KR100847348B1 - 효소 합성법에 의한 데옥시구아노신의 효율적 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N-데옥시리보실트란스퍼라제 (NDT, N-deoxyribosyltransferase)와 아데노신 데아미나제 (ADD, adenosine deaminase)를 순차적으로 사용하는 2단계 효소합성법에 의한 2'-데옥시구아노신 (2'-deoxyguanosine)의 효율적 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 신규한 NDT 효소와 유전적으로 개량된 ADD 효소를 ADD 유전자 발현의 최적화 조건에서 사용함으로써 2'-데옥시구아노신을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

2'-데옥시구아노신, N-데옥시리보실트란스퍼라제, 아데노신 데아미나제

Description

효소 합성법에 의한 데옥시구아노신의 효율적 생산방법{Improved enzymatic production of deoxyguanosine}

도 1은 본 발명의 Lactobacillus gasseri 유래 NDT 효소의 아미노산 서열(도 1의 아랫 서열)을 Lactobacillus leichmannii 유래 NDT 효소의 아미노산 서열(도 1의 윗 서열)과 비교한 도면.

도 2는 카나마이신 저항성 유전자를 마커로 하고(E. coli HB101/pBSK-GAL-ADD-Kn) 효모 추출물을 유일한 질소원으로 한 5 L 발효조 배양 결과도.

도 3은 탄소원으로 포도당 대신 글리세롤을 사용하여 도 2와 동일한 조건에서 5 L 발효조 배양한 결과도.

도 4는 도 2의 E. coli HB101 균주의 배양 도중에 프롤린, 류신 및 이소류신을 추가로 첨가한 경우의 5 L 발효조 배양 결과도.

도 5는 포도당이 1-2 g/L로 유지되도록 간헐적으로 추가 공급한 5 L 발효조 배양의 결과도(새로 형질전환시킨 균주를 사용한 경우).

도 6는 포도당이 1-2 g/L로 유지되도록 간헐적으로 추가 공급한 5 L 발효조 배양의 결과도(도 2에서 사용한 균주를 사용한 경우).

도 7은 포도당이 5-10 g/L로 유지되도록 간헐적으로 추가 공급한 5 L 발효조 배양의 결과도.

도 8은 E. coli BL21 균주를 사용하여 최소배지에서 아미노산의 추가 공급 없이 5 L 발효조 배양한 결과도.

도 9는 E. coli HB101 균주를 사용하여 프롤린만 추가 공급된 5 L 발효조 배양 결과도.

도 10은 E. coli HB101 균주를 사용하여 프롤린과 포도당이 추가 공급된 5 L 발효조 배양의 결과도.

도 11은 E. coli HB101 균주를 사용하여 프롤린이 추가 공급된 300 L 발효조 배양의 결과도.

도 12는 E. coli BL21 균주를 사용하여 효모 추출물이 10 g/L로 감소된 배지에서 아미노산의 추가 공급 없이 5 L 발효조 배양한 결과도.

도 13은 E. coli BL21 균주를 사용하여 효모 추출물은 10 g/L로, 포도당은 10 g으로 각각 줄인 배지에서 포도당이나 아미노산의 추가 공급 없이 300 L 발효조 배양한 결과도.

도 14는 ADD의 기질과 억제물질들의 분자구조도.

도 15는 error-prone PCR 기법을 이용하여 생성된 ADD 변이체 중 DAPDR에 대한 기질특이성이 큰 ADD 변이체를 선발하기 위한 전략의 모식도.

도 16은 DAPDR 농도에 따른 대장균 Sφ3834의 성장을 비교한 사진.

도 17은 코포마이신 농도에 따른 대장균 Sφ3834의 성장을 비교한 사진.

도 18은 퓨린 리보시드 농도에 따른 대장균 Sφ3834의 성장을 비교한 사진.

본 발명은 N-데옥시리보실트란스퍼라제 (NDT, deoxyribosyltransferase)와 아데노신데아미나제 (ADD, adenosine deaminase)를 순차적으로 사용하는 2단계 효소합성법에 의한 2'-데옥시구아노신 (2'-deoxyguanosine)의 효율적 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 신규한 NDT 효소와 유전적으로 개량된 ADD 효소를 ADD 유전자 발현의 최적화 조건에서 사용함으로써 2'-데옥시구아노신을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

종래의 2'-데옥시리보뉴클레오시드 (2'-deoxyribonucleoside)의 제조법으로는 화학합성법과 가수분해법이 알려져 있지만 비용과 효율면에서 실용화하기에는 한계가 있었던 바[J. Mol. Catal. B: Enzymatic 10: 215-222 (2000년)], 이들 방법을 대체하기 위한 효소합성법이 최근 개발되고 있다.

효소합성법의 예로는, (1) 미생물 유래의 뉴클레오시드 포스포릴라제 (nucleoside phosphorylase)에 의한 트란스글리코실레이션 (transglycosylation) 반응을 통해 2'-데옥시유리딘 (dUR, 2'-deoxyuridine)과 2,6-디아미노퓨린 (DAP, diaminopurine)을 2,6-디아미노퓨린-2'데옥시리보시드 (DAPDR, 2,6-diaminopurine-2'-deoxyriboside)로 전환한 다음, 여기에 아데노신데아미나제(ADD)에 의한 탈아미노 (deamination) 반응을 추가함으로써 2'-데옥시구아노신을 효율적으로 생산할 수 있는 방법[J. Mol. Catal. B: Enzymatic 10: 207-213(2000).], (2) Klebsiella pneumoniae 등의 미생물을 사용하여 2'-데옥시리보스-1-인산 (2'-deoxyribose-1-phosphoric acid)이나 그 염을 2,6-디아미노퓨린 (2,6-diaminopurine)과 반응시켜 DAPDR을 만든 다음, 순차적으로 ADD를 반응시켜 2'-데옥시구아노신을 얻는 방법[참조: 미국특허공보 6,197,552], (3) NDT를 사용하여 티미딘(thymidine)과 DAP로부터 DAPDR을 만들고 여기에 ADD를 다시 반응시켜 2'-데옥시구아노신을 얻는 방법[참조: 일본특허공보 3,729,712]이 알려져 있다.

효소 합성법은 비용이나 효율면에서 2'-데옥시구아노신의 공업적 생산을 가능케한 효과적인 방법임에는 틀림없으나, 화학합성법이나 가수분해법과는 달리 생물학적 촉매인 효소를 사용하는 만큼, 효소의 종류, 유래 및 아미노산 서열상의 미세한 차이, 플라스미드 컨스트럭트(construct), 숙주균주, 유전자 발현을 위한 배양 조건 등의 차이에 따라 최종산물인 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 수율과 안정적 생산에 큰 차이를 보이는 문제가 있다. 따라서, 효율적이고 안정적인 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 공업적 생산을 위해서는 (1) 활성이 강하고 안정적으로 발현하는 효소 유전자들을 탐색함과 아울러, (2) 이들 유전자가 안정적으로 발현될 수 있는 유전자 발현 시스템을 찾는 것이 선결과제이다.

상기 효소 합성법들은 효소 합성법에 의해 2'-데옥시리보뉴클레오시드를 공업적으로 생산할 수 있다는 가능성을 제시한 것으로 중요한 의의를 갖지만, 실용성 있는 공업적 생산을 위한 세부 조건에 대해서는 구체적으로 개시하고 있지 않다.

본 발명자들은 효소합성법에 의한 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 효율적 생산방법을 개발하기 위하여, (1) 티미딘과 DAP로부터 DAPDR을 합성하는 NDT 효소를 코딩하는 새로운 유전자를 발굴하고자 하였고, (2) 재조합 ADD를 대장균에서 발현시키는 경우, 플라스미드 상실(plasmid loss)이 일어나서 ADD 효소 활성이 급격히 감소하는 문제가 있는 바, 이러한 문제를 해결하기 위해, 대장균 ADD를 생산하는 재조합 균주에서 ADD 효소 유전자를 안정적으로 발현할 수 있는 방안을 규명하고자 하였으며, 또한 (3) 대장균 유래의 ADD는 아데노신(adenosine)에 대한 높은 기질특이성을 보이는 바, 이 효소의 생리적 기질이 아닌 DAPDR에 대해 활성이 증가된 ADD 변이체(variant)를 찾고자 하였다. 이상과 같은 노력 결과, 본 발명을 통해 얻어진 신규한 NDT 효소와 유전적으로 개량된 ADD 효소를, 후술하는 바와 같은 ADD 유전자 발현의 최적화 조건에서 사용함으로써 2'-데옥시구아노신을 효율적으로 생성될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제(NDT, deoxyribosyltransferase)와 아데노신 데아미나아제(ADD, adenosine deaminase)를 ADD 유전자 발현의 최적화 조건에서 순차적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 2단계 효소합성법에 의한 2'-데옥시구아노신의 효율적 생산 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 추가의 목적은, 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 공업적 생산에 필요한 티미딘과 DAP로부터 DAPDR을 합성하는 NDT 효소를 코딩하는 새로운 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 중간산물인 DAPDR에 대해 활성이 증가 된 ADD 변이 효소(ADD variant)를 발현하는 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명은, 일면에 있어서, N-데옥시리보실트란스퍼라제 (NDT, deoxyribosyltransferase)와 아데노신 데아미나제 (ADD, adenosine deaminase)를 순차적으로 사용하는 효소합성법에 의해 2'-데옥시구아노신을 공업적으로 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은, 다른 일면에 있어서, 상기 2'-데옥시구아노신을 제조함에 있어서 재조합 ADD를 대장균에서 발현시키는 경우에, 플라스미드 불안정성을 해결함과 아울러, 형질전환체로부터 ADD 효소 유전자를 안정적으로 발현할 수 있는 배양 조건을 제공한다.

본 발명은, 또 다른 일면에 있어서, 대장균 유래의 ADD 효소의 생리적 기질이 아닌 DAPDR에 대한 활성이 증가된 ADD 변이 유전자를 제공한다.

이하, 상기 각 발명에 대하여 나누어 상술한다.

가. NDT 효소의 신규 유전자 확보

본 발명에서는 현재 알려진 NDT 유전자와 비교적 유사성이 높은 유전자를, 염기서열에 대한 공공 데이터 베이스의 검색을 통하여 선별한 뒤, 이들 유전자를 대장균에서 발현시킨 다음, 알려진 NDT 효소와 활성을 비교하여 기지의 NDT 효소와 동등하거나 더 좋은 활성과 안정성을 갖는 염기서열을 찾는 방식을 채택하였다. L. gasseri 유래의 NDT 효소에 대한 유전자의 염기서열은 공공 데이터베이스에 밝혀져 있으나 NDT 효소로 annotation되어 있지 않으며 본 발명에서 개시된 방법에 의해 처음으로 NDT 활성이 있는 유전자로 증명되었다.

NDT 효소의 경우, 티미딘과 구아닌(guanine)을 기질로 하여 1단계 반응으로 2'-데옥시구아노신을 생성하는 것으로 알려져 있으므로, 이 방법에서 문제가 될 수 있는 구아닌의 낮은 용해도를 해결할 수 있는 방안을 강구한다면 공정의 간소화를 기할 수도 있을 것이다.

NDT는 트란스-N-데옥시리보실라제(trans-N-deoxyribosylase)로도 불리는 효소로서 Lactobacillus helveticus 균주에서 처음 발견되었고[참조: Biochem. J. 50: 383-397(1952년)], DRTase I 및 II의 두 종류의 동위효소가 알려져 있다. DRTase I은 두 퓨린(purine) 사이에서 데옥시리보스의 전달(transfer) 반응을 촉매하고, DRTase II는 퓨린 간, 피리미딘(pyrimidine) 간 또는 퓨린과 피리미딘 간 데옥시리보스의 전달 반응을 촉매한다. Lactobacillus leichmannii DRTase II는 이러한 전달 반응 뿐만 아니라, 수용체 염기(acceptor base)가 없을 경우 뉴클레오시드(nucleoside)를 염기와 데옥시리보스로 가수분해하는 활성도 가지고 있다. L. helveticus나 L. leichmannii 균주 유래의 DRTase II 효소는 수용체 염기에 대한 낮은 특이성(specificity)과 glycosyltransfer 반응 시 베타-아노머(β-anomer)만을 생성하는 입체 특이성(stereospecificity)을 가지고 있어, 많은 항바이러스(antiviral) 혹은 항암 뉴클레오시드 아날로그 합성에 이들 두 균주의 crude extract가 많이 사용되고 있다[참조: Antiviral Chem. Chemother 3: 153-156(1992년)].

현재까지 NDT 유전자는, L. leichmannii로부터 DRTase II를 코딩하는 유전자[참조: J. Biol. Chem. 271: 4978-4987(1996년)]와, L. helveticus로부터 DRTase I 및 DRTase II를 코딩하는 유전자[참조: J. Biol. Chem. 277: 14400-14407(2002년)]가 클로닝되어 있을 뿐이다.

따라서, 본 발명자들은 티미딘(thymidine)과 DAP로부터 DAPDR을 합성하는 NDT 효소를 코딩하는 새로운 유전자를 발굴하기 위하여 연구를 수행한 결과, L. gasseri로부터 새로운 NDT 유전자를 발견하기에 이른 것이다.

나. ADD 유전자의 발현 안정화

아데노신 데아미나제(ADD)는 아데노신(adenosine)의 탈아미노 반응을 촉매하여 이노신(inosine)을 생성하는 효소로서 원핵세포와 진핵세포에 고루 분포하는 효소이다. 인체 유래의 ADD는 질병과 관련하여 많은 연구가 이루어져 왔고, 다양한 미생물로부터 ADD가 분리, 정제되어 그 특성에 관한 연구가 이루어져 왔다.

그 연구 사례를 살펴보면, 원핵세포 생물의 경우, E. coli 유래의 ADD는 단량체(monomer)로서 분자량이 29,000이며 2mM CaCl₂, 50μM EDTA, 20% 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)의 조건에서 안정하다고 한다[참조: Meth. Enzymol. 51: 508-512(1978년)]. Bacillus cereus 유래 ADD는 단량체로서 분자량이 53,700이고 -20 ℃에서 상당히 안정한 반면 4 ℃에서는 불안정하고, 20mM 이상 농도의 KCl이 효소 활성 안정화에 요구된다고 한다[참조: Biochim. Biophys. Acta 884: 490-496(1986년)]. Klebsiella sp. LF1202의 경우는 분자량 26,000의 단량체로서 별다른 조치가 없어도 4 ℃에서 3주 정도 안정하다고 한다. Pseudomonas iodinum IFO 3558 유래 효소는 분자량 240,000으로서 15% 에탄올과 50mM Tris를 요구하며[참조: FEBS Lett. 86: 174-178(1978년)], Micrococcus sodonensis ATCC 11880 (수용성 및 막결합 형태)의 경우는 100 μg/ml 이하의 희석된 농도에서 냉동 시 특히 불안정하며, 효소 활성과 안정성에 마그네슘 이온을 요구한다[참조: Can. J. Biochem. 53: 344-353(1975년)]. Streptomyces sp. J-845S 유래 효소는 세포외 효소(extracellular enzyme)로서 이량체(dimer)구조이며, 분자량은 90,000이고 Fe³⁺에 의하여 활성이 증진된다[참조: J. Ferm. Bioeng. 71: 6-11(1991년)]. Aspergillus oryzae 유래 ADD도 세포외 효소이며 기질 특이성이 낮고 이량체 구조로서 분자량은 103,000이고, Zn-효소이나 별도의 Zn 첨가를 요구하지는 않는다[참조: J. Biochem. 58: 519-525(1965년)].

하등 진핵세포 생물인 Saccharomyces cerevisiae ADD는 척추동물 ADD와 달리 Zn를 요구하지 않으며 기질과 억제물질에 대한 특이성이 척추동물 ADD에 비해서 높은 편이다[참조: Biochim. Biophys. Acta 1122: 311-316(1992년)]. 무척추동물 ADD로는 Drosophila melanogaster 유래의 효소가 알려져 있고, 최근 아데노신 데아미나제-관련 생장인자(ADGF, adenosine deaminase-related growth factor)라는 ADD 활성을 나타내는 새로운 단백질이 발견되었는데 세포 밖으로 분비되는 것으로 알려졌다[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 4403-4408(2002년)]. 포유동물 ADD로는 인체 유래 ADD가 대표적이며 이는 Zn-효소이지만 활성화에 별도의 Zn 첨가는 불필요 하다고 한다[참조: Adv. Exp. Med. Biol. 76A: 223-234(1977년)].

그런데, 효소 합성법에 의한 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 생산은, NDT나 ADD 효소 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 숙주세포(예: 대장균)를 발효조에서 증식시키면서 이 과정에서 발현시킨 NDT나 ADD 효소를 배지 중의 기질과 반응시킴으로써 이루어지는데, 효소 유전자의 발현 과정에서 플라스미드 불안정성으로 인한 반응 수율의 저하가 문제되며, 이러한 플라스미드 불안정성은 플라스미드 construct 자체나 숙주세포, 배지 조성, 및 발효조건 등에 의해서 큰 영향을 받는다.

따라서, 본 발명에 의하여, 플라스미드 불안정성을 해소하여 ADD 유전자 발현을 안정화할 수 있는 항생제 저항성 마커 프로모터 및 숙주세포, 기타 배양조건을 제공하는 것이 가능하게 되었는 바, 플라스미드 불안정성의 문제는 항생제 저항성 마커를 앰피실린에서 카나마이신으로 교체하고 숙주세포를 영양요구성(auxotrophy) 균주로 사용함과 아울러, 급격한 유전자 발현을 유도하지 않는 GAL 프로모터와 같은 상시 발현 프로모터를 사용함으로써 해결할 수 있었고, 그 외 다양한 발효조건의 시험을 통하여 발효 최적 조건을 수립하였다. 또한 발효조 운용시험에서 나타난 발효 후반부에서의 ADD 효소의 활성 저하는 숙주세포를 E. coli BL21 균주로 교체함으로써 해결할 수 있었다.

다. ADD 효소의 개량

본 발명에 따른 효소합성법에 의한 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 생산 방식에 있어서, 최종산물인 2'-데옥시리보뉴클레오시드는 중간산물인 DAPDR이 ADD의 촉 매작용을 받아 탈아미노화(deamination)되면서 생성된다. 그런데, 대장균 유래 ADD 효소는 DAPDR보다는 아데노신에 대한 기질 특이성(substrate specificity)이 훨씬 크고, 대장균세포에서 과발현시의 플라스미드 불안정성을 유발하는 문제점이 있다.

따라서 본 발명에 의하여, 방향성 진화기술을 채용하여 DAPDR에 대한 기질 특이성이 증가된 ADD 효소 변이체를 만들고자 하였으며, 본 발명을 통해 이러한 특성을 구비한 몇 가지 ADD 유전자 변이체를 얻을 수 있었다.

이하 본 발명의 실시예에서 사용된 재료 및 방법으로서, 구체적 실시예에서 달리 특별히 명시하지 않은 경우에 채용된 재료와 방법들을 이용하였다.

1. ADD 효소 활성의 측정

기질로 사용되는 아데노신은 온도를 높이거나 pH를 중성으로 적정해야 용해되므로 15 mM의 아데노신을 NaOH로 적정한 뒤에 바로 Tris-Cl 완충용액을 첨가하여 아데노신 기질을 제조하였다(50 mM, pH 7.5). 몇몇 문헌에 의하면, ADD 활성은 기질에 의한 억제작용(substrate inhibition)을 받는 것으로 알려져 있으며, 효소량에 따라서도 변칙적인 동역학 행태(anomalous kinetic behavior)를 보인다[참조: Anal. Biochem. 122: 328-337(1982년)]. 따라서 아데노신 기질은 90 μM의 농도가 되도록 큐벳에 첨가하였고 이 때 265 nm에서의 흡광도는 약 1.2 정도의 값을 보였다. ADD 효소 활성은 25 mM Tris-Cl buffer 및 90 μM 아데노신을 함유한 1 ml의 반응용액에 5 ㎕의 세포 파쇄액을 첨가한 직후에 265 nm에서의 흡광도 감소 속도를 측정하여, 분당 흡광도 감소속도를 계산하여 얻었다.

2. HPLC를 사용한 NDT 효소 활성의 측정

NDT 효소 활성은 티미딘과 2,6-디아미노퓨린 (DAP, diaminopurine)을 사용하여 효소반응을 진행한 후, 반응산물인 DAPDR의 생성량을 HPLC로 정량하여 측정하였다. 티미딘과 DAP를 각각 50 mM, 10 mM 함유한 50 ml의 10mM Tris-Cl (pH 7.4) 완충용액 내에서 40℃의 반응온도를 유지하면서 1hr, 2hr, 6hr, 9hr, 20hr 간격으로 시료를 채취하여 분석하였다. HPLC 분석은 C-18 컬럼을 사용하여 water/methanol = 90:10의 혼합액을 분당 1 ㎖의 속도로 흘려주며 254 nm에서 용출액(elution)을 모니터하는 방식으로 하였다.

3. 세포의 파쇄

세포로부터 효소를 추출하기 위해 채용한 세포파쇄방법으로는 초음파분쇄법과 detergent 추출법 (B-PER II 추출 키트, Pierce)을 병행하였다. 이들 두 방법 간에는 큰 차이를 관찰할 수 없어서, 달리 명시하지 않은 경우, B-PER II 추출 키트를 사용하였다. 초음파분쇄(sonication) 조건은, 배양액 1 ml를 12,000 rpm에서 공지된 방법으로 원심분리하여 세포침전물을 회수한 뒤, 30초 간격으로 50 % duty cycle로 펄스를 주었으며, 다시 12,000 rpm에서 원심분리하여 세포 파편(cell debris)을 제거한 후 5 ㎕를 효소활성 측정에 사용하였다. B-PER II 추출 키트를 사용하는 경우, 배양액 1 ml를 12,000 rpm에서 원심분리하여 세포를 얻은 후, 그대로 150 ㎕의 B-PER II 추출 용액에 resuspend하거나 -70℃ 에 약 1 시간 동안 냉동시킨 후 B-PER II 추출 용액에 재현탁하는 두 경우를 사용하였고, 재현탁된 세포는 다시 1분간 와동(vortexing)을 거쳐 파쇄한 다음, 0.85 ㎖의 완충 용액으로 1 ㎖이 되도록 맞춘 후 12,000 rpm에서 원심분리하여 세포 파편을 제거한 뒤, 상층액 5 ㎕ 를 효소활성 측정에 사용하였다.

세포 파쇄액의 단백질 정량은 브래드포드(Bradford) 방법에 따랐으며 20 ㎕의 시료를 1 ml의 염료(dye) (Bio-Rad, 1/5로 희석)와 혼합하여 반응 후 595 nm에서의 흡광도를 측정하여 행하였다.

4. HPLC를 사용한 ADD 반응 역가 결정

ADD 효소 활성은 아데노신이 이노신(inosine)으로 변환되는 정도를 분광광도계법(spectrophotometry)으로 측정하거나, DAPDR의 감소 또는 2'-데옥시구아노신의 생성 정도를 HPLC 방법으로 각각 정량하여 구할 수 있다.

본 발명에서 채용한 방식은, DAPDR을 0.27 g/100 ml Tris-Cl (pH 7.4)의 농도로 준비하고 40 ℃로 유지하면서 공지된 방법으로 15분, 30분, 60분 간격으로 시료 채취하여 분석하였다. HPLC 조건은 C-18 컬럼을 사용하여 water/methanol = 90/10의 혼합액을 분당 1 ml의 속도로 흘려주며 254 nm에서 용출액을 모니터하였다.

5. DNA 조작

일반적인 DNA 조작은 Sambrook 등 [참조: Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Harbor Lab. Press, 1989, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 따랐으며, 서브클로닝에 필요한 DNA는 아가로스 겔 전기영동 후 잘라내어 겔 추출 키트(Viogene)를 사용하여 정제한 뒤 사용하였다. 염색체 DNA는 DNA Isolation Kit (Roche Applied Sciences)를 사용하여 준비하였고, 올리고뉴클레오타이드는 Genotech사에 의뢰하여 합성하였다. DNA 서열분석은 자동 DNA 서열분석기 (Model 373A, Applied Biosystems)를 사용하였으며, 일반적인 DNA 서열분석에는 DNASTAR 프로그램을 사용하였다. PCR 반응은 Pfu 중합효소(Stratagene사 제품)를 사용하여 94 ℃ 3분, 94 ℃ 30 초/55 ℃ 30초/72 ℃ 1분 cycle의 25회 반복, 그리고 72 ℃ 5분의 프로그램을 사용하였다. 대장균에 대한 형질전환(transformation)은 "Simple and Efficient Method" (SEM) 방법 [참조: Gene 96: 23-28(1990년)]에 준하여 하였다.

6. Error-prone PCR에 의한 방향성 진화(directed evolution)

ADD 유전자의 무작위 돌연변이유도 (random mutangenesis) 방법으로 error-prone PCR 법을 사용하였다. 주형으로 사용할 ADD 유전자를 pGAL-ADD 벡터의 GAL 프로모터로부터 위치하는 프라이머인 GAL 100과 벡터의 multi-cloning site에 위치하는 T7 프라이머를 이용하여 증폭하였다. Clontech사의 PCR random mutagenesis kit를 이용하여 약 1kb의 ADD 유전자 부위를 4 - 5개의 염기서열을 무작위적으로 돌연변이를 일으키는 조건에서 수행하였다. PCR 조건은 DNA를 94℃에서 3분간 정치한 후 94℃에서 30초, 68℃에서 1분간 30 cycle을 반복하였고 68℃에서 1분간 정치한 후 증폭산물을 얻어내었다. PCR 증폭산물은 아가로스 겔 키트를 이용하여 정제하였다.

7. 발효 배양

플라스미드를 함유하는 재조합 대장균 균주는 100 ㎍/ml의 암피실린(ampicillin)이나 50 ㎍/ml의 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 배지 (효모 추출물 5 g/ℓ, 트립톤 10 g/ℓ, NaCl 5g/ℓ) 혹은 TB (Terrific Broth) (효모 추 출물 24 g/ℓ, 트립톤 12 g/ℓ, 글리세롤 4ml/ℓ)에서 배양하였고, 발효조를 사용한 발효시험의 경우 기본 배지로서 포도당 15 g/ℓ, Na₂HPO₄??12H₂O 5 g/ℓ, KH₂PO₄ 3 g/ℓ, (NH₄)₂SO₄ 10 g/ℓ, MgSO₄ 2 g/ℓ, 효모 추출물 30 g/ℓ, NaCl 0.5 g/ℓ, 2ml/ℓ를 사용하였고 효모 추출물(yeast extract)나 soytone은 공업용을 사용하였다.

<실시예>

이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 기술한 것으로서 발명의 내용 및 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: NDT 효소의 신규 유전자의 클로닝

현재 티미딘으로부터 DAPDR을 생산하는데 사용하는 NDT 효소는 Lactobacillus leichmannii 유래의 유전자를 대장균에서 발현시킨 것이다. 따라서 본 발명자들은 공공 데이터베이스에 발표된 모든 염기서열을 검색하여 L. leichmannii 유래의 NDT 유전자와 비교적 유사성이 높은 유전자들을 선별한 뒤, 이들 각각의 유전자를 대장균에서 발현시킨 다음, Lactobacillus leichmannii 유래의 NDT 효소와 활성을 비교함으로써 DAPDR 생성능력이 향상된 신규 NDT 효소 유전자를 확보하고자 하였다.

공공 데이터베이스를 검색한 결과, Lactobacillus helveticus, Oenococcus oeni에서는 NDT와 유사한 효소가 2개씩 발견되었으며 Lactobacillus gasseri에서도 NDT로 추정되는 유전자가 발견되었다. 염기서열을 기초로 유추된 아미노산 서열을 L. leichmannii 유래의 NDT 효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, Lactobacillus helveticus 유래의 첫 번째 NDT 효소는 27.4%, 두 번째 NDT 효소는 81.5%, Oenococcus oeni 유래의 첫 번째 NDT 효소는 25.5%, 두 번째 NDT 효소는 40.9%, 그리고 Lactobacillus gasseri 유래의 NDT 효소는 77.1%의 유사도를 나타내었다. 아미노산 서열간의 유사도는 매우 다양하였으나 NDT 효소의 활성에 필요한 부위는 공통적으로 존재함을 확인하였다. 각각의 유전자를 확보하기 위하여 유전자 은행으로부터 각각의 균주를 분양받은 후 genomic DNA를 추출하였으며 이들 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 다음(서열번호 1-10)과 같으며 발현벡터 제작에 용이하도록 제한효소 인식부위를 첨가하여 제작하였다.

(1) Lactobacillus gasseri NDT 유전자 클로닝을 위한 프라이머

gNDTf : 5'-GGGGAATTCCATGACAAAACAAAAGAC-3'(서열번호 1)

gNDTr : 5'-CCCCTCGAGTACCAGCTTATTTTTATC-3'(서열번호 2)

(2) Lactobacillus helveticus의 첫번째 NDT 유전자 클로닝을 위한 프라이머

hNDT1f: 5'-GGGGAATTCTTATGAAAGCAGTAGTTCC-3'(서열번호 3)

hNDT1r: 5'-CCCCTCGAGATTAAGAAATTGCTTATTG-3'(서열번호 4)

(3)Lactobacillus helveticus의 두번째 NDT 유전자 클로닝을 위한 프라이머

hNDT2f: 5'-GGGGAATTCTTATGAACAAGAAAAAGAC-3'(서열번호 5)

hNDT2r: 5'-CCCCTCGAGATAGGTCATTTAGTTTGC-3'(서열번호 6)

(4)Oenococcus oeni 첫번째 NDT 유전자 클로닝을 위한 프라이머

oNDT1f: 5'-GGGGATATCAGATGAATATGGCAAAGA-3'(서열번호 7)

oNDT1r: 5'-GGGGATATCTAATTAATTATATTAAACG-3'(서열번호 8)

(5)Oenococcus oeni 두번째 NDT 유전자 클로닝을 위한 프라이머

oNDT2f: 5'-GGGGAATTCACATGAATAAAGTTTATTT-3'(서열번호 9)

oNDT2r: 5'-GGGCTCGAGCCGCTTTAATCGCGATGCC-3'(서열번호 10)

위와 같이 얻은 PCR 산물들을 ADD 유전자 발현에 사용한 pGAL-ADD벡터에 각각 도입하여 발현 벡터를 제작한 후 염기서열 분석을 통하여 진정한 클론임을 확인하였다.

실시예 2 : 신규 NDT 유전자의 발현 및 활성 확인

현재 DAPDR 생산에 사용하는 NDT 발현 벡터는 pGAL-ADD 백터와는 다른 벡터를 사용하기 때문에 상기 실시예 1에서 확보한 유전자들의 효소 활성을 L. leichmannii 유래의 NDT 효소와 동일한 조건에서 비교하기 위하여, L. leichmannii 유래의 NDT 유전자를 pGAL-ADD 벡터의 GAL10 프로모터 뒤에 삽입한 pGAL-NDT 벡터를 제작하였다. 이들 각각의 벡터를 대장균 DH5α균주에 도입하여 발현시킨 후 OD₆₀₀= 1에 해당하는 균체를 회수하여 50mM 티미딘, 10mM DAP와 37℃에서 반응시켰다. 반응물로부터 시료를 15분 간격으로 채취하여 HPLC 분석을 통하여 생성된 DAPDR양을 비교하였다.

O. oeni와 L. helveticus 유래의 NDT2로 명명한 효소에서는 NDT 효소 활성이 거의 나타나지 않은 반면에, NDT1로 명명한 효소들에서는 NDT 효소 활성을 확인할 수 있었다. 그러나 L. leichmannii 유래의 NDT 효소와 활성을 비교 하였을 경우 L. gasseri 유래의 NDT를 제외하고는 상대적으로 낮은 효소 활성을 나타내었다.

L. gasseri 유래의 NDT 효소는 동일한 조건에서 비교하였을 경우 L. leichmannii 유래의 NDT 효소와 거의 유사한 활성과 안정성을 나타내었다. L. gasseri 유래의 NDT 효소의 유전자의 염기서열은 공공 데이터베이스에 밝혀져 있으나 NDT 효소로 annotation되어 있지 않으며 본 연구에서 처음으로 NDT 활성이 있는 유전자로 증명되었다. 또한 본 연구에서 클로닝한 L. gasseri 유래 NDT 효소의 아미노산 서열은 알려진 서열과 두개의 아미노산이 상이함을 확인하였다(도 1의 아랫 서열, 서열번호 11).

실시예 3: ADD 유전자의 발현 안정화

ADD 발현의 안정성을 조사하기 위하여 유도성 발현계(inducible expression system)인 pET-ADD 플라스미드와 상시 발현계(constitutive expression system)인 pBSK-GAL-ADD 플라스미드의 안정성을 조사하였다.

pET-ADD 플라스미드의 경우, 숙주세포로 BL21(DE3)와 BL21(DE3)(pLysS) 균주를 사용했는데, 이들을 LB 배지에 배양하여 IPTG로 유도(induction)했을 때 각각 1.71과 1.20의 효소활성을 보였다. 특기할 것은 IPTG 유도를 하지 않았을 경우에도 각각 0.66 및 0.61의 비교적 높은 효소활성을 보였는데 이는 LB 배지 성분에 IPTG와 유사한 유도자(inducer) 역할을 하는 물질이 존재하는 것에 기인하는 것으로 추정된다. 이 중 pET-ADD/BL21(DE3)(pLysS) 조합의 4개의 형질전환체(transformant) 를 무작위로 골라 LB 배지에서 배양한 후 효소활성을 측정하고, 이를 다시 LB 배지에 접종하여 계대배양 후 활성을 측정한 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 형질전환체 간에도 차이가 심했으며, 계대배양 후 활성이 급격히 떨어지는 경향을 보였다. 이는 LB 배지에서 별도의 유도를 하지 않아도 상당히 많은 양의 ADD가 발현되고 이 발현이 숙주세포의 성장을 방해하기 때문이라고 판단되었다.

pET-ADD/BL21(DE3)(pLysS) 형질전환체 간의 활성 및 계대 간 활성 차이

	1차배양		2차배양
	OD	활성	OD	활성
#1	5.4	0.61	5.1	0.10
#2	5.3	0.50	5.1	0.10
#3	5.0	0.15	4.7	0.05
#4	5.5	0.46	5.0	0.08

한편, pBSK-GAL-ADD 플라스미드의 경우, 별도의 유도를 요하지 않는 항시적 발현시스템이므로 BL21을 숙주세포로 하고 배지를 LB 및 TB (Terrific Broth)를 사용하여 (20 ml 배지/250 ml 플라스크) 각각의 활성을 조사한 결과, 역시 [표 2]와 같이 세포 성장이 좋은 TB 배지의 경우에 그렇지 않은 LB 배지의 경우보다 ADD 효소 활성의 발현이 저조한 결과를 나타내었다. 한편, pET-ADD를 TB에 배양하였을 경우에는 OD=11에 Act=0.06을 보였다.

	OD	활성
LB	4.1	1.41
TB	7.8	0.40

상기 [표 1, 2]의 두 사례에서 볼 수 있듯이 ADD 효소의 발현은 숙주세포 성장에 유해한 것으로 보인다. 유해한 단백질이 과량 발현될 경우 플라스미드 상실(plasmid loss)이 생기고, 플라스미드를 상실한 세포는 상대적으로 성장속도가 빨라 발효 후반부에 이르면 ADD를 발현하지 않는 세포만 남게 되는 것이다.

플라스미드의 유지에 필요한 선발 마커(selection marker)로 가장 많이 사용하는 암피실린을 사용하는 경우 이러한 문제가 두드러질 수 있다. 이는 암피실린을 분해하여 저항성을 갖도록 하는 저항성 마커로 사용되는 베타-락탐아제(β-lactamase)는 분비성 효소로서 발효가 진행됨에 따라 점점 더 많은 양의 암피실린을 분해하게 되는 데에 기인한다. 또한 암피실린은 세포벽 합성을 저해함으로써 항균활성을 보이게 되므로 성장 중인 세포에 대해서만 항균활성을 보이는 제약이 있다. 이러한 경우 카나마이신을 사용하는 경우가 있는데 이 항생제는 세포 내에 이송되어 작용하며 성장하고 있지 않는 세포에도 활성을 보이는 차이점이 있다.

따라서 ADD 발현이 세포에 유해하고 이로 인하여 플라스미드 상실이 발생함으로써 ADD 발현이 불안정한지 여부를 조사하기 위하여, ADD발현 벡터 상의 암피실린 저항성 유전자를 카나마이신 저항성 유전자로 교체하여 ADD 발현의 안정성에 미치는 영향을 조사하였다.

카나마이신 저항성 유전자를 얻기 위해 pUC4K 플라스미드를 SalI으로 처리하고, Klenow 중합효소로 fill-in하여 평활말단으로 만든 1.2 Kb insert를 얻은 다음, 이를 pBSK-GAL-ADD의 암피실린 저항성 유전자 내부에 있는 ScaI 부위에 삽입하여 pBSK-GAL-ADD-Kn을 제조하였다. 이 플라스미드를 HB101과 DH5α 균주에 각각 형질전환시켜 ADD 활성이 발현됨을 확인한 다음, 이들 중 1, 3, 7번의 HB101 형질전환주와 9번의 DH5α 형질전환주를 사용하여 각각 LB 및 TB 배지에서 5 ml 시험관 배양을 하고 이어서 1/100로 희석하여 20 ml/250 ml 플라스크에 계대배양하면서 효소 활성을 조사하였다. [표 3]에 나타난 바와 같이, 상기의 카나마이신 저항성 유전자를 갖는 벡터는, 암피실린 저항성 유전자를 갖는 벡터와 달리, TB 배지에서 빠른 세포 성장을 보일 때에도 효소 활성의 저하가 두드러지지 않음을 보여주었다.

		LB		TB
		OD	활성	OD	활성
5ml 시험관 배양	#1	3.0	1.34	10.6	4.20
	#3	3.7	1.38	8.1	2.64
	#7	3.4	1.41	11.6	3.84
	#9	2.3	0.21	4.8	4.29
20ml 플라스크 배양	#1	8.5	1.50	20.3	2.73
	#3	9.5	0.78	23.1	3.43
	#7	7.9	1.10	24.1	4.14
	#9	6.0	0.15	26.2	2.34

또한 DH5α와 HB101의 각 숙주세포 내 균주간의 변이를 조사하기 위하여 이들 각 숙주세포별로 상기 pBSK-GAL-ADD-Kn 플라스미드 construct를 가지는 5개의 콜로니를 무작위로 선별한 후 활성을 조사한 결과, [표 4]와 같이 숙주세포 내 균주 간의 편차는 비교적 심하지 않은 것으로 나타났다.

	DH5α	HB101
1	2.3	1.9
2	1.1	1.9
3	1.0	2.6
4	1.0	1.1
5	1.3	1.4

DH5α와 HB101는 영양요구성 균주이기 때문에, 영양요구성이 아니면서 재조합 단백질 생산에 가장 많이 사용되는 균주 중 하나인 BL21 균주의 장점을 활용할 수 있는 가능성을 조사하기 위하여, 상기의 pBSK-GAL-ADD-Kn 플라스미드 construct를 다시 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS 균주에 형질전환하고 각 균주별로 5개의 콜로니를 무작위로 선별하여 활성을 조사하였다. ADD 활성은 [표 5]에 표시한 바와 같이 균주 간에 매우 균일한 분포를 보였다.

	BL21(DE3)	BL21(DE3)pLysS
1	1.1	0.00
2	0.9	0.46
3	1.2	0.40
4	1.1	0.47
5	1.3	0.41

또한 상기의 pBSK-GAL-ADD-Kn 플라스미드 construct를 BL21 균주에 형질전환한 다음, 10개의 콜로니를 무작위로 선별하여 평면배지(plate)에 계대하며 ADD 활성을 조사한 결과, [표 6]과 같이 안정적인 발현 양상을 보였다.

BL21	원균주	1차계대
1	1.4	2.6
2	1.8	2.4
3	1.2	3.1
4	1.3	2.5
5	1.4	3.3
6	1.9	2.1
7	1.8	3.5
8	2.0	2.9
9	1.3	3.4
10	1.9	3.4

한편, 카나마이신 저항성과 아울러, 류신 영양요구성(leucine auxotrophy)에 의한 selection force를 추가함으로써 플라스미드 안정성을 향상시킬 수 있는지 조사하기 위하여, HB101의 류신 영양요구성을 효모 Hansenula polymorpha 유래의 류신 생합성 유전자인 LEU2 유전자 (HLEU2)로 complementation할 수 있도록 새로운 발현 벡터를 제조하였다. 즉, pBSK-GAL-ADD로부터 GAL-ADD 절편을 BamHI 및 SalI으로 잘라내어 Klenow 중합효소로 처리하여 평활말단화한 다음, HLEU2 유전자와 카나마이신 저항성 마커를 가지고 있는 벡터, pKLG6048를 EcoRI/Klenow로 처리하여 평활말단화시킨 뒤 EcoRI 부위에 삽입하였다. 이 때 삽입된 절편은 2가지 방향성을 가질 수 있는데, HLEU2 및 카나마이신 저항성 마커의 전사 방향과 같은 방향성(polarity)을 갖는 표 7의 균주 #9와 반대의 방향성을 갖는 표 7의 균주 #8로부터 각각 세 콜로니를 선별하여 효소 활성을 조사하였다. [표 7]에 나타난 바와 같이, ADD 효소 활성은 전반적으로 낮은 편이었는데, 균주 #8이 균주 #9보다는 높은 활성을 보였다.

	균주	활성
반대극성 (opposite polarity)	#8-1	0.77
	#8-2	0.56
	#8-3	0.31
동일 극성 (same polarity)	#9-1	0.32
	#9-2	0.22
	#9-3	0.56

이 중 #8-1번 균주를 사용하여 콜로니 간의 편차를 조사한 결과, 0.81 - 0.94 사이의 매우 균일한 효소 활성 분포를 보였는데, 이 결과는 LB 배지에서 류신 complementation 없이 얻은 값이므로 만약 추후 류신 complementation까지 작동되도록 할 경우 더욱 균일한 값을 얻을 수 있을 것으로 기대되었다.

한편, 플라스미드 안정성을 유지하기 위한 항생제 저항성 마커로서 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항성 유전자를 이용할 수 있는지 알아보기 위해, pBC 벡터를 근간으로 클로람페니콜 저항성 마커를 가지는 발현 벡터를 제조하여 조사하였다. pBC KS(+)의 MCS의 BamHI/SalI 위치에 GAL 프로모터에 연결된 ADD 유전자를 삽입하여 제조한 플라스미드 construct가 플라스미드 안정성에 미치는 효과를 조사한 결과, 균주간의 편차는 적었으나 (예 : 0.33/0.30/0.32/0.29/0.37/0.26/0.29/0.30) ADD 활성은 전반적으로 저조한 결과를 보였다.

실시예 4: ADD 유전자 발현 최적화를 위한 발효조 운용시험

도 2는 암피실린 대신 카나마이신 저항성 유전자를 선발 마커로 대체한 플라스미드로 형질전환한 균주(E. coli HB101/pBSK-GAL-ADD-Kn)를 동물성 질소원(nitrogen source)인 펩톤(peptone) 대신 효모 추출물(yeast extract)만을 질소원으로 30 g/L 첨가한 배지를 사용하여 5 L 발효조에서 배양한 결과도이다.

접종용 배지(seed media)는 LB/kan 배지로 했고, 기본배지(main media)는 기본배지 1 리터 당, 포도당 15 g; Na₂HPO_4˙12H₂O 2 g; KH₂PO₄ 1 g; (NH₄)₂SO₄ 10 g; MgSO₄ 2 g; 효모 추출물 30 g; NaCl 0.5 g; 미량원소(trace element) 2 ml; 50 mg/ml 카나마이신 2 ml를 각각 포함하며, 배양조건은 37 ℃, pH 7.0였다.

ADD의 발현은 지수생장(exponential growth) 말기에 개시되어 약 5 U/ml까지 급속히 증가했다가 다시 급속하게 떨어지는 경향을 보였다. 최초 배지의 포도당이 모두 소비된 시점에 포도당을 5 g/L/h로 추가 공급(feeding)하였는데, 공급 후 약 2시간 이후부터 포도당이 배지 내에 축적되는 현상을 보였다. 이는 포도당으로부터 생성되는 부산물의 영향일 가능성이 있어, 도 3의 실험에서는 탄소원으로 포도당 대신 글리세롤을 사용하여 보았다. 탄소원을 글리세롤로 대체한 것 외에는 도 2와 동일한 균주(E. coli HB101/pBSK-GAL-ADD-Kn), 배지조성, 배양온도 및 pH에서 배양하였다. 도 3의 결과에서 보는 바와 같이, 균주는 글리세롤을 기질로서 섭취를 하지 못하고 효모 추출물에 있는 탄소원으로만 성장을 하여 균체의 성장이 7 OD까지만 증가하였으며, ADD의 활성은 배양 초기부터 발현되기 시작하여 약 2.5 U/ml까지 증가하다가 이 후 서서히 감소하는 경향을 보였다. 이는 HB101 균주가 글리세롤을 효율적인 탄소원으로 사용하지 못함에 기인하는 것으로 추정되었다

문헌에 의하면 E. coli HB101 균주는 프롤린 및 류신 영양요구주로서, 고농도 배양을 위해서는 프롤린, 류신, 이소류신(isoleucine)의 첨가가 필요하다고 보고되어 있고, 특히 동물성 배지인 펩톤을 사용하지 아니하는 경우에 더욱 문제가 될 수 있으므로, 상기 3 종류의 아미노산을 도 4에 나타낸 바와 같이 각각 1g씩 첨가하여 배양하였다. 기본배지조성 중 Na₂HPO_4˙12H₂O와 KH₂PO₄는 도 2의 경우와 달리 각각 5 g과 3 g으로 하였으나, 균주, 배양온도 및 pH는 도 2와 동일하며, 아미노산 추가 공급은 도 4에 표시한 것처럼 포도당 추가 공급 개시 시점에 행하였다. 도 4의 결과도에서 보는 바와 같이, 최초 배지의 포도당이 고갈된 후 포도당을 5 g/L/hr의 속도로 연속 공급하여도 배지 내에 포도당이 축적되는 현상은 나타나지 않았고, ADD 활성의 발현도 8 U/ml까지 증가하였으며, 그 이후의 ADD 효소 활성의 감소 경향도 도 2의 경우와는 달리 완만해진 것으로 나타났다.

도 5는 도 2, 3, 및 4에서 포도당을 연속적으로 공급한 방식과 달리, 최초 배지의 포도당이 소모되기 전에 간헐적으로 포도당을 추가 공급하여 포도당이 1-2 g/L로 유지되도록 한 경우, ADD의 발현 양상을 보여주는 결과도이다. 포도당의 간헐적 추가 공급을 제외한 배지조성 및 배양조건은 도 4의 경우와 동일하게 하였다. 도 5의 결과에서 보여주는 것처럼, 도 2, 3, 및 4에서와 같은 ADD의 감소가 눈에 띄지 않았지만, ADD의 활성은 4 U/ml에 불과하였으며, 균체의 성장도 도 2 및 3과 상당히 다르게 나타났다. 그 원인은 새로이 형질전환된 형질전환주를 사용한 것에 기인하는 것으로 추정되었다.

따라서, 도 2 및 3에서 사용했던 균체를 사용하여 도 5에서와 동일한 조건에서 재실험하였다. 도 6의 결과에서 보는 바와 같이, ADD의 활성은 6 U/ml까지 증가하다가 다시 감소하는 경향을 보였으며, ADD 활성의 발현은 도 4에서의 포도당의 연속적 공급방식보다 개선되지는 않았다.

도 7은 도 6과 마찬가지로 포도당을 간헐적으로 공급하되, 잔존 포도당의 농도가 5-10 g/L로 유지되도록 추가 공급량을 늘린 배양 결과도이다. 그 외 배지조성 및 배양조건은 도 6과 같다. 상기 도 6의 경우와 달리, 배양 개시 후 12시간까지는 ADD의 활성이 거의 나타나지 않다가, 12-16시간 사이에 급증하여 약 10 U/ml까지 증가하였다. 그러나 여전히 발효 후반부에 ADD 활성이 저하되는 문제점이 있었다.

이러한 문제점을 개선하기 위하여, 프롤린 및 류신 영양요구성 균주인 E. coli HB101 균주 대신에 ADD 발현의 숙주균주로서 E. coli BL21 균주를 사용함과 아울러, 도 7의 배양 배지로부터 프롤린, 류신, 이소류신과 complex media인 효모 추출물을 제외시킨 최소배지(minimal media)에서 균주를 배양하였다. 도 8의 배양 결과도와 같이, 균체의 성장은 100 OD까지 증가하였으며, ADD의 활성은 최초 배지의 포도당이 고갈되는 시점에 나타나기 시작해서 이 후 급격히 증가한 뒤 약 2.5-3 U/ml 수준을 계속 유지하였다. 즉, E. coli HB101과는 달리, 발효 후반부에도 ADD의 활성이 상당히 안정적으로 유지되었다.

한편, 카나마이신 저항성에 류신 영양요구성을 selection force로 추가함으로써 플라스미드 안정성이 향상되는지 조사하기 위해, 벡터 pKLG6048-GAL-ADD-Kn으로 형질전환된 HB101 균주를 사용하여, 앞서의 배양과 달리, 류신과 이소류신을 첨가하지 않고 프롤린만 첨가한 5 L 배양을, 도 8의 경우와 원칙적으로 동일조건에서 행하였다.

도 9의 결과도에서 보는 바와 같이, 최초 배지의 포도당이 고갈된 뒤 포도당을 8 g/L/hr의 속도로 연속적으로 공급하여도 포도당 축적은 일어나지 않았으며, ADD의 발현은 도 8과 유사한 경향이었다. 따라서 류신 보족 유전자(complementary gene)를 사용함으로써 류신과 이소류신을 첨가하지 않아도 균체성장과 ADD의 발현에는 아무런 이상이 없음을 확인하였다.

도 9에서 사용한 균주를 사용하여, 도 9와 원칙적으로 동일한 조건에서 배양하되, 최초 배지의 포도당이 고갈되기 전에 포도당을 연속적으로 공급하여 2-10 g/L로 유지되도록 하고, 프롤린을 배양 개시 후 약 12시간 및 20시간 경과 시점에 2번에 걸쳐 공급한 경우에도 도 9와 유사한 발효 양상을 보여 주었다 (도 10 참조).

이상의 결과를 바탕으로 원칙적으로 도 10과 동일한 배지 및 발효 조건에서, HB101/pKLG6048-GAL-ADD-Kn 균주를 사용하여 프롤린을 첨가하는 발효 방법으로 300 L 발효조에서 100 L 발효를 수행한 결과, 3.5 kg(wet wt.)의 균체를 얻었고 10 U/ml의 효소 활성을 얻을 수 있었다 (도 11 참조). 그러나 이 경우 균체를 회수하는 과정에서 미리 발효액을 냉각하지 않은 상태로 상온에서 6시간 동안 연속원심분리기를 통과하는 공정을 거쳐, 발열에 의한 효소 활성의 급격한 감소를 초래하게 되었다. 따라서 이 후의 대량 발효에서는 발효액을 미리 15℃ 정도로 냉각한 후 균체를 회수하여 ADD 효소 활성의 급격한 감소 문제를 완화시킬 수 있었다.

한편, 숙주균주로서 E. coli BL21/pGAL-ADD-Kn을 사용하여, 원칙적으로 도 8과 동일한 조건에서 배양하되, 도 8에서와 달리, 최초 배지에 효모 추출물을 10 g/L만 포함시킨 배지에서 5 L 발효조 배양을 한 결과, 균체 성장이 좋아진 반면 비활성은 비교적 낮았으나, 본 실험에서 가장 중요시되는 활성의 안정적 발현면에서는 우수한 것으로 나타났다 (도 12 참조).

도 12의 결과를 바탕으로 도 12와 동일한 균주를 사용하여 300 L 발효조에서 배양시험을 수행하였다.

160 L의 배지를 사용하였고 포도당의 추가적인 공급 없이 최초 배지의 10 g/L의 포도당만으로 발효를 진행하였고, 효모 추출물도 역시 최초 배지에 10 g/L만 첨가하였다. 도 13의 결과도에서 보는 바와 같이, 앞서의 여러 발효 결과와 마찬가지로 포도당의 소모되는 시점에 ADD의 발현이 개시되었고, 발효 개시 후 9 시간만에 OD 32의 값을 보였으며, 이 때 효소활성은 8.8 의 비교적 높은 값을 보였다. 이 때 수득한 균체 량은 (wet wt.) 5 kg였다.

한편 BL21 균주의 경우, 포도당 대신 글리세롤을 첨가할 경우, 시험관이나 플라스크 배양 등의 소규모 발효시험에서는 수 배의 높은 효소활성을 보였으나, 300 L 규모의 발효조 운용에 의한 실증시험에서는 비교적 저조한 성적을 보였다(data not shown). 즉, 글리세롤 10 g/L, soytone 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L 및 NaCl 10 g/L의 배지를 사용하고, 10 g/L의 글리세롤을 추가로 첨가하였을 때, 7시간 만에 OD 33까지 성장하였고 생체중 7 kg의 세포를 얻었으나 효소활성은 3.4 수준으로 상당히 낮았다.

도 13의 300 L 발효에서 채취한 BL21/pGAL-ADD-Kn 균체의 ADD 전환반응 활성을 DAPDR을 기질로 사용하여 HPLC 분석을 통해 조사한 결과, 전체 반응액의 10%에 해당하는 균체를 사용했을 경우 약 81%의 전환율을 보였다. 이는 HB101 균주의 경우의 약 80%에 해당하는 값으로서 약간 저조한 활성으로 보이나, 이는 BL21 균주의 경우 균체 성장이 우수하여 균체량 대비 효소 활성 (비활성)이 낮은 데에 기인하는 것이므로 효소활성의 안정성을 고려한다면 BL21균주의 사용이 바람직할 것으로 판단되었다.

실시예 5: ADD 효소의 방향성진화(directed evolution)를 위한 선별시스템 구축

DAPDR의 탈아미노기(deamination) 반응에 사용하는 대장균 유래의 ADD 효소는 아데노신에 대한 높은 기질 특이성과 대장균세포에서 과 발현시의 불안정해지는 문제점이 있어서, DAPDR로부터 데옥시구아노신을 공업적으로 생산하는 데 이용하기 위해서는 효소의 특성 개량이 요청된다.

따라서, 본 발명자는 방향성 진화(directed evolution) 기술을 이용하여 ADD 효소 개량을 시도하였다. 그런데 방향성 진화기술을 이용하기 위해서는, 변이체 효소들 중에서 원하는 특성을 갖는 효소를 쉽고 빠르고 선별할 수 있는 방법의 개발이 선행되어야 하는 바, 이러한 선별시스템 구축을 위해서 ADD 결핍주인 대장균 Sφ3834(rpsL, add-uid-man, metB, guaA, uraA::Tn10)를 이용하였다.

SΦ3834 균주는 퓨린 뉴클레오티드 생합성 경로의 ADD 유전자와 구아노신-1-인산 생성 유전자가 불활성화된 균주로서, 최소배지에서 성장하기 위해서는 외부로부터 뉴클레오티드 기질과 ADD 유전자를 반드시 공급해 주어야 한다. 따라서, 상기 SΦ3834 균주의 이러한 특성을 활용하면 ADD 효소 활성을 갖는 균주를 선별할 수 있으며, 여기에 ADD 효소에 대한 경쟁적 저해물질(competitive inhibitor)을 병용함으로써 효과적인 ADD 변이체(즉, DAPDR에 대한 기질 특이성이 증가된 ADD 변이체) 선별시스템을 구축할 수 있다.

데옥시코포마이신(deoxy-coformycin)과 코포마이신(coformycin)은 아데노신과 매우 유사한 구조를 가지는 ADD 효소의 경쟁적 저해물질이다(도 14 참조). 코포마이신은 코포마이신의 디아제핀(diazepine)고리의 8-히드록시(8-hydroxy)의 4면체 원자배열(tetrahedral configuration)이 아데노신의 전이상태 중간생성물(transition state intermediate)과 구조가 유사하고, 리보스(ribose)와 데옥시리보스 부위가 아데노신 탈아미노기 효소(adenosine deaminase)-코포마이신 결합의 안정성에 기여하게 됨으로써 아데노신 또는 DAPDR 기질에 대한 저해물질(inhibitor)로서 기능을 한다.

따라서 도 15와 같이, error-prone PCR 기법을 이용하여 ADD 유전자에 무작위적 돌연변이가 유발된 ADD 발현 벡터를 만든 다음, 이들 벡터를 SΦ3834 균주에 도입한 뒤, 상기의 반응 억제제가 포함된 최소배지 표면에 도말하여 형성된 균체를 분석하였다. 이러한 균주로부터 얻은 ADD 변이체들은 DAPDR에 대한 기질 친화도가 증가된 유전자를 포함하고 있을 가능성이 높기 때문에 본 발명에서 필요로 하는 ADD 유전자를 확보 할 수 있을 것으로 판단되었다.

이러한 선별시스템을 확립하기 위해서 대장균 Sφ3834 균주의 성장에 필요한 DAPDR의 최적농도와 ADD 효소의 반응 억제에 필요한 코포마이신과 퓨린 리보시드(purine riboside)의 최소 농도를 하기와 같이 결정하였다.

5-1) DAPDR 의 최적농도 결정

ADD 발현벡터인 pGAL-ADD의 암피실린 저항성 유전자를 카나마이신 저항성 유전자로 교체한 벡터인 pBSK-GAL-ADD-Kn 벡터와 ADD 유전자가 없는 pUC4K 벡터를 이용하여 최적 DAPDR 농도를 결정하였다. 각각의 벡터로 형질전환된 Sφ3834/pBSK-GAL-ADD-Kn와 Sφ3834/pUC4K를 0, 20, 30, 40, 50, 80, 100㎍/㎖ 농도의 DAPDR을 포함하는 최소배지에 도말한 후 37℃에서 3~4일간 배양하여 균체 형성 여부를 확인하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이 Sφ3834/pUC4K의 경우 DAPDR 농도에 관계없이 성장하지 못하였으나 Sφ3834/pBSK-GAL-ADD-Kn는 40~50 ㎍/㎖ 농도에서 가장 잘 성장하였으며 그 이상의 농도에서는 오히려 성장 억제효과를 보였다. 이때 사용한 최소배지의 조성은 다음과 같다: 13.6 g KH₂PO₄, 2 g (NH₄)₂SO₄, 0.5 mg FeSO₄.7H₂O, 0.2 g MgSO₄, 0.01 g CaCl₂-2H₂O, 10 ㎖ Glycerol/리터, 50 mg/㎖ L-메티오닌, 50 mg/㎖ 카나마이신, 1 mg/㎖ 티아민, 0~100 ㎍/㎖ DAPDR, pH 7.2.

5-2) 코포마이신과 퓨린 리보시드의 최소 억제농도 결정

ADD 효소의 가장 특이적 억제물질은 데옥시코포마이신이지만 현재 생산되고 있지 않기 때문에 코포마이신과 퓨린 리보시드(purine riboside)를 확보하여 최소 성장 억제 농도를 확인하고자 하였다. 도 17은 코포마이신 농도에 따른 대장균 Sφ3834 성장의 비교도이다.

최적 농도로 결정된 DAPDR 50 ㎍/㎖과 각각 0, 1, 5, 10, 20 μM 농도의 코포마이신을 포함하는 최소배지내에, 형질전환된 Sφ3834/pBSK-GAL-ADD-Kn의 균 배양액을 단계적으로 10, 100, 1000 배 희석시킨 후, 각각 10㎕씩 spotting하여 접종한 다음 37℃에서 약 3~4일간 배양한 결과, 10~20 μM의 코포마이신이 포함된 배지에서는 균체 형성이 저해됨을 확인하였다(도 17 참조). 데옥시코포마이신의 경우 20nM 농도에서도 ADD 효소를 저해하는 것으로 알려져 있으나 코포마이신은 ADD 효소를 저해하기 위해서는 데옥시코포마이신보다 1000이상 높은 농도를 필요로 함을 확인하였다.

상기 도 17의 경우와 동일한 방법으로, 퓨린 리보시드를 각각 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10 mM을 포함하는 최소배지에, 형질전환된 Sφ3834/pBSK-GAL-ADD-Kn의 균 배양액을 단계별로 10, 100, 1000 배 희석시킨 후 각각 10㎕씩 spotting하여 접종한 다음 약 3~4일간 배양한 결과, 도 18에서 보여주는 것처럼 10 mM 이상의 퓨린 리보시드 농도에서 균체 형성이 저해됨을 확인하였다.

실시예 6: ADD 효소의 방향성진화

Sφ3834 균주는 여러 가지 변이가 도입된 불안정한 균주이기 때문에 먼저 항생제 저항성 유전자에 따른 형질전환 효율을 조사하였다. 즉, 항생제 저항성 유전자인 카나마이신 저항성 유전자를 선발 마커(selection marker)로 가지는 pBSK-GAL-ADD-Kn 벡터와 암피실린을 선발 마커로 가지는 pGAL-ADD 벡터를 각각 Sφ3834 균주와 DH5α 균주에 형질전환시킨 뒤 형성된 균체의 수를 비교하였다. 아래 표 8은 그 결과이다.

DH5α 균주는 선발 마커와 관계없이 유사한 형질전환 효율은 보이는 반면, Sφ3834는 카나마이신 저항성 유전자를 선발 마커로 사용하는 경우 암피실린 저항성 유전자를 선발 마커로 한 벡터에 비하여 형질전환 효율이 급격히 감소함을 확인 하였다. 그러므로 암피실린 저항성 유전자를 선발 마커로 가지고 있는 pGal-ADD 벡터를 우선적으로 ADD 효소의 방향성 진화에 이용하였다.

균 주	발현 벡터	균체의 수
Sφ3834	pBSK-GAL-ADD-Km	20 CFU/plate 이하
Sφ3834	pGAL-ADD	104 CFU/plate 이상
DH5α	pBSK-GAL-ADD-Km	104 CFU/plate 이상
DH5α	pGAL-ADD	104 CFU/plate 이상

상기 표에서 *= CFU(colony forming unit)

ADD 효소 유전자에 무작위적으로 돌연변이를 도입하기 위하여 error prone PCR을 이용하였다. 우선 pGAL-ADD로부터 정상적인 PCR을 이용하여 ADD 유전자를 증폭시켜 원하는 양을 얻어낸 후 유전자 1 kb당 4-5개의 염기변이가 도입되는 조건으로 error prone PCR법을 수행하여 ADD 유전자 변이체를 얻어 내었다.

ADD 유전자의 양쪽 말단을 제한효소 EcoRI과 SalI으로 잘라낸 후 EcoRI과 SalI으로 처리한 pGAL-ADD 벡터에 연결한 뒤 이를 DH5α에 형질전환하였으며, 이들 형질전환체로부터 플라스미드를 회수하여 ADD 유전자의 변이 라이브러리를 제조하였다. 확보된 ADD 유전자의 변이 라이브러리를 Sφ3834균주에 형질전환하고 40 ㎍/ml의 DAPDR과 10μM의 코포마이신을 포함하는 최소배지에 도말한 후 37℃에서 배양하여 약 4-5일 후 240여 개의 형성된 균체를 확인할 수 있었다. 형성된 균체를 암피실린을 포함하는 LB 고체배지로 옮긴 후 그 중 잘 자란 93개의 균체를 분광광도계(spectrophotometer)와 HPLC를 이용하여 분석하였다.

상기의 93개의 균체를 각각 동일 양 회수하여 15 mM의 아데노신과 반응시킨 뒤, 분광광도계를 이용하여 아데노신이 이노신(inosine)으로 전환되는 양을 측정하는 방식으로 ADD 활성을 확인한 결과, 6 개의 균체에서 돌연변이 도입 이전의 ADD 유전자보다 높은 ADD 효소 활성을 보였으며, 효소 활성을 보다 정밀하게 비교하기 위하여 선별된 상기의 6개의 균체를 다시 HPLC를 이용하여 분석하였다(표 9 참조).

콜로니	O.D. 600	분광학적 에세이	HPLC 에세이(%)
		아데노신→이노신	DAPDR→2'-dG
1	2.45	0.115	54.60
2	2.42	0.632	46.75
3	2.61	0.067	69.88
4	1.19	-	39.40
5	2.56	-	85.94
6	2.33	-	46.58
대조구	1.23~2.53	0.011~0.045	0.0~33.55

상기 표에서, 대조구=SΦ3834/pGal-ADD.

LB 액체배지에서 배양 시 Sφ3834 균주의 불안정성으로 인하여, 도입된 ADD발현 벡터가 균주 내에서 안정적으로 유지되지 않기 때문에 비교적 플라스미드 안정성이 높은 DH5α 균주로 각각의 ADD 유전자를 포함하는 플라스미드를 옮겨서 발현 시킨 후 기질로 사용된 DAPDR과 30분간 반응한 후 생성된 2'-데옥시구아노신의 생성량을 HPLC 분석을 통하여 확인함으로써 ADD 효소의 활성을 비교 측정한 결과를 표 10에 나타내었다.

시료	O.D. 600	보정 OD 600	HPLC 에세이(%)
			DAPDR→2'-dG
1	4.53	2.71	66.0
2	3.65	2.70	100
3	4.20	2.65	100
4	3.35	2.58	28.0
5	4.20	2.65	43.5
6	4.23	2.67	15.0
대조구	3.49	2.64	100

상기 표에서, 대조구=SΦ3834/pGal-ADD.

상기 표 10에 보는 바와 같이, 2번과 3번 ADD 효소 변이주는 대조구와 마찬가지로, 첨가된 DAPDR을 모두 데옥시구아닌으로 전환하였으며(즉, 전환효율 100 %), 반응시간을 단축하여 재분석한 경우, 2번 변이주가 대조구에 비해 더 안정하게 ADD 효소를 발현하고 있음을 확인되었다. 이러한 변이체의 염기서열 분석과 이 염기서열을 바탕으로 방향성 진화를 반복함으로써 활성과 안정성이 더욱 향상된 ADD 유전자를 더욱 확보할 수 있다.

이상 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 신규한 N-데옥시리보실트란스퍼라제 (NDT, N-deoxyribosyltransferase) 효소와 유전적으로 개량된 아데노신 데아미나제 (ADD, adenosine deaminase) 효소를, 순차적으로, ADD 유전자 발현의 최적화 조건에서 사용함으로써 2'-데옥시구아노신을 효율적으로 산업적 생산할 수 있고, 나아가 안티센스 의약품 등의 경제적 생산에 이바지할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제(NDT, deoxyribosyltransferase)와 아데노신 데아미나제(ADD, adenosine deaminase)를 순차적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 2단계 효소합성법에 의한 2'-데옥시구아노신의 생산방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제(ADD)는 2,6-디아미노퓨린-2'데옥시리보시드(DAPDR)에 대한 활성이 증가된 대장균 유래의 것인 2'-데옥시구아노신의 생산방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제는 이를 코딩하는 유전자를 상시 발현 프로모터 하류단에 위치시킨 벡터를 이용하여 발현시켜 얻는 것인 2'-데옥시구아노신의 생산방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 상시발현 프로모터는 GAL인 것인 2'-데옥시구아노신의 생산방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제를 카나마이신 저항성 마커를 사용한 재조합 플라스미드에서 발현시켜 얻는 것인 2'-데옥시구아노신의 생산방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제를 카나마이신 저항성 마커를 포함하는 플라스미드와 류신 요구성 숙주세포 시스템 하에서 발현시켜 얻는 것인 2'-데옥시구아노신의 생산방법.
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