KR20230029344A - 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 생산방법 - Google Patents
니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide, NMN)를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산방법에 관한 것으로 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)를 재조합한 대장균 및 이의 고농도 유가식 배양을 이용하여 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 생산량을 증가시키는 생산방법을 기술적 특징으로 한다.
Description
본 발명은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide, NMN)를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산방법에 관한 것이다.
최근 항노화제로 각광받고 있는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide, 이하 NMN)는 세포 내의 산화환원 반응에 있어서 중요한 매개체 역할을 하는 조효소 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(nicotinamide adenin dinucleotide, 이하 NAD+)의 전구물질이다. 나이가 들어감에 따라 우리 몸은 NAD+를 적게 생성하고 미토콘드리아와 세포핵 사이의 통신이 손상되며, NAD+의 감소는 세포의 에너지 생성 능력을 손상시켜 노화와 질병으로 이어질 수 있음이 보고되었다. NMN이 체내에 들어가면 NAD+로 변화하면서 체내 NAD+의 양이 증가하여 결국 노화를 최소화 시킬 수 있다. 따라서 NMN을 활용한 질환별 치료제, 장수 관련 영양식품, 노화방지용 화장품 등 다양한 분야에서 제품화가 이루어질 것으로 기대되고 있다.
본 발명은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터에 대한 것으로, 이를 이용하여 NMN생산 수율을 향상시키는 재조합 대장균을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 NMN 생산 방법에 대한 것으로, 상기 재조합 대장균을 이용해 NMN 생산 수율을 향상시키는 NMN 생산 방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)를 코딩하는 뉴클레오티드, 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1)을 코딩하는 뉴클레오티드 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)”는 인간 유래 소스에서 선택된 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)”는 서열번호 1로 이루어진 것이고, “포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1)”는 서열번호 2로 이루어진 것이며 “포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)”는 서열번호 3으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “재조합 대장균”은 NMN을 생산하는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “재조합 대장균”은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)의 동시 발현을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 재조합 대장균을 NAM이 첨가된 표 3의 초기 배지 조성을 이용하여 회분식 배양하는 1단계, 포도당 농도가 0으로 감소하기 전에 포도당 600 g/L, 효모 추출물 60 g/L 및 트립톤 60 g/L 조성의 용액을 공급하는 2단계, 상기 2단계와 동시에 유당 유도제를 10 g/L 공급하여 재조합 대장균을 고농도로 유가식 배양하는 3단계를 포함하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산 방법법”은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)의 동시 발현을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산 방법”은 NAM의 농도를 3 내지 10(g/L) 인 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)를 코딩하는 뉴클레오티드, 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1)을 코딩하는 뉴클레오티드 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터에 대한 것으로, 보다 구체적으로 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 대장균을 이용해 NMN을 생산하고, 생산수율이 높은 NMN 생산방법을 제공한다.
도 1은 대장균(Escherichia coli) 5탄당 인산 경로를 통한 NAM(nicotinamide) 으로부터의 NMN(nicotinamide mononucleotide)의 세포내 생산 경로를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))에 의해 발현되는 NAMPT-PRPS1-PRPS2 합성효소 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 유당과 IPTG 유도의 경우 (a) Mg2+와 인산염 미첨가시 (b) Mg2+첨가시 (c)인산염 첨가시, NMN 생산값 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 세포에 의한 NMN 생성에 대한 Mg2+ 및 인산염 첨가의 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 유당 또는 IPTG 유도제를 사용한 경우 농도별 NMN 생산량을 나타낸 도이다.
도 6은 (a) NMN 표준시약, (b) 반응 혼합물, (c) 반응 혼합물의 NMN 생산의 HPLC 분석에 따른 LC/MS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 7은 초기 NAM 농도별(도 7a : 3 g/L, 도 7b : 5 g/L, 도 7c : 10 g/L) 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 균주의 유가식 배양 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 유가식 배양에서 NAM 농도별 건조 세포 무게 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 유가식 배양에서 NAM 농도별 최대 NMN 농도 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))에 의해 발현되는 NAMPT-PRPS1-PRPS2 합성효소 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 유당과 IPTG 유도의 경우 (a) Mg2+와 인산염 미첨가시 (b) Mg2+첨가시 (c)인산염 첨가시, NMN 생산값 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 세포에 의한 NMN 생성에 대한 Mg2+ 및 인산염 첨가의 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 유당 또는 IPTG 유도제를 사용한 경우 농도별 NMN 생산량을 나타낸 도이다.
도 6은 (a) NMN 표준시약, (b) 반응 혼합물, (c) 반응 혼합물의 NMN 생산의 HPLC 분석에 따른 LC/MS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 7은 초기 NAM 농도별(도 7a : 3 g/L, 도 7b : 5 g/L, 도 7c : 10 g/L) 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 균주의 유가식 배양 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 유가식 배양에서 NAM 농도별 건조 세포 무게 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 유가식 배양에서 NAM 농도별 최대 NMN 농도 비교 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
일 측면에서 본 발명은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)를 코딩하는 뉴클레오티드, 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1)을 코딩하는 뉴클레오티드 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터에 대한 것이다.
일 측면에서 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 대장균에 대한 것이다.
일 측면에서 본 발명은 재조합 대장균을 NAM이 첨가된 초기 배지에서 회분식 배양하는 1단계, 포도당 농도가 0으로 감소하기 전에 포도당 600 g/L, 효모 추출물 60 g/L 및 트립톤 60 g/L 조성의 용액을 공급하는 2단계, 상기 2단계와 동시에 유당 유도제를 10 g/L 공급하여 재조합 대장균을 고농도로 유가식 배양하는 3단계를 포함하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산 방법에 대한 것이다.
본 발명의 NMN은 NAD+ 생합성 과정에서 인산기와 리보스를 함유하는 뉴클레오사이드와 nicotinamide(NAM)가 반응하여 생성되는 중간 생성물이다. NMN은 화학적 및 효소적 합성 방법에 의해 생성될 수 있으나, 화학적 합성 방법은 비용이 많이 들고 원치 않는 부산물을 생성하기 때문에 효소적 방법이 선호된다. NMN은 NAMPT(nicotinamide phosphoribosyl transferase) 효소의 존재 하에서 PRPP(phosphoribosyl pyrophosphate)와 NAM(nicotinamide)을 기질로 사용하여 생성된다.
PRPP(phosphoribosyl pyrophosphate)는 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase, PRPS)가 존재할 때 ATP와 D-리보스-5-포스페이트(D-ribose-5-phosphate, R5P)로부터 생성되는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 생합성을 위한 빌딩 블록으로 작용한다. PRPS는 PRPP 생성에 필요한 가장 중요한 효소 중 하나이며, 인간에서 PRPS 유전자는 PRPS1, PRPS2 및 PRPS3의 3개의 그룹으로 분류된다. PRPS1은 퓨린 생합성에서 중요한 역할을 한다(https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PRPS1). PRPS2는 ATP 및 R5P 반응을 통한 PRPP 형성 과정에서 퓨린과 피리미딘의 합성에 관여한다(https://www.genecards.org/ cgi-bin/carddisp.pl?gene=PRPS2). PRPS1의 경우, 디포스포릴기는 ATP 또는 dATP에서만 R5P로 전달되는 반면, PRPS2는 ATP, dATP, UTP, CTP 및 GTP를 포함하는 디포스포릴 공여체에 대해 상당히 넓은 특이성을 가지고 있다. 대부분의 PRPS1 효소는 효소 활동을 위해 Mg2+ 및 인산염을 필요로 한다. PRPS3와 관련하여 뉴클레오타이드 합성 및 NMN 생산에서의 역할에 대한 정보는 많지 않다.
본 발명에서는 NMN 생산을 위해 인간 유래의 PRPS1 및 PRPS2와 함께 NAMPT를 대장균에 클로닝하기 위해 대사 공학 접근이 사용되었다. PRPP 합성 과정에서 PRPS2의 상당한 역할을 염두에 두고 PRPP 및 궁극적으로 NMN의 향상된 생산을 달성하기 위해 E. coli에서 PRPS2를 PRPS1 및 NAMPT와 함께 유전자 조작하였다. E. coli는 잘 알려진 강력한 유전 도구이자 대사 공학 연구에 가장 선호되는 숙주이다. 일반적으로 인간 유래의 NAMPT는 박테리아, 효모 유래보다 NAM에 대해 더 높은 특이성을 나타낸다. 대부분의 연구가 박테리아 유래의 NAMPT와 함께 PRPS1만 구현했지만 본 발명에서는 인간 유래의 PRPS1 및 PRPS2 유전자와 함께 NAMPT를 이용하였다.
NMN은 살비지(salvage) 경로를 통해 PRPP의 존재 하에 NAMPT의 촉매 활성을 통해 NAM의 전환에 의해 생성된다. 이러한 관점에서 본 발명에서는 먼저 당 대사 및 효소 반응을 포함하는 생체 촉매인 대장균의 대사 설계에 중점을 두었다(도 1). 이 대사 과정은 오탄당 인산 경로를 통해 PRPP를 제공하는 발효 과정과 NAM을 NMN으로 전환시키는 효소 반응 과정으로 구성된다. 최근 대장균의 대사공학을 통한 NMN의 세포내 생합성과 관련된 여러 연구가 보고되었으나 NMN의 수율은 매우 낮았다. 따라서 본 연구에서는 NMN 수율을 향상시키기 위해 PRPS1 및 PRPS2가 삽입된 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))를 개발하였으며, NMN 생산 증가를 위해 탄소원, 마그네슘 및 무기 인산염 공급원과 같은 다양한 요소를 RSM(response surface method) 접근법을 사용하여 최적화했다.
현재까지 박테리아 및 효모를 사용한 NMN 생산에 관한 연구는 소수에 불과하다. 대부분의 보고된 연구에서 더 높은 NMN 수율을 달성하기 위해 대사적으로 조작된 E. coli 균주가 사용되었다. 본 발명에서 추가로 삽입된 PRPS2는 Mg2+ 및 인산염의 존재 하에 유전자를 상향 조절함으로써 향상된 NMN 생성에 중요한 역할을 한다. 또한 대사적으로 조작된 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))은 RSM 최적화 연구 및 고농도 유가식 배양을 통해 NMN의 더 높은 세포내 생산을 나타냈다. 대사적으로 조작된 대장균을 사용한 NMN 생산에 대한 여러 연구가 보고되었지만, 본 연구는 보고된 것보다 세포내 수준에서 가장 높은 NMN 생산을 나타냈다. 본 발명은 포도당, 유당, NAM과 같은 저렴한 기질을 사용하여 개량된 대장균 균주에 의해 약학적으로 중요한 NMN을 쉽고 경제적으로 생산하는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<준비예>
1. 균주, 플라스미드 및 시약
대장균 DH5α 및 BL21(DE3)의 컴피턴트(competent) 세포는 Takara에서 구입하여 각각 클로닝 및 단백질 발현 숙주로 사용하였다. 두 균주 모두 Luria Bertani(LB) 배지(기산바이오)에서 배양하였다. 암피실린은 75 μg/ml 농도에서 선택 마커로 사용되었다. pET21b 플라스미드(Novagen)를 발현 벡터로 사용하였다. 제한 효소는 Takara에서 구입했다. 기질로 포도당과 유당을 사용하였다. NMN 표준 시약은 Prohealth Longevity Company에서 구입했다.
2. 클로닝 발현 벡터
재조합 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2) 유전자는 단백질 발현을 위한 pET21b 발현 벡터(Novagen)에 클로닝되었다. NAMPT-PRPS1-PRPS2 효소를 코딩하는 전체 유전자를 pBHA 플라스미드(바이오니아)에 구축한 후 대장균에서 발현시켰다. NAMPT(GenBank: AAI06047.1), PRPS1(GenBank: NM_001204402.2) 및 PRPS2(GenBank: AAI10876.2) 효소를 인코딩하는 유전자는 Homo sapiens 소스에서 선택하고 E. coli DH5α 세포에 클로닝했다. 글리신-세린 유연 링커(GGGGS)2를 코딩하는 DNA 서열이 기능적 도메인 사이에 도입되었다. 발현된 NAMPT, PRPS1 및 PRPS2 유전자는 NAMPT에 대한 정방향 프라이머 GCGGCTAGCATGAATCCTGCGG 및 PRPS1에 대한 역방향 프라이머 GCGGTCGACTAAAGGGACATGGC 및 PRPS2에 대한 역방향 프라이머 GCGCTCGAGTAGCGGGACATGG를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔에 로딩하여 벡터의 존재를 확인하고, 추가적으로 구축된 플라스미드를 E. coli DH5α 균주로 형질전환시켰다. NAMPT-PRPS1-PRPS2 전체 유전자 서열은 하기 표 1과 같다.
| 유전자 이름 | 서열번호 | 염기서열 |
| NAMPT | 1 | ATGAATCCTGCGGCAGAAGCCGAGTTCAACATCCTCCTGGCCACCGACTCCTACAAGGTTACTCACTATAAACAATATCCACCCAACACAAGCAAAGTTTATTCCTACTTTGAATGCCGTGAAAAGAAGACAGAAAACTCCAAATTAAGGAAGGTGAAATATGAGGAAACAGTATTTTATGGGTTGCAGTACATTCTTAATAAGTACTTAAAAGGTAAAGTAGTAACCAAAGAGAAAATCCAGGAAGCCAAAGATGTCTACAAAGAACATTTCCAAGATGATGTCTTTAATGAAAAGGGATGGAACTACATTCTTGAGAAGTATGATGGGCATCTTCCAATAGAAATAAAAGCTGTTCCTGAGGGCTTTGTCATTCCCAGAGGAAATGTTCTCTTCACGGTGGAAAACACAGATCCAGAGTGTTACTGGCTTACAAATTGGATTGAGACTATTCTTGTTCAGTCCTGGTATCCAATCACAGTGGCCACAAATTCTAGAGAGCAGAAGAAAATATTGGCCAAATATTTGTTAGAAACTTCTGGTAACTTAGATGGTCTGGAATACAAGTTACATGATTTTGGCTACAGAGGAGTCTCTTCCCAAGAGACTGCTGGCATAGGAGCATCTGCTCACTTGGTTAACTTCAAAGGAACAGATACAGTAGCAGGACTTGCTCTAATTAAAAAATATTATGGAACGAAAGATCCTGTTCCAGGCTATTCTGTTCCAGCAGCAGAACACAGTACCATAACAGCTTGGGGGAAAGACCATGAAAAAGATGCTTTTGAACATATTGTAACACAGTTTTCATCAGTGCCTGTATCTGTGGTCAGCGATAGCTATGACATTTATAATGCGTGTGAGAAAATATGGGGTGAAGATCTAAGACATTTAATAGTATCAAGAAGTACACAGGCACCACTAATAATCAGACCTGATTCTGGAAACCCTCTTGACACTGTGTTAAAGGTTTTGGAGATTTTAGGTAAGAAGTTTCCTGTTACTGAGAACTCAAAGGGTTACAAGTTGCTGCCACCTTATCTTAGAGTTATTCAAGGGGATGGAGTAGATATTAATACCTTACAAGAGATTGTAGAAGGCATGAAACAAAAAATGTGGAGTATTGAAAATATTGCCTTCGGTTCTGGTGGAGGTTTGCTACAGAAGTTGACAAGAGATCTCTTGAATTGTTCCTTCAAGTGTAGCTATGTTGTAACTAATGGCCTTGGGATTAACGTCTTCAAGGACCCAGTTGCTGATCCCAACAAAAGGTCCAAAAAGGGCCGATTATCTTTACATAGGACGCCAGCAGGGAATTTTGTTACACTGGAGGAAGGAAAAGGAGACCTTGAGGAATATGGTCAGGATCTTCTCCATACTGTCTTCAAGAATGGCAAGGTGACAAAAAGCTATTCATTTGATGAAATAAGAAAAAATGCACAGCTGAATATTGAACTGGAAGCAGCACATCATGGTGGTGGTGGCAGTGGTGGAGGTGGTAGC |
| PRPS1 | 2 | ATGGTGCTTGTGGGAGATGTGAAGGATCGGGTGGCCATCCTTGTGGATGACATGGCTGACACTTGTGGCACAATCTGCCATGCAGCTGACAAACTTCTCTCAGCTGGCGCCACCAGAGTTTATGCCATCTTGACTCATGGAATCTTCTCCGGTCCTGCTATTTCTCGCATCAACAACGCATGCTTTGAGGCAGTAGTAGTCACCAATACCATACCTCAGGAGGACAAGATGAAGCATTGCTCCAAAATACAGGTGATTGACATCTCTATGATCCTTGCAGAAGCCATCAGGAGAACTCACAATGGAGAATCCGTTTCTTACCTATTCAGCCATGTCCCTTTA |
| PRPS2 | 3 | ATGCCCAACATCGTGCTGTTCAGCGGCAGCTCGCATCAGGACCTGTCCCAGCGCGTGGCCGACCGCCTGGGCCTGGAGCTGGGCAAGGTGGTCACGAAGAAGTTCAGCAACCAGGAGACCAGCGTGGAGATTGGTGAAAGCGTGAGAGGGGAAGATGTCTACATCATCCAGAGCGGCTGCGGGGAAATTAACGACAACCTGATGGAACTCCTCATCATGATCAATGCCTGCAAGATTGCGTCATCATCCAGAGTAACTGCCGTGATCCCGTGTTTCCCATACGCCCGACAAGATAAAAAGGACAAGGTAGGAGAGAGTCGTGCCCCAATTTCTGCAAAACTTGTGGCCAATATGCTGTCGGTGGCTGGGGCGGATCACATCATCACCATGGACCTGCATGCTTCTCAGATACAGGGATTCTTTGATATTCCTGTGGATAATTTGTATGCGGAGCCCGCAGTCCTGCAGTGGATTCGGGAAAACATTGCCGAGTGGAAGAACTGTATCATTGTTTCACCTGACGCAGGGGGAGCCAAAAGGGTTACATCAATTGCAGACAGGTTGAATGTGGAATTTGCTTTGATCCACAAAGAGAGGAAGAAGGCGAATGAAGTGGACCGGATGGTCCTGGTGGGCGACGTGAAGGACCGTGTGGCCATCCTCGTGGATGACATGGCTGACACTTGCGGCACCATCTGCCATGCTGCGGACAAGCTGCTGTCAGCTGGAGCCACCAAAGTGTATGCTATCCTTACCCATGGGATCTTCTCTGGACCAGCTATTTCCAGAATAAATAATGCCGCCTTTGAGGCTGTTGTCGTCACAAACACAATTCCGCAAGAGGACAAAATGAAACACTGCACCAAGATTCAGGTCATTGACATTTCCATGATCTTGGCCGAAGCAATCCGAAGGACACACAATGGGGAATCCGTGTCCTACCTGTTCAGCCATGTCCCGCTA |
3. 세균의 형질전환과 단백질 발현
박테리아 형질전환을 위해 컴피턴트 대장균 BL21을 준비했다. 50 μl의 컴피턴트 세포를 4 μl의 플라스미드 DNA(pET21b-NAMPT-PRPS1-PRPS2)와 혼합했다. 모든 튜브를 30분 동안 얼음 위에 놓고 42 ℃에서 30초 동안 열 충격을 가한 다음 얼음 위에서 2분 동안 냉각했다. 그런 다음, 900 μl의 LB 배지를 첨가하고 튜브를 200 rpm 진탕 조건 하에 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 형질전환된 세포를 암피실린 항생제 마커(75 μg/ml)가 포함된 LB 한천 플레이트에 옮긴 후 암피실린 내성 콜로니를 선택하고 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 클로닝된 벡터는 다음과 같이 콜로니 PCR을 이용하여 확인하였다. 초기 변성은 95 ℃에서 5분 동안 수행한 후, 95 ℃에서 30초 동안 최종 변성, 55 ℃에서 30초 동안 어닐링, 72 ℃에서 3분간 확장, 72 ℃에서 5분간 최종 신장 단계의 25주기를 수행했다. PCR 산물은 아가로스(2.5%) 겔 전기영동에서 검사되었다. 재조합 대장균 균주에서 원하는 유전자의 존재를 확인한 후, 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포를 NMN 생산에 대한 추가 연구에 사용하였다. pET21b 플라스미드를 함유하는 형질전환 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))을 600 nm에서 광학 밀도가 0.6에 도달할 때까지 37 ℃에서 75 ㎍/ml의 암피실린이 보충된 LB 배지 100 ml에서 배양한 후 유도제를 첨가하였다.
NAMPT-PRPS1-PRPS2 유전자를 발현하는 재조합 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 세포를 스크리닝하기 위해, LB 플레이트 상의 암피실린 내성 콜로니를 분리하고 NMN 생산 실험에 사용하였다. 유도 후 발현된 단백질은 SDS PAGE(10%) 분석에 의해 추가로 확인되었으며, 도 2와 같이 재조합 유전자 NAMPT-PRPS1-PRPS2에 해당하는 약 105 kDa 크기의 밴드를 나타냈다. 발현된 단백질을 검증한 후, 형질전환된 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 세포는 NMN 생산의 최적화 연구에 추가로 사용되었다.
4. 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 세포를 사용한 플라스크 수준에서의 회분식 배양
형질전환된 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 세포를 250 mL 삼각 플라스크에 암피실린(75 ㎍/ml)을 함유하는 LB 배지(100 ml)에서 성장시키고 200 rpm에서 진탕하면서 37 °C에서 배양하였다. 분광광도계(UVmini-1240, Shimadzu)를 사용하여 600 nm 파장에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 세포 성장을 모니터링했다. 배양된 샘플(1 ml)을 2시간 간격으로 수집하고 4 °C에서 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리했다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 분리하고 1 ml의 용해 완충액(50 mM HEPES 및 500 mM NaCl, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 2분 동안 초음파 처리하고 원심분리 후 상등액을 회수하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 사용하여 NMN을 정량하기 위해 상등액을 0.25 μm 주사기 필터로 여과했다.
<실시예>
1. NMN 생성에 대한 Mg
2+
및 무기 인산염 농도의 영향
NMN 생성에 대한 마그네슘(MgCl2, 1 mM) 및 무기 인산염(Na2HPO4 및 NaH2PO4, 1 mM)의 효과는 IPTG 및 유당 유도제의 존재 하에 조사되었다. Mg2+ 및 인산염을 첨가하지 않은 경우, 얻어진 NMN 수율은 IPTG 및 유당 유도의 경우 모두 유도 8시간 후 1 mM 미만이었다(도 3a). 그러나 Mg2+ 및 인산염의 첨가는 NMN 수율을 1.57 mM로 향상시켰으며, 이는 유당을 유도제로 사용한 경우 대조군(도 3a)에 비해 거의 두 배였다(도 3b 및 도 3c). IPTG 유도의 경우, NMN 생산 수준(1.05 mM)은 Mg2+(도 3b)와 인산염(도 3c)을 모두 사용한 유당 유도의 경우보다 낮았다. 따라서 이러한 결과는 IPTG 및 유당 유도의 경우 모두 Mg2+와 인산염이 NMN 생성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
본 발명에서는 NAM을 NMN으로 변환하는 데 필요한 NAMPT 유전자와 함께 PRPS1 및 PRPS2 유전자를 모두 보유하는 재조합 대장균 균주를 사용했다. PRPS1 유전자는 R5P에서 PRPP로의 전환에서 디포스포릴 공여체로 작용하며, 이는 궁극적으로 살비지 경로를 통해 NAMPT를 이용하여 NAM의 존재하에 NMN을 생성한다. 재조합 대장균 세포에 의한 NMN 생산에 대한 NAMPT 및 PRPP 합성효소 유전자(PRPS1 및 PRPS2)의 동시 발현 효과를 조사하기 위해 Mg2+ 및 인산염 존재 하에서 NAMPT-PRPS1 및 NAMPT-PRPS2 유전자의 개별 발현을 연구했다. 도 4a에서 볼 수 있듯이 PRPS1과 PRPS2의 동시 발현은 인산염을 첨가하는 것보다 Mg2+의 존재 하에 더 높은 NMN 생산을 나타냈다(1.25 mM). 개별 PRPS1 유전자 발현의 경우, Mg2+ 및 인산염이 개별적으로 사용될 때 NMN 생산(0.59 mM)의 거의 유사한 프로필이 얻어졌다(도 4b). 도 4c에 도시된 바와 같이, Mg2+의 존재하에 개별 PRPS2 유전자 발현은 0.79 mM NMN의 생산을 나타내었으며, 이는 인산염을 첨가하는 것보다 약간 더 높았다. PRPS2는 Mg2+와 인산염이 모두 존재할 때 PRPS1(0.82 mM)보다 비교적 높은 NMN 수율(0.95 mM)을 보여주었다(도 4d). 또한 NMN 생산은 PRPS1 또는 PRPS2 유전자만 발현된 경우보다 PRPS1 및 PRPS2 유전자가 공동 발현될 때 훨씬 더 높았다(1.57 mM)(도 4d). 따라서 PRPS1과 PRPS2 유전자가 동시에 발현되었을 때 NMN 생성에 대한 Mg2+와 인산염의 결합 효과가 현저하다고 결론지을 수 있다.
2. NMN 생성에 대한 기질 농도 및 유도제의 영향
NMN은 살비지 경로를 통해 NAM을 기질로 사용하는 NAD+의 생합성 동안 형성된 중간 생성물이다. 이 경로를 통해 NAMPT 유전자는 NMN 생합성을 위해 PRPP에서 NAM으로 포스포리보실 잔기를 전달한다. 본 발명에서는 bicistronic 발현 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)) 세포를 사용하여 기질 농도의 효과와 LB 배양 배지에서 IPTG와 lactose의 비교 효과를 연구하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 유당 보충 배지에서의 단백질 발현은 모든 기질 농도에 대해 IPTG 유도보다 NMN 생산의 개선을 나타내었다. 또한 NMN 수율은 유당 및 IPTG 유도 모두에 대해 도 5에 나타난 바와 같이 NAM 농도(0.1-0.5%)에 따라 증가했다. 0.1% 및 0.3% NAM 농도를 사용한 경우 유당 유도를 통해 각각 0.82 mM 및 0.93 mM의 NMN 수율을 얻었다. 0.5% NAM 농도를 사용하여 유당 유도 시 1.57 mM, IPTG 유도 시 1.08 mM의 가장 높은 NMN 수율을 각각 얻었다.
3. RSM을 사용한 배지 성분의 최적화
CCD 접근법을 사용하여 30개의 회분식 실험을 수행한 결과, 유당 유도의 경우 0.5% NAM, 1 mM Mg2+ 및 인산염, 1% 리보스(Run 9) 조건에서 2.31 mM의 가장 높은 NMN 수율을 얻은 것을 확인하였다. 표 2는 유당 유도를 사용한 실제 값 및 응답 값을 갖는 최적화 변수의 중심 합성 설계 매트릭스에 관한 것이다.
| Run | Nicotinamide (wt%) | Mg 2+ (mM) | Phosphate (mM) | Ribose (wt%) | NMN concentration (mM) | |
| Actual | Predicted | |||||
| 1 | 0.5 | 1 | 1 | 0.5 | 2.030 | 1.90 |
| 2 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 0.868 | 0.87 |
| 3 | 0.5 | 2 | 1 | 0.5 | 1.676 | 1.66 |
| 4 | 1 | 2 | 1 | 0.5 | 0.955 | 0.817 |
| 5 | 0.5 | 1 | 2 | 0.5 | 1.819 | 1.66 |
| 6 | 1 | 1 | 2 | 0.5 | 1.091 | 0.99 |
| 7 | 0.5 | 2 | 2 | 0.5 | 1.400 | 1.32 |
| 8 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 0.868 | 0.87 |
| 9 | 0.5 | 1 | 1 | 1 | 2.311 | 1.90 |
| 10 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1.140 | 1.11 |
| 11 | 0.5 | 2 | 1 | 1 | 1.667 | 1.49 |
| 12 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1.288 | 1.25 |
| 13 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 0.868 | 0.87 |
| 14 | 1 | 1 | 2 | 1 | 0.970 | 0.904 |
| 15 | 0.5 | 2 | 2 | 1 | 1.523 | 1.20 |
| 16 | 1 | 2 | 2 | 1 | 1.040 | 1.06 |
| 17 | 0.25 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 1.183 | 1.64 |
| 18 | 1.25 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 0.592 | 0.501 |
| 19 | 0.75 | 0.5 | 1.5 | 0.75 | 1.471 | 1.69 |
| 20 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 0.868 | 0.87 |
| 21 | 0.75 | 1.5 | 0.5 | 0.75 | 1.285 | 1.19 |
| 22 | 0.75 | 1.5 | 2.5 | 0.75 | 1.130 | 1.20 |
| 23 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 0.25 | 0.936 | 1.04 |
| 24 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 1.25 | 0.875 | 1.13 |
| 25 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 0.868 | 0.87 |
| 26 | 0.75 | 2.5 | 1.5 | 0.75 | 1.306 | 1.44 |
| 27 | 1 | 1 | 1 | 0.5 | 0.839 | 0.903 |
| 28 | 0.75 | 1.5 | 1.5 | 0.75 | 0.868 | 0.87 |
| 29 | 0.5 | 1 | 2 | 1 | 1.338 | 1.37 |
| 30 | 1 | 2 | 2 | 0.5 | 0.820 | 0.98 |
4. 고농도 유가식 배양에 의한 NMN 농도 향상
재조합 대장균을 고농도로 배양하여 NMN농도를 향상시키기 위해 기질 공급을 계단식으로 증가시키는 유가식 배양을 실시하였으며, 이를 위한 초기 배지 조성은 표 3과 같고, 공급 용액의 조성은 포도당 600 g/L, 효모 추출물 60 g/L, 트립톤 60 g/L에 해당하였다. 다양한 농도의 NAM(3, 5, 10 g/L)이 첨가된 표 3의 초기 배지 조성을 이용하여 회분식 배양 후, 포도당 농도가 0으로 감소하기 전에 공급 용액(포도당 600 g/L, 효모 추출물 60 g/L, 트립톤 60 g/L)의 공급을 시작하고 동시에 유당 유도제를 10 g/L 공급하여 재조합 대장균을 고농도로 유가식 배양하였다.
| 성분 | 농도 |
| Citric acid | 1.7 g/L |
| KH2PO4 | 13.3 g/L |
| (NH4)2HPO4 | 4 g/L |
| MgSO4.7H2O | 1.2 g/L |
| Trace element solution | 10 ml/L |
| FeSO4.7H2O | 10 g/L |
| CaCl2.2H2O | 2 g/L |
| ZnSO4.7H2O | 2.25 g/L |
| MnSO4.4H2O | 0.5 g/L |
| (NH4)6Mo7O24.4H2O | 0.1 g/L |
| Na2B4O7.10H2O | 0.02 g/L |
| CuSO4.5H2O | 1 g/L |
초기 배지 조성에 NAM 첨가 농도를 3, 5, 10 g/L로 변화시키면서 세 가지 유가식 배양을 수행한 결과, NAM 농도가 5 g/L일 때 18시간에 최대 건조 균체 농도 68 g/L, NMN 농도 55 mM(18 g/L)을 얻을 수 있었다(도 7 내지 9 참조).
이와 같은 NMN 농도는 지금까지 보고된 값 중 가장 높은 농도에 해당한다.
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mononucleotide using the same
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<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgaatcctg cggcagaagc cgagttcaac atcctcctgg ccaccgactc ctacaaggtt 60
actcactata aacaatatcc acccaacaca agcaaagttt attcctactt tgaatgccgt 120
gaaaagaaga cagaaaactc caaattaagg aaggtgaaat atgaggaaac agtattttat 180
gggttgcagt acattcttaa taagtactta aaaggtaaag tagtaaccaa agagaaaatc 240
caggaagcca aagatgtcta caaagaacat ttccaagatg atgtctttaa tgaaaaggga 300
tggaactaca ttcttgagaa gtatgatggg catcttccaa tagaaataaa agctgttcct 360
gagggctttg tcattcccag aggaaatgtt ctcttcacgg tggaaaacac agatccagag 420
tgttactggc ttacaaattg gattgagact attcttgttc agtcctggta tccaatcaca 480
gtggccacaa attctagaga gcagaagaaa atattggcca aatatttgtt agaaacttct 540
ggtaacttag atggtctgga atacaagtta catgattttg gctacagagg agtctcttcc 600
caagagactg ctggcatagg agcatctgct cacttggtta acttcaaagg aacagataca 660
gtagcaggac ttgctctaat taaaaaatat tatggaacga aagatcctgt tccaggctat 720
tctgttccag cagcagaaca cagtaccata acagcttggg ggaaagacca tgaaaaagat 780
gcttttgaac atattgtaac acagttttca tcagtgcctg tatctgtggt cagcgatagc 840
tatgacattt ataatgcgtg tgagaaaata tggggtgaag atctaagaca tttaatagta 900
tcaagaagta cacaggcacc actaataatc agacctgatt ctggaaaccc tcttgacact 960
gtgttaaagg ttttggagat tttaggtaag aagtttcctg ttactgagaa ctcaaagggt 1020
tacaagttgc tgccacctta tcttagagtt attcaagggg atggagtaga tattaatacc 1080
ttacaagaga ttgtagaagg catgaaacaa aaaatgtgga gtattgaaaa tattgccttc 1140
ggttctggtg gaggtttgct acagaagttg acaagagatc tcttgaattg ttccttcaag 1200
tgtagctatg ttgtaactaa tggccttggg attaacgtct tcaaggaccc agttgctgat 1260
cccaacaaaa ggtccaaaaa gggccgatta tctttacata ggacgccagc agggaatttt 1320
gttacactgg aggaaggaaa aggagacctt gaggaatatg gtcaggatct tctccatact 1380
gtcttcaaga atggcaaggt gacaaaaagc tattcatttg atgaaataag aaaaaatgca 1440
cagctgaata ttgaactgga agcagcacat catggtggtg gtggcagtgg tggaggtggt 1500
agc 1503
<210> 2
<211> 342
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggtgcttg tgggagatgt gaaggatcgg gtggccatcc ttgtggatga catggctgac 60
acttgtggca caatctgcca tgcagctgac aaacttctct cagctggcgc caccagagtt 120
tatgccatct tgactcatgg aatcttctcc ggtcctgcta tttctcgcat caacaacgca 180
tgctttgagg cagtagtagt caccaatacc atacctcagg aggacaagat gaagcattgc 240
tccaaaatac aggtgattga catctctatg atccttgcag aagccatcag gagaactcac 300
aatggagaat ccgtttctta cctattcagc catgtccctt ta 342
<210> 3
<211> 963
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgcccaaca tcgtgctgtt cagcggcagc tcgcatcagg acctgtccca gcgcgtggcc 60
gaccgcctgg gcctggagct gggcaaggtg gtcacgaaga agttcagcaa ccaggagacc 120
agcgtggaga ttggtgaaag cgtgagaggg gaagatgtct acatcatcca gagcggctgc 180
ggggaaatta acgacaacct gatggaactc ctcatcatga tcaatgcctg caagattgcg 240
tcatcatcca gagtaactgc cgtgatcccg tgtttcccat acgcccgaca agataaaaag 300
gacaaggtag gagagagtcg tgccccaatt tctgcaaaac ttgtggccaa tatgctgtcg 360
gtggctgggg cggatcacat catcaccatg gacctgcatg cttctcagat acagggattc 420
tttgatattc ctgtggataa tttgtatgcg gagcccgcag tcctgcagtg gattcgggaa 480
aacattgccg agtggaagaa ctgtatcatt gtttcacctg acgcaggggg agccaaaagg 540
gttacatcaa ttgcagacag gttgaatgtg gaatttgctt tgatccacaa agagaggaag 600
aaggcgaatg aagtggaccg gatggtcctg gtgggcgacg tgaaggaccg tgtggccatc 660
ctcgtggatg acatggctga cacttgcggc accatctgcc atgctgcgga caagctgctg 720
tcagctggag ccaccaaagt gtatgctatc cttacccatg ggatcttctc tggaccagct 780
atttccagaa taaataatgc cgcctttgag gctgttgtcg tcacaaacac aattccgcaa 840
gaggacaaaa tgaaacactg caccaagatt caggtcattg acatttccat gatcttggcc 900
gaagcaatcc gaaggacaca caatggggaa tccgtgtcct acctgttcag ccatgtcccg 960
cta 963
Claims (9)
- 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)를 코딩하는 뉴클레오티드, 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1)을 코딩하는 뉴클레오티드 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)는 인간 유래 소스에서 선택된 것을 특징으로 하는, 재조합 플라스미드 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)는 서열번호 1이고, 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1)은 서열번호 2이며, 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)은 서열번호 3인 재조합 플라스미드 벡터. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 벡터에 의해 형질전환된 재조합 대장균.
- 제4항에 있어서,
상기 대장균은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide, NMN)를 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균. - 제4항에 있어서,
상기 대장균은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)의 동시 발현을 특징으로 하는 재조합 대장균. - 제4항의 재조합 대장균을 NAM이 첨가된 표 3의 초기 배지 조성을 이용하여 회분식 배양하는 1단계,
포도당 농도가 0으로 감소하기 전에 포도당 600 g/L, 효모 추출물 60 g/L 및 트립톤 60 g/L 조성의 용액을 공급하는 2단계,
상기 2단계와 동시에 유당 유도제를 10 g/L 공급하여 재조합 대장균을 고농도로 유가식 배양하는 3단계를 포함하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산 방법. - 제7항에 있어서,
상기 방법은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT), 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 1(PRPS1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 합성효소 2(PRPS2)의 동시 발현을 특징으로 하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산 방법. - 제7항에 있어서,
상기 니코틴아미드(NAM)의 농도는 3 내지 10(g/L) 인 것을 특징으로 하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산 방법.
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| KR1020210111714A KR20230029344A (ko) | 2021-08-24 | 2021-08-24 | 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 생산방법 |
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Patent Citations (1)
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