BR112020007068A2

BR112020007068A2 - métodos e composições para produção de nucleosídeo trifosfato e ácido ribonucleico

Info

Publication number: BR112020007068A2
Application number: BR112020007068-8A
Authority: BR
Inventors: Drew S. Cunningham; Rachit Jain; Karthikeyan RAMACHANDRIYA; Daniel MacEachran; Himanshu Dhamankar; Ifeyinwa Iwuchukwu; James Robbins Abshire; Mehak Gupta; Matthew Eduardo Moura; Naveen Sudharsan; Nicholas Skizim
Original assignee: Greenlight Biosciences, Inc.
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2020-10-06
Also published as: KR20200066686A; US20190144489A1; WO2019075167A1; US20210309691A1; MX2020003841A; AU2018347405B2; JP2024043531A; AU2018347405A1; CN111465701A; KR102571743B1; CA3078726A1; RU2020115572A; US10858385B2; CL2020000946A1; IL273887A; JP2020536570A; AU2022201599A1; SG11202003192UA; IL273887B; EP3695002A1

Abstract

A presente invenção refere-se, em algumas modalidades, a métodos e composição para a produção de nucleosídeos trifosfatos e ácidos ribonucleicos.

Description

Relatório descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS E COMPOSIÇÕES PARA PRODUÇÃO DE NUCLEOSÍDEO TRI- FOSFATO E ÁCIDO RIBONUCLEICO”.

[0001] PEDIDO RELACIONADO

[0002] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. $ 119(e) do número do pedido provisório US 62/571.071, depositado em 11 de ou- tubro de 2017, que está aqui integralmente incorporado, por referência.

[0003] ANTECEDENTES

[0004] O ácido ribonucleico (RNA) inclui unidades de repetição de ribonucleotídeos e desempenha um papel nos principais processos ce- lulares, incluindo a expressão gênica e a síntese de proteínas. Dessa forma, o RNA é um alvo atraente para modular os processos fundamen- tais da célula, por exemplo, as vacinas de RNA que induzem uma res- posta imune celular. A produção de baixo custo do RNA em escala co- mercial (por exemplo, gramas para quilogramas), no entanto, é desafia- dora, devido, em parte, ao custo das matérias-primas (por exemplo, nu- cleosídeos trifosfatos (NTPs)) e componentes de reação (por exemplo, modelo de DNA e polimerase). O fornecimento de RNA de elevada qua- lidade em escalas comercialmente relevantes requer uma produção econômica de ambos NTPs e RNA.

[0005] — SUMÁRIO

[0006] São fornecidos aqui sistemas, métodos, composições (por exemplo, células, lisados celulares, reagentes e misturas de reação), e kits para produção de baixo custo (biossíntese) de NTPs e/ou RNAs, usando vias biossintéticas desenvolvidas para usar substratos de baixo custo (por exemplo, RNA celular, nucleobases, nucleosídeos, nucleosí- deos monofosfatos (NMPs) e/ou nucleosídeos difosfatos(NDP's)), enzi- mas recombinantes e/ou endógenas (por exemplo, quinases e/ou poli- merases), e fontes de energia (por exemplo, NTP'ss, polifosfato e/ou pi- rofosfato). A produção de NTPs e/ou RNA, em algumas modalidades, é alcançada usando sistemas de lisado in vitro e/ou livre de células proje- tados para minimizar (por exemplo, reduzir, inibir e/ou remover) ativida- des enzimáticas indesejáveis, aumentando assim a eficiência do pro- cesso e o rendimento do produto final desejado.

[0007] As vias biossintéticas descritas aqui normalmente utilizam polifosfato quinase e polifosfato como uma alternativa às enzimas da via endógena e fontes de fosfato.

[0008] Assim, alguns aspectos da presente descrição fornecem mé- todos e composições para produzir NTPs que compreendem incubação em uma mistura de reação NDPs (por exemplo, ADP, CDP, GDP e/ou UDP), um polifosfato quinase (por exemplo, PPK2) e um polifosfato (por exemplo, hexametafosfato) sob condições adequadas para a produção de NTPs. Como mostrado na Fig. 2A, o PPK transfere um fosfato do polifosfato para o ADP, CDP, GDP e UDP, resultando na produção de ATP, CTP, GDP e UTP. Em algumas modalidades, essa mistura de re- ação inclui ainda uma NDP quinase (por exemplo, ndk).

[0009] Outros aspectos da presente descrição fornecem sistemas, métodos, composições, e kits para produzir NTPs que compreendem a incubação em uma mistura de reação de NMP'ss (por exemplo, 5-NMPs, como 5-AMP, 5-CMP, 5-GMP, e/ou 5-UMP), um polifosfato quinase e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação inclui ainda um NMP qui- nase ou um NDP quinase (por exemplo, ndk). Em algumas modalida- des, a mistura de reação compreende ainda um NMP quinase (por exemplo, adk, cmk, gmk e/ou pyrH) e NDP quinase (por exemplo, ndk).

[0010] Outros aspectos adicionais da presente descrição fornecem sistemas, métodos, composições, e kits para produzir NTPs que com- preendem a incubação em uma mistura de reação de nucleosídeos (por exemplo, adenosina, citidina, guanosina e/ou uridina), um polifosfato quinase e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de

NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase, um NMP quinase ou um NDP quinase. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende adicional- mente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e um NDP quinase.

[0011] Outros aspectos da presente descrição fornecem sistemas, métodos, composições e kits para produzir NTPs que compreendem a incubação em uma mistura de reação de nucleobases (por exemplo, adenina, citosina, guanina e/ou uracila), um fosforibosiltransferase, um fosforibosilpirofosfato, um polifosfato quinase e um polifosfato sob con- dições adequadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase, um NMP quinase ou um NDP quinase. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e um NDP quinase.

[0012] Em algumas modalidades, o material de partida (por exem- plo, NMPs, NDP's e/ou nucleosídeos) para a biossíntese de NTPs é pro- duzido a partir do RNA celular. Assim, alguns aspectos da presente des- crição fornecem sistemas, métodos, composições e kits para produzir NTPs que compreendem (a) a incubação em uma mistura de reação de RNA celular (por exemplo, obtidos a partir de organismos unicelulares ou multicelulares), fosforilase polinucleotídica (PNPase) e fosfato inor- gânico sob condições adequadas para a produção de difosfatos de nu- cleosídeos (NDP's); (b) eliminação da PNPase (e, opcionalmente, elimi- nando outras atividades enzimáticas indesejáveis); e (c) incubação na mistura de reação resultante dos NDPs, um polifosfato quinase e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NTPs. Em al- gumas modalidades, a mistura de reação da etapa (c) inclui ainda uma NDP quinase. Alternativamente, os métodos podem compreender (a) incubação em uma mistura de reação de ácido ribonucléico (RNA) ce-

lular, uma PNPase, fosfato inorgânico, um polifosfato quinase e um po- lifosfato sob condições adequadas para a produção dos nucleosídeos difosfatos (opcionalmente, onde a mistura de reação inclui ainda uma quinase NDP); (b) eliminação da PNPase; e (c) incubação da mistura de reação sob condições adequadas para a produção de NTPs. Em al- gumas modalidades, as enzimas da via necessária (por exemplo, poli- fosfato quinase e/ou NDP quinase) podem suportar as condições de eli- minação (por exemplo, exposição a altas temperaturas ou um inibidor químico), de forma que elas mantêm a sua atividade (por exemplo, pelo menos 50% da sua atividade) após a exposição às condições usadas para eliminar (por exemplo, reduzir, inibir e/ou remover) a PNPase.

[0013] Outros aspectos da presente descrição fornecem sistemas, métodos, composições e kits para produzir NTPs que compreendem (a) a incubação em uma primeira mistura de reação de RNA celular e uma ribonuclease (Rnase, por exemplo, RNase R ou Nuclease P1) sob con- dições adequadas para a produção de NDP'ss (p.ex., 5 "NMP's); (b) elimi- nação da RNase (e, opcionalmente, outras atividades enzimáticas inde- sejáveis); e (c) incubação na mistura de reação resultante dos NMP's, um polifosfato quinase e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação da etapa (c) compreende adicionalmente um NMP quinase, um NDP qui- nase ou ambos NMP quinase e um NDP quinase. Alternativamente, os métodos podem compreender (a) incubação em uma mistura de reação de RNA celular, uma RNase, um polifosfato quinase e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NMPs (p.ex.5-NMPs); (b) eliminação da RNase; e (c) incubação da mistura de reação sob con- dições adequadas para a produção de NTPs.

[0014] Os NTPs produzidos aqui são usados, em algumas modali- dades, para a produção do RNA (por exemplo, mRNA ou RNA de fita dupla). Isto pode ser conseguido, por exemplo, adicionando o modelo de DNA e polimerase (por exemplo, T7 RNA polimerase) para qualquer uma das misturas de reação usadas para a produção de NTP, conforme descrito aqui. Como alternativa, os NTPs podem ser isolados e combi- nados com o modelo de DNA e polimerase em uma mistura de reação separada para produzir o RNA. Assim, a presente descrição também fornece métodos e composições para a produção de RNA.

[0015] Em qualquer uma das vias biossintéticas descritas aqui as nucleobases, os nucleosídeos, NMPs, NDPs ou NTPs, quando usados como substrato de partida, podem ser sintetizados quimicamente, um produto de fermentação, ou produzidos por outros meios.

[0016] O polifosfato quinase usado nos sistemas, misturas de rea- ção e métodos descritos aqui podem ser selecionados a partir de qual- quer dos polifosfatos quinases listados na Tabela 2 ou 12. Em algumas modalidades, o polifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0017] O polifosfato pode ser qualquer polifosfato que serve como um substrato para uma via de enzimas. Em algumas modalidades, o polifosfato é o hexametafosfato.

[0018] Em modalidades onde o RNA celular é usado, o RNA celular compreende, por exemplo, o RNA ribossômico, o RNA mensageiro, e/ou o RNA de transferência. O RNA celular pode ser de um organismo uni- celular (por exemplo, bactérias ou leveduras) ou de um organismo mul- ticelular (por exemplo, plantas).

[0019] Enzimas das vias biossintéticas úteis na presente descrição podem ser obtidas (isoladas e/ou purificadas) de (pelo menos um) um lisado celular preparado a partir de, por exemplo, células (por exemplo, células modificadas) que expressam enzimas da via (por exemplo, nu- cleases (como RNases e/ou PNPases), polifosfato quinases, NMP qui- nases, NDP quinase e/ou polimerases). Métodos exemplares para pre- parar estes lisados celulares são descritos aqui. Alternativamente, a mistura de reação pode incluir um lisado celular (um único lisado celular ou uma mistura de lisados celulares) preparada a partir de células (por exemplo, células modificadas) que expressam enzimas da via. Isto é, uma reação completa pode ser realizada em um lisado celular ou uma mistura de lisados celulares contendo enzimas recombinantes e/ou en- zimas endógenas da via, bem como outros componentes de reação (por exemplo, polifosfato) necessário para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, uma (pelo menos uma) enzima da via purificada é adicio- nada a uma mistura de reação.

[0020] Para as misturas de reação que incluem o(s) lisado(s) celu- lar(es) ou enzimas obtidas a partir de lisado(s) celular(es) pode ser van- tajoso eliminar atividades enzimáticas nativas indesejadas usando qual- quer um dos métodos de eliminação descritos aqui. Atividades enzimá- ticas nativas indesejáveis incluem, por exemplo, fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hidrolases. Em algumas mo- dalidades, a atividade nativa enzimática é eliminada através da modifi- cação genética, secreção enzimática a partir de uma célula, localização (por exemplo, direcionamento periplasmático) e/ou direcionamento da protease. Em outras modalidades, a atividade enzimática nativa é elimi- nada através de temperatura, pH, sal, detergente, álcool ou outros sol- ventes e/ou inibidores químicos. Ainda em outras modalidades, a ativi- dade enzimática nativa é eliminada através de separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0021] Os detalhes de várias modalidades da invenção são estabe- lecidos nos Exemplos, nos Desenhos e na Descrição Detalhada abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão visíveis a partir da descrição e das reivindicações.

[0022] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] Figura 1A mostra as vias biossintéticas para a produção dos nucleosídeos trifosfatos (NTPs), e o ácido ribonucléico a jusante (RNA),

usando materiais de partida de nucleotídeos. Figura 18 mostra exem- plos de estratégias de fosfato de alta energia, onde o polifosfato é ali- mentado para a mistura de reação. Figura 1C mostra exemplos de es- tratégias de fosfatos de alta energia.

[0024] Figura 2A mostra uma via biossintética para a produção de NTPs, e RNA a jusante, usando nucleosídeos difosfatos (NDPs) como materiais de partida. Figura 2B mostra uma via biossintética para a pro- dução de NTPs, e RNA a jusante, usando 5' nucleosídeos monofosfatos (S5-NMP's) como materiais de partida. Figura 2C mostra uma via biossin- tética para a produção de NTP's, e RNA a jusante, usando nucleosídeos como materiais de partida. Figura 2D mostra uma via biossintética para a produção de NTPs, e RNA a jusante, usando nucleobases como ma- teriais de partida. Figura 2E mostra uma via biossintética para a produ- ção de NTPs, e RNA a jusante, usando nucleobases e ribose como ma- teriais de partida.

[0025] Figura 3A mostra uma via biossintética para a produção de NTPs, e RNA a jusante, usando RNA celular como material de partida. Nesta via, a fosforilase polinucleotídica é usada para degradar o RNA celular em NDP's. Figura 3B mostra uma via biossintética para a produ- ção de NTPs, e RNA a jusante, usando RNA celular como material de partida. Nesta via, a ribonuclease é usada para degradar o RNA celular em NMPs.

[0026] Figura 4A mostra uma via biossintética para a produção de NTPs, e RNA a jusante, usando apenas polifosfato quinase. Figura 4B mostra uma via biossintética para a produção de NTPs, e RNA a ju- sante, usando ambos polifosfato quinases (por exemplo, PPK2) e qui- nases dependentes de ATP/ADP (por exemplo, NMP quinases como adk, cmk, gmk e/ou pyrH, e/ou NDP quinases como ndk).

[0027] Figura 5 mostra uma via biossintética para a produção de RNA a partir de 5" NMPs.

[0028] Figura 6 mostra uma via biossintética para a produção de RNA a partir do RNA celular. O esquema mostra um exemplo em que o modelo, a quinase e a polimerase são adicionados durante uma reação de produção de RNA.

[0029] Figura 7 mostra uma via biossintética para a produção de RNA a partir do RNA celular. O esquema mostra um exemplo em que o modelo pode ser adicionado durante a fase de despolimerização ou a fase de produção de RNA, a quinase pode ser adicionada durante a fase de despolimerização ou a fase de produção do RNA, e a polimerase pode ser adicionada durante a fase de despolimerização ou a fase de produção de RNA.

[0030] Figura 8A mostra um gráfico de nucleotídeos solúveis em ácido (mM) produzidos ao longo do tempo durante a despolimerização de RNA de lisados de E. coli usando RNase R superexpressada. Os nucleotídeos solúveis em ácido foram medidos por absorção de UV.

[0031] Figura 8B mostra um gel de agarose de produtos de RNA produzidos em reações compreendendo RNA polimerase e NMPs pro- duzidos por despolimerização (- NMPs) ou NMPs purificados (+ NMP's, 4 mM cada). Abreviaturas: — 2log: Escada de DNA de 2-log (New En- gland Biolabs), NMPs: mistura equimolar de 5"NMPs, RNA Pol: RNA polimerase T7 termoestável, Modelo 1: Modelo de DNA linear, Modelo 2: Modelo de DNA plasmidial.

[0032] Figura 9A mostra um gráfico de nucleotídeos solúveis em ácido (mM) produzidos ao longo do tempo durante a despolimerização de RNA purificado usando 1 mg/mL de RNase R purifica. Os nucleotí- deos solúveis em ácido foram medidos por absorção de UV.

[0033] Figura 9B mostra um gel de agarose de produtos de RNA produzidos em reações compreendendo RNA polimerase e NMPs pro- duzidos por despolimerização de RNA purificado. Como controle nega-

tivo, a reação foi realizada na ausência de RNA polimerase. Abreviatu- ras: — 2log: Escada de DNA de 2-log (New England Biolabs), NMPs: mistura equimolar de 5' nucleosídeos monofosfatos, RNA Pol: RNA po- limerase T7 termoestável, Modelo 1: Modelo de DNA linear, Modelo 2: Modelo de DNA plasmidial.

[0034] Figura 10 mostra um gel de agarose de produtos de RNA produzidos pela síntese de RNA livre de célula usando uma polimerase tipo selvagem (W) ou um mutante de polimerase termoestável (T) a 37 ºC. Abreviaturas: — 2log: Escada de DNA de 2-log (New England Bio- labs), W: RNA T7 polimerase do tipo selvagem (New England Biolabs), T: RNA T7 polimerase termoestável, Modelo 1: Modelo de DNA linear, Modelo 2: Modelo de DNA plasmidial.

[0035] Figura 11A mostra um gráfico do fator de resposta (calculado como proporção de área do dsRNA de interesse do padrão interno do dAsRNA disponível comercialmente) das reações compreendendo DgPPK2 como única quinase ou sistema lisado de 5-enzimas.

[0036] Figura 11B mostra os cromatogramas de HPLC do produto de dsRNA produzido em reações compreendendo lisado DIPPHK2, sis- tema de lisado de 5-enzimas e os controles negativos sem RNA polime- rase T7.

[0037] Figura 12A mostra um gráfico de nucleotídeos solúveis em ácido (mM) produzidos ao longo do tempo durante a despolimerização de várias fontes de RNA usando RNase R ou Nuclease P1 purificada. Os nucleotídeos solúveis em ácido foram medidos por absorção de UV.

[0038] Figura 12B mostra um gráfico do percentual de 5-NMPs dis- ponível produzido ao longo do tempo durante a despolimerização de RNA de E. coli ou leveduras usando Nuclease P1. Porcentagem de 5"- NMP's foi determinada por LC-MS.

[0039] Figura 13 mostra gráficos do perfil nucleômico para a despo- limerização do RNA em diferentes temperaturas do lisado de GL17-109.

As concentrações cumulativas dos 20 analitos são mostradas. Nucleo- sídeos são mostrados em um padrão manchado de branco e foram mi- nimamente produzidos. Dados para 50 ºC foram coletados, mas não é mostrado.

[0040] Figura 14 é um diagrama de uma via enzimática para produ- ção de ATP a partir de pirofosfato, através da fosforilação cíclica de ace- tato. O significado das abreviaturas é da seguinte forma: AcK1 = pri- meiro acetato quinase, AcK2 = segundo acetato quinase, PP; = pirofos- fato inorgânico, P; = fosfato inorgânico, ATP = trifosfato de adenosina, ADP = difosfato de adenosina e Acetil-P = acetil-fosfato.

[0041] Figura 15A-15B é um esquema de uma via enzimática para produção de ATP a partir de citrato. A Figura 15A apresenta as três re- ações enzimáticas para a produção de ATP a partir de citrato e pirofos- fato. A Figura 15B apresenta a reação química global. O significado das abreviaturas é da seguinte forma: PP; = pirofosfato inorgânico, PEP = Fosfoenolpiruvato, CO>2 = o dióxido de carbono, P; = fosfato inorgânico, ATP = adenosina trifosfato e AMP = monofosfato de adenosina.

[0042] Figura 16 é um esquema de uma via enzimática para produ- ção de ATP a partir de sulfito. O significado das abreviaturas é da se- guinte forma: ATP = trifosfato de adenosina, AMP = monofosfato de ade- nosina, APS = adenosina 5"'-fosfosulfato e PP; = pirofosfato inorgânico.

[0043] Figura 17 é um gráfico que mostra que essa síntese livre de célula de dsRNA produz titulações do produto semelhantes, indepen- dente da fonte de nucleotídeo.

[0044] Figura 18 é um gráfico que mostra que essa síntese livre de célula de dsRNA resulta em titulações de produtos comparáveis com RNA polimerases do tipo selvagem e mutantes termoestáveis na tem- peratura de reação de mesófilos.

[0045] Figura 19 é um gráfico que mostra que essa síntese livre de célula de NTPs resulta em titulações de NTP similares independentes da fonte de nucleotídeo após uma incubação de 1h a 48 ºC. Para cada fonte de nucleotídeos (RNA celular, NMP's purificados, ou NDPs purifi- cados), uma quantidade de substrato suficiente para fornecer cerca de 4 mM de cada nucleotídeo foi adicionada à reação. Por exemplo, as reações com NDPs compreendem 4 mM cada de ADP, CDP, GDP e UDP.

[0046] DESCRIÇÃO DETALHADA

[0047] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, vias bi- ossintéticas para produção de NTPs e/ou RNA que usam componentes de reação eficaz, como substratos de RNA celular ou substratos mono- méricos como nucleobases, nucleosídeos, NMPs, ou NDP's, enzimas da via recombinantes e/ou purificadas (por exemplo, fosforibosiltransfera- ses, nucleosídeos fosforilases, riboquinases, fosfopentomutases, nu- cleases, polifosfato quinases, NMP quinases, NDP quinases, nucleosí- deos quinases, RNA polimerases), fontes de fosfato de alta energia (por exemplo, polifosfato), e/ou modelos de DNA.

[0048] Componentes de reação

[0049] RNA celular. RNA celular inclui, por exemplo, o RNA men- sageiro (MRNA), RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossômico (rRNA) obtidos a partir de material celular (biomassa). RNA celular pode ser obtido a partir de qualquer fonte de material celular, incluindo, mas não limitado a, organismos unicelulares (por exemplo, bactérias e leve- duras) e organismos multicelulares (por exemplo, plantas e animais), quer da fermentação ou a partir de um fluxo de resíduos do processo, por exemplo, RNA celular obtido a partir de um lisado expressando uma enzima (por exemplo, uma quinase).

[0050] Nucleobases. Uma nucleobase é um componente de base nitrogenada de um nucleosídeo ou nucleotídeo. Nucleobases funcionam como unidades fundamentais do código genético. Nucleobases incluem adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracila (U). Nucleo- bases incluem nucleobases modificadas, incluindo, mas não limitadas a, pseudouridina (4), dihidrouridina (D) e 7-metilguanosina (m'G).

[0051] Nucleosídeos. Um nucleosídeo é uma nucleobase ligada a um açúcar de cinco carbonos (por exemplo, uma ribose). Exemplos de nucleosídeos incluem adenosina, citidina, guanosina, timidina e uridina.

[0052] Nucleotídeos. Um nucleotídeo inclui um nucleosídeo e um grupo fosfato. Um nucleosídeo tendo um grupo fosfato é um monofos- fato de nucleosídeo (NMP), que incluem o monofosfato de adenosina (AMP), monofosfato de citidina (CMP), monofosfato de guanosina (GMP), monofosfato de timidina (TMP) e monofosfato de uridina (UMP). Um nucleosídeo tendo dois grupos fosfato é um difosfato de nucleosí- deo (NDP), que incluem o difosfato de adenosina (ADP), difosfato de citidina (CDP), difosfato de guanosina (PIB), difosfato de timidina (TDP) e difosfato de uridina (UDP). Um nucleosídeo tendo três grupos fosfato é um trifosfato de nucleosídeo (NTP), que incluem trifosfato de adeno- sina (ATP), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de timidina (TTP) e trifosfato de uridina (UTP).

[0053] Fosforibosiltransferases. Fosforibosiltransferases, como fosforibosiltransferase adenina (APRTase), está envolvida na via de res- gate do nucleotídeo nas células, que fornece uma alternativa para a bi- ossíntese de nucleotídeos. APRTase catalisa a reação seguinte na via de resgate do nucleotídeo purina: Adenina + fosforribosil pirofosfato (PRPP) — adenosina 5' monofosfato (AMP) + pirofosfato (PPi).

[0054] Riboquinases. Riboquinase é uma enzima que transfere o fosfato da fonte de fosfato de alta energia (por exemplo, ATP ou polifos- fato) para D-ribose formando Dr-ribose-5-fosfato. Os exemplos incluem os produtos do gene rbsK de E. coli e o produto do gene QT17 05185 de Thermus sp. 2.9.

[0055] Fosfopentomutases. Fosfopentomutase é uma enzima que transfere o fosfato da molécula de ribose-fosfato. Especificamente, a fosforibomutase catalisa a interconversão reversível de D-ribose-1-fos- fato e D-ribose-5-fosfato. Os exemplos incluem os produtos do gene deoB de E. coli e o produto do gene TMO167 de Thermotoga maritima.

[0056] Nucleosídeos fosforilases. Nucleosídeos fosforilases são enzimas que catalisam a seguinte reação reversível - nucleobase + D- ribose-1-fosfato €<> nucleosídeos + fosfato inorgânico. Purina nucleo- sídeo fosforilase catalisa tal reação com purina nucleobases (por exem- plo, adenina, guanina) e purina nucleosídeos (por exemplo, adenosina, guanosina). Pirimidina nucleosídeo fosforilase catalisa tal reação com nucleobases pirimidina (p.ex., citosina, uracil) e pirimidina nucleosídeos (p.ex., citidina, uridina). Exemplos de nucleosídeos fosforilases incluem os produtos de genes deoD, xapA e udp de E. coli, assim como o TtPNPI, TtPNPII, e TtPyNP, enzimas de Thermus thermophilus HB27.

[0057] Fosforilases polinucleotídicas. Fosforilase polinucleotídica (PNPase) é uma enzima bifuncional com uma atividade de exoribonu- clease 3' para 5' fosforolítica e uma atividade de polimerase de oligonu- cleotídeo 3'-terminal. PNPase é capaz de catalisar a degradação do RNA em nucleosídeos 5 difosfatos (NDPs) usando fosfato inorgânico como um co-substrato. Uso de altas concentrações de fosfato inorgâà- nico enquanto empregando PNPase para degradar o RNA pode simul- taneamente dirigir a atividade de PNPase, reduzindo a perda de rendi- mento potencial de NDP devido a atividades de fosfatase que podem estar presentes na mistura de reação, como o fosfato inorgânico é co- nhecido por inibir tais atividades indesejáveis. Em algumas modalida- des, uma PNPase é utilizada, opcionalmente, em conjunto com uma ou mais helicases para catalisar a degradação de RNA em NDPs. Adicio- nando uma helicase pode melhorar a despolimerização mediada por PNPase de RNA celular, melhorando a acessibilidade de RNA estrutu- rado.

[0058] Nucleases. Nucleases são enzimas que clivam as ligações de fosfodiéster na cadeia principal de DNA (DNases) ou RNA (RNases). Assim, as ribonucleases (RNases) são capazes de catalisar a degrada- ção do RNA em monofosfatos de nucleosídeo (NMPs). Exemplos não limitantes de enzimas que podem ser usadas para despolimerizar o RNA, como fornecidos aqui, são apresentados na Tabela 1. Em algu- mas modalidades, mais de uma nuclease é usada em uma mistura de reação para despolimerizar o RNA. Em algumas modalidades, 2, 3, 4, ou 5 nucleases diferentes são usadas em uma mistura de reação. Tabela 1. Exemplos de enzimas para despolimerização do RNA Nuclease P1 Penicillium citrinum 3.1.30.1 P24289 1,2,3 P1 nuclease RNase R Pseudomonas putida ou | 3.1.13. R9vaM9 Escherichia coli P21499

[0059] Quinases. Quinases, geralmente, são enzimas que catali- sam a transferência de grupos fosfato de uma molécula doadora de fos- fato de alta energia (p.ex., ATP, GTP, UTP, CTP, ou polifosfato con- tendo grupos de fosfato n no polímero) para substratos/moléculas espe- cíficos. Este processo produz um substrato fosforilado e uma forma des- fosforilada das moléculas doadoras de fosfato de alta energia (p.ex., ADP, GDP, UDP, CDP, ou polifosfato contendo grupos de fosfato n-1 no polímero). Exemplos não limitantes de quinases para uso como for- necido aqui incluem NMP quinases, NDP quinases, nucleosídeos qui- nases, e polifosfato quinases.

[0060] Polifosfato quinases. Um polifosfato quinase é uma enzima que catalisa a transferência de grupo(s) fosfato(s) de moléculas doado- ras de fosfato de alta energia, como polifosfato (PolyPrn), para substra- tos/moléculas específicos. Este processo é chamado de fosforilação, onde o substrato ganha um grupo de fosfato e molécula doadora de fosfato de alta energia doa um grupo fosfato.

Esta transesterificação produz um substrato fosforilado e uma molécula doadora de fosfato, fal- tando o grupo fosfato doado, como PolyPn-1. O polifosfato quinase da presente descrição, em algumas modalidades, converte nucleosídeos para NMPs, NMPs para NDPs, e/ou NDPs para NTPs.

Exemplos não limitantes de polifosfato quinase são fornecidos na Tabela 2. Em algu- mas modalidades, mais de um polifosfato quinase é usado em uma mis- tura de reação.

Em algumas modalidades, 2, 3, 4, ou 5 polifosfato qui- nases diferentes são usados em uma mistura de reação.

Tabela 2. Exemplos de polifosfato quinases Nó de Identi Referên- júúmero de Identi- | Organismo Gena ficação de Se- o quências Fes [PRE renan Famosa UNE veotsssto sssoNos — | [PAR [esmas sao DSTs eo stars [15 rm E eae [FR oceanos poetas DST Weptato Tematnos | [PE [ARA T eae [FE se we san | [PRE reparado/amosmirs ves sara | | rgerismes foferantas eseiverte |O PPK1 Pseudomonas putida DOT-TIE AFOS0238.1 42 I7BEV8 PPK1 Escherichia coli K-12 AAC75554.1 POA7B1 PPK1 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 NP 347259.1 43 Q97LEO Regatas O OF estas CO Leteras OS adosSe"]"

[0061] Nucleosídeos quinases. Nucleosídeos quinases catalisam a transferência de fosforil de uma molécula doadora de fosfato de alta energia (p. ex., um nucleotídeo trifosfato) para um aceptor R-OH, o que é tipicamente o grupo 5'-hidroxila da porção do açúcar dos nucleosídeos (por exemplo, adenosina, guanosina, citidina, uridina). Este processo converte um nucleosídeo a um NMP (p.ex., AMP, CMP, GMP, UMP). Em algumas modalidades, o nucleosídeo quinase catalisa a transferên- cia de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfatos para a ade- nosina para produção de monofosfato de adenosina (AMP). Em algu- mas modalidades, o nucleosídeo quinase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfato para citidina para produzir citidina monofosfato (CMP). Em algumas modalidades, o nu- cleosídeo quinase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfato para a guanosina para a produção de mo- nofosfato de guanosina (GMP). Em algumas modalidades, o nucleosí- deo quinase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfatos para a uridina para produção de monofosfato de uridina (UMP). Exemplos não limitantes de nucleosídeos quinases são fornecidos na Tabela 3. Em algumas modalidades, mais de um nucleo- sídeo quinase é usado em uma mistura de reação. Em algumas moda- lidades, 2, 3, 4, ou 5 nucleosídeos quinases diferentes são usados em uma mistura de reação.

Tabela 3. Exemplos de nucleosídeo quinases GenBank * Enzima Organismo UniProt % Referência

[0062] NMP Quinases. Um nucleosídeo monofosfato quinase (NMP quinase) é uma enzima que catalisa a transferência do grupo fosforil terminal de um nucleosídeo trifosfato (NTP), geralmente ATP, para o grupo fosforila em um nucleosídeo monofosfato (por exemplo, AMP, CMP, GMP, UMP). Este processo converte um NMP para um NDP (p.ex., ADP, CDP, GDP, UDP). Em algumas modalidades, o NMP qui- nase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doa- dora de fosfatos para AMP para produzir difosfato de adenosina (ADP). Em algumas modalidades, o NMP quinase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfato para CMP para pro- duzir difosfato de citidina (CDP). Em algumas modalidades, o NMP qui- nase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doa- dora de fosfato para GMP para a produção de difosfato de guanosina (GDP). Em algumas modalidades, o NMP quinase catalisa a transferên- cia de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfatos para UMP para produzir difosfato de uridina (UDP). Exemplos não limitantes de NMP quinases são fornecidos na Tabela 4. Em algumas modalidades, mais de um NMP quinase é usado em uma mistura de reação. Em al- gumas modalidades, 2, 3, 4, ou 5 NMP quinases diferentes são usados em uma mistura de reação. Tabela 4A. Exemplos de enzimas quinase AMP Nú de Identi Referência júúmero de Identi- Organismo GenBank ficação de Se- mniPro quências em | organismos tolerantes gen q) 42 po [amena [| =

"e BAE76253.1 nu Adk Escheríchia coli K12 W3110 Boda : CAK45139.1 4s Adk1 Aspergillus niger CBS 513.88 Sodens Ade Saccharomyces cerevisiae ATCC AAC33143.1 4 204508 / S288c Po717O AAKB1051 1 Adk Clostridium acetobutylicum ATCC 824 — | ARTES o AAG19963 1 2 Adk Halobacterium salinarum ATCC 700922 | ASSTOS Adk Acidithiobacillus thiooxidans WP 024894015.1 NS NNE Acidithiobacillus ferrooxidans WP 0642184201 Lo Adk Acetobacter aceti WP 0778115961 NNE Sulfolobus solfataricus WP 009991241.1 NNE Adk Amphibacillus xylanus WP 0150088831 NNE ad CTolwellia psychrerythraea (Vibrio WP 033093471.1 8 psychroerythus) Q47XA8 7 AISTI3 de Adk Psyehromonas ingrahamii WP 011769361 | pj ; WP 010903267.1 32 Tabela 4B. Exemplos de enzimas quinase CMP Referência : GenBank £ Número de Identífica- | emma Jommamo eme | são de Soquências ee Thermus thermophilus QS5SL35 SEQ ID NO:13 Organismos tolerantes a solvente

P AFO48857.1 Pseudomonas puto DoTTrFA ITBXE2 NR Cmk Escherichia coli K-12 MG1655 AACTI996.1 v mi :scherichia coli K- DOREIO Cmk Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | AAKT9812.1 ” 097/08 mk Halobacterium salinarum ATCC AAG19965.1 m 700922 Q9HPAS Acidófilos [A Acidithiobacílus thiooxidans WP 024892761.1 Lo ll O)

Acidithiobacillus ferrooxidans WP 064220349.1 Fo 1 Alcalífilos Cmk Amphibacíllus xylanus WP 015009966.1 Fo Cmk Thioalkalivibrio denitrificans WP 077278466.1 NM mk Colwella psychrerythraea (Vibrio WP 011043148.1 8 psychroerythus; 48264 Cmk Pseudoalteromonas haloplanktis O3ILA1 de CAIS6499.1 QA4FRL5 de Cmk Psychromonas ingrahamii A1SZO1 de ABMOAZAs |U | ; YP 236713 Halófilos Tabela 4C.

Exemplos de enzimas quinase UMP Referênci Organismo GenBank £ Número de Identifica- | “rência 9 UniProt ção de Sequências RE O OODECSSTITDOODODDOO | —— Thermus thermophilus P43891 | | 33 Organismos tolerantes a solvente ND PyrH Pseudomonas putida DOT-TIE — | AFO4S412.1 ? Y P I7BW46 CAA55S388.1 48 PyrH Escherichia coliKk-12MG1655 — | Bones An13g00440 Aspergillus niger CBS 513.88 CAK41445.1 ” bi PPErgiius na - A2R195 URAS Saccharomyces cerevisiae AAAB5194.1 á ATCC 204508 / S288c P15700 PyrH Clostridium acetobutylicum AAKT9754.1 4 táb ATCC 824 097/64 PyrH Halobacterium salinaum ATCC — | AAG20182.1 * y 700922 Q9HNN8 Acidófilos = Metallosphaera sedula WP 012021705 Alcalífilos Ne Thioalkalivibrio sp.

HK1 WP 0817591721 Amphibacillus xylanus WP 0150102001 —. Colwellia psychrerythraea (Vibrio | WP. 011042391 1 28 y psychroerythus) Q485G8 Pseudoalteromonas haloplanktis | Q31rx6 de cResazae. 1 ||| ja

[55 nenem [ENE [| ; ; WP 0109034831 [em Trasammenem — [ERES DT Tabela 4D. Exemplos de enzimas quinase GMP GenBank 4 Nó de Identifi. Referência ; renBan| lúmero de Identifi- Organismo UniProt cação de Sequências RREO cs cc He E roms Femepis ER O [rs Bra Fra O O 42 AFO49847.1 [eme | reescemenes pao norre [Bege 50 inhi, : AAB8S711.1 CAKA5182 1 4 Anoggo0300 Aspergillus niger CBS 513.88 | Sopy GU Saccharomyces cerevisiae AAA3A657.1 St ATCC 204508 / S288c P15454 Gmk Clostridium acetobutylicum AAK79684.1 s ATCC 824 Q97IDO

FE O A [eme [esamesíea [west o [A [em amasse o women o [A Gmk Colwellia psychrerythraea Q47UB3 de AAZ24463 28 Vibrio psychroerythus) [eme | paneteemensta fase das planktis WP 0112809841 Gmk Psychrobacter arcticus Q4FOY7 30 ABMOS5306 Gmk Psychromonas ingrahamii AITOP1 WP 0033926011 Gmk Pseudomonas syringae Q477Y8 31

[0063] NDP Quinases. Um nucleosídeo difosfato quinase (NDP qui- nase) é uma enzima que catalisa a troca de fosfato terminal entre dife- rentes NDPs (por exemplo, ADP, CDP, GDP, UDP) e nucleosídeos tri- fosfatos (NTP) em uma forma reversível de produzir NTPs (p.ex., ATP, CTP, GTP, UTP). Em algumas modalidades, o NDP quinase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfato para o ADP para produção de trifosfato de adenosina (ATP). Em algu- mas modalidades, o NDP quinase catalisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfato para CDP para produzir tri- fosfato de citidina (CTP). Em algumas modalidades, o NDP quinase ca- talisa a transferência de fosfato a partir de uma molécula doadora de fosfato para GDP para a produção de trifosfato de guanosina (GTP). Em algumas modalidades, o NDP quinase catalisa a transferência de fos- fato a partir de uma molécula doadora de fosfatos para UDP para pro- duzir trifosfato de uridina (UTP). Exemplos não limitantes de NDP qui- nases são fornecidos na Tabela 5. Em algumas modalidades, mais de um NDP quinase é usado em uma mistura de reação.

Em algumas mo- dalidades, 2, 3, 4, ou 5 NDP quinases diferentes são usados em uma mistura de reação.

Tabela 5. Exemplos de NDP quinases Referência Organismo GenBank * Número de Identifica- 9 UniProt 4 ção de Sequências ermáftas EE ea Te Teses 42 De e em | = Ndk Escheri CAA40780.1 53 eríchia coli K-12 POA763 A A CAK40394.1 4 no9go5870 | Aspergillus niger CBS 513.88 A2QUIJ6 e amem am 204508 / S288c P36010 43 53 [e dem me e [Ne feras o [wo o [o [Nao [Femonama o [mes [OO

[Não — Tmestospraeesaata women Do 1

PRE O A [er [esamtome neo — BRR o |

EXP [o een EEE |

[0064] Exemplos não limitantes de quinases que convertem NDP ao NTP incluem nucleosídeo difosfato quinase, polifosfato quinase e pi- ruvato quinase. Como discutido aqui, variantes termoestáveis das enzi- mas anteriormente mencionadas são abrangidas pela presente descri- ção. Em algumas modalidades, o(s) NDP quinase(s) é/são obtido(s) a partir de Aquifex aeolicus.

[0065] Fosforilação de NMPs a NTPs ocorre, em algumas modali- dades, através da via da quinase dependente do polifosfato, onde fos- fato de alta energia é transferido de polifosfato para ADP através de um polifosfato quinase (PPK). Em algumas modalidades, o polifosfato qui- nase pertence à família do polifosfato quinase 1 (PPK1), que transfere fosfato de alta energia do polifosfato para o ADP para formar ATP. Este ATP é posteriormente usado pelos NMP quinases (por exemplo, AMP quinase, UMP quinase, GMP quinase e CMP quinase) para converter NMP's para os seus difosfatos ribonucleotídeo cognatos (NDPs). Além disso, o ATP é posteriormente usado por nucleotídeo difosfato quinase para converter NDPs para NTP's.

[0066] Em algumas modalidades, o polifosfato quinase pertence à família polifosfato quinase 2 (PPK2). Em algumas modalidades, o poli- fosfato quinase pertence à família do PPK2 de classe 1, que transfere fosfato de alta energia do polifosfato para NDPs para formar NTPs. O ATP produzido pelo sistema é usado como um doador de fosfatos de alta energia para converter NMPs para NDPs. Em algumas modalida- des, o polifosfato quinase pertence à família PPK2 de classe Ill, que transfere fosfato de alta energia do polifosfato para o NMPs e NDPs para formar NTPs. Em algumas modalidades, o PPK2 classe Ill é usado sozinho para produzir NTPs a partir de NMPs. Em outras modalidades, PPK?2 classe Ill é usado em combinação com outras quinases. PPK2 classe Ill produz ATP a partir de ADP, AMP e polifosfato, que é posteri- ormente usado pelo NMP e DNP quinases para converter NMPs para NTPs.

[0067] Exemplos não limitantes de enzimas PPK2 para uso como fornecidos aqui estão listados na Tabela 2. Assim, em algumas modali- dades, as enzimas PPK2 termoestáveis. Por exemplo, as enzimas PPK2 podem ser enzimas PPK?2 classe Ill termoestáveis, que favore- cem a síntese de ATP durante a polimerização do polifosfato e conver- tem ambos ADP e AMP em ATP. Em algumas modalidades, as enzimas PPK2 são usadas para converter um polifosfato, como hexametafosfato, para ATP, com taxas que variam, por exemplo, de 10 a 800 mM por hora (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 ou 800 mM por hora).

[0068] Polifosfato e outros fosfatos de alta energia. Moléculas de fosfato de alta energia (moléculas doadoras de fosfato) liberam energia na hidrólise da ligação de alta energia, proporcionando, assim, uma fonte de energia para as reações bioquímicas. Polifosfato (PolyPn) e ou- tras moléculas de fosfato de alta energia podem ser usadas como fontes de fosfato para produção de NTP's, e produção a jusante de RNA, como descrito aqui. PolyPn, por exemplo, compreende unidades repetidas de fosfato (PO4) ligado por átomos de oxigênio compartilhados. Fosforila- ção dos substratos/moléculas específicos por quinases da presente descrição envolve a doação de um grupo fosfato a partir do PolyPrn, pro- duzindo assim PolyPn-1.

[0069] A presente descrição não é limitada pelo número de grupos fosfato no polifosfato. Em algumas modalidades, PolyPn compreende pelo menos 3 grupos fosfato (PolyP3). Em algumas modalidades, PolyPn compreende pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 grupos fosfato. Em algumas modalidades, o PolyPrn é o hexametafosfato.

[0070] Outros exemplos de moléculas de fosfato de alta energia in- cluem, mas não estão limitados a NTP (p.ex., ATP), NDP (p.ex., ADP), NMP (p.ex., AMP), fosfoenolpiruvato, 1,3-bisfosfoglicerato, fosfocrea- tina, piruvato de fosfoenol, glicose 1-fosfato, frutose 6-fosfato e glicose 6-fosfato. Em algumas modalidades, mais de um fosfato de alta energia é usado em uma mistura de reação. Em algumas modalidades, 2, 3, 4, ou 5 diferentes fosfatos de alta energia são usados em uma mistura de reação.

[0071] Modelos. Um modelo de DNA inclui um promotor, opcional- mente um promotor induzível, ligado de maneira funcional à sequência de codificação de um produto de RNA desejado e, opcionalmente, um terminador de transcrição. Um modelo de DNA é normalmente fornecido em um vetor, como um plasmídeo, embora outros formatos de modelo possam ser usados (por exemplo, modelos de DNA linear gerados pela reação em cadeia da polimerase (PCR), síntese química, ou outros meios conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, mais de um modelo de DNA é usado em uma mistura de reação. Em algumas mo- dalidades, 2, 3, 4, ou 5 modelos de DNA diferentes são usados em uma mistura de reação.

[0072] Um promotor ou um terminador pode ser uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência modificada. Em algumas modali- dades, uma sequência modificada é modificada para melhorar a ativi- dade transcricional. Em algumas modalidades, o promotor é uma se- quência de ocorrência natural. Em outras modalidades, o promotor é uma sequência modificada. Em algumas modalidades, o terminador é uma sequência de ocorrência natural. Em outras modalidades, o termi- nador é uma sequência modificada.

[0073] Polimerases. Polimerases são enzimas que sintetizam polí- meros de ácidos nucleicos. Polimerases da presente descrição incluem polimerases de RNA dependentes de DNA e polimerases de RNA de- pendentes de RNA. Exemplos não limitantes de polimerases são forne- cidos na Tabela 6. Em algumas modalidades, uma polimerase é um RNA polimerase, como o RNA polimerase T7. Em algumas modalida- des, mais de uma polimerase é usada em uma mistura de reação. Em algumas modalidades, 2, 3, 4, ou 5 polimerases diferentes são usadas em uma mistura de reação. Tabela 6. Exemplos de RNA Polimerases [Enima = [orgasmo === | GenBank*Uniprotá =|

[0074] Produtos de RNA. O RNA produzido pelos métodos forne- cidos aqui pode ser qualquer forma de RNA, incluindo RNA de fita sim- ples (SSRNA) e RNA de fita dupla (ASRNA). Exemplos não limitantes de RNA de fita simples inclui RNA mensageiro (mMRNA), micro RNA (mMIRNA), pequenas de RNA de pequena interferência (SiRNA), e o RNA antissenso. O RNA de fita dupla aqui inclui moléculas inteiras de fita dupla que não contêm uma região de fita simples (por exemplo, um laço ou uma saliência), bem como parcialmente moléculas de fita dupla que contêm uma região de fita dupla e uma região de fita simples (por exem- plo, um laço ou uma saliência). Assim, RNA curto em forma de grampo de cabelo (ShRNA) pode ser produzido pelos métodos da presente des- crição.

[0075] O RNA produzido pelos métodos fornecidos aqui pode ser modificado conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, o RNA é produzido de acordo com um método descrito aqui e, posteriormente, modificado. Em algumas modalidades, o RNA é produzido de acordo com um método descrito aqui usando um material de partida modificado. Em algumas modalidades, o material de partida modificado é uma nu- cleobase. Em algumas modalidades, o material de partida modificado é um nucleosídeo. Em algumas modalidades, o material de partida modi- ficado é um nucleotídeo.

[0076] Em algumas modalidades, o RNA modificado compreende uma modificação de estrutura. Em alguns casos, a modificação de es- trutura resulta em uma meia-vida mais longa para o RNA devido à redu- ção da degradação mediada por nuclease. Esta por sua vez resulta em uma meia-vida mais longa. Exemplos de modificações adequadas de estrutura incluem, mas não estão limitados a, modificações de fosforo- tioato, modificações fosforoditioato, modificações p-etóxi, modificações de metilfosfonato, modificações de metilfosforotioato, fosfatos de alquila e de arila (em que o oxigênio fosfonato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), alquilfosfotriésteres (nos quais a porção do oxi- gênio carregada é alquilada), modificações de estrutura do ácido nu- cléico peptídico (PNA), modificações de estrutura de ácido nucleico blo- queado (LNA), e similares. Estas modificações podem ser usadas em combinação umas com as outras e/ou em combinação com os acopla- mentos da estrutura do fosfodiéster.

[0077] Como alternativa ou adicionalmente, o RNA pode incluir ou- tras modificações, incluindo modificações na base ou nas porções do açúcar. Exemplos incluem o RNA tendo açúcares que são covalente- mente ligados a grupos orgânicos de baixo peso molecular diferente de um grupo hidroxila na posição 3' e outros diferentes de um grupo de fosfato na posição 5' (p.ex., uma ribose 2'-O-alquilada), RNA tendo açú- cares como arabinose, em vez de ribose. O RNA também inclui purinas e pirimidinas substituídas como bases modificadas de propina C-5

(Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). Outras purinas e pirimidinas incluem, mas não estão limitadas a, 5-metilcitosina, 2-ami- nopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina. Ou- tras modificações são bem conhecidas por um versado na técnica.

[0078] Vias de produção de NTP

[0079] São fornecidos aqui sistemas, métodos, composições e kits para a produção de NTPs através de várias vias enzimáticas diferentes, cada uma das quais usam fontes de energia como descrito aqui, e ma- térias-primas de baixo custo da mistura de reação. Estas vias enzimáti- cas podem ser estendidas, em algumas modalidades, para a produção de RNA (por exemplo, mRNA ou RNA de fita dupla) através da adição de um modelo de DNA e polimerase para a mistura de reação (ver, por exemplo, FIG. 1).

[0080] Deve ser entendido que qualquer uma das enzimas da via descritas aqui (por exemplo, nucleases, quinases e/ou polimerases) po- dem ser obtidas de células sem modificações (nativa) ou modificadas. Em algumas modalidades, a(s) enzima(s) da via é(são) secretada(s) a partir das células (por exemplo, as células são modificadas para secre- tar a(s) enzima(s)). Em outras modalidades, as enzimas da via são ob- tidas a partir de lisado(s) celular(es) das células. Em algumas modalida- des, as enzimas da via são componentes do(s) lisado(s) celular(es) das células, que neste caso, o(s) lisado(s) celular(es) é(são) adicionado(s) ou serve(m) como a mistura de reação em uma reação biossintética. Nos casos em que o(s) lisado celular(es) é(são) usado(s) em ou serve(m) como a mistura de reação, o lisado celular pode ser exposto a condições para eliminar atividades enzimáticas indesejáveis, como des- crito abaixo, antes de produzir o produto (NTP e/ou RNA) de interesse.

[0081] Conversão de NDP ao NTP. Em alguns aspectos, os NTPs são produzidos usando NDPs como substratos, como ilustrado na Fig.

2A. Por exemplo, métodos de produção de NTP podem incluir incuba- ção em uma mistura de reação NDPs, um (p.ex., 1, 2, 3, ou 4) polifosfato quinase, e um (por exemplo,1, 2, 3, ou 4) polifosfato em condições ade- quadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação para produção de NTP inclui um NDP quinase (ver, por exem- plo, Tabela 5). Em algumas modalidades, a mistura de reação da pro- dução de NTP pode também incluir um nucleosídeo quinase.

[0082] Conversão de NMP ao NTP. Em alguns aspectos, os NTPs são produzidos usando 5' NMPs como substratos, como ilustrado na Fig. 2B. Por exemplo, métodos de produção de NTP podem incluir incu- bação em uma mistura de reação 5'-NDPs, um (p.ex., 1, 2, 3, ou 4) po- lifosfato quinase, e um (por exemplo,1, 2, 3, ou 4) polifosfato em condi- ções adequadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação para produção de NTP inclui um NMP quinase (ver, por exemplo, Tabela 4) e/ou um NDP quinase (ver, p.ex., Tabela 5). Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de NTP pode também incluir um nucleosídeo quinase.

[0083] Conversão de nucleosídeos ao NTP. Em alguns aspectos, os NTPs são produzidos usando nucleosídeos como substratos, como ilustrado na Fig. 2C. Por exemplo, métodos de produção de NTP podem incluir incubação em uma reação nucleosídeos, um (p.ex., 1, 2, 3, ou 4) polifosfato quinase, e um (por exemplo,1, 2, 3, ou 4) polifosfato em con- dições adequadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação para produção de NTP inclui um nucleosídeo qui- nase (ver, por exemplo, Tabela 3) e/ou um NMP quinase (ver, p.ex., Tabela 4) e/ou um NDP quinase (ver, por exemplo, Tabela 5).

[0084] Conversão de nucleobases ao NTP. Em alguns aspectos, os NTPs são produzidos usando nucleobases como substratos, como ilustrado na Fig. 2D. Por exemplo, métodos de produção NTP podem incluir incubação em uma mistura de reação nucleobases, um (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4) fosforibosiltransferase, um fosforibosilpirofosfato, um (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4) polifosfato quinase, e um (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4) polifosfato quinase em condições adequadas para a pro- dução de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação para produção de NTP pode incluir também um NMP quinase (ver, por exem- plo, Tabela 4) e/ou um NDP quinase (ver, p.ex., Tabela 5). Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de NTP pode também incluir um nucleosídeo quinase.

[0085] Em algumas modalidades, uma via biossintética para produ- ção de NTPs e/ou RNA pode usar RNA celular como o substrato, quer primeiro pela despolimerização do RNA celular em NDPs ou primeiro pela despolimerização do RNA celular em NMPs.

[0086] Conversão de nucleobases e ribose ao NTP. Em alguns aspectos, os NTPs são produzidos usando nucleobases como substra- tos, como ilustrado na Fig. 2E. Por exemplo, métodos de produção de NTP podem incluir incubação em uma reação nucleobases, D-ribose, riboquinase, fosfopentomutase, pelo menos um (p.ex., 1, 2, 3, ou 4) nu- cleosídeo fosforilase, pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4) poli- fosfato quinase, e pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4) polifosfato em condições adequadas para a produção de NTPs. Em algumas mo- dalidades, a mistura de reação para produção de NTP pode incluir tam- bém pelo menos um NMP quinase (ver, por exemplo, Tabela 3) e/ou pelo menos um NDP quinase (ver, p.ex., Tabela 4) e/ou um nucleosídeo quinase.

[0087] Conversão do RNA celular em NTP através de NDP. Em alguns aspectos, o NTP é produzido usando um RNA celular como um substrato por primeiro quebrar (degradar/despolimerizar) o RNA celular em NDPs e, em seguida, converter NDPs em NTPs, como ilustrado na Fig. 3A. Por exemplo, métodos de produção de NTP podem incluir incu-

bação em uma mistura de reação RNA celular, uma fosforilase polinu- cleotídica (PNPase) e um polifosfato em condições adequadas para a produção de NDP's. Para continuar com a produção de NTPs, a mistura de reação, em algumas modalidades, também compreende um polifos- fato quinase e polifosfato. Assim, os métodos compreendem ainda incu- bar a mistura de reação em condições adequadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende ainda um NDP quinase. Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de NTP pode também incluir um nucleosídeo quinase.

[0088] Conversão do RNA celular em NTP através de NMP. Em alguns aspectos, o NTP é produzido usando um RNA celular como um substrato por primeiro quebrar o RNA celular em 5'-NDPs e, em se- guida, converter NMPs em NDPs e NTPs, como ilustrado na Fig. 3B. Por exemplo, métodos de produção de NTP podem incluir incubação em uma mistura de reação RNA celular, e uma ribonuclease em condi- ções adequadas para a produção de 5'-NMPs. Para continuar com a produção de NTP's, a mistura de reação, em algumas modalidades, tam- bém compreende um polifosfato quinase e um polifosfato. Assim, os métodos compreendem ainda incubar a mistura de reação em condi- ções adequadas para a produção de NTPs. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende ainda um NDP quinase. Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de NTP pode também incluir um nucleosídeo quinase. Alternativamente, métodos de produção de NTP podem incluir incubação em uma mistura de reação RNA celu- lar, uma ribonuclease que cliva o RNA em 3'-NMP's, e uma fosfatase apropriada (por exemplo, fosfatase alcalina ou outros) em condições adequadas para a produção de nucleosídeos. A fosfatase seria então eliminada antes de prosseguir com a produção de NTP's.

[0089] Vias de produção de RNA

[0090] Como mostrado na Fig. 1, o RNA (p.ex., MRNA ou RNA de fita dupla) pode ser produzido através de várias vias enzimáticas dife- rentes, cada uma das quais usam fontes de energia como descrito aqui, e matérias-primas de baixo custo na(s) mistura(s) de reação. Assim, sis- temas, métodos, composições e kits para a produção de RNA são for- necidos aqui.

[0091] Conversão de NDP ao RNA. Em alguns aspectos, o RNA é produzido usando NDPs como substratos, como ilustrado na Fig. 2A. Por exemplo, métodos de produção de RNA podem incluir incubação em uma mistura de reação NDPs, um polifosfato quinase, um polifos- fato, um modelo de DNA e uma polimerase em condições adequadas para a produção de RNA. Em algumas modalidades, a mistura de rea- ção da produção de RNA pode também incluir um NDP quinase (ver, p.ex., Tabela 5). Em algumas modalidades, a mistura de reação da pro- dução de RNA pode também incluir um nucleosídeo quinase.

[0092] Conversão de NMP ao RNA. Em alguns aspectos, o RNA é produzido usando 5' NMP como substratos, como ilustrado na Fig. 2B. Por exemplo, métodos de produção de RNA podem incluir incubação em uma mistura de reação 5' NMPs, um polifosfato quinase, um polifos- fato, um modelo de DNA e uma polimerase em condições adequadas para a produção de RNA. Em algumas modalidades, a mistura de rea- ção para produção de RNA pode incluir também um NMP quinase (ver, por exemplo, Tabela 4) e/ou um NDP quinase (ver, p.ex., Tabela 5). Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de RNA pode também incluir um nucleosídeo quinase.

[0093] Conversão de nucleosídeos ao RNA. Em alguns aspectos, o RNA é produzido usando nucleosídeos como substratos, como ilus- trado na Fig. 2C. Por exemplo, métodos de produção de RNA podem incluir incubação em uma mistura de reação nucleosídeos, um polifos- fato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA e uma polimerase em condições adequadas para a produção de RNA. Em algumas modalida- des, a mistura de reação para produção de RNA inclui um nucleosídeo quinase (ver, por exemplo, Tabela 3) e/ou um NMP quinase (ver, p.ex., Tabela 4) e/ou um NDP quinase (ver, por exemplo, Tabela 5).

[0094] Conversão do RNA celular em RNA através de NDP. Em alguns aspectos, o RNA é produzido usando um RNA celular como um substrato por primeiro quebrar o RNA celular em NDPs como ilustrado na Fig. 3A. Por exemplo, métodos de produção de RNA podem incluir incubação em uma mistura de reação RNA celular, uma fosforilase po- linucleotídica (PNPase) e um polifosfato em condições adequadas para a produção de NDPs. Antes de prosseguir para a produção de RNA, pode ser vantajoso eliminar a PNPase para evitar a degradação do pro- duto final. Assim, os métodos podem compreender ainda a eliminação da PNPase, e incubação da mistura de reação, ou em uma segunda mistura de reação, os NDPs, um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA e uma polimerase em condições adequadas para a pro- dução de RNA. Em algumas modalidades, a mistura de reação compre- ende ainda um NDP quinase. Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de RNA pode também incluir um nucleosídeo qui- Nnase.

[0095] Em algumas modalidades, essas enzimas da via são capa- zes de resistir a condições de eliminação, como discutido abaixo, e, as- sim, todos os componentes de reação são incluídos em uma única mis- tura de reação (uma etapa). Por exemplo, o método para produção de RNA pode compreender (a) incubação em uma mistura de reação o RNA celular, uma PNPase, um fosfato, um polifosfato quinase, um poli- fosfato, um modelo de DNA e uma polimerase sob condições adequa- das para a produção de NDPs (opcionalmente, onde a mistura de rea- ção compreende ainda um NDP quinase); (b) eliminação da PNPase; e (c) incubação da mistura de reação sob condições adequadas para a produção de RNA.

[0096] Conversão do RNA celular em RNA através de NMP. Em alguns aspectos, o RNA é produzido usando um RNA celular como um substrato por primeiro quebrar o RNA celular em 5' NMPs, como ilus- trado na Fig. 3B. Por exemplo, métodos de produção de RNA podem incluir incubação em uma mistura de reação RNA celular e uma ribonu- clease em condições adequadas para a produção de 5-NMPs. Antes de prosseguir para a produção de RNA, pode ser vantajoso eliminar a ribonuclease para evitar a degradação do produto final. Assim, os mé- todos podem compreender ainda a eliminação da ribonuclease, e incu- bação da mistura de reação, ou em uma segunda mistura de reação, os 5' NMPs, um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA e uma polimerase em condições adequadas para a produção de RNA. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende ainda um NMP quinase e/ou um NDP quinase. Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de RNA pode também incluir um nucleosídeo qui- Nnase.

[0097] Em algumas modalidades, essas enzimas da via são capa- zes de resistir a condições de eliminação, como discutido abaixo, e, as- sim, todos os componentes de reação são incluídos em uma única mis- tura de reação (uma etapa). Por exemplo, o método para produção de RNA pode compreender (a) incubação em uma mistura de reação o RNA celular, uma ribonuclease, um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA e uma polimerase sob condições adequadas para a produção de NMP's (opcionalmente, onde a mistura de reação com- preende ainda um NMP quinase e/ou NDP quinase); (b) eliminação da ribonuclease; e (c) incubação da mistura de reação sob condições ade- quadas para a produção de RNA.

[0098] Conversão de nucleobases ao RNA. Em alguns aspectos,

o RNA é produzido usando nucleobases como substratos, como ilus- trado na Fig. 2D. Por exemplo, métodos de produção de RNA podem incluir incubação em uma mistura de reação nucleobases, um (p.ex., 1, 2, 3, ou 4) fosforibosiltransferase, um fosforibosilpirofosfato, um polifos- fato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA e um RNA polimerase em condições adequadas para a produção de RNA. Em algumas moda- lidades, a mistura de reação para produção de RNA pode incluir também um NMP quinase (ver, por exemplo, Tabela 4) e/ou um NDP quinase (ver, p.ex., Tabela 5). Em algumas modalidades, a mistura de reação da produção de RNA pode também incluir um nucleosídeo quinase.

[0099] Conversão de nucleobases e ribose ao RNA. Em alguns aspectos, o RNA é produzido usando nucleobases como substratos, como ilustrado na Fig. 2E. Por exemplo, métodos de produção de RNA podem incluir incubação em uma mistura de reação nucleobases, D- ribose, riboquinase, fosfopentomutase, pelo menos um (p.ex., 1, 2, 3, ou 4) nucleosídeo fosforilase, pelo menos um polifosfato quinase, pelo menos um polifosfato, pelo menos um modelo de RNA e pelo menos um RNA polimerase em condições adequadas para a produção de RNA. Em algumas modalidades, a mistura de reação para produção de RNA pode incluir também pelo menos um NMP quinase (ver, por exemplo, Tabela 3) e/ou pelo menos um NDP quinase (ver, p.ex., Tabela 4) e/ou um nucleosídeo quinase.

[0100] Fontes de enzima

[0101] Qualquer (por exemplo, um, dois, três ou mais) ou todas as enzimas da via fornecida(s) (por exemplo, nucleases, quinases, polime- rases, etc.) podem ser enzimas endógenas (sem modificações) ou en- zimas recombinantes expressadas por uma célula. Em algumas moda- lidades, as enzimas da via são fornecidas como um componente de um lisado celular, que é incluído em uma mistura de reação. Em algumas modalidades, as enzimas da são purificadas a partir de um lisado celular incluído em uma mistura de reação. Em algumas modalidades, a enzima da via é fornecida como um componente de um lisado celular e uma enzima da via é purificada a partir de um lisado celular. Em algumas modalidades, a enzima da via é secretada e opcionalmente de purifica- das de caldo de células.

[0102] Em algumas modalidades, uma enzima da via (por exemplo, nucleases, quinases, polimerases, etc.) é uma enzima endógena purifi- cada a partir de uma célula e inclui uma mistura de reação como uma enzima purificada. Em algumas modalidades, a enzima da via (por exemplo, nucleases, quinases, polimerases, etc.) é uma enzima endó- gena fornecida como um componente de um lisado celular, que é inclu- ido em uma mistura de reação. Em algumas modalidades, uma enzima da via (por exemplo, nucleases, quinases, polimerases, etc.) é uma en- zima recombinante purificada a partir de uma célula e inclui uma mistura de reação como uma enzima purificada. Em algumas modalidades, uma enzima da via (por exemplo, nucleases, quinases, polimerases, etc.) é uma enzima recombinante fornecida como um componente de um li- sado celular, que é incluído em uma mistura de reação. Em algumas modalidades, a enzima da via é secretada e opcionalmente de purifica- das de caldo de células.

[0103] A presente descrição também engloba as enzimas endóge- nas e as enzimas recombinantes secretadas por uma célula. Assim, em algumas modalidades, uma enzima da via (por exemplo, nucleases, qui- nases, polimerases, etc.) é uma enzima endógena purificada a partir de uma célula. Em algumas modalidades, uma enzima da via (por exemplo, nucleases, quinases, polimerases, etc.) é uma enzima recombinante se- cretada de uma célula.

[0104] Eliminação de atividades enzimáticas indesejáveis

[0105] Em várias modalidades fornecidas aqui, as enzimas prepa-

radas a partir de células ou lisados de células que expressam as enzi- mas da via são usadas em uma mistura de reação para a produção do NTP e/ou RNA. Nestas células ou lisados celulares, existem enzimas que podem ter efeitos deletérios sobre a produção de NTP e/ou de RNA. Exemplos não limitantes de tais enzimas incluem fosfatases, nucleases, proteases, desaminases, oxidoreductases, e/ou hidrolases, como as ex- pressadas por células de Escherichia coli. Fosfatases removem grupos fosfato (por exemplo, conversão de NMPs para nucleosídeos, conver- tendo NDPs em NMPs, ou convertendo NTPs em NDP'ss), que reduzem a produção de NTP devido aos ciclos fúteis de fosforilação/desfosforila- ção de nucleotídeos. Nucleases clivam ácidos nucleicos em monômeros ou oligôêômeros, que levam à degradação do produto de RNA (por exem- plo, por RNase) e/ou degradação do modelo de DNA (por exemplo, DNase). Proteases clivam proteínas em aminoácidos ou peptídeos, que degradam enzimas da via. Desaminases removem grupos amino, que reduzem as concentrações de NTP pela conversão de intermediários da via para substratos não úteis (por exemplo, xantina e hipoxantina) e pode levar a mutações em produtos de RNA (p.ex., C a U). Hidrolases (por exemplo, nucleosídeo hidrolase ou nucleotídeo hidrolase) clivam nucleosídeos ou nucleotídeos na base e nas porções do açúcar, que reduzem as concentrações de NTP devido à degradação irreversíveis de nucleotídeos. Oxidoreductases catalisam a transferência de elétrons de uma molécula (o oxidante) para outra molécula (o redutor). Reações de oxidação e redução podem ser, por exemplo, nucleobases danifica- das no DNA e/ou RNA, levando a erros de transcrição e/ou tradução, ou proteínas ou enzimas danificadas levando à perda de função.

[0106] Assim, é vantajoso em muitas modalidades para eliminar es- sas atividades enzimáticas nativas ou outras atividades enzimáticas in- desejáveis em uma preparação enzimática, um lisado celular, e/ou uma mistura de reação. Neste documento, a "eliminação" de atividades en- zimáticas pode ser parcial (por exemplo, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da atividade é eliminada) ou completa (100% da atividade é eliminada) de uma atividade enzimática indesejável. Como discutido aqui, a atividade enzimática pode ser eliminada por mo- dificação genética, inativação condicional e/ou separação física. Outros métodos de eliminação também podem ser usados. A atividade enzimá- tica indesejável pode resultar de pelo menos uma (por exemplo, 1,2,3, 4 ou 5) enzima nativa (endógena), incluindo, mas não se limitando a, fosfatases, nucleases, proteases, desaminases, oxidoreductases e/ou hidrolases.

[0107] Em algumas modalidades, a atividade da fosfatase indese- jada é eliminada em uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação. Em algumas modalidades, a atividade da nu- clease indesejada é eliminada em uma preparação enzimática, um |li- sado celular e/ou uma mistura de reação. Em algumas modalidades, a atividade de proteases indesejada é eliminada em uma preparação en- zimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação. Em algumas modalidades, a atividade da desaminase indesejada é eliminada em uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de re- ação. Em algumas modalidades, a atividade de hidrolase indesejada é eliminada em uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação.

[0108] Atividades enzimáticas indesejadas (por exemplo, nativas) podem ser eliminadas usando abordagens genéticas, condicionais ou de separação. Em algumas modalidades, uma abordagem genética é usada para remover a atividade enzimática indesejável. Assim, em al- gumas modalidades, as células são modificadas para reduzir ou elimi- nar as atividades enzimáticas indesejáveis. Exemplos de abordagens genéticas que podem ser usadas para reduzir ou eliminar a atividade enzimática indesejável incluem, mas não estão limitados a, secreção, gene nocaute, e direcionamento de protease. Em algumas modalida- des, uma abordagem condicional é usada para remover a atividade en- zimática indesejável. Assim, em algumas modalidades, enzimas inde- sejadas que exibem atividades indesejadas permanecem em uma pre- paração enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação e são seletivamente inativadas. Exemplos de abordagens condicionais que podem ser usadas para reduzir ou eliminar a atividade enzimática inde- sejável incluem, mas não estão limitadas a, mudanças na temperatura, PH, sal, detergentes, solventes orgânicos (por exemplo, álcool), e o uso de inibidores químicos. Em algumas modalidades, uma abordagem de separação/ purificação é usada para remover a atividade enzimática in- desejável. Assim, em algumas modalidades, enzimas indesejadas que exibem atividades indesejadas são fisicamente removidas de uma pre- paração enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação. Exemplos de abordagens de separação que podem ser usados para reduzir ou eliminar a atividade enzimática indesejável incluem, mas não estão limitados a, precipitação, imobilização, filtração e cromatografia.

[0109] Abordagens genéticas. Em algumas modalidades, as célu- las expressando uma enzima e/ou modelo de DNA de uma via de pro- dução de NTP e/ou de RNA são modificadas para reduzir ou eliminar atividades enzimáticas indesejáveis. Em algumas modalidades, um gene que codifica uma enzima exibindo uma atividade indesejada é ex- cluído da célula. Em algumas modalidades, um gene que codifica uma enzima exibindo uma atividade indesejada é modificado de modo que o produto gênico resultante se torna não funcional. Em algumas modali- dades, uma enzima exibindo uma atividade indesejada é modificada para incluir uma sequência de reconhecimento da protease sítio espe- cífica em sua sequência de proteína de modo que a enzima pode ser "direcionada" e clivada para inativação (ver, por exemplo, publicação

US 2012/0052547 A1, publicada em 1 de março, 2012; Publicação In- ternacional WO 2015/021058 A2, publicada em 12 de fevereiro, 2015; e publicação internacional WO 2012/030980, publicada em 8 de março, 2012, cada uma das quais é incorporada aqui por referência).

[0110] Clivagem de uma enzima contendo uma sequência de reco- nhecimento de protease sítio específico resulta do contato com uma pro- tease sítio específica cognata de que é sequestrada no periplasma da célula (separado da enzima alvo) durante a fase de crescimento celular (por exemplo, como as células modificadas são cultivadas) e é colocada em contato com a enzima durante a fase de produção de ATP (por exemplo, após lise celular para produzir um lisado celular). Assim, as células modificadas da presente descrição incluem, em algumas moda- lidades, (i) um ácido nucleico modificado codificando uma enzima que exibe uma atividade indesejada e inclui uma sequência de reconheci- mento de protease sítio específica na sequência proteica da enzima, e (ii) um ácido nucleico modificado codificando uma protease sítio espe- cífico que cliva uma sequência de reconhecimento de protease sítio es- pecífica da enzima e inclui uma sequência de direcionamento periplás- mico. Esta sequência de direcionamento periplásmico é responsável por sequestrar a protease sítio específica para o espaço periplásmico da célula até a célula ser lisada. Exemplos de sequências de direciona- mento periplásmico são conhecidos.

[0111] Exemplos de proteases que podem ser usadas de acordo com a presente descrição incluem, mas não se limitam a, alanina car- boxipeptidase, astacina, leucil aminopeptidase bacteriana, procoagu- lante de câncer, catepsina B, clostripaina, citosol alanil aminopeptidase, elastase, endoproteinase Brg-C, enteroquinase, gastricsina, gelatinase, Gly-X carboxipeptidase, glicil endopeptidase, rinovírus humano 3C pro- tease, hipodermina C, serina endopeptidase específica de Iga, leucila aminopeptidase, leucila endopeptidase, IysC, carboxipeptidase pro-X li- sossomais, lisila aminopeptidase, metionila aminopeptidase, mixobac- teria, nardilisina, endopeptidase pancreática E, picornaina 2B, picor- naina 3C, proendopeptidase, prolil aminopeptidase, proproteina conver- tase |, proproteina convertase Il, russelisina, sacaropepsina, semenoge- lase, ativador de plasminogênio T, trombina, calicreína tecidual, vírus do mosaico do tabaco (TEV), togavirina, triptofanil aminopeptidase, ativa- dor do plasminogênio U, V8, venombina B, venombin BB e aminopepti- dase Xaa-pro.

[0112] Abordagens Condicionais. Em algumas modalidades, uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação inclui uma enzima exibindo atividade indesejada que é seletivamente inativada. Em algumas modalidades, uma enzima exibindo atividade in- desejada é seletivamente inativada ao expor a enzima a condições de eliminação (por exemplo, alta ou baixa temperatura, valor de pH ácido ou básico, sal elevado ou baixo, detergente, sal e/ou solvente orgânico).

[0113] Em algumas modalidades, uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação é exposta a uma temperatura que temporária ou irreversivelmente inativa a enzima exibindo atividade indesejada. "Temperatura de inativação" refere-se ao processo de aquecimento ou refrigeração de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação a uma temperatura suficiente para inativar (ou pelo menos parcialmente inativar) as enzimas alvo nativas. Geralmente, o processo de inativação da temperatura envolve a desna- turação (desdobramento) da enzima deletéria. A temperatura na qual uma enzima desnatura varia entre os organismos. Em E. coli, por exem- plo, as enzimas geralmente desnaturam a temperaturas acima de 41ºC. A temperatura de desnaturação pode ser maior ou menor do que 41ºC para outros organismos. Enzimas de um lisado celular, como fornecidas aqui, por ter inativada pela temperatura a uma temperatura de 0ºC a

95ºC ou superior. Em algumas modalidades, as enzimas de um lisado celular são inativadas pela temperatura a uma temperatura de O a 90ºC, O a 80ºC, 0 a 70ºC, 0 a 60ºC, O a 50ºC, 0 a 40ºC, 0 a 30ºC, 0 a 20 ºC, 0a10ºCou0a5C.Em algumas modalidades, as enzimas de um lisado celular são inativadas pela temperatura a uma temperatura de 5 a 95ºC, a 95ºC, 20 a 95ºC, 30 a 95ºC, 40 a 95ºC, 50 a 95ºC, 60 a 95ºC, 70 a 95ºC, 80 a 95ºC ou 90 a 95ºC. Por exemplo, as enzimas de um lisado de células de temperatura podem ser inativadas em uma temperatura de aproximadamente 40ºC, 42ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC, 70ºC, 75ºC, 80ºC, 85ºC, 90ºC ou 95ºC. Em algumas modalidades, as enzimas de um lisado celular são inativadas pela temperatura a uma temperatura de 50 a 80ºC. Em algumas modalidades, as enzimas de um lisado ce- lular são inativadas pela temperatura a uma temperatura de aproxima- damente 70ºC. Em algumas modalidades, as enzimas de um lisado ce- lular são inativadas pela temperatura a uma temperatura de aproxima- damente 60ºC.

[0114] Em algumas modalidades, uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são expostos a um ácido ou a uma base (mudança no pH) que temporária ou irreversivelmente ina- tiva uma enzima exibindo atividade indesejada. “Inativação ácida ou bá- sica" refere-se ao processo de ajuste de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação a um pH suficiente para inativar (ou pelo menos parcialmente inativar) uma enzima. Geralmente, o processo de inativação básica ou ácida envolve a desnaturação (des- dobramento) da enzima. O pH no qual uma enzima desnatura varia en- tre os organismos. Em E. coli, por exemplo, as enzimas nativas geral- mente desnaturam a pH acima de 7,5 ou abaixo de 6,5. O pH de des- naturação pode ser maior ou menor do que o pH de desnaturação para outros organismos. Enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação, como fornecidas aqui, podem ser inativadas pela base em pH de 7,5 a 14, ou superior. Em algumas mo- dalidades, as enzimas de um lisado celular são inativadas pela base em pH 8-14, 8,5-14, 9-14, 9,5-14, 10-14, 10,5-14, 11-14, 11,5-14, 12-14, 12,5-14, 13-14 ou 13,5-14. Em algumas modalidades, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de re- ação são inativados pela base a um pH de 7,5-13,5, 7,5-13, 7,5-12,5, 7,5-12,7,5-11,5, 7,5-11,7,5-10,5, 7,5-10, 7,5-9,5, 7,5-9, 7,5-8,5 ou 7,5-

8. Por exemplo, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação podem ser inativados pela base em um pH de aproximadamente 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5 ou 14. Enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação, como fornecidas aqui, podem ser inativadas pelo ácido em pH de 6,5 a 0, ou inferior. Em algumas moda- lidades, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são inativados pelo ácido a um pH de 6,5- 0,5, 6,5-1, 6,5-1,5, 6,5-2, 6,5-2,5, 6,5-3, 6,5-3,5, 6,5-4, 6,5-4,5, 6,5-5 ou 6,5-6. Em algumas modalidades, as enzimas de uma preparação enzi- mática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são inativados pelo ácido a um pH de 6-0, 5,5-0, 5-0, 4,5-0, 4-0, 3,5-0, 3-0, 2,5-0, 2-0, 1,5-0, 1-0 ou 0,5-0. Por exemplo, as enzimas de uma preparação enzi- mática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação podem ser inati- vados pelo ácido em um pH de aproximadamente 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 0u O.

[0115] Em algumas modalidades, uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são expostos a um sal supe- rior ou sal inferior (mudança na concentração do sal) que temporária ou irreversivelmente inativa uma enzima exibindo atividade indesejada. “Inativação do sal" refere-se ao processo de ajuste de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação a uma con- centração suficiente de sal para inativar (ou pelo menos parcialmente inativar) uma enzima.

Geralmente, o processo de inativação do sal en- volve a desnaturação (desdobramento) da enzima.

A concentração do sal na qual as enzimas desnaturam varia entre os organismos.

Em E. coli, por exemplo, as enzimas nativas geralmente desnaturam a uma concentração de sal abaixo de 600 nM.

A concentração de sal de des- naturação pode ser maior ou menor do que a concentração de sal de desnaturação para outros organismos.

Sais são combinações de ânions e cátions.

Exemplos não limitantes de cátions incluem lítio, sódio, po- tássio, magnésio, cálcio e amônio.

Exemplos não limitantes de ânions incluem acetato, cloreto, sulfato e fosfato.

Enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação, como forne- cidos aqui, podem ser inativadas por uma concentração de sal de 600- 1000 mM, ou superior.

Em algumas modalidades, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são inativados pelo sal a uma concentração de sal de 700-1000 mM, 750-1000 mM, 800-1000 mM, 850-1000 mM, 900-1000 mM, 950-1000 mM.

Em algumas modalidades, as enzimas de uma preparação enzi- mática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são inativados pelo sal a uma concentração de sal de 600-950 mM, 600-900 mM, 600- 850 mM, 600-800 mM, 600-750 mM, 600-700 mM ou 600-650 mM.

Por exemplo, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação podem ser inativados pelo sal em uma con- centração de sal de aproximadamente 600 mM, 650 mM, 700 mM, 750 MM, 800 mM, 850 mM, 900 mM, 950 mM ou 1000 mM.

Enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação, como fornecidos aqui, podem ser inativadas por uma concentração de sal de 400-0 mM, ou inferior.

Em algumas modalidades, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de re- ação são inativados pelo sal a uma concentração de sal de 350-0 mM, 300-0 MM, 250-0 MM, 200-0 MM, 150-0 MM, 100-0 mM ou 50-0 mM.

Em algumas modalidades, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são inativados pelo sal a uma concentração de sal de 400-50 mM, 400-100 mM, 400-150 mM, 400-200 mM, 400-250 mM, 400-300 mM ou 400-350 mM. Por exemplo, as enzimas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação podem ser inativados pelo sal em uma concentração de sal de aproximadamente 400 mM, 350 mM, 300 mM, 250 mM, 200 MM, 150 MM, 100 mM, 50 mM ou O mM.

[0116] Em algumas modalidades, um solvente orgânico é adicio- nado a uma preparação de enzima, um lisado celular e uma mistura de reação inativar uma enzima exibindo atividade indesejada. Exemplos não limitantes de solventes orgânicos incluem etanol, metanol, éter, dioxano, acetona, cetona etílica e metílica, acetonitrila, sulfóxido de di- metila e tolueno.

[0117] Em algumas modalidades, um detergente é adicionado a uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de re- ação para inativar uma enzima exibindo atividade indesejada. Exem- plos não limitantes de detergentes incluem dodecil sulfato de sódio (SDS), brometo de etil trimetilamônio (ETMAB), brometo de lauril trimetil amônio (LTAB) e cloreto de lauril trimetilamónio (LTAC).

[0118] Em algumas modalidades, um inibidor químico é adicionado a uma preparação de enzima, um lisado celular e/ou uma mistura de reação para inativar uma enzima exibindo atividade indesejada. Exem- plos não limitantes de inibidores químicos incluem ortovanadato de só- dio (inibidor de proteínas fosfotirosil fosfatases), fluoreto de sódio (inibi- dor de fosfoseril e fosfotreonil fosfatases), pirofosfato de sódio (inibidor da fosfatase), fosfato de sódio e/ou fosfato de potássio. Em algumas modalidades, os inibidores químicos são selecionados a partir de uma biblioteca inibidora química.

[0119] Para qualquer das abordagens condicionais usadas aqui,

deve ser entendido que qualquer das enzimas da via presentes no li- sado celular ou mistura de reação também podem ser expostas a con- dições de eliminação (por exemplo, alta ou baixa temperatura, valor de pH ácido ou básico, sal de teor alto ou baixo, detergente e/ou solvente orgânico). Assim, em algumas modalidades, as enzimas da via (por exemplo, polifosfato quinase, NMP quinase, NDP quinase e/ou polime- rase) podem suportar condições de eliminação. Uma enzima é conside- rada para suportar condições de eliminação se a enzima, após a expo- sição a condições de eliminação, conserva, no mínimo, 10% (por exem- plo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou, pelo menos, 90% de sua atividade enzimática (em relação à atividade enzi- mática antes da exposição à condição de inativação).

[0120] Por exemplo, quando as enzimas nativas de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação são inativados pelo calor (por exemplo, expostos a uma temperatura de pelo menos 40 ºC, ou 40-95 ºC durante, pelo menos, 2 min, ou 2-60 min), as enzimas da via podem ser enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modali- dades, pelo menos um de polifosfato quinase, NMP quinase, NDP qui- nase, nucleosídeo quinase, fosforibosiltransferase, nucleosídeo fosfori- lase, riboquinase, fosfopentomutase e polimerase é termoestável. Uma enzima (p.ex., quinase ou polimerase) é considerada termoestável se a enzima (a) mantém a atividade após exposição temporária a altas tem- peraturas que desnatura as enzimas nativas ou (b) funciona com uma taxa alta após exposição temporária a uma temperatura média a alta onde as enzimas nativas funcionam em taxas baixas. As enzimas ter- moestáveis são conhecidas, e exemplos não limitantes de enzimas ter- moestáveis para uso são fornecidos aqui. Outros exemplos não limitan- tes de enzimas da via que podem suportar condições de eliminação também são fornecidos aqui.

[0121] Abordagens de separação. Em algumas modalidades, a enzima nativa que exibe atividade indesejada é fisicamente removida de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação. Em algumas modalidades, uma enzima que exibe atividade in- desejada é precipitada de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação. Em algumas modalidades, uma enzima que exibe atividade indesejada é filtrada (p.ex., com base no tamanho) de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação. Em algumas modalidades, uma enzima exibindo atividade inde- sejada é removida de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação através de captura e/ou cromatografia (p. ex., pela afinidade diferencial com a fase estacionária).

[0122] Em algumas modalidades, uma enzima que exibe atividade indesejada é removida de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação através de cromatografia de afinidade. Exemplos de cromatografia de afinidade incluem, mas não estão limita- dos a, a cromatografia com proteína A, cromatografia com proteína G, cromatografia de ligação de metal (por exemplo, cromatografia de ní- quel), cromatografia com lectina e cromatografia GST.

[0123] Em algumas modalidades, uma enzima que exibe atividade indesejada é removida de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação através de cromatografia de troca iônica. Exemplos de cromatografia de troca aniônica (AEX) incluem, mas não estão limitados a, cromatografia com dietilaminoetila (DEAE), cromato- grafia com aminoetila quaternária (QaAE) e cromatografia com amina quaternária (Q). Exemplos de cromatografia de troca catiônica incluem, mas não estão limitados a, cromatografia com carboximetila (CM), cro- matografia com sulfoetila (SE), cromatografia com sulfopropila (SP), cro- matografia com fosfato (P) e cromatografia com sulfonato (S).

[0124] Em algumas modalidades, uma enzima que exibe atividade indesejada é removida de uma preparação enzimática, um lisado celular e/ou uma mistura de reação através de cromatografia de interação hi- drofóbica (HIC). Exemplos de cromatografia de interação hidrofóbica in- cluem, mas não estão limitados a, cromatografia com fenil sefarose, cro- matografia com butil sefarose, cromatografia com octila sefarose, cro- matografia com capto fenila, cromatografia com Toyopearl butila, cro- matografia com Toyopearl hexila, cromatografia com éter e cromatogra- fia com Toyopearl PPG. Qualquer um dos elementos químicos detalha- dos acima poderia ser, alternativamente, usado para imobilizar ou cap- turar as enzimas da via.

[0125] Enzimas termoestáveis

[0126] Quaisquer uma das enzimas da via fornecidas aqui (por exemplo, nucleases, quinases, polimerases, etc.) podem ser enzimas termoestáveis. Termoestabilidade refere-se à qualidade das enzimas para resistir à desnaturação a temperatura relativamente alta ou baixa. Por exemplo, se uma enzima é desnaturada (inativada) a uma tempera- tura de 42 ºC, uma enzima com atividade semelhante (por exemplo, ati- vidade quinase) é considerada "termoestável" se não desnatura a 42 ºC.

[0127] Uma enzima (p.ex., quinase ou polimerase) é considerada termoestável se a enzima (a) mantém a atividade após exposição tem- porária a altas temperaturas que desnatura outras enzimas nativas ou (b) funciona com uma taxa alta após exposição temporária a uma tem- peratura média a alta onde as enzimas nativas funcionam em taxas bai- xas.

[0128] Uma enzima (p.ex., quinase ou polimerase) é também consi- derada termoestável se a enzima (a) mantém a atividade após exposi- ção temporária a baixas temperaturas que desnatura as enzimas nati- vas ou (b) funciona com uma taxa alta após exposição temporária a uma temperatura média a baixa onde as enzimas nativas funcionam em ta- xas baixas.

[0129] Em algumas modalidades, uma enzima termoestável man- tém mais que 10% de atividade após exposição temporária à tempera- tura relativamente alta (por exemplo, superior a 41 ºC para quinases obtidas de E. coli, superior a 37 ºC para muitas RNA polimerases) que, de outra forma, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não ter- moestável). Em algumas modalidades, uma enzima termoestável retém 10-100%, 25-100% ou 50-100% de atividade após exposição temporá- ria à temperatura relativamente alta que, de outra forma, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoestável). Por exemplo, uma enzima termoestável pode reter 10-90%, 10-85%, 10-80%, 10-75%, 10- 70%, 10-65%, 10 a 60%, 10-55%, 25-90%, 25-85%, 25-80%, 25-75%, 25-70%, 25-65%, 25-60%, 55%, 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50- 70%, 50-65%, 50-60% ou 50-55% para exposição temporária à tempe- ratura relativamente alta que, de outra forma, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoestável). Em algumas modalidades, uma enzima termoestável retém 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de atividade após exposição temporária à temperatura relativamente alta que, de outra forma, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoestável).

[0130] Em algumas modalidades, uma enzima termoestável man- tém mais que 50% de atividade após exposição temporária à tempera- tura relativamente baixa (por exemplo, inferior a 32 ºC para quinases obtidas de E. coli, inferior a 32 ºC para muitas RNA polimerases) que, de outra forma, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não ter- moestável). Em algumas modalidades, uma enzima termoestável retém 50-100% de atividade após exposição temporária à temperatura relati-

vamente baixa que, de outra forma, desnaturaria uma enzima nativa se- melhante (não termoestável). Por exemplo, uma enzima termoestável pode reter 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50-65%, 50- 60% ou 50-55% de atividade após exposição temporária à temperatura relativamente baixa que, de outra forma, desnaturaria uma enzima na- tiva semelhante (não termoestável). Em algumas modalidades, uma en- zima termoestável retém 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de atividade após exposição temporária à temperatura relativamente baixa que, de outra forma, desnaturaria uma enzima nativa semelhante (não termoes- tável).

[0131] Em algumas modalidades, a atividade de uma enzima ter- moestável após exposição temporária à temperatura média a alta (por exemplo, 42-80ºC) é maior que (por ex., 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% maior que) a atividade de uma enzima nativa semelhante (não termoestável).

[0132] Em algumas modalidades, a atividade de uma enzima ter- moestável após exposição temporária de média a baixa temperatura (por exemplo, 32-0ºC) é maior que (por ex., 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% maior que) a atividade de uma enzima nativa semelhante (não termoestável).

[0133] A atividade de uma quinase termoestável, por exemplo, pode ser medida pela quantidade de NMP ou NDP quinase é capaz de fosfo- rilar. Assim, em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em temperatura relativamente alta (por exemplo, 42ºC) converte mais que 50% do NMP ao NDP, ou mais que 50% do NDP ao NTP, na mesma quantidade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tem- peratura relativamente alta (por exemplo, 42ºC) converte mais que 60% do NMP ao NDP, ou mais que 60% do NDP ao NTP, na mesma quanti- dade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tempe- ratura relativamente alta (por exemplo, 42ºC) converte mais que 70% do NMP ao NDP, ou mais que 70% do NDP ao NTP, na mesma quanti- dade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tempe- ratura relativamente alta (por exemplo, 42ºC) converte mais que 80% do NMP ao NDP, ou mais que 80% do NDP ao NTP, na mesma quanti- dade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tempe- ratura relativamente alta (por exemplo, 42ºC) converte mais que 90% do NMP ao NDP, ou mais que 90% do NDP ao NTP, na mesma quanti- dade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC.

[0134] Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em temperatura relativamente baixa (por exemplo, 32ºC) converte mais que 50% do NMP ao NDP, ou mais que 50% do NDP ao NTP, na mesma quantidade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tem- peratura relativamente baixa (por exemplo, 32ºC) converte mais que 60% do NMP ao NDP, ou mais que 60% do NDP ao NTP, na mesma quantidade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tem- peratura relativamente baixa (por exemplo, 32ºC) converte mais que 70% do NMP ao NDP, ou mais que 70% do NDP ao NTP, na mesma quantidade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tem- peratura relativamente baixa (por exemplo, 32ºC) converte mais que 80% do NMP ao NDP, ou mais que 80% do NDP ao NTP, na mesma quantidade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC. Em algumas modalidades, uma quinase termoestável, em tem- peratura relativamente baixa (por exemplo, 32ºC) converte mais que 90% do NMP ao NDP, ou mais que 90% do NDP ao NTP, na mesma quantidade de tempo necessária para completar uma conversão similar a 37ºC.

[0135] A atividade de uma polimerase termoestável, por exemplo, é avaliada com base na fidelidade e cinética de polimerização (por exem- plo, taxa de polimerização). Assim, uma unidade de uma polimerase ter- moestável T7, por exemplo, pode incorporar 10 nmoles do NTP em ma- terial insolúvel em ácido em 30 minutos em temperaturas acima de 37ºC (p. ex., a 50ºC). Em outro exemplo, uma unidade de uma polimerase T7 termoestável pode incorporar 10 nmoles do NTP em material insolúvel em ácido em 30 minutos em temperaturas abaixo de 32ºC (por ex., a 25ºC)

[0136] Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis (por exemplo, quinases ou polimerases) podem permanecer ativas (capaz de catalisar uma reação) a uma temperatura de 42ºC a 80ºC ou supe- rior. Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis permanecem ativas a uma temperatura de 42-80ºC, 42-70ºC, 42-60 ºC, 42-50ºC, 50- 80ºC, 50-70ºC, 50-60ºC, 60-80ºC, 60-70ºC ou 70-80ºC. Por exemplo, as enzimas termoestáveis podem permanecer ativas em uma tempera- tura de 42ºC, 43ºC, 44ºC, 45ºC, 46ºC, 47ºC, 48ºC, 49ºC, 50ºC, 51ºC, 52ºC, 53ºC, 54ºC, 55ºC, 55ºC, 56ºC, 57ºC, 58ºC, 59ºC, 60ºC, 61ºC, 62ºC, 63ºC, 64ºC, 65ºC, 66ºC, 67ºC, 68ºC, 69ºC, 70ºC, 71ºC, 72ºC, 73ºC, 7T4ºC, 75ºC, 76ºC, 77ºC, 78ºC, 79ºC ou 80ºC. As enzimas ter- moestáveis podem permanecer ativas em temperaturas relativamente altas por 15 minutos a 48 horas, ou mais. Por exemplo, as enzimas ter- moestáveis podem permanecer ativas em temperaturas relativamente elevadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 36, 42 ou 48 horas.

[0137] Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis (por exemplo, quinases ou polimerases) podem permanecer ativas (capaz de catalisar uma reação) a uma temperatura de 32ºC a 0ºC ou inferior. Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis permanecem ati- vas a uma temperatura de 32-5ºC, 32-10ºC, 32-20ºC, 32-25ºC, 32- 30ºC, 30-0ºC, 25-0ºC, 20-0ºC, 10-0ºC ou 5-0ºC. Por exemplo, as enzi- mas termoestáveis podem permanecer ativas em uma temperatura de 32ºC, 31ºC, 30ºC, 29ºC, 28ºC, 27ºC, 26ºC, 25ºC, 24ºC, 23ºC, 22ºC, 21ºC, 20ºC, 19ºC, 18ºC, 17ºC, 16ºC, 15ºC, 14ºC, 13ºC, 12ºC, 10ºC, 9ºC, 8ºC, 7ºC, 6ºC, 5ºC, 4ºC, 3ºC, 2ºC, 1ºC ou 0ºC. As enzimas ter- moestáveis podem permanecer ativas em temperaturas relativamente baixas por 15 minutos a 48 horas, ou mais. Por exemplo, as enzimas termoestáveis podem permanecer ativas em temperaturas relativa- mente baixas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42 ou 48 horas.

[0138] Exemplos não limitantes de NMP quinases termoestáveis são listados nas Tabela 4A-4D. Outras quinases termoestáveis incluem nucleosídeo difosfato quinases termoestáveis (ver, por exemplo, Tabela 5), piruvato quinases termoestáveis e polifosfato quinases termoestá- veis (ver, por exemplo, Tabela 2). Outras quinases termoestáveis são abrangidas pela presente descrição.

[0139] Exemplos não limitantes de RNA polimerases estão listados na Tabela 6. Outros RNA polimerases, incluindo RNA polimerases ter- moestáveis, são abrangidos pela presente divulgação.

[0140] RNA polimerases termoestáveis podem ser preparadas pela modificação das enzimas do tipo selvagem. Tais modificações (por exemplo, mutações) são conhecidas. Por exemplo, RNA polimerases T7 variantes termoestáveis podem incluir uma ou mais das seguintes mutações pontuais: V426L, A702V, V7951I, S430P, F849|, S633P, F880Y, C510R e S767G (EP2377928 e EP1261696A1, cada uma das quais é aqui incorporada por referência). Em algumas modalidades, uma RNA polimerase T7 variante termoestável inclui mutações V426L, A7TO2V e V795I. Em algumas modalidades, uma RNA polimerase T7 va- riante termoestável inclui mutações S430P, F849|, S633P e F880Y. Em algumas modalidades, uma RNA polimerase T7 variante termoestável inclui mutações F880Y, S430P, F849I, S633P, C510R e S767G. Em al- gumas modalidades, uma RNA polimerase T7 variante termoestável in- clui mutações Y639V, H784G, E593G e V685A. Em algumas modalida- des, uma RNA polimerase T7 variante termoestável inclui mutações S430P, N433T, S633P, F849| e F880Y. Outras variantes e polimerases termoestáveis recombinantes são abrangidas pela presente descrição.

[0141] Em algumas modalidades, uma polimerase T7 termoestável é usada para produzir um RNA de interesse. Por exemplo, uma polime- rase T7 termoestável (por exemplo, incubada a uma temperatura de 37- 60ºC), com uma concentração de 0,1-5% de proteína total, pode ser usada para sintetizar RNA de interesse a uma taxa superior a 1 g/L/h (ou, por exemplo, 1 g/L/hr - 20 g/L/h).

[0142] Deve ser entendido que enquanto muitas modalidades da presente descrição descrevem o uso de polimerases/enzimas termoes- táveis, outras enzimas/polimerases podem ser usadas. Em algumas modalidades, a polimerase pode ser adicionada exogenamente aos |i- sados celulares inativados pelo calor, por exemplo, para compensar qualquer redução ou perda da atividade da(s) enzima(s) termoestá- vel(eis).

[0143] Enzimas de fusão

[0144] Quaisquer uma das enzimas da via fornecidas aqui (por exemplo, nucleases, quinases, polimerases, etc.) podem ser enzimas individuais, enzimas com múltiplas atividades ou enzimas de fusão. Uma enzima de fusão pode ser criada ao unir dois ou mais genes ou segmentos de genes que codificam proteínas separadas. Tradução de gene de fusão resulta em um único ou vários polipeptídeos com propri- edades funcionais derivados de cada uma das proteínas originais como, por exemplo, a proteína de fusão que age como uma nuclease, age como uma quinase e/ou age como uma polimerase. Outras enzimas também podem ser expressadas como uma proteína de fusão.

[0145] Algumas enzimas que existem na natureza são multifuncio- nais (por exemplo, CMP-UMP quinases). Assim, o termo "enzima" en- globa "atividades enzimáticas", independentemente de como eles são fornecidos.

[0146] Uma enzima de fusão é considerada a "agir como uma nu- clease" se a enzima exibe atividade de nuclease (cliva ou despolimeriza um ácido nucleico, por exemplo, RNase R). Uma enzima de fusão é considerada a "agir como uma quinase" se a enzima exibe atividade quinase (catalisa a transferência do grupo fosfato a partir de uma molé- cula a outra molécula; por exemplo, polifosfato quinase). Uma enzima de fusão é considerada a "agir como uma polimerase" se a enzima exibe atividade polimerase (reúne nucleotídeos para produzir ácidos nuclei- cos; por exemplo, o RNA polimerase).

[0147] Fontes de energia

[0148] Existem várias fontes de energia e de fosfato que podem ser usadas, conforme nele previsto, para a produção do NTP e/ou RNA. Exemplos não limitantes de fontes de fosfato incluem NTP (p.ex., ATP, GTP, UTP, CTP), polifosfato (p. Ex., hexametafosfato) e pirofosfato (PPi). Em algumas modalidades, NTP, quer quimicamente sintetizado, um produto de fermentação, ou extraído de uma fonte natural, está in- cluído em uma mistura de reação para a produção de RNA. Em algumas modalidades, polifosfato e polifosfato quinase são incluídos em uma mistura de reação para a produção do NTP e/ou RNA. Em algumas mo- dalidades, acetato, ADP, pirofosfato e pelo menos dois acetatos quina- ses (por exemplo, acetato quinase (difosfato) EC 2.7.2.12 e acetato qui- nase (fosforilação) EC.7.2.1) estão incluídos em uma mistura de reação para a produção do NTP e/ou RNA. Em algumas modalidades, citrato, AMP, pirofosfato, citrato de liase (complexo citrato de liase), um fosfoe- nolpiruvato de carboxiquinase (PEPCK) ou um fosfoenolpiruvato de car- boxilase (PEPC) e um piruvato fosfato diquinase (PPDK) são incluídos em uma mistura de reação para a produção do NTP e/ou RNA. Em al- gumas modalidades, sulfito, AMP, pirofosfato, sulfato de adenilil redu- tase e sulfato de adenilil transferase são incluídos em uma mistura de reação para a produção do NTP e/ou RNA. Outras fontes de energias são também abrangidas pela presente descrição.

[0149] Em algumas modalidades, uma fonte de energia é ATP pro- duzido a partir de através de pirofosfato através de fosforilação cíclica de acetato, de pirofosfato e citrato, ou de pirofosfato e sulfito. Métodos para a produção de ATP a partir das vias acima estão descritas aqui. Um resumo das vias de produção de ATP e as enzimas da via é forne- cido na Tabela 7 abaixo. Tabela 7: Resumo das vias de produção de ATP exemplar e enzi- mas [Via de produção de ATA Bras fato do ciclo de fosforilação/desfosfori- | Acetato quinase (fosforilação) (EC 2.7.2.1) lação de acetato Produção de ATP a partir de citrato e Citrato liase (EC 4.1.3.6) Fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) (EC 4.1.1.38) Piruvato fosfato dicinase (PPDK) (EC 2.7.9.1, 2.7.9.2) Fosfenolpiruvato carboxilase (PEPC) (EC 4.1.1.31) pirofosfato Aulfato de adenilil redutase (EC 1.8.99.2)

[0150] Produção de ATP através do pirofosfato e ADP de um ci- clo de fosforilação/desfosforilação de acetato

[0151] Alguns aspectos da presente descrição usam métodos para produzir ATP a partir do pirofosfato (doador de fosfato de alta energia)

e ADP (aceitador final de energia/fosfato), através de um ciclo de fosfo- rilação/desfosforilação do acetato (ver, por exemplo, Figura 14). O pri- meiro acetato quinase (AcK1; EC 2.7.2.12) fosforilatos acetato usando pirofosfato inorgânico (PPi), que produz acetil-fosfato e fosfato inorgã- nico (Pi). O acetil-fosfato é, então, desfosforilado por um segundo ace- tato quinase (AcK2; EC 2.7.2.1), que transfere o grupo de fosfatos de alta energia a partir do acetil-fosfato para o ADP e produz o ATP e o acetato. O acetato resultante é então livre para ser fosforilado nova- mente pelo AcK1, completando assim um ciclo de reação.

[0152] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP a partir de pirofosfato e ADP incluem cultura de células modificadas para expressar um primeiro acetato quinase, um segundo acetato quinase ou dois diferentes acetatos quinases. Em algumas modalidades, os méto- dos incluem cultura de células modificadas para expressar um primeiro acetato quinase e um segundo acetato quinase. Em algumas modalida- des, o primeiro acetato quinase e o segundo acetato quinase são ex- pressados como uma única proteína de fusão (quimérico).

[0153] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, to- das as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas moda- lidades, os métodos incluem cultura de células modificadas para expres- sar um acetato quinase termoestável. Em outras modalidades, os mé- todos incluem cultura de células modificadas para expressar um pri- meiro acetato quinase termoestável e um segundo acetato quinase ter- moestável.

[0154] Em algumas modalidades, métodos de produção de ATP a partir do pirofosfato, através da fosforilação cíclica de acetato incluem lise (por exemplo, lise térmica, osmótica, mecânica (por exemplo, soni- cação), química ou enzimática) de células cultivadas para a produção de pelo menos um (por exemplo, de pelo menos dois) lisado celular. Deve ser entendido que vários lisados celulares (e, portanto, várias po- pulações celulares, como, por exemplo, do mesmo organismo (por exemplo, bactérias) ou de organismos diferentes (por exemplo, bacté- rias, leveduras e/ou planta) podem ser usados em uma reação enzimá- tica como fornecido aqui. Por exemplo, uma população celular pode ser projetada para expressar um primeiro acetato quinase da via de produ- ção de ATP, enquanto outra população de células pode ser projetada para expressar um segundo acetato quinase de produção de ATP. As- sim, em algumas modalidades, os métodos compreendendo a cultura de uma população celular projetada para expressar um acetato quinase, e/ou a cultura de uma população celular projetada para expressar pelo menos um acetato quinase adicional. Após a lise das células, o lisado celular é combinado de tal modo que as enzimas estão presentes em um único lisado celular/mistura de reação.

[0155] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP do pirofosfato, através da fosforilação cíclica de acetato incluem ainda aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados ce- lulares) a uma temperatura que inativa a atividade enzimática nativa, mas não inativa qualquer uma das enzimas termoestáveis da via de pro- dução de ATP para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) li- sado(s) celular(es), em algumas modalidades, é aquecido a uma tem- peratura de pelo menos 50ºC. Por exemplo, o(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido(s) a uma temperatura de, pelo menos, 55ºC, 60ºC, 65ºC, 70ºC, 75ºC, 80ºC, 85ºC e 90ºC. Uma enzima nativa (ou ou- tra enzima não termoestável) é considerada inativa, em algumas moda- lidades, quando o seu nível de atividade é reduzido em pelo menos 50%. Em algumas modalidades, uma enzima nativa (ou outra enzima não termoestável) é considerada inativa quando o seu nível de atividade é reduzido em pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,

95% ou 100%.

[0156] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido por um perí- odo de tempo suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras en- zimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisad(s) celu- lar(es) pode(m) ser aquecido(s) por, pelo menos, 2, 3, 4, ou, pelo me- nos, 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é (são) aquecido(s) por mais de 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é (são) aquecido(s) por mais de 15 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é (são) aquecido(s) por menos de 2 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celu- lar(es) é (são) aquecido(s) por um período de tempo suficiente para re- duzir a atividade de enzimas nativas (ou outras enzimas não termoes- táveis) por, pelo menos, 50% (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).

[0157] Após a inativação do calor, em algumas modalidades, pelo menos um (p. ex., pelo menos dois ou pelo menos três) enzimas purifi- cadas podem ser adicionadas para o lisado celular/mistura de reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, pode incluir uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressado pela(s) célula(s) hospedeira(s) modificada(s) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser um primeiro acetato quinase e/ou segundo acetato quinase. Em algumas modalida- des, um lisado celular pode ser arrefecido (por ex., a 50ºC), após uma etapa de inativação pelo calor, antes de adicionar a(s) enzima(s) purifi- cada(s).

[0158] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP a partir do pirofosfato, através da fosforilação cíclica de acetato, também incluem a incubação do(s) lisado(s) inativado(s) pelo calor na presença de acetato, adenosina difosfato (ADP) e fosfato inorgânico e para pro-

duzir ATP. O fosfato inorgânico pode ser, por exemplo, pirofosfato. Ou- tros fosfatos inorgânicos e/ou polímeros de ortofosfato, incluindo, mas não limitado a, tripolifosfato, tetrapolifosfato, pentapolifosfato, hexame- tafosfato, e suas misturas, podem ser usados.

[0159] Também são englobados aqui células e lisados celulares usados para a produção de ATP a partir do pirofosfato, através da fos- forilação cíclica de acetato. Assim, uma célula modificada (por exemplo, célula bacteriana, célula de levedura e/ou célula vegetal) ou lisado(s) celular(es) da presente descrição pode incluir pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois) acetato quinase. Em algumas modalidades, uma célula modificada (por exemplo, célula bacteriana, célula de leve- dura e/ou célula vegetal) ou lisado(s) celular(es) da presente descrição inclui pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois) acetato quinase termoestável. Tabela 8. Acetato de enzimas quinases exemplar

[0160] A produção de ATP a partir de pirofosfato, AMP e citrato

[0161] Alguns aspectos da presente descrição usam métodos para produzir ATP a partir do pirofosfato, AMP e citrato (ver, por exemplo, Figuras 15A-15B). Uma via enzimática de três etapas é mostrada na Figura 15A. Na primeira etapa, o citrato liase converte o citrato para acetato e oxaloacetato. Na segunda etapa, fosfoenolpiruvato carboxi- quinase (PEPCK) converte o pirofosfato e o oxaloacetato gerado na pri- meira etapa de fosfoenolpiruvato (PEP), dióxido de carbono (CO>) e fos- fato inorgânico (Pi). Na terceira etapa, o piruvato fosfato diquinase (PPDK) converte pirofosfato inorgânico (PP;), AMP e PEP gerado na se- gunda etapa para o piruvato, Pi, e ATP. A reação química combinada usa um mol de citrato, um mol de AMP, e dois moles de PP; para produ- zir uma mole de acetato, um mol de piruvato, um mol de CO», dois moles de Pi, e um mol de ATP (Figura 15B). Alternativamente, fosfenolpiruvato carboxilase (PEPC) pode ser usado para catalisar a carboxilação de

PEP para oxaloacetato, que pode ser reversível sob determinadas con- dições.

[0162] Esses métodos, em algumas modalidades, incluem a cultura de células modificadas para expressar um citrato de liase, um PEPCK (ou, pelo menos, uma PEPC), um PPDK, ou uma combinação de pelo menos dois ou pelo menos três das enzimas acima. Em algumas moda- lidades, citrato de liase e PEPCK (ou PEPC), PEPCK (ou PEPC) e PPDK ou citrato de liase e PPDK são expressados como uma única proteína de fusão (quimérica).

[0163] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas ou pelos menos três das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algu- mas modalidades, todas as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem a cultura de células mo- dificadas para expressar um citrato de liase termoestável, um PEPCK termoestável, um PPDK, ou uma combinação de pelo menos dois ou pelo menos três das enzimas termoestáveis acima.

[0164] Em algumas modalidades, métodos de produção de ATP a partir do citrato incluem lise (por exemplo, lise térmica, osmótica, mecâ- nica (por exemplo, sonicação), química ou enzimática) de células culti- vadas para a produção de pelo menos um (por exemplo, de pelo menos dois ou três) lisado celular. Deve ser entendido que vários lisados celu- lares (e, portanto, várias populações celulares, como, por exemplo, do mesmo organismo (por exemplo, bactérias) ou de organismos diferen- tes (por exemplo, células de bactérias, leveduras e/ou plantas) podem ser usados em uma reação enzimática como fornecido aqui. Por exem- plo, uma população celular pode ser projetada para expressar uma ou mais enzimas da via de produção de ATP, enquanto outra população de células (ou várias outras populações de células) pode ser projetada para expressar outra (pelo menos uma outra) enzima da via de produção de

ATP. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem a cultura de uma população de células modificadas para expressar um citrato de liase, a cultura de uma população celular modificada para ex- pressar um PEPCK (um PEPCK termoestável), e/ou a cultura de uma população celular modificada para expressar um PPDK. Após a lise das células, o lisado celular é combinado de tal modo que as enzimas estão presentes em um único lisado celular/mistura de reação.

[0165] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP do citrato incluem ainda aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) a uma temperatura que inativa a atividade enzimática nativa, mas não inativa qualquer uma das enzimas termoes- táveis da via de produção de ATP para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é aquecido a uma temperatura de pelo menos 50ºC. Por exemplo, o(s) lisado(s) celu- lar(es) pode(m) ser aquecido(s) a uma temperatura de, pelo menos, 55ºC, 60ºC, 65ºC, 70ºC, 75ºC, 80ºC, 85ºC e 90ºC. Uma enzima nativa (ou outra enzima não termoestável) é considerada inativa, em algumas modalidades, quando o seu nível de atividade é reduzido em pelo me- nos 50%. Em algumas modalidades, uma enzima nativa (ou outra en- zima não termoestável) é considerada inativa quando o seu nível de ati- vidade é reduzido em pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[0166] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido por um perí- odo de tempo suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras en- zimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisad(s) celu- lar(es) pode(m) ser aquecido(s) por, pelo menos, 2, 3, 4, ou, pelo me- nos, 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é (são) aquecido(s) por mais de 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é (são) aquecido(s) por um período de tempo sufi- ciente para reduzir a atividade de enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) por, pelo menos, 50% (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).

[0167] Após a inativação do calor, em algumas modalidades, pelo menos um (p. ex., pelo menos dois ou pelo menos três) enzimas purifi- cadas podem ser adicionadas para o lisado celular/mistura de reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, pode incluir uma combinação de enzimas presentes no lisado celular (expressado pela(s) célula(s) hospedeira(s) modificada(s) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser selecionada do grupo consistindo em citrato de liase, PEPCK (ou PEPC) e PPDK. Em algumas modalidades, um lisado celular pode ser arrefecido (por ex., a 50 ºC), após uma etapa de inativação pelo calor, antes de adicionar a(s) enzima(s) purificada(s).

[0168] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP a partir do citrato também incluem a incubação do(s) lisado(s) inati- vado(s) pelo calor na presença de citrato, adenosina monofosfato (AMP) e fosfato inorgânico e para produzir ATP. O fosfato inorgânico pode ser, por exemplo, pirofosfato. Outros fosfatos inorgânicos e/ou polímeros de ortofosfato, incluindo, mas não limitado a, tripolifosfato, tetrapolifosfato, pentapolifosfato, hexametafosfato, e suas misturas, podem ser usados.

[0169] Também são englobados aqui células e lisados celulares usados para a produção de ATP a partir do citrato. Assim, uma célula modificada (por exemplo, célula bacteriana, célula de levedura e/ou cé- lula vegetal) ou lisado(s) celular(es) da presente descrição pode incluir pelo menos uma (por exemplo, pelo menos dois ou pelo menos três) enzima selecionada do grupo que consiste em citrato de liase, PEPCK (ou PEPC) e PPDK. Em algumas modalidades, uma célula modificada (por exemplo, célula bacteriana, célula de levedura e/ou célula vegetal) ou lisado(s) celular(es) da presente descrição incluem pelo menos uma (p. ex., pelo menos duas ou pelo menos rês) enzimas selecionadas a partir do grupo consistindo em citrato de liase termoestável, PEPCK ter- moestável (ou PEPC termoestável) e PPDK termoestável. Tabela 9. A produção de ATP exemplar das enzimas da via do pi- rofosfato e citrato via 1 Citrato liase 4.1.3.6 Escherichia coli AAC28949.1; AAC7T3717.2; AACT3716.1 Caloramator australicus CCJI33900.1; CCJI33901.1; CCJ33902.1 2 Fosfoenolpiruvato carboxiqui- | 4.1.1.38 | Propionibacterium freudenreichii AJQB9945.1 nase (PEPCK); também co- LCO62511.1 nhecido como fosfoenolpi- Entamoeba histolytica ruvato carboxitransfosforilase XP 654765.1 XP 6508621 ge [5] reemee | ee PEPC) (PPDK)

[0170] Produção de ATP a partir de pirofosfato, AMP e sulfito

[0171] Alguns aspectos da presente descrição usam métodos para produzir ATP a partir do pirofosfato, AMP e sulfito (ver, por exemplo, Figura 16). Na primeira etapa, o sulfato de adenilil redutase converte o monofosfato de adenosina (AMP) para 5'-fosfosulfato de adenosina (APS) com o consumo de sulfito. Na segunda etapa, o sulfato de adenilil transferase catalisa a conversão de APS para sulfato com geração de ATP e consumo de pirofosfato.

[0172] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP a partir do pirofosfato, AMP e sulfito incluem a cultura de células modi- ficadas para expressar um sulfato de adenilil redutase, um sulfato de adenilil transferase, ou uma combinação de um sulfato de adenilil redu- tase e um sulfato de adenilil transferase. Em algumas modalidades, o sulfato de adenilil redutase e o sulfato de adenilil transferase são ex- pressados como uma única proteína de fusão (quimérica) ou uma pro- teína bifuncional.

[0173] Em algumas modalidades, os agentes redutores podem ser adicionados, que servem como dissipadores de elétrons. Exemplos de tais agentes redutores incluem, mas não estão limitados a: ditiotreitol

(DTT) ou glutationa ou ferricianida ou ditiotreitol ou cloridrato de tris-2- carboxietilfosfina (TCEP). Enquanto as enzimas individuais irão diferir em suas preferências de cofator, pode haver casos em que cofatores biológicos como NAD*, NADP*, NADH, ou NADPH podem ser usados por uma enzima para absorver esses elétrons. Nestes casos, cofatores como estes podem também ser incluídos.

[0174] Em algumas modalidades, pelo menos uma das enzimas é uma enzima termoestável. Em algumas modalidades, pelo menos duas das enzimas são enzimas termoestáveis. Em algumas modalidades, to- das as enzimas são enzimas termoestáveis. Assim, em algumas moda- lidades, os métodos incluem cultura de células modificadas para expres- sar um sulfato de adenilil redutase termoestável e um sulfato de adenilil transferase termoestável.

[0175] Em algumas modalidades, métodos de produção de ATP a partir do sulfito incluem lise (por exemplo, lise térmica, osmótica, mecâ- nica (por exemplo, sonicação), química ou enzimática) de células culti- vadas para a produção de pelo menos um (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) lisado celular. Deve ser entendido que vários lisados celulares (e, por- tanto, várias populações celulares, como, por exemplo, do mesmo or- ganismo (por exemplo, bactérias) ou de organismos diferentes (por exemplo, bactérias, leveduras e/ou planta) podem ser usados em uma reação enzimática como fornecido aqui. Por exemplo, uma população celular pode ser modificada para expressar um sulfato de adenilil redu- tase, enquanto outra população de células (ou várias outras populações celulares) pode ser modificada para expressar um sulfato de adenilil transferase. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreen- dem a cultura de uma população celular projetada para expressar um sulfato de adenilil redutase e/ou a cultura de uma população celular pro- jetada para expressar um sulfato de adenilil transferase. Após a lise das células, o lisado celular é combinado de tal modo que as enzimas estão presentes em um único lisado celular/mistura de reação.

[0176] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP do sulfito incluem ainda aquecimento do(s) lisado(s) celular(es) (ou uma mistura de lisados celulares) a uma temperatura que inativa a atividade enzimática nativa, mas não inativa qualquer uma das enzimas termoes- táveis da via de produção de ATP para produzir um lisado inativado pelo calor. O(s) lisado(s) celular(es), em algumas modalidades, é aquecido a uma temperatura de pelo menos 50ºC. Por exemplo, o(s) lisado(s) celu- lar(es) pode(m) ser aquecido(s) a uma temperatura de, pelo menos, 55ºC, 60ºC, 65ºC, 70ºC, 75ºC, 80ºC, 85ºC e 90ºC. Uma enzima nativa (ou outra enzima não termoestável) é considerada inativa, em algumas modalidades, quando o seu nível de atividade é reduzido em pelo me- nos 50%. Em algumas modalidades, uma enzima nativa (ou outra en- zima não termoestável) é considerada inativa quando o seu nível de ati- vidade é reduzido em pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[0177] O(s) lisado(s) celular(es) pode(m) ser aquecido por um perí- odo de tempo suficiente para inativar as enzimas nativas (ou outras en- zimas não termoestáveis) da célula. Por exemplo, o(s) lisado(s) celu- lar(es) pode(m) ser aquecido(s) por, pelo menos, 2, 3, 4, ou, pelo me- nos, 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é (são) aquecido(s) por mais de 5 minutos. Em algumas modalidades, o(s) lisado(s) celular(es) é (são) aquecido(s) por um período de tempo sufi- ciente para reduzir a atividade de enzimas nativas (ou outras enzimas não termoestáveis) por, pelo menos, 50% (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%).

[0178] Após a inativação do calor, em algumas modalidades, pelo menos um (p. ex., pelo menos dois ou pelo menos três) enzimas purifi- cadas podem ser adicionadas para o lisado celular/mistura de reação. Assim, uma mistura de reação, em algumas modalidades, pode incluir uma combinação de lisado celular, enzimas presentes no lisado celular (expressado pela(s) célula(s) hospedeira(s) modificada(s) e pelo menos uma enzima purificada. Pelo menos uma enzima purificada pode ser um primeiro acetato quinase e/ou segundo acetato quinase. Em algumas modalidades, um lisado celular pode ser arrefecido (por ex., a 50ºC), após uma etapa de inativação pelo calor, antes de adicionar a(s) en- zima(s) purificada(s).

[0179] Em algumas modalidades, os métodos de produção de ATP a partir do sulfito também incluem a incubação do(s) lisado(s) inati- vado(s) pelo calor na presença de sulfito, adenosina monofosfato (AMP) e fosfato inorgânico e para produzir ATP. O fosfato inorgânico pode ser, por exemplo, pirofosfato. Outros fosfatos inorgânicos e/ou polímeros de ortofosfato, incluindo, mas não limitado a, tripolifosfato, tetrapolifosfato, pentapolifosfato, hexametafosfato, e suas misturas, podem ser usados.

[0180] Também são englobados aqui células e lisados celulares usados para a produção de ATP. Assim, uma célula modificada (por exemplo, célula bacteriana, célula de levedura e/ou célula vegetal) ou lisado(s) celular(es) da presente descrição pode incluir pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois) sulfato de adenilil redutase e/ou pelo menos um sulfato de adenilil transferase. Em algumas modalidades, uma célula modificada (por exemplo, célula bacteriana, célula de leve- dura e/ou célula vegetal) ou lisado(s) celular(es) da presente descrição incluem pelo menos uma (p. ex., pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro) sulfato de adenilil redutase termoestável e/ou sul- fato de adenilil transferase termoestável. Tabela 10. Produção de ATP exemplar das enzimas da via do piro- fosfato, AMP e sulfito [To seeds | rea | Amen ts | st | as Lo ee ess |

A Poa em ES o pesorenens | ves | as | YP 010067.1 QO59338 Eos acaso palmos | Wet | Lo een att | ET | nobacius deniifcans — | —asotistt | Lo ese rt WP 0109385901 Lo cc Eseherchiacor ==] —anozesoat [| o)

[0181] Despolimerização do RNA celular

[0182] Em algumas modalidades, o RNA celular serve como o subs- trato para a produção de NTP e/ou RNA. Despolimerização (degrada- ção) do RNA celular resulta em um pool composto por difosfatos de nu- cleosídeo (NDPs) ou 5' monofostafos de nucleosídeos (5'- NMPs), de- pendendo das enzimas usadas para despolimerização.

[0183] O RNA celular, em algumas modalidades, é despolarizado em NDPs usando, por exemplo, uma fosforilase polinucleotídica (PNPase) (ver, por exemplo, Tabela 1). Em algumas modalidades, a concentração de PNPase usada em uma mistura de reação é de 0,001- 10 mg/mL (p. ex., 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 5 ou 10 mg/mL). Em algumas modalidades, a concentração de PNPase em uma mistura de reação é de 0,5-5 mg/mL. Em algumas mo- dalidades, a concentração de PNPase em uma mistura de reação é de mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de PNPase em uma mistura de reação é superior a 10 mg/mL.

[0184] O RNA celular, em outras modalidades, é despolarizado em NMPs usando, por exemplo, uma nuclease (p.ex., RNase R ou P1 nu- clease) (ver, por exemplo, Tabela 1). Dependendo da enzima, a despo- limerização enzimática de RNA pode render 3'-NMPs, 5'-NMPs ou uma combinação de 3'-NMP's e 5'-NMP's. Porque não é possível polimerizar 3'-NTPs (convertido a partir de 3'-NDPs, que são convertidos a partir de 3'-NMP'ss), enzimas (por exemplo, RNase R e/ou P1 nuclease) que pro- duzem 5'-NMP's (que são convertidos em 5'-NDPs e, em seguida, 5'- NTPs) são preferidas. Em algumas modalidades, a concentração de nu- clease (p.ex., RNase R e/ou P1 nuclease) usada em uma mistura de reação é de 0,001-10 mg/mL (p. ex., 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 5 ou 10 mg/mL). Em algumas modalidades, a con- centração de nuclease em uma mistura de reação é de 0,05-5 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de nuclease em uma mistura de reação é de 5 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de nuclease em uma mistura de reação é superior a 10 mg/mL.

[0185] A PNPase e/ou a RNase, em algumas modalidades, é obtida a partir de ou é um componente de um lisado celular de células que expressam a PNPase e/ou a RNase.

[0186] A quantidade de RNA celular necessária para sintetizar um produto RNA de interesse pode variar, dependendo, por exemplo, do comprimento desejado e rendimento do produto de RNA, bem como a composição de nucleotídeos do produto do RNA em relação à compo- sição de nucleotídeos do material de partida do RNA celular. Normal- mente, para uma célula bacteriana ou uma célula de levedura, por exemplo, o teor de RNA celular varia de 5-50% da massa celular total. A porcentagem de massa celular total pode ser calculada, por exemplo, usando a seguinte equação: (quilograma (kg) de RNA/quilo de peso da célula seca) x 100%.

[0187] Condições adequadas para a produção de NMPs e condi- ções adequadas para a produção de NDPs são conhecidas na técnica ou podem ser determinadas por um versado na técnica, levando em consideração, por exemplo, as condições ideais para atividade da nu- clease (por exemplo, RNase), incluindo pH (p.ex., pH 3-8), temperatura (p.ex., 15ºC a 70ºC), comprimento de tempo (p.ex., 5 min-72 horas), e concentração de sal (p.ex., cloreto de sódio, cloreto de potássio, acetato de sódio, acetato de potássio na concentração de 5 mM a 1 M) da mis- tura de reação, bem como quaisquer cofatores exógenos. Em algumas modalidades, o tampão é adicionado a um lisado celular, por exemplo, para alcançar um determinado valor de pH e/ou concentração de sal.

Exemplos de tampões incluem, sem limitação, tampão de fosfato tam- pão Tris, tampão MOPS, tampão HEPES, tampão de citrato, tampão de acetato, tampão de malato, tampão MES, tampão de histidina, tampão PIPES, tampão bis-tris e tampão de etanolamina.

[0188] Em algumas modalidades, uma mistura de reação durante uma reação de despolimerização do RNA é incubada por 24 horas a uma temperatura de 37ºC. Em algumas modalidades, uma mistura de reação durante uma reação de despolimerização do RNA é incubada por 5 a 30 min a uma temperatura de 37ºC. Em algumas modalidades, uma mistura de reação durante uma reação de despolimerização do RNA tem um pH de 7,0 e é incubada por 15 minutos a uma temperatura de 37ºC. Em algumas modalidades, uma mistura de reação durante uma reação de despolimerização do RNA pode ser incubada em condi- ções que resultam em mais de 65% de conversão do RNA para NDP ou RNA para 5'-NMPs. Em algumas modalidades, o RNA é convertido em NDP ou 5'-NMPs a uma taxa de (pelo menos) 50 mM/h, 100 mM/h ou 200 mM/h. Em outras modalidades, uma mistura de reação durante uma reação de despolimerização do RNA é incubada a uma temperatura mais alta (por exemplo, 50ºC - 70ºC), como no Exemplo 5.

[0189] Polimerização do produto de RNA

[0190] Em algumas modalidades, os NTPs, quer produzidos por um método fornecido aqui ou fornecidos a partir de fontes comerciais, são usados em uma via biossintética para a produção de um produto de RNA de interesse. Um DNA projetado para codificar o produto de RNA serve como modelo para a síntese de RNA. O modelo de DNA pode ser projetado, em alguns casos, para ter um promotor transcricional que se- letivamente dirige a transcrição do RNA de interesse. A polimerização de RNA, requer NTPs, um modelo de DNA compreendendo um promo- tor transcricional, e uma polimerase (por exemplo, o RNA polimerase),

específico para o promotor transcricional. Normalmente, uma polime- rase para uso como indicado aqui é uma subunidade única de polime- rase, é altamente seletiva para o seu promotor transcricional cognato, tem alta-fidelidade, e é altamente eficiente.

[0191] Em algumas modalidades, a concentração do modelo de DNA em uma mistura de reação é de 0,001-10 ug/ul. Em algumas mo- dalidades, a concentração do modelo do DNA em uma mistura de rea- ção é de 0,001 ug/ul, 0,05 upa/ul, 0,1 ua/ul, 0,5 pa/ul, 1,0 pa/ul, 5 pa/yl, ou 10 ug/ul.

[0192] Condições adequadas para a produção de RNA são conhe- cidas na técnica ou podem ser determinadas por um versado na técnica, levando em consideração, por exemplo, as condições ideais para ativi- dade da polimerase (por exemplo, RNA polimerase T7), incluindo pH (p.ex., pH 3-8), temperatura (p.ex., 15ºC a 70ºC), comprimento de tempo (p.ex., 5 min-72 horas), e concentração de sal (p.ex., cloreto de sódio, cloreto de potássio, acetato de sódio, acetato de potássio na con- centração de 5 mM a 1 M) da mistura de reação, bem como quaisquer cofatores exógenos. Em algumas modalidades, o tampão é adicionado a um lisado celular, por exemplo, para alcançar um determinado valor de pH e/ou concentração de sal. Exemplos de tampões incluem, sem limitação, tampão de fosfato tampão Tris, tampão MOPS, tampão HEPES, tampão de citrato, tampão de acetato, tampão de malato, tam- pão MES, tampão de histidina, tampão PIPES, tampão bis-tris e tampão de etanolamina.

[0193] Em algumas modalidades, uma mistura de reação durante uma reação de polimerização do RNA é incubada por 0,5-24 horas a uma temperatura de 37ºC. Em algumas modalidades, uma mistura de reação durante uma reação de polimerização do RNA é incubada por 0,5-24 horas a uma temperatura de 50ºC.

[0194] Células e lisados celulares

[0195] Células da presente descrição, em algumas modalidades, expressam RNA celular, enzimas que despolimerizam o RNA (por exemplo, RNases), enzimas da via (por exemplo, enzimas recombinan- tes como polifosfato quinase), e/ou polimerases (por exemplo, RNA po- limerases). Em algumas modalidades, as células modificadas incluem um modelo de DNA contendo um promotor e, opcionalmente, um termi- nador transcricional, ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos codificando o produto de RNA de interesse.

[0196] Em algumas modalidades, as células são células modifica- das. As células modificadas são células que compreendem um ácido nucleico (por exemplo, recombinante ou sintético), ou de outra forma modificadas de modo que são estruturalmente e/ou funcionalmente dis- tintas dos seus homólogos de ocorrência natural. Assim, uma célula que contém um ácido nucleico modificado é considerada uma "célula modi- ficada".

[0197] Uma célula "expressa" um produto se o produto, codificado por um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico modificado), é produzido na célula. É conhecido na técnica que a expressão do gene se refere ao processo pelo qual as instruções genéticas sob a forma de um ácido nucleico são usadas para sintetizar um produto, como uma proteína (por exemplo, uma enzima).

[0198] Células podem ser células procarióticas e células eucarióti- cas. Em algumas modalidades, as células são células de bactérias, de leveduras, de inseto, de mamíferos, de plantas, ou outros tipos de célu- las.

[0199] Células bacterianas da presente descrição incluem, sem |li- mitação, Escherichia spp., Streptomyces spp., Zymomonas spp., Ace- tobacter spp., Citrobacter spp., Synechocystis spp., Rhizobium spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Xanthomo-

nas spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Alcalige- nes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Azotobacter spp., Co- mamonas spp., Mycobacterium spp., Rhodococcus spp., Gluconobacter spp., Ralstonia spp., Acidithiobacillus spp., Microlunatus spp., Geobac- ter spp., Geobacillus spp., Arthrobacter spp., Flavobacterium spp., Ser- ratia spp., Saccharopolyspora spp., Thermus spp., Stenotropphomonas spp., Chromobacterium spp., Sinorhizobium spp., Saccharopolyspora spp., Agrobacterium spp., Pantoea spp e Vibrio natriegens.

[0200] As células de levedura da presente descrição incluem, sem limitação, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia e Pichia modificadas.

[0201] Em algumas modalidades, as células da presente descrição são células de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae ou Lactobacillus brevis. Em algumas moda- lidades, as células da presente descrição são células de Escherichia coli.

[0202] Geralmente, as células são cultivadas. A cultura é o processo pelo qual as células são cultivadas em condições controladas, geral- mente fora do seu ambiente natural. Por exemplo, células, como as cé- lulas bacterianas, podem ser cultivadas como uma suspensão no caldo nutriente líquido, também referido como meio de cultura líquido.

[0203] Exemplos de meios de crescimento bacterianos de Escheri- chia coli comumente usados incluem, sem limitação, caldo Miller LB (Caldo de lisogenia) (1% NaCl): peptona a 1%, extrato de levedura a 0,5% e NaCl a 1%; Caldo de Lennox LB (caldo de lisogenia) (NaCl a 0,5%): peptona a 1%, extrato de levedura a 0,5% e NaCl a 0,5%; meio SOB (caldo super ideal): peptona a 2%, extrato de levedura a 0,5%, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 MM MgSO4; meio SOC (super caldo ideal com repressor catabólico): SOB + 20 mM glicose; 2x caldo

YT (2x extrato de levedura e triptona): peptona a 1,6%, extrato de leve- dura a 1% e NaCl a 0,5%; meio TB (Terrific Broth): peptona a 1,2%, extrato de levedura a 2,4%, 72 mM K2HPOa, 17 MM KH2PO;, e glicerol a 0,4%; e meio SB (super caldo): peptona a 3,2%, extrato de levedura a 2% e NaCl a 0,5% e ou meio Korz (Korz, DJ et al. 1995).

[0204] Exemplos de meios de crescimento bacteriano de alta densi- dade de Escherichia coli incluem, mas não estão limitados a, meio DNAGro'Y, meio ProGro'"Y, meio AutoX'TY, meio DetoX'Y, meio In- duX'TY, meio SecPro""Y,

[0205] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em con- dições que resultam na expressão de enzimas ou ácidos nucleicos. Tais condições de cultura podem depender do produto específico sendo ex- pressado e da quantidade desejada do produto.

[0206] Em algumas modalidades, as células são cultivadas a uma temperatura de 30ºC a 40ºC. Por exemplo, células modificadas podem ser cultivadas a uma temperatura de 30ºC, 31ºC, 32ºC, 33ºC, 34ºC, 35ºC, 36ºC, 37ºC, 38ºC, 39ºC e 40ºC. Normalmente, as células, como células de E. coli modificadas, são cultivadas a uma temperatura de 37ºC.

[0207] Em algumas modalidades, as células são cultivadas por um período de tempo de 12 horas para 72 horas, ou mais. Por exemplo, células modificadas podem ser cultivadas por um período de tempo de 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 ou 72 horas. Normalmente, as células, como células bacterianas modificadas, são cultivadas por um período de tempo de 12 a 24 horas. Em algumas modalidades, as célu- las são cultivadas por 12 a 24 horas a uma temperatura de 37ºC.

[0208] Em algumas modalidades, as células são cultivadas (p.ex., em meio de cultura celular líquido) para uma densidade óptica, medidas no comprimento de onda de 600 nm (ODsoo), de 5 a 200. Em algumas modalidades, as células são cultivadas a uma ODgeoo de 5, 10, 15, 20,

25, 50, 75, 100, 150 ou 200.

[0209] Em algumas modalidades, as células são cultivadas a uma densidade de 1 x 108 (ODsoo< 1) a 2x 10º? (OD- 200) células viáveis/ml de meio de cultura de células. Em algumas modalidades, as células são cultivadas a uma densidade de 1 x 10º, 2 x 10%, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 10º, 2 x 10º, 3 x 10º, 4 x 10%, 5x 10º, 6 x 10º, 7 x 10º, 8 x 10º, 9 x 10º, 1 x 107º, 2 x 107º, 3 x 107º, 4 x 10º, x 10%, 6 x 10%, 7 x 10%, 8 x 107º, 9 x 107º, 1 x 10 ou 2 x 10º! de células viáveis/ml. (Fator de conversão: OD 1 = 8 x 10º células/ml).

[0210] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um biorreator. Um biorreator refere-se simplesmente a um recipiente no qual as células são cultivadas, como, por exemplo, um frasco de cultura, um prato, ou um saco que pode ser de uso único (descartável), autocla- vável ou esterilizável. O biorreator pode ser feito de vidro, ou pode ser à base de polímeros, ou pode ser feito de outros materiais.

[0211] Exemplos de biorreatores incluem, mas não se limitam a, biorreatores de tanque agitado (por exemplo, misturado no poço) e tu- bular (por exemplo, fluxo pistonado), biorreatores de transporte aéreo, biorreatores agitados de membrana, tanques agitados com filtro de ro- tação, vibromixers, reatores de leito fluidizado e biorreatores de mem- brana. O modo de operação do biorreator pode ser um processo de ba- telada ou contínuo e dependerá das células modificadas serem cultiva- das. Um biorreator é contínuo quando os fluxos de alimentação e de produto estão continuamente sendo alimentados e retirados do sistema. Um biorreator de batelada pode ter um fluxo de recirculação contínuo, mas nenhuma alimentação contínua de nutrientes ou produto de cultivo. Para culturas de colheita intermitente e lote alimentado (ou alimentado por lote), as células são inoculadas a uma menor densidade celular viá- vel em um meio que é semelhante em composição a um lote médio. As células são deixadas para crescer exponencialmente com essencial- mente nenhuma manipulação externa até que os nutrientes sejam um pouco esgotados e as células estejam se aproximando da fase de cres- cimento estacionária. Neste ponto, para um processo de alimentação por batelada intermitente, uma parte das células e o produto podem ser colhidos, e o meio de cultura removido é alimentado com um meio fresco. Este processo pode ser repetido várias vezes. Para a produção de proteínas recombinantes e anticorpos, um processo de alimentação em batelada pode ser usado. Enquanto as células estão crescendo ex- ponencialmente, mas nutrientes estão se tornando esgotados, o meio de alimentação concentrado (p.ex., meio basal 10-15 vezes concen- trado) é adicionado de forma contínua ou intermitente para fornecer nu- trientes adicionais, permitindo aumentar ainda a concentração de célu- las e o comprimento da fase de produção. Um meio fresco pode ser adicionado proporcional à concentração de células sem a remoção do meio de cultura (caldo). Para acomodar a adição de meio, uma cultura alimentada por batelada é iniciada em um volume muito menor que a capacidade total do biorreator (por exemplo, cerca de 40% a 50% do volume máximo).

[0212] Alguns métodos da presente descrição são direcionados para uma produção em grande escala (em escala comercial) de RNA (por exemplo, mRNA). Para os métodos de produção em grande escala, as células podem ser cultivadas em meio de cultura líquido em um vo- lume de 5 litros (L) para 250.000 L, ou mais. Em algumas modalidades, as células podem ser cultivadas em meio de cultura líquido em um vo- lume maior do que (ou igual a) 10 L, 100 L, 1000 L, 10000 L ou 100000 L. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cul- tura líquido em um volume de 5 L, 10 L, 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 35 L, 40 L, 45 L, 50 L, 100 L, 500 L, 1000 L, 5000 L, 10000 L, 100000 L, 150000 L, 200000 L, 250000 L, ou mais. Em algumas modalidades, as células podem ser cultivadas em meio de cultura líquido em um volume de 5 L a 10L,5La15L,5La20L,5La25L,5La30L,5La35L,5L ado L,5La45L,10La15L,10La20L,10La25L,20La30L,10La 35L, 10La40L,10La45L,10La50L,15La20L,15La25L,15 La30L,15La35L,15La40L,15La45Lou15a50L. Em algumas modalidades, as células podem ser cultivadas em meio de cultura lí- quido em um volume de 100 L a 300000 L, 100 L a 200000 L ou 100 L a 100000 L.

[0213] Normalmente, a cultura de células é seguida pela lise das células. Lise é o processo pelo qual as células são quebradas, por exemplo, por mecanismos virais, térmicos, químicos, enzimáticos, me- cânicos ou osmóticos. Um lisado celular é um fluido contendo o teor de células lisadas (por exemplo, células lisadas modificadas), incluindo, por exemplo, organelas, lipídios de membrana, proteínas, ácidos nucleicos e vesículas de membrana invertida. Lisados celulares da presente des- crição podem ser produzidos ao lisar qualquer população de células mo- dificadas, conforme fornecido aqui.

[0214] Lise celular pode perturbar ambientes celulares cuidadosa- mente controlados, resultando na degradação de proteínas e modifica- ção por proteases endógenas e fosfatases não reguladas. Assim, em algumas modalidades, os inibidores de protease e/ou inibidores de fos- fatase alcalina e/ou inibidores de nuclease e/ou inibidores da hidrolase e/ou inibidores de desaminase podem ser adicionados ao lisado celular ou células antes da lise, ou estas atividades podem ser removidas pela inativação térmica, inativação do gene ou direcionamento da protease.

[0215] Os lisado celulares, em algumas modalidades, podem ser combinados com um nutriente. Por exemplo, os lisado celulares podem ser combinados com Na2HPOa, KH2POa4, NHaCI, NaCl, MgSO2.a, CaCla. Exemplos de outros nutrientes incluem, mas não estão limitados a, sul- fato de magnésio, cloreto de magnésio, orotato de magnésio, citrato de

7T7/146 magnésio, fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico, fosfato de potássio tribásico, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio tribásico, fosfato de amônio monobá- sico, fosfato de amônio dibásico, sulfato de amônio, cloreto de amônio e hidróxido de amônio.

[0216] Os lisado celulares, em algumas modalidades, podem ser combinados com um cofator. Por exemplo, os lisados celulares podem ser combinados com a adenosina difosfato (ADP), a adenosina trifosfato (ATP), a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+), e outros compos- tos químicos não proteicos necessários para a atividade de uma enzima (por exemplo, íons inorgânicos e coenzimas).

[0217] O volume de lisado celular usado para uma única reação pode variar. Em algumas modalidades, o volume de um lisado celular é 0,001 a 250 mº?.

[0218] — Ácidos nucleicos

[0219] Um "ácido nucléico" é, pelo menos, dois nucleotídeos cova- lentemente ligados juntos e, em alguns casos, podem conter ligações fosfodiésteres (por exemplo, uma estrutura fosfodiéster). Os ácidos nu- cléicos (por exemplo, componentes ou partes, de ácidos nucleicos) po- dem ser de ocorrência natural ou modificados. "De ocorrência natural" os ácidos nucléicos estão presentes em uma célula que existe na natu- reza, na ausência de intervenção humana. “Ácidos nucleicos modifica- dos" incluem os ácidos nucleicos recombinantes e ácidos nucléicos sin- téticos. Um "ácido nucleico recombinante" refere-se a uma molécula que é construída juntando moléculas de ácidos nucleicos (p.ex., a partir da mesma espécie ou de espécies diferentes) e, geralmente, podem repli- car em uma célula viva. Um "ácido nucleico sintético" refere-se a uma molécula que é biologicamente sintetizada, quimicamente sintetizada, ou por outros meios sintetizados ou amplificados. Um ácido nucleico sintético inclui os ácidos nucléicos que são quimicamente modificados ou de outro modo modificados, mas podem emparelhar com ácidos nu- cleicos de ocorrência natural. Ácidos nucléicos recombinantes e sintéti- cos também incluem as moléculas que resultam da replicação de qual- quer um dos anteriores. Ácidos nucleicos modificados podem conter porções de ácidos nucleicos que são de ocorrência natural, mas como um todo, ácidos nucleicos modificados não ocorrem naturalmente e re- querem intervenção humana. Em algumas modalidades, um ácido nu- cléico codificando um produto da presente descrição é um ácido nu- cleico recombinante ou um ácido nucleico sintético. Em outras modali- dades, um ácido nucléico codificando um produto é de ocorrência natu- ral.

[0220] Um modelo de DNA modificado codificando o RNA, conforme fornecido aqui, pode ser ligado de maneira funcional a um promotor, que é uma região de controle de um ácido nucleico, em que a iniciação e a taxa de transcrição do restante de um ácido nucleico são controladas. Um promotor dirige a expressão ou a transcrição do ácido nucleico que ele regula.

[0221] Um promotor poderá ser um naturalmente associado com um gene ou uma sequência, como pode ser obtido através do isolamento das sequências 5' não codificantes localizadas a montante do segmento de codificação de um determinado gene ou sequência. Tal promotor pode ser endógeno.

[0222] Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico de codificação pode ser posicionada sob o controle de um promotor re- combinante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não é nor- malmente associado com a sequência codificada em seu ambiente na- tural. Tais promotores podem incluir promotores de outros genes; pro- motores isolados de qualquer outra célula; e promotores ou potenciado- res sintéticos que não são "de ocorrência natural", como, por exemplo,

aqueles que contêm diferentes elementos de regiões regulatórias trans- cricionais diferentes e/ou mutações que alteram expressão através de métodos de engenharia genética que são conhecidos na técnica. Além de produzir sequências de ácidos nucleicos de promotores e potencia- dores de forma sintética, as sequências podem ser produzidas usando clonagem recombinante e/ou tecnologia de amplificação de ácidos nu- cléicos, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0223] Um promotor é considerado ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos quando está em um local funcional e orientação correta em relação à sequência de nucleotídeos que o regula para controlar ("dirigir") a iniciação transcricional e/ou expressão da se- quência de nucleotídeos.

[0224] Ácidos nucleicos modificados da presente descrição podem conter um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Em algumas modalidades, o promotor constitutivo ou o promotor induzível é ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação e, opcionalmente, um ou mais terminais transcricional. Em algumas modalidades, a se- quência de codificação codifica uma proteína ou um produto de RNA. Um "promotor constitutivo" refere-se a um promotor que está sempre ativo em uma célula. Um "promotor induzível" refere-se a um promotor que inicia ou melhora a atividade transcricional quando em presença de, influenciado por, ou contactado por um indutor ou agente indutor, ou ativado na ausência de um fator que causa a repressão. Os promotores induzíveis para uso de acordo com a presente descrição incluem qual- quer promotor induzível descrito aqui ou conhecido por um versado na técnica. Exemplos de promotores induzíveis incluem, sem limitação, promotores quimicamente/bioquimicamente regulados e fisicamente re- gulados como promotores regulados por solvente orgânico, promotores regulados por tetraciclina, promotores regulados por esteroides, promo-

tores regulados por metal, promotores regulados por patogênese, pro- motores induzíveis pela temperatura/calor, promotores regulamentados por fosfato (por exemplo, PhoA), e promotores regulados pela luz.

[0225] Um RNA de codificação do modelo de DNA, conforme forne- cido aqui, pode ser também ligado de maneira funcional a uma ou mais terminadores transcricionais, que são regiões de controle de um ácido nucléico que fazem com que uma polimerase pare de transcrever e se dissociar do modelo de DNA.

[0226] Um terminador poderá ser uma ou mais sequências natural- mente associadas com um gene ou uma sequência, como pode ser ob- tido através do isolamento das sequências 3' não codificantes localiza- das a jusante do segmento de codificação de um determinado gene ou sequência. Tal terminador pode ser endógeno ou modificado para me- lhor eficiência de terminação. Sequências terminadoras endógenas e/ou modificadas de uma ou mais fontes podem ser adicionadas em série para melhor eficiência de terminação.

[0227] Modelos de DNA circular de codificação de RNA podem in- cluir um ou mais terminadores transcricionais para minimizar ou prevenir a transcrição da sequência de DNA de não modelo, por exemplo, uma sequência que é parte de uma estrutura do plasmídeo.

[0228] Ácidos nucleicos modificados podem ser introduzidos em cé- lulas hospedeiras usando qualquer meio conhecido na técnica, inclu- indo, sem limitação, transformação, transfecção (por exemplo, química (por exemplo, fosfato de cálcio, polímeros catiônicos ou lipossomas) ou não químicos (por exemplo, eletroporação, sonoporação, impalefecção, transfecção óptica, transfecção hidrodinâmica)) e transdução (por exemplo, transdução viral).

[0229] Enzimas ou outras proteínas codificadas por um ácido nu- cleico intracelular de ocorrência natural podem ser referidas como "en- zimas endógenas" ou "proteínas endógenas."

[0230] Composições

[0231] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs) compreende nucleosídeos difosfatos (NDPs), um polifosfato quinase e um polifosfato. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou um NDP quinase.

[0232] Em algumas modalidades, uma mistura de reacção para a produção de NTPs compreende nucleosídeo 5' monofosfatos, um poli- fosfato quinase e um polifosfato. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0233] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de NTPs compreende nucleosídeos, um polifosfato quinase e um polifosfato. Em algumas modalidades, a mistura de reação compre- ende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0234] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de NTPs compreende nucleobases, um fosforibosiltransfe- rase, um fosforibosilpirofosfato, um polifosfato quinase e um polifosfato. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende adicional- mente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP qui- Nnase.

[0235] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de NTPs compreende nucleobases, D-ribose, um riboquinase, uma fosfopentomutase, um nucleosídeo fosforilases, um polifosfato qui- nase e um polifosfato. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0236] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de ácido ribonucleico (RNA) compreende nucleosídeos difos- fatos (NDPs), um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de ácido desoxirribonucléico (DNA) e uma polimerase. Em algumas moda- lidades, a mistura de reação compreende adicionalmente um nucleosí- deo quinase, um NMO quinase e/ou um NDP quinase.

[0237] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de RNA compreende nucleosídeo 5' monofosfatos, um poli- fosfato quinase, um polifosfato, um modelo de ácido desoxirribonucléico (DNA) e uma polimerase. Em algumas modalidades, a mistura de rea- ção compreende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP qui- nase e/ou um NDP quinase.

[0238] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de RNA compreende nucleosídeos, um nucleosídeo quinase, um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de ácido desoxirribo- nucléico (DNA) e uma polimerase. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0239] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de RNA compreende nucleobases, um fosforibosiltransferase, um fosforibosilpirofosfato, um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de ácido desoxirribonucléico (DNA) e uma polimerase. Em al- gumas modalidades, a mistura de reação compreende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0240] Em algumas modalidades, uma mistura de reação para a produção de RNA compreende nucleobases, D-ribose, uma riboqui- nase, uma fosfopentomutase, um nucleosídeo fosforilase, um polifos- fato quinase, um polifosfato, um modelo de ácido desoxirribonucléico (DNA) e uma polimerase. Em algumas modalidades, a mistura de rea- ção compreende adicionalmente um nucleosídeo quinase, um NMP qui- nase e/ou um NDP quinase.

[0241] Modalidades adicionais

[0242] As modalidades adicionais da presente descrição são englo- badas pelos seguintes parágrafos numerados.

[0243] 1. “Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs), que compreende:

[0244] incubar em uma mistura de reação os nucleosídeos difosfa- tos (NDPs), um polifosfato quinase, e um polifosfato sob condições ade- quadas para a produção de NTPs, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou uma NDP qui- nase.

[0245] 2. —Método,de acordo com o parágrafo 1, em que os NDPs compreendem ADP, GDP, CDP e/ou UDP.

[0246] 3. — Método, de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que os NDP's são quimicamente sintetizados, um produto de fermentação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0247] 4. "Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0248] 5. — Método, de acordo com o parágrafo 4, em que o poli- fosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0249] 6. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0250] 7. — Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6, em que o polifosfato quinase, nucleosídeo quinase, e/ou o NDP quinase é preparado a partir de células que expressam o polifosfato qui- nase, nucleosídeo quinase, e/ou o NDP quinase.

[0251] 8. — Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que a mistura de reação compreende um lisado de células ou uma preparação enzimática de células que expressam o polifosfato qui- nase, o nucleosídeo quinase, e/ou o NDP quinase.

[0252] 9. "Método, de acordo com o parágrafo 8, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas.

[0253] 10. Método, de acordo com o parágrafo 9, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou a preparação enzimática foram eliminadas através da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma célula, e/ou direcionamento da protease.

[0254] 11. Método, de acordo com o parágrafo 9 ou 10, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na prepara- ção enzimática foram eliminadas através da temperatura, pH, sal, de- tergente, álcool e/ou inibidores químicos.

[0255] 12. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 9 a 11, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0256] 13. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 9 a 12, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hidro- lases.

[0257] 14. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase e/ou o NDP quinase podem suportar condições de eliminação.

[0258] 15. Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs), que compreende:

[0259] incubar em uma mistura de reação de 5' nucleosídeos mono- fosfatos (5' NMPs), um polifosfato quinase, e um polifosfato sob condi- ções adequadas para a produção de NTPs, opcionalmente, onde a mis- tura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou uma

NMP quinase e/ou uma NDP quinase.

[0260] 16. Método, de acordo com o parágrafo 15, em que os 5' NMP's compreendem 5' AMP, 5' GMP, 5' CMP e/ou 5' UMP.

[0261] 17. Método, de acordo com o parágrafo 15 ou 16, em que os 5' NMPs são quimicamente sintetizados, um produto de fermentação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0262] 18. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 17, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0263] 19. Método, de acordo com o parágrafo 18, em que o poli- fosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0264] 20. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 19, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0265] 21. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 20, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP qui- nase e/ou o NDP quinase é preparado a partir de células que expressam o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0266] 22. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 21, em que a mistura de reação compreende um lisado de células ou uma preparação enzimática de células que expressam o polifosfato qui- nase, o nucleosídeo quinase, oNMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0267] 23. Método, de acordo com o parágrafo 22, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0268] 24. Método, de acordo com o parágrafo 23, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0269] 25. Método, de acordo com o parágrafo 23 ou 24, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0270] 26. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 25, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0271] 27. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 26, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hidro- lases.

[0272] 28. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 27, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP qui- nase e/ou o NDP quinase podem suportar condições de eliminação.

[0273] 29. Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs), que compreende:

[0274] incubar em uma mistura de reação nucleosídeos, um polifosfato quinase, e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NTPs, opcionalmente, onde a mistura de reação compre- ende ainda um nucleosídeo quinase e/ou um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0275] 30. Método, de acordo com o parágrafo 29, em que os nu- cleosídeos compreendem adenosina, guanosina, citidina e/ou uridina.

[0276] 31. Método, de acordo com o parágrafo 29 ou 30, em que os nucleosídeos são quimicamente sintetizados, um produto de fermen- tação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0277] 32. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 31, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0278] 33. Método, de acordo com o parágrafo 32, em que o poli- fosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0279] 34. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 33, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0280] 35. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 34, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NMP qui- nase e/ou a NDP quinase é preparado a partir de células que expressam o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0281] 36. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 35, em que a mistura de reação compreende um lisado de células ou uma preparação enzimática de células que expressam o polifosfato qui- nase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0282] 37. Método, de acordo com o parágrafo 36, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0283] 38. Método, de acordo com o parágrafo 37, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0284] 39. Método, de acordo com o parágrafo 37 ou 38, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0285] 40. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 39, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0286] 41. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 40, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hidro- lases.

[0287] 42. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 41, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP qui- nase e/ou o NDP quinase podem suportar condições de eliminação.

[0288] 43. Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs), que compreende:

[0289] incubar em uma mistura de reação nucleobases, uma fosforibosiltransferase, um fosforibosilpirofosfato, um polifosfato qui- nase, e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NTP's, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou uma NMP quinase e/ou uma NDP quinase.

[0290] 44. Método, de acordo com o parágrafo 43, em que as nu- cleobases compreendem adenina, guanidina, citosina e/ou uracila.

[0291] 45. Método, de acordo com o parágrafo 43 ou 44, em que as nucleobases são quimicamente sintetizadas, um produto de fermen- tação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0292] 46. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 43 a 45, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0293] 47. Método, de acordo com o parágrafo 46, em que o poli- fosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0294] 48. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 43 a 47, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0295] 49. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 43 a 48, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP qui- nase e/ou o NDP quinase é preparado a partir de células que expressam o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0296] 50. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 43 a 49, em que a mistura de reação compreende um lisado de células ou uma preparação enzimática de células que expressam o polifosfato qui- nase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0297] 51. Método, de acordo com o parágrafo 50, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0298] 52. Método, de acordo com o parágrafo 51, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0299] 53. Método, de acordo com o parágrafo 51 ou 52, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0300] 54. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 51 a 53, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0301] 55. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 51 a 54, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hidro- lases.

[0302] 56. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 43 a 55, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP qui- nase e/ou o NDP quinase podem suportar condições de eliminação.

[0303] 57. Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs), que compreende:

[0304] incubar em uma mistura de reação nucleobases, ribose, riboquinase, fosfopentomutase, um nucleosídeo fosforilase, um polifos- fato quinase e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NTPs, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0305] 58. Método, de acordo com o parágrafo 57, em que as nu- cleobases compreendem adenina, guanidina, citosina e/ou uracila.

[0306] 59. Método, de acordo com o parágrafo 57 ou 58, em que as nucleobases são quimicamente sintetizadas, um produto de fermen- tação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0307] 60. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 57 a 59, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0308] 61. Método, de acordo com o parágrafo 60, em que o poli- fosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0309] 62. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 57 a 61, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0310] 63. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 57 a 62, em que a riboquinase, a fosfopentomutase, o nucleosídeo fosfori- lase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase é preparada a partir de células que expressam a ribo- quinase, a fosfopentomutase, o nucleosídeo fosforilase e o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0311] 64. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 57 a 63, em que a mistura de reação compreende um lisado preparado de células que expressam a riboquinase, a fosfopentomutase, o nucleosí- deo fosforilase a polifosfatase quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0312] 65. Método, de acordo com o parágrafo 64, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0313] 66. Método, de acordo com o parágrafo 65, em que a ativi-

dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0314] 67. Método, de acordo com o parágrafo 65 ou 66, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, solvente orgânico e/ou inibidores químicos.

[0315] 68. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 65 a 67, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0316] 69. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 65 a 68, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, desaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0317] 70. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 57 a 69, em que a rinoquinase, a fosfopentomutase, o nucleosídeo fosfori- lase, o polifosfato quinase, o NMP quinase, o NDP e/ou o nucleosídeo quinase podem suportar condições de eliminação.

[0318] 71. Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs), que compreende:

[0319] incubar em uma mistura de reação o ácido ribonucleico celu- lar (RNA), uma fosforilase polinucleotídica (PNPase), o fosfato inorgãà- nico, um polifosfato quinase, e um polifosfato sob condições adequadas para a produção de NDPs e NTPs, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou uma NDP qui- Nnase.

[0320] 72. Método, de acordo com o parágrafo 71, em que o RNA celular compreende o RNA ribossômico, o RNA mensageiro e/ou RNA de transferência.

[0321] 73. Método, de acordo com o parágrafo 61 ou 72, em que o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um organismo multi- celular.

[0322] 74. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 71 a 73, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0323] 75. Método, de acordo com o parágrafo 74, em que o poli- fosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0324] 76. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 71 a 75, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0325] 77. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 71 a 76, em que a PNPase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, e/ou o NDP quinase é preparado a partir de células que expressam a PNPase, o polifosfato quinase, nucleosídeo quinase, e/ou o NDP qui- nase.

[0326] 78. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 71 a 77, em que a mistura de reação compreende um lisado de células ou uma preparação enzimática de células que expressam a PNPase, o po- lifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, e/ou o NDP quinase.

[0327] 79. Método, de acordo com o parágrafo 78, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0328] 80. Método, de acordo com o parágrafo 79, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0329] 81. Método, de acordo com o parágrafo 79 ou 80, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0330] 82. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 79 a 81, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0331] 83. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 79 a 82, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, desaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0332] 84. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 79 a 83, em que a PNPase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase e/ou o NDP quinase podem suportar condições de eliminação.

[0333] 85. Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTP's), que compreende:

[0334] (A) incubar em uma mistura de reação o ácido ribonucleico celular (RNA), uma ribonuclease, um polifosfato quinase, e um polifos- fato sob condições adequadas para a produção de 5' NMPs e NTPs, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleo- sídeo quinase e/ou uma NMP quinase e/ou uma NDP quinase.

[0335] 86. Método, de acordo com o parágrafo 85, em que o RNA celular compreende o RNA ribossômico, o RNA mensageiro e/ou RNA de transferência.

[0336] 87. Método, de acordo com o parágrafo 85 ou 86, em que o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um organismo multi- celular.

[0337] 88. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 85 a 87, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0338] 89. Método, de acordo com o parágrafo 88, em que o poli- fosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0339] 90. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 85 a 89, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0340] 91. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 85 a 90, em que a ribonuclease, o polifosfato quinase, o nucleosídeo qui- nase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase é preparado a partir de célu- las que expressam a ribonuclease, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0341] 92. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 85 a 91, em que a mistura de reação compreende um lisado de células ou uma preparação enzimática de células que expressam a ribonuclease, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase.

[0342] 93. Método, de acordo com o parágrafo 92, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0343] 94. Método, de acordo com o parágrafo 93, em que a ativi- dade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0344] 95. Método, de acordo com o parágrafo 93 ou 94, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0345] 96. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 93 a 95, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0346] 97. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 93 a 96, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, desaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0347] 98. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 93 a 97, em que a ribonuclease, o polifosfato quinase, o nucleosídeo qui- nase, o NMP quinase e/ou o NDP quinase podem suportar condições de eliminação.

[0348] 99. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende:

[0349] incubar a mistura de reação nucleosídeos difosfatos (NDPs), um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA codificando um RNA de interesse, e uma RNA polimerase sob condições adequadas para a produção do RNA de interesse, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou uma NDP quinase.

[0350] 100. Método, de acordo com o parágrafo 99, em que os NDPs compreendem ADP, GDP, CDP e/ou UDP.

[0351] 101. Método, de acordo com o parágrafo 99 ou 100, em que os NDPs são quimicamente sintetizados, um produto de fermentação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0352] 102. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 99 a 101, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0353] 103. Método, de acordo com o parágrafo 102, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0354] 104. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 99 a 103, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0355] 105. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 99 a 104, em que o polifosfato quinase, o modelo de DNA, a polimerase, o nucleosídeo quinase e/ou o NDP quinase é preparado a partir de células que expressam o polifosfato quinase, o modelo do DNA, a polimerase, o nucleosídeo quinase e/ou o NDP quinase.

[0356] 106. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 99 a 105, em que a mistura de reação compreende um lisado de células ou uma preparação enzimática de células que expressam o polifosfato qui- nase, o modelo de DNA, a polimerase, o nucleosídeo quinase e/ou o NDP quinase.

[0357] 107. Método, de acordo com o parágrafo 106, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas.

[0358] 108. Método, de acordo com o parágrafo 107, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou a preparação enzimática foram eliminadas através da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma célula, e/ou direcionamento da protease.

[0359] 109. Método, de acordo com o parágrafo 107 ou 108, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na prepa- ração enzimática foram eliminadas através da temperatura, pH, sal, de- tergente, álcool e/ou inibidores químicos.

[0360] 110. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 107 a 109, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da sepa- ração, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0361] 111. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 107 a 110, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, desaminases, oxidoreductases e hidrolases.

[0362] 112. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 99 a 111, em que o polifosfato quinase, a polimerase, o nucleosídeo qui- nase e/ou o NDP quinase podem suportar condições de eliminação.

[0363] 113. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 99 a 112, em que a polimerase compreende um RNA polimerase.

[0364] 114. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA),

que compreende:

[0365] incubar a mistura de reação 5' nucleosídeos monofosfatos (5' NMP's), um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA co- dificando um RNA de interesse, e uma polimerase sob condições ade- quadas para a produção do RNA de interesse, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0366] 115. Método, de acordo com o parágrafo 114, em que os 5' NMP's compreendem 5' AMP, 5' GMP, 5' CMP e/ou 5' UMP.

[0367] 116. Método, de acordo com o parágrafo 114 ou 115, em que os 5' NMPs são quimicamente sintetizados, um produto de fermentação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0368] 117. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 116, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0369] 118. Método, de acordo com o parágrafo 117, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0370] 119. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 118, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0371] 120. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 119, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NMP quinase, a NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase é prepa- rada a partir de células que expressam o polifosfato quinase, o nucleo- sídeo quinase, o NMP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0372] 121. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 120, em que a mistura de reação compreende um lisado de célu- las ou uma preparação enzimática de células que expressam o polifos- fato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0373] 122. Método, de acordo com o parágrafo 121, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0374] 123. Método, de acordo com o parágrafo 122, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0375] 124. Método, de acordo com o parágrafo 122 ou 123, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool! e/ou inibido- res químicos.

[0376] 125. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 122 a 124, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da sepa- ração, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0377] 126. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 122 a 125, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0378] 127. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 125, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase e/ou a polimerase podem suportar condições de eliminação.

[0379] 128. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 127, em que a polimerase compreende um RNA polimerase.

[0380] 129. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende:

[0381] incubar a mistura de reação nucleosídeos, um polifosfato qui- nase, um polifosfato, um modelo de DNA codificando um RNA de inte- resse, e/ou uma polimerase sob condições adequadas para a produção do RNA de interesse, opcionalmente, onde a mistura de reação com- preende ainda um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou um NDP quinase.

[0382] 130. Método, de acordo com o parágrafo 129, em que os nu- cleosídeos compreendem adenosina, guanosina, citidina e/ou uridina.

[0383] 131. Método, de acordo com o parágrafo 129 ou 130, em que os nucleosídeos são quimicamente sintetizados, um produto de fermen- tação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0384] 132. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 129 a 131, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0385] 133. Método, de acordo com o parágrafo 132, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0386] 134. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 129 a 133, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0387] 135. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 129 a 134, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase é prepa- rada a partir de células que expressam pelo menos um polifosfato qui- nase, o nucleosídeo quinase, o polifosfato, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0388] 136. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 129 a 135, em que a mistura de reação compreende um lisado de célu- las ou uma preparação enzimática de células que expressam pelo me- nos o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o mo- delo de DNA e/ou a polimerase.

[0389] 137. Método, de acordo com o parágrafo 136, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0390] 138. Método, de acordo com o parágrafo 137, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0391] 139. Método, de acordo com o parágrafo 137 ou 138, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0392] 140. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 137 a 139, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da sepa- ração, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0393] 141. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 137 a 140, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidorreductases e hidrolases.

[0394] 142. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 129 a 141, em que pelo menos o polifosfato quinase, o polifosfato, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase e/ou a polimerase podem suportar condições de eliminação.

[0395] 143. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 129 a 142, em que a polimerase compreende uma RNA polimerase.

[0396] 144. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende:

[0397] incubar a mistura de reação nucleobases, uma fosforibosil- transferase, um fosforibosilpirofosfase, um polifosfato quinase e um po- lifosfato, um modelo de DNA codificando um RNA de interesse, e/ou uma polimerase sob condições adequadas para a produção do RNA de interesse, opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase, uma NMP quinase e/ou uma NDP quinase.

[0398] 145. Método, de acordo com o parágrafo 144, em que as nu- cleobases compreendem adenina, guanidina, citosina e/ou uracila.

[0399] 146. Método, de acordo com o parágrafo 144 ou 145, em que as nucleobases são quimicamente sintetizadas, um produto de fermen- tação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0400] 147. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 146, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0401] 148. Método, de acordo com o parágrafo 148, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0402] 149. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 144 a 148, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0403] 150. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 149, em que a fosforibosiltransferase, o polifosfato quinase, o nu- cleosídeo quinase, uma NMP quinase, a NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase é preparada a partir de células que expressam a fosforibosiltransferase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0404] 151. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 144 a 150, em que a mistura de reação compreende um lisado de célu- las ou uma preparação enzimática de células que expressam a fosfori- bosiltransferase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0405] 152. Método, de acordo com o parágrafo 151, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0406] 153. Método, de acordo com o parágrafo 152, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0407] 154. Método, de acordo com o parágrafo 152 ou 153, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0408] 155. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 137 a 139, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da sepa- ração, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0409] 156. Método, de acordo com a reivindicação 152 a 155, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hidrolases.

[0410] 157. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 114 a 156, em que a fosforibosiltransferase, o polifosfato quinase, o nu- cleosídeo quinase, a NMP quinase, a NDP quinase e/ou a polimerase podem suportar condições de eliminação.

[0411] 158. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 144 a 157, em que a polimerase compreende uma RNA polimerase.

[0412] 159. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende:

[0413] incubar a mistura de reação nucleobases, uma ribose, uma riboquinase, uma fosfopentomutase, um nucleosídeo fosforilase, um po- lifosfato quinase e um polifosfato, um modelo de DNA codificando um RNA de interesse, e uma polimerase sob condições adequadas para a produção do RNA de interesse, opcionalmente, onde a mistura de rea- ção compreende ainda um nucleosídeo quinase, uma NMP quinase e/ou uma NDP quinase.

[0414] 160. Método, de acordo com o parágrafo 159, em que as nu- cleobases compreendem adenina, guanidina, citosina e/ou uracila.

[0415] 161. Método, de acordo com o parágrafo 159 ou 160, em que as nucleobases são quimicamente sintetizadas, um produto de fermen- tação, ou extraídos de uma fonte natural.

[0416] 162. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 159 a 161, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0417] 163. Método, de acordo com o parágrafo 162, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0418] 164. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 159 a 163, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0419] 165. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 159 a 164, em que a riboquinase, a fosfopentomutase, o nucleosídeo fosforilase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NMP qui- nase, a NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase é de pelo menos um lisado preparado de células modificadas que expressam a riboquinase, a fosfopentomutase, o nucleosídeo fosforilase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NMP quinase, a NDP quinase, o mo- delo de DNA e/ou a polimerase.

[0420] 166. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 159 a 165, em que a mistura de reação compreende um lisado prepa- rado de células que expressam a riboquinase, a fosfopentomutase, o nucleosídeo fosforilase a polifosfatase quinase, o nucleosídeo quinase, a NMP quinase, a NDP quinase o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0421] 167. Método, de acordo com o parágrafo 166, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada.

[0422] 168. Método, de acordo com o parágrafo 167, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0423] 169. Método, de acordo com o parágrafo 167 ou 168, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, solvente orgânico e/ou inibidores químicos.

[0424] 170. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 167 a 169, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foram eliminadas através da sepa- ração, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0425] 171. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 167 a 170, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0426] 172. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 159 a 171, em que a riboquinase, a fosfopentomutase, o nucleosídeo fosforilase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NMP qui- nase, a NDP e/ou a polimerase é modificada para suportar condições de eliminação.

[0427] 173. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 159 a 172, em que pelo menos a polimerase compreende pelo menos uma RNA polimerase.

[0428] 174. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende:

[0429] (a) incubarem uma mistura de reação o ácido ribonucleico celular (RNA), uma fosforilase polinucleotídica (PNPase) e o fosfato inorgânico, sob condições adequadas para a produção de nucleosídeos difosfatos (NDP's);

[0430] (b) eliminaraPNPase; e

[0431] (c) incubara mistura de reação, ou em uma segunda mis- tura reação, os NDPs, um polifosfato quinase, um polifosfato, um mo- delo de DNA codificando um RNA de interesse, e uma polimerase sob condições adequadas para a produção do RNA de interesse, opcional- mente, onde a mistura de reação da etapa (c) compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou NDP quinase.

[0432] 175. Método, de acordo com o parágrafo 174, em que o RNA celular compreende o RNA ribossômico, o RNA mensageiro e/ou RNA de transferência.

[0433] 176. Método, de acordo com o parágrafo 174 ou 175, em que o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um organismo multi- celular.

[0434] 177. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 174 a 176, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2.

[0435] 178. Método, de acordo com o parágrafo 177, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0436] 179. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 174 a 178, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0437] 180. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 174 a 179, em que a PNPase é preparada a partir de células que ex- pressam a PNPase.

[0438] 181. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 174 a 180, em que a mistura de reação de (a) compreende um lisado celular preparado a partir de células que expressam a PNPase.

[0439] 182. Método, de acordo com o parágrafo 181, em que a etapa (b) compreende a eliminação da PNPase através de temperatura, PH, sal, detergente, álcool e/ou inibidores químicos.

[0440] 183. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 181 a 182, em que a etapa (b) compreende a eliminação da via PNPase em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular ou na preparação enzimática foi eliminada através da separação, precipi- tação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0441] 184. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 174 a 183, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase é preparada a partir de células que expressam o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0442] 185. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 174 a 183, em que a mistura de reação da etapa (c) compreende um lisado celular preparado de células que expressam o polifosfato qui- nase, o nucleosídeo quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0443] 186. Método, de acordo com o parágrafo 185, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular da etapa (c) foi eliminada.

[0444] 187. Método, de acordo com o parágrafo 186, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0445] 188. Método, de acordo com o parágrafo 186 ou 187, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0446] 189. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 186 a 188, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0447] 190. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 186 a 189, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, desaminases, oxidorreductases e hidrolases.

[0448] 191. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 186 a 190, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NDP quinase e/ou a polimerase pode suportar condições de eliminação.

[0449] 192. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 174 a 191, em que a polimerase compreende uma RNA polimerase.

[0450] 193. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende

[0451] (a) incubar em uma mistura de reação o ácido ribonucleico celular (RNA), uma fosforilase polinucleotídica (PNPase), o fosfato inor- gânico, um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA co- dificando um RNA de interesse, e uma polimerase sob condições ade- quadas para a produção de disfosfatos de nucleosídeos, opcional- mente, onde a mistura de reação compreende ainda um nucleosídeo quinase e/ou um NDP quinase;

[0452] (b) eliminaraPNPase;e

[0453] (c) incubar a mistura de reação em condições adequadas para a produção do RNA de interesse.

[0454] 194. Método, de acordo com o parágrafo 193, em que o RNA celular compreende o RNA ribossômico, o RNA mensageiro e/ou RNA de transferência.

[0455] 195. Método, de acordo com o parágrafo 193 ou 194, em que o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um organismo multi- celular.

[0456] 196. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 193 a 195, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e das enzimas da família PPK2.

[0457] 197. Método, de acordo com o parágrafo 196, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0458] 198. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 193 a 197, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0459] 199. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 193 a 198, em que a PNPase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo qui- nase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase é preparada a partir de células que expressam a PNPase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polime- rase.

[0460] 200. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 193 a 199, em que a mistura de reação de (a) compreende um lisado celular preparado de células que expressam a PNPase, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0461] 201. Método, de acordo com o parágrafo 200, em que a etapa (b) compreende a eliminação da PNPase e das atividades enzi- máticas nativas no lisado celular através de temperatura, pH, sal, deter- gente, álcool e/ou inibidores químicos.

[0462] 202. Método, de acordo com o parágrafo 200 ou 201, em que a etapa (b) compreende a eliminação da PNPase e atividades enzimá- ticas nativas no lisado celular através da separação, precipitação, filtra- ção, captura e/ou cromatografia.

[0463] 203. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 200 a 202, em que a etapa (b) compreende a eliminação das atividades enzimáticas nativas no lisado celular através da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma célula, protease e/ou direciona- mento.

[0464] 204. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 200 a 203, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0465] 205. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 201 a 204, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NDP quinase e/ou a polimerase pode suportar condições de eliminação.

[0466] 206. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 193 a 205, em que a polimerase compreende uma RNA polimerase.

[0467] 207. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende:

[0468] (a) incubar em uma mistura de reação do ácido ribonu- cleico celular (RNA) e uma ribonuclease, sob condições adequadas para a produção de 5' nucleosídeos monofosfatos (5' NMP's);

[0469] (b) eliminar a ribonuclease; e

[0470] (c) incubara mistura de reação, ou em uma segunda mis- tura reação, os 5' NMP's, um polifosfato quinase, um polifosfato, um mo- delo de DNA codificando um RNA de interesse, e uma polimerase sob condições adequadas para a produção do RNA de interesse, opcional- mente, onde a mistura de reação da etapa (c) compreende ainda um nucleosídeo quinase, um NMP quinase e/ou NDP quinase.

[0471] 208. Método, de acordo com o parágrafo 207, em que o RNA celular compreende o RNA ribossômico, o RNA mensageiro e/ou RNA de transferência.

[0472] 209. Método, de acordo com o parágrafo 207 ou 208, em que o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um organismo multi- celular.

[0473] 210. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 207 a 209, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e das enzimas da família PPK2.

[0474] 211. Método, de acordo com o parágrafo 210, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0475] 212. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos

207 a 211, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0476] 213. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 207 a 212, em que a ribonuclease é preparada a partir de células que expressam a ribonuclease.

[0477] 214. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 207 a 213, em que a mistura de reação de (a) compreende um lisado celular preparado a partir de células que expressam a ribonuclease.

[0478] 215. Método, de acordo com o parágrafo 214, em que a etapa (b) compreende a eliminação da ribonuclease através de tempe- ratura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibidores químicos.

[0479] 216. Método, de acordo com o parágrafo 214 ou 215, em que a etapa (b) compreende a eliminação da ribunuclease através da sepa- ração, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0480] 217. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 107 a 216, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, a NMP quinase, a NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase é prepa- rada a partir de células que expressam o polifosfato quinase, o nucleo- sídeo quinase, o NMP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0481] 218. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 207 a 216, em que a mistura de reação da etapa (c) compreende um lisado celular preparado de células que expressam o polifosfato qui- nase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0482] 219. Método, de acordo com o parágrafo 218, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular da etapa (c) foi eliminada.

[0483] 220. Método, de acordo com o parágrafo 219, em que a ati- vidade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foi eliminada atra- vés da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma cé- lula, e/ou direcionamento da protease.

[0484] 221. Método, de acordo com o parágrafo 219 ou 220, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram elimi- nadas através da temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibido- res químicos.

[0485] 222. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 219 a 221, em que a atividade enzimática nativa de enzimas no lisado celular foram eliminadas através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0486] 223. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 219 a 222, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0487] 224. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 219 a 223, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase e/ou a polimerase podem suportar condições de eliminação.

[0488] 225. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 207 a 224, em que a polimerase compreende pelo menos uma RNA polimerase.

[0489] 226. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), que compreende:

[0490] (a) incubarem uma mistura de reação o ácido ribonucleico celular (RNA), uma ribonuclease, um polifosfato quinase, um polifosfato, um modelo de DNA codificando um RNA de interesse e uma polimerase, sob condições adequadas para a produção de 5' nucleosídeos mono- fosfatos (5' NMP's);

[0491] (b) eliminar a ribonuclease; e

[0492] (c) incubar a mistura de reação em condições adequadas para a produção do RNA de interesse.

[0493] 227. Método, de acordo com o parágrafo 226, em que o RNA celular compreende o RNA ribossômico, o RNA mensageiro e/ou RNA de transferência.

[0494] 228. Método, de acordo com o parágrafo 226 ou 214, em que o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um organismo multi- celular.

[0495] 229. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 228, em que o polifosfato quinase é selecionado a partir das en- zimas da família PPK1 e das enzimas da família PPK2.

[0496] 230. Método, de acordo com o parágrafo 229, em que o po- lifosfato quinase compreende um polifosfato quinase de classe Ill 2 de Deinococcus geothermalis.

[0497] 231. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 230, em que o polifosfato compreende o hexametafosfato.

[0498] 232. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 231, em que a ribonuclease, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a po- limerase é preparada a partir de células que expressam a ribonuclease, o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0499] 233. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 227 a 232, em que a mistura de reação de (a) compreende um lisado celular preparado de células que expressam a ribonuclease, o polifos- fato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase, o modelo de DNA e/ou a polimerase.

[0500] 234. Método, de acordo com o parágrafo 233, em que a etapa (b) compreende a eliminação da ribonuclease e das atividades enzimáticas nativas no lisado celular através de temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibidores químicos.

[0501] 235. Método, de acordo com o parágrafo 233 ou 234, em que a etapa (b) compreende a eliminação da ribonuclease e atividades en- zimáticas nativas no lisado celular através da separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

[0502] 236. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 233 a 235, em que a etapa (b) compreende a eliminação das atividades enzimáticas nativas no lisado celular através da modificação genética, secreção de enzimas a partir de uma célula, protease e/ou direciona- mento.

[0503] 237. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 234 a 236, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hi- drolases.

[0504] 238. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 234 a 237, em que o polifosfato quinase, o nucleosídeo quinase, o NMP quinase, o NDP quinase e/ou a polimerase podem suportar condições de eliminação.

[0505] 239. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 238, em que a polimerase compreende uma RNA polimerase.

[0506] EXEMPLOS

[0507] Exemplo 1 - Síntese livre de célula de RNA a partir de lisado de RNA ou RNA purificado de E. coli

[0508] Materiais e métodos

[0509] Cepas e Lisados

[0510] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada com vetores PETDuet-1 que codificam versões otimizadas por códon das seguintes enzimas: RNase R (K544R) de E. coli (ECRNR), UMP quinase de Pyro- coccus furiosus (PÍPyrH), CMP quinase de Thermus thermophilus (Tthemk), GMP quinase de Thermotoga maritima (TmGmk), NDP qui- nase de Aquifex aeolicus (AaNdk), e polifosfato quinase de classe Ill de Deinococcus geothermalis (D9PPK2). Todas as enzimas, exceto

DgPPK2, continham etiquetas N-terminal de hexahistidina. As cepas re- sultantes foram cultivadas em um em processo de fermentação de ba- telada a 37ºC em meio Korz suplementado com 40 g/L glicose e 50 mg/L carbenicilina até ODgeoo = 20, induzidas com 0,8 mM isopropila B-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG), e cultivadas por mais 1 hora antes da co- lheita através de centrifugação. Após a colheita, os péletes de biomassa foram armazenados a -80ºC.

[0511] Os péletes de biomassa foram então usados para preparar lisados celulares. Os lisados foram preparados por descongelamento de péletes de biomassa no gelo e, em seguida, ressuspensos em tampão de ressuspensão de 1,5 volume. Para a cepa expressando EcRNR, a biomassa foi ressuspensa em 58,8 mM fosfato de potássio dibásico. Para cepas expressando PíPyrH, TthCmk, TMGmKk e AaNdk, a bio- massa foi ressuspensa em 50 mM de Tris-HCI (pH 8,5) com 50 mM NaCl. Para a cepa expressando DgPPK2, a biomassa foi ressuspensa em 100 mM MOPS-NaOH (pH 7,0). Para todas as cepas, a biomassa foi lisadas por 2-3 passagens de homogeneização mecânica a 15.000 psi a 4ºC. Os lisados foram então clarificados por centrifugação a 16.000 x g por 1 hora a 4ºC.

[0512] Extração e purificação de RNA de E. coli

[0513] O RNA foi extraído e purificado a partir de lisados de E. coli de alta densidade (concentração de proteínas: 40-50 mg/mL), de acordo com protocolos estabelecidos (Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. J. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and poly- adenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in Enzymology, 447, 3-29).

[0514] Expressão e purificação da proteína

[0515] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada com um vetor PBAD?24 codificando um RNA polimerase T7 mutante termoestável e uma etiqueta N-terminal de hexahistidina. A cepa resultante foi cultivada em balão de Erlenmeyer com meio de caldo de lisogênio (LB) suple- mentado com 50 mg/L de carbenicilina. As culturas foram cultivadas a 37ºC, com agitação até ODgeoo = 0,6, então induzidas com L-Arabinose a 0,2% (p/v) e cultivadas por mais 4 horas. A biomassa foi então colhida por centrifugação e armazenada a -80ºC antes de lise. Os lisados foram preparados por descongelamento de péletes de biomassa no gelo, res- suspensos em tampão de estabilização/lavagem de 1,5 volumes (20 mM fosfato de sódio, pH 7,4, 500 mM cloreto de sódio, 30 mM imidazol) e 2-3 passagens de homogeneização mecânica a 15.000 psi e 4ºC. Os lisados foram então clarificados por centrifugação. A proteína recombi- nante foi purificada por cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) usando um AKTAPrime Plus equipado com uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare Life Sciences) na sequência de protocolos padrão. Frações contendo proteína recombinante foram então combinadas e trocadas pelo tampão por diálise em 2x solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementado com 5 mM DTT e Triton X-100 a 0,01%. Pós-diá- lise, os estoques de proteína foram diluídos com volume igual de glicerol e armazenados a -20ºC.

[0516] Para RNase R de E. coli, as culturas foram cultivadas, a ex- pressão foi induzida e os lisados foram preparados seguindo os proto- colos descritos aqui. A enzima foi então purificada seguindo os protoco- los descritos aqui, exceto que a enzima purificada foi trocada com tam- pão por diálise em 2X PBS suplementado com 500 mM NaCl, antes de misturar com glicerol.

[0517] Preparação do modelo de DNA

[0518] Modelos de DNA linear foram amplificados a partir de DNA sintético por PCR e purificados usando imobilização reversível de fase sólida (SPRI) em microesferas paramagnéticas. Modelos de DNA plas- midial foram preparados por clonagem da sequência de interesse em um vetor plasmidial adequado, transformando o plasmídeo resultante em cepa de E. coli DH10b, cultivando os transformantes em meio LB e purificando os plasmídeos através dos kits de plasmídeo Maxi ou Giga (Qiagen).

[0519] Síntese de RNA livre da célula do RNA lisado

[0520] Os lisados expressando ECRNR, TthCmk, PfPyrH, TmMGmk, AaNdk e DgPPK?2 foram diluídos cada para 42 mg/ml em 50 mM Tris, 50 mM NaCl! (pH 7,0) e, em seguida, combinados em igual proporção. A despolimerização do RNA nos lisados foi iniciada pela adição de um volume igual de 3 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em 50 mM Tris, 50 mM NaCl (pH 7,0) e incubando a 37ºC por 15 minutos. À despolimerização foi monitorada através da quantificação de nucleotí- deos solúveis em ácido por absorbância a 260 nm. O sulfato de magné- sio e o hexametafosfato de sódio foram adicionados aos lisados para concentrações finais de 30 mM e 1 mM, respectivamente, então os lisa- dos foram incubados a 70ºC por 15 minutos para inativar ECRNR e en- zimas endógenas de E. coli. Após 15 minutos, a temperatura foi redu- zida para 50ºC, e a reação foi montada com a seguinte composição: Tabela 11. Condições de reação

[0521] As reações foram incubadas a 50ºC por 2 horas, tratadas com TURBO DNase (Thermo Fisher), e analisadas por eletroforese em gel de agarose.

[0522] Síntese de RNA livre da célula do RNA de E. coli purifi- cado

[0523] RNA purificado de E. coli (cerca de 8 g/L) foi despolimerizado por incubação com 1 g/L de RNase R purificado de E. coli em um tam- pão contendo 50 mM de Tris-HCI (pH 7,0), 50 mM cloreto de sódio e 2 mM sulfato de magnésio. A reação de despolimerização foi incubada a

37ºC por 30 minutos e monitorada pela quantificação de nucleotídeos solúveis em ácido por absorbância a 260 nm. Após 30 minutos, a reação de despolimerização foi combinada com os lisados TthCmk, TmMGmk, PfPyrH, AaNdk e DIPPK?2 cada um diluído em 50 mM Tris-HCI (pH 7,0), 50 mM NaCl, e misturado em proporção igual. O sulfato de magnésio e o hexametafosfato de sódio foram, então, adicionados a concentrações finais de 30 MM e 1 mM, respectivamente, e a reação aquecida a 70ºC por 15 minutos. Após a inativação térmica, as reações foram montadas como descrito aqui com a seguinte composição: Tabela 12. Condições de reação

[0524] Resultados

[0525] A síntese livre de célula de RNA foi realizada usando o lisado de RNA como substrato. O RNA a partir de lisados agrupados superex- pressando as enzimas da via foi primeiro despolimerizado por RNase R de E. coli (ECRNR) superexpressada, uma exonuclease que produz 5' NMP's. A despolimerização foi rápida, produzindo aproximadamente 14 mM de nucleotídeos solúveis em ácido após 15 minutos (FIG. 8A). À mistura do lisado contendo enzimas da via e 5' NMPs foi então tratada com calor para inativar ECRNR e as enzimas endógenas de E. coli, en- quanto as enzimas termoestáveis da via permaneceram ativas. Após a inativação térmica, a reação de síntese de RNA foi montada, incubada a 50ºC, e visualizada em gel de agarose (FIG. 8B). Reações com dois modelos diferentes, incluindo um produto de PCR linear (Modelo 1) e um modelo em forma de grampo (hairpin) codificado em um plasmídeo (Modelo 2), produziu bandas distintas em um gel de agarose (FIG. 8B). Não foram observadas bandas nas condições sem RNA polimerase.

Como controle positivo, as reações foram realizadas onde 5'NMPs pu- rificados (4 MM cada AMP, CMP, GMP e UMP) foram adicionadas. Es- tas reações produziram produtos que migraram no mesmo tamanho como reações usando NMPs produzidos pela despolimerização do RNA.

[0526] A síntese livre de célula de RNA também foi realizada usando o RNA purificado de E. coli como substrato. O RNA foi primeiro incubado com RNase R purificada de E. coli (KS44R) para liberar 5' NMPs (FIG. 9A). Após 30 minutos, a reação de despolimerização foi combinada com uma mistura de lisado contendo as enzimas da via e com tratamento térmico para inativar ECRNR e as enzimas endógenas de E. coli, en- quanto as enzimas termoestáveis da via permaneceram ativas. Após a inativação térmica, a reação de síntese de RNA foi montada, incubada a 50ºC, e visualizada em gel de agarose (FIG. 9B). Reações com dois modelos diferentes, incluindo um produto de PCR linear (Modelo 1) e um modelo em forma de grampo (hairpin) codificado em um plasmídeo (Modelo 2), produziu bandas definidas em um gel de agarose, apesar dos rendimentos parecerem baixos para o Modelo 2 (FIG. 9B). Mais uma vez, não foram observadas bandas nas condições sem RNA poli- merase.

[0527] Tomados em conjunto, esses resultados demonstram que a síntese de RNA livre de células pode ser usada para produzir um RNA de interesse a partir de uma variedade de NMP, material de origem, in- cluindo NMP's adquiridos de alta pureza, NMPs produzidos por despoli- merização enzimática de lisado de RNA, e NMPs produzidos por des- polimerização enzimática de RNA purificado.

[0528] Exemplo 2 - Síntese livre de célula de RNA usando uma polimerase não termoestável do tipo selvagem ou uma polimerase mutante termoestável, e NMPs purificados como substrato

[0529] Materiais e métodos

[0530] Biomassa, lisados, proteínas purificadas e modelo de DNA foram preparados conforme descrito aqui. Síntese livre de célula de RNA foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 1, exceto que o EcRNR foi omitido e 4 MM de cada AMP, CMP, GMP e UMP foram adicionados à reação.

[0531] Resultados

[0532] A síntese livre de célula de RNA foi realizada usando NMP purificados como um substrato a uma temperatura de reação de 37ºC. Os lisados contendo enzimas da via foram então tratados com calor para inativar as enzimas endógenas de E. coli, enquanto as enzimas termoestáveis da via permaneceram ativas. Após a inativação de calor, a reação foi montada usando o RNA polimerase T7 do tipo selvagem ou um mutante termoestável, incubada a 37ºC por 2 horas, e visualizadas em gel de agarose (FIG. 10). Reações com dois modelos diferentes, incluindo um produto de PCR linear (Modelo 1) e um modelo em forma de grampo (hairpin) codificado em um plasmídeo (Modelo 2), produziu bandas distintas com ambas as polimerases. A 37ºC, o rendimento do RNA (com base na intensidade da banda de gel) pareceu maior com a polimerase do tipo selvagem do que o mutante termoestável, especial- mente com o Modelo 2. Não foram observadas bandas nas condições sem RNA polimerase.

[0533] Esses resultados demonstram que o RNA polimerase usado para a síntese de RNA de células livres não precisa ser termoestável, e que o RNA pode ser produzido com um RNA polimerase T7 do tipo sel- vagem em uma reação a 37ºC.

[0534] Exemplo 3 - Síntese livre da célula de RNA usando um polifosfato quinase 2 de classe Ill de Deinococcus geotherma- lis(DgPPK2) e NMPs como um substrato

[0535] Materiais e métodos

[0536] Reações de síntese de RNA livre de células foram montadas,

essencialmente, como descrito no Exemplo 2, com a seguinte composi- ção: Tabela 13. Condições de reação

[0537] Como controle positivo, um sistema do lisado de 5 enzimas contendo uridilato quinase, citidilato quinase, guanilato quinase, nucle- otídeo difosfato quinase e um polifosfato quinase foi usado na reação de acordo com os Exemplos 1-2. O dsRNA sintetizado nas reações foi purificado através de um protocolo de extração de RNASwift adaptado e quantificado usando uma cromatografia de par de íon de fase reversa, conforme descrito aqui (Nwokeji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry, 512, 36 -46).

[0538] Resultados

[0539] A síntese livre de células de RNA foi realizada em reações com DgPPK2 como a única quinase na reação, e os NMPs como subs- trato. Como controle positivo, o RNA foi sintetizado na presença do sis- tema de lisado de 5 enzimas contendo uridilato quinase, citidilato qui- nase, guanilato quinase, nucleotídeo difosfato quinase e polifosfato qui- nase. A reação de controle foi realizada na ausência de polimerase.

[0540] O fator de resposta para cada reação foi determinado. O fator de resposta foi calculado como razão de área do dsRNA de interesse para o padrão interno do dsRNA comercialmente disponível. A compa- ração dos fatores de resposta demonstrou que as reações contendo DgPPK2 como a única quinase sintetizada -48% do dsRNA sintetizado que foi sintetizado em reações contendo o sistema de lisado de 5 enzi- mas (FIG. 11A). O produto de dsRNA sintetizado na reação de DIoPPK2 e a reação do sistema de lisado de 5 enzimas foram analisadas por HPLC. Os cromatogramas de HPLC do produto de dsRNA das reações foram semelhantes, demonstrando que o produto de dsRNA produzido pelo sistema só DgPPK?2 foi semelhante ao produto produzido pelo sis- tema de 5 enzimas (FIG. 11B).

[0541] Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que o DgPPK2 poderia ser usado como uma única quinase para sintetizar o dsRNA livre de células de NMPs ou NDPs.

[0542] Exemplo 4 - Despolimerização do RNA a partir de várias fontes usando RNase R purificada ou nuclease P1 purificada

[0543] Materiais e métodos

[0544] Extração e purificação de RNA e nuclease

[0545] O RNA foi extraído e purificado a partir de lisados de E. coli de alta densidade (concentração de proteínas: 40-50 mg/mL), de acordo com protocolos estabelecidos (Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. J. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and poly- adenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in Enzymology, 447, 3-29).

[0546] O RNA de Vibrio foi purificado a partir de caldo celular de V. natriegens usando o protocolo RNASwift (Nwokeji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Bio- chemistry, 512, 36-46).

[0547] O extrato de RNA derivado de levedura foi comprado de fon- tes comerciais. O RNA em pó foi -85% a -90% puro e não necessitou mais purificação. A RNase R foi purificada a partir de uma cepa de E. coli superexpressando a RNase R e cultivada a alta densidade celular. As proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade de metal imobilizada usando colunas HisTrap HP conectadas a um sistema AK- TAPrime Plus FPLC (GE Healthcare). Nuclease P1 purificada, uma 5'

fosfodiesterase, foi obtida a partir de fontes comerciais.

[0548] Despolimerização de RNA com nuclease exógena

[0549] O RNA de E. coli, RNA de V. natriegens, RNA derivado de levedura em pó ressuspenso em água livre de nuclease (teor de RNA de 11 mg/mL), solução de RNase R (1 mg/ml em 300 mM tampão de fosfato de potássio, pH 7,4, 200 mM KCI, 2 mM MgCl2) e nuclease P1 purificada (também chamado da 5' fosfodiesterase) (1 - 2 mg/ml em 100 mM tampão fosfato de potássio pH 7,4, 1 mM ZnCl2, 10 MM MgCl2) foram pré-equilibrados em 2ºC antes de iniciar a reação. No tempo t = O, 50 ul de RNA e 50 uL de solução de nuclease foram misturados e a reação iniciada por transferência para um bloco pré-aquecido a 37ºC. Depois da iniciação, as reações foram incubadas a 37ºC e amostradas periodicamente pela transferência de 10 uL de solução de resfriamento ácida (90 ul de 0,2 M ácido sulfúrico) no gelo. Após a conclusão do curso do tempo, as amostras resfriadas foram clarificadas por centrifu- gação a 3.200 x g por 20 minutos a 2ºC. A despolimerização foi primeiro quantificada pela absorção de nucleotídeos solúveis em ácido em 260 nm. O agrupamento total de nucleotídeo (por exemplo, 100% de despo- limerização) foi determinado por hidrólise alcalina do RNA: 50 ul de RNA foi combinado com 150 ul de 0,2M hidróxido de potássio e, em seguida, aquecido a 99ºC por 20 minutos. As amostras foram hidrolisa- das-alcalina foram então resfriadas e analisadas conforme descrito acima. A despolimerização também foi quantificada pela análise LC-MS de 5', 2' e 3' NMPs: 10 ul de amostra foi resfriada em 30 uL de acetoni- trila a 100% e diluída em 500 ul de água deionizada contendo 10 uM ácido adípico usado como padrão interno. A amostra foi então centrifu- gada e passada através de um filtro de 0,2 um antes da análise LC-MS.

[0550] Análise de nucleotídeos

[0551] Análise de 2', 3' e 5' NMPs foi realizada por espectrometria de massa e cromatografia líquida usando um espectrômetro de massa

ABSCIEX API 5000 e um HPLC Agilent 1200 padrão equipado com co- luna de zinco-hilico Sequant (2,1 x 50 mm, 3 um i.d.). As fases móveis consistiram em 20 mM acetato de amônio em acetonitrila (A) a 90% e mM acetato de amônio em acetonitrila (B) a 10%. O método de se- paração consistiu dos seguintes: gradiente de partida de B a 6% seguido de um gradiente de B a 8,5% por mais de 600 segundos, um gradiente de B a 13% por mais de 400 segundos, seguido por um gradiente de B a 20% por mais de 60 segundos, uma lavagem em B a 50% por 60 segundos e, por fim, reequilíbrio em B a 6% por 220 segundos. A quan- tificação foi realizada de modo negativo de ionização por eletrospray (ESI) usando as seguintes transições de espec. de massa 2'3'5' AMP: 346,1 - 134,1, 2:3'5' UMP: 323,0 — 97, 2:3'5' CMP: 322 — 97, 23'5' GMP: 362,1 - 211 As áreas de pico foram comparadas com as curvas padrão consistindo de compostos purificados (adquiridos da Sigma-Aldrich, ex- ceto para 2' e 3! CMP, UMP e GMP que foram comprados de Biolog Life Science Institute) e normalizado a um padrão interno (ácido adípico) que foi fortificado para as amostras antes da análise. Para a análise de amostras, as curvas padrão foram preparadas em água deionizada, di- luídas com padrão interno e filtradas em etapas de preparação da amos- tra descritas aqui.

[0552] Resultados

[0553] O RNA de Natriegens V. foi digerido usando RNase R de E. coli purificada e extrato purificado de RNA de E. coli e de RNA derivado de levedura foram digeridos usando ambas as RNase R Nuclease P1 de E. coli. A despolimerização foi monitorada pela liberação de nucleo- tídeos solúveis em ácido. Tratamento de RNA de E. coli e V. natriegens com RNase R mostrou uma conversão dependente do tempo de RNA para nucleotídeos solúveis em ácido alcançando -98 a -100% de des- polimerização após 30 minutos de incubação (FIG. 12A). Tratamento do extrato de RNA derivado de levedura atingiu -94% de despolimerização com nuclease P1 (Fig. 12A). Além disso, o tratamento do RNA de E. coli com nuclease P1 resultou em -90% de despolimerização (FIG. 12A). Análises posteriores por LC-MS revelou a liberação de 5' NMPs em RNA de E. coli e extrato de RNA derivado de levedura tratados com nuclease P1 (Fig. 12B)

[0554] Esses resultados demonstram que diferentes fontes de RNA (por exemplo, RNA de Vibrio, RNA de E. coli e RNA de levedura) podem ser digeridas a 5' NMP usando diferentes nucleases (por exemplo, RNase R e Nuclease P1).

[0555] Exemplo 5 - Efeitos da temperatura e inativação do lisado na despolimerização do RNA

[0556] Materiais e métodos

[0557] Cepas e Lisados

[0558] Cepa GL17-086 (BL21(DE3).AtolC.Aph[DE3]1+2*.Aph[285p]*.AfhuA*.AlamB*. rna::tolC) e cepa GL17-109 (BL21(DE3). AtoIC.Aph[DE3]1+2*.Aph[285p]*.AfhuA* .AlamB*. Arna*. AphoA”*.AappA*.Aamn*.AnagD*.AushA::tolC) foram usados no estudo descrito aqui. Para ambas as cepas, 1L de culturas foram cultivadas sob condições de crescimento de lote em meio KORZ (5 g/L (NHa4)2SO34, 15,7 g/L K2HPOa, 4,2 g/L KH2PO2, 1,7 g/L de ácido cítrico, 0,6 g/L de MgSO:, tiamina-HCIl 0,1%, plurônico a 0,01%, traço de metais e 40 g/L de glicose) por aproximadamente 7 horas. Após o crescimento as células foram centrifugadas a 6000 g por 20 minutos e, em seguida, armazenadas a -80ºC. Biomassa congelada foi desconge- lada em 1,5X volumes de 58,8 mM solução de fosfato de potássio dibá- sico e lisado ao passar através de um homogeneizador EmulsiFlex C3 (Avestina) por 3 passagens, recirculação, com pulsos de 15000-20000 psi. O lisado foi clarificado por centrifugação a 15000g por 1 hora a 4ºC. O lisado foi, em seguida, armazenado a -80ºC em alíquotas de uso único.

[0559] Análise de produtos de polimerização de RNA em dife- rentes temperaturas

[0560] Os lisados congelados para ambas as cepas (086 e 109) fo- ram incubados em diferentes temperaturas para o perfil de produtos de despolimerização de RNA e seu potencial de degradação. Alíquotas de lisado foram descongeladas no gelo e, em seguida, dispensadas em tubos de fita de PCR. Em seguida os tubos foram incubados a 40ºC, 50ºC, 60ºC e 70ºC até uma hora com amostragem intermitente. O mo- mento inicial to foi tomado por resfriamento enquanto os lisados ainda estavam no gelo. Para todos os outros tempos, as amostras foram res- friadas em 5X volumes de acetonitrila com 60 ul diluído em 500 ul de uma solução de 50 uM de ácido adípico em 50 mM acetato de amônio e, em seguida, corridas em um LC-QQQ. Usando MRM, todos os quatro nucleotídeos principais e seus derivados associados (ATP, ADP, AMP, adenina, adenosina, GTP, GDP, GMP, guanina, guanosina, CTP, CDP, CMP, citidina, citosina, UTP, UDP, UMP, uridina e uracila) foram quan- tificados em cada ponto no tempo. A hidrólise de base de lisados, onde o RNA é totalmente hidrolisado para NMP's, foi realizada por incubação do lisado em 3X volume de 0,2M NaOH a 99ºC por 20 minutos. Ela foi então neutralizada com um volume igual de 150 mM HCl e 20 ul desta solução foi diluído em 200 ul de uma solução de 50 mM acetato de amô- nio com 50 uM ácido adípico. Os valores do lisado hidrolisado base re- presentam 100% de despolimerização. Sob algumas condições, estes lisados foram incubados como estão e em outras condições os lisados foram misturados com 0,5 mg/ml! nuclease P1 (Sigma N8630) ou RNase R. RNase R foi preparada como se segue: as células foram ressuspen- sas em 1,5X volumes de tampão de lise (50 mM fosfato de potássio, pH = 7,4, 500 MM NaCl, 20 mM imidazol), lisadas em um homogeneizador EmulsiFlex C3 (Avestina) por três passagens em 15000-25000 psi, cla- rificadas durante uma hora a 16000 g, 4ºC. O sobrenadante foi então purificado por FPLC, então dialisado durante a noite em 2X PBS. Prote- ínas precipitadas pós-diálise foram recuperadas pela adição de 500 mM NaCl, misturadas com glicerol para produzir uma solução de glicerol a 50% para fazer alíquotas e armazenar a -20ºC.

[0561] Análise dos efeitos de diluição e efeitos de morte pré- aquecimento na despolimerização de RNA

[0562] Os experimentos foram realizados com o lisado de GL17- 109, preparados conforme descrito aqui. Os lisados foram preparados sob uma ampla gama de condições. Comum em todas as condições, as reações receberam um fosfato de potássio 150 mM adicionado (pH = 7,4), 100 MM KCl e 0,1 MM ZnCl>2, e todas as condições a seguir foram testadas com RNase R, Nuclease P1, ou nenhuma nuclease exógena adicionada. Ambas as soluções de estoque da nuclease foram feitas como descrito anteriormente. As reações de despolimerização foram re- alizadas em 80% e 50% de diluições de lisado na água. Estas foram avaliados com 0,5 ou 0,31 mg/ml, respectivamente, de nuclease exó- gena fortificadas. Misturas de lisado também foram preparadas fazendo um lisado de nuclease de 1 mg/ml e misturando-o em um lisado sem fortificação rendendo 0,064 e 0,04 mg/ml de nuclease em condições de diluição a 80%, ou 0,04 e 0,025 mg/ml de nuclease em condições de diluição de 50%. Por último, as condições foram testadas onde lisados que não continham nuclease adicionada foram mortos pelo calor a 70ºC por 15 minutos e, em seguida, misturados com nuclease purificada ou o lisado de nuclease ainda ativa de 1 mg/ml. As amostras foram incuba- das a 37ºC por 30 minutos e amostradas através de resfriamento em 5X volumes de acetonitrila, e diluindo em 1 ml! de uma solução de 50 uM de ácido adípico em 50 mM de acetato de amônio. A solução resfriada foi, em seguida, girada para baixo, filtrada através de uma placa de filtro de 0,2 um, e o filtrado foi corrido em um LC-QQQ para medir NMPs, nu- cleosídeos e nucleobases.

[0563] Resultados

[0564] RNA nucleases (RNases) são conhecidas por terem perfis de atividade, que abrangem os perfis de temperatura de forma mais ampla do que muitas outras enzimas provenientes de fontes de mesófilos, oca- sionalmente mostrando atividade até 60ºC, apesar de originar de um organismo evoluiu para crescer a 37ºC. Para avaliar o impacto de tem- peraturas elevadas na despolimerização de RNA em um lisado de E. coli, dois estudos separados foram conduzidos. Primeiro, os lisados de duas cepas separadas foram incubados em temperaturas superiores a 37ºC ao longo de uma hora, com ou sem a adição de uma das duas Rnases - RNase R ou RNase P1. O segundo estudo envolveu a elimi- nação de um lisado para remover atividades enzimáticas deletérias e mistura deste lisado inativo com um lisado ativo para estudar os poten- ciais impactos na despolimerização do RNA ou a mistura de nucleases exógenas no lisado inativado.

[0565] A despolimerização melhorada foi observada quando os lisa- dos foram incubados a 60ºC e 70ºC (FIG. 13). A despolimerização foi melhorada de várias formas. Quando o RNA despolimeriza, ele produz predominantemente NMPs. Em um lisado ativo, no entanto, esses NMP's continuam a ser degradados por outras enzimas, com um grande acúmulo de dois produtos principais - guanosina e uracila. Incubando os lisados a 60ºC e 70ºC diminuiu significativamente o acúmulo dessas nu- cleobases, mesmo nos lisados que não receberam RNase R ou Nu- clease P1 (Fig. 13). Como cada mol de nucleobase corresponde a uma perda irreversível dos NMPs de RNA, isto demonstrou melhora na esta- bilidade de NMP em lisados. Além disso, quando a nuclease exógena é adicionada nestas condições de temperatura, melhoria dramática na acumulação líquida de NMP é vista, como mostrado na Fig. 13 a 70ºC, com RNase R adicionada. Hidrólise de base do lisado GL17-109 mos-

trou uma concentração máxima de 32,6 mM NMPs. Corrigindo para di- luição da nuclease adicionada, o acúmulo de -22 mM NMPs visto a 70ºC, com RNase R é um rendimento de 75%. Assumindo que o tRNA representa cerca de 15% do pool de RNA total e que é inacessível para estas nucleases, isso representaria um rendimento de 94% de todos RNAs acessíveis. A despolimerização em GL17-086 foi menos satisfa- tória através da placa do que GL17-109, provavelmente devido à maior atividade fosforilítica (dados não mostrados).

[0566] Os impactos da morte pré-aquecimento e diluições de lisado mostraram uma pequena vantagem, mas somente sob um lisado diluído mais pesadamente. Neste estudo, dois tipos de lisados foram feitos - um lisado "reagente", que contém o RNA a ser despolimerizado, e o lisado "catalisador", contendo nuclease exógena (RNase R ou nuclease P1). Muitas condições diferentes foram avaliadas, conforme mostrado na Tabela 14 abaixo, para determinar o seu impacto na despolimeriza- ção do RNA. Os lisados que foram diluídos para apenas 80% apresen- taram desempenho semelhante de despolimerização, independente- mente se porções do lisado foram mortas pelo calor ou não. No entanto, os lisados que foram diluídos para 50% mostraram desempenho um pouco melhor quando uma grande porção do RNA estava em um lisado inativado. Em todas as condições testadas para esta diluição, uma me- lhoria do rendimento médio de despolimerização de 2,7% foi observada. O desempenho da reação de despolimerização sob estas condições não mostra uma melhora dramática, mas ao desempenhar de forma equivalente ou apenas um pouco melhor, isso não deixar a possibilidade aberta para a execução de uma morte térmica pré-despolimerização se outras partes do processo exigir, por exemplo, deter o crescimento de qualquer célula não lisada que possa permanecer na cultura ou reduzir o teor de proteína do lisado se uma etapa de granulação for incluída após tratamento térmico.

Tabela 14. Resumo de rendimentos de despolimerização de RNA através de diferentes misturas de lisados, nucleases e lisados inativados. Porcentagem dos rendimentos são baseadas em uma base de 32,6 mM NMPs, como quantificados através de hidrólise de base do lisado de RNA. Sem morte preaquecimento Morte preaquecimento Reação % Despol. % Despol. % Despol. % Despol. Rendimento Produtivi- Rendimento Produtivi- (RNase R) dade (Nu- (RNase R) dade (Nu- clease P;) clease P;) 80% lisado de fundo + 0,5 mg/ml Nu- 26 40 27 40 clease 72% lisado de fundo + 8% de 1 mg/mL li- 26 33 22 30 sado nuclease (0,064 mg/mL nuclease fi- nal) 75% lisado de fundo + 5% de 1 mg/mL li- 29 31 24 29 sado nuclease (0,04 mg/mL nuclease final) 80% lisado de fundo - sem nuclease con- 18 23 10 10 trole 50% lisado de fundo + 0,31 mg/ml Nu- 41 49 44 56 clease 46% lisado de fundo + 4% de 1 mg/mL li- 33 41 40 36 sado nuclease (0,04 mg/mL nuclease final) 47,5% lisado de fundo + 2,5% de 1 mg/ml 27 37 27 41 lisado nuclease (0,025 mg/mL nuclease fi- nal) 50% lisado de fundo - sem nuclease con- 20 34 10 12 trole

[0567] Exemplo 6: Produção livre de célula de RNA usando vá- rias fontes de nucleotídeo

[0568] Materiais e métodos

[0569] RNA de levedura em pó obtido a partir de fontes comerciais foi dissolvido em água a 45-60 g/L e despolimerizado usando 1,2 g/L P1 nuclease a 70ºC, pH 5,5-5,8 por 1 hora na presença de 0,05 mM de cloreto de zinco. O material resultante da despolimerização foi clarifi- cado por centrifugação e filtrado através de um filtro MWVCO de 10 kDa. O fluxo resultante continha 5' nucleotídeos monofosfatos (NMPs) em uma concentração total de -— 90 - 100 mM (- 20 - 25 mM cada AMP, CMP, GMP e UMP).

[0570] Os derivados de E. coli BL21(DE3) carregando os vetores derivados de pBAD24 codificando as enzimas quinases individuais (Tthemk, PfPyrH, TnGmk, AaNdk e DA9PPK22) foram cultivados em fer- mentações com meio Korz suplementado com 50 mg/L de carbenicilina usando as técnicas padrão [Korz, D. J., Rinas, U., Hellmuth, K., San- ders, E. A., & Deckwer, W. D. (1995). Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli. Journal of biotechnology, 39(1), 59-65.]. A expressão da proteína foi induzida pela adição de L- arabinose. Após a colheita, os lisados foram preparados em tampão de fosfato 60 MM com homogeneização a alta pressão, resultando em mis- turas de cerca de 40 g/L de proteína total.

[0571] Os derivados de E. coli BL21(DE3) carregando os vetores derivados puUC19 contendo um ou mais modelos transcricionais (cada um consistindo em um promotor T7, sequência alvo, e um ou mais ter- minais transcricional) codificando uma sequência de RNA de fita dupla de 524bp. As células foram cultivadas em fermentações em meio Korz usando as técnicas padrão [Phue, J. N., Lee, S. J., Trinh, L., & Shiloach, J. (2008). Modified Escherichia coli B (BL21), a superior producer of plasmid DNA compared with Escherichia coli K (DH5alpha). Biotechno- logy and bioengineering, 101(4), 831.]. Após a colheita, os lisados foram criados por homogeneização a alta pressão, diluídos, e tratados termi- camente após procedimentos semelhantes.

[0572] Os derivados de E. coli BL21(DE3) carregados por vetores derivados de pBAD24 codificando enzimas RNA polimerase T7 ter- moestáveis foram cultivadas, a expressão da enzima foi induzida, e os lisados foram preparados usando procedimentos semelhantes. As enzi- mas polimerase foram parcialmente purificadas usando duas etapas de fracionamento de sulfato de amônio.

[0573] As reações foram montadas em 30 mM de tampão fosfato, pH 7, de acordo com a Tabela 15. Tabela 15. Condições de reação

[0574] Na montagem de reações livres de célula, os lisados con- tendo enzimas quinases e DNA do modelo foram diluídos, combinados em igual proporção, e misturados com aditivos de reação, como o sul- fato de magnésio e hexametafosfato de sódio. Os lisados foram incuba- dos a 70ºC por 15 minutos para inativar outras atividades enzimáticas e, ao mesmo tempo, preservar as atividades das quinases superexpres- sadas. As reações livres de células foram iniciadas pela adição de RNA polimerase, incubadas a 48ºC por 1 hora, e analisadas de acordo com protocolos estabelecidos [Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical biochemistry, 512, 36].

[0575] Resultados

[0576] As reações de síntese de RNA livres de células foram reali- zadas usando RNA celular, uma mistura equimolar de nucleosídeos 5'- monofosfatos (AMP, CMP, GMP, UMP), ou uma mistura equimolar de 5' nucleosídeo difosfatos (ADP, CDP, GDP, UDP). Titulações semelhan- tes do produto de dsRNA foram produzidas para cada fonte de nucleo- tídeo (FIG. 17).

[0577] Esses resultados demonstram que as reações livres de cé- lula descritas aqui podem ser usadas para a síntese de RNA a partir de várias fontes de nucleotídeos incluindo RNA celular, nucleosídeo 5'-mo- nofosfatos e nucleosídeo difosfatos.

[0578] Exemplo 7: Produção livre de células de RNA usando RNA polimerase do tipo selvagem

[0579] Materiais e métodos

[0580] Os derivados de E. coli BL21(DE3) carregados por vetores derivados de pBAD24 codificando enzimas RNA polimerase T7 ter- moestáveis marcadas por hexahistidina ou do tipo selvagem foram cul-

tivadas, a expressão da enzima foi induzida, e os lisados foram prepa- rados usando procedimentos descritos aqui. Enzimas polimerase foram purificadas por cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), con- forme descrito aqui. As reações livres de células foram realizadas con- forme descrito aqui, exceto que as reações foram realizadas em uma gama de temperaturas (37 - 48ºC) por 2 horas. As titulações do produto de dsRNA foram quantificadas conforme descrito aqui.

[0581] Resultados

[0582] As reações de síntese de RNA livres de células foram reali- zadas usando RNA polimerase T7 do tipo selvagem ou um mutante ter- moestável (FIG. 18). Reações realizadas com o mutante termoestável produziram o produto dsRNA a 37ºC e 48ºC. Em contraste, as reações realizadas com a polimerase do tipo selvagem produziram o produto a 37ºC, mas não a 48ºC.

[0583] Esses resultados demonstram que as reações livres de cé- lula descritas aqui não requerem RNA polimerases termoestáveis desde que sejam incubadas a temperaturas adequadas.

[0584] Exemplo 8: Produção livre de célula de NTPs usando vá- rias fontes de nucleotídeo

[0585] Materiais e métodos

[0586] As reações livres de células foram realizadas como descrito no Exemplo 6, exceto que o lisado do DNA do modelo e RNA polimerase foram omitidos. Nucleotídeos foram analisados por HPLC usando uma adaptação de métodos publicados [de Korte, D., Haverkort, W. A., Roos, D., & van Gennip, A. H. (1985). Anion-exchange high performance liquid chromatography method for the quantitation of nucleotides in human blood cells. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemis- try, 148(3), 185.]

[0587] Resultados

[0588] As reações livres de células para produzir nucleotídeos 5'-

trifosfatos (NTPs: ATP, CTP, GTP e UTP) foram realizadas usando RNA celular, uma mistura equimolar de nucleosídeos 5'- monofosfatos (AMP, CMP, GMP, UMP), ou uma mistura equimolar de 5' nucleosídeo difos- fatos (ADP, CDP, GDP, UDP). Titulações semelhantes de cada NTP fo- ram produzidas para cada fonte de nucleotídeo (FIG. 19).

[0589] Esses resultados demonstram que as reações livres de cé- lula descritas aqui também podem ser usadas para produzir NTPs sim- plesmente omitindo o RNA polimerase e modelo de DNA. Da mesma forma que as reações livres de célula produzindo RNA descrita no Exemplo 6, as reações livres de células produzindo NTPs podem usar múltiplas fontes de nucleotídeos, incluindo RNA celular, nucleosídeo 5'- monofosfatos e nucleosídeo difosfatos.

[0590] Referências

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42. Polosina, Y. Y., Zamyatkin, D. F., Kostyukova, A. S., Filimonov, V.

V., & Fedorov, O. V. (2002). Stability of Natrialba magadii NDP kinase: comparisons with other halophilic proteins. Extremophiles: life under ex- treme conditions, 6(2), 135.

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[0591] Sequências

[0592] Deinococcus geothermalis DSM 11300 PPK2

[0593] MQLDRYRVPPGORVRLSNWPTDDDGGLSKAEGEALLP- DLQOQRLANLQERLYAESQQAL-

LIVLOARDAGGKDGTVKHVIGAFNPSGVQVSNFKVPTEEERAHDFLW RIHRQTPRLGMIGVFNRSQYEDVLVTRVHHLIDDOQTAQRRLKHICA- FESLLTDSGTRIVK-

FYLHISPEEQKKRLEARLADPSKHWKFNPGDLQERAHWDAYTAVYE DVLTTSTPAAPWYVVPADRKWFRNLLVSQILVATLEEMNPQFPAPA- FNAADLRIV (SEQ ID NO: 1)

[0594] Meiothermus ruber DM 1279 PPK2

[0595] MGFCSIEFLMGAQMKKYRVQPDGRFELKRFDPDDTSA- FEGGKQAALEALAVLNRR-

LEKLQELLYAEGQHKVLVVLOAMDAGGKDGTIRVVFDGVNPSGVRV ASFGVPTEQELARDYLWRVHQQVPRKGELVIFNRS- HYEDVLVVRVKNLVY-

PQQVWAKRYRHIREFERMLADEGTTILKFFLHISKDEQRQRLQERLD NPEKRWKFRMGDLEDRRLWDRYQEAYEAAIRETSTEYAPWYVI- PANKNWYRNWLVSHILVETLEGLAMQYPQPETASEKIVIE (SEQ ID NO: 2)

[0596] Meiothermus silvanus DSM 9946 PPK2

[0597] MAKTIGATLNLQDIDPRSTPGFNGDKEKALALLEKLTARL- DELQEQLYAEHQHRVLVILOG-

MDTSGKDGTIRHVFKNVDPLGVRVVAFKAPTPPELERDYLWRVHQH VPANGELVIFNRSHYEDVLVARVHNLVPPAIWSRRYDHINAFEKMLVY- DEGTTVLKFFLHIS-

KEEQKKRLLERLVEADKHWKFDPQDLVERGYWEDYMEAYQDVLDK THTQYAPWHVIPADRKWYRNLQVSRLLVEALEGLRMKYPRPKLNI- PRLKSELEKM (SEQ |D NO: 3)

[0598] Thermosynechococcus elongatus BP-1 PPK2

[0599] MIPQDFLDEINPDRYIVPAGGNFHWKDYDPGDTA- GLKSKVEAQELLAAGI|IK-

KLAAYQDVLYAQNIYGLLIIFOAMDAAGKDSTIKHVMSGLNPQACRVY SFKAPSAEELDHDFLWRANRALPERGCIGIFNRSYYEEVLVVRVHP- DLLNRQQLPPETKT-

KHIWKERFEDINHYERYLTRNGILILKFFLHISKAEQKKRFLERISRPEK NWKFSIEDVRDRAHWDDYQQAYADVFRHTSTKWAPWHIIPA- NHKWFARLMVAHFIYQKLAS- LNLHYPMLSEAHREQLLEAKALLENEPDED (SEQ ID NO: 4)

[0600] Anaerolinea thermophila UNI-1 PPK2

[0601] MGEAMERYFIKPGEKVRLKDWSPDPPKDFEGDKESTRA- AVAELNRKLEVLQERLYAER-

KHKVLVILAGMDTSGKDGVIRSVFEGVNPQGVKVANFKVPTQEELDH DYLWRVHKVVPGKGEIVIFNRSHYEDVLVVRVHNLVPPEVWK- KRYEQINQFERLLHETGT-

TILKFFLFISREEQKQRLLERLADPAKHWKFNPGDLKERALWEEYEKA YEDVLSRTSTEYAPWILVPADKKWYRDWVISRVLVETLEGLEIQL- PPPLADAETYRRQLLEEDAPESR (SEQ ID NO: 5)

[0602] Caldilinea aerophila DSM 14535 PPK2

[0603] MDVDRYRVPPGSTIHLSQWPPDDRSLYEGDKKQGKQDL-

SALNRRLETLQELLYAE- GKHKVLIILOGMDTSGKDGVIRHVFNGVNPQGVKVASFKVPTAVELA HDFLWRIHRQTPGSGEIVIFNRSHYEDVLVVRVHGLVPPEVWAR- RYEHINAFEKLLVDEGT-

TILKFFLHISKEEQRQRLLERLEMPEKRWKFSVGDLAERKRWDEYMA AYEAVLSKTSTEYAPWYIVPSDRKWYRNLVISHVIINALEGLNM- RYPQPEDIAFDTIVIE (SEQ ID NO: 6)

[0604] Chlorobaculum tepidum TLS PPK2

[0605] MKLDLDAFRIQPGKKPNLAKRPTRIDPVYRSKGEYHEL- LANHVAELSKLQNVLYADNRYAIL-

LIFOAMDAAGKDSAIKHVMSGVNPQGCQVYSFKHPSATELEHDFLW RTNCVLPERGRIGIFNRSYYEEVLVVRVHPEILEMOQNIPHN- LAHNGKVWDHRYRSIVSHE-

QHLHCONGTRIVKFYLHLSKEEQRKRFLERIDDPNKNWKFSTADLEER KFWDQYMEAYESCLQETSTKDSPWFAVPADDKKNARLIVSRI- VLDTLESLNLKYPEPSPERRKELLDIRKRLENPENGK (SEQ ID NO: 7)

[0606] Oceanithermus profundus DSM 14977 PPK2

[0607] MDVSRYRVPPGSGFDPEAWPTREDDDFAGGKKEAKKE- LARLAVRLGELQARLYAEGROQAL-

LIVLAGMDTAGKDGTIRHVFRAVNPQGVRVTSFKKPTALELAHDYLW RVHRHAPARGEIGIFNRSHYEDVLVVRVHELVPPEVWGRRYDHINA- FERLLADEGTRIVK-

FFLHISKDEQKRRLEARLENPRKHWKFNPADLSERARWGDYAAAYA EALSRTSSDRAPWYAVPADRKWQRNRIVAQVLVDALEAMD- PRFPRVDFDPASVRVE (SEQ ID NO: 8)

[0608] Roseiflexus castenholzii DSM 13941 PPK2

[0609] MYAQRVVPGMRVRLHDIDPDANGGLNKDEGRARFA- ELNAELDVMQEELYAAGIHALLLILOG-

MDTAGKDGAIRNVMLNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHRV VPRKGMVGVFNRSHYEDVLVVRVHSLVPESVWRARYDOQINAFERL- LADTGTIIVKCFLHIS-

KEEQEQRLLARERDVSKAWKLSAGDWRERAFWDDYMAAYEEALTR CSTDYAPWYIIPANRKWYRDLAISEALVETLRPYRDDWRRALDAMS- RARRAELEAFRAE QHAMEGRPQGAGGVSRR (SEQ ID NO: 9)

[0610] Roseiflexus sp. R8-1 PPK2

[0611] MHYAHTVIPGTQVRLRDIDPDASGGLTKDEGRERFAS- FNATL-

DAMQEELYAAGVHALLLILOGMDTAGKDGAIRNVMHNLNPQGCRVE SFKVPTEEELAHDFLWRVHKVVPRKGMVGVFNRS- HYEDVLVVRVHSLVPEHVWRARYDOQINA-

FERLLTDTGTIIVKCFLHISKDEQEKRLLAREQDVTKAWKLSAGDWRE RERWDEYMAAYEEALTRCSTEYAPWYIIPANRKWYRDLAISEVL- VETLRPYRDDWQRALDAMSQARLAELKAFRHQQTAGATRL (SEQ ID NO: 10)

[0612] Truepera radiovictrix DSM 17093 PPK2

[0613] MSQGSAKGLGKLDKKVYARELALLQLE- LVKLAGWIKAQGLKVVVLFEGRDAAGKGSTITRIT-

QPLNPRVCRVVALGAPTERERTQWYFQRYVHHLPAAGEMVLFDRS WYNRAGVERVMGFCTEAEYREFLHACPTFERLLLDAGII- LIKYWFSVSAAEQERRMRRRNEN-

PAKRWKLSPMDLEARARWVAYSKAKDAMFYHTDTKASPWYVVNAE DKRRAHLSCIAHLLSLIPYEDLTPPPLEMPPRDLAGADEGYERPD- KAHQTWVPDYVPPTR (SEQ ID NO: 11)

[0614] Thermus thermophilus Adk

[0615] MDVGQAVIFLGPPGAGKGTQASRLAQELGFKKLSTGDIL- RDHVARGTPLGERVRPIMER-

GDLVPDDLILELIREELAERVIFDGFPRTLAQAEALDRLLSETGTRLLG VVLVEVPEEELVRRILRRAELEGRSDDNEETVRRRLEVYREKTE- PLVGYYEARGVLKRVDGLGTPDEVYARIRAALGI (SEQ ID NO: 12)

[0616] Thermus thermophilus Cmk

[0617] MRGIVTIDGPSASGKSSVARRVAAALGV- PYLSSGLLYRAAAFLALRAGVDPGDEEGLLALLE-

GLGVRLLAQAEGNRVLADGEDLTSFLHTPEVDRVVSAVARLPGVRA WVNRRLKEVPPPFVAEGRDMGTAVFPEAAHKFYLTASPEVRAWR- RARERPQAYEEVLRDLL- RRDERDKAQSAPAPDALVLDTGGMTLDEVVAWVLAHIRR (SEQ ID NO: 13)

[0618] Pyrococcus furiosus PyrH

[0619] MRIVFDIGGSVLVPENPDIDFIKEIAYQLTKVSEDHE- VAVVVGGGKLARKYIEVAEKFNS-

SETFKDFIGIQITRANAMLLIAALREKAYPVVVEDFWEAWKAVOQLKKIP VMGGTHPGHTTDAVAALLAEFLKADLLVVITNVDGVYTADPKKDP- TAKKIKKMKPEELLEI]-

VGKGIEKAGSSSVIDPLAAKIIARSGIKTIVIGKEDAKDLFRVIKGDHNG TTIEP (SEQ ID NO: 14)

[0620] Thermotoga maritima Gmk

[0621] MKGQLFVICGPSGAGKTSIIKEVLKRLDNVVFSVSCT- TRPKRPHEEDGKDYFFITEEE-

FLKRVERGEFLEWARVHGHLYGTLRSFVESHINEGKDVVLDIDVQGA LSVKKKYSNTVFIYVAPPSYADLRERILKRGTEKEADVLVRLE- NAKWELMFMDE-

FDYIVVNENLEDAVEMVVSIVRSERAKVTRNQDKIERFKMEVKGWKK L (SEQ ID NO: 15)

[0622] Aquifex aeolicus Ndk

[0623] MAVERTLIIVKPDAMEKGALGKILDRFIQEGFQIKALKM- FRFTPEKAGEFYY-

VHRERPFFQELVEFMSSGPVVAAVLEGEDAIKRVREIIGPTDSEEARK VAPNSIRAQFGTDKGKNAIHASDSPESAQYEICFIFSGLEIV (SEQ ID NO: 16)

[0624] Todas as referências, patentes e pedidos de patente revela- dos aqui são incorporados por referência em relação ao assunto para o qual cada um é citado, o que, em alguns casos, pode abranger a totali- dade do documento.

[0625] O artigo indefinido "o/a" e "um/uma", como usado aqui na es- pecificação e nas reivindicações, a menos que claramente indicado ao contrário, deve ser entendido no sentido de "pelo menos um".

[0626] Ele também deve ser entendido que, a menos que clara- mente indicado ao contrário, em todos os métodos reivindicados aqui que incluem mais de uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou atos do método não se limita necessariamente a ordem em que as etapas ou atos do método são recitados.

[0627] Nas reivindicações, bem como na especificação acima, todas as frases de transição como "compreendendo", "incluindo", "realizando", "tendo", "contendo", "envolvendo", "mantendo", "composto de", e simi- lares devem ser entendidos para ser abertos, ou seja, para significar, mas se limitar. Apenas as frases de transição "consistindo em" e "con- siste essencialmente em" devem ser frases de transição fechadas ou semifechadas, respectivamente, conforme estabelecido no Manual de Patentes dos Estados Unidos de Procedimentos de Exame de Patentes, seção 2111.03.

[0628] Os termos "cerca de" e "substancialmente" precedendo um valor numérico significa +10% do valor numérico recitado.

[0629] Quando uma faixa de valores é fornecida, cada valor entre as extremidades superior e inferior da faixa é especificamente contem- plado e descrito neste documento.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção de nucleosídeos trifosfatos (NTPs), caracterizado pelo fato de que compreende: incubar em uma mistura de reação os nucleosídeos di- fosfatos (NDPs), um polifosfato quinase, e polifosfato sob condições adequadas para a produção de NTPs, opcionalmente, onde a mistura de reação inclui ainda NDP quinase(s).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, adicionalmente: incubar em uma mistura de reação 5' nucleosídeos mo- nofosfatos (5' NMPs), um polifosfato quinase, e polifosfato sob condi- ções adequadas para a produção do NDP's, opcionalmente, onde a mis- tura de reação inclui ainda NMP quinase(s).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende adicionalmente: incubar em uma mistura de reação o ácido ribonucleico (RNA) celular e (a) uma fosforilase polinucleotídica (PNPase) e fosfato inor- gânico, em condições adequadas para a produção de 5' NDP's, opcio- nalmente, onde a mistura de reação inclui ainda uma helicase; ou (b) uma ribonuclease, sob condições adequadas para a produção de 5' NMPs.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende: incubar em uma mistura de reação os NTPs, um mo- delo de DNA codificando um RNA de interesse e uma RNA polimerase em condições adequadas para a produção do RNA de interesse.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os NDPs compreendem ADP, GDP, CDP e/ou UDP.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a5, caracterizado pelo fato de que os NDPs são quimicamente sinte- tizados, um produto de fermentação, ou extraídos de uma fonte natural.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que os 5' NMPs compreendem 5' AMP, 5' GMP, 5' CMP e/ou 5' UMP.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que os 5' NMPs são quimicamente sintetizados, um produto de fermentação, ou extraídos de uma fonte na- tural.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a8, caracterizado pelo fato de que o polifosfato quinase é selecionado a partir de enzimas da família PPK1 ou PPK2, opcionalmente, onde o polifosfato quinase (PPK) compreende uma PPK?2 classe Ill a partir de Deinococcus geothermalis (SEQ ID NO: 1).

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a9, caracterizado pelo fato de que o polifosfato compreende o hexa- metafosfato.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que: (a) o polifosfato quinase, o(s) NMP quinase, o(s) NDP qui- nase, o PNPase, a ribonuclease, o modelo de DNA e/ou o RNA polime- rase são preparados a partir de células que expressam ou produzem o polifosfato quinase, o(s) NMP quinase, o(s) NDP quinase, o PNPase, a ribonuclease, o modelo de DNA e/ou RNA polimerase; ou (b) a mistura de reação compreende um lisado celular ou uma preparação enzimática de células que expressam ou produzem o polifosfato quinase, o(s) NMP quinase, o NDP quinase, a PNPase, a ribonuclease, o modelo de DNA e/ou o RNA polimerase, opcionalmente onde a atividade enzimática nativa das enzimas no lisado celular foi eli- minada e, opcionalmente, onde a atividade enzimática nativa das enzi- mas no lisado celular foi eliminada através da modificação genética, se- creção enzimática de uma célula, direcionamento da protease, tempe- ratura, pH, sal, detergente, álcool, inibidores químicos, separação, pre- cipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidoreductases e hidro- lases.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o polifosfato quinase, o(s) NMP quinase e/ou o(s) NDP quinase podem suportar condições de elimina- ção.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 13, caracterizado pelo fato de que o RNA celular compreende RNA ribossômico, RNA mensageiro e/ou RNA de transferência e, opcional- mente, onde o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um or- ganismo multicelular.

15. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), caracterizado pelo fato de incluir: (a) incubação de uma mistura de reação o RNA celular e uma ribonuclease (RNase), sob condições adequadas para a produção de 5' nucleosídeos monofosfatos (NMPs); (b) eliminação da RNase; e (c) incubação da mistura de reação, ou em uma segunda mistura reação, os NMPs, um polifosfato quinase, polifosfato, um mo- delo de ácido desoxirribonucleico (DNA) codificando um RNA de inte- resse, e uma RNA polimerase sob condições adequadas para a produ- ção do RNA de interesse, opcionalmente, onde a mistura de reação da etapa (c) compreende ainda NMP quinase(s) e/ou NDP quinase(s).

16. Método para a produção de ácido ribonucleico (RNA), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) incubar em uma mistura de reação o RNA celular, uma fosforilase polinucleotídica (PNPase) e o fosfato inorgânico, sob condi- ções adequadas para a produção de 5' nucleosídeos difosfatos (NDPs), opcionalmente, onde a mistura de reação compreende ainda uma heli- case; (b) eliminar a PNPase; e (c) incubar a mistura de reação, ou em uma segunda mistura reação, os NDPs, um polifosfato quinase, polifosfato, um modelo de ácido desoxirribonucléico (DNA) codificando um RNA de interesse, e uma RNA polimerase sob condições adequadas para a produção do RNA de interesse, opcionalmente, onde a mistura de reação da etapa (c) compreende ainda NDP quinase(s).

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a Rnase é Nuclease P1 ou RNase R.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac- terizado pelo fato de que o RNA celular compreende RNA ribossômico, RNA mensageiro e/ou RNA de transferência, opcionalmente, onde o RNA celular é de um organismo unicelular ou de um organismo multice- lular.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 18, caracterizado pelo fato de que o polifosfato quinase é selecio- nado a partir de enzimas da família PPK1 ou PPK2 e, opcionalmente, onde o polifosfato quinase (PPK) compreende uma PPK?2 classe Ill a partir de Deinococcus geothermalis (SEQ ID NO: 1).

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o polifosfato compreende o he- xametafosfato.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 20, caracterizado pelo fato de que a RNase ou PNPase é prepa- rada a partir de células que expressam a RNase ou PNPase, ou onde a mistura de reação de (a) compreende um lisado celular ou preparação enzimática preparada a partir de células que expressam a RNase ou PNPase.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende a elimi- nação da RNase ou PNPase através de temperatura, pH, sal, deter- gente, álcool, inibidores químicos, separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que o polifosfato quinase, o(s) NMP quinase, o(s) NDP quinase, o modelo de DNA e/ou RNA polimerase são preparados a partir de células que expressam ou produzem o polifosfato quinase, NMP quinase(s), NDP quinase(s), o modelo de DNA e/ou RNA polimerase, ou em que a mistura de reação da etapa (a) ou etapa (c) compreende um lisado celular ou preparação enzimática preparada a partir de células que expressam ou produzem o polifosfato quinase, o(s) NMP quinase, o(s) NDP quinase, o modelo de DNA e/ou RNA polime- rase.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a atividade enzimática nativa das enzimas no lisado celular ou preparação enzimática foram elimina- das e, opcionalmente, onde a atividade enzimática nativa das enzimas no lisado celular ou preparação enzimática foram eliminadas através da modificação genética, secreção da enzima a partir de uma célula, pro- tease-alvo, temperatura, pH, sal, detergente, álcool, inibidores quími- cos, separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas de fosfatases, nucleases, proteases, deaminases, oxidorreductases e hi- drolases.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 22, caracterizado pelo fato de que o polifosfato quinase, o(s) NMP quinase, o(s) NDP quinase, e/ou RNA polimerase podem suportar con- dições de eliminação.