ppk 각각의 양은, 적절히 조절할 수 있다. 마찬가지로, 반응 매체 중에 포함되는, R5P, NAM, ATP, 폴리인산, 리보오스, 또한 필요에 따라서 사용되는 기타의 원료의 양도 적절히 조절할 수 있다. 반응 용매 중(제조계 내)의 상기 각 물질의 농도는 다음과 같다.
Nampt의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 10g/L이다. Prs의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 10g/L이다. Rbk의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 10g/L이다. Ppk의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 10g/L이다. 소정의 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 소정의 각 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물의 반응 용매에의 첨가량을 적절히 조정함으로써, 각 효소의 반응 용매 중의 농도를 상기 범위로 조절하는 것이 가능하다.
R5P의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 100g/L이다. 리보오스의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 100g/L이다. NAM의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 500g/L이다. ATP의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 100g/L이다. 폴리인산의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 200g/L이다. 이들 원료의 반응 용매에의 첨가량 등의 조정에 의해, 각 원료의 반응 용매 중의 농도를 상기 범위로 조절하는 것이 가능하다. 반응 용매에의 첨가는, 원료에 따라, 제3 공정의 처음에 일괄적으로 소정량을 투입하게 해도 되고, 제3 공정의 처음 및/또는 도중의 적절한 단계에서, 순차 소정량을 첨가하게 해도 된다.
상술한 바와 같은 각 물질의 농도 이외의, 효소 반응을 진행시키기 위한 조건, 예를 들어 온도, 시간 등도 적절히 조절할 수 있다. 반응 온도는, 각 효소의 촉매 효율이 최적으로 되는 범위에서 조절하는 것이 바람직하다. 반응 시간은, 목적 화합물인 NMN의 생성량이 소정의 양에 도달할 때까지로 할 수 있다.
생성한 NMN은, 통상의 방법에 따라서, 제조계로부터 회수하고, 적절히 농축, 정제할 수 있다. 회수·정제의 방법은, NMN의 순도를 향상시킬 수 있고, 또한 효율적으로 NMN을 회수할 수 있는 방법이면, 어떠한 방법을 사용할 수도 있지만, 예를 들어, 이하와 같은 방법을 들 수 있다. NMN 합성 반응 후, 균체를 사용하여 반응을 행한 경우에는, 원심 분리나 막 여과 등의 수단에 의해, 균체를 제거할 수 있다. 혹은, 무세포 추출물이나 정제 효소를 사용하여 반응을 행한 경우에는, 한외 여과막에 의한 여과나, 과염소산 등을 첨가하여 침전시킨 후에 원심 분리를 행하는 것 등에 의해 단백질 등을 제거할 수 있다. 과염소산에 의한 처리를 행한 경우에는, 수산화칼륨 등에 의해 pH를 약산성으로 되돌리고, 발생한 과염소산칼륨의 침전을 다시 원심 분리에 의해 제거한다. 균체 또는 단백질을 제거한 후, 필요에 따라, 활성탄 흡착에 의한 세정 처리를 행할 수 있다. NMN을 포함하는 수용액을 활성탄과 접촉시켜, NMN을 흡착시킨다. 여과지 등을 사용하여 NMN이 흡착된 활성탄을 여과한 후, 이소아밀알코올 등의 용매로 세정함으로써, 일정한 불순물을 제거할 수 있다. 계속해서, 음이온 교환 수지에 의해 처리함으로써, 더욱 정제를 행할 수 있다. NMN을 포함하는 용액을 Dowex 등의 음이온 교환 수지에 통과시키고, 흡착된 NMN을 물로 용출할 수 있다. 또한, 얻어진 NMN 수용액의 pH를 산성으로 하고, 대량의 아세톤을 가함으로써, NMN을 침전으로서 얻을 수 있다. 이 침전을 건조함으로써, 정제된 NMN을 얻을 수 있다.
본 발명은 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합이, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하로 되도록 행할 수 있다. 이것을 행하기 위한 수단으로서는, 결과적으로, NMN 제조를 위하여 첨가하는 ATP 등의 사용량을 삭감할 수 있으면, 어떠한 방법을 사용할 수도 있지만, 예를 들어, 이하에 나타내는 수단을 단독으로 또는 적절히 조합하여 실시할 수 있다. 이들 수단의 상세는, 후술하는 제4 발명군의 설명에 기재한다.
(1) ATP 재생계의 공액
(2) PPase의 공존
(3) 박테리아 유래 Nampt의 이용
(4) 불필요 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주의 이용
(5) 적절한 기질 농도
-제2 발명군-
본 발명의 NMN의 제조 방법 중, 제2 발명군은, PPase의 존재 하에서, Nampt의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, NAM 및 PRPP와 접촉시키는 공정을 포함한다.
제2 발명군에 의한 NMN의 제조 방법은, 이하의 점을 제외하고, 제1 발명군과 마찬가지로, 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 순차 행함으로써 실시된다. 즉, 제1 공정 및 제2 공정은, 적어도 Nampt의 발현이 강화된 형질 전환체, 당해 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을 조제함과 함께, PPase의 발현이 강화된 형질 전환체 내지는 특별 발현은 강화되어 있지 않지만 내재성 효소로서 PPase를 발현하고 있는 미생물 등, 당해 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을 조제하기 위한 공정으로 하고, 제3 공정에 있어서, 그러한 제1 공정 및 제2 공정을 거친 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액 또는 그들의 처리물을 적어도 NAM 및 PRPP와 접촉시키면 되는 점이다.
·PPase
PPase(EC number: 3.6.1.1)는 피로인산을 2 분자의 인산에 가수분해하는 효소이다. 본 발명의 NMN의 제조 방법 중, 제2 발명군에서는, PPase의 존재 하에서, 제3 반응을 행함으로써, 제3 반응을 매우 효율적으로 진행시킬 수 있다.
Nampt에 의한 제3 반응에서는, NMN과 함께 피로인산이 부생한다. 일반적인 효소 반응의 견지에서는, 제3 반응계에 PPase를 가함으로써, 부생물인 피로인산이 인산으로 분해되어, NMN 생성 방향의 반응이 촉진될 것은 예측된다. 그러나, Nampt의 경우, 반드시 그것은 자명한 것은 아니다. 왜냐하면, 피로인산을 분해해버리면, Nampt 반응이 계속적으로 진행하지 않을 가능성이 있기 때문이다. Nampt는, ATP를 가수분해하고, 자기 인산화에 의해 활성화되는 것이 알려져 있다. Nampt에 의한 제3 반응이 계속하기 위해서는, 반응마다 자기 인산화된 Nampt의 탈인산화가 필요해서, 피로인산은, 그 탈인산화의 트리거 물질인 것으로 되어 있다(Biochemistry 47, 11086-11096(2008)). 따라서, PPase에 의해 피로인산을 제거해버리면, Nampt의 탈인산화가 일어나지 않아, 반응이 계속되지 않을 가능성이 충분히 생각된다. 그러나, 제2 발명군에서는, 제3 반응을 PPase의 존재 하에서 행함으로써, 현저하게 제3 반응을 촉진할 수 있다.
PPase로서는, 예를 들어, 효모 유래의 것(P00817), 대장균 유래의 것(NP_418647), 고초균 유래의 것(P37487), Thermus thermophilus(테르무스 테르모필루스) 유래의 것(P38576), Streptococcus gordonii(스트렙토코쿠스 고르도니) 유래의 것(P95765), Streptococcus mutans(스트렙토코쿠스 뮤탄스)(O68579) 등을 들 수 있다.
PPase는, 제3 반응계에 첨가하는 것이 가능하면 어떠한 형태여도 되고, 또한 어떠한 방법으로 조제해도 된다. 구체적으로는, 먼저, 제1 발명군에 있어서의 제1 공정과 마찬가지로, PPase를 코드하는 유전자를 포함하는 형질 전환체를 제작하여 배양하거나, 또는 당해 각 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액으로 단백질 합성 반응을 행하여, 당해 각 효소를 발현시킨다. 또한, PPase는, 통상의 미생물 등에 있어서는, 생존에 필요한 효소로서 일정량 발현하고 있기 때문에, 특별 발현이 강화되어 있지 않은 미생물 등을 배양하고, 그대로 사용할 수 있다. 계속해서, 제1 발명군에 있어서의 제2 공정과 마찬가지로, 제1 공정을 거친 형질 전환체, 특별 발현이 강화되어 있지 않은 미생물 등 또는 무세포 단백질 합성 반응액으로부터 처리물을 조제할 수 있다. 혹은, 처리물의 일 형태로서 시판하고 있는 PPase 정제 효소를 이용할 수도 있다. 시판하고 있는 PPase 정제 효소로서는, 시그마·알드리치사의 효모 유래 PPase 정제 효소(제품 번호 10108987001) 등을 들 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 PPase의 존재 하에서, Nampt의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, NAM 및 PRPP와 접촉시킴으로써, 제2 발명군에 의한 NMN의 제조 방법을 실시할 수 있다. 제2 발명군에 의해, 제3 반응을 매우 효율적으로 진행시킬 수 있고, NMN을 효율적으로 제조할 수 있다. 제2 발명군에 의한 제3 반응은, 제3 반응 단독으로 행할 수도 있지만, 제1 반응, 제2 반응 및 ATP 재생 반응의 1개 이상 반응과 조합하고, 동일한 반응계에서 행할 수도 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 제1 발명군에 있어서의 제3 반응의 실시 형태를, 본 발명의 제2 발명군에서 규정하는 제3 반응으로 함으로써, 제1 발명군 및 제2 발명군을 통합한 NMN의 제조 방법을 실시하는 것도 가능하다.
사용하는 형질 전환체가 실질적으로 살아 있는 경우, 즉, 세포 증식능을 유지하고 있는 경우, 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 반응을 행하는 것이 바람직하다. 그러한 조건에서 반응을 행함으로써, 본 반응에 있어서의 기질이나 생성물이, 형질 전환체의 증식에 이용되거나, 분해되거나 하지 않고, 높은 수율로 목적 생성물로서 생산되는 것을 기대할 수 있다. 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건이란, 실질적으로 반응계 내의 형질 전환체의 수가 증가하지 않는 조건이면 어떠한 조건이어도 된다. 예를 들어, 형질 전환체가 용이하게 이용 가능한 탄소원(글루코오스 등)을 포함하지 않는 용액 중에서 반응을 행하는 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 제2 공정의 형태로서는, 특히 처리물이 정제 효소인 것이 바람직하다. 정제 효소를 사용함으로써 반응물(기질)이나 생성물의 분해 또는 부반응을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명에 의한 제3 반응의 촉진 효과를 보다 향수할 수 있다.
-제3 발명군-
본 발명의 NMN의 제조 방법 중, 제3 발명군은, (d) EC 3.5.1.42에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자와, 이하의 (a)(c)(g)(h)(i)에 나타나는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자가 파괴 또는 결실되고, 또한, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화되어 있는 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 적어도 니코틴아미드(NAM)와 접촉시키는 공정을 포함한다.
(a) EC 3.1.3.5
(c) EC 2.4.2.1
(g) EC 3.2.2.1
(h) EC 3.2.2.3
(i) EC 3.2.2.14
제3 발명군에 의한 NMN의 제조 방법은, 이하의 점을 제외하고, 제1 발명군과 마찬가지로, 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 순차 행함으로써 실시된다. 즉, 제1 공정 및 제2 공정은, 각종 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자가 파괴 또는 결실되고, 또한, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화되어 있는 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 조제하기 위한 공정으로 하고, 제3 공정에 있어서, 그러한 제1 공정 및 제2 공정을 거친 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 적어도 NAM과 접촉시키면 되는 점이다.
각종 EC 번호로 분류되는 효소에 대해서는, 전술한 바와 같다. 대장균 등의 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 사용하여 NMN을 합성하는 경우, 이들 효소는, 생성한 NMN을 분해하고, 결과적으로 NMN의 생산량을 저하시키는 요인이 된다. 숙주가 갖는 NMN의 분해 경로로서는, NAM을 발생하는 분해 경로와, 니코틴산모노뉴클레오티드(NaMN)를 발생하는 분해 경로의 2개가 알려져 있다(도 9). 본 발명자들은, 양쪽 경로를 약화시킴(경로 위로 있는 1개 이상의 효소를 코드하는 유전자를 파괴 또는 결실함)으로써, 한쪽 경로를 약화시키기 보다도, NMN의 분해를 비약적으로 억제할 수 있음을 알아내고, 제3 발명군을 완성시켰다.
NMN으로부터 NaMN을 발생하는 분해 경로를 약화시키기 위해서는, 도 9에 도시하는 바와 같이, (d) EC 3.5.1.42에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자를 파괴 또는 결실시키면 된다.
NMN으로부터 NAM을 발생하는 분해 경로를 약화시키기 위해서는, 도 9에 도시하는 바와 같이, 이하의 (a)(c)(g)(h)(i)에 나타나는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자를 파괴 또는 결실시키면 된다.
(a) EC 3.1.3.5
(c) EC 2.4.2.1
(g) EC 3.2.2.1
(h) EC 3.2.2.3
(i) EC 3.2.2.14
NMN의 분해에 직접적으로 관계되는 효소인 것으로부터, (a) EC 3.1.3.5 또는 (i) EC 3.2.2.14에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자를 파괴 또는 결실시키는 것이 바람직하고, (a) EC 3.1.3.5에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자를 파괴 또는 결실시키는 것이 보다 바람직하다.
유전자를 파괴 또는 결실시키는 방법은, 특별 한정되는 것은 아니며, 제1 발명군의 설명에 기재한 바와 같다. 본 발명의 제3 발명군은, 본 발명의 제1 및 제2 발명군의 한쪽 또는 양쪽에 통합하여, NMN의 제조 방법을 실시하는 것도 가능하다.
-제4 발명군-
본 발명의 NMN의 제조 방법 중, 제4 발명군에서는, NMN의 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하로 할 수 있다.
지금까지 설명해 온 제1 반응, 제2 반응 및 제3 반응에 의한 NMN의 제조에 있어서는 ATP가 필요해진다. 즉, 제1 반응에서는, 리보오스로부터의 R5P의 생성에 수반하여, ATP가 ADP로 변환되기 때문에, 1몰의 R5P의 생성에 대해서, 1몰의 ATP가 사용된다. 제2 반응에서는, R5P로부터의 PRPP의 생성에 수반하여, ATP가 AMP로 변환되기 때문에, 1몰의 PRPP의 생성에 대해서, 1몰의 ATP가 사용된다. 제3 반응에서는, PRPP으로부터의 NMN의 생성 시에, 그 반응 자체에 ATP는 필수는 아니다. 그러나, 상술과 같이, Nampt에는 ATP 가수분해 활성이 있고, ATP의 가수분해에 의해 Nampt가 자기 인산화되어, NMN 생성에 유리한 방향으로 효소학적 파라미터나 화학 평형이 변화한다. 따라서, 제3 반응계 내에 ATP가 충분히 존재하는 경우에는, PRPP으로부터의 NMN의 생성에 수반하여, 실질적으로 1몰의 PRPP의 생성에 대해서, 1몰 이상의 ATP가 사용되게 된다. 즉, R5P를 원료로 한 제2 반응 및 제3 반응에 의한 NMN의 제조에 있어서는, 1몰의 NMN의 생성에 대해서, 계 2몰 이상의 ATP가, 리보오스를 원료로 한 제1 반응, 제2 반응 및 제3 반응에 의한 NMN의 제조에 있어서는, 1몰의 NMN의 생성에 대해서, 계 3몰 이상의 ATP가 사용되게 된다.
ATP는 고가의 화합물이기 때문에, NMN을 저렴하게 제조하고자 하는 경우, 그 사용량은 가능한 한 적은 쪽이 바람직하다. 본 발명의 NMN의 제조 방법 중, 제4 발명군을 이용함으로써, NMN의 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하로 할 수 있다.
제4 발명군에 의한 NMN의 제조 방법은, NMN 제조를 위하여 첨가하는 ATP 등의 사용량을 삭감할 수 있으면, 어떠한 방법을 사용하여 행할 수도 있지만, 예를 들어, 이하에 나타내는 수단을, 단독으로 또는 적절히 조합하여 실시할 수 있다.
(1) ATP 재생계의 공액
부생한 ADP 또는 AMP를 ATP로 재생할 수 있는 계를, 적어도, 제2 반응 및 제3 반응을 포함하는 NMN 생성 반응계와 공액시킴으로써, NMN 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. ATP 재생계로서는, AMP 및 ADP로부터 ATP를 재생할 수 있는 계이면 어떠한 계여도 되고, 예를 들어, 폴리인산을 인산원으로 하여 Ppk를 사용하는 계, 포스포에놀피루브산을 인산원으로 하여 피루브산키나아제를 사용하는 계, 크레아틴인산을 인산원으로 하여 크레아틴인산키나아제를 사용하는 계 등을 들 수 있는데, 인산원의 비용의 관점에서는, 폴리인산을 인산원으로 하여 Ppk를 사용하는 계가 바람직하다. 폴리인산과 Ppk를 사용한 ATP 재생계를 공액시킨 NMN 생성 반응은, 구체적으로는, 제1 발명군에 있어서의 제3 공정에 기재된 바와 같이 실시할 수 있다.
(2) PPase의 공존
NMN 생성 반응계에 PPase를 공존시킴으로써, 부생물인 피로인산이 인산으로 분해되어, NMN 생성 방향의 반응이 촉진됨으로써, 결과적으로, NMN 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. PPase를 공존시킨 NMN 생성 반응은, 구체적으로는, 제2 발명군에 기재된 바와 같이 실시할 수 있다.
(3) 박테리아 유래 Nampt의 이용
제3 반응을 촉매하는 효소 Nampt로서, 박테리아 유래의 Nampt를 사용함으로써, NMN의 생성이 효율적으로 진행하고, 결과적으로, NMN 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. 박테리아 유래의 Nampt로서는, 제1 발명군에 있어서의 제1 공정에 기재된 것을 이용할 수 있다.
(4) 불필요 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주의 이용
형질 전환체, 형질 전환체로부터 조제한 휴지 균체, 막투과성 향상 균체, 불활성화 균체, 파쇄 균체, 파쇄 균체로부터 조제한 무세포 추출물 및 이들에 대하여 안정화 처리를 행한 안정화 처리물을 사용하여 NMN의 생성 반응을 행하는 경우, 반응물(기질)이나 생성물의 분해, 혹은 부반응의 원인이 되는 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 제1 발명군에 있어서의 제1 공정에 기재된 유전자의 어느 하나 이상을 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 제3 발명군에 기재된 유전자 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다.
(5) 적절한 기질 농도
화학 평형이나 효소의 기질 친화성의 관점에서, 반응계 내의 리보오스나 NAM 농도를 높임으로써, NMN 생성 속도나 생성량의 향상을 기대할 수 있고, 결과적으로, NMN 제조를 위하여 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. 한편, ATP도, 반응계 내의 농도를 높임으로써, 마찬가지의 효과는 기대할 수 있지만, 필요 이상으로 ATP를 첨가해도, 거기에 적당한 NMN 생성량의 증가가 없으면, NMN을 1몰 생성시키기 위하여 사용하는 ATP의 몰수는 증가해버린다. 즉, 적절한 양의 ATP를 반응계에 첨가함으로써, 효율적으로 NMN을 제조할 수 있다. 반응계에 첨가하는 ATP의 몰수는, 생성하는 NMN의 몰수의 1당량 이하가 바람직하고, 0.5당량 이하가 보다 바람직하고, 0.1당량 이하가 더욱 바람직하다.
본 발명의 제4 발명군은, 본 발명의 제1, 제2 및 제3 발명군의 1개 또는 2개 이상에 통합하여, NMN의 제조 방법을 실시하는 것도 가능하다.
실시예
[실시예 1] <ATP 재생계를 이용한 리보오스로부터의 NMN 합성>
본 실시예에서는, 소정의 각 효소로서 하기의 것을 사용하였다.
Nampt: Haemophilus ducreyi 유래(AAR87771)
Prs: Bacillus subtilis 유래(BAA05286), Homo sapiens 유래(NP_002755)
Ppk(Ppk2 클래스 3): Deinococcus radiodurans 유래(NP_293858)
Rbk: Saccharomyces cerevisiae 유래(P25332)
(1) 발현 플라스미드의 제작
각 효소의 발현 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다. 표 1의 「유래」에 기재된 생물종 유래의 각 효소에 대해서, 동 표 중의 「아미노산 서열」에 기재된 각 서열 번호로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 효소 단백질을 코드하는 DNA(표 1의 「염기 서열」에 기재된 각 서열 번호로 나타나는 염기 서열을 포함한다)를 합성하고, 각각 발현 벡터 pET-26b(+)(Novagen)의 NdeI-XhoI 사이트에 클로닝했다(유전자 합성은 젠스크립트 재팬에서 실시, 대장균 발현용으로 코돈을 최적화). 얻어진 각 플라스미드를, 표 1의 「발현 플라스미드」에 나타낸 바와 같이 명명하였다.
Figure pct00001
(2) 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체의 제작
대장균(E. coli) BL21(DE3)주의 컴피텐트 세포(Zip Competent Cell BL21(DE3), 붕어 면발이 쫄깃함)를 얼음 상에서 융해하고, (1)에서 제작한 각 플라스미드 DNA 용액을 혼합하여 얼음 상에서 10분간 정치하였다. 42℃에서 45초간 히트 쇼크를 가한 후, 다시 빙냉하고, SOC 배지를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 진탕 배양을 행한 후, LB 한천 배지(카나마이신 황산염 50mg/L 함유)에 도포하고, 37℃에서 밤새 정치 배양을 행하였다. 얻어진 콜로니를 각 효소의 발현이 강화된 재조합체로 하였다.
(3) 재조합체의 배양
각 효소의 발현이 강화된 재조합체의 콜로니를, Overnight Express Autoinduction system 1(Merck)을 첨부 프로토콜에 따라서 첨가한 LB 배지(카나마이신 황산염 50mg/L을 포함한다) 2ml에 식균하였다. 온도 37℃, 진탕 회전수 200rpm으로 3시간 배양을 행한 후, 온도 17℃, 회전 진탕수 200rpm로 변경하고, 또한 18시간 배양을 행하였다.
(4) 무세포 추출물의 조제
(3)에서 얻어진 배양액을 원심 분리(5,000×g, 10분간)하고, 상청을 폐기하였다. 침전한 균체에, 50mM HEPES-NaOH 버퍼(pH 7.5)를 첨가하고, 파장 630㎚의 탁도가 10으로 되도록 조정하였다. 단, Prs 발현 균체에 대해서는, 50mM 인산 칼륨 버퍼(pH7.5)를 사용하여 행하였다. 버퍼 균체 현탁액 0.5ml를 Bioruptor(코스모 바이오)로 15분간 파쇄하였다. 파쇄액을 원심 분리(5,000×g, 10분간)하고, 얻어진 상청을 무세포 추출물로 하였다. 무세포 추출물의 단백질 농도는, BSA(소혈청 알부민, 바이오래드)를 표준 단백질로서, Bio-Rad protein assay(바이오래드)를 사용하여 측정하였다.
(5) NMN 합성 반응
(4)에서 조제한 무세포 추출물을 사용하여 NMN 합성 반응을 행하였다. 반응액량을 100μL로 하고, 표 2(No.1-2, 1-4)에 나타내는 조성으로 각 반응액을 조제하고, 37℃에서 정치 반응을 행하였다.
Figure pct00002
반응 개시 직후(0시간 후), 3시간 후 및 6시간 후에, 반응액 10μL씩을 샘플링하였다. 샘플링한 반응액을 (6)에 기재하는 HPLC 이동상 90μL와 혼합하고, 바로 빙냉함으로써 반응을 정지하였다. 희석액을 한외 여과막(센트리커트 초미니, 분화 분자량 10,000, 구라보)으로 여과하고(5,000×g, 10분간), 여액을 HPLC로 분석하였다.
(6) NMN의 분석
NMN 합성 반응 샘플의 분석은, HPLC에 의해 이하의 조건에서 행하였다.
칼럼: SUPELCOSIL LC-18-T(시그마·알드리치)
이동상: 0.05M KH2PO4/K2HPO4(pH 7)
유속: 1ml/min
검출: UV 261㎚
칼럼 온도: 30℃
(7) 실험 결과
실험 결과를 도 2에 도시한다. Ppk를 첨가한 샘플 No.1-2와 No.1-4에서는, 각각 0.5mM, 0.6mM의 NMN의 생성이 보였다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.05㎛ol, 0.06㎛ol) 각각 0.2당량, 0.17당량이었다. 또한, Prs는, Bacillus subtilis 유래(BsPrs), Homo sapiens 유래(HsPrs)의 어느 것이든 NMN이 생성되는 것이 확인되었다. 이상의 결과로부터, ATP 재생 효소인 Ppk를 공존시킴으로써, 리보오스로부터 효율적으로 NMN을 합성하는 것이 가능함이 나타났다.
[비교예 1] <ATP 재생계를 이용하지 않는 리보오스로부터의 NMN 합성>
(1) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
본 비교예에서는, 실시예 1(2) 내지 (4)와 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소의 무세포 추출물을 조제하였다.
(2) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(1)에서 얻어진 무세포 추출물을 사용하여, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 반응액량을 100μL로 하고, 표 2(No.1-1, 1-3)에 나타내는 조성으로 각 반응액을 조제하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
(3) 실험 결과
실험 결과를 도 2에 도시한다. Ppk를 첨가하지 않은 샘플 No.1-1 및 No.1-3에서는, NMN의 생성은 검출 한계 이하였다.
[실시예 2] <냉동 보존한 무세포 추출물에 의한 NMN의 합성>
(1) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
본 실시예에서는, Prs로서 Bacillus subtilis 유래(BsPrs)만을 사용하는 것 이외에는, 실시예 1(2) 내지 (4)와 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소의 무세포 추출물을 조제하였다. 조제 직후에, (2)에서 후술하는 NMN 합성 반응을 행하였다. 또한, 얻어진 각 무세포 추출물을 -20℃에서 보존하였다. 1개월간 후, 보존해 둔 무세포 추출물을 사용하여, 다시 NMN 합성 반응을 행하였다.
(2) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(1)에서 얻어진 조제 직후 및 1개월간 보존 후(-20℃ 보존)의 무세포 추출물을 사용하여, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 각 반응액을 표 3에 나타내는 조성으로 조제하는 것, 및 반응 개시 후 6시간에 샘플링하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00003
(3) 실험 결과
무세포 추출물을 -20℃에서 보존한 No.2-2는, 무세포 추출물 조제 직후의 샘플 No.2-1과 마찬가지로, 반응 6시간 후에 0.5mM의 NMN 생성이 보였다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.05㎛ol)의 0.2당량이었다. 따라서, 동결 보존함으로써, NMN 합성능을 가진 상태에서, 무세포 추출물이 보존 가능함이 나타났다.
[실시예 3] <Prs 변이체를 이용한 NMN의 합성>
본 실시예에서는, 소정의 각 효소로서 하기의 것을 사용하였다.
Nampt: Haemophilus ducreyi 유래(AAR87771)
Prs: Bacillus subtilis 유래(BAA05286) Asn120Ser 변이체(BsPrsN120S) 및 Leu135Ile 변이체(BsPrsL135I)
Ppk(Ppk2 클래스 3): Deinococcus radiodurans 유래(NP_293858)
Rbk: Saccharomyces cerevisiae 유래(P25332)
BsPrsN120S 및 BsPrsL135I는, 120번째의 아스파라긴이 세린으로, 135번째로 류신이 이소류신으로 각각 치환되어 있다. 양쪽 변이체의 생물종 유래, 아미노산 서열을 나타내는 서열 번호, DNA의 염기 서열을 나타내는 서열 번호, 발현 플라스미드명을 각각 표 4에 나타내었다.
Figure pct00004
(1) Prs 변이체 발현 플라스미드의 제작
Prs 변이체를 발현하는 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다. 표 1에 기재한 pEBsPrs를 주형으로 하여, 변이 도입 PCR 반응을 행하였다. 변이 도입용 프라이머명 및 그 염기 서열을 나타내는 서열 번호, Prs 변이체명을 표 5에 나타내었다.
Figure pct00005
변이 도입 PCR 반응은, 표 6에 나타내는 반응액 조성 및 표 7에 나타내는 반응 조건에서 행하였다.
Figure pct00006
Figure pct00007
PCR 반응 종료 후, QIAquick PCR Purification Kit(퀴아젠)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서 PCR 산물을 정제하였다. 생성한 PCR 산물을 DpnI(New England Biolabs)로 소화한 반응액을 사용하여, 대장균 HST08(다카라 바이오)을 형질 전환하였다. 출현한 콜로니로부터 플라스미드 추출을 행하고, 프라이머 T7-PP(서열 번호 19) 및 T7-TP(서열 번호 20)를 사용하여 염기 서열의 확인을 행하였다. 정확하게 변이가 도입된 각 플라스미드를 표 4에 기재한 각 변이체 Prs 발현 플라스미드로 하였다.
(2) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
Prs로서, BsPrsN120S 및 BsPrsL135I를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1(2) 내지 (4)와 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소의 무세포 추출물을 조제하였다.
(3) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(1)에서 얻어진 무세포 추출물을 사용하여, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 각 반응액을 표 8에 나타내는 조성으로 조제하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00008
(4) 실험 결과
실험 결과를 도 3에 도시한다. BsPrsN120S 및 BsPrsL135I를 사용한 경우, 반응 6시간 후에는 야생형보다도 높은 NMN 생성량을 나타냈다. Prs를 첨가하지 않은 경우, NMN의 생성은 보이지 않았다. 이상의 결과로부터, Prs 변이체를 사용함으로써 효율적으로 NMN을 합성할 수 있음이 나타났다.
[실시예 4] <기질 농도의 검토>
(1) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
본 실시예에서는, Prs로서, 실시예 3에 기재된 BsPrsN120S를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1(2) 내지 (4)와 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소의 무세포 추출물을 조제하였다.
(2) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(1)에서 얻어진 무세포 추출물을 사용하여, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 각 반응액을 표 9에 나타내는 조성으로 조제하는 것, 및 반응 개시 후 18시간에 샘플링하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00009
(3) 실험 결과
실험 결과를 도 4에 도시한다. 폴리인산(Poly-P) 농도는 10mM보다도 5mM로 하는 쪽이, 전체적으로 NMN의 생성량이 많음이 확인되었다. 폴리인산 농도가 5mM이고, 기질 리보오스 농도가 30mM인 경우, 또하나의 기질인 니코틴아미드 농도는 6mM인 경우(샘플 No.4-1, 4-4)보다도 20mM인 경우(샘플 No.4-2, 4-5) 쪽이, NMN 생성량은 1.7배 이상 높아지는 것이 확인되었다. 단, 마그네슘 농도에 의한 영향은 거의 보이지 않았다. 한편, 양 기질을 동일한 비율로 2배 농도로 한 경우(샘플 No.4-3, 4-6), 마그네슘 농도 10mM(샘플 No.4-3)에서는 NMN 생성량은 미증에 머물렀지만, 마그네슘 농도 20mM(샘플 No.4-6)에서는, NMN 생성량이 증가하고, 2.6mM 생성되었다. 샘플 No.4-6에서는, 첨가한 ATP의 몰수(0.1㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.26㎛ol)의 0.38당량이었다. 이상의 결과로부터, NMN의 효율적인 생성에는, 리보오스, 니코틴아미드, 폴리인산, 마그네슘의 농도를 적절하게 설정하는 것이 중요함이 나타났다.
[실시예 5] <박테리아 유래 및 인간 유래 Nampt 정제 효소를 사용한 NMN 합성>
본 실시예에서는, 소정의 각 효소로서 하기의 것을 사용하였다.
Nampt: Haemophilus ducreyi 유래(AAR87771) Nampt에 His 태그를 부가한 것(HdNampt-His), Deinococcus radiodurans 유래(AE001890) Nampt에 His 태그를 부가한 것(DrNampt-His), Shewanella oneidensis 유래(NP_717588) Nampt에 His 태그를 부가한 것(SoNampt-His) 및 인간(Homo sapiens) 유래(NP_005737) Nampt에 His 태그를 부가한 것(HsNampt-His)
Prs: Bacillus subtilis 유래(BAA05286) Prs의 Asn120Ser 변이체(BsPrsN120S)
Ppk(Ppk2 클래스 3): Deinococcus radiodurans 유래(NP_293858) Ppk
Rbk: Saccharomyces cerevisiae 유래(P25332) Rbk
(1) His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드의 제작
박테리아 유래의 각종 Nampt에 His 태그가 부가된 단백질을 발현하는 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다. 먼저, Deinococcus radiodurans 유래(AE001890) 및 Shewanella oneidensis 유래(NP_717588)의 각 효소에 대해서, 표 10 중의 「아미노산 서열」에 기재된 각 서열 번호로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 효소 단백질을 코드하는 DNA(표 10의 「염기 서열」에 기재된 각 서열 번호로 나타나는 염기 서열을 포함한다)를 합성하고, 각각 발현 벡터 pET-26b(+)(Novagen)의 NdeI-XhoI 사이트에 클로닝했다(유전자 합성은 젠스크립트 재팬에서 실시). 얻어진 각 플라스미드를, 표 10의 「발현 플라스미드」에 나타낸 바와 같이 명명하였다.
Figure pct00010
계속해서, 제작한 pEDrNampt, pESoNampt 및 pEHdNampt(실시예 1기재)를 주형으로 하여, Nampt에 His 태그를 부가하기 위한 변이 도입 PCR 반응을 행하였다. 주형 플라스미드명, 변이 도입용 프라이머명 및 그 염기 서열을 나타내는 서열 번호, His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드명을 표 11에 나타내었다.
Figure pct00011
His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드의 제작은, 표 11에 나타내는 각종 주형 플라스미드와 변이 도입 프라이머를 사용하는 이외에는, 실시예 3(1)과 마찬가지의 조작에 의해, 변이 도입 PCR 반응으로부터 염기 서열 확인까지 행하였다. 정확하게 His 태그가 부가된 플라스미드를 표 11에 기재한 각 플라스미드로 하였다.
(2) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
실시예 4(1)과 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소를 발현하는 재조합체의 제작, 배양 및 무세포 추출물의 조제를 행하였다. 단, 박테리아 유래 Nampt에 대해서는, (1)에서 제작한 His 태그 부가 발현 플라스미드를 사용하여 재조합체의 제작 및 배양을 행하여, His 태그 부가 Nampt를 포함하는 무세포 추출물을 조제하였다. 그 때, 균체를 현탁하는 버퍼로서는, 50mM HEPES-NaOH 버퍼(pH 8.0)를 사용하였다.
(3) Nampt 정제 효소의 조제
(2)에서 조제한 박테리아 유래 His 태그 부가 Nampt를 포함하는 무세포 추출물을 사용하여, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해, His 태그 부가 Nampt의 정제를 행하였다. TALON Metal Affinity Resin(다카라 바이오) 200μL를 1.5ml 튜브에 채취하고, 원심 분리(5000g, 2분간)에 의해 수지를 침전시켰다. 상청을 버리고, 증류수 1ml를 첨가하여 현탁한 후, 다시 원심 분리를 행하였다. 이 일련의 세정 조작을 계 2회 행한 후, 50mM HEPES-NaOH 버퍼(pH 8.0)를 사용하여 마찬가지로, 2회 세정을 행하였다. 세정 후의 수지에, 각 박테리아 유래 His 태그 부가 Nampt의 무세포 추출물 1ml를 첨가하고, 4℃에서 1시간 천천히 진탕하였다. 원심 분리에 의해 무세포 추출물을 제거한 후, Wash 버퍼(50mM 인산나트륨, 300mM 염화나트륨, pH7.0)를 사용하여 2회 세정을 행하였다. 원심 분리에 의해 Wash 버퍼를 제거한 후, Elution 버퍼(50mM 인산나트륨, 300mM 염화나트륨, 150mM 이미다졸, pH7.0)를 100μL 첨가하였다. 원심 분리에 의해 상청을 회수한 후, 다시, Elution 버퍼를 100μL 첨가하였다. 이 일련의 조작을 3회 행하고, 얻어진 용출액을 혼합하였다. 혼합한 용출액을, 자비 세정한 투석 튜브(산코 준야쿠)에 넣고, 50mM HEPES-NaOH 버퍼(pH 7.5)를 사용하여 투석을 행하였다. 투석 후의 용액을 회수하고, 각 박테리아 유래 His 태그 부가 Nampt의 정제 효소 용액으로 하였다.
(4) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(2)에서 얻어진 Nampt 이외의 각 효소의 무세포 추출물과, Nampt 정제 효소를 사용하여 NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 박테리아 유래의 Nampt 정제 효소로서는, (3)에서 조제한 3종의 His 태그 부가 Nampt 정제 효소를 사용하였다. 인간 유래 Nampt 정제 효소(HsNampt-His)로서는, 시판되고 있는 인간 유래 His 태그 부가 Nampt 정제 효소(CY-E1251, MBL)를 사용하였다. 각 반응액을 표 12에 나타내는 조성으로 조제하는 것, 반응 개시 후 12시간에 샘플링하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00012
(5) 실험 결과
실험 결과를 도 5에 도시한다. 박테리아 유래 Nampt(HdNampt-His, DrNampt-His, SoNampt-His)를 사용한 경우, 1.4mM으로부터 2.4mM의 NMN이 생성되었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.14 내지 0.24㎛ol)의 0.042 내지 0.071당량이었다. 한편, 인간 유래 Nampt(HsNampt-His)를 사용한 경우, NMN의 생성량은 0.6mM이었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.06㎛ol)의 0.17당량이었다. 이상의 결과로부터, 박테리아 유래, 인간 유래 어느 Nampt로도 NMN의 합성은 가능하지만, 특히 박테리아 유래 Nampt를 사용함으로써 효율적으로 NMN을 합성하는 것이 가능함이 나타났다.
[실시예 6] <ATP 재생계를 이용한 R5P로부터의 NMN 합성>
(1) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
본 실시예에서는, 실시예 1(2) 내지 (4)와 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소의 무세포 추출물을 조제하였다.
(2) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(1)에서 얻어진 무세포 추출물을 사용하여, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 반응액량을 100μL로 하고, 표 13(No.6-2)에 나타내는 조성으로 각 반응액을 조제하는 것, 및 샘플링을 반응 개시 직후(0시간 후)와 6시간 후에 행하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00013
(3) 실험 결과
실험 결과를 도 6에 도시하였다. Ppk를 첨가한 샘플 No.6-2에서는, 2.4mM의 NMN의 생성이 보였다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.24㎛ol)의 0.042당량이었다. 이상의 결과로부터, ATP 재생 효소인 Ppk를 공존시킴으로써, R5P로부터 효율적으로 NMN을 합성하는 것이 가능함이 나타났다.
[비교예 2] <ATP 재생계를 이용하지 않는 R5P로부터의 NMN 합성>
(1) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
본 비교예에서는, 실시예 1(2) 내지 (4)와 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소의 무세포 추출물을 조제하였다.
(2) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(1)에서 얻어진 무세포 추출물을 사용하여, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 반응은, 반응액량을 100μL로 하고, 표 13(No.6-1)에 나타내는 조성으로 각 반응액을 조제하는 것, 및 샘플링을 반응 개시 직후(0시간 후)와 6시간 후에 행하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
(3) 실험 결과
실험 결과를 도 6에 도시하였다. Ppk를 첨가하지 않은 샘플 No.6-1에서는, NMN의 생성은 검출 한계 이하였다.
[실시예 7] <불필요 유전자 파괴 숙주로 조제한 무세포 추출액을 사용한 NMN 합성>
(1) 불필요 유전자 파괴 숙주의 제작
반응물(기질)인 NAM, 및 생성물인 NMN의 분해 또는 부반응을 억제하기 위해서, 분해나 부반응의 원인이 되는 각 효소를 코드하는 유전자를 파괴한 표 14의 숙주를 제작하였다.
Figure pct00014
불필요 유전자 파괴 숙주의 제작은, TargeTron Gene Knockout System(시그마·알드리치)을 사용하고, 기본적으로 첨부 프로토콜에 따라 행하였다.
·BN1주의 제작
처음에, 대장균 BL21(DE3)을 숙주로 하여 ushA 유전자가 파괴된, BN1주를 이하와 같이 제작하였다. 먼저, 서열 번호 31(IBS 프라이머), 서열 번호 32(EBS1d 프라이머) 및 서열 번호 33(EBS2 프라이머)에 나타내는 각 프라이머, 및 TargeTron Gene Knockout System 첨부의 EBS Universal 프라이머를 사용하여, 표 15에 나타내는 반응액 조성 및 표 16에 나타내는 반응 조건에서 PCR을 행하였다.
Figure pct00015
Figure pct00016
PCR 반응 종료 후, 반응액에 3μL를, 4％ 아가로오스 겔로 전기 영동을 행하여, 약 350bpDNA 단편의 증폭을 확인하였다. 나머지 PCR 반응액을, QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)에 의해 정제하였다. 정제한 PCR 반응액 8μL에, 103Restriction Enzyme Buffer(키트 첨부) 2μL, HindIII 1μL, BsrGI 1μL, 멸균수 8μL를 첨가하였다. 37℃에서 30분간, 계속하여 60℃에서 30분간 소화를 행한 후, 80℃에서 10분간 처리를 행하였다. 얻어진 소화 산물 3μL를 60℃에서 30초간 열처리한 후, 얼음 상에서 1분간 냉각하였다. pACD4K-C Linear Vector(키트 첨부) 1μL, DNA Ligation Kit <Mighty Mix>(다카라 바이오) 4μL를 첨가하여 혼합한 후, 16℃에서 1시간, 라이게이션 반응을 행하였다. 라이게이션 반응액 5μL를, 대장균 JM109 컴피텐트 세포(다카라 바이오) 50μL와 혼합하고, 얼음 상에서 30분간 정치하였다. 42℃에서 45초간 인큐베이트한 후, 다시 얼음 상에서 5분간 정치하였다. SOC 배지를 500μL 첨가하고, 37℃에서 1시간, 200rpm으로 진탕 배양을 행한 후, LB 한천 배지(클로람페니콜 25μg/mL 함유)에 적량을 도포하였다. 37℃에서 밤새 배양을 행한 후, 생육한 콜로니를 LB 액체 배지(클로람페니콜 25μg/mL 함유)에 식균하고, 37℃에서 16시간, 200rpm으로 진탕 배양을 행하였다. 배양액을 원심하여 균체를 회수하고, QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서 플라스미드 추출을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 HindIII로 소화 후, 1％ 아가로오스 겔로 전기 영동을 행하여, 약 7.7kbp의 밴드가 확인된 플라스미드를, pACD4K-C-ushA로 하였다.
계속해서, 카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는 ushA 유전자 파괴용 플라스미드를 제작하기 위해서, pACD4K-C-ushA를 주형으로 하여, 서열 번호 34(pACD4K-C-dKm-F2) 및 서열 번호 35(pACD4K-C-dKm-R)에 나타내는 프라이머를 사용하여, 표 17에 나타내는 반응액 조성 및 표 18에 나타내는 반응 조건에서, PCR 반응을 행하였다. 또한, 서열 번호 34에 나타내는 프라이머는, 5'말단에 인산화 수식이 된 것을 사용하였다.
Figure pct00017
Figure pct00018
PCR 반응 종료 후, 반응액에 1μL의 DpnI(다카라 바이오)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응을 행하였다. QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)에 의해 정제한 반응액 2μL에, DNA Ligation Kit <Mighty Mix>(다카라 바이오) 2μL를 첨가하여 혼합한 후, 16℃에서 1시간, 라이게이션 반응을 행하였다. 라이게이션 반응액을, 대장균 JM109 컴피텐트 세포(다카라 바이오) 40μL와 혼합하고, 얼음 상에서 30분간 정치하였다. 42℃에서 45초간 인큐베이트한 후, 다시 얼음 상에서 5분간 정치하였다. SOC 배지를 500μL 첨가하고, 37℃에서 1시간, 200rpm으로 진탕 배양을 행한 후, LB 한천 배지(클로람페니콜 25μg/mL 함유)에 적량을 도포하였다. 37℃에서 밤새 배양을 행한 후, 생육한 콜로니를 LB 액체 배지(클로람페니콜 25μg/mL 함유)에 식균하고, 37℃에서 16시간, 200rpm으로 진탕 배양을 행하였다. 배양액을 원심하여 균체를 회수하고, QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서 플라스미드 추출을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 MluI로 소화 후, 1％ 아가로오스 겔로 전기 영동을 행하여, 약 6.3kbp의 밴드가 확인된 플라스미드를, pACD4K-C-ushAΔKm으로 하였다.
1μL의 pACD4K-C-ushAΔKm 플라스미드 용액을, 대장균 BL21(DE3) 컴피텐트 세포(바이오 다이내믹스 연구소) 50μL에 첨가하고, 얼음 상에서 10분간 정치하였다. 42℃에서 45초간 히트 쇼크를 행하고, 다시 얼음 상에서 5분간 정치하였다. 실온으로 한 SOC 배지 450μL를 첨가하고, 37℃에서 1시간, 200rpm으로 진탕 배양을 행하였다. 진탕 후의 배양액 100μL를, 3mL의 LB 액체 배지(1％ 글루코오스, 25μg/ml 클로람페니콜 함유)에 첨가하고, 37℃에서 밤새, 200rpm으로 진탕 배양을 행하였다. 얻어진 배양액 40μL를, 2mL의 LB 액체 배지(1％ 글루코오스, 25μg/ml 클로람페니콜 함유)에 첨가하고, OD600이 약 0.2가 될 때까지 37℃에서 배양을 계속하였다. OD600이 약 0.2가 된 후, 10μL의 100mM IPTG 용액을 배양액에 첨가하고, 30℃에서 30분간, 200rpm으로 진탕 배양을 행하였다. 그 후, 마이크로 원심기를 사용하여 최대 속도로 1분간 원심 분리를 행하고, 균체를 1mL의 LB 액체 배지(1％ 글루코오스 함유, 클로람페니콜 비함유)에 재현탁하였다. 30℃에서 1시간, 20rpm으로 진탕 배양을 행한 후, 100μL의 배양액을, 미리 100μL의 100mM IPTG 용액을 도포해 둔 LB 한천 플레이트에 도포하고, 30℃에서 3일간, 배양을 행하였다. 출현한 복수의 콜로니에 대하여 Forward 프라이머(서열 번호 36) 및 Reverse 프라이머(서열 번호 37)를 사용하여, 콜로니 PCR을 행하였다. 반응액 조성은 표 19, 반응 조건은 표 18로 하였다. 원래의 숙주(BL21(DE3))에서는 약 1.1kbp의 밴드가 증폭되는 데 반해, 약 1.8kbp의 밴드가 증폭된 클론이 얻어졌다. 이 클론을, ushA 유전자가 파괴된 숙주로 하여 BN1주로 하였다. E.coli Transformation Kit, Mix & Go(ZYMO RESEARCH)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서, BN1주의 컴피텐트 세포를 제작하였다.
Figure pct00019
·BN3주의 제작
계속해서, BN1주를 숙주로 하여 pncA 유전자가 파괴된, BN3주를 이하와 같이 제작하였다. 서열 번호 38(IBS 프라이머), 서열 번호 39(EBS1d 프라이머) 및 서열 번호 40(EBS2 프라이머)에 나타내는 각 프라이머, 및 TargeTron Gene Knockout System 첨부의 EBS Universal 프라이머를 사용하여, 표 15에 나타내는 반응액 조성 및 표 16에 나타내는 반응 조건에서 PCR을 행하였다. BN1주 제작 시와 마찬가지로, PCR 반응액의 정제, HindIII와 BsrGI에 의한 제한 효소 처리, 벡터 pACD4K-C와의 라이게이션 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 플라스미드 추출을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 HindIII로 소화 후, 1％ 아가로오스 겔로 전기 영동을 행하여, 약 7.7kbp의 밴드가 확인된 플라스미드를, pACD4K-C-pncA로 하였다.
카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는 pncA 유전자 파괴용 플라스미드를 제작하였다. PCR 반응 시의 템플릿으로서 pACD4K-C-pncA를 사용하는 것 이외에는, pACD4K-C-ushAΔKm 제작 시와 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. 얻어진 플라스미드를 pACD4K-C-pncAΔKm으로 하였다.
BN1주를 숙주로 하여, pncA 유전자가 파괴된 BN3주를 제작하였다. 유전자 파괴 플라스미드로서 pACD4K-C-pncAΔKm을 사용하는 것, 및 컴피텐트 세포로서 BN1주 컴피텐트 세포를 사용하는 것 이외에는, 상술한 BN1주의 제작과 마찬가지의 조작에 의해 제작하였다. 출현한 복수의 콜로니에 대하여 Forward 프라이머(서열 번호 41) 및 Reverse 프라이머(서열 번호 42)를 사용하여, 콜로니 PCR을 행하였다. 반응액 조성은 표 19, 반응 조건은 표 18로 하였다.
원래의 숙주(BL21(DE3))에서는 약 2.2kbp의 밴드가 증폭되는 데 반해, 약 2.9kbp의 밴드가 증폭된 클론이 얻어졌다. 이 클론을, ushA 유전자와 pncA 유전자가 파괴된 숙주로 하여, BN3주로 하였다. E.coli Transformation Kit, Mix & Go(ZYMO RESEARCH)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서, BN3주의 컴피텐트 세포를 제작하였다.
·BN6주의 제작
계속해서, BN3주를 숙주로 하여 pncC 유전자가 파괴된, BN6주를 이하와 같이 제작하였다. 서열 번호 43(IBS 프라이머), 서열 번호 44(EBS1d 프라이머) 및 서열 번호 45(EBS2 프라이머)에 나타내는 각 프라이머, 및 TargeTron Gene Knockout System 첨부의 EBS Universal 프라이머를 사용하여, 표 15에 나타내는 반응액 조성 및 표 16에 나타내는 반응 조건에서 PCR을 행하였다. BN1주 제작 시와 마찬가지로, PCR 반응액의 정제, HindIII와 BsrGI에 의한 제한 효소 처리, 벡터 pACD4K-C와의 라이게이션 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 플라스미드 추출을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 HindIII로 소화 후, 1％ 아가로오스 겔로 전기 영동을 행하여, 약 7.7kbp의 밴드가 확인된 플라스미드를, pACD4K-C-pncC으로 하였다.
카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는 pncC 유전자 파괴용 플라스미드를 제작하였다. PCR 반응 시의 템플릿으로서 pACD4K-C-pncC을 사용하는 것 이외에는, pACD4K-C-ushAΔKm 제작 시와 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. 얻어진 플라스미드를 pACD4K-C-pncCΔKm으로 하였다.
BN3주를 숙주로 하여, pncC 유전자가 파괴된 BN6주를 제작하였다. 유전자 파괴 플라스미드로서 pACD4K-C-pncCΔKm을 사용하는 것 이외에는, 상술한 BN1주의 제작과 마찬가지의 조작에 의해 제작하였다. 출현한 복수의 콜로니에 대하여 Forward 프라이머(서열 번호 46) 및 Reverse 프라이머(서열 번호 47)를 사용하여, 콜로니 PCR을 행하였다. 반응액 조성은 표 19, 반응 조건은 표 18로 하였다.
원래의 숙주(BL21(DE3))에서는 약 0.5kbp의 밴드가 증폭되는 데 반해, 약 1.2kbp의 밴드가 증폭된 클론이 얻어졌다. 이 클론을, ushA 유전자, pncA 유전자 및 pncC 유전자가 파괴된 숙주로 하여, BN6주로 하였다. E.coli Transformation Kit, Mix & Go(ZYMO RESEARCH)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서, BN6주의 컴피텐트 세포를 제작하였다.
·BN8주의 제작
계속해서, BN6주를 숙주로 하여 yrfG 유전자가 파괴된, BN8주를 이하와 같이 제작하였다. 서열 번호 48(IBS 프라이머), 서열 번호 49(EBS1d 프라이머) 및 서열 번호 50(EBS2 프라이머)에 나타내는 각 프라이머, 및 TargeTron Gene Knockout System 첨부의 EBS Universal 프라이머를 사용하여, 표 15에 나타내는 반응액 조성 및 표 16에 나타내는 반응 조건에서 PCR을 행하였다. BN1주 제작 시와 마찬가지로, PCR 반응액의 정제, HindIII와 BsrGI에 의한 제한 효소 처리, 벡터 pACD4K-C와의 라이게이션 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 플라스미드 추출을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 HindIII로 소화 후, 1％ 아가로오스 겔로 전기 영동을 행하여, 약 7.7kbp의 밴드가 확인된 플라스미드를, pACD4K-C-yrfG으로 하였다.
카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는 yrfG 유전자 파괴용 플라스미드를 제작하였다. PCR 반응 시의 템플릿으로서 pACD4K-C-yrfG을 사용하는 것 이외에는, pACD4K-C-ushAΔKm 제작 시와 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. 얻어진 플라스미드를 pACD4K-C-yrfGΔKm으로 하였다.
BN6주를 숙주로 하여, yrfG 유전자가 파괴된 BN8주를 제작하였다. 유전자 파괴 플라스미드로서 pACD4K-C-yrfGΔKm을 사용하는 것, 및 컴피텐트 세포로서 BN6주 컴피텐트 세포를 사용하는 것 이외에는, 상술한 BN1주의 제작과 마찬가지의 조작에 의해 제작하였다. 출현한 복수의 콜로니에 대하여 Forward 프라이머(서열 번호 51) 및 Reverse 프라이머(서열 번호 52)를 사용하여, 콜로니 PCR을 행하였다. 반응액 조성은 표 19, 반응 조건은 표 18로 하였다.
원래의 숙주(BL21(DE3))에서는 약 0.4kbp의 밴드가 증폭되는 데 반해, 약 1.1kbp의 밴드가 증폭된 클론이 얻어졌다. 이 클론을, ushA 유전자, pncA 유전자, pncC 유전자 및 yrfG 유전자가 파괴된 숙주로 하여, BN8주로 하였다. E.coli Transformation Kit, Mix & Go(ZYMO RESEARCH)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서, BN8주의 컴피텐트 세포를 제작하였다.
(2) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
본 실시예에서는, Prs로서, 실시예 3에 기재된 BsPrsN120S를 사용하는 것, 및 효소 발현의 숙주로서, 본 실시예 (1)에 기재된 BN3주 및 BN8주를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1(2) 내지 (4)와 마찬가지의 조작에 의해, 각 효소의 무세포 추출물을 조제하였다.
(3) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(1)에서 얻어진 무세포 추출물을 사용하여, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 각 반응액을 표 20에 나타내는 조성으로 조제하는 것, 및 샘플링을 반응 개시 직후(0시간 후), 6시간 후, 및 24시간 후에 행하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00020
(4) 실험 결과
실험 결과를 도 7에 도시하였다. 반응 6시간 시점에서는, 통상의 BL21(DE3)을 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용한 경우(샘플 No.7-1), 1.9mM의 NMN의 생성이 보였다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.19㎛ol)의 0.052당량이었다. 한편, ushA 유전자 및 pncA 유전자를 파괴한 BN3주를 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용한 경우(샘플 No.7-2), 2.3mM의 NMN의 생성이 보였다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.23㎛ol)의 0.043당량이었다. ushA 유전자, pncA 유전자, pncC 유전자 및 yrfG 유전자를 파괴한 BN8주를 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용한 경우도(샘플 No.7-3), 마찬가지로 2.3mM의 NMN의 생성이 보였다. 첨가한 ATP의 몰수(0.01㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.23㎛ol)의 0.043당량이었다. 즉, NMN의 생성이 진행하는 단계에서는, BN3주 및 BN8주를 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용하는 쪽이, BL21(DE3)을 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용하는 것 보다도, NMN의 생산량이 높아짐을 알았다.
또한, 반응 24시간 시점에서는, BL21(DE3) 및 BN3주를 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용한 경우(샘플 No.7-1, No.7-2), NMN을 검출할 수 없었다. BN8주를 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용한 경우(샘플 No.7-3), 2.0mM의 NMN이 잔존하고 있었다. 즉, NMN이 일정량 생성된 후의 단계에서는, BL21(DE3) 및 BN3주를 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액보다도, BN8을 숙주로 하여 조제한 무세포 추출액을 사용하는 쪽이, 생성한 NMN의 분해가 현저히 억제됨을 알았다. 단, NMN의 분해가 진행되기 전의 시점(예를 들어 6시간)에서, 생성한 NMN을 적절하게 회수하는 공정을 행하면, 어느 숙주 유래의 무세포 추출액을 사용한 경우에도, 생성한 NMN을 적절하게 취득할 수 있다.
[실시예 8] <PPase를 사용한 정제 효소에 의한 NMN 합성>
본 실시예에서는, 소정의 각 효소로서 하기의 것을 사용하였다.
Nampt: Haemophilus ducreyi 유래(AAR87771) Nampt에 His 태그를 부가한 것(HdNampt-His)
Prs: Bacillus subtilis 유래(BAA05286) Prs의 Asn120Ser 변이체에 His 태그를 부가한 것(BsPrsN120S-His)
Ppk(Ppk2 클래스 3): Deinococcus radiodurans 유래(NP_293858) Ppk에 His 태그를 부가한 것(DrPpk-His)
Rbk: Saccharomyces cerevisiae 유래(P25332) Rbk에 His 태그를 부가한 것(ScRbk-His)
(1) His 태그 부가 Prs, Ppk 및 Rbk 발현 플라스미드의 제작
Prs, Ppk 및 Rbk에 His 태그가 부가된 단백질을 발현하는 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다. 실시예 3에서 제작한 pEBsPrsN120S, 실시예 1에서 제작한 pEDrPpk 및 pEScRbk를 주형으로 하여, 각 효소에 His 태그를 부가하기 위한 변이 도입 PCR 반응을 행하였다. 주형 플라스미드명, 변이 도입용 프라이머명 및 그 염기 서열을 나타내는 서열 번호, His 태그 부가 효소 발현 플라스미드명을 표 21에 나타내었다.
Figure pct00021
His 태그 부가 효소 발현 플라스미드의 제작은, 표 21에 나타내는 각종 주형 플라스미드와 변이 도입 프라이머를 사용하는 이외에는, 실시예 3(1)과 마찬가지의 조작에 의해, 변이 도입 PCR 반응으로부터 염기 서열 확인까지 행하였다. 정확하게 His 태그가 부가된 플라스미드를 표 21에 기재한 각 플라스미드로 하였다.
(2) 재조합체의 제작·배양 및 무세포 추출물의 조제
상기 (1)에서 His 태그 부가 효소 발현 플라스미드를 사용하고, 실시예 4(1)과 마찬가지의 조작에 의해, 재조합체의 제작, 배양 및 무세포 추출물의 조제를 행하였다. 그 때, 균체를 현탁하는 버퍼로서는, BsPrsN120S-His 이외에는, 50mM HEPES-NaOH 버퍼(pH 8.0)를 사용하였다. 단, BsPrsN120S-His에 대해서는, 50mM 인산 칼륨 버퍼(pH7.5)를 사용하여 행하였다.
(3) 정제 효소의 조제
(2)에서 조제한 His 태그 부가 효소를 포함하는 무세포 추출물을 사용하여, 실시예 5(3)과 마찬가지로, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해, 각 His 태그 부가 효소의 정제를 행하였다. 단, BsPrsN120S-His에 대해서는, 50mM 인산 칼륨 버퍼(pH7.5)를 사용하여 용투석을 행하였다.
(4) NMN 합성 반응, NMN의 분석
(3)에서 얻어진 각종 정제 효소를 사용하여, PPase(효모 유래, 시그마·알드리치사, 제품 번호 10108987001)의 존재 하 또는 비존재 하에서, NMN 합성 반응 및 분석을 하였다. 각 반응액을 표 22에 나타내는 조성으로 조제하는 것, 샘플링을 반응 개시 직후(0시간 후), 6시간 후, 24시간 후 및 48시간 후에 행하는 것 이외에는, 실시예 1(5) 및 (6)과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00022
(5) 실험 결과
실험 결과를 도 8에 도시하였다. 제3 반응만의 경우, PPase를 첨가한 경우(샘플 No.8-1)에는, 반응 48시간에 4.0mM의 NMN이 생성되었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.1㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.40㎛ol)의 0.25당량이었다. 한편, PPase를 첨가하지 않았을 경우(샘플 No.8-2), 0.52mM의 NMN이 생성되었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.1㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.052㎛ol)의 1.9당량이었다. 제2 반응+제3 반응의 경우, PPase를 첨가한 경우(샘플 No.8-3)에는, 반응 48시간에 4.1mM의 NMN이 생성되었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.1㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.41㎛ol)의 0.24당량이었다. 한편, PPase를 첨가하지 않았을 경우(샘플 No.8-4), 0.34mM의 NMN이 생성되었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.1㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.034㎛ol)의 2.9당량이었다. 또한, 제1 반응+제2 반응+제3 반응의 경우, PPase를 첨가한 경우(샘플 No.8-5)에는, 반응 48시간에 3.6mM의 NMN이 생성되었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.1㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.36㎛ol)의 0.28당량이었다. 한편, PPase를 첨가하지 않았을 경우(샘플 No.8-6), 0.25mM의 NMN이 생성되었다. 첨가한 ATP의 몰수(0.1㎛ol)는 생성한 NMN의 몰수(0.025㎛ol)의 4.0당량이었다. 이상의 결과로부터, 정제 효소 반응계에 PPase를 첨가함으로써, 효율적으로 NMN을 합성하는 것이 가능함이 나타났다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 15: Prs 변이체 BsPrsN120S의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 16: Prs 변이체 BsPrsN120S의 변이 도입용 프라이머(리버스)
서열 번호 17: Prs 변이체 BsPrsL135I의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 18: Prs 변이체 BsPrsL135I의 변이 도입용 프라이머(리버스)
서열 번호 19: 프라이머 T7-PP
서열 번호 20: 프라이머 T7-TP
서열 번호 25: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEHdNampt-His의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 26: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEHdNampt-His의 변이 도입용 프라이머(리버스)
서열 번호 27: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEDrNampt-His의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 28: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEDrNampt-His의 변이 도입용 프라이머(리버스)
서열 번호 29: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pESoNampt-His의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 30: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pESoNampt-His의 변이 도입용 프라이머(리버스)
서열 번호 31: ushA용 IBS 프라이머
서열 번호 32: ushA용 EBS1d 프라이머
서열 번호 33: ushA용 EBS2 프라이머
서열 번호 34: pACD4K-C-ushAΔKm 조제용 프라이머(포워드)
서열 번호 35: pACD4K-C-ushAΔKm 조제용 프라이머(리버스)
서열 번호 36: ushA 유전자 파괴 검출용 프라이머(포워드)
서열 번호 37: ushA 유전자 파괴 검출용 프라이머(리버스)
서열 번호 38: pncA용 IBS 프라이머
서열 번호 39: pncA용 EBS1d 프라이머
서열 번호 40: pncA용 EBS2 프라이머
서열 번호 41: pncA 유전자 파괴 검출용 프라이머(포워드)
서열 번호 42: pncA 유전자 파괴 검출용 프라이머(리버스)
서열 번호 43: pncC용 IBS 프라이머
서열 번호 44: pncC용 EBS1d 프라이머
서열 번호 45: pncC용 EBS2 프라이머
서열 번호 46: pncC 유전자 파괴 검출용 프라이머(포워드)
서열 번호 47: pncC 유전자 파괴 검출용 프라이머(리버스)
서열 번호 48: yrfG용 IBS 프라이머
서열 번호 49: yrfG용 EBS1d 프라이머
서열 번호 50: yrfG용 EBS2 프라이머
서열 번호 51: yrfG 유전자 파괴 검출용 프라이머(포워드)
서열 번호 52: yrfG 유전자 파괴 검출용 프라이머(리버스)
서열 번호 53: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEBsPrsN120S-His의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 54: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEBsPrsN120S-His의 변이 도입용 프라이머(리버스)
서열 번호 55: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEDrPpk-His의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 56: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEDrPpk-His의 변이 도입용 프라이머(리버스)
서열 번호 57: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEScRbk-His의 변이 도입용 프라이머(포워드)
서열 번호 58: His 태그 부가 Nampt 발현 플라스미드 pEScRbk-His의 변이 도입용 프라이머(리버스)
SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> Method for producing nicotinamide mononucleotide and transformant for use in the method <130> PMC-9019WO <150> JP 2017-190028 <151> 2017-09-29 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 495 <212> PRT <213> Haemophilus ducreyi <400> 1 Met Asp Asn Leu Leu Asn Tyr Ser Ser Arg Ala Ser Ala Ile Pro Ser 1 5 10 15 Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Lys Thr Ser His Arg Ile Met Tyr Pro Glu 20 25 30 Cys Ser Gln Ile Ile Tyr Ser Thr Phe Thr Pro Arg Ser Asn Glu Gln 35 40 45 Ala Pro Tyr Leu Thr Gln Val Val Ser Phe Gly Phe Gln Ala Phe Ile 50 55 60 Ile Lys Tyr Leu Ile His Tyr Phe Asn Asp Asn Phe Phe Ser Arg Asp 65 70 75 80 Lys His Asp Val Val Thr Glu Tyr Ser Ala Phe Ile Glu Lys Thr Leu 85 90 95 Gln Leu Glu Asp Thr Gly Glu His Ile Ala Lys Leu His Glu Leu Gly 100 105 110 Tyr Leu Pro Ile Arg Ile Lys Ala Ile Pro Glu Gly Lys Thr Val Ala 115 120 125 Ile Lys Val Pro Val Met Thr Ile Glu Asn Thr His Ser Asp Phe Phe 130 135 140 Trp Leu Thr Asn Tyr Leu Glu 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180 attatccaga gcaccagcga tccggtgaat gaacatatca tggaactgct gattatggtt 240 gatgcgctga aacgtgcgag cgccaaaacc atcaacatcg ttatcccgta ctacggctat 300 gcgcgtcagg atcgcaaagc ccgtagccgc gaaccgatta ccgcgaaact gtttgcctct 360 ctgctggaaa ccgccggtgc aacccgcgtg attgccctgg atctgcatgc cccgcagatt 420 cagggctttt tcgatatccc gattgatcat ctgatgggcg ttccgatcct gggtgaatat 480 tttgaaggca aaaacctgga agatatcgtg attgttagcc cggatcatgg cggtgtgacc 540 cgtgcgcgta aactggcaga tcgtctgaaa gcgccgattg ccattatcga taaacgtcgc 600 ccgcgcccga atgtggcgga agttatgaac atcgttggca atattgaagg taaaaccgcc 660 atcctgattg atgatattat cgataccgcg ggtaccatta ccctggcggc caacgccctg 720 gtggaaaatg gcgcgaaaga agtttatgcc tgctgtaccc acccggtgct gagcggtccg 780 gccgttgaac gtatcaacaa tagcaccatt aaagaactgg tggttaccaa cagcatcaaa 840 ctgccggaag aaaagaaaat tgaacgcttt aaacagctga gcgtgggccc gctgctggca 900 gaagcgatta ttcgtgtcca tgaacaacaa agcgtcagct acctgttttc ctaa 954 <210> 13 <211> 317 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 13 Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp 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mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEHdNampt-His <400> 26 gtggtggtgc agggtcgtgc ggctaac 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEDrNampt-His <400> 27 ggtcgtggcc accaccacca ccaccac 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEDrNampt-His <400> 28 gtggtggtgg ccacgaccac ggatttc 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pESoNampt-His <400> 29 tcccgtcgcc accaccacca ccaccac 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pESoNampt-His <400> 30 gtggtggtgg cgacgggatg cggccag 27 <210> 31 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS primer for ushA <400> 31 aaaaaagctt ataattatcc ttaggtagcg tgctggtgcg cccagatagg gtg 53 <210> 32 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS1d primer for ushA <400> 32 cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcgtgctg cttaacttac ctttctttgt 60 <210> 33 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS2 primer for ushA <400> 33 tgaacgcaag tttctaattt cgattctacc tcgatagagg aaagtgtct 49 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for preparation of plasmid pACD4K-C-ushAdKm <400> 34 ttggcgtata acatagtatc gacggagccg 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for preparation of plasmid pACD4K-C-ushAdKm <400> 35 acgcgtcgcc acgtaataaa tatctggacg 30 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for detection of disruption of ushA gene <400> 36 atggtatccg caaagaggtt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for detection of disruption of ushA gene <400> 37 acctctttac cggtcatgtc 20 <210> 38 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS primer for pncA <400> 38 aaaaaagctt ataattatcc ttaatcgacg aattggtgcg cccagatagg gtg 53 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS1d primer for pncA <400> 39 cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcgaattg attaacttac ctttctttgt 60 <210> 40 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS2 primer for pncA <400> 40 tgaacgcaag tttctaattt cggtttcgat ccgatagagg aaagtgtct 49 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for detection of disruption of pncA gene <400> 41 aattgcccag ggccacgtct 20 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for detection of disruption of pncA gene <400> 42 ccagcgtaaa attacccctg tgtctct 27 <210> 43 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS primer for pncC <400> 43 aaaaaagctt ataattatcc ttagattacg ccgtggtgcg cccagatagg gtg 53 <210> 44 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS1d primer for pncC <400> 44 cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcgccgtg tctaacttac ctttctttgt 60 <210> 45 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS2 primer for pncC <400> 45 tgaacgcaag tttctaattt cgatttaatc tcgatagagg aaagtgtct 49 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for detection of disruption of pncC gene <400> 46 ctgacagtga actgatgcag ttaag 25 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for detection of disruption of pncC gene <400> 47 tcaagtgttt tgtagaaatt gttgcc 26 <210> 48 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS primer for yrfG <400> 48 aaaaaagctt ataattatcc ttaggcacct tgctcgtgcg cccagatagg gtg 53 <210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS1d primer for yrfG <400> 49 cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcttgctc gataacttac ctttctttgt 60 <210> 50 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS2 primer for yrfG <400> 50 tgaacgcaag tttctaattt cgattgtgcc tcgatagagg aaagtgtct 49 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for detection of disruption of yrfG gene <400> 51 gttctgctgg atatggac 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for detection of disruption of yrfG gene <400> 52 aaatgtgtgg gtggaaag 18 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEBsPrsN120St-His <400> 53 ctgttttccc accaccacca ccaccac 27 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEBsPrsN120St-His <400> 54 gtggtggtgg gaaaacaggt agctgac 27 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEDrPpk-His <400> 55 gtgatccatc accaccacca ccaccac 27 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEDrPpk-His <400> 56 gtggtggtga tggatcacca ctttgga 27 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (forward) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEScRbk-His <400> 57 gatgttcaga aagatgctca ccaccac 27 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (reverse) for mutagenesis of His-tag added Nampt expression plasmid pEScRbk-His <400> 58 gtggtggtga gcatctttct gaacatc 27

Claims (15)

  1. 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt), 포스포리보실피로인산신타아제(Prs) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스-5-인산(R5P), 니코틴아미드(NAM), ATP, 및 폴리인산과 접촉시키는 공정을 포함하는, 니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 리보키나아제(Rbk) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스, ATP, 및 폴리인산과 접촉시켜서 상기 R5P를 제조하는 공정을 더 포함하는, NMN의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 행하는, NMN의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Nampt가 박테리아 유래의 것인, NMN의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ppk가, 폴리인산키나아제 2형 패밀리인, NMN의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질 전환체의 숙주가, 대장균, 코리네박테리움속 세균, 로도코커스속 세균, 또는 효모인, NMN의 제조 방법.
  7. 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt), 포스포리보실피로인산신타아제(Prs) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체.
  8. 리보키나아제(Rbk) 및 폴리인산키나아제(Ppk)의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체.
  9. 피로포스파타아제(PPase)의 존재 하에서, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 니코틴아미드(NAM) 및 포스포리보실피로인산(PRPP)과 접촉시키는 공정을 포함하는, 니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 행하는, NMN의 제조 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 처리물이 정제 효소인, NMN의 제조 방법.
  12. (d) EC 3.5.1.42에 나타나는 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자와, 이하의 (a)(c)(g)(h)(i)에 나타나는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코드하는 유전자가 파괴 또는 결실되고, 또한, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화되어 있는 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 적어도 니코틴아미드(NAM)와 접촉시키는 공정을 포함하는, NMN의 제조 방법.
    (a) EC 3.1.3.5
    (c) EC 2.4.2.1
    (g) EC 3.2.2.1
    (h) EC 3.2.2.3
    (i) EC 3.2.2.14
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합이, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하인, NMN의 제조 방법.
  14. 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt) 및 포스포리보실피로인산신타아제(Prs)의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스-5-인산(R5P), 니코틴아미드(NAM) 및 ATP와 접촉시키는 공정을 포함하는, 니코틴아미드모노뉴클레오티드(NMN)의 제조 방법이며, 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합이, 생성하는 NMN의 몰수의 0.5당량 이하인, NMN의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 리보키나아제(Rbk)의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들의 처리물을, 리보오스 및 ATP와 접촉시켜서 상기 R5P를 제조하는 공정을 더 포함하는, NMN의 제조 방법.
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