KR100599934B1

KR100599934B1 - 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100599934B1
Application number: KR1019980056996A
Authority: KR
Inventors: 김문무; 석재균; 김상년; 김정훈; 박상기; 이학모
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2006-11-30
Also published as: KR20000041190A

Abstract

본 발명은 약제 조성물에 관한 것이다. 이 약제 조성물은 유백피 및 녹차로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제, 쾨르세틴, 루틴, 탁시폴린, 캠프페롤, 미리세틴, 큐르큐민, 레스베라트롤, 아레콜린, 아피제닌, 우고닌, 루테오린 및 텍토리제닌으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성 억제제 및 유지피, 오수유 및 위령선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로스타글란딘 생성 억제제를 포함한다.

이 약제 조성물은 치주 질환, 항염증 치료 효과가 탁월하다. 또한, 본 발명의 약제 조성물은 콜라게나제, 나이트릭 옥사이드(nitric oxide), 슈퍼옥사이드(superoxide), 프로스타글란딘, 인터루킨-1β 및 종양 괴사 인자 생성을 억제하는 효과가 우수하다. 따라서, 이러한 효능과 관련된 치주 질환, 상처, 암전이, 류마토이드 관절염, 염등, 부갑상선항진증, 당뇨병, 각막 궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 주름, 여드름, 에이즈, 화상, 동맥 경화, 골절과 같은 질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물

[산업상 이용 분야]

본 발명은 약제 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 치주 질환, 염증, 류마토이드 관절염 및 암전이 등과 같은 질환을 예방 및 치료하는데 유용한 약제 조성물에 관한 것이다.

[종래 기술]

기질 금속 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase)는 다형핵성 호중구(Polymorphonuclear neutrophil), 대식 세포(Macrophage), 치은 섬유 아세포(Fibroblast), 골세포(Bone cell)와 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존 엔도펩티다제로 중성의 pH에서 작용하며, 기질로써 여러 가지 세포외 기질을 이용한다.

이러한 단백질 분해 효소는 배발생, 조직의 형성, 타액선 형성, 치아 발생과 같은 수많은 생리학적 과정뿐만 아니라, 상처, 암전이, 치주 질환, 류마토이드 관절염, 염증, 부갑상선 항진증, 당뇨병, 각막 궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 주름, 여드름, 에이즈, 화상, 동맥경화, 골절과 같은 병리학적 과정 각종 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다.

기질 금속 단백질 분해 효소는 12개의 군으로 나누어지며 성장인자 및 사이토카인(cytokine)에 의하여 이 효소의 유전자가 발현되어 만들어진 효소가 분비되는 것으로 알려져 있다. 또한, 혈관, 결합 조직 및 림프관으로 발생되는 중배엽 조직의 간엽 세포와 각질 세포 내에서 성장 인자와 인터루킨-1β, 종양 괴사 인자-α, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자와 같은 사이토카인은 상기 효소의 유전자 발현을 촉진하는 반면, 인터페톤감마와 글루티코르티코이드 및 변형 성장 인자-β는 상기 효소의 유전자 발현을 억제시킨다. 그리고 골흡수와 관련하여 부갑상선 호르몬 및 세포내독소 및 프로스타글란딘은 효소의 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

이러한 유전적 조절 기작에는 원종양 유전자인 c-fos와 c-jun과 같은 전사 인자에 의하여 유전자에 대한 활성 인자 단백질-1이 변형되고 부가적으로 PEA3와 NIP 단백질 결합 부위가 상승 작용으로 치은 섬유 아세포의 콜라게나제와 스토로멜리신(Stomelysin) 프로모터에서 전사 활성을 최대 수준으로 유발시킨다. 호중구의 금속 단백 분해 효소의 조절은 전사 수준에서 보다는 리소좀의 과립에 의하여 일차적으로 조절된다.

기질 금속 단백질 분해 효소의 분자 구조는 일반적으로 다섯 개의 지역인 신호펩타이드, 프로펩타이드, 촉매 부위, 경첩 부위, 펙신과 같은 부위로 특징화된다. 젤라티나제, 기질 금속단백질 분해 효소-2 및 기질 금속 단백질 분해 효소-9는 1개의 파이브로넥틴과 같은 콜라겐 부위를 가지고 있으며, 기질 금속 단백질 분해 효소-9는 하나의 부가적인 타입Ⅴ 콜라겐 부위를 가지고 있다. 이러한 효소는 세포에서 저장되지 않고 불활성화된 프로엔자임 및 자이모겐(Zymogen)으로 분비되며 신호 펩타이드가 상실되면서 활성을 찾는다. 프로펩타이드의 기능은 효소의 불활성을 유지하는데 관련되며 여러 단계에서 절단된다. 이러한 효소의 활성을 유발시키는데는 세정제, 산화제, 유기 금속 물질 및 트립신 및 플라스민과 같은 효소가 관여하여 효소 촉매 부위의 아연으로부터 시스테인을 떨어져 나가게 하여, 아연은 물과 상호 작용하여 기질을 가수분해시킨다. 호중구 및 다형핵성 백혈구의 기질 금속 단백질 분해 효소는 산화적 과정에 의하여 일차적으로 활성화되며 그 과정은 먼저 세포내에서 과산화 수소가 발생되면 염소 이온의 존재에서 미엘로페록시다제(Myeloperoxidase)에 의하여 차아염소산으로 전환하고 이것이 기질 금속 단백질 분해 효소를 불활성화시킨다. 섬유 아세포의 기질 금속 단백질 분해 효소는 트립신 및 프라스민과 같은 단백질 분해 효소에 의하여 활성화된다.

이리하여 활성화된 효소는 불과 소량이 정해진 생리학적 기능을 수행하는데 과량으로 분비되어 활성화되면 되며 상기에서 언급한 각종 질환을 유발시키게 된다. 효소의 기질 특이성은 헤모펙신 혹은 비트로넥틴 부위의 특이성에 따라 결정되며 기본적으로 콜라게나제는 독특하게 섬유상 콜라겐에 대한 특이성을 보여주는 반면에 젤라티나제는 변성된 콜라겐 및 기저막의 타입Ⅳ 콜라겐을 분해한다.

구체적으로 언급하면 기질 금속 단백질 분해 효소-2에는 72-KD의 젤라티나제(A)가 속하며 기질은 젤라틴, 콜라겐 타입 Ⅳ, Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ, 엘라스틴 및 피이브로넥틴이 있다. 기질 금속 단백질 분해 효소-3에는 스트로메리신-1이 속하며 기질은 프로테오글리칸, 파이브로넥틴, 라미닌, 프로콜라제나제, 콜라겐 타입 Ⅳ, Ⅴ, Ⅸ, Ⅹ과 엘라스틴이 있다. 기질 금속 단백질 분해 효소-7에는 마트리리신(Matrilysin)이 속하며 기질은 라민, 파이브로넥틴, 콜라겐 타입 Ⅳ, 젤라틴, 프로콜라게나제, 프로테오글리칸, 유로키나제가 있다. 기질 금속 단백질 분해 효소-8에는 다형핵성 백혈구의 콜라게나제가 속하며 기질은 기질 금속 단백질 분해 효소 -1과 같다. 기질 금속 단백질 분해 효소-10에는 스트로멜리신-2가 속하며 기질은 기질 금속 단백질 분해 효소-3과 같다. 기질 금속 단백질 분해 효소-11에는 스트로멜린-3이 속하며 기질은 결정되지 않았다. 기질 금속 단백질 분해 효소-12에는 대식 세포의 메탈로에스탈라제가 속하며 기질은 엘라스틴이다.

특히 기질 금속 단백질 분해 효소 중에서 타입 Ⅳ 콜라게나제(colagenase)인 72-KD 92-KD-11 콜라게나제는 암전이의 첫 번째 장벽인 기저막의 주요 구조적인 성분인 타입 Ⅳ 콜라겐(colagen)을 분해하는 효소로 암세포의 침윤과 전이에 있어서 가장 중요한 효소라 할 수 있다. 따라서, 암의 침윤과 전이 그리고 콜라겐성 결합 조직의 분해가 원인이 되는 류마토이드, 치주 질환, 각막 궤양의 치료에 유용한 약제를 개발하기 위하여 타입 Ⅳ 콜라게나제에 대한 저해제에 대한 연구가 진행되고 있다.

상술한 질환 중에서, 치주 질환은 임상적으로 치은염증과 출혈, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 인하여 치아의 상실을 가져오는 것을 말한다. 이러한 치주 질환은 세균의 집락 형성 및 세균의 치주 조직 침투, 치주 조직이 파괴되는 과정으로 진행되며, 그를 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저 구강내 타액 중의 타액 단백질이 상아질과 백악질 표면에 흡착되면서 피막을 형성하고, 이 피막 표면에 스트렙토코커스(Streptococcus)와 악티노마이시스(Actinomyces)와 같은 세균이 성장하면서 프라그를 형성한다. 이 후, 시간이 경과함에 따라 형성된 프라그가 치근단 방향으로 이동함과 동시에 포피로모나스(Porphyromonas)와 악티노바실러스(Actinobacillus)와 같은 혐기성 그람음성균이 성장하게 된다.

이와 같이 형성된 세균, 세균 성분, 세균 산물들이 치은열 구상피를 통하여 치은 결합 조직내로 침투하여 치주낭이 형성된다. 이러한 세균의 대사 결과 치주 조직에 유독한 황화 수소, 암모니아, 유독한 아민과 같은 세포의 독소를 분비한다. 이와 동시에 세포벽 구성분인 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccaride)와 같은 내독소에 의하여 직접 조직이 파괴된다. 또는, 생체 면역계를 자극하여 자극된 체액성 및 세포성 면역계의 여러 작용에 의하여 세포 외부로 분비된 나이트릭 옥사이드(nitric oxide)와 슈퍼옥사이드(superoxide), 프로스타글란딘즈(Prostaglandins), 루코트리엔즈(Luekotriens), 히스타민(Histamine), 인터루킨즈(Interluekins) 및 종양 괴사 인자(Tumor necrosis factor α)와 같은 여러 종류의 사이토카인(Cytokine) 등에 의하여 잇몸 염증이 유발된다. 또한, 세균 및 백혈구로부터 분비된 콜라게나제와 같은 효소에 의하여 치주 조직의 기질인 콜라겐이 분해되어 잇몸 퇴축이 일어나고, 계속 방치하게 되면 치주 질환으로 진행된다.

이러한 치주 질환의 발생을 예방하기 위하여, 클로로헥시딘 글루코네이트(Chlorhexidine gluconate), 세틸피리디움 클로라이드(Cetylpyridium chloride), 상귀나린(Sanguinarine) 및 트리크로산(Triclosan)과 같은 항균제가 개발되어 양치액 및 치약과 같은 구강 제품에 적용되어 왔다. 그러나 이러한 항균제는 아직까지 치주 질환의 발생을 근본적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다.

최근에는 국내에서도 몰약, 상백피, 승마, 녹차, 감초, 황금, 포공영, 금은화 등과 같은 생약 추출물을 사용하여 치주 질환을 억제시키려는 노력이 활발하게 일어나고 있다. 그러나 치주 질환을 유발시키는데 있어 결정적인 역할을 하는 프로스타글란딘의 생성을 억제시키거나 치주 조직을 분해시키는 콜라게나제의 활성을 억제시키는 식물추출물은 아직 확인되지 않고 있다. 대개의 경우에는 프라그의 형성을 억제시키거나 항균, 소염, 수렴, 지혈, 혈액순환촉진과 같은 한방약재의 작용을 통하여 치주 질환의 발생을 예방한다는 정도이다.

현재까지 치주 질환을 치료할 수 있는 방법으로 가장 널리 사용되고 있는 방법은 치주 조직을 분해시키는 콜라게나제 효소의 활성을 억제시키거나 치주 질환 유발 물질인 프로스타글란딘의 생성을 억제시키는 약효제를 사용하고 있다.

미국 특허 제 5,230,895 호는 테트라사이크린(Tetracycline)을 함유하는 약효 물질이 지속적으로 송달되는 시스템을 개발하여 치주 조직을 분해시키는 콜라게나제의 효소 활성을 억제함으로써 치주 질환을 치료할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 유럽 특허 공개 제 528468 A1 호는 트라이클로산(Triclsan)을 함유하는 치약 및 구강 청정제를 개발하여 치주 질환 유발 물질인 프로스타글란딘의 생성을 억제하여 치주 질환을 억제시킬 수 있다는 것을 확인하여 치주 질환을 치료할 수 있다는 방법을 제시하였다.

하지만 이상에서 소개한 약효제는 치주 질환을 치료하는데 있어 치주 질환 유발물질의 생성을 억제시킴과 동시에 치주 조직 분해 효소의 활성을 억제시키는 두 가지 작용을 가지지 못하고 한 가지 작용만을 나타내어 치주 질환을 완전히 치료하는데는 한계성을 가지고 있을 뿐만 아니라 합성 물질임으로 장기간 사용시 여러 가지 부작용이 우려되고 있다.

또한, 테트라사이크린을 투여하는 미국 특허에서는, 테트라사이크린을 보통 250 ㎎(1정)을 하루 4회 투여하여, 하루 동안 모두 1000 ㎎을 투여하여 5 내지 7일간 투여하는 방법이 기술되어 있다. 일반적으로 테트라사이크린 투여시 임상적으로 또한 세균학적으로 정상적인 상태까지 호전되고 있는 것이 보고되고 있으며 치석 제거 후 테트라사이크린을 하루 투여할 경우 상당히 좋은 효과를 나타낸다는 결과가 나오고 있다. 저농도의 장기 투여에 대한 연구 보고서를 보면 1일 1000 ㎎을 2주 투여한 후 250 ㎎을 하루 한 번 투여하여 48주간 계속 투여시 임상적으로 치은염이 감소되고 치은연하치태중 운동성 균주가 없어지며 치주낭 깊이나 부착도 상실이 감소되는 결과가 보인다고 하였다. 그러나 저농도의 테트라사이크린을 장기간 사용시 그람음성균의 내성발현이 자주 발생된다. 이러한 내성균주의 발현은 항생제 투여를 중지할 경우에도 자주 발생됨으로 대단히 조심하여야 하며 부작용으로는 구토, 위장관의 동통 호소, 설사, 치아 착생 등이 아주 자주 발생되며 임산부나 어린 아이는 삼가야 하는 한계성이 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 콜라게나제 활성 및 프로스타글란딘의 생성을 억제할 수 있어 치주 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 기질 금속 단백질 분해 효소의 활성을 억제할 수 있으므로 이에 따른 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유백피 및 녹차로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제; 쾨르세틴(Quercetin), 루틴(Rutin), 탁시폴린(Tacifolin), 캠프페롤(Kaempferol), 미리세틴(Myricetin), 큐르큐민(Curcumin), 레스베라트롤(Resveratrol), 아레콜린(Arecolin), 아피제닌(Apigenin), 우고닌(Wogonin), 루테오린(Luteolin) 및 텍토리제닌(Tectorigenin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 나이트릭 옥사이드(nitric oxide)와 슈퍼옥사이드(superoxide) 생성 억제제; 및 유지피, 오수유 및 위령선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로스타글란딘 생성 억제제를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자는 상처, 암전이, 치주 질환, 류마토이드 관절염, 염증, 부갑상선 항진증, 당뇨병, 각막 궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 주름, 여드름, 에이즈, 화상, 동맥 경화, 골절과 같은 질환을 예방 및 치료하는데 중요한 약효제로 알려져 있는 물질을 대상으로 광범위한 연구를 실시하였다. 이 연구를 통하여 염증을 유발시키는 결합 조직을 분해시키는 콜라게나제의 활성 측정법, 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성측정법, 프로스타글란딘의 정량법을 사용하여 한방 약재 및 식물 추출물을 대상으로 콜라게나제의 활성을 억제시키거나 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 및 프로스타글란딘 생성 억제 및 종양 괴사 인자 및 인터루킨-1β의 생성을 억제시키는데 탁월한 효능을 나타내는 한방 및 식물 추출물을 스크리닝하였다.

이러한 실험 결과, 상기 효능을 나타내는 물질을 혼합시 상승 효과로 효능이 탁월하다는 것을 발견하고 치주 질환, 염증, 류마토이드 관절염 치료 및 암전이를 억제할 수 있는 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 약제 조성물은 유백피 및 녹차로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제, 쾨르세틴, 루틴, 탁시폴린, 캠프페롤, 미리세틴, 큐르큐민, 레스베라트롤, 아레콜린, 아피제닌, 우고닌, 루테오린 및 텍토리제닌으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성 억제제 및 유지피, 오수유 및 위령선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로스타글란딘 생성 억제제를 포함한다.

본 발명의 조성물은 결합 조직의 기질인 콜라겐 단백질을 분해하는 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제를 전체 약제 조성물 중량에 대하여 0.0001∼5 중량%의 양으로 포함한다. 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 효과가 미비하며, 5 중량%를 초과하는 경우에는 제형에 문제가 발생되며, 색상에 영향을 미친다. 이러한 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제로는 유백피 또는 녹차를 한 종 이상 사용할 수 있다.

유백피로는 한국의 중부 이북과 중국 및 일본에 각각 분포하는 느릅나무과 식물인 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa), 비술나무(Ulmus pumila), 느릅나무(Ulmus davidiana)의 줄기 부분 또는 뿌리 부분의 근피를 채취하여 햇볕에 말린 것을 사용한다. 유백피의 약리작용으로는 이수, 소종, 통림, 수종, 단독 작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 주요 성분으로는 베타시토스테롤(β-Sitosterol), 식물 스롤 및 탄닌 등으로 구성되어 있다.

녹차로는 차나무과(Theaceae) 식물인 차(Camella sinensis O. Ktze.)의 잎을 채취하여 햇볕에 말린 것을 사용한다. 녹차의 약리작용으로는 항균, 간염, 심장 순환계 질환 및 동맥 경화에 효과가 있으며, 특히 항암 작용도 있는 것으로 보고되고 있다. 주성분으로는 카테친(Catechin), 에피카테친(Epicatechin), 에피카테친갈레이트(Epicatechin gallate), 에피갈로카테친갈레이트(Epigallocatechin gallate)가 있다.

본 발명의 약제 조성물에는 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드의 생성 억제제를 전체 약제 조성물 중량에 대하여 0.0001∼5 중량%의 양으로 포함한다. 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드의 생성 억제제의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 효과가 미비하며, 5 중량%를 초과하는 경우에는 제형에 문제가 발생되며, 색상에 영향을 미친다. 이러한 생성 억제제로는 쾨르세틴, 루틴, 탁시폴린, 캠프페롤, 미리세틴, 큐르큐민, 레스베라트롤, 아레콜린, 아피제닌, 우고닌, 루테오린 혹은 텍토리제닌을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약제 조성물에는 또한 프로스타글란딘 생성 억제제를 전체 약제 조성물 중량에 대하여 0.000∼5 중량%의 양으로 포함하므로 프로스타글란딘, 특히 프로스타글란딘 E2 생성을 억제하므로 통증 및 염증 유발을 방지할 수 있다. 프로스타글란딘 생성 억제제의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 효과가 미비하며, 5 중량%를 초과하는 경우에는 제형에 문제가 발생되며, 색상에 영향을 미친다. 이러한 프로스타글란딘 생성 억제제로는 유지피, 오수유 또는 위령선을 한 종 이상 사용할 수 있다. 유지피로는 버드나무과(Salicaceae) 식물인 수양버들(Salix babylonica Linnaeus)의 줄기 껍질을 채취하여 햇볕에 말린 것을 사용한다. 유지피의 약리작용으로 이수, 소종, 지통, 거풍, 단독, 치통 등에 효능이 알려져 있다. 유지피의 주요 약효 성분으로는 살리신(Salicin), 갈로타닌(Gallotannin), 인돌-3-아세트산(indole-3-acetic acid), 포풀린(Populin), 준세인(Juncein) 등이 있다.

오수유로는 운향과(Rutaceae) 식물인 오수유나무(Evodia officinalis) 의 성숙한 과실로 채취하여 햇볕에 말린 것을 사용한다. 오수유의 약리 작용으로 진통 작용, 소독 작용, 위염증 억제 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 오수유의 주요 성분으로는 에보디아민(Evodiamine), 에보덴(Evodene), 에보돌(Evodol), 루타에카르핀(Rutaecarpine) 등이 있다.

위령선으로는 나리아제비과(Ranunculaceae) 식물인 으아리(Clematis mandshurica)의 뿌리를 채취하여 햇볕에 말린 것을 사용한다. 위령선의 약리작용으로 진통작용, 항균 작용, 골연화 작용 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있고, 주요 약효 성분으로는 아네모닌(Anemonin), 아네몰(Anemol), 사포닌(Saponin) 등이 있다.

이와 같은 성분을 포함하는 본 발명의 약제 조성물의 제조 방법은 다음과 같다. 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제, 나이트릭 옥사이드 및 슈퍼옥사이드 생성 억제제 및 프로스타글란딘 생성 억제제로 사용되는 건조 생약제를 음건 세절하고 분말화한다. 얻어진 가루에 에탄올 등의 알콜을 가하여 약 3일간 침적 추출한다. 추출물을 여과지를 이용하여 여과한 후 감압 농축하여 생약 추출물을 얻는다.

상기한 성분을 포함하는 본 발명의 약제 조성물은 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제, 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 억제 및 프로스타글란딘 E₂ 생성 억제 뿐만 아니라, 인터루킨-1β 및 종양 괴사 인자의 생성까지 억제할 수 있다. 따라서, 이러한 효능과 관련된 치주 질환, 상처, 암전이, 외상, 주름, 여드름, 에이즈, 화상, 동맥경화, 골절과 같은 질환을 예방 및 치료하는데 주요한 약효제로 사용될 수 있다.

이와 같은 본 발명의 약제 조성물은 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성 억제, 콜라게나제와 같은 기질 금속 단백질 분해 효소의 활성 억제, 프로스타글란딘 생성 억제를 위한 복합 제제로 어떠한 형태의 약제로도 제조될 수 가 있다. 그러한 형태는 정제, 캡슐, 분말, 연고, 용액, 젤, 페이스트(paste), 첩포제, 과립상으로도 가능하나 특히 본 발명에서는 구강제품인 치약 및 항염증 연고제 등에 이들 성분을 유효 성분으로 동시에 적용한 것을 예로 들어 설명한다.

1. 치약 조성물의 제조 방법

본 발명의 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제, 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성 억제제 및 프로스타글란딘 생성 억제제를 포함하는 약제 조성물, 연마제, 습윤제, 결합제 및 기포제를 혼합하여 치약 조성물을 제조한다.

본 발명의 치약 조성물은 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제, 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성 억제제 및 프로스타글란딘 생성 억제제를 전체 치약 조성물 중량에 대하여 각각 0.0001 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%를 포함하는 약제 조성물을 포함한다. 억제제들의 함량이 각각 0.0001 중량% 미만인 경우에는 치주 질환에 대한 효능, 효과를 기대할 수 없고, 5 중량%를 초과하는 경우에는 제품의 안전성의 저하로 부적합하다.

연마제는 치아 표면을 상처냄이 없이 치아 표면의 부착물을 제거하고 치아 본래의 광택을 내게 하는 성분으로 주로 무기 화합물 분말이 사용된다. 연마제의 대표적인 예로는 인산일수소칼슘, 침강실리카, 실리카젤, 중조, 탄산칼슘, 함수 알루미나, 불용성 메타인산나트륨, 피로인산나트륨, 함수 실리카 등을 1종 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으며, 특히, 인산일수소칼슘, 함수실리카, 탄산칼슘을 1종 또는 혼합하여 주로 사용된다. 연마제 성분의 함량은 전체 치약 조성물 중량에 대하여 1-90 중량%를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 20-60 중량%를 사용할 수 있다.

습윤제는 치약 조성물의 상태 유지 및 건조 방지를 위하여 사용되는 성분이다. 이러한 습윤제로는 글리세린, 소르비톨액, 폴리에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 등이 있으며 단독 또는 2종 이상 혼합하여 20-60 중량%를 사용한다.

본 발명의 치약 조성물에 포함되는 결합제는 치약 성분중 액체와 고체 성분을 결합시켜 치약의 형태를 유지하고 안전성을 확보하기 위하여 사용되는 것이다. 결합제로는 주로 카르긴산나트륨, 또는 칼슘염, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 잔탄검, 아카시아검 등의 천연 또는 합성 고분자 물질이 사용되며 그 사용량은 0.1-5 중량%를 사용한다.

기포제는 연마제의 세정 작용을 보완하며 약효제를 칫솔이 도달하기 힘든 부위까지 침투시켜 주는 것은 물론 기포를 발생시켜 양치감을 증대시켜 주는 역할을 하며 세정 작용을 도와주고 약효제의 분산 및 침투를 빠르게 하고 계면장력을 감소시켜 줌으로 구강내 이물질이 쉽게 떨어지는 작용을 한다. 주로 사용되는 기포제로는 음이온 계면활성제인 라우릴 황산나트륨, 알킬황산나트륨이 사용되고 보조적으로 비이온 계면활성제인 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 공중합체, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산, 알칸올 아미드 지방산 에스테르, 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 아주까리경화유 유도체가 사용된다. 기포제의 사용량은 음이온 또는 비이온 계면활성제를 단독 또는 2종 이상 혼용하여 0.5 내지 5 중량%를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치약 조성물은 치아의 재석회하를 촉진시켜 치아의 조직을 강화시키는 약효제를 더욱 포함할 수 있다. 이러한 기능을 갖는 약효제는 불소 화합물로는 불화나트륨, 제일불화인산나트륨을 혼용 또는 단독 사용하고 그 함량은 0.01 내지 2.0 중량%가 적당하다. 불소 화합물의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우에는 효과가 없고 2.0 중량%를 초과할 경우에는 인체의 안전성에 영향을 줄 수 있기 때문에 구강용 제제로써 적합하지 못하다.

그 외에도 텁텁하거나 다소 쓴 맛을 조절하기 위하여 향료와 감미제가 사용되는데 향료에는 주로 천연 향료인 페파민트와 스피아민트 오일이 많이 사용되며 치약 중에 0.1 내지 1 중량% 사용한다. 감미제는 합성 또는 천연의 비발효성 당 등이 주로 사용되며 대표적인 것으로는 삭카린나트륨, 아스파탐, 락토오스, 말토오스, 자이리톨 등이 있으며, 적당한 감미제로는 삭카린감미제 등을 0.05 내지 1 중량% 사용하는 것이 바람직하다.

그리고 치약 조성물의 pH를 조정하는 완충제로는 정인산의 알칼리 금속염, 특히 제일 인산나트륨, 제 2 인산나트륨, 제 3 인산나트륨, 구연산 및 구연산나트륨, 인산, 염산, 수산화나트륨 그리고 피로인산나트륨 및 피로인산염 등이 사용될 수 있으며, 특히, 제 1 인산나트륨, 제 2 인산나트륨, 제 3 인산나트륨의 2종을 적당히 혼합하여 주로 사용된다. 치약 조성물의 pH는 5 내지 8.0으로 조정한다.

치약 조성물의 제조 및 사용 중에 발생할 우려가 있는 미생물의 오염을 방지하기 위하여 일반적으로 식품 및 의약품에 사용이 허가되어 있는 파라옥시 안식향산메틸, 안식향산, 안식향산나트륨, 살리실산 등을 단독 또는 혼합하여 0.01 내지 0. 5 중량% 사용한다.

2. 연고제 조성물의 제조 방법

본 발명의 약제 조성물, 저급 알콜, 상태 안정제, 습윤제 및 약효 전달 시스템을 혼합한다. 이 혼합물을 완충 용액에 용해하고 겔화시켜 연고제 조성물을 제조한다.

본 발명의 연고제 조성물은 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제, 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성 억제제 및 프로스타글란딘 생성 억제제를 전체 연고제 조성물 중량에 대하여 각각 0.0001 내지 5 중량%를 포함하는 약제 조성물을 포함한다. 억제제의 함량이 각각 0.0001 중량% 미만인 경우에는 효과가 미비하며, 5 중량%를 초과하는 경우에는 제형에 문제가 발생되며, 색상에 영향을 미친다.

본 발명에 사용된 저급 알콜로는 에탄올, 이소프로필알콜을 각각 혹은 혼용하여 0 내지 20 % 사용할 수 있다. 상태 안정제는 연고 조성물의 상태를 안정시키기 위하여 사용되는 것으로서, 플루오닉 유도체를 사용할 수 있다. 플루오닉 유도체로는 폴록사머 407 또는 폴록사머 348을 사용할 수 있고, 그 사용량은 5 내지 30 중량% 사용할 수 있다.

습윤제는 연고 조성물의 상태 유지 및 건조 방지를 위하여 사용된다. 이러한 습윤제로는 글리세린, 소르비톨액, 폴리에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 상품명 폴록사머 407(Poloxamer 407)로 시판되는 폴록사머, 상품명 미베롤 18-99(Myverol 18-99)로 시판되는 모노글리세라이드, 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 습윤제의 사용량은 전체 연고 조성물 중량에 대하여 1 내지 20 중량%를 사용한다.

연고 조성물의 pH를 조정하는 완충제로는 정인산의 알칼리금속염, 특히 제일 인산나트륨, 제 2 인산나트륨, 제 3 인산나트륨, 구연산 및 구연산나트륨, 인산, 염산, 수산화나트륨 그리고 피로인산나트륨 및 피로인산염 등을 사용할 수 있으며, 주로 제 1 인산나트륨, 제 2 인산나트륨, 제 3 인산나트륨의 2종을 적당히 혼합하여 사용된다. 연고 조성물의 pH는 5 내지 8.0으로 조정한다.

그 외에도 텁텁하거나 다소 쓴맛을 조절하기 위하여 향료와 감미제가 사용되는데 향료에는 주로 천연 향료인 페파민트와 스피아민트 오일이 많이 사용되며 연고 조성물 중에 0.1 내지 1 중량% 사용한다. 감미제는 합성 또는 천연의 비발효성 당 등이 주로 사용되며 대표적인 것으로는 삭카린나트륨, 아스파탐, 락토오스, 말토오스, 자이리톨 등이 있으며, 적당한 감미제로는 삭카린감미제 등을 0.05 내지 1 중량% 사용하는 것이 바람직하다.

연고 조성물의 제조 및 사용 중에 발생할 우려가 있는 미생물의 오염을 방지하기 위하여 일반적으로 식품 및 의약품에 사용이 허가되어 있는 파라옥시 안식향산메틸, 파라옥시 안식향산프로필, 안식향산, 안식향산나트륨, 살리실산 등을 단독 또는 혼합하여 0.01 내지 0.5 중량% 사용할 수 있다.

[실시예]

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다.

1. 약제 조성물

(실시예 1 내지 5)

유백피, 유지피, 녹차, 큐르큐민을 건조한 건조 생약제를 음건 세절하고 분말화하였다. 분말 가루 50 g에 95 % 에탄올 500 ㎖를 가하여 3일간 침적 추출한 후 1번 와트만지(Whatman No. 1)를 이용하여 그 추출물을 여과시킨 다음 감압 농축하여 생약 추출물을 얻었다. 이 생약 추출물을 하기 표 1에 나타낸 양으로 혼합하였다.

[표 1]

(실시예 6 내지 10)

큐르큐민 대신 쾨르세틴을 하기 표 2에 나타낸 양으로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[표 2]

(실시예 11 내지 15)

큐르큐민 대신 탁시폴린을 하기 표 3에 나타낸 양으로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[표 3]

(실시예 16 내지 20)

큐르큐민 대신 루틴을 하기 표 4에 나타낸 양으로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[표 4]

(실시예 21 내지 25)

큐르큐민 대신 레스베라톨을 하기 표 5에 나타낸 양으로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[표 5]

2. 치약 조성물

(실시예 26 내지 27 및 비교예 1 내지 2)

하기 표 6에 나타낸 성분을 혼합하여 치약 조성물을 제조하였다.

[표 6]

(실시예 28 내지 29 및 비교예 3 내지 4)

하기 표 7에 나타낸 성분을 혼합하여 치약 조성물을 제조하였다.

[표 7]

(실시예 30 내지 31 및 비교예 5 내지 6)

하기 표 8에 나타낸 성분을 혼합하여 치약 조성물을 제조하였다.

[표 8]

3. 연고제 조성물

(실시예 32 내지 33 및 비교예 7 내지 8)

세틸피리디움클로라이드, 플루로닉, 저급알콜, 글리세린, 젤라틴, 펙틴, 카복시메틸셀룰로스, 폴록사머(Poloxamer 407), 모노글리세라이드(Myverol 18-99), 프로필렌글리콜 혹은 폴리에틸렌글리콜, 멘톨 및 방부제를 하기 표 9에 나타낸 양으로 혼합하였다. 이 혼합물을 완충용액에 용해 및 젤화시켜 제조하였다.

[표 9]

(실시예 34 내지 35 및 비교예 9 내지 10)

하기 표 10에 나타낸 성분을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 34와 동일하게 실시하였다.

[표 10]

(실시예 36 내지 37 및 비교예 11 내지 12)

하기 표 11에 기재된 성분을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 34와 동일하게 실시하였다.

[표 11]

A. 본 발명의 실시예 1 내지 25의 약효 성분으로 콜라나제 효소 활성 억제, 타입 Ⅳ 콜라게나제 활성 억제, 슈퍼옥사이드 생성 억제, 프로스타글란딘 E2 생성 억제, 인터루킨-1β 생성 억제 및 종양 괴사 인자 생성 억제에 대한 실험을 다음과 같이 실시하였다.

실험예 1: 본 발명의 약제 조성물(실시예 1 내지 25)의 치주 조직 분해 효소인 콜라게나제의 효소 활성에 대한 억제 효과

본 발명 약효 시스템을 가지고 치주 조직 분해 효소인 콜라게나제에 대한 억제 효과를 실시한 실험 결과는 다음과 같다.

본 시험 방법은 진행 과정에서 치주 질환 원인균인 포피로모나스 진지 발리스(Porphyromonas gingivalis)와 다핵성 백혈구(Polymorphonuclear leukocytes) 및 중성 백혈구(Neutrophil)로부터 분비된 치주 질환 환자의 타액과 치은 열구액 속에 함유된 콜라게나제 효소의 작용에 의하여 치주 조직의 기질인 콜라RPS이 분해되어 잇몸 퇴축이 일어나는 생체 구강 환경을 모방한 실험 방법이다.

25개의 1.5 ㎖ 에펜돌프(Eppendorf) 튜브에 2 %의 적색 콜라겐 기질인 아조콜(Azocoll) 용액 100 ㎕를 각각 첨가하였다. 한 개의 에펜돌프튜브는 블랭크(blank)로 사용하고 3개의 튜브에는 시그마로부터 구입한 콜라게나제 타입 Ⅰ인 표준 효소 용액(콜라겐 분해 활성도: 315 units/㎎)을 10, 100, 200 ppm되게 첨가하G였다. 나머지 튜브의 각각에는 치주 질환 환자의 타액과 치은 열구액으로부터 세파릴(Sephacryl)S-200 크로마토그래피를 통하여 순수 분리된 콜라게나제 효소 100 ㎕를 첨가하였다.

한 개의 튜브는 대조군으로 사용하고 나머지 튜브의 각각에 실험군을 적당 농도되게 10 ㎕ 처리한 후 완충용액(0.05 M, Tris-HClm 1 nM CaCl₂, pH 7.8을 총 반응액이 500 ㎕되게 첨가하였다.

이어서, 얻어진 에펜돌르 튜브를 37 ℃ 항온기에서 18 시간 동안 반응시키고, 에펜돌프 튜브를 10000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리하여 분해되지 않은 콜라겐은 침전하고 분해된 콜라겐을 함유하는 상등액을 취하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 표준 활성도 곡선을 작성하였다. 이 표준 곡선으로부터 효소의 활성 농도를 환산하여 실험군과 대조군의 효소 활성도를 비교 평가하여 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 또한, 실시예 1 내지 25의 약제 조성물을 이용하여 얻은 결과를 하기 표 13 내지 표 15에 나타내었다.

[표 12]

[표 13]

[표 14]

[표 15]

상기 표 12에 나타낸 것과 같이, 유백피와 녹차를 각각 사용하였을 경우에는 콜라게나제 활성에 대한 억제 효과가 0.01 % 이상의 농도로 사용한 경우에 탁월한 것으로 나타났다. 그러나 표 13 내지 15에 나타낸 것과 같이, 3가지 성분을 모두 함유하고 있는 실시예 1-25의 조성물은 각 성분을 0.001 %만 포함하여도(실시예 1, 6, 11, 16, 21) 콜라게나제 활성에 대한 억제 효과가 상승하는 것을 알 수 있다. 실시예의 콜라게나제 활성에 대한 억제 효과는 대조군에 비하여, 89 %에서 93 %까지 나타났고, 0.01 % 이상의 농도에서는 95 % 이상의 콜라게나제 활성에 대한 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.

실험예 2: 본 발명의 조성물(실시예 1 내지 25)의 타입Ⅳ 콜라게나제 활성에 대한 억제 효과

아크릴아마이드젤 제조시 기질인 젤라틴을 1 ㎎/㎖ 첨가한 분리젤을 만들어 34개의 1.5 ㎖ 에펜돌프 튜브를 준비하였다. 한 개의 에펜돌프 튜브는 블랭크로 사용하고 9개의 튜브에는 칼바이오캠으로부터 구입한 타입Ⅳ 콜라게나제를 10, 100, 200 ppm 되게 첨가하고 나머지 튜브의 각각에는 100 ㎕의 효소와 실험대상군을 적당 농도되게 각각 10 ㎕ 처리하였다. 모든 튜브에 소디움도델실설페이트(Sodium dodecyl sulfate: SDS) 시료 완충 용액(4 % SDS, 125 mM Tris-Cl, pH 6.8, 10 % 글리세롤)을 총 반응액이 500 ㎕되게 첨가하여 혼합한 후 전기 영동하였다.

전기 영동 후 겔을 2.5 % 트리톤(Triton) X-100이 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액으로 30분간 2회 세척하여 SDS를 제거한 후 반응 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM CaCl₂, 0.01 % NaN₃)으로 37 ℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 이 후 겔을 0.1 % 코마리지브릴리언트 블루(Cooasie brilliant blue)로 염색시킨 다음 탈색하여 젤라틴 분해능을 덴시토메터(Densitometer)로 표준 활성도 곡선을 작성하고 표준 곡선으로부터 효소의 활성 농도를 환산하여 실험군과 대조군의 효소 활성도를 비교하여 그 결과를 하기 표 16에 나타내었다. 또한, 실시예 1 내지 25의 약제 조성물을 이용하여 얻은 결과를 하기 표 17 내지 표 19에 나타내었다.

[표 16]

[표 17]

[표 18]

[표 19]

상기 표 16에 나타낸 것과 같이, 유백피와 녹차의 타입Ⅳ 콜라게나제 효소 활성에 대한 억제 효과는 0.001 %의 농도에서는 각각 75 % 및 80 %의 억제 효과를 나타내었다. 또한, 상기 표 17 내지 19에 나타낸 것과 같이, 3가지 성분을 모두 포함하는 경우에는 각 성분을 0.001 %만 함유하고 있는 경우(실시예 1, 6, 11, 16, 21)에도 콜라게나제 활성에 대한 억제 효과는 상승 효과가 있는 것으로 나타났으며, 그 값은 89 %에서 93 %까지 나타났다. 또한, 0.01 % 이상의 농도에서는 95 % 이상의 타입Ⅳ 콜라게나제 효소 활성에 대한 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.

실험예 3: 본 발명의 조성물의 슈퍼옥사이드 생성에 대한 억제 효과

전신 질환이 없는 건강한 성인으로부터 구연산을 항응고제로 사용하여 채집된 정맥혈액을 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후, 가운데 층의 백혈구 농축액을 회수하고, 이 농축액과 RPMI 1640 배지와 1 : 1의 부피 비율로 희석하였다. 이어서, 50 ㎖의 원심분리관에 피콜-플라그(Ficoll-Plaque) 12 ㎖를 첨가한 후에 희석된 혈액 30 ㎖가 가운데 층이 되도록 주의 깊게 첨가하였다. 이 원심분리관을 1600 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후에 혈청이 포함된 상층을 제거하고 단핵세포가 함유된 가운데 층을 주의 깊게 희석하였다.

상기 희석액에 3배의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 800 rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버리고 RPMI 1640 배지를 10 ㎖ 첨가하였다. 얻어진 생성물에서 부드럽게 피펫팅(pipetting)하여 시료를 채취한 후, 이 시료를 800 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리하여 얻어진 결과물에서 상등액을 버리고 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 완충용액을 첨가한 후, 피펫팅하여 시료를 채취하였다. 이 시료를 24-웰 플레이트에, 사람의 단핵 백혈구가 10⁶ cell/well 되게 0.45 ㎖ 분주하였다.

시료와 백혈구를 포함하는 플레이트를 95 % 공기, 5 % CO₂, 100 % 습도 조건하에서 무균적으로 2시간 동안 배양한 후에, FMLP(N-Formul-Met-Leu-Phe)를 10^-6M 되게 0.05 ㎖ 처리하고 37 ℃에서 15분 동안 배양하여 세포를 자극하였다. 배양물에 80 μM되게 0.1 ㎖ 사이토크롬 C(Cytochrome C), 30 ㎍되게 0.1 ㎖ 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase), 실험 대상군을 적당 농도되게 0.1 ㎖ 첨가하고, 나머지 총 반응액이 0.9 ㎖되게 HBSS를 첨가하였다.

상기 혼합물을 37 ℃에서 10분간 보온하고 자극 물질인 식균화된 자이모산 A(Zymosan A)를 최종 농도 1.3 ㎎/㎖되게 0.1 ㎖를 첨가하고 진탕하면서 37 ℃에서 90분간 보온한 후에, 4 ℃에 10분간 넣어 반응을 정지시킨 다음에 4 ℃, 1500 rpm, 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 550 ㎚에서 하기 표 20의 시료 B의 광학 밀도(optical density)를 측정하였다.

사용량을 하기 표 20에 나타낸 것과 같이 변경한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 하기 표 20의 시료 A, C 및 D의 광학 밀도를 측정하였다. 이 광학 밀도를 이용하여 하기 수학식 1에 따라 슈퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion)의 생성량을 계산하여 그 결과를 표 21 및 22에 나타내었다.

[수학식 1]

O^-2 = (Δ O. D. / 21.0) × 10³ (nmmoles/10⁶ cell.min)

Δ O. D. = (B - D) - (A - C) = (B + C) - (D + A)

[표 20]

[표 21]

[표 22]

실시예 1 내지 25의 약제 조성물을 이용하여 동일하게 실시한 결과를 하기 표 23 내지 25에 나타내었다.

[표 23]

[표 24]

[표 25]

이상의 실험 결과에서 큐르큐민, 쾨르세틴, 탁시폴린, 루틴, 레스테라트롤의 슈퍼옥사이드 생성 억제 효과가 탁월하여, 이러한 약효제를 각각 함유하고 있는 실시예 1 내지 25에서도 마찬가지로 이러한 효과가 유백피, 유지피 및 녹차에 의하여 억제되지 않는 것을 보여주었다.

실험예 4: 본 발명 조성물(실험예 1 내지 22)의 단핵 백혈구의 나이트릭 옥사이드(NO) 생성에 대한 억제 효과

10 % 소태아 혈청을 5 % 함유하고 있는 DMEM(dulbecco's modified eagle medium) 배지에서 RAW 264.7 세포를 배양한다. 이 세포가 직경 10 ㎝의 세포 배양 플레이트에 가득 찼을 때, 24-웰 플레이트에 10⁶ cell/well이 되게 1 ㎖ 분주하였다. RAW 세포를 포함하는 플레이트를 95 % 공기, 5 % CO₂, 100 % 습도 조건하에서 무균적으로 24 시간 동안 배양하였다.

상기 배양물에 실험대상군을 100 ppm 농도가 되게 1시간 동안 처리하였다. 실험대상군을 첨가하지 않은 배양물만을 대조군으로 사용하였다. 이어서, 나이트릭 옥사이드의 생성을 유발시키기 위하여 E. coli 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)와 인터페론 감마를 각각 1 ppm 및 100 U되게 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.. 그 다음 배지 상등액과 시그마로부터 구입한 그리스(Griss) 시약을 1 : 1로 혼합후 5분 후에 540 ㎚에서 광학 밀도를 측정하고 표준 용액의 흡광도 값으로 스탠다드 커브를 작성하여 실험군의 나이트릭 옥사이드의 생성량을 산정하였다. 그 결과를 하기 표 26 내지 표 27에 나타내었다.

[표 26]

[표 27]

실시예 1 내지 25의 조성물을 이용하여 동일한 실시하여 그 결과를 하기 표 28 내지 30에 나타내었다.

[표 28]

[표 29]

[표 30]

이상의 실험결과에서 슈퍼옥사이드 생성 억제 효과에서의 결과와 마찬가지로 큐르큐민, 쾨르세틴, 탁시폴린, 루틴, 레스테라트롤의 나이트릭 옥사이드의 생성 억제 효과가 탁월하였으며, 이러한 약효제를 각각 0.001 % 함유하고 있는 실시예 1, 6, 11, 16, 21에서는 나이트릭 옥사이드 생성 억제에 있어 상승 효과가 있는 것으로 나타났으며, 0.01 % 이상의 농도에서도 그 효과가 유백피, 유지피 및 녹차에 의하여 억제되지 않고 탁월하다는 것을 보여주고 있다.

실험예 5: 본 발명의 조성물(실험군 1 내지 25)의 단핵 백혈구의 프로스타 글란딘(PGE ₂ ) 생성에 대한 억제 효과

본 발명 조성물을 가지고 치주질환 유발 물질인 프로스타글란딘의 생성에 대한 억제 효과를 실시한 실험 결과는 다음과 같다. 본 시험 방법은 E. coli의 세포벽 구성분인 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide: LPS)로 사람의 단핵 백혈구를 자극하여 유발된 프로스타글란딘(PGE2)의 생성을 항원-항체의 면역 진단법으로 억제 효과를 비교평가하였다.

구체적인 시험 방법은 혈액에서 분리한 혈액 단핵 백혈구를 24-웰 플레이트에 0.8 ㎖ 첨가하여 10⁶ cell/well이 되도록 분주하였다. 혈액 단핵 백혈구가 첨가된 웰 플레이트에 RPMI 1640 배지 200 ㎕를 첨가한 웰을 대조군으로 사용하고, 상기 웰 플레이트에 E. coli LPS(250 ppm) 100 ㎕를 첨가한 웰 및 LPS(250 ppm) 100 ㎕와 실험대상군을 적당 농도되게 100 ㎕를 첨가한 웰을 실험군으로 하여 24시간 동안 배양하였다.

염소의 항-마우스 1gG를 부착시킨 96-웰 플레이트(96-well plate)의 블랭크(blank) 웰에 50 ㎕ 완충용액(0.9 % NaCl, 0.1 % 소혈청 알부민, 0.5 % 카톤(Kathon)을 함유하는 0.1 M 인산 완충 용액)을 첨가하였다. 표준 웰에는 적당 농도(40, 80, 160, 320pg)의 프로스타글란딘 표준 용액 50 ㎕을 첨가하였다.

실험 대상군이 처리된 배지 상등액 50 ㎕를 실험군으로 선정된 웰에 첨가하였다. 또한, 50 ㎕의 PGE₂에 대한 항테를 블랭크 웰을 제외한 모든 웰에 첨가한 후 50 ㎕의 PGE₂ 컨쥬게이트(Conjugate) 퍼옥시데이즈(Peroxidase)를 블랭크 웰을 제외한 모든 웰에 첨가하고 96-웰 플레이트를 덮고 25 ℃에서 1시간 동안 유지하였다. 모든 웰 플레이트를 세척 완충용액(0.05 % 트윈 20을 함유하는 인산 완충 용액: pH 7.5)으로 4번 세척하고 상온에서 150 ㎕의 효소 기질(20%의 디메틸포르마이드에 용해된 3,3 ',5,5' -테트라메틸벤지딘/과산화수소)을 즉시 첨가하고 25 ℃에서 30분 동안 유지시키고 1M 황산 100 ㎕를 첨가한 후 마이크로플레이트 판독기로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준 용액의 흡광도 값으로 스탠다드 커브를 작성하여 실험군의 프로스타글란딘 생성량을 산정하였다. 프로스타글란딘 생성을 억제하는 유지피, 오수유 및 위령선 각각을 실험 대상군으로 사용하고, 대조군 및 LPS 처리군의 실험 결과는 하기 표 에 나타내었다. 또한, 실시예 1 내지 25의 약제 조성물을 실험 대상군으로 이용하여 얻은 결과는 하기 표 31 및 32에 나타내었다.

[표 31]

[표 32]

E. coli LPS로 자극한 사람 단핵 백혈구의 PGE₂ 생성에 대한 효능, 효과를 시험한 결과 유지피는 농도가 증가함에 따라 효능이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 0.005 % 이상의 농도애서 그 효능이 급격하게 증가하였다. 또한, 이러한 약효제를 각각 함유하고 있는 실시예 1 내지 25 역시 PGE₂ 생성에 대한 생성 억제 효과가 유백피, 유지피 및 녹차에 의하여 억제되지 않고 오히려 각각 그 농도가 0.01 % 함유하고 있는 실시예 1, 6, 11, 16, 21에서는 상승 효과가 있는 것으로 나타났다.

실험예 6: 본 발명 조성물의 (실시예 1 내지 25)의 단백 백혈구의 인터루킨 -1베타(IL-1β) 생성에 대한 억제 효과

혈액에서 분리한 혈액 단핵 백혈구를 24-웰 플레이트에 0.8 ㎖ 첨가하여 10⁶ cell/well이 되도록 분주하였다. 이 플레이트에 RPMI 1640 배지 200 ㎕를 첨가한 웰을 대조군으로 사용하고, 이 플레이트에 E. coli LPS(250 ppm) 100 ㎕을 첨가한 웰 및 LPS(250 ppm) 100 ㎕와 실시예 1 내지 25 조성물 100 ㎕를 적당 농도가 되게 첨가한 웰을 실험군으로 하여 24시간 동안 배양하였다.

인터루킨(IL-1β)의 항체가 부착된 96-웰 플레이트(96-well plate)의 웰에, 인터루킨-1β의 표준 용액(0, 10, 24, 25.6, 64, 160, 400 pg/well)을 50 ㎕ 첨가하고, 실험군 웰에 상기의 세포 배양액 50 ㎕를 첨가하고, 모든 웰에 50 ㎕의 바이오티닐레이티드 항체 시약(biotinylated antibody reagent)를 첨가하였다.

모든 웰을 25 ℃에서 3시간 동안 유지시킨 후 세척 완충 용액으로 3회 세척하고, 스트렙트아비딘-HRP 콘쥬게이트(Streptavidin-HRP conjugate)를 모든 웰에 첨가하여 다시 25 ℃에서 30분 동안 유지시킨 후 다시 세척 완충 용액으로 3번 세척하고 100 ㎕의 효소 기질을 즉시 첨가하였다. 이어서, 모든 웰을 25 ℃, 암실에서 플레이트의 뚜껑을 열어둔 채로 30 분 동안 유지시키고 0.18 M 황산 100 ㎕를 첨가한 후 마이크로플레이트 판독기로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 표준 용액의 흡광도 값으로 스탠다드 커브를 작성하여 실험군의 인터루킨 생성량을 산정하였다. 그 결과를 하기 표 33에 나타내었다.

[표 33]

E. coli LPS로 자극한 사람 단핵 백혈구의 IL-1β 생성에 대한 효능, 효과를 시험한 결과 실시예 1 내지 25는 농도가 증가함에 따라 효능이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 0.1 % 이상의 농도에서 그 효능이 급격하게 증가하여 LPS를 자극하지 않은 대조군보다 IL-1β의 함량이 감소한 것으로 나타났다.

실험예 7: 본 발명 조성물의 (실시예 1 내지 25)의 단핵 백혈구의 종양 괴사 인자(TNF-α) 생성에 대한 억제 효과

혈액에서 분리한 혈액 단핵 백혈구를 24-웰 플레이트에 0.8 ㎖ 첨가하여 10⁶ Cell/well이 되도록 분주하였다. 이 웰-플레이트에 RPMI 1640 배지 200 ㎕를 첨가한 웰을 대조군으로 사용하고, E. coli LPS (250 ppm) 100 ㎕를 첨가한 웰 및 LPS(250 ppm) 100 ㎕와 실시예 1 내지 25 조성물 100 ㎕를 적당 농도가 되게 첨가한 웰을 실험군으로 하여 24시간 동안 배양하였다.

TNF α의 항체가 부착된 96-웰 플레이트(96-well plate)의 웰에, 종양 괴사 인자의 표준 용액(0, 10.24, 25.6, 64, 160, 400 pg/well)을 50 ㎕ 첨가하고, 실험군 웰에 상기의 세포 배양액 50 ㎕를 첨가하였다.

또한, 모든 웰에 50 ㎕의 바이오티닐레이티드 항체 시약을 첨가한 다음 25 ℃에서 3시간 동안 유지시킨 후 세척 완충 용액을 3회 세척하고, 스트렙토아비딘 -HRP 컨쥬게이트를 모든 웰에 첨가하여 다시 25 ℃에서 30분 동안 유지시켰다. 모든 웰을 다시 세척 완충 용액으로 3번 세척한 후, 100 ㎕의 효소 기질을 즉시 첨가하고 25 ℃, 암실에서 플레이트의 뚜껑을 열어둔 채로 30분 동안 유지시키고 0.18 M 황산 100 ㎕를 첨가한 후, 마이크로플레이트 판독기로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 표준 용액의 흡광도 값으로 스탠다트 커브를 작성하여 실험군의 TNF α 생성량을 산정하였다. 그 결과를 하기 표 34에 나타내었다.

[표 34]

E. coli LPS로 자극한 사람 단핵 백혈구의 TNF α 생성에 대한 효능, 효과를 시험한 결과 실시예 1 내지 25는 농도가 증가함에 따라 효능이 증가하는 것으로 나타났다. 인터루킨-1베타에서의 시험결과에서와 마찬가지로 0.1 % 이상의 농도에서 그 효능이 급격하게 증가하여 LPS를 자극하지 않은 대조군보다 TNF α의 함량이 감소한 것으로 나타났다.

실험예 8: 본 발명 치약(실시예 26 내지 31)의 효능, 효과에 대한 임상 실험

본 발명 치약을 가지고 치주 질환 치료에 대한 임상 실험을 실시한 결과는 다음과 같다.

실험 대상자는 치열이 고르고 결손 치아가 없고 치주 질환 환자를 대상으로 하여 연령별 30세부터 50세까지 10세 간격으로 성별에 따라 30명씩 정밀한 구강검진을 실시하여 120명의 실험 대상군을 선별한 후 60명씩 나누어 실험군 치약(실시예 26 내지 31)과 비교군 치약(비교예 1 내지 6)의 치주 질환 치료 효과에 대한 임상 실험을 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

먼저 본 발명 치약의 임상실험 방법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

실험대상군을 실험군과 비교군으로 나눈 후 구강 보건 교육 및 올바른 칫솔질 방법을 교습시켰다. 모든 실험 대상군에게 동일한 대조 칫솔을 공급하고 치면 세마를 실시하여 초기 치은염 지수를 점수화하고 실험군 치약과 비교군 치약을 공급하여 사용하도록 하여 1주, 1개월, 3개월, 6개월 경과후에 구강 검진을 실시하여 치은염 지수를 검사하였으며, 치은염 지수의 측정 방법은 페리오덴탈 프로브(Periodental probe)를 치은열구내에 삽입하여 힘을 가하지 않은 상태로 각 치아 주위를 연속하여 탐침하고 30초가 지난 뒤에 출현된 상태를 측정하여 하기 표 35에 나타낸 방법으로 점수를 기록하여 얻은 결과를 하기 표 36에 나타내었다.

[표 35]

[표 36]

이상의 실험 결과에서 치주 조직을 분해시키는 콜라세나제의 효소 활성을 억제시킬 수 있는 유백피와 녹차 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성을 억제시키는 큐르큐민, 쾨르세틴, 탁시폴린, 루틴 혹은 레스베라트롤, 치주 질환을 유발시키는 프로스타글란딘의 생성을 억세키시는 유지피를 함유한 본 발명 치약(실시예 26 내지 31)의 치주 질환 치료 효과는 1주일에서 6개월 경시까지 이들 약효제를 단독으로 함유한 비교예 1 내지 6보다 그 효능이 탁월한 것을 알 수 있다. 따라서, 약제를 모두 포함하는 경우가 효과가 상승된다는 것을 나타내었다.

비교예의 치은염 지수는 1개월 이후부터 기간이 경과함에 따라 지속적으로 상승되는 반면에, 본 발명에 의하여 개발된 치약을 사용시 치주 질환의 발생은 억제되어 치은염 지수가 시간이 경과하더라도 현저히 감소되는 것으로 나타났다.

실험예 9: 본 발명 연고 조성물(실시예 32 내지 37)의 항염증 효능, 효과에 대한 동물 실험

본 발명 연고 조성물의 임상 실험 방법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

체중 200 내지 250 g의 위스타 웅성 랫트를 실험군과 비교군으로 나눈 후 에테르로 가볍게 마취하였다. 랫트 오른쪽 뒤 발바닥에 캄플리트 프론드 어져번트(Complete Freynd's adjuvant)를 주사하여 실험대상군으로 설정하고 0.1 ㎖의 유동 파라핀을 주사한 군을 대조군으로 정하였다. 주사 5일후부터 19일째까지 실험 대상군 쥐의 오른쪽 뒷발바닥에 실시예 연고 조성물(실시예 32 내지 37)과 비교예 연고 조성물(비교예 7 내지 12)을 이틀 간격으로 같은 시간에 바른 후 초기, 10, 20일째에 측정된 족두께를 대조군과의 %로 나타내어 그 결과를 하기 표 37에 나타내었다.

[표 37]

이상의 실험 결과에서 치주 조직을 분해시키는 콜라게나제의 효소 활성을 억제시킬 수 있는 유백피와 녹차 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성을 억제시키는 큐르큐민, 쾨르세틴, 탁시폴린, 루틴 및 레스베라트롤, 치주질환을 유발시키는 프로스타글란딘의 생성을 억제시키는 유지피를 함유한 본 발명 연고 조성물(실시예 32 내지 37)의 족부종 발생의 억제 효과는 1주일에서 1개월 경시까지 비교예 7 내지 10보다 그 효능이 탁월한 것으로 나타났다.

비교예의 족부종은 5일 이후부터 기간이 경과함에 따라 지속적으로 상승되는 반면에, 본 발명에 의하여 개발된 연고 조성물을 사용시 족부종의 발생은 억제되어 시간이 경과하더라도 현저히 감소되는 것으로 나타났으며, 3가지 억제제를 동시에 함유한 연고 조성물이 각각 단독 혼합한 연고 조성물에 비하여 항염증에 대한 탁월한 상승 효과가 있는 것으로 나타났다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 약제 조성물은 치주 질환, 항염증 치료 효과가 탁월하다. 또한, 본 발명의 약제 조성물은 콜라게나제, 나이트릭 옥사이드, 슈퍼옥사이드, 프로스타글란딘, 인터루킨-1β 및 종양 괴사 인자 생성을 억제하는 효과가 우수하다. 따라서, 이러한 효능과 관련된 치주 질환, 상처, 암전이, 류마토이드 관절염, 염등, 부갑상선항진증, 당뇨병, 각막 궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 주름, 여드름, 에이즈, 화상, 동맥 경화, 골절과 같은 질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

유백피 및 녹차로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질 금속 단백질분해 효소 활성 억제제;

쾨르세틴, 루틴, 탁시폴린, 캠프페롤, 미리세틴, 큐르큐민, 레스베라트롤, 아레콜린, 아피제닌, 우고닌, 루테오린 및 텍토리제닌으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성 억제제; 및

유지피, 오수유 및 위령선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로 스타글란딘 생성 억제제

를 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 기질 금속 단백질 분해 효소 활성 억제제, 나이트릭 옥사이드와 슈퍼옥사이드 생성억제제 및 프로스타글란딘 생성 억제제의 양이 전체 조성물 중량에 대하여 각각 0.0001 내지 5 중량%인 조성물.