WO2019065876A1 - ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法およびその方法に用いる形質転換体 - Google Patents

ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法およびその方法に用いる形質転換体 Download PDF

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    • C12Y305/01042—Nicotinamide-nucleotide amidase (3.5.1.42)
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    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01015—Ribokinase (2.7.1.15)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid compound such as nicotinamide mononucleotide.
  • Nicotinamide mononucleotide is a synthetic intermediate of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +).
  • NAD + nicotinamide adenine dinucleotide
  • NMN controls the activity of the longevity gene "Sirtuin” through conversion to NAD +, and that administration of NMN to mice exhibits anti-aging action.
  • NMN is effective in preventing diseases and improving symptoms of diseases such as diabetes, Alzheimer's disease, and heart failure.
  • Such NMNs are expected to be used as components of functional foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like, and research and development of efficient manufacturing methods are being promoted with the aim of improving productivity.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing NMN in which cells (yeast, bacteria, etc.) overexpressing nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) are isolated, and the cells are cultured in the presence of nicotinamide (NAM). It has been described (claims 1, 13, 15 etc.). Nampt is an enzyme that produces NMN from NAM and phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) that is biosynthesized in cells. Patent Document 1 also describes overexpressing phosphoribosyl pyrophosphate synthase (Prs) in the cells to promote the biosynthesis of PRPP (Claim 3 and the like).
  • Prs phosphoribosyl pyrophosphate synthase
  • Prs is an enzyme that produces PRPP and AMP from ribose-5-phosphate (R5P) and ATP.
  • a target compound such as NMN is produced by an enzyme reaction in a living body while culturing in a medium containing a carbon source, a nitrogen source and the like in a state where cells overexpressing a specific enzyme are used. There is.
  • Patent Document 2 a Prs mutant having reduced sensitivity to a reaction product (that is, capable of increasing the supply amount of PRPP into the system because it is less susceptible to negative feedback by PRPP generated by Prs)
  • a synthetic system of an NAD precursor is described (claim 1, paragraph 0068, etc.). It is also described that this Prs mutant may be recombinantly produced, isolated and purified (claim 6 etc.).
  • Patent Document 2 also describes that the system may further include Nampt, ATP, R5P, and PRPP (claims 10, 20, 21, 23, etc.).
  • Non-Patent Document 1 uses three enzymes: ribokinase (Rbk, which is described as RK in the relevant literature), Prs (also described as PPS) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase (8B3).
  • Rbk ribokinase
  • Prs also described as PPS
  • hypoxanthine phosphoribosyltransferase 8B3
  • Rbk is involved in the reaction (i) to generate R5P and ADP from ribose and ATP
  • Prs is involved in the reaction (ii) to generate PRPP and AMP from R5P and ATP
  • 8B3 is (iii) PRPP and inosine It participates in the reaction of producing IMP and pyrophosphate (PPi) from acid.
  • ADP is regenerated from AMP produced in reaction (ii) by adenylate kinase.
  • phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase regenerate ATP from the regenerated ADP and ADP generated in reaction (i).
  • Patent Document 3 describes a method for producing ATP by reacting polyphosphate kinase (Ppk) type 2, which is an enzyme capable of synthesizing ATP from AMP alone, with polyphosphate and AMP.
  • Ppk polyphosphate kinase
  • polyphosphate kinase having a specific amino acid sequence derived from a thermophilic bacterium (Thermosynchoccus elongatus etc.) is disclosed.
  • the synthesis reaction of the target compound and the regeneration reaction of ATP are coupled by simultaneously carrying out the above-mentioned production method of ATP, It is also described that ATP regenerated from AMP is utilized for the synthesis of a target compound.
  • Patent Document 4 shows that a typical enzyme of E. coli loses its activity and cell permeability of polyphosphate is obtained in E. coli containing a Ppk gene from a thermophilic bacterium that is not inactivated even by heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes. There is described a method of regenerating ATP by heating at 60 to 80 ° C. to destroy the cell membrane of E. coli.
  • Patent Document 5 describes a method for producing nicotinamide mononucleotide, which is produced from NAM, ATP and ribose as raw materials, and is reacted under the catalytic action of nicotinamide phosphoribosyltransferase, ribose phosphate pyrophosphate kinase and ribose kinase.
  • Non-Patent Document 2 describes a method for synthesizing glycerol triphosphate using Ppk derived from a thermophilic bacterium and an ATP regeneration system thereby.
  • a buffer solution containing glycerol, ADP, polyphosphate, glycerol kinase (GK), Ppk and the like is used as a primary reaction solution, and the reaction is allowed to proceed while sequentially adding polyphosphate.
  • Non-Patent Document 3 shows a glutathione synthetase (GshF) derived from Streptococcus sanguinis and an ATP regenerating system by Ppk derived from a thermophilic bacterium Thermosynechococcus elongates BP-1 having an activity similar to that described in Patent Document 3.
  • GshF glutathione synthetase
  • Patent Documents 1 to 5 and Non-patent Documents 1 to 3 have problems in efficiently producing NMN, and can not be said to be excellent methods.
  • NMN is generated by an enzyme reaction in vivo while culturing in a medium containing a carbon source, a nitrogen source, etc. in a state where cells overexpressing a specific enzyme are used alive.
  • the amount produced is 300 nmol-NMN / g-yeast wet cell weight (Example 1). Assuming that the ratio of yeast dry cell weight / yeast wet cell weight ratio is 0.2, about 0.5 g ⁇ NMN / kg ⁇ yeast dry cell weight is obtained, and there is a problem that the amount of production is low.
  • Patent Document 2 describes a system for synthesizing an NAD precursor using a Prs mutant with reduced sensitivity to a reaction product. However, no example showing production of NMN is described, and no specific method for producing NMN or production amount is shown.
  • Patent Document 3 a method for producing ATP, in which a polyphosphate kinase (Ppk) type 2 which is an enzyme capable of independently synthesizing ATP from AMP is reacted with polyphosphate and AMP, is coupled with a synthesis reaction of a target compound.
  • Ppk polyphosphate kinase
  • Methods of making the material are described. However, no specific method for producing NMN or production amount is shown.
  • Patent Document 4 describes a method of heating ATP in which E. coli containing the Ppk gene derived from the thermophilic bacterium is destroyed and the ATP regenerating reaction is performed in a state in which the E. coli cell membrane is destroyed. There is no indication of the production method or amount of
  • Patent Document 5 describes a method for producing nicotinamide mononucleotide which is reacted with nicotinamide phosphoribosyltransferase, ribose phosphate pyrophosphate kinase and ribose kinase as catalysts using nicotinamide, ATP and ribose as raw materials.
  • a large amount of ATP is used for the production of NMN.
  • the number of moles of ATP added to the reaction system for the production of NMN is at least twice the number of moles of NMN to be produced. Since ATP is an expensive raw material, it can not be said that it is a cost-effective production method.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing nicotinamide mononucleotide excellent in production efficiency.
  • the present inventors have developed transformants in which the expression of three enzymes, Nampt, Prs and Ppk, are enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the three enzymes are expressed, or their processed products, R5P, NAM, ATP It was found that NMN can be produced more efficiently and inexpensively than conventional methods when the enzyme reaction is allowed to proceed by contacting with polyphosphate and causing the enzyme reaction to proceed (see FIG. 1).
  • NMN NMN could be manufactured more efficiently than the conventional method, and came to complete the 2nd invention group.
  • the present inventors have shown that (d) a gene encoding an enzyme classified into the EC number shown in EC 3.5.1.42, and the following (a) (c) (g) (h) (i) Or a gene encoding an enzyme classified into any one or more EC numbers, and transformants in which expression of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is enhanced, or their treatment
  • the object of the present invention has been found to be capable of efficiently producing NMN while remarkably suppressing the degradation of NMN by contacting at least nicotinamide (NAM), and the third invention group has been completed.
  • A EC 3.1.3.5
  • C EC 2.4.2.1
  • G EC 3.2.2.1
  • H EC 3.2.2.3
  • I EC 3.2.2.14
  • the present inventors added the total number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system for the production of NMN by a single or a combination of multiple means to 0.5 of the number of moles of NMN to be produced. It has been found that the amount can be made equal to or less than the equivalent, and the fourth invention group has been completed.
  • the present invention relates to the following [Item 1] to [Item 17].
  • [Item 1] Transformant in which expression of three enzymes, nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt), phosphoribosyl pyrophosphate synthase (Prs) and polyphosphate kinase (Ppk) is enhanced, cell-free protein synthesis reaction solution in which the three enzymes are expressed
  • a process for producing nicotinamide mononucleotide (NMN) comprising the step of bringing a treated product thereof into contact with ribose-5-phosphate (R5P), nicotinamide (NAM), ATP, and polyphosphate.
  • [Section 2] A transformant in which expression of two enzymes of ribokinase (Rbk) and polyphosphate kinase (Ppk) is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the two enzymes are expressed, or their processed products, ribose, ATP,
  • the method for producing NMN according to Item 1 further comprising the step of contacting with polyphosphoric acid to produce the R5P.
  • Item 3 The method for producing NMN according to Item 1 or 2, which is performed under conditions such that the transformant does not substantially grow.
  • [Section 4] The method for producing NMN according to any one of Items 1 to 3, wherein the Nampt is derived from bacteria.
  • FIG. 10 A transformant in which expression of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is enhanced in the presence of pyrophosphatase (PPase), a cell-free protein synthesis reaction solution in which the enzyme is expressed, or a processed product thereof
  • PPase pyrophosphatase
  • a method of producing nicotinamide mononucleotide (NMN) comprising the steps of contacting (NAM) and phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP).
  • NAM nicotinamide mononucleotide
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate
  • NMN The method for producing NMN according to any one of Items 1 to 14, wherein the total number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system is 0.5 equivalents or less of the number of moles of NMN to be produced.
  • the production amount of NMN is dramatically improved over the conventional one (for example, 10 times or more of the production amount described in Patent Document 1) ) Becomes possible.
  • the production method of the present invention utilizing the ATP regeneration reaction, it is possible to produce NMN from inexpensive R5P or ribose as a raw material without adding a large amount of expensive intermediates and ATP as PRPP. Also, the cost of production can be reduced.
  • the third reaction can be efficiently advanced by utilizing the method for producing NMN according to the second invention group of the present invention. This makes it possible to improve the production amount and production rate of NMN, and can suppress the production cost of NMN.
  • a transformant, a resting cell prepared from the transformant, a membrane permeability improving cell, an inactivated cell, a disrupted cell, a disruption When the cell-free extract prepared from the cells and the stabilized product obtained by subjecting the cell-free extract to the stabilization treatment are used to carry out the reaction for producing NMN, the degradation of the product NMN can be suppressed. As a result, it becomes possible to produce NMN with a high yield using cells and cell-free extract which are in a low cost catalytic form, and the production cost of NMN can be suppressed.
  • the amount of ATP to be added for producing NMN can be reduced. Since ATP is expensive, this can reduce the production cost of NMN.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a reaction which proceeds in the method for producing NMN of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the concentration of NMN in Example 1 and Comparative Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the concentration of NMN produced in Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the concentration of NMN produced in Example 4.
  • FIG. 5 is a graph showing the concentration of NMN produced in Example 5.
  • FIG. 6 is a graph showing the concentration of NMN in Example 6 and Comparative Example 2.
  • FIG. 7 is a graph showing the concentration of NMN produced in Example 7.
  • FIG. 8 is a graph showing the concentration of NMN produced in Example 8.
  • FIG. 9 is a diagram showing the disassembly path of NMN.
  • Nampt Nicotinamide phosphoribosyltransferase: Nicotinamide phosphoribosyltransferase Prs (Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase): Phosphoribosyl pyrophosphate synthase Rbk (Ribokinase): Ribokinase Ppk (Polyphosphate kinase): Polyphosphate kinase PPase (Pyrophos ophate n) ): Nicotinamide mononucleotide PRPP (Phosphoribosyl pyrophosphate): Phosphoribosyl pyrophosphate NAM (Nicotinamide): Nicotinamide R5P (Ribose-5-phosphate): Ribose-5-phosphate NR (Nicotinamide riboside): Nicotinamide riboside): Nicotinamide riboside): Nico
  • the first invention group is a transformant in which the expression of three enzymes, Nampt, Prs and Ppk, is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the three enzymes are expressed, or Contacting the processed products with R5P, NAM, ATP, and polyphosphate.
  • the method for producing NMN of the present invention comprises, as the step of producing R5P, a transformant in which the expression of two Rbk and Ppk enzymes is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the two enzymes are expressed, or
  • the method further includes the step of contacting the treated products with a mixture containing ribose, ATP, and polyphosphate. That is, in the present invention, NMN is produced by advancing a predetermined enzyme reaction while utilizing the ATP regeneration reaction.
  • Such a method for producing NMN of the first invention group is typically referred to as the following steps (1) to (3) (hereinafter referred to as the first step, the second step and the third step, respectively): Is carried out by sequentially performing These steps may be performed by the same person or different persons. In addition, these steps may be performed continuously, or may be performed stepwise with a predetermined period between each step.
  • the method for producing NMN of the present invention will be described in more detail along the embodiments in which the first step, the second step and the third step are performed.
  • the method for producing NMN of the present invention can be performed in an embodiment in which the first step, the second step, and the third step specifically described below are appropriately modified without departing from the spirit of the present invention. It is.
  • Nampt, Prs and Ppk, and optionally, Rbk 4 enzymes are used.
  • Nampt, Prs, Ppk and Rbk are all known enzymes, and their amino acid sequences and the base sequences of the genes encoding them are readily available to those skilled in the art.
  • the above four predetermined enzymes may be naturally occurring enzymes, as long as they can catalyze the respective target reactions, and are preferably produced by modifying the amino acid sequence of the naturally occurring enzymes. May be a mutant enzyme with improved expression level and enzyme activity.
  • various tags proteins or peptides
  • tags include His tag (histidine tag), Strep (II) -tag, GST tag (glutathione-S-transferase tag), MBP tag (maltose binding protein tag), GFP tag (green fluorescent protein tag), SUMO Tags (Small Ubiquitin-related (like) Modifier tag) FLAG tag, HA tag, myc tag, etc. may be mentioned. Furthermore, the four enzymes may be expressed as fusion proteins with one another.
  • Nampt Nampt (EC number: 2.4.2.12) is generally known to be involved in the NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) salvage pathway, and in the present invention, the reaction to generate NMN from PRPP and NAM (third) The enzyme used for the reaction).
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • ATP is not essential in the reaction between NMPP by PRMP and NAM by Nampt.
  • Nampt has ATP hydrolysis activity, and that hydrolysis of ATP causes autophosphorylation of Nampt to change enzymatic parameters and chemical equilibrium in a direction favorable to NMN formation. (Biochemistry 2008, 47, 11086-11096).
  • Nampt examples include those derived from human (Homo sapiens) (NP_005737), those derived from mouse (Mus musculus) (NP_067499), those derived from rat (Rattus norvegicus) (NP_808789), and those derived from zebrafish (Danio rerio) Those derived from bacteria such as those (NP_997833), Haemophilus ducreyi (AAR87771), Deinococcus radiodurans (AE001890), Oenococcus oeni (KZD13878), Shewanella oneidensis (NP_717588) and the like can be mentioned.
  • bacteria are a group of prokaryotes that do not have a nuclear envelope, and are a group of organisms including E. coli, Bacillus subtilis, cyanobacteria and the like.
  • Prs Prs (EC number: 2.4.2.17) is an enzyme used for the reaction (second reaction) for producing PRPP and AMP from R5P and ATP in the present invention.
  • Prs for example, those derived from human (Homo sapiens) (NP_002755), those derived from Bacillus subtilis (BAA05286), those derived from Bacillus caldolyticus (CAA58682), those derived from Arabidopsis thaliana (Q680A5), Methanocaldococcus Those from jannaschii (Q58761) can be mentioned.
  • the production of PRPP by the second reaction and the subsequent formation of NMN by the third reaction are continued over a long period of time, particularly when the substrate concentration in the production system is high (that is, the concentration in the production system of the final product NMN It is also possible to use mutant Prs as described in US Pat.
  • mutant Prs for example, a mutant such as Asp 51 His (substituting ASP at position 51 with His for the Prs derived from human, the same applies hereinafter), Asn 113 Ser, Leu 128 Ile, Aspl 82 His, Ala 189 Val, and His 192 Gln, and the like
  • mutant forms of Prs derived from other organisms for example, Bacillus subtilis derived Prs include mutant forms such as Asn120Ser (corresponding to Asn113Ser described above) and Leu135Ile (corresponding to Leu128Ile described above).
  • Rbk Rbk (EC number: 2.7.1.15) is an enzyme used for the reaction (first reaction) for producing R5P and ADP from ribose and ATP in the present invention.
  • Rbk natural Rbk derived from various organisms, or mutant Rbk produced by modifying the amino acid sequence thereof can be used, for example, those derived from human (Homo sapiens) (NP_002755), yeast ( Those derived from Saccharomyces cerevisiae (P25332), those derived from Bacillus subtilis (P36945), those derived from Escherichia coli (AAA51476), and those derived from Haemophilus influenzae (P44331) can be mentioned.
  • ⁇ Ppk Ppk (EC number: 2.7.4.1) is a reaction for regenerating ATP from the ADP produced in the first reaction or the AMP produced in the second reaction and the polyphosphate in the present invention (ATP regeneration reaction) It is an enzyme to be used.
  • Ppk can be classified into two families, polyphosphate kinase type 1 family (Ppk1) and polyphosphate kinase type 2 family (Ppk2), according to differences in amino acid sequence and kinetics.
  • Ppk2 is higher than Ppk1 as an activity to regenerate ATP using polyphosphate as a substrate. Therefore, it is preferable to use Ppk2 as Ppk in the present invention.
  • Ppk2 can be further classified into three subfamilies, class 1, class 2 and class 3. Class 1 and class 2 Ppk2 respectively catalyze the reaction of phosphorylating ADP to generate ATP, and the reaction of phosphorylating AMP to generate ADP. In contrast, class 3 Ppk2 can catalyze both AMP phosphorylation and ADP phosphorylation, so it can produce ATP from AMP alone.
  • Ppk in the present invention a combination of Ppk2 class 1 for regenerating ATP from ADP and Ppk2 class 2 for regenerating ADP from AMP can be used.
  • Ppk2 class 1 or Ppk1 for regenerating ATP from ADP is used as Ppk in the present invention
  • Ppk2 class 3 because of the efficiency with which both reactions of ATP regeneration from ADP and ATP regeneration from AMP can be catalyzed alone.
  • Ppk of the first reaction and Ppk of the second reaction can be made common.
  • Ppk2 class 3 includes, for example, those derived from Deinococcus radiodurans (NP_293858), those derived from Paenarthrobacter aurescens (ABM 08865), those derived from Meiothermus rube (ADD29239), those derived from Deinococcus geothermalis (WP_011531362), those derived from Thermosynechococcus elongatus NP — 682498).
  • Ppk2 class 1 includes, for example, those derived from Rhodobacter sphaeroides (CS 253 628), those derived from Sinorhizobium meliloti (NP 384613), PA 0141 derived from Pseudomonas aeruginosa (NP 24 8831), PA 2428 derived from Pseudomonas aeruginosa (NP 2511 118), and derived from Francisella tularensis (AJI 69883).
  • Ppk2 class 2 includes, for example, PA3455 (NP — 252145) derived from Pseudomonas aeruginosa.
  • examples of adenylate kinase include those derived from Bacillus cereus (AAP07232).
  • the transformant used in the present invention is one in which the expression of each of the predetermined enzymes is enhanced as compared to the (wild type) cells or cells before transformation. It is not unambiguously determined how "expression is enhanced” means how much the expression level of each enzyme is enhanced, and as described later, in the reaction solvent of each enzyme (within the production system)
  • the amount of expression in transformants can be adjusted so that the concentration of the protein is in the appropriate range, but at least by artificial manipulation, it is expressed more than (wild-type) cells or cells before transformation. Should be strengthened.
  • the artificial manipulation is not particularly limited, and uses an expression vector as described below, introduces multiple copies of a gene expression unit encoding a predetermined enzyme into the genome, and originally designates the predetermined enzyme present on the genome Manipulations such as replacing the promoter of the gene encoding.
  • the transformant used in the present invention may be composed only of (i) a transformant containing all of the genes encoding each of the predetermined enzymes, or (ii) a gene encoding each of the predetermined enzymes.
  • a combination of transformants in which expression of Nampt and Prs is enhanced and a transformant in which expression of Ppk is enhanced may be used as a combination of transformants that are separately included.
  • the host of the transformant is not particularly limited as long as it is a cell capable of expressing a predetermined enzyme by a protein expression system using an expression vector or the like.
  • bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes (e.g. Rhodococcus, Corynebacterium), etc .
  • yeasts e.g. Saccharomyces), Candida (such as Saccharomyces) Candida), genus Pichia
  • filamentous fungi plant cells; animal cells such as insect cells and mammalian cells.
  • Escherichia coli, Corynebacterium bacteria and Rhodococcus bacteria, and Saccharomyces yeast, Candida yeast and Pichia yeast are preferable, and Escherichia coli is more preferable.
  • E. coli examples include, for example, E. coli strains K12 and B, and W3110 strain, JM109 strain, XL1-Blue strain (eg, XL1-Blue MRF '), K802 strain, C600 strain, BL21 strain derived from a wild strain thereof.
  • the strain, BL21 (DE3) strain and the like can be mentioned.
  • an expression vector it is not particularly limited as long as it contains a gene of each of the predetermined enzymes used in the present invention in an expressible state, and a vector suitable for each host can be used. Details of the construction of the expression vector will be described later.
  • the method for introducing the expression vector into the host is not particularly limited as long as it is a method suitable for the host.
  • methods that can be used include electroporation, methods using calcium ions, spheroplast methods, lithium acetate methods, calcium phosphate methods, and lipofection methods.
  • the transformant into which the expression vector has been introduced may be cultured by a method suitable for the cells (bacterial cells) used as the host to express the predetermined enzymes.
  • a method suitable for the cells (bacterial cells) used as the host to express the predetermined enzymes As described above, when combining transformants separately containing a gene encoding each predetermined enzyme, for example, a transformant in which expression of Nampt and Prs is enhanced and a transformant in which expression of Ppk is enhanced When producing and combining them, each transformant may be cultured in the same medium, or may be mixed after being cultured in separate media.
  • Transformants resting cells prepared from transformants, membrane permeability improving cells, inactivated cells, disrupted cells, cell-free extracts prepared from disrupted cells, and stabilization treatment thereof
  • the reaction to form NMN is carried out using the stabilized product (for details, refer to the matter regarding the second step below)
  • decomposition or side reaction of the reaction product (substrate) ribose or NAM, product NMN It may happen that NMN can not be manufactured efficiently.
  • a host in which a gene causing degradation or a side reaction is destroyed or deleted can be used.
  • a host in which a gene encoding an enzyme classified into any one or more of the EC numbers shown in the following (a) to (i) is deleted or destroyed can be used.
  • the enzyme classified into EC 3.1.3.5 is 5'-nucleotidase and includes an enzyme which catalyzes a reaction of hydrolyzing NMN to form nicotinamide riboside (NR) and phosphate.
  • Examples of the gene encoding 5'-nucleotidase include Escherichia coli ushA, surE, yrfG, yjjG and the like.
  • UshA which is a 5'-nucleotidase, is reported as an enzyme playing a major role in NAD degradation in E. coli. It is disclosed to have degradation activity.
  • ushA or its homolog gene is particularly preferable.
  • nicotinamide The enzyme classified into EC 3.5.1.19 is nicotinamide, which is involved in the degradation of NAM.
  • Examples of a gene encoding nicotinamide include pncA of E. coli.
  • An enzyme classified into EC 2.4.2.1 is purine-nucleoside phosphorylase, which catalyzes a reaction of phosphorolysis of NR to form NAM and ribose-1-phosphate (R1P) including.
  • Examples of a gene encoding purine-nucleoside phosphorylase include deoD of E. coli. Molecular and General Genetics, 104 (1969), 351-359 disclose deoD as one of a group of genes related to the metabolism of nucleosides.
  • deoD or a homolog gene thereof is preferable.
  • nicotinamide mononucleotide Deaminase is an enzyme that hydrolyzes NMN to generate NaMN and ammonia.
  • Examples of the gene encoding nicotinamide mononucleotide deamidase include pncC of E. coli. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 286 (2011), 40365-40375 discloses findings on Shencella oneidensis and pncC of E. coli.
  • pncC or a homolog gene thereof is preferable.
  • the enzymes classified into (e) EC 1.17.2.1 and (f) EC 1.17.1.5 are nicotinate dehydrogenase, which may be involved in the by-production of hydroxynicotinic acid from NAM.
  • purine nucleosidase An enzyme classified into EC 3.2.2.1 is purine nucleosidase, which includes an enzyme that catalyzes a reaction of hydrolyzing NR to generate NAM and ribose.
  • the gene encoding purine nucleosidase includes, for example, Pu-N of Ochrobactrum anthropi (Applied and Environmental Microbiology, 67 (2001), 1783-1787).
  • Pu-N or a homolog gene thereof is preferable.
  • uridine nucleosidase An enzyme classified into EC 3.2.2.3 is uridine nucleosidase, which includes an enzyme capable of catalyzing the reaction of hydrolyzing NR to form NAM and ribose.
  • Examples of the gene encoding uridine nucleosidase include URH1 of Arabidopsis thaliana (Plant Cell, 21 (2009), 876-91).
  • URH1 or its homolog gene is preferable.
  • NMN nucleosidase The enzyme classified into EC 3.2.2.14 is NMN nucleosidase, which catalyzes a reaction of hydrolyzing NMN to generate NAM and R5P. Biochem. Biophys. Res. Commun., 49 (1972), 264-9 disclose the NMN nuclease activity of E. coli. In the present invention, it is preferable to disrupt or delete a gene encoding an enzyme having an NMN nuclease activity.
  • the gene to be deleted or destroyed is a gene encoding an enzyme classified into the EC number shown in (d), and any one or more of (a) (c) (g) (h) (i)
  • a gene encoding an enzyme classified into the EC number of SEQ ID NO: 2 and a gene encoding an enzyme classified into the EC number shown in (d) and an EC number shown in (a) More preferably, it is a gene encoding an enzyme. Details are described in the description of the third invention group described later.
  • the method of disrupting or deleting a gene is not particularly limited, and can be performed by a known method of disrupting or deleting a gene.
  • a method using a linearized gene disruption or deletion fragment a method using a circular gene disruption or deletion plasmid without an origin of replication, a method using a group II intron, a Red-ET homologous recombination method, ZFN Methods using genome editing such as TALEN, CRISPR / Cas9 etc. can be mentioned.
  • the gene encoding each of the predetermined enzymes used in the present invention is typically introduced into the host of the transformant as it is contained in an expression vector.
  • one expression vector may contain all of the genes encoding the respective enzymes to be expressed, or two or more coexistence in the host. Genes encoding each enzyme to be expressed may be appropriately distributed and contained in the expression vector. For example, when preparing transformants in which expression of Nampt, Prs and Ppk is enhanced, one expression vector may be used which includes all the genes encoding Nampt, Prs and Ppk, or encoding Nampt and Prs. And the expression vector containing the gene encoding Ppk may be comprised by the combination of two vectors of an expression vector.
  • the expression vector used in the present invention can be produced by a known method.
  • a transcription promoter and in some cases, a terminator may be inserted upstream of a gene encoding a predetermined enzyme to construct an expression cassette, and this cassette may be inserted into an expression vector.
  • a transcription promoter and / or terminator is already present in the expression vector, a gene encoding the enzyme of interest using the transcription promoter and / or terminator of the vector without constructing the expression cassette. Just insert it.
  • those genes may all be inserted under the same promoter, or may be inserted under different promoters. Good.
  • the type of promoter is not particularly limited as long as it enables appropriate expression in the host, but for example, as usable in E. coli host, T7 promoter, trp promoter, lac promoter, lambda phage derived Examples include PL promoter and PR promoter, tac promoter, and trc promoter.
  • the gene (nucleic acid) encoding each predetermined enzyme can also be obtained, for example, by preparing primers according to (i) base sequence information and amplifying the genome etc. as a template, or (ii) amino acid sequence of the enzyme It can also be obtained by synthesizing DNA in an organic synthetic manner according to the information.
  • the gene may be optimized depending on the cell serving as the host of the transformant.
  • a method using a restriction enzyme, a method using topoisomerase, or the like can be used.
  • Appropriate linkers may be added if necessary for the insertion.
  • ribosome binding sequences such as SD sequence and Kozak sequence are known as base sequences important for translation into amino acids, and these sequences may be inserted upstream of a gene. A part of the amino acid sequence encoded by the gene may be replaced upon insertion.
  • the vector contains a factor (selection marker) for selecting a target transformant.
  • Selection markers include drug resistance genes, auxotrophic complementation genes, assimilability imparting genes, and the like, and may be selected according to the purpose or host.
  • drug resistance genes used as selection markers in E. coli include ampicillin resistance gene, kanamycin gene, dihydrofolate reductase gene, and neomycin resistance gene.
  • an appropriate expression vector selected from plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, artificial chromosome DNA and the like may be used according to the host.
  • E. coli E. coli is used as a host
  • pTrc99A GE Healthcare Biosciences
  • pACYC184 Nippon Gene
  • pMW118 Nippon Gene
  • pET series vector Novagen
  • pETDuet-1 Novagen
  • a method of enhancing expression of a predetermined enzyme a method using an expression vector as described above is typical, but other methods can also be used.
  • expression of a predetermined enzyme can be enhanced by inserting an expression cassette in which an appropriate promoter, terminator, marker gene or the like is linked to a gene encoding a predetermined enzyme on the genome of the host.
  • a known method can be used as a method for obtaining a transformant in which the expression cassette has been inserted into the genome.
  • transformation is carried out using a plasmid which has an expression cassette of a predetermined enzyme and an arbitrary genomic region and is not replicable in the host.
  • transformants into which the entire plasmid or expression cassette has been inserted can be obtained.
  • a plasmid carrying a negative selection marker such as SacB gene (encoding levansucrase) or a plasmid having a temperature-sensitive replication mechanism (ts) only the expression cassette is genomically obtained by two homologous recombinations. It is also possible to efficiently obtain transformed transformants.
  • transformation may be performed using a DNA fragment consisting only of an expression cassette, whereby a transformant in which the expression cassette is inserted at random positions on the genome can also be obtained.
  • the expression may be enhanced by replacing the promoter of the enzyme gene on the genome with a strong one. it can.
  • the promoter used in the expression vector mentioned above can be utilized similarly.
  • Cell-free protein synthesis reaction solution The cell-free protein synthesis system is expressed not by living microorganisms or cells but by cell-free extracts extracted from various organisms, amino acids, energy molecules such as ATP, energy regeneration systems, salts such as magnesium ions, and so on. This system is for synthesizing a protein in vitro by a cell-free protein synthesis reaction solution to which a gene (DNA or RNA) encoding a protein of interest is added.
  • Cell-free extracts include translational components such as ribosomes, tRNAs, aminoacylated tRNA synthetases, translation initiation factors, translation elongation factors, translation termination factors and the like.
  • a solution for carrying out a protein synthesis reaction by a cell-free protein synthesis system is referred to as a cell-free protein synthesis reaction solution including before and after the reaction.
  • the cell-free protein synthesis system used in the present invention may be any system as long as it can be expressed in a state in which each predetermined enzyme has an original function, for example, a wheat germ-derived synthesis system, Escherichia coli-derived synthesis A system, a rabbit reticulocyte-derived system, an insect cell-derived synthetic system, or a human cell-derived synthetic system can be used.
  • a wheat germ-derived synthesis system Escherichia coli-derived synthesis A system, a rabbit reticulocyte-derived system, an insect cell-derived synthetic system, or a human cell-derived synthetic system
  • PURE Protein synthesis using recombinant elements
  • a batch method As a protein synthesis reaction process in a cell-free system, a batch method, a continuous-flow cell-free (CFCF) method, a continuous exchange cell-free (CECF) method, an overlay method or the like can be used.
  • the template of the enzyme gene to be expressed may be RNA or DNA.
  • RNA is used as a template, total RNA, mRNA, in vitro transcripts and the like can be used.
  • the second step is, if necessary, a step of preparing a treated product from the transformant or cell-free protein synthesis reaction solution that has undergone the first step.
  • processed products of transformants include resting cells prepared from transformants, membrane permeability improving cells, inactivated cells, disrupted cells and the like.
  • cell-free extracts and purified enzymes prepared from disrupted cells are also included in the treated product of the present invention.
  • the processed product of the cell-free protein synthesis reaction include purified enzymes prepared from the cell-free protein synthesis reaction.
  • transformants, cell-free protein synthesis reaction solutions, and stabilized products obtained by subjecting these processed products to stabilization processing are also included in the processed products of the present invention.
  • Resting cells mean cells whose growth has been substantially stopped. Specifically, after the transformant grown by culture is recovered from the culture medium, the transformant is suspended in a buffer or the like containing no readily available carbon source, or the recovered transformant is frozen. It can be prepared by drying or drying to powder. Any method may be used to recover the transformant from the culture medium, and examples include a method using centrifugation, a method using membrane filtration, and the like. Centrifugation is not particularly limited as long as it can supply a centrifugal force to precipitate the transformant, and a cylindrical type, a separation plate type, or the like can be used. The centrifugal force can be, for example, about 500 G to 20,000 G.
  • Membrane filtration may be performed using either a microfiltration (MF) membrane or an ultrafiltration (UF) membrane, as long as the transformant can be recovered from the culture medium.
  • the buffer for suspending the transformant may be any buffer as long as the growth of the transformant is substantially stopped and the function of each predetermined enzyme is maintained, for example, phosphate buffer Solution, acrylic acid buffer solution, tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane) -hydrochloric acid buffer solution, HEPES (2- (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperidinyl) ethanesulfonic acid) and other Good's buffer solution (Good 's buffers) etc. can be used.
  • the transformant When freezing the transformant, it may be frozen in a state in which most of the water has been removed by the above-mentioned operation such as centrifugation or suspended in an appropriate buffer.
  • the freezing temperature varies depending on the components of the buffer in which the transformant is suspended, but may be any temperature that substantially freezes the transformant, for example, in the range of -210 ° C to 0 ° C, etc. You can do it in
  • any method may be used as long as the growth of the transformant is substantially stopped and the functions of the predetermined enzymes are maintained. Drying methods, spray drying methods and the like can be mentioned.
  • Preparation of membrane permeability improving cells can be performed using a known method. For example, by treating the transformant with an organic solvent or surfactant, the substrate or product can easily pass through the cell membrane or cell wall of the transformant.
  • organic solvent and surfactant used is not particularly limited as long as the membrane permeability is improved and the function of each predetermined enzyme can be maintained, and if it is an organic solvent, it is toluene
  • surfactant include Triton-X 100 and benzethonium chloride.
  • Preparation of inactivated cells can be performed using a known method. For example, it can be carried out by drug treatment or heat treatment.
  • a drug for example, cationic surfactants such as benzethonium chloride, cetyl pyridinium chloride, methyl stearoyl chloride, cetyltrimethyl ammonium bromide, and zwitterionic surfactants such as alkyldiaminoethylglycine hydrochloride may be used.
  • zwitterionic surfactants such as alkyldiaminoethylglycine hydrochloride
  • alcohols such as ethanol, thiols such as 2-mercaptoethanol, amines such as ethylene diamine, amino acids such as cysteine, ornithine, citrulline and the like can also be mentioned.
  • the heat treatment may be performed at a temperature and for a time at which the target enzyme is not inactivated.
  • Preparation of disrupted cells can be performed using a known method. For example, ultrasonication, high pressure treatment with a French press or homogenizer, grinding treatment with a bead mill, collision treatment with an impact crusher, enzyme treatment with lysozyme, cellulase, pectinase etc., freeze-thaw treatment, hypotonic solution treatment, lysis with phage Induction treatment and the like can be mentioned, and any of the methods can be used alone or in combination as needed.
  • high pressure treatment, grinding treatment, collision treatment, or treatment combining these treatments with enzyme treatment etc. should be performed in consideration of operability, recovery rate, cost, etc. preferable.
  • the beads used have a density of 2.5 to 6.0 g / cm 3 and a size of 0.1 to 1.0 mm and are usually crushed by about 80 to 85%.
  • a driving method either a batch system or a continuous system can be adopted.
  • the treatment pressure is not particularly limited as long as the target protein recovery rate from cells is sufficiently high, but for example, about 40 to 200 MPa, preferably about 60 to 150 MPa, more preferably about 80 to 120 MPa Crushing can be performed at a pressure of
  • multistage processing can be performed to improve crushing and operation efficiency by arranging the apparatuses in series or using an apparatus having a multi-stage structure.
  • a temperature rise of 2 to 3 ° C. occurs at a treatment pressure of 10 MPa, it is preferable to carry out a cooling treatment as necessary.
  • cell slurry is previously frozen into fine particles (for example, 50 ⁇ m or less) by spray freezing (for example, freezing speed: several thousand ° C. per minute) and the like, and this is high speed (for example, about 300 m / s)
  • spray freezing for example, freezing speed: several thousand ° C. per minute
  • high speed for example, about 300 m / s
  • the cell-free extract can be prepared by removing disrupted debris (insoluble fraction including cell membrane, cell wall, etc.) from disrupted cells.
  • the removal of the crushing residue can be performed by a known method, and for example, centrifugation, membrane filtration, filter cloth filtration, etc. can be used. Centrifugation can be performed as described above, but if the crush residue of the transformant is fine and it is difficult to easily settle, use a flocculant etc. to increase the residue precipitation efficiency if necessary. It can also be done.
  • Membrane filtration can also be performed as described above, but in particular ultrafiltration (UF) membranes can be used if the crush residue of the transformant is fine.
  • UF ultrafiltration
  • a filter aid and a coagulant can be used in combination.
  • a filter aid diatomaceous earth, cellulose powder, activated carbon and the like can be mentioned.
  • the aggregating agent include cationic aggregating agents, anionic aggregating agents, amphoteric aggregating agents, nonionic aggregating agents and the like.
  • the cell-free extract containing each of the predetermined enzymes can be prepared by recovering the supernatant in the absence of bacterial cells and decellularizing (making it cell-free) by any of the above operations.
  • Preparation of the purified enzyme can be carried out by general biochemical methods such as ammonium sulfate precipitation, various chromatography (eg gel filtration chromatography (Sephadex column etc), ion exchange chromatography (DEAE-Toyopearl etc), affinity chromatography (TALON) Metal Affinity Resin etc., hydrophobic chromatography (butyl Toyopearl etc.), anion chromatography (MonoQ column etc.)), SDS polyacrylamide gel electrophoresis etc. can be carried out by using alone or in combination.
  • various chromatography eg gel filtration chromatography (Sephadex column etc), ion exchange chromatography (DEAE-Toyopearl etc), affinity chromatography (TALON) Metal Affinity Resin etc.
  • hydrophobic chromatography butyl Toyopearl etc.
  • anion chromatography MonoQ column etc.
  • SDS polyacrylamide gel electrophoresis etc. can be carried
  • the above-described transformant, cell-free protein synthesis reaction solution, and the treated product thereof may be used after the stabilization treatment (stabilized treatment product).
  • the stabilization treatment may be any treatment as long as the stability of each predetermined enzyme against environmental factors (temperature, pH, chemical concentration, etc.) is improved or the stability during storage is improved compared to the untreated state.
  • inclusion in gels such as acrylamide, treatment with aldehydes such as glutaraldehyde (including CLEA: Cross-linked enzyme aggregate), and treatment onto an inorganic carrier (alumina, silica, zeolite, diatomaceous earth, etc.) can be mentioned.
  • the substrates and products used in the present invention are relatively polar, and cell membranes and cell walls may be rate-limiting for mass transfer. Therefore, in view of the permeability of the substrate and the product, it is particularly preferable in the present invention to use disrupted cells, cell-free extracts, purified enzymes, or their stabilized products.
  • the transformant described above, the cell-free protein synthesis reaction solution, or the processed product thereof can be stored under any conditions as long as the enzyme activity is maintained. If desired, the solutions may be frozen under appropriate conditions (eg, -80 ° C. to -20 ° C., 1 day to 1 year) and stored until used (when performing the third step).
  • each of the transformants may be separately treated, and then the treated products may be mixed, or (ii) the transformants may be mixed. After the process, each process may be performed collectively.
  • the third step is a step of bringing the transformant or cell-free protein synthesis reaction solution that has undergone the first step, or, if necessary, those treated products that have undergone the second step, into contact with the substrates used as various raw materials for the enzyme reaction. It is.
  • the second reaction by Prs and the third reaction by Nampt are performed in conjunction with the ATP regeneration reaction by Ppk.
  • the substrate is phosphorylated using ATP as a phosphate source, and in the third reaction by Nampt, ATP is consumed because it is autophosphorylated by the ATP hydrolysis activity possessed by Nampt itself.
  • Ru is a step of bringing the transformant or cell-free protein synthesis reaction solution that has undergone the first step, or, if necessary, those treated products that have undergone the second step, into contact with the substrates used as various raw materials for the enzyme reaction. It is.
  • the second reaction by Prs and the third reaction by Nampt are performed in conjunction with the ATP regeneration reaction by Ppk.
  • the substrate
  • ADP or AMP may be added to the reaction solvent instead of ATP. This is because the added ADP and AMP are immediately regenerated to ATP in the system by the ATP regeneration system, so that substantially the same state as adding a proper amount of ATP is obtained. Moreover, you may add the mixture which contains these in arbitrary ratios.
  • the second reaction and the third reaction may be combined with the first reaction with Rbk coupled with the ATP regeneration reaction with Ppk, if necessary.
  • the first reaction with Rbk may be performed first
  • the second reaction with Prs and the third reaction with Nampt may be performed using the reaction solution as a raw material, or the first reaction with Rbk and the second reaction with Prs
  • the reaction and the third reaction by Nampt may be performed in the same reaction system.
  • the second reaction by Prs and the third reaction by Nampt are transformants in which expression of three enzymes of Nampt, Prs and Ppk is enhanced, cell-free protein synthesis reaction solution in which the three enzymes are expressed, or processed products thereof By contacting with R5P, NAM, ATP, and polyphosphate.
  • the first reaction with Rbk is a transformant in which the expression of Rbk and Ppk 2 enzymes is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the 2 enzymes are expressed, or their processed products, ribose, ATP, and polyline It is carried out by contacting with an acid.
  • the raw material used in the third step can be one purchased from a general supplier, or one synthesized by self-reacting.
  • R5P may be a commercially available product, from the viewpoint of raw material cost
  • the first reaction with Rbk that is, a transformant in which expression of two enzymes of Rbk and Ppk is enhanced, the above two enzymes are expressed It is preferable to use a cell-free protein synthesis reaction solution, or a product synthesized by contacting the reaction product with ribose and polyphosphate.
  • Polyphosphoric acid which is one of the above-mentioned raw materials is known in various chain lengths.
  • the chain length of the polyphosphate used in the present invention may be any chain length as long as the ATP regeneration reaction can be performed efficiently, but from the viewpoint of the viscosity and cost of the solution when dissolved, the chain length is 3 It is preferably about -100, and more preferably about 3-30.
  • a compound other than the above-mentioned raw material is transformed with a transformant in which expression of each predetermined enzyme is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which each predetermined enzyme is expressed, or a treatment thereof It may be in contact with a substance, or may be contained in a reaction solvent (in the production system).
  • a metal ion such as magnesium ion
  • the transformant to be used is substantially alive, ie, maintaining cell proliferation ability
  • the substrate or product in this reaction can be produced as a target product in a high yield without being used for the growth of transformants or being degraded. I can expect it.
  • the conditions under which the transformants do not substantially proliferate may be any conditions that do not substantially increase the number of transformants in the reaction system.
  • the reaction may be performed in a solution which does not contain a carbon source (such as glucose) which is easily available to transformants.
  • concentrations of the above-mentioned substances in the reaction solvent (within the production system) are as follows.
  • the concentration of Nampt is, for example, 1 ⁇ g / L to 10 g / L.
  • the concentration of Prs is, for example, 1 ⁇ g / L to 10 g / L.
  • the concentration of Rbk is, for example, 1 ⁇ g / L to 10 g / L.
  • the concentration of Ppk is, for example, 1 ⁇ g / L to 10 g / L.
  • Each enzyme is prepared by appropriately adjusting the amount of the transformant in which the expression of each of the predetermined enzymes is enhanced, the cell-free protein synthesis reaction solution in which each of the predetermined enzymes is expressed, or the processed product thereof.
  • the concentration in the reaction solvent of can be adjusted to the above range.
  • the concentration of R5P is, for example, 1 ⁇ g / L to 100 g / L.
  • the concentration of ribose is, for example, 1 ⁇ g / L to 100 g / L.
  • the concentration of NAM is, for example, 1 ⁇ g / L to 500 g / L.
  • the concentration of ATP is, for example, 1 ⁇ g / L to 100 g / L.
  • the concentration of polyphosphoric acid is, for example, 1 ⁇ g / L to 200 g / L.
  • the concentration of each raw material in the reaction solvent can be adjusted to the above-mentioned range by adjusting the addition amount of these raw materials to the reaction solvent and the like. For addition to the reaction solvent, depending on the raw materials, a predetermined amount may be charged at once at the beginning of the third step, or a predetermined amount is sequentially added at an appropriate stage at the beginning and / or during the third step. You may do so.
  • Conditions for advancing the enzyme reaction other than the concentration of each substance as described above for example, temperature, time, and the like can also be appropriately adjusted.
  • the reaction temperature is preferably adjusted within the range in which the catalytic efficiency of each enzyme is optimal.
  • the reaction time can be made until the production amount of the target compound NMN reaches a predetermined amount.
  • the generated NMN can be recovered from the production system according to a conventional method, appropriately concentrated and purified.
  • any method can be used as long as it can improve the purity of NMN and can efficiently recover NMN.
  • the following methods It can be mentioned.
  • the reaction is performed using bacterial cells after the NMN synthesis reaction, the bacterial cells can be removed by means such as centrifugation or membrane filtration.
  • the reaction is carried out using a cell-free extract or a purified enzyme, proteins, etc. are removed by filtration using an ultrafiltration membrane or precipitation after addition of perchloric acid etc. can do.
  • the pH is returned to weak acidity by potassium hydroxide or the like, and the formed precipitate of potassium perchlorate is again removed by centrifugation.
  • a washing treatment by activated carbon adsorption can be performed.
  • An aqueous solution containing NMN is brought into contact with activated carbon to adsorb the NMN.
  • certain impurities can be removed by washing with a solvent such as isoamyl alcohol. Subsequently, further purification can be performed by treatment with an anion exchange resin.
  • the solution containing NMN can be passed through an anion exchange resin such as Dowex et al, and the adsorbed NMN can be eluted with water. Furthermore, the pH of the obtained aqueous solution of NMN can be acidified, and a large amount of acetone can be added to obtain NMN as a precipitate. The precipitate can be dried to obtain purified NMN.
  • an anion exchange resin such as Dowex et al
  • the present invention can be carried out such that the total number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system is equal to or less than 0.5 equivalent of the number of moles of NMN to be produced.
  • any method can be used as long as the amount of ATP or the like added for the production of NMN can be reduced as a result, for example, the means shown below alone or It can carry out combining suitably. The details of these means are described in the description of the fourth invention group described later.
  • Conjugation of ATP regeneration system (2) Coexistence of PPase (3) Use of bacteria-derived Nampt (4) Use of host in which unwanted genes are destroyed or deleted (5) Appropriate substrate concentration
  • the second invention group relates to a transformant in which the expression of Nampt is enhanced in the presence of PPase, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the enzyme is expressed, or the like. Contacting the product with the NAM and PRPP.
  • the method for producing NMN according to the second invention group is carried out by sequentially performing the first step, the second step and the third step in the same manner as the first invention group except for the following points. That is, in the first and second steps, a transformant in which expression of at least Nampt is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the enzyme is expressed, or a processed product thereof is prepared, and expression of PPase is A cell-free protein synthesis reaction solution in which the enzyme or the like is expressed, or a treated product thereof is prepared, such as a microorganism which expresses PPase as an endogenous enzyme although the transformant or the enhanced transformant is not particularly enhanced.
  • the transformant, the cell-free protein synthesis reaction solution or the processed product thereof obtained through the first and second steps may be brought into contact with at least NAM and PRPP. It is.
  • ⁇ PPase PPase (EC number: 3.6.1.1) is an enzyme that hydrolyzes pyrophosphate into two molecules of phosphate.
  • the third reaction can be advanced extremely efficiently by performing the third reaction in the presence of PPase.
  • Nampt In the third reaction by Nampt, pyrophosphate is by-produced together with NMN. From the viewpoint of a general enzyme reaction, it is predicted that the addition of PPase to the third reaction system results in the decomposition of the by-product pyrophosphate into phosphoric acid and the promotion of the reaction in the direction of NMN formation. However, in the case of Nampt, that is not necessarily obvious. The reason is that once pyrophosphate is decomposed, the Nampt reaction may not proceed continuously. Nampt is known to hydrolyze ATP and be activated by autophosphorylation.
  • PPases for example, those derived from yeast (P00817), those derived from E. coli (NP_418647), those derived from Bacillus subtilis (P37487), those derived from Thermus thermophilus (P38576), those derived from Streptococcus gordonii (P95765), Streptococcus mutans (O68579) and the like.
  • PPase may be in any form as long as it can be added to the third reaction system, and may be prepared by any method. Specifically, first, as in the first step of the first invention group, a transformant containing a gene encoding PPase is prepared and cultured, or a cell-free protein containing a gene encoding each of the enzymes The protein synthesis reaction is carried out in the synthesis reaction solution to express the respective enzymes. In addition, since PPase is expressed in a constant amount as an enzyme necessary for survival in ordinary microorganisms and the like, microorganisms and the like whose expression is not particularly enhanced can be cultured and used as it is.
  • the treated product can be prepared from the transformant that has undergone the first step, a microorganism or the like whose expression is not particularly enhanced, or a cell-free protein synthesis reaction solution .
  • a commercially available PPase-purified enzyme can also be used as an embodiment of the treated product.
  • Examples of commercially available PPase-purified enzymes include yeast-derived PPase-purified enzymes from Sigma-Aldrich (Product No. 10108987001).
  • the method for producing NMN according to the second invention group can be carried out.
  • the third reaction can be advanced extremely efficiently, and NMN can be efficiently produced.
  • the third reaction according to the second invention group can be performed by the third reaction alone, it may be performed in the same reaction system in combination with one or more of the first reaction, the second reaction, and the ATP regeneration reaction. You can also.
  • the embodiment of the third reaction in the first invention group of the present invention the third reaction defined in the second invention group of the present invention, the first invention group and the second invention It is also possible to carry out a method of manufacturing an integrated MNN.
  • the transformant to be used is substantially alive, ie, maintaining cell proliferation ability
  • the substrate or product in this reaction can be produced as a target product in a high yield without being used for the growth of transformants or being degraded. I can expect it.
  • the conditions under which the transformants do not substantially proliferate may be any conditions that do not substantially increase the number of transformants in the reaction system.
  • the reaction may be performed in a solution which does not contain a carbon source (such as glucose) which is easily available to transformants.
  • the treated product is preferably a purified enzyme.
  • the purified enzyme By using the purified enzyme, the decomposition or side reaction of the reactant (substrate) or the product can be suppressed, so that the promoting effect of the third reaction according to the present invention can be further enjoyed.
  • the third invention group comprises (d) a gene encoding an enzyme classified into the EC number shown in EC 3.5.1.42, and the following (a) (c) (g) (H) a gene encoding an enzyme classified into any one or more of the EC numbers shown in (h) is destroyed or deleted, and expression of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is enhanced Contacting the transformant or the treated product thereof with at least nicotinamide (NAM).
  • A EC 3.1.3.5
  • C EC 2.4.2.1
  • G EC 3.2.2.1
  • H EC 3.2.2.3
  • I EC 3.2.2.14
  • the method for producing NMN according to the third invention group is carried out by sequentially performing the first step, the second step and the third step in the same manner as the first invention group except for the following points. That is, in the first and second steps, a transformant in which a gene encoding an enzyme classified into various EC numbers is disrupted or deleted, and expression of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is enhanced Or in the third step, the transformant obtained through the first and second steps or the treated product thereof may be brought into contact with at least the NAM in the third step. is there.
  • NMN When NMN is synthesized using a transformant such as E. coli or a processed product thereof, these enzymes degrade the generated NMN, which results in a reduction in the production of NMN.
  • a degradation pathway of NMN possessed by the host two are known: a degradation pathway producing NAM and a degradation pathway producing nicotinic acid mononucleotide (NaMN) (FIG. 9).
  • the present inventors jump the degradation of NMN rather than attenuating one pathway by attenuating both pathways (destruction or deletion of a gene encoding one or more enzymes present in the pathway). Found that it could be suppressed, and the third invention group was completed.
  • any one or more EC numbers shown in the following (a) (c) (g) (h) (i) The gene encoding the enzyme to be classified may be disrupted or deleted.
  • the method for disrupting or deleting the gene is not particularly limited, and is as described in the description of the first invention group.
  • the third invention group of the present invention can be integrated into one or both of the first and second invention groups of the present invention to carry out the method for producing NMN.
  • the sum of the number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system for producing NMN is 0.5 of the number of moles of NMN to be produced. It can be less than or equal to the equivalent weight.
  • ATP is required in the production of NMN by the first reaction, the second reaction and the third reaction described so far. That is, in the first reaction, since ATP is converted to ADP along with the formation of R5P from ribose, one mole of ATP is used for the production of one mole of R5P. In the second reaction, 1 mol of ATP is used for the production of 1 mol of PRPP since ATP is converted to AMP along with the production of PRPP from R5P. In the third reaction, ATP is not essential for the reaction itself when generating NMN from PRPP.
  • Nampt has an ATP hydrolysis activity, and the hydrolysis of ATP results in the autophosphorylation of Nampt, and changes the enzymatic parameters and chemical equilibrium in a direction favorable to the formation of NMN. Therefore, when there is sufficient ATP in the third reaction system, one or more moles of ATP will be used substantially for the production of 1 mole of PRPP, along with the production of NMN from PRPP. .
  • a total of 2 moles or more of ATP per one reaction of the second reaction and the second reaction using ribose as a raw material per generation of 1 mol of NMN In the production of NMN by the third reaction, a total of 3 moles or more of ATP will be used for production of 1 mole of NMN.
  • ATP is an expensive compound
  • the amount used be as small as possible when attempting to produce NMN inexpensively.
  • the total number of moles of ATP, ADP and AMP to be added to the reaction system for producing NMN the number of moles of NMN to be produced Less than 0.5 equivalents of
  • the method for producing NMN according to the fourth invention group can be carried out using any method as long as the amount of ATP or the like added for the production of NMN can be reduced.
  • the means shown below can be It can carry out alone or in combination as appropriate.
  • Coupling of ATP Regeneration System For the production of NMN, at least a system capable of regenerating by-produced ADP or AMP into ATP is coupled with an NMN generation reaction system including a second reaction and a third reaction. The total number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system can be reduced.
  • the ATP regeneration system may be any system as long as it can regenerate ATP from AMP and ADP.
  • a system using Ppk with polyphosphate as a phosphate source, pyruvate kinase with phosphoenolpyruvate as a phosphate source A system to be used, a system using creatine phosphate kinase using creatine phosphate as a phosphate source, and the like can be mentioned, but from the viewpoint of the cost of the phosphate source, a system using Ppk as a phosphate source is preferable.
  • an NMN generation reaction in which an ATP regeneration system using polyphosphate and Ppk is coupled can be carried out as described in the third step in the first invention group.
  • bacteria-derived Nampt As the enzyme Nampt that catalyzes the third reaction, generation of NMN proceeds efficiently, and as a result, it is added to the reaction system for NMN production.
  • the total number of moles of ATP, ADP and AMP can be reduced.
  • Nampt derived from bacteria those described in the first step in the first invention group can be used.
  • a host in which an unnecessary gene has been disrupted or deleted A transformant, a resting cell prepared from the transformant, a membrane permeability improving cell, an inactivated cell, a disrupted cell, a disrupted cell
  • a gene causing decomposition of the reaction product (substrate) or product or side reaction It is possible to use a host which has been disrupted or deleted.
  • a host in which any one or more of the genes described in the first step in the first invention group are disrupted or deleted can be used.
  • the gene disrupted or deleted host described in the third invention group can be used.
  • ATP can also be expected to have the same effect by increasing the concentration in the reaction system, but even if ATP is added more than necessary, if there is no increase in the amount of NMN production corresponding to it, 1 mole of NMN is produced The number of moles of ATP used to cause this increase.
  • the number of moles of ATP added to the reaction system is preferably 1 equivalent or less of the number of moles of NMN to be produced, more preferably 0.5 equivalents or less, and still more preferably 0.1 equivalents or less.
  • the fourth invention group of the present invention can be integrated into one or more of the first, second and third invention groups of the present invention to carry out the method for producing NMN.
  • Nampt from Haemophilus ducreyi (AAR 87771)
  • Prs derived from Bacillus subtilis (BAA05286), Homo sapiens (NP_002755)
  • Ppk Ppk2 class 3
  • Rbk derived from Saccharomyces cerevisiae (P 25332)
  • NMN synthesis reaction The cell-free extract prepared in (4) was used to carry out an NMN synthesis reaction.
  • the reaction liquid volume was 100 ⁇ L, each reaction liquid was prepared with the composition shown in Table 2 (Nos. 1-2, 1-4), and stationary reaction was performed at 37 ° C.
  • Comparative Example 1 ⁇ Synthesis of NMN from Ribose without Using ATP Regeneration System> (1) Preparation of recombinant, culture and preparation of cell-free extract In this comparative example, a cell-free extract of each enzyme was prepared by the same operation as in Example 1 (2) to (4).
  • Example 2 ⁇ Synthesis of NMN by Cryopreserved Cell-free Extract> (1) Preparation of recombinant, culture and preparation of cell-free extract In this example, the same as Example 1 (2) to (4) except using only Bacillus subtilis derived (BsPrs) as Prs. Cell-free extracts of each enzyme were prepared by the procedure. Immediately after preparation, the NMN synthesis reaction described later in (2) was performed. In addition, each obtained cell-free extract was stored at -20 ° C. One month later, the stored cell-free extract was used to perform the NMN synthesis reaction again.
  • BsPrs Bacillus subtilis derived
  • Example 3 ⁇ Synthesis of NMN Using Prs Mutant>
  • Nampt from Haemophilus ducreyi (AAR 87771)
  • Prs Bacillus subtilis (BAA05286) Asn120Ser mutant (BsPrsN120S) and Leu135Ile mutant (BsPrsL135I)
  • Ppk Ppk2 class 3: derived from Deinococcus radiodurans (NP_293858)
  • Rbk derived from Saccharomyces cerevisiae (P 25332)
  • BsPrsN120S and BsPrsL135I 120th asparagine is substituted to serine and 135th leucine to isoleucine.
  • the derived species of both mutants, SEQ ID NO showing the amino acid sequence, SEQ ID NO showing the base sequence of DNA, and expression plasmid name are shown in Table 4, respectively.
  • Prs Mutant Expression Plasmid A plasmid expressing Prs mutant was prepared as follows. Mutagenesis PCR reaction was performed using pEBsPrs described in Table 1 as a template. Table 5 shows the names of primers for introducing a mutation and SEQ ID NOs indicating the nucleotide sequences thereof, and the names of Prs mutants.
  • the mutagenic PCR reaction was carried out under the reaction solution composition shown in Table 6 and the reaction conditions shown in Table 7.
  • the PCR product was purified according to the attached protocol using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • E. coli HST08 (Takara Bio) was transformed using a reaction solution obtained by digesting the generated PCR product with DpnI (New England Biolabs). The extracted colonies were subjected to plasmid extraction, and the nucleotide sequences were confirmed using primers T7-PP (SEQ ID NO: 19) and T7-TP (SEQ ID NO: 20).
  • Each plasmid into which a mutation was correctly introduced was designated as each mutant Prs expression plasmid described in Table 4.
  • Example 4 ⁇ Examination of substrate concentration> (1) Preparation of recombinant, culture and preparation of cell-free extract In this example, the same as Example 1 (2) to (4) except that BsPrsN120S described in Example 3 is used as Prs. Cell-free extracts of each enzyme were prepared by the procedure.
  • Nampt Haemophilus ducreyi derived (AAR 87771) Nampt with His tag added (HdNampt-His), Deinococcus radiodurans derived (AE001890) Namt added with His tag (DrNampt-His), Shewanella oneidensis derived from (NP_717588) Nampt His tag added (SoNampt-His) and human (Homo sapiens) derived (NP_005737) Nampt added His tag (HsNampt-His) Prs: Asn120Ser mutant (BsPrsN120S) derived from Bacillus subtilis (BAA05286) Prs Ppk (Ppk2 class 3): derived from Deinococcus radiodurans (NP_293858) Ppk Rbk: derived from
  • a plasmid expressing a protein in which His tag was added to various Nampts derived from bacteria was prepared as follows. First, for each of the enzymes derived from Deinococcus radiodurans (AE001890) and Shewanella oneidensis (NP_717588), a DNA encoding each enzyme protein consisting of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO: listed in “Amino acid sequence” in Table 10 ( Were synthesized and cloned into the NdeI-XhoI site of the expression vector pET-26b (+) (Novagen) (gene synthesis is as described below) Conducted at Genscript Japan). The resulting plasmids were designated as indicated in Table 10 under "Expression Plasmids".
  • the mixed eluate was placed in a boiling and washed dialysis tube (Sanko Pure Chemical Industries, Ltd.) and dialyzed with 50 mM HEPES-NaOH buffer (pH 7.5). The solution after dialysis was collected and used as a purified enzyme solution of His-tagged Nampt derived from each bacterium.
  • Example 6 NMN Synthesis from R5P Using ATP Regeneration System (1) Preparation of recombinant, culture and preparation of cell-free extract
  • a cell-free extract of each enzyme was prepared by the same procedure as in Example 1 (2) to (4).
  • Example 7 ⁇ NMN synthesis using cell-free extract prepared in unwanted gene disruption host> (1) Preparation of unwanted gene disruption host In order to suppress the decomposition or side reaction of the reactant (substrate) NAM and the product NMN, the gene encoding each enzyme causing decomposition or side reaction is disrupted The host shown in Table 14 was produced.
  • the generation of the unwanted gene disrupting host was basically performed according to the attached protocol using TargeTron Gene Knockout System (Sigma Aldrich).
  • BN1 strain in which the ushA gene was disrupted using E. coli BL21 (DE3) as a host was prepared as follows. First, using the primers shown in SEQ ID NO: 31 (IBS primer), SEQ ID NO: 32 (EBS1d primer) and SEQ ID NO: 33 (EBS2 primer), and the EBS Universal primer attached to TargeTron Gene Knockout System, the reaction liquid composition shown in Table 15 And PCR was performed on the reaction conditions shown in Table 16.
  • PCR reaction After completion of the PCR reaction, 3 ⁇ L of the reaction solution was electrophoresed on a 4% agarose gel to confirm amplification of the approximately 350 bp DNA fragment.
  • the remaining PCR reaction was purified by QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). To 8 ⁇ L of the purified PCR reaction solution, 2 ⁇ L of 103 Restriction Enzyme Buffer (provided with the kit), 1 ⁇ L of HindIII, 1 ⁇ L of BsrGI, and 8 ⁇ L of sterile water were added. After digestion for 30 minutes at 37 ° C., followed by 30 minutes at 60 ° C., treatment was carried out at 80 ° C. for 10 minutes.
  • the resulting digested product (3 ⁇ l) was heat-treated at 60 ° C. for 30 seconds, and then cooled on ice for 1 minute. After 1 ⁇ L of pACD4K-C Linear Vector (supplied with the kit) and 4 ⁇ L of DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (Takara Bio) were added and mixed, a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 1 hour. 5 ⁇ L of the ligation reaction mixture was mixed with 50 ⁇ L of E. coli JM109 competent cells (Takara Bio), and allowed to stand on ice for 30 minutes. After incubating for 45 seconds at 42 ° C., it was again placed on ice for 5 minutes.
  • the resulting plasmid DNA was digested with HindIII, and electrophoresed on a 1% agarose gel, and the plasmid for which a band of about 7.7 kbp was identified was designated as pACD4K-C-ushA.
  • SEQ ID NO: 34 (pACD4K-C-dKm-F2) and SEQ ID NO: 35 (pACD4K-C-dKm) using pACD4K-C-ushA as a template.
  • SEQ ID NO: 34 (pACD4K-C-dKm-F2) and SEQ ID NO: 35 (pACD4K-C-dKm) using pACD4K-C-ushA as a template.
  • a PCR reaction was performed under the reaction liquid composition shown in Table 17 and the reaction conditions shown in Table 18.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 34 had a 5 'end phosphorylated.
  • the resulting plasmid DNA was digested with MluI and electrophoresed on a 1% agarose gel, and the plasmid in which a band of about 6.3 kbp was identified was designated as pACD4K-C-ushA ⁇ Km.
  • the Colony PCR was performed using a Forward primer (SEQ ID NO: 36) and a Reverse primer (SEQ ID NO: 37) on a plurality of emerging colonies.
  • the reaction liquid composition was as shown in Table 19, and the reaction conditions were as shown in Table 18.
  • the original host (BL21 (DE3)) amplified a band of about 1.1 kbp, whereas a clone was obtained in which a band of about 1.8 kbp was amplified.
  • strain BN1 This clone was designated as strain BN1 as a host in which the ushA gene was disrupted.
  • E. Competent cells of strain BN1 were prepared using E. coli Transformation Kit, Mix & Go (ZYMO RESEARCH) according to the attached protocol.
  • a BN3 strain in which the pncA gene was disrupted using the BN1 strain as a host was prepared as follows. Reaction liquid composition and table shown in Table 15 using each primer shown in SEQ ID NO: 38 (IBS primer), SEQ ID NO: 39 (EBS1d primer) and SEQ ID NO: 40 (EBS2 primer) and EBS Universal primer attached to TargeTron Gene Knockout System PCR was performed under the reaction conditions shown in 16. Purification of the PCR reaction solution, restriction enzyme treatment with HindIII and BsrGI, ligation reaction with vector pACD4K-C, transformation of E.
  • coli JM109 and plasmid extraction were performed in the same manner as in the BN1 strain preparation.
  • the resulting plasmid DNA was digested with HindIII and electrophoresed on a 1% agarose gel, and the plasmid for which a band of about 7.7 kbp was identified was designated as pACD4K-C-pncA.
  • a plasmid for pncA gene disruption that did not contain the kanamycin resistance gene was prepared. The same procedure as in the preparation of pACD4K-C-ushA ⁇ Km was performed except that pACD4K-C-pncA was used as a template for PCR reaction. The resulting plasmid was designated pACD4K-C-pncA ⁇ Km.
  • BN3 strain in which the pncA gene was disrupted was prepared.
  • the procedure was the same as the preparation of the BN1 strain described above except that pACD4K-C-pncA ⁇ Km was used as the gene disruption plasmid and BN1 strain competent cells were used as the competent cells.
  • Colony PCR was performed using the Forward primer (SEQ ID NO: 41) and the Reverse primer (SEQ ID NO: 42) for the multiple colonies that appeared.
  • the reaction liquid composition was as shown in Table 19, and the reaction conditions were as shown in Table 18.
  • the original host (BL21 (DE3)) amplified a band of about 2.2 kbp, whereas a clone was obtained in which a band of about 2.9 kbp was amplified.
  • This clone was designated as strain BN3 as a host in which the ushA gene and the pncA gene were disrupted.
  • E. Competent cells of BN3 strain were prepared using E. coli Transformation Kit, Mix & Go (ZYMO RESEARCH) according to the attached protocol.
  • BN6 strain in which the pncC gene was disrupted using the BN3 strain as a host was prepared as follows. Reaction liquid composition and table shown in Table 15 using each primer shown in SEQ ID NO: 43 (IBS primer), SEQ ID NO: 44 (EBS1d primer) and SEQ ID NO: 45 (EBS2 primer) and EBS Universal primer attached to TargeTron Gene Knockout System PCR was performed under the reaction conditions shown in 16. Purification of the PCR reaction solution, restriction enzyme treatment with HindIII and BsrGI, ligation reaction with vector pACD4K-C, transformation of E.
  • coli JM109 and plasmid extraction were performed in the same manner as in the BN1 strain preparation.
  • the obtained plasmid DNA was digested with HindIII, and electrophoresed on a 1% agarose gel, and the plasmid in which a band of about 7.7 kbp was confirmed was designated as pACD4K-C-pncC.
  • a plasmid for pncC gene disruption that did not contain the kanamycin resistance gene was prepared. The same procedure as in the preparation of pACD4K-C-ushA ⁇ Km was performed except that pACD4K-C-pncC was used as a template for PCR reaction. The resulting plasmid was designated pACD4K-C-pncC ⁇ Km.
  • a BN6 strain in which the pncC gene was disrupted was prepared using the BN3 strain as a host. The procedure was the same as that for the BN1 strain described above, except that pACD4K-C-pncC ⁇ Km was used as a gene disruption plasmid. Colony PCR was performed using a Forward primer (SEQ ID NO: 46) and a Reverse primer (SEQ ID NO: 47) for a plurality of emerging colonies. The reaction liquid composition was as shown in Table 19, and the reaction conditions were as shown in Table 18.
  • the original host (BL21 (DE3)) amplified a band of about 0.5 kbp, whereas a clone was obtained in which a band of about 1.2 kbp was amplified.
  • This clone was designated as strain BN6 as a host in which the ushA gene, the pncA gene and the pncC gene were disrupted.
  • E. Competent cells of BN6 strain were prepared using E. coli Transformation Kit, Mix & Go (ZYMO RESEARCH) according to the attached protocol.
  • BN8 strain in which the yrfG gene was disrupted using BN6 strain as a host was prepared as follows. Reaction liquid composition and table shown in Table 15 using each primer shown in SEQ ID NO: 48 (IBS primer), SEQ ID NO: 49 (EBS1d primer) and SEQ ID NO: 50 (EBS2 primer) and EBS Universal primer attached to TargeTron Gene Knockout System PCR was performed under the reaction conditions shown in 16. Purification of the PCR reaction solution, restriction enzyme treatment with HindIII and BsrGI, ligation reaction with vector pACD4K-C, transformation of E.
  • coli JM109 and plasmid extraction were performed in the same manner as in the BN1 strain preparation.
  • the resulting plasmid DNA was digested with HindIII and electrophoresed on a 1% agarose gel, and the plasmid for which a band of about 7.7 kbp was confirmed was designated as pACD4K-C-yrfG.
  • a plasmid for yrfG gene disruption not containing the kanamycin resistance gene was prepared. The same procedure as in the preparation of pACD4K-C-ushA ⁇ Km was performed except that pACD4K-C-yrfG was used as a template for PCR reaction. The resulting plasmid was designated pACD4K-C-yrfG ⁇ Km.
  • BN8 strain in which the yrfG gene was disrupted was prepared.
  • the procedure was the same as the preparation of the BN1 strain described above, except that pACD4K-C-yrfG ⁇ Km was used as the gene disruption plasmid and that the BN6 strain competent cell was used as the competent cell.
  • Colony PCR was performed using a Forward primer (SEQ ID NO: 51) and a Reverse primer (SEQ ID NO: 52) on a plurality of emerging colonies.
  • the reaction liquid composition was as shown in Table 19, and the reaction conditions were as shown in Table 18.
  • the original host (BL21 (DE3)) amplified a band of about 0.4 kbp, whereas a clone was obtained in which a band of about 1.1 kbp was amplified.
  • This clone was designated as strain BN8 as a host in which the ushA gene, the pncA gene, the pncC gene and the yrfG gene were disrupted.
  • E. Competent cells of BN8 strain were prepared using E. coli Transformation Kit, Mix & Go (ZYMO RESEARCH) according to the attached protocol.
  • Example 3 BsPrsN120S described in Example 3 is used as Prs, and as a host for enzyme expression described in Example (1).
  • Cell-free extracts of each enzyme were prepared in the same manner as in Example 1 (2) to (4) except that strains BN3 and BN8 were used.
  • the number of moles of added ATP (0.01 ⁇ mol) was 0.043 equivalent of the number of moles of NMN (0.23 ⁇ mol) formed. Also in the case of using the cell-free extract prepared with BN8 strain in which the ushA gene, pncA gene, pncC gene and yrfG gene were disrupted as a host (Sample No. 7-3), the generation of 2.3 mM NMN was similarly recognized It was done.
  • the number of moles of added ATP (0.01 ⁇ mol) was 0.043 equivalent of the number of moles of NMN (0.23 ⁇ mol) formed. That is, when the production of NMN proceeds, using cell-free extract prepared with BN3 strain and BN8 strain as host is more effective than using cell-free extract prepared with BL21 (DE3) as host. It turned out that the amount of production goes up.
  • the step of appropriately recovering the generated NMN is carried out at a time (for example, 6 hours) before the decomposition of the NMN proceeds, the generated NMN can be produced regardless of which host cell-derived extract is used. It can be acquired properly.
  • Nampt (AAR87771) Nampt derived from Haemophilus ducreyi with His tag added (HdNampt-His)
  • Prs An Asn120Ser mutant of Bacillus subtilis (BAA05286) Prs with His tag added (BsPrsN120S-His)
  • Ppk (Ppk2 class 3): Deinococcus radiodurans origin (NP_293858) Ppk with His tag added (DrPpk-His)
  • Rbk Saccharomyces cerevisiae-derived (P25332)
  • Rbk with His tag added (ScRbk-His)
  • a plasmid expressing a protein in which His tag was added to Prs, Ppk and Rbk was prepared as follows. Using pEBsPrsN120S prepared in Example 3 and pEDrPpk and pEScRbk prepared in Example 1 as templates, a mutagenic PCR reaction for adding a His tag to each enzyme was performed. Table 21 shows the name of the template plasmid, the name of the primer for introducing a mutation, the SEQ ID NO showing the nucleotide sequence thereof, and the name of the His-tagged enzyme expression plasmid.
  • NMN synthesis reaction analysis of NMN Using various purified enzymes obtained in (3), an NMN synthesis reaction in the presence or absence of PPase (from yeast, Sigma-Aldrich, product number 10108987001) and Analysis was carried out.
  • SEQ ID NO: 15 Primer for introducing a mutation in Prs mutant BsPrsN120S (forward)
  • SEQ ID NO: 16 Primer for introducing a mutation in Prs mutant BsPrsN120S (reverse)
  • SEQ ID NO: 17 Primer for introducing a mutation in Prs mutant BsPrsL135I (forward)
  • SEQ ID NO: 18 Primer for introducing a mutation in Prs mutant BsPrsL135I (reverse)
  • SEQ ID NO: 19 Primer T7-PP SEQ ID NO: 20: Primer T7-TP
  • SEQ ID NO: 25 Primer for introducing a mutation into His-tagged Nampt expression plasmid pEHdNampt-His (forward)
  • SEQ ID NO: 26 Primer for introducing a mutation into His-tagged Nampt expression plasmid pEHdNampt-His (reverse)
  • SEQ ID NO: 27 Primer for mutagenesis of

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Abstract

本発明は、生産効率に優れたニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法を提供することを課題とする。本発明（第一の発明群）に係るＮＭＮの製造方法は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の各酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、ＡＴＰ、およびポリリン酸を含む混合物と接触させる工程を含む。

Description

ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法およびその方法に用いる形質転換体
　本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチド等の核酸系化合物の製造方法に関する。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の合成中間体である。近年、ＮＭＮはＮＡＤ＋への変換を通じて長寿遺伝子「サーチュイン」の活性をコントロールすること、ＮＭＮをマウスに投与すると抗老化作用が示されることが明らかにされた。さらに、ＮＭＮは糖尿病、アルツハイマー病、心不全などの疾患の予防や症状の改善に効果があることも報告されている。このようなＮＭＮには、機能性食品、医薬品、化粧品等の成分としての用途が期待されており、生産性の向上を目指して、効率的な製造方法の研究開発が進められている。
　特許文献１には、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を過剰発現させた細胞（酵母、細菌等）を単離し、その細胞をニコチンアミド（ＮＡＭ）の存在化で培養する、ＮＭＮの製造方法が記載されている（請求項１，１３，１５等）。Ｎａｍｐｔは、ＮＡＭと細胞内で生合成されるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）とからＮＭＮを生成する酵素である。特許文献１には、ＰＲＰＰの生合成を促進するため、前記細胞にさらにホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）を過剰発現させることも記載されている（請求項３等）。Ｐｒｓは、リボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）およびＡＴＰから、ＰＲＰＰおよびＡＭＰを生成する酵素である。特許文献１では、特定の酵素を過剰発現する細胞を生かした状態で、炭素源、窒素源等を含有する培地で培養させながら、生体内での酵素反応によりＮＭＮ等の目的化合物を生成させている。
　特許文献２には、反応生成物に対する感受性が弱められた（つまり、Ｐｒｓにより生成するＰＲＰＰによる負のフィードバックを受けにくいため、系内へのＰＲＰＰの供給量を増加させることができる）Ｐｒｓ変異体を用いた、ＮＡＤ前駆体の合成システムが記載されている（請求項１、段落００６８等）。このＰｒｓ変異体は、組換え体において生成され、単離、精製されたものであってもよいことも記載されている（請求項６等）。特許文献２には、システムがさらにＮａｍｐｔ、ＡＴＰ、Ｒ５Ｐ、ＰＲＰＰを含んでいてもよいことも記載されている（請求項１０、２０、２１、２３等）。
　一方、非特許文献１には、リボキナーゼ（Ｒｂｋ、当該文献ではＲＫと表記されている）、Ｐｒｓ（同じくＰＰＳと表記されている）およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（８Ｂ３）の３つの酵素を用いて、リボースからイノシン一リン酸（ＩＭＰ）を合成する方法が記載されている。Ｒｂｋは、リボースおよびＡＴＰからＲ５ＰおよびＡＤＰを生成する反応（i）に関与し、Ｐｒｓは、Ｒ５ＰおよびＡＴＰからＰＲＰＰおよびＡＭＰを生成する反応（ii）に関与し、８Ｂ３は（iii）ＰＲＰＰおよびイノシン酸からＩＭＰおよびピロリン酸（ＰＰｉ）を生成する反応に関与する。上記の非特許文献１に記載の方法では、反応（ii）で生成するＡＭＰから、アデニル酸キナーゼによりＡＤＰが再生される。また、その再生されたＡＤＰおよび反応（i）で生成するＡＤＰから、ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼにより、ＡＴＰが再生される。
　特許文献３には、単独でＡＭＰからＡＴＰを合成可能な酵素であるポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）２型を、ポリリン酸およびＡＭＰと反応させる、ＡＴＰの製造方法が記載されている。そのようなポリリン酸キナーゼ２型として、好熱菌（Thermosynechococcus elongatus等）に由来する、特定のアミノ酸配列を有するポリリン酸キナーゼが開示されている。特許文献３にはさらに、ＡＴＰを利用して物質（目的化合物）を製造する方法において、上記のＡＴＰの製造方法を同時に実施することにより、目的化合物の合成反応とＡＴＰの再生反応を共役させ、ＡＭＰから再生されたＡＴＰが目的化合物の合成に利用されるようにすることも記載されている。
　特許文献４には、７０℃、１０分間の熱処理でも失活しない好熱菌由来のＰｐｋの遺伝子を含む大腸菌を、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる、６０～８０℃で加熱して、大腸菌の細胞膜が破壊された状態で、ＡＴＰの再生反応を行う方法が記載されている。
　特許文献５には、ＮＡＭ、ＡＴＰおよびリボースを原料とし、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、リボースリン酸ピロリン酸キナーゼおよびリボースキナーゼの触媒作用下で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法が記載されている。
　非特許文献２には、好熱菌由来のＰｐｋおよびそれによるＡＴＰ再生系を利用した、グリセロール三リン酸の合成方法が記載されている。その方法では、グリセロール、ＡＤＰ、ポリリン酸、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、Ｐｐｋ等を含む緩衝液を初発反応液として用い、逐次ポリリン酸を添加しながら、反応を進行させている。
　非特許文献３には、Streptococcus sanguinis由来のグルタチオンシンターゼ（ＧｓｈＦ）と、特許文献３に記載されているものと同様の活性を有する、好熱菌Thermosynechococcus elongates BP-1由来のＰｐｋによるＡＴＰ再生系とを共役させた、カスケード反応によるグルタチオンの製造方法が記載されている。
国際公開２０１５／０６９８６０号 国際公開２０１６／１９８９４８号 特開２０１３－０２１９６７号 特開２００７－１４３４６３号 国際公開２０１７／１８５５４９号
Scism, Robert A. and Bachmann, Brian O. "Five‐component cascade synthesis of nucleotide analogues in an engineeredself‐immobilized enzymeaggregate." ChemBioChem 11.1 (2010): 67-70. Restiawaty, Elvi et al. "Feasibility ofthermophilic adenosine triphosphate-regeneration system using Thermusthermophilus polyphosphate kinase." Process Biochemistry 46.9 (2011):1747-1752. Zhang, Xing et al. "One-pot synthesis ofglutathione by a two-enzyme cascade using a thermophilic ATP regenerationsystem." Journal of Biotechnology 241 (2017): 163-169.
　しかしながら、特許文献１～５および非特許文献１～３に開示された方法は、ＮＭＮを効率的に製造するうえで問題があり、優れた方法とは言えない。具体的には、特許文献１では、特定の酵素を過剰発現する細胞を生かした状態で、炭素源、窒素源等を含有する培地で培養させながら、生体内での酵素反応によりＮＭＮを生成させているが、その生成量は３００ｎｍｏｌ－ＮＭＮ／ｇ－酵母湿菌体重量（実施例１）である。仮に、酵母乾燥菌体重量／酵母湿菌体重量の比が０．２と仮定すると、約０．５ｇ－ＮＭＮ／ｋｇ―酵母乾燥菌体重量となり、生成量が低いという問題がある。
　特許文献２には、反応生成物に対する感受性が弱められたＰｒｓ変異体を用いた、ＮＡＤ前駆体の合成システムが記載されている。しかし、ＮＭＮの生成を示す実施例は記載されておらず、具体的なＮＭＮの製造方法や生成量は示されていない。
　特許文献３には、単独でＡＭＰからＡＴＰを合成可能な酵素であるポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）２型をポリリン酸およびＡＭＰと反応させるＡＴＰの製造方法と、目的化合物の合成反応とを共役させる、物質の製造方法が記載されている。しかし、具体的なＮＭＮの製造方法や生成量は示されていない。
　特許文献４には、好熱菌由来のＰｐｋの遺伝子を含む大腸菌を加熱して、大腸菌の細胞膜が破壊された状態で、ＡＴＰの再生反応を行う方法が記載されているが、具体的なＮＭＮの製造方法や生成量は示されていない。
　特許文献５には、ニコチンアミド、ＡＴＰおよびリボースを原料とし、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、リボースリン酸ピロリン酸キナーゼおよびリボースキナーゼの触媒作用下で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法が記載されている。しかし、特許文献５では、ＮＭＮの製造に多量のＡＴＰを使用している。具体的には、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰのモル数が、生成するＮＭＮのモル数の２倍以上となっている。ＡＴＰは高価な原料であるため、コスト的に効率的な製造方法とは言えない。
　従って、これまでにも多くのＮＭＮの製造法は示されているが、ＮＭＮの生成量およびＮＭＮの製造ために必要となるＡＴＰの量の観点から、いずれも十分なものではなかった。
　本発明は、生産効率に優れたニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて酵素反応を進行させた場合（図１参照）、従来の方法よりも効率的に、また安価にＮＭＮを生産することができることを見出した。さらに、前記Ｒ５Ｐを、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて製造する場合は、一層効率的かつ安価にＮＭＮを生産することができることを見出し、第一の発明群を完成させるに至った。
　また、本発明者らは、ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）の存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させて酵素反応を進行させた場合、従来の方法よりも効率的にＮＭＮを生産することができることを見出し、第二の発明群を完成させるに至った。
　さらに、本発明者らは、（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させることで、ＮＭＮの分解を顕著に抑制しながら、効率的にＮＭＮを生産することができることを見出し、第三の発明群を完成させるに至った。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
　さらに、本発明者らは、単独または複数の手段の組み合わせにより、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にすることができることを見出し、第四の発明群を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は下記［項１］～［項１７］に関する。
［項１］
　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
［項２］
　リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、項１に記載のＮＭＮの製造方法。
［項３］
　実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、項１または２に記載のＮＭＮの製造方法。
［項４］
　前記Ｎａｍｐｔがバクテリア由来のものである、項１～３のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項５］
　前記Ｐｐｋが、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーである、項１～４のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項６］
　前記Ｐｐｋが、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーのクラス３サブファミリー（Ｐｐｋ２クラス３）である、項１～５のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項７］
　前記形質転換体の宿主が、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、または酵母である、項１～６のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項８］
　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体。
［項９］
　リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体。
［項１０］
　ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）の存在下で、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
［項１１］
　実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、項１０に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１２］
　前記処理物が精製酵素である、項１０または１１に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１３］
　前記Ｎａｍｐｔがバクテリア由来のものである、項１０～１２のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１４］
　（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させる工程を含む、ＮＭＮの製造方法。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
［項１５］
　反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、項１～１４のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１６］
　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）およびホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびＡＴＰと接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法であって、反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、ＮＭＮの製造方法。
［項１７］
　リボキナーゼ（Ｒｂｋ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボースおよびＡＴＰと接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、項１６に記載のＮＭＮの製造方法。
　本発明の第一の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、ＮＭＮの生産量を従来よりも飛躍的に向上させる（例えば、特許文献１に記載された生産量の１０倍以上にする）ことが可能となる。また、ＡＴＰ再生反応を利用する本発明の製造方法により、ＰＲＰＰのように高価な中間体やＡＴＰを多量に投入せずとも、より安価なＲ５Ｐまたはリボースを原料としてＮＭＮを生産することができるため、生産コストの抑制も可能となる。
　本発明の第二の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、第３反応を効率的に進行させることができる。これにより、ＮＭＮの生産量や生成速度を向上させることが可能になり、ＮＭＮの生産コストを抑制することができる。
　本発明の第三の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物を用いてＮＭＮの生成反応を行う際、生成物であるＮＭＮの分解を抑制することができる。これにより、安価な触媒形態である菌体や無細胞抽出物などを用いて、高い収率でＮＭＮを生産することが可能になり、ＮＭＮの生産コストを抑制することができる。
　本発明の第四の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、ＮＭＮの製造のために添加するＡＴＰの量を削減することができる。ＡＴＰは高価であるため、これにより、ＮＭＮの生産コストを抑制することができる。
図１は、本発明のＮＭＮの製造方法において進行する反応を示した概略図である。 図２は、実施例１および比較例２におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。 図３は、実施例３におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。 図４は、実施例４におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。 図５は、実施例５におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。 図６は、実施例６および比較例２におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。 図７は、実施例７におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。 図８は、実施例８におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。 図９は、ＮＭＮの分解経路を示す図である。
　本明細書で用いられる略語の定義はそれぞれ次の通りである。
　Ｎａｍｐｔ（Nicotinamide phosphoribosyltransferase）：ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ
　Ｐｒｓ（Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase）：ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ
　Ｒｂｋ（Ribokinase）：リボキナーゼ
　Ｐｐｋ（Polyphosphate kinase）：ポリリン酸キナーゼ
　ＰＰａｓｅ（Pyrophosphatase）：ピロホスファターゼ
　ＮＭＮ（Nicotinamide mononucleotide）：ニコチンアミドモノヌクレオチド
　ＰＲＰＰ（Phosphoribosyl pyrophosphate）：ホスホリボシルピロリン酸
　ＮＡＭ（Nicotinamide）：ニコチンアミド
　Ｒ５Ｐ（Ribose-5-phosphate）：リボース－５－リン酸
　ＮＲ（Nicotinamide riboside）：ニコチンアミドリボシド
　ＮａＭＮ（Nicotinic acid mononucleotide）：ニコチン酸モノヌクレオチド
　ＮＡＤ（Nicotinamide adenine dinucleotide）：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
　ＰＰｉ（Pyrophosphate）：ピロリン酸
　ＰｏｌｙＰ（Polyphosphate）：ポリリン酸
　－第一の発明群－
　本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第一の発明群は、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させる工程を含む。好ましくは、本発明のＮＭＮの製造方法は、前記Ｒ５Ｐの製造工程として、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸を含む混合物と接触させる工程をさらに含む。つまり、本発明では、ＡＴＰ再生反応を利用しながら、所定の酵素反応を進行させることによりＮＭＮを製造する。
　このような第一の発明群のＮＭＮの製造方法は、典型的には、下記（１）～（３）の工程（本明細書において、それぞれ第１工程、第２工程および第３工程と称する）を順次行うことにより実施される。これらの工程は、同一の者が実施してもよいし、異なる者が実施してもよい。また、これらの工程は、連続的に行ってもよいし、各工程の間に所定の期間をおいて段階的に行ってもよい。
（１）Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋの各酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる工程（第１工程）；
（２）必要に応じ、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液から、処理物を調製する工程（第２工程）；および
（３）第１、第２工程を経た形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、各基質化合物と接触させる工程（第３工程、図１参照）。
　以下、本発明のＮＭＮの製造方法について、第１工程、第２工程および第３工程を行う実施形態に沿って、さらに詳細に説明する。ただし、本発明のＮＭＮの製造方法は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、以下に具体的に記載する第１工程、第２工程および第３工程を適宜改変した実施形態で行うことも可能である。
　［第１工程］
　第１工程は、Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋの各酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる工程である。
　（酵素）
　本発明では、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋと、必要によりさらにＲｂｋの４酵素を利用する。Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＰｐｋおよびＲｂｋはいずれも既知の酵素であり、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は当業者であれば容易に入手可能である。上記所定の４酵素は、それぞれの目的反応を触媒することができるものであれば、天然型の酵素であってもよいし、天然型の酵素のアミノ酸配列を改変することにより作製された、好ましくは発現量や酵素活性が向上した、変異型の酵素であってもよい。また、精製の簡略化や可溶性発現の促進、抗体による検出等を目的として、各酵素には種々のタグ（タンパク質またはペプチド）が付加されていてもよい。タグの種類としては、Ｈｉｓタグ（ヒスチジンタグ）、Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）－ｔａｇ、ＧＳＴタグ（グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼタグ）、ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質タグ）、ＧＦＰタグ（緑色蛍光タンパク質タグ）、ＳＵＭＯタグ（Ｓｍａｌｌ　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ（ｌｉｋｅ）　Ｍｏｄｉｆｉｅｒタグ）ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ等が挙げられる。さらに、４酵素は、互いに融合タンパク質として発現されていてもよい。
　・Ｎａｍｐｔ
　Ｎａｍｐｔ（EC number: 2.4.2.12）は、一般的にＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）サルベージ経路に関与することが知られており、本発明において、ＰＲＰＰおよびＮＡＭからＮＭＮを生成させる反応（第３反応）のために利用される酵素である。ＮａｍｐｔによるＰＲＰＰとＮＡＭからのＮＭＮ合成反応において、本来、ＡＴＰは必須ではない。しかし、ＮａｍｐｔにはＡＴＰ加水分解活性があり、ＡＴＰの加水分解によってＮａｍｐｔが自己リン酸化されることで、ＮＭＮ生成に有利な方向に酵素学的パラメータや化学平衡が変化することが報告されている（Biochemistry 2008, 47, 11086-11096）。
　Ｎａｍｐｔとしては、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_005737）、マウス（Mus musculus）由来のもの（NP_067499）、ラット（Rattus norvegicus）由来のもの（NP_808789）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）由来のもの（NP_997833）、Haemophilus ducreyi（AAR87771）、Deinococcus radiodurans（AE001890）、Oenococcus oeni（KZD13878）、Shewanella oneidensis（NP_717588）等バクテリア由来のものが挙げられる。本発明では、第３反応における酵素活性に優れることから、バクテリア由来のものを用いることが好ましい。ここで、バクテリアとは、核膜を有さない原核生物の一群であり、大腸菌、枯草菌、シアノバクテリアなどを含む生物群である。
　・Ｐｒｓ
　Ｐｒｓ（EC number: 2.4.2.17）は、本発明において、Ｒ５ＰおよびＡＴＰからＰＲＰＰおよびＡＭＰを生成させる反応（第２反応）のために利用される酵素である。
　Ｐｒｓとしては、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（BAA05286）、Bacillus caldolyticus由来のもの（CAA58682）、Arabidopsis thaliana由来のもの（Q680A5）、Methanocaldococcus jannaschii由来のもの（Q58761）が挙げられる。長時間にわたって、特に製造系内の基質濃度が高い場合に、第２反応によるＰＲＰＰの生成およびそれに続く第３反応によるＮＭＮの生成を継続させる（つまり最終産物であるＮＭＮの製造系内の濃度を上昇させ続ける）ことができるよう、特許文献２に記載されているような変異型Ｐｒｓを用いることもできる。変異型Ｐｒｓとしては、例えば、ヒト由来のＰｒｓについての、Ａｓｐ５１Ｈｉｓ（５１位のＡＳＰのＨｉｓへの置換、以下同様）、Ａｓｎ１１３Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅ、Ａｓｐｌ８２Ｈｉｓ、Ａｌａ１８９Ｖａｌ、およびＨｉｓｌ９２Ｇｌｎなどの変異型、ならびにそれらに対応する他の生物由来のＰｒｓにおける変異型、例えば、枯草菌由来のＰｒｓについて、Ａｓｎ１２０Ｓｅｒ（上記Ａｓｎ１１３Ｓｅｒに対応）、Ｌｅｕ１３５Ｉｌｅ（上記Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅに対応）などの変異型が挙げられる。
　・Ｒｂｋ
　Ｒｂｋ（EC number: 2.7.1.15）は、本発明において、リボースおよびＡＴＰからＲ５ＰおよびＡＤＰを生成させる反応（第１反応）のために利用される酵素である。Ｒｂｋとしては、各種の生物に由来する天然型Ｒｂｋ、またはそのアミノ酸配列を改変して作製された変異型Ｒｂｋを用いることができ、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のもの（P25332）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（P36945）、大腸菌（Escherichia coli）由来のもの（AAA51476）、Haemophilus influenzae由来のもの（P44331）が挙げられる。
　・Ｐｐｋ
　Ｐｐｋ（EC number: 2.7.4.1）は、本発明において、第１反応で生成するＡＤＰまたは第２反応で生成するＡＭＰと、ポリリン酸とから、ＡＴＰを再生する反応（ＡＴＰ再生反応）のために利用される酵素である。
　Ｐｐｋはアミノ酸配列およびキネティクスの違いにより２つのファミリー、ポリリン酸キナーゼ１型ファミリー（Ｐｐｋ１）およびポリリン酸キナーゼ２型ファミリー（Ｐｐｋ２）に分類することができる。ポリリン酸を基質としてＡＴＰを再生する活性としては、Ｐｐｋ１よりもＰｐｋ２のほうが高い。従って、本発明におけるＰｐｋとしては、Ｐｐｋ２を用いることが好ましい。
　Ｐｐｋ２はさらに、３つのサブファミリー、クラス１、クラス２およびクラス３に分類することができる。クラス１およびクラス２のＰｐｋ２はそれぞれ、ＡＤＰをリン酸化してＡＴＰを生成する反応、およびＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する反応を触媒する。これに対してクラス３のＰｐｋ２は、ＡＭＰのリン酸化反応およびＡＤＰのリン酸化反応の両方を触媒することができるため、単独でＡＭＰからＡＴＰを生成することができる。
　本発明におけるＰｐｋとしては、ＡＤＰからＡＴＰを再生するためのＰｐｋ２クラス１と、ＡＭＰからのＡＤＰを再生するためのＰｐｋ２クラス２の組み合わせを用いることができる。または、ＡＭＰからのＡＤＰを再生するためにアデニル酸キナーゼ（ＡＭＰ＋ＡＴＰ→２ＡＤＰという反応を触媒する）を併用する場合は、ＡＤＰからＡＴＰを再生するためのＰｐｋ２クラス１またはＰｐｋ１のみを本発明におけるＰｐｋとして用いることも可能である。しかし、ＡＤＰからのＡＴＰの再生と、ＡＭＰからのＡＴＰの再生の、両方の反応を単独で触媒することができるという効率性の良さから、Ｐｐｋ２クラス３を用いることが好ましい。このようなＰｐＫを用いる場合は、第１反応のＰｐｋと第２反応のＰｐｋを共通化することができる。
　Ｐｐｋ２クラス３としては、例えば、Deinococcus radiodurans由来のもの（NP_293858）、Paenarthrobacter aurescens由来のもの（ABM08865）、Meiothermus rube由来のもの（ADD29239）、Deinococcus geothermalis由来のもの（WP_011531362）、Thermosynechococcus elongatus由来のもの（NP_682498）が挙げられる。一方、Ｐｐｋ２クラス１としては、例えばRhodobacter sphaeroides由来のもの（CS253628）、Sinorhizobium meliloti由来のもの（NP_384613）、Pseudomonas aeruginosa由来のPA0141（NP_248831）、Pseudomonas aeruginosa由来のPA2428（NP_251118）、Francisella tularensis由来のもの（AJI69883）が挙げられる。Ｐｐｋ２クラス２としては、例えばPseudomonas aeruginosa由来のPA3455（NP_252145）が挙げられる。また、アデニル酸キナーゼとしては、例えばBacillus cereus由来のもの（AAP07232）が挙げられる。
　（形質転換体）
　本発明で用いられる形質転換体は、形質転換を行う前の（野生型の）細胞ないし菌体と比較して、所定の各酵素の発現が強化されたものである。「発現が強化された」とは、各酵素の発現量がどの程度強化されたかを意味するかは一概に決定されるものではなく、後述するように各酵素の反応溶媒中（製造系内）の濃度が適切な範囲となるよう、形質転換体における発現量は調節することができるが、少なくとも、人為的な操作によって、形質転換を行う前の（野生型の）細胞ないし菌体よりも発現が強化されていればよい。人為的な操作としては、特に限定されず、次に述べるように発現ベクターを利用する、ゲノム上に所定の酵素をコードする遺伝子発現ユニットを多コピー導入する、元々ゲノム上に存在する所定の酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なものに置き換える等の操作が挙げられる。
　本発明で用いられる形質転換体は、（i）所定の各酵素をコードする遺伝子の全てを含む形質転換体のみから構成されていてもよいし、（ii）所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士の組み合わせとして、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓの発現が強化された形質転換体およびＰｐｋの発現が強化された形質転換体からなる組み合わせによって、構成されていてもよい。
　形質転換体の宿主は、発現ベクター等を利用したタンパク質発現システムによって所定の酵素を発現することができる細胞であれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、放線菌（例えばロドコッカス属（Rhodococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium））などの細菌；酵母（例えばサッカロマイセス属（Saccharomyces）、キャンディダ属（Candida）、ピキア属（Pichia））；糸状菌；植物細胞；昆虫細胞、哺乳類細胞などの動物細胞が挙げられる。これらの中でも、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌およびロドコッカス属細菌、ならびにサッカロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母およびピキア属酵母が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　大腸菌としては、例えば、大腸菌Ｋ１２株およびＢ株、ならびにそれらの野生株由来の派生株であるＷ３１１０株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ株（例えば、ＸＬ１－ＢｌｕｅＭＲＦ'）、Ｋ８０２株、Ｃ６００株、ＢＬ２１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株等が挙げられる。
　発現ベクターを用いる場合は、本発明で用いる所定の各酵素の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。発現ベクターの構成の詳細については後述する。
　宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法が挙げられる。
　発現ベクターが導入された形質転換体は、宿主として用いた細胞（菌体）に適した方法で培養して、所定の各酵素を発現させればよい。前述したように、所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士を組み合わせる場合、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓの発現が強化された形質転換体とＰｐｋの発現が強化された形質転換体を作製して組みあわせる場合は、それぞれの形質転換体を同一の培地で培養してもよいし、別々の培地で培養した後に混合してもよい。
　形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物（詳細は後記第２工程に関する事項を参照）を用いてＮＭＮの生成反応を行う場合、反応物（基質）であるリボースやＮＡＭ、生成物であるＮＭＮの分解または副反応が起き、ＮＭＮが効率的に製造できないことがある。その場合、分解や副反応の原因となる遺伝子を破壊または欠失させた宿主を用いることができる。具体的には、以下の（ａ）～（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子が、欠損または破壊されている宿主を用いることができる。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｂ）EC 3.5.1.19
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｄ）EC 3.5.1.42
（ｅ）EC 1.17.2.1
（ｆ）EC 1.17.1.5
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
　（ａ）EC 3.1.3.5に分類される酵素は、5'-nucleotidaseであり、ＮＭＮを加水分解してニコチンアミドリボシド（ＮＲ）とリン酸を生成する反応を触媒する酵素を含む。5'-nucleotidaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｕｓｈＡ、ｓｕｒＥ、ｙｒｆＧ、ｙｊｊＧ等が挙げられる。例えば、Enzyme and Microbial Technology, 58-59(2014), 75-79には、大腸菌におけるＮＡＤ分解の主要な役割を担う酵素として、5'-nucleotidaseであるＵｓｈＡが報告されており、同酵素がＮＭＮ分解活性を有することが開示されている。本発明において破壊または欠失させる5'-nucleotidaseとしては、特にｕｓｈＡまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
　（ｂ）EC 3.5.1.19に分類される酵素は、nicotinamidaseであり、ＮＡＭの分解に関与する。nicotinamidaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｐｎｃＡが挙げられる。
　（ｃ）EC 2.4.2.1に分類される酵素は、purine-nucleoside phosphorylaseであり、ＮＲを加リン酸分解して、ＮＡＭとリボース－１－リン酸（Ｒ１Ｐ）とを生成する反応を触媒する酵素を含む。purine-nucleoside phosphorylaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｄｅｏＤが挙げられる。Molecular and General Genetics, 104(1969), 351-359には、ヌクレオシドの代謝に関する遺伝子群の一つとして、ｄｅｏＤが開示されている。本発明において破壊または欠失させるpurine-nucleoside phosphorylaseとしては、ｄｅｏＤまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
　（ｄ）EC 3.5.1.42に分類される酵素は、nicotinamide mononucleotide
deamidaseであり、ＮＭＮを加水分解して、ＮａＭＮとアンモニアを生成する酵素である。nicotinamide mononucleotide deamidaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｐｎｃＣが挙げられる。THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 286(2011), 40365-40375には、Shewanella oneidensisおよび大腸菌のｐｎｃＣに関する知見が開示されている。本発明において破壊または欠失させるnicotinamide mononucleotide deamidaseとしては、ｐｎｃＣまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
　（ｅ）EC 1.17.2.1および（ｆ）EC 1.17.1.5に分類される酵素は、nicotinate dehydrogenaseであり、ＮＡＭからのヒドロキシニコチン酸の副生に関与する可能性が考えられる。
　（ｇ）EC 3.2.2.1に分類される酵素は、purine nucleosidaseであり、ＮＲを加水分解して、ＮＡＭとリボースを生成する反応を触媒する酵素を含む。purine nucleosidaseをコードする遺伝子としては、例えば、Ochrobactrum anthropiのＰｕ－Ｎが挙げられる（Applied and Environmental Microbiology, 67(2001), 1783-1787）。本発明において破壊または欠失させるpurine nucleosidaseとしては、Ｐｕ－Ｎまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
　（ｈ）EC 3.2.2.3に分類される酵素は、uridine nucleosidaseであり、ＮＲを加水分解して、ＮＡＭとリボースを生成する反応を触媒しうる酵素を含む。uridine nucleosidaseをコードする遺伝子としては、例えば、Arabidopsis thalianaのＵＲＨ１が挙げられる（Plant Cell, 21(2009), 876-91）。本発明において破壊または欠失させるuridine nucleosidaseとしては、ＵＲＨ１またはそのホモログ遺伝子が好ましい。
　（ｉ）EC 3.2.2.14に分類される酵素は、NMN nucleosidaseであり、ＮＭＮを加水分解して、ＮＡＭとＲ５Ｐを生成する反応を触媒する酵素である。Biochem. Biophys. Res. Commun., 49(1972), 264-9には、大腸菌のNMN nucleosidase活性が開示されている。本発明においては、NMN nucleosidase活性を有する酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させることが好ましい。
　欠損または破壊されるのは、（ｄ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とであることが好ましく、（ｄ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、（ａ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とであることがより好ましい。詳細は、後述する第三の発明群の説明に記載する。
　遺伝子を破壊または欠失させる方法は、特段限定されるものではなく、公知の遺伝子破壊または欠失方法で行うことができる。例えば、線状にした遺伝子破壊または欠失用断片を用いる方法、複製起点を含まない環状の遺伝子破壊または欠失プラスミドを用いる方法、グループIIイントロンを用いる方法、Ｒｅｄ－ＥＴ相同組換え法、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集を用いる方法などが挙げられる。
　（発現ベクター）
　本発明で用いられる、所定の各酵素をコードする遺伝子は、典型的には、発現ベクターに含まれた状態で形質転換体の宿主に導入される。一つの形質転換体において２つ以上の酵素を発現させる場合、１つの発現ベクターに、発現させる各酵素をコードする遺伝子の全てが含まれていてもよいし、宿主内で共存可能な２以上の発現ベクターに、発現させる各酵素をコードする遺伝子が適宜振り分けられて含まれていてもよい。例えば、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの発現が強化された形質転換体を作製する場合、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋをコードする遺伝子全てが含まれる１つの発現ベクターを用いてもよいし、ＮａｍｐｔとＰｒｓをコードする遺伝子を含む発現ベクターとＰｐｋをコードする遺伝子を含む発現ベクターの２つのベクターの組み合わせによって構成されていてもよい。
　本発明で用いられる発現ベクターは、公知の手法により作製することができる。一般的には、所定の酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入すればよい。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、そのベクターの転写プロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に所定の酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。上述したように、１つの発現ベクターに２つ以上の酵素をコードする遺伝子を含める場合、それらの遺伝子は全て同一のプロモーター下に挿入されていてもよいし、異なるプロモーター下に挿入されていてもよい。プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌宿主において利用できるのものとしては、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来ＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターが挙げられる。
　所定の各酵素をコードする遺伝子（核酸）は、例えば、（i）塩基配列情報に従い、プライマーを作製し、ゲノム等を鋳型として増幅することによって得ることもできるし、（ii）酵素のアミノ酸配列情報に従い、有機合成的にＤＮＡを合成することによって得ることもできる。形質転換体の宿主となる細胞に応じて、遺伝子は最適化されていてもよい。
　発現ベクターに所定の酵素をコードする遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入してもよい。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。また、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含めることが好ましい。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
　発現ベクターは、宿主に応じて、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどから選ばれる適切なものを用いればよい。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス）、ｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン）、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン）、ｐＥＴシリーズベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）などを挙げることができる。また２以上の挿入箇所を有するベクターとしてはｐＥＴＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）等を挙げることができる。必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
　所定の酵素の発現を強化する方法としては、上述のような発現ベクターを用いる方法が典型的であるが、それ以外の方法を利用することもできる。例えば、所定の酵素をコードする遺伝子に、適切なプロモーターやターミネーター、マーカー遺伝子等を連結させた発現カセットを宿主のゲノム上に挿入することで、所定の酵素の発現を強化することができる。発現カセットがゲノム上に挿入された形質転換体を取得する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、相同組換えにより発現カセットをゲノム上に挿入する場合は、所定の酵素の発現カセットと任意のゲノム領域の配列を有し、宿主内で複製不可能なプラスミドを用いて形質転換を行うことで、当該プラスミド全体または発現カセットが挿入された形質転換体を得ることができる。その際、ＳａｃＢ遺伝子（レバンスクラーゼをコード）等のネガティブ選択マーカーを搭載したプラスミドや、複製機構が温度感受性（ｔｓ）のプラスミドを用いることで、２回の相同組換えにより発現カセットのみがゲノム上にされた形質転換体を効率的に取得することもできる。また、発現カセットのみから成るＤＮＡ断片を用いて形質転換を行うことで、ゲノム上のランダムな位置に発現カセットが挿入された形質転換体を得ることもできる。
　また、所定の酵素として宿主がゲノム上に元々有する酵素（内因性酵素）を利用する場合は、ゲノム上の当該酵素遺伝子のプロモーターを強力なものに置換することで、その発現を強化することもできる。プロモーターとしては、上述した発現ベクターにおいて用いるプロモーターを同様に利用することができる。
　（無細胞タンパク質合成反応液）
　無細胞タンパク質合成系は、生きた微生物や細胞等ではなく、種々の生物から抽出した無細胞抽出物に、アミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー分子、エネルギー再生系、マグネシウムイオン等の塩類、そして、発現させたいタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を添加した無細胞タンパク質合成反応液により、タンパク質を試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で合成するシステムである。無細胞抽出物には、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子などの翻訳成分が含まれる。本明細書中では、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成反応を行うための溶液を、反応の前後を含めて、無細胞タンパク質合成反応液と呼ぶ。
　本発明で用いる無細胞タンパク質合成系としては、所定の各酵素が本来の機能を有する状態で発現することができるものであればいかなる系でもよいが、例えば、コムギ胚芽由来合成系、大腸菌由来合成系、ウサギ網状赤血球由来系、昆虫細胞由来合成系、ヒト細胞由来合成系を用いることができる。また、必要な可溶性タンパク質因子を組換えタンパク質として調製するＰＵＲＥ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）　Ｓｙｓｔｅｍ等を用いてもよい。無細胞系でのタンパク質合成反応プロセスとしては、バッチ法、ＣＦＣＦ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ－Ｆｌｏｗ　Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ）法、ＣＥＣＦ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ）法、重層法等を用いることができる。また、発現させる酵素遺伝子の鋳型としては、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。鋳型としてＲＮＡを用いる場合は、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写産物などを用いることができる。
　［第２工程］
　第２工程は、必要に応じ、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液から処理物を調製する工程である。形質転換体の処理物としては、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体等が挙げられる。また、破砕菌体から調製した無細胞抽出物および精製酵素も本発明の処理物に含まれる。無細胞タンパク質合成反応液の処理物としては、無細胞タンパク質合成反応液から調製した精製酵素が挙げられる。さらには、形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液およびこれら処理物に対して安定化処理を行った安定化処理物も、本発明の処理物に含まれる。
　休止菌体の調製は、公知の方法を用いて行うことができる。休止菌体とは、その増殖が実質的に停止した状態に置かれた菌体を意味する。具体的には、培養により増殖させた形質転換体を培地から回収した後、形質転換体が容易に利用可能な炭素源等を含まない緩衝液等に懸濁したり、回収した形質転換体を凍結させたり、乾燥させて粉末化したりすることにより調製することができる。形質転換体を培地から回収する方法は如何なる方法でもよく、例えば、遠心分離を用いた方法、膜ろ過を用いた方法等が挙げられる。遠心分離は、形質転換体を沈降させる遠心力が供給できるものであれば特に限定されることはなく、円筒型や分離板型などを利用することができる。遠心力としては、例えば、５００Ｇ～２０，０００Ｇ程度で行うことができる。膜ろ過は、形質転換体を培地から回収することができれば、精密ろ過（ＭＦ）膜、限外ろ過（ＵＦ）膜いずれを用いて行ってもよい。形質転換体を懸濁する緩衝液としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれるものであれば如何なるものでもよく、例えば、リン酸緩衝液、アクリル酸緩衝液、トリス（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）‐塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２－（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）やその他グッドの緩衝液（Ｇｏｏｄ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒｓ）等を用いることができる。形質転換体を凍結する場合は、上記の遠心分離等の操作により大半の水分を除去した状態、または適当な緩衝液に懸濁された状態で凍結すればよい。凍結する温度は、形質転換体を懸濁する緩衝液の成分によっても異なるが、実質的に形質転換体が凍結する温度であれば如何なる温度でもよく、例えば、－２１０℃～０℃等の範囲で行えばよい。また、形質転換体を乾燥する場合、その乾燥方法としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれる方法であれば如何なる方法でもよく、凍結乾燥法や噴霧乾燥法等が挙げられる。
　膜透過性向上菌体の調製は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、有機溶媒や界面活性剤で形質転換体を処理することにより、基質や生成物が、形質転換体の細胞膜や細胞壁を通過しやすくなる。使用する有機溶媒や界面活性剤の種類としては、膜透過性が向上し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれるものであれば特段限定されることはなく、有機溶媒であればトルエンやメタノール等、界面活性剤であればＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ　１００や塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
　不活化菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば薬剤処理や加熱処理により行うことができる。薬剤による処理は、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤、塩酸アルキルジアミノエチルグリシンなどの両性イオン系界面活性剤などを用いることができる。また、エタノール等のアルコール類、２－メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン、シトルリン等のアミノ酸類なども挙げられる。加熱による処理は、目的の酵素が失活しない温度と時間で熱処理を行えばよい。
　破砕菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ビーズミルによる磨砕処理、衝撃破砕装置による衝突処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等が挙げられ、いずれかの方法を単独または必要に応じ組み合わせて利用することができる。工業的規模で細胞の破砕を行う場合は、操作性、回収率、コスト等を勘案し、例えば、高圧処理や磨砕処理、衝突処理あるいはこれら処理に酵素処理等を組み合わせた処理を行うことが好ましい。
　ビーズミルによる磨砕処理を行う場合、用いられるビーズは、例えば、密度２．５～６．０ｇ／ｃｍ３、サイズ０．１～１．０ｍｍのものを通常８０～８５％程度充填することにより破砕を行うことができ、運転方式としては回分式、連続式いずれをも採用することができる。
　高圧処理を行う場合、処理圧力は、細胞からの目的タンパク質回収率が十分高いものであれば特段限定されないが、例えば、４０～２００ＭＰａ程度、好ましくは６０～１５０ＭＰａ程度、より好ましくは８０～１２０ＭＰａ程度の圧力で破砕を行うことができる。必要に応じて、装置を直列に配置したり、複数ステージ構造の装置を用いたりすることにより、多段階処理を行い、破砕および操作効率を向上させることも可能である。通常、処理圧力１０ＭＰａあたり２～３℃の温度上昇が生じることから、必要に応じて冷却処理を行うことが好ましい。
　衝突処理の場合、例えば、細胞スラリーを予め噴霧急速凍結処理（凍結速度：例えば１分間当たり数千℃）等によって凍結微細粒子（例えば５０μｍ以下）にしておき、これを高速（例えば約３００ｍ／ｓ）の搬送ガスによって衝突板に衝突させることで効率的に細胞を破砕することができる。
　無細胞抽出物は、破砕菌体から破砕残渣（細胞膜や細胞壁等を含む不溶性画分）を除去することによって調製することができる。破砕残渣の除去は、公知の手法により行うことができ、例えば、遠心分離や膜ろ過、ろ布ろ過等を利用することができる。遠心分離操作は、上述したように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細であり、容易に沈降し難い場合は、必要に応じて凝集剤等を使用して残渣沈殿効率を上げることもできる。膜ろ過も、上述のように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細である場合には、特に限外ろ過（ＵＦ）膜を使用することができる。ろ布ろ過を行う場合には、ろ過助剤や凝集剤を併用して行うことができる。ろ過助剤としては、珪藻土やセルロースパウダー、活性炭などが挙げられる。凝集剤としては、カチオン系凝集剤、アニオン系凝集剤、両性系凝集剤、ノニオン系凝集剤等が挙げられる。上記いずれかの操作により、菌体が存在しない上清を回収し、無細胞化する（セルフリーにする）ことで、所定の各酵素を含む無細胞抽出物を調製することができる。
　精製酵素の調製は、一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム等）、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ等）、アフィニティークロマトグラフィー（ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ等）、疎水性クロマトグラフィー（ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ等）、陰イオンクロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱカラム等））、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を、単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。
　本発明においては、上述した形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、およびそれらの処理物に対して、安定化処理を行ったもの（安定化処理物）を用いることもできる。安定化処理は、未処理の状態よりも、環境因子（温度、ｐＨ、化学物質濃度等）に対する所定の各酵素の安定性、あるいは保存時の安定性が向上する処理であればいかなる処理でもよい。例えばアクリルアミド等のゲルへの包含、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類による処理（ＣＬＥＡ：Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅを含む）、無機担体（アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等）への担持処理等が挙げられる。
　本発明で用いる基質や生成物は、極性が比較的高く、細胞膜や細胞壁が物質移動の律速となる可能性がある。従って、基質や生成物の透過性の観点から、本発明では、特に、破砕菌体、無細胞抽出物、精製酵素、またはそれらの安定化処理物を用いることが好ましい。
　上述した形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物は、その酵素活性が保持される限り、如何なる条件で保存することもできる。所望により適切な条件下で（例えば－８０℃～－２０℃、１日～１年）それらの溶液を凍結し、使用時（第３工程の実施時）まで保存するようにしてもよい。
　前述したように、所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士を組み合わせる場合、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓの発現が強化された形質転換体およびＰｐｋの発現が強化された形質転換体を作製して組み合わせる場合は、（i）それぞれの形質転換体について別々に各処理を行ったのち、それらの処理物を混合するようにしてもよいし、（ii）それらの形質転換体を混合した後、一括して当該各処理を行ってもよい。
　［第３工程］
　第３工程は、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液、または必要に応じてさらに第２工程を経たそれらの処理物を、酵素反応の各種原料となる基質と接触させる工程である。この工程においては、Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応がＰｐｋによるＡＴＰ再生反応と共役して行われる。Ｐｒｓによる第２反応では、ＡＴＰをリン酸源として基質がリン酸化されるため、また、Ｎａｍｐｔによる第３反応では、Ｎａｍｐｔ自身が有するＡＴＰ加水分解活性により自己リン酸化されるため、ＡＴＰが消費される。従って、両反応をＡＴＰ再生反応と共役して行うことで、消費されたＡＴＰを補いながら効率的に反応を進行させることができる。また、Ｐｒｓによる第２反応の生成物であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）は比較的不安定な化合物であるため、第２反応と第３反応を同一系内で行うことで、ＰＲＰＰ生成後、速やかにＮａｍｐｔによる第３反応を行うことができる。本発明においては、ＡＴＰ再生反応によりＡＤＰおよび／またはＡＭＰからＡＴＰが再生されるので、ＡＴＰは枯渇することはないが、反応中に維持したいＡＴＰ濃度に応じて、適度な量のＡＴＰを反応溶媒中に添加することが必要となる。この際、必要に応じて、ＡＴＰの代わりに、ＡＤＰまたはＡＭＰを反応溶媒中に添加してもよい。添加したＡＤＰやＡＭＰは、ＡＴＰ再生系によって系内ですぐにＡＴＰに再生されるため、実質的に、適度な量のＡＴＰを添加したのと同じ状態になるためである。また、これらを任意の割合で含有する混合物を添加してもよい。
　第２反応および第３反応は、必要に応じて、ＰｐｋによるＡＴＰ再生反応を共役させたＲｂｋによる第１反応と組み合わせてもよい。両者を組み合わせる場合、Ｒｂｋによる第１反応をまず行い、その反応液を原料として、Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応を行ってもよいし、Ｒｂｋによる第１反応と、Ｐｒｓによる第２反応およびＮａｍｐｔによる第３反応を同じ反応系で行ってもよい。
　Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応は、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させることにより行われる。
　Ｒｂｋによる第１反応は、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させることにより行われる。
　第３工程で用いる上記原料は、一般的な供給業者から購入したものを用いることもできるし、自ら反応を行って合成したものを用いることもできる。例えば、Ｒ５Ｐは、市販品を用いることもできるが、原料コストの観点から、Ｒｂｋによる第１反応、すなわち、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボースおよびポリリン酸と接触させることにより合成したものを用いることが好ましい。
　上記原料の一つであるポリリン酸は、種々の鎖長のものが知られている。本発明において使用するポリリン酸の鎖長は、ＡＴＰ再生反応が効率的に行えるものであれば如何なる鎖長のものでもよいが、溶解した際の溶液の粘度やコストの観点から、鎖長は３～１００程度が好ましく、３～３０程度がさらに好ましい。
　第３工程では、必要に応じて、上記原料以外の化合物を、所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物と接触させ、あるいは反応溶媒中（製造系内）に含めるようにしてもよい。例えば、各酵素が機能を発揮するための成分として、マグネシウムイオン等の金属イオンを含めることが適切である。また、バッファー成分を含めることも好ましい。
　用いる形質転換体が実質的に生きている場合、すなわち、細胞増殖能を維持している場合、実質的に形質転換体が増殖しない条件で反応を行うことが好ましい。そのような条件で反応を行うことにより、本反応における基質や生成物が、形質転換体の増殖に利用されたり、分解されたりすることなく、高い収率で目的生成物として生産されることが期待できる。実質的に形質転換体が増殖しない条件とは、実質的に反応系内の形質転換体の数が増加しない条件であれば如何なる条件でもよい。例えば、形質転換体が容易に利用可能な炭素源（グルコース等）を含まない溶液中で反応を行うことが挙げられる。
　反応溶媒中（製造系内）に含まれる、所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物の量、すなわち、より具体的にはＮａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋそれぞれの量は、適宜調節することができる。同様に、反応媒体中に含まれる、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、ポリリン酸、リボース、さらに必要に応じて用いられるその他の原料の量も、適宜調節することができる。反応溶媒中（製造系内）の上記各物質の濃度は次の通りである。
　Ｎａｍｐｔの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌである。Ｐｒｓの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌである。Ｒｂｋの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌである。Ｐｐｋの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌである。所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物の反応溶媒への添加量を適宜調整することにより、各酵素の反応溶媒中の濃度を上記の範囲に調節することが可能である。
　Ｒ５Ｐの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。リボースの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。ＮＡＭの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～５００ｇ／Ｌである。ＡＴＰの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。ポリリン酸の濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌである。これらの原料の反応溶媒への添加量などの調整により、各原料の反応溶媒中の濃度を上記範囲に調節することが可能である。反応溶媒への添加は、原料に応じて、第３工程の最初に一括で所定量を仕込むようにしてもよいし、第３工程の最初および／または途中の適切な段階で、順次所定量を添加するようにしてもよい。
　上述したような各物質の濃度以外の、酵素反応を進行させるための条件、例えば温度、時間なども、適宜調節することができる。反応温度は、各酵素の触媒効率が最適となる範囲で調節することが好ましい。反応時間は、目的化合物であるＮＭＮの生成量が所定の量に到達するまでとすることができる。
　生成したＮＭＮは、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。回収・精製の方法は、ＮＭＮの純度を向上させることができ、かつ効率的にＮＭＮを回収することができる方法であれば、如何なる方法を用いることもできるが、例えば、以下のような方法が挙げられる。ＮＭＮ合成反応後、菌体を用いて反応を行った場合は、遠心分離や膜ろ過等の手段により、菌体を除去することができる。あるいは、無細胞抽出物や精製酵素を用いて反応を行った場合は、限外ろ過膜によるろ過や、過塩素酸等を添加して沈殿させた後に遠心分離を行うこと等によってタンパク質等を除去することができる。過塩素酸による処理を行った場合は、水酸化カリウムなどによりpHを弱酸性に戻し、生じた過塩素酸カリウムの沈殿を再度遠心分離により除去する。菌体またはタンパク質を除去した後、必要に応じて、活性炭吸着による洗浄処理を行うことができる。ＮＭＮを含む水溶液を活性炭と接触させ、ＮＭＮを吸着させる。ろ紙等を用いてＮＭＮが吸着した活性炭をろ過した後、イソアミルアルコール等の溶媒で洗浄することで、一定の不純物を除去することができる。続いて、陰イオン交換樹脂により処理することで、さらに精製を行うことができる。ＮＭＮを含む溶液をＤｏｗｅｘ等の陰イオン交換樹脂に通し、吸着されたＮＭＮを水で溶出することができる。さらに、得られたＮＭＮ水溶液のｐＨを酸性にし、大量のアセトンを加えることで、ＮＭＮを沈殿として得ることができる。この沈殿を乾燥することで、精製されたＮＭＮを得ることができる。
　本発明は、反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下となるように行うことができる。これを行うための手段としては、結果として、ＮＭＮ製造のために添加するＡＴＰ等の使用量を削減することができれば、如何なる方法を用いることもできるが、例えば、以下に示す手段を単独でまたは適宜組み合わせて、実施することができる。これら手段の詳細は、後述する第四の発明群の説明に記載する。
（１）ＡＴＰ再生系の共役
（２）ＰＰａｓｅの共存
（３）バクテリア由来Ｎａｍｐｔの利用
（４）不要遺伝子を破壊または欠失させた宿主の利用
（５）適切な基質濃度
　－第二の発明群－
　本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第二の発明群は、ＰＰａｓｅの存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させる工程を含む。
　第二の発明群によるＮＭＮの製造方法は、以下の点を除き、第一の発明群と同様に、第１工程、第２工程および第３工程を順次行うことにより実施される。すなわち、第１工程および第２工程は、少なくともＮａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、当該酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を調製するとともに、ＰＰａｓｅの発現が強化された形質転換体乃至は特段発現は強化されていないが内在性酵素としてＰＰａｓｅを発現している微生物等、当該酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を調製するための工程とし、第３工程において、そのような第１工程および第２工程を経た形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液またはそれらの処理物を、少なくともＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させればよい点である。
　・ＰＰａｓｅ
　ＰＰａｓｅ（EC number: 3.6.1.1）は、ピロリン酸を２分子のリン酸に加水分解する酵素である。本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第二の発明群では、ＰＰａｓｅの存在下で、第３反応を行うことにより、第３反応を極めて効率的に進行させることができる。
　Ｎａｍｐｔによる第３反応では、ＮＭＮとともにピロリン酸が副生する。一般的な酵素反応の見地からは、第３反応系にＰＰａｓｅを加えることで、副生物であるピロリン酸がリン酸に分解され、ＮＭＮ生成方向の反応が促進されることは予測される。しかし、Ｎａｍｐｔの場合、必ずしもそれは自明ではない。なぜならば、ピロリン酸を分解してしまうと、Ｎａｍｐｔ反応が継続的に進行しない可能性があるからである。Ｎａｍｐｔは、ＡＴＰを加水分解して、自己リン酸化によって活性化されることが知られている。Ｎａｍｐｔによる第３反応が継続するためには、反応毎に自己リン酸化されたＮａｍｐｔの脱リン酸化が必要であり、ピロリン酸は、その脱リン酸化のトリガー物質であるとされている（Biochemistry 47, 11086-11096(2008)）。従って、ＰＰａｓｅによりピロリン酸を除去してしまうと、Ｎａｍｐｔの脱リン酸化が起きず、反応が継続しない可能性が十分に考えられる。しかし、第二の発明群では、第３反応をＰＰａｓｅの存在下で行うことにより、顕著に第３反応を促進することができる。
　ＰＰａｓｅとしては、例えば、酵母由来のもの（P00817）、大腸菌由来のもの（NP_418647）、枯草菌由来のもの（P37487）、Thermus thermophilus由来のもの（P38576）、Streptococcus gordonii由来のもの（P95765）、Streptococcus mutans（O68579）などが挙げられる。
　ＰＰａｓｅは、第３反応系に加えることが可能であればいかなる形態でもよく、またいかなる方法で調製してもよい。具体的には、まず、第一の発明群における第１工程と同様に、ＰＰａｓｅをコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる。また、ＰＰａｓｅは、通常の微生物等においては、生存に必要な酵素として一定量発現しているため、特段発現が強化されていない微生物等を培養して、そのまま用いることができる。続いて、第一の発明群における第２工程と同様に、第１工程を経た形質転換体、特段発現が強化されていない微生物等または無細胞タンパク質合成反応液から処理物を調製することができる。あるいは、処理物の一態様として市販のＰＰａｓｅ精製酵素を利用することもできる。市販のＰＰａｓｅ精製酵素としては、シグマ・アルドリッチ社の酵母由来ＰＰａｓｅ精製酵素（製品番号10108987001）などが挙げられる。
　上記のようにして得られたＰＰａｓｅの存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させることで、第二の発明群によるＮＭＮの製造方法を実施することができる。第二の発明群により、第３反応を極めて効率的に進行させることができ、ＮＭＮを効率的に製造することができる。第二の発明群による第３反応は、第３反応単独で行うこともできるが、第１反応、第２反応およびＡＴＰ再生反応の一つ以上の反応と組み合わせて、同一の反応系で行うこともできる。換言すれば、本発明の第一の発明群における第３反応の実施形態を、本発明の第二の発明群で規定する第３反応とすることにより、第一の発明群および第二の発明群を統合したＮＭＮの製造方法を実施することも可能である。
　用いる形質転換体が実質的に生きている場合、すなわち、細胞増殖能を維持している場合、実質的に形質転換体が増殖しない条件で反応を行うことが好ましい。そのような条件で反応を行うことにより、本反応における基質や生成物が、形質転換体の増殖に利用されたり、分解されたりすることなく、高い収率で目的生成物として生産されることが期待できる。実質的に形質転換体が増殖しない条件とは、実質的に反応系内の形質転換体の数が増加しない条件であれば如何なる条件でもよい。例えば、形質転換体が容易に利用可能な炭素源（グルコース等）を含まない溶液中で反応を行うことが挙げられる。
　本発明における第２工程の形態としては、特に処理物が精製酵素であることが好ましい。精製酵素を用いることで、反応物（基質）や生成物の分解または副反応が抑制できるため、本発明による第３反応の促進効果をより享受することができる。
　－第三の発明群－
　本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第三の発明群は、（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させる工程を含む。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
　第三の発明群によるＮＭＮの製造方法は、以下の点を除き、第一の発明群と同様に、第１工程、第２工程および第３工程を順次行うことにより実施される。すなわち、第１工程および第２工程は、各種ＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子が破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を調製するための工程とし、第３工程において、そのような第１工程および第２工程を経た形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともＮＡＭと接触させればよい点である。
　各種ＥＣ番号に分類される酵素については、前述の通りである。大腸菌等の形質転換体またはそれらの処理物を用いてＮＭＮを合成する場合、これらの酵素は、生成したＮＭＮを分解し、結果としてＮＭＮの生産量を低下させる要因となる。宿主が有するＮＭＮの分解経路としては、ＮＡＭを生じる分解経路と、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）を生じる分解経路の２つが知られている（図９）。本発明者らは、両方の経路を弱化する（経路上にある一つ以上の酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失する）ことで、片方の経路を弱化するよりも、ＮＭＮの分解を飛躍的に抑制できることを見出し、第三の発明群を完成させた。
ＮＭＮからＮａＭＮを生じる分解経路を弱化するためには、図９に示すように、（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させればよい。
ＮＭＮからＮＡＭを生じる分解経路を弱化するためには、図９に示すように、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させればよい。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
　ＮＭＮの分解に直接的に関わる酵素であることから、（ａ）EC 3.1.3.5または（ｉ）EC 3.2.2.14に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させることが好ましく、（ａ）EC 3.1.3.5に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させることがより好ましい。
　遺伝子を破壊または欠失させる方法は、特段限定されるものではなく、第一の発明群の説明に記載した通りである。本発明の第三の発明群は、本発明の第一および第二の発明群の一方または両方に統合して、ＮＭＮの製造方法を実施することも可能である。
　－第四の発明群－
　本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第四の発明群では、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にすることができる。
　これまで述べてきた第１反応、第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においてはＡＴＰが必要となる。すなわち、第１反応では、リボースからのＲ５Ｐの生成に伴い、ＡＴＰがＡＤＰに変換されるため、１モルのＲ５Ｐの生成につき、１モルのＡＴＰが使用される。第２反応では、Ｒ５ＰからのＰＲＰＰの生成に伴い、ＡＴＰがＡＭＰに変換されるため、１モルのＰＲＰＰの生成につき、１モルのＡＴＰが使用される。第３反応では、ＰＲＰＰからのＮＭＮの生成に際し、その反応自体にＡＴＰは必須ではない。しかし、先述のように、ＮａｍｐｔにはＡＴＰ加水分解活性があり、ＡＴＰの加水分解によってＮａｍｐｔが自己リン酸化され、ＮＭＮ生成に有利な方向に酵素学的パラメータや化学平衡が変化する。従って、第３反応系内にＡＴＰが十分に存在する場合は、ＰＲＰＰからのＮＭＮの生成に伴い、実質的に、１モルのＰＲＰＰの生成につき、１モル以上のＡＴＰが使用されることになる。すなわち、Ｒ５Ｐを原料とした第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においては、１モルのＮＭＮの生成につき、計２モル以上のＡＴＰが、リボースを原料とした第１反応、第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においては、１モルのＮＭＮの生成につき、計３モル以上のＡＴＰが使用されることになる。
　ＡＴＰは高価な化合物であるため、ＮＭＮを安価に製造しようとする場合、その使用量はできるだけ少ないほうが望ましい。本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第四の発明群を利用することで、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にすることができる。
　第四の発明群によるＮＭＮの製造方法は、ＮＭＮ製造のために添加するＡＴＰ等の使用量を削減することができれば、如何なる方法を用いて行うこともできるが、例えば、以下に示す手段を、単独でまたは適宜組み合わせて、実施することができる。
（１）ＡＴＰ再生系の共役
　副生したＡＤＰまたはＡＭＰをＡＴＰに再生することができる系を、少なくとも、第２反応および第３反応を含むＮＭＮ生成反応系と共役させることで、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。ＡＴＰ再生系としては、ＡＭＰおよびＡＤＰからＡＴＰを再生できる系であればいかなる系でもよく、例えば、ポリリン酸をリン酸源としてＰｐｋを用いる系、ホスホエノールピルビン酸をリン酸源としてピルビン酸キナーゼを用いる系、クレアチンリン酸をリン酸源としてクレアチンリン酸キナーゼを用いる系等が挙げられるが、リン酸源のコストの観点からは、ポリリン酸をリン酸源としてＰｐｋを用いる系が好ましい。ポリリン酸とＰｐｋを用いたＡＴＰ再生系を共役させたＮＭＮ生成反応は、具体的には、第一の発明群における第３工程に記載されたように実施することができる。
（２）ＰＰａｓｅの共存
　ＮＭＮ生成反応系にＰＰａｓｅを共存させることにより、副生物であるピロリン酸がリン酸に分解され、ＮＭＮ生成方向の反応が促進されることで、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。ＰＰａｓｅを共存させたＮＭＮ生成反応は、具体的には、第二の発明群に記載されたように実施することができる。
（３）バクテリア由来Ｎａｍｐｔの利用
　第３反応を触媒する酵素Ｎａｍｐｔとして、バクテリア由来のＮａｍｐｔを用いることにより、ＮＭＮの生成が効率的に進行し、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。バクテリア由来のＮａｍｐｔとしては、第一の発明群における第１工程に記載されたものを利用することができる。
（４）不要遺伝子を破壊または欠失させた宿主の利用
　形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物を用いてＮＭＮの生成反応を行う場合、反応物（基質）や生成物の分解、あるいは副反応の原因となる遺伝子を破壊または欠失させた宿主を用いることができる。具体的には、第一の発明群における第１工程に記載された遺伝子のいずれか一つ以上を、破壊または欠失させた宿主を用いることができる。好ましくは、第三の発明群に記載された遺伝子破壊または欠失させた宿主を用いることができる。
（５）適切な基質濃度
　化学平衡や酵素の基質親和性の観点から、反応系内のリボースやＮＡＭ濃度を高めることによって、ＮＭＮ生成速度や生成量の向上が期待でき、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。一方、ＡＴＰも、反応系内の濃度を高めることによって、同様の効果は期待できるが、必要以上にＡＴＰを添加しても、それに見合ったＮＭＮ生成量の増加がなければ、ＮＭＮを１モル生成させるために用いるＡＴＰのモル数は増加してしまう。すなわち、適切な量のＡＴＰを反応系に添加することで、効率的にＮＭＮを製造することができる。反応系に添加するＡＴＰのモル数は、生成するＮＭＮのモル数の１当量以下が好ましく、０．５当量以下がより好ましく、０．１当量以下がさらに好ましい。
　本発明の第四の発明群は、本発明の第一、第二および第三の発明群の一つまたは二つ以上に統合して、ＮＭＮの製造方法を実施することも可能である。
［実施例１］＜ＡＴＰ再生系を利用したリボースからのＮＭＮ合成＞
　本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
　Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）
　Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）、Homo sapiens由来（NP_002755）
　Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）
　Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）
　（１）発現プラスミドの作製
　各酵素の発現プラスミドを以下のように作製した。表１の「由来」に記載された生物種由来の各酵素について、同表中の「アミノ酸配列」に記載された各配列番号で示されるアミノ酸配列から成る各酵素タンパク質をコードするＤＮＡ（表１の「塩基配列」に記載された各配列番号で示される塩基配列から成る）を合成し、それぞれ発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ－ＸｈｏＩサイトにクローニングした（遺伝子合成はジェンスクリプトジャパンで実施、大腸菌発現用にコドンを最適化）。得られた各プラスミドを、表１の「発現プラスミド」に示されるように命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）各酵素の発現が強化された形質転換体の作製
　大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテントセル（Ｚｉｐ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　ＢＬ２１　（ＤＥ３）、フナコシ）を氷上で融解し、（１）で作製した各プラスミドＤＮＡ溶液を混合して氷上で１０分間静置した。４２℃で４５秒間ヒートショックを加えた後、再度氷冷し、ＳＯＣ培地を添加した。３７℃で１時間振とう培養を行った後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌ含有）に塗布し、３７℃で一晩静置培養を行った。得られたコロニーを各酵素の発現が強化された組換え体とした。
　（３）組換え体の培養
　各酵素の発現が強化された組換え体のコロニーを、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　１（Ｍｅｒｃｋ）を添付プロトコールに従って添加したＬＢ培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む）２ｍｌに植菌した。温度３７℃、振とう回転数２００ｒｐｍで３時間培養を行った後、温度１７℃、回転振とう数２００ｒｐｍに変更して、さらに１８時間培養を行った。
　（４）無細胞抽出物の調製
　（３）で得られた培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、１０分間）し、上清を廃棄した。沈殿した菌体に、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ　７．５）を添加し、波長６３０ｎｍの濁度が１０となるように調整した。ただし、Ｐｒｓ発現菌体については、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて行った。バッファー菌体懸濁液０．５ｍｌをＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（コスモバイオ）で１５分間破砕した。破砕液を遠心分離（５，０００×ｇ、１０分間）し、得られた上清を無細胞抽出物とした。無細胞抽出物のタンパク質濃度は、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、バイオラッド）を標準タンパク質として、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ（バイオラッド）を用いて測定した。
　（５）ＮＭＮ合成反応
　（４）で調製した無細胞抽出物を用いてＮＭＮ合成反応を行った。反応液量を１００μＬとし、表２（Ｎｏ．１－２、１－４）に示す組成で各反応液を調製し、３７℃で静置反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　反応開始直後（０時間後）、３時間後および６時間後に、反応液１０μＬずつをサンプリングした。サンプリングした反応液を（６）に記載するＨＰＬＣ移動相９０μＬと混合し、すぐに氷冷することで反応を停止した。希釈液を限外ろ過膜（セントリカット超ミニ、分画分子量１０，０００、クラボウ）でろ過し（５，０００×ｇ、１０分間）、ろ液をＨＰＬＣで分析した。
　（６）ＮＭＮの分析
　ＮＭＮ合成反応サンプルの分析は、ＨＰＬＣにより以下の条件で行った。
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ　ＬＣ－１８－Ｔ（シグマ・アルドリッチ）
移動相：０．０５Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ　７）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２６１ｎｍ
カラム温度：３０℃
　（７）実験結果
　実験結果を図２に示す。Ｐｐｋを添加したサンプルＮｏ．１－２とＮｏ．１－４では、それぞれ０．５ｍＭ、０．６ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０５μｍｏｌ、０．０６μｍｏｌ）のそれぞれ０．２当量、０．１７当量であった。また、Ｐｒｓは、Bacillus subtilis由来（ＢｓＰｒｓ）、Homo sapiens由来（ＨｓＰｒｓ）のいずれでもＮＭＮが生成することが確認された。以上の結果から、ＡＴＰ再生酵素であるＰｐｋを共存させることで、リボースから効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。
［比較例１］＜ＡＴＰ再生系を利用しないリボースからのＮＭＮ合成＞
　（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　本比較例では、実施例１（２）～（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。
　（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。反応液量を１００μＬとし、表２（Ｎｏ．１－１、１－３）に示す組成で各反応液を調製すること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
　（３）実験結果
　実験結果を図２に示す。Ｐｐｋを添加しなかったサンプルＮｏ．１－１およびＮｏ．１－３では、ＮＭＮの生成は検出限界以下であった。
［実施例２］＜冷凍保存した無細胞抽出物によるＮＭＮの合成＞
　（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　本実施例では、ＰｒｓとしてBacillus subtilis由来（ＢｓＰｒｓ）のみを用いること以外は、実施例１（２）～（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。調製直後に、（２）で後述するＮＭＮ合成反応を行った。また、得られた各無細胞抽出物を－２０℃で保存した。１か月間後、保存しておいた無細胞抽出物を用いて、再度ＮＭＮ合成反応を行った。
　（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（１）で得られた調製直後および１か月間保存後（－２０℃保存）の無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表３に示す組成で調製すること、および反応開始後６時間でサンプリングすること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（３）実験結果
　無細胞抽出物を－２０℃で保存したＮｏ．２－２は、無細胞抽出物調製直後のサンプルＮｏ．２－１と同様、反応６時間後で０．５ｍＭのＮＭＮ生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０５μｍｏｌ）の０．２当量であった。従って、凍結保存することで、ＮＭＮ合成能を有した状態で、無細胞抽出物が保存可能であることが示された。
［実施例３］＜Ｐｒｓ変異体を利用したＮＭＮの合成＞
　本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
　Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）
　Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）Ａｓｎ１２０Ｓｅｒ変異体（ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ）およびＬｅｕ１３５Ｉｌｅ変異体（ＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉ）
　Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）
　Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）
　ＢｓＰｒｓＮ１２０ＳおよびＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉは、１２０番目のアスパラギンがセリンに、１３５番目にロイシンがイソロイシンにそれぞれ置換されている。両変異体の生物種由来、アミノ酸配列を示す配列番号、ＤＮＡの塩基配列を示す配列番号、発現プラスミド名をそれぞれ表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（１）Ｐｒｓ変異体発現プラスミドの作製
　Ｐｒｓ変異体を発現するプラスミドを以下のように作製した。表１に記載したpEBsPrsを鋳型として、変異導入ＰＣＲ反応を行った。変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Ｐｒｓ変異体名を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　変異導入ＰＣＲ反応は、表６に示す反応液組成および表７に示す反応条件にて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＰＣＲ反応終了後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、添付プロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製した。生成したＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した反応液を用いて、大腸菌ＨＳＴ０８（タカラバイオ）を形質転換した。出現したコロニーからプラスミド抽出を行い、プライマーＴ７－ＰＰ（配列番号１９）およびＴ７－ＴＰ（配列番号２０）を用いて塩基配列の確認を行った。正しく変異が導入された各プラスミドを表４に記載した各変異体Ｐｒｓ発現プラスミドとした。
　（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　Ｐｒｓとして、ＢｓＰｒｓＮ１２０ＳおよびＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉを用いること以外は、実施例１（２）～（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。
　（３）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表８に示す組成で調製すること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（４）実験結果
　実験結果を図３に示す。ＢｓＰｒｓＮ１２０ＳおよびＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉを用いた場合、反応６時間後には野生型よりも高いＮＭＮ生成量を示した。Ｐｒｓを添加しない場合、ＮＭＮの生成は認められなかった。以上の結果から、Ｐｒｓ変異体を用いることで、効率的にＮＭＮを合成できることが示された。
［実施例４］＜基質濃度の検討＞
　（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　本実施例では、Ｐｒｓとして、実施例３記載のＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓを用いること以外は、実施例１（２）～（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。
　（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表９に示す組成で調製すること、および反応開始後１８時間でサンプリングすること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（３）実験結果
　実験結果を図４に示す。ポリリン酸（Ｐｏｌｙ－Ｐ）濃度は１０ｍＭよりも５ｍＭとしたほうが、全体的にＮＭＮの生成量が多いことが確認された。ポリリン酸濃度が５ｍＭで、基質リボース濃度が３０ｍＭの場合、もう一つの基質であるニコチンアミド濃度は６ｍＭの場合（サンプルＮｏ．４－１、４－４）よりも２０ｍＭの場合（サンプルＮｏ．４－２、４－５）のほうが、ＮＭＮ生成量は１．７倍以上高くなることが確認された。ただし、マグネシウム濃度による影響はほとんど見られなかった。一方、両基質を同じ比率で２倍濃度とした場合（サンプルＮｏ．４－３、４－６）、マグネシウム濃度１０ｍＭ（サンプルＮｏ．４－３）ではＮＭＮ生成量は微増に留まったが、マグネシウム濃度２０ｍＭ（サンプルＮｏ．４－６）では、ＮＭＮ生成量が増加し、２．６ｍＭ生成した。サンプルＮｏ．４－６では、添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２６μｍｏｌ）の０．３８当量であった。以上の結果から、ＮＭＮの効率的な生成には、リボース、ニコチンアミド、ポリリン酸、マグネシウムの濃度を適切に設定することが重要であることが示された。
［実施例５］＜バクテリア由来およびヒト由来Ｎａｍｐｔ精製酵素を用いたＮＭＮ合成＞
　本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
　Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＨｄＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）、Deinococcus radiodurans由来（AE001890）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＤｒＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）、Shewanella oneidensis由来（NP_717588）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＳｏＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）およびヒト（Homo sapiens）由来（NP_005737）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＨｓＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）
　Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）ＰｒｓのＡｓｎ１２０Ｓｅｒ変異体（ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ）
　Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）Ｐｐｋ
　Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）Ｒｂｋ
　（１）Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ発現プラスミドの作製
　バクテリア由来の各種ＮａｍｐｔにＨｉｓタグが付加されたタンパク質を発現するプラスミドを以下のように作製した。まず、Deinococcus radiodurans由来（AE001890）およびShewanella oneidensis由来（NP_717588）の各酵素について、表１０中の「アミノ酸配列」に記載された各配列番号で示されるアミノ酸配列から成る各酵素タンパク質をコードするＤＮＡ（表１０の「塩基配列」に記載された各配列番号で示される塩基配列から成る）を合成し、それぞれ発現ベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ－ＸｈｏＩサイトにクローニングした（遺伝子合成はジェンスクリプトジャパンで実施）。得られた各プラスミドを、表１０の「発現プラスミド」に示されるように命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　続いて、作成したpEDrNampt、pESoNamptおよびpEHdNampt（実施例１記載）を鋳型として、ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加するための変異導入ＰＣＲ反応を行った。鋳型プラスミド名、変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ発現プラスミド名を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ発現プラスミドの作製は、表１１に示す各種鋳型プラスミドと変異導入プライマーを用いる以外は、実施例３（１）と同様の操作により、変異導入ＰＣＲ反応から塩基配列確認までを行った。正しくＨｉｓタグが付加されたプラスミドを表１１に記載した各プラスミドとした。
　（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　実施例４（１）と同様の操作により、各酵素を発現する組換え体の作製、培養および無細胞抽出物の調製を行った。ただし、バクテリア由来Ｎａｍｐｔについては、（１）で作製したＨｉｓタグ付加発現プラスミドを用いて組換え体の作製および培養を行い、Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔを含む無細胞抽出物を調製した。その際、菌体を懸濁するバッファーとしては、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ　８．０）を用いた。
　（３）Ｎａｍｐｔ精製酵素の調製
　（２）で調製したバクテリア由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔを含む無細胞抽出物を用いて、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔの精製を行った。ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ）２００μＬを１．５ｍｌチューブに採取し、遠心分離（５０００ｇ、２分間）により樹脂を沈殿させた。上清を捨て、蒸留水１ｍｌを加えて懸濁した後、再度遠心分離を行った。この一連の洗浄操作を計２回行った後、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ　８．０）を用いて同様に、２回洗浄を行った。洗浄後の樹脂に、各バクテリア由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔの無細胞抽出物１ｍｌを添加し、４℃で１時間穏やかに振とうした。遠心分離により無細胞抽出物を除いた後、Ｗａｓｈバッファー（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いて２回洗浄を行った。遠心分離によりＷａｓｈバッファーを除いた後、Ｅｌｕｔｉｏｎバッファー（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、１５０ｍＭ　イミダゾール、ｐＨ７．０）を１００μＬ添加した。遠心分離により上清を回収した後、再度、Ｅｌｕｔｉｏｎバッファーを１００μＬ添加した。この一連の操作を３回行い、得られた溶出液を混合した。混合した溶出液を、煮沸洗浄した透析チューブ（三光純薬）に入れ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ　７．５）を用いて透析を行った。透析後の溶液を回収し、各バクテリア由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔの精製酵素溶液とした。
　（４）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（２）で得られたＮａｍｐｔ以外の各酵素の無細胞抽出物と、Ｎａｍｐｔ精製酵素を用いてＮＭＮ合成反応および分析を行った。バクテリア由来のＮａｍｐｔ精製酵素としては、（３）で調製した３種のＨｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ精製酵素を用いた。ヒト由来Ｎａｍｐｔ精製酵素（ＨｓＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）としては、市販されているヒト由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ精製酵素（ＣＹ－Ｅ１２５１、ＭＢＬ）を用いた。各反応液を表１２に示す組成で調製すること、反応開始後１２時間にサンプリングすること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　（５）実験結果
　実験結果を図５に示す。バクテリア由来Ｎａｍｐｔ（ＨｄＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ、ＤｒＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ、ＳｏＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）を用いた場合、１．４ｍＭから２．４ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．１４～０．２４μｍｏｌ）の０．０４２～０．０７１当量であった。一方、ヒト由来Ｎａｍｐｔ（ＨｓＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）を用いた場合、ＮＭＮの生成量は０．６ｍＭであった。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０６μｍｏｌ）の０．１７当量であった。以上の結果から、バクテリア由来、ヒト由来いずれのＮａｍｐｔでもＮＭＮの合成は可能であるが、特にバクテリア由来Ｎａｍｐｔを用いることで、効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。
［実施例６］＜ＡＴＰ再生系を利用したＲ５ＰからのＮＭＮ合成＞
　（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　本実施例では、実施例１（２）～（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。
　（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。反応液量を１００μＬとし、表１３（Ｎｏ．６－２）に示す組成で各反応液を調製すること、およびサンプリングを反応開始直後（０時間後）と６時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（３）実験結果
　実験結果を図６に示す。Ｐｐｋを添加したサンプルＮｏ．６－２では、２．４ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２４μｍｏｌ）の０．０４２当量であった。以上の結果から、ＡＴＰ再生酵素であるＰｐｋを共存させることで、Ｒ５Ｐから効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。
［比較例２］＜ＡＴＰ再生系を利用しないＲ５ＰからのＮＭＮ合成＞
　（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　本比較例では、実施例１（２）～（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。
　（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。反応は、反応液量を１００μＬとし、表１３（Ｎｏ．６－１）に示す組成で各反応液を調製すること、およびサンプリングを反応開始直後（０時間後）と６時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
　（３）実験結果
　実験結果を図６に示す。Ｐｐｋを添加しなかったサンプルＮｏ．６－１では、ＮＭＮの生成は検出限界以下であった。
［実施例７］＜不要遺伝子破壊宿主で調製した無細胞抽出液を用いたＮＭＮ合成＞
　（１）不要遺伝子破壊宿主の作製
　反応物（基質）であるＮＡＭ、および生成物であるＮＭＮの分解または副反応を抑制するため、分解や副反応の原因となる各酵素をコードする遺伝子を破壊した表１４の宿主を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　不要遺伝子破壊宿主の作製は、ＴａｒｇｅＴｒｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（シグマ・アルドリッチ）を用い、基本的に添付プロトコールに従って行った。
　・ＢＮ１株の作製
　最初に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主としてｕｓｈＡ遺伝子が破壊された、ＢＮ１株を以下のように作成した。まず、配列番号３１（ＩＢＳプライマー）、配列番号３２（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号３３（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　ＰＣＲ反応終了後、反応液の３μＬを、４％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約３５０ｂｐＤＮＡ断片の増幅を確認した。残りのＰＣＲ反応液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。精製したＰＣＲ反応液８μＬに、１０３Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（キット添付）　２μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ　１μＬ、ＢｓｒＧＩ　１μＬ、滅菌水８μＬを加えた。３７℃で３０分間、続いて６０℃で３０分間消化を行った後、８０℃で１０分間処理を行った。得られた消化産物３μＬを６０℃で３０秒間熱処理した後、氷上で１分間冷却した。ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ　Ｌｉｎｅａｒ　Ｖｅｃｔｏｒ（キット添付）１μＬ、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ）４μＬを加えて混合した後、１６℃で１時間、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液５μＬを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）５０μＬと混合し、氷上で３０分間静置した。４２℃で４５秒間インキュベートした後、再び氷上で５分間静置した。ＳＯＣ培地を５００μＬ加え、３７℃で１時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った後、ＬＢ寒天培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に適量を塗布した。３７℃で一晩培養を行った後、生育したコロニーをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に植菌し、３７℃で１６時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。培養液を遠心して菌体を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従ってプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡとした。
　続いて、カナマイシン耐性遺伝子を含まないｕｓｈＡ遺伝子破壊用プラスミドを作製するため、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡを鋳型として、配列番号３４（ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｄＫｍ－Ｆ２）および配列番号３５（ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｄＫｍ－Ｒ）に示すプライマーを用いて、表１７に示す反応液組成および表１８に示す反応条件にて、ＰＣＲ反応を行った。なお、配列番号３４に示すプライマーは、5’末端にリン酸化修飾がされたものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　ＰＣＲ反応終了後、反応液に１μＬのＤｐｎＩ（タカラバイオ）を添加し、３７℃で１時間反応を行った。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した反応液２μＬに、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ）２μＬを加えて混合した後、１６℃で１時間、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液を、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）４０μＬと混合し、氷上で３０分間静置した。４２℃で４５秒間インキュベートした後、再び氷上で５分間静置した。ＳＯＣ培地を５００μＬ加え、３７℃で１時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った後、ＬＢ寒天培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に適量を塗布した。３７℃で一晩培養を行った後、生育したコロニーをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に植菌し、３７℃で１６時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。培養液を遠心して菌体を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従ってプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約６．３ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡΔＫｍとした。
　１μＬのｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡΔＫｍプラスミド溶液を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（バイオダイナミクス研究所）５０μＬに添加し、氷上で１０分間静置した。４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で５分間静置した。室温にしたＳＯＣ培地４５０　μＬを添加し、３７℃で１時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。振とう後の培養液１００μＬを、３ｍＬのＬＢ液体培地（１％グルコース、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有）に添加し、３７℃で一晩、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。得られた培養液４０μＬを、２ｍＬのＬＢ液体培地（１％グルコース、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有）に添加し、ＯＤ６００が約０．２になるまで３７℃で培養を継続した。ＯＤ６００が約０．２になった後、１０μＬの１００ｍＭ　ＩＰＴＧ溶液を培養液に添加し、３０℃で３０分間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。その後、マイクロ遠心機を用いて最大速度で１分間遠心分離を行い、菌体を１ｍＬのＬＢ液体培地（１％グルコース含有、クロラムフェニコール非含有）に再懸濁した。３０℃で１時間、２０ｒｐｍで振とう培養を行った後、１００μＬの培養液を、予め１００μＬの１００ｍＭ　ＩＰＴＧ溶液を塗布しておいたＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で３日間、培養を行った。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号３６）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号３７）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約１．１ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約１．８ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子が破壊された宿主としてＢＮ１株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　Ｍｉｘ　＆　Ｇｏ（ＺＹＭＯ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ１株のコンピテントセルを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　・ＢＮ３株の作製
　続いて、ＢＮ１株を宿主としてｐｎｃＡ遺伝子が破壊された、ＢＮ３株を以下のように作成した。配列番号３８（ＩＢＳプライマー）、配列番号３９（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号４０（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。ＢＮ１株作製時と同様に、ＰＣＲ反応液の精製、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｒＧＩによる制限酵素処理、ベクターｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃとのライゲーション反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換およびプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＡとした。
　カナマイシン耐性遺伝子を含まないｐｎｃＡ遺伝子破壊用プラスミドを作製した。ＰＣＲ反応時のテンプレートとしてｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＡを用いること以外は、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡΔＫｍ作製時と同様の操作により行った。得られたプラスミドをｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＡΔＫｍとした。
　ＢＮ１株を宿主として、ｐｎｃＡ遺伝子が破壊されたＢＮ３株を作製した。遺伝子破壊プラスミドとしてｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＡΔＫｍを用いること、およびコンピテントセルとしてＢＮ１株コンピテントセルを用いること以外は、上述のＢＮ１株の作製と同様の操作により作製した。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４１）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４２）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。
　元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約２．２ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約２．９ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子とｐｎｃＡ遺伝子が破壊された宿主として、ＢＮ３株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　Ｍｉｘ　＆　Ｇｏ（ＺＹＭＯ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ３株のコンピテントセルを作製した。
　・ＢＮ６株の作製
　続いて、ＢＮ３株を宿主としてｐｎｃＣ遺伝子が破壊された、ＢＮ６株を以下のように作成した。配列番号４３（ＩＢＳプライマー）、配列番号４４（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号４５（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。ＢＮ１株作製時と同様に、ＰＣＲ反応液の精製、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｒＧＩによる制限酵素処理、ベクターｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃとのライゲーション反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換およびプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＣとした。
　カナマイシン耐性遺伝子を含まないｐｎｃＣ遺伝子破壊用プラスミドを作製した。ＰＣＲ反応時のテンプレートとしてｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＣを用いること以外は、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡΔＫｍ作製時と同様の操作により行った。得られたプラスミドをｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＣΔＫｍとした。
　ＢＮ３株を宿主として、ｐｎｃＣ遺伝子が破壊されたＢＮ６株を作製した。遺伝子破壊プラスミドとしてｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｐｎｃＣΔＫｍを用いること以外は、上述のＢＮ１株の作製と同様の操作により作製した。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４６）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４７）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。
　元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約０．５ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約１．２ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子、ｐｎｃＡ遺伝子およびｐｎｃＣ遺伝子が破壊された宿主として、ＢＮ６株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　Ｍｉｘ　＆　Ｇｏ（ＺＹＭＯ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ６株のコンピテントセルを作製した。
　・ＢＮ８株の作製
　続いて、ＢＮ６株を宿主としてｙｒｆＧ遺伝子が破壊された、ＢＮ８株を以下のように作成した。配列番号４８（ＩＢＳプライマー）、配列番号４９（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号５０（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。ＢＮ１株作製時と同様に、ＰＣＲ反応液の精製、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｒＧＩによる制限酵素処理、ベクターｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃとのライゲーション反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換およびプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｙｒｆＧとした。
　カナマイシン耐性遺伝子を含まないｙｒｆＧ遺伝子破壊用プラスミドを作製した。ＰＣＲ反応時のテンプレートとしてｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｙｒｆＧを用いること以外は、ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡΔＫｍ作製時と同様の操作により行った。得られたプラスミドをｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｙｒｆＧΔＫｍとした。
　ＢＮ６株を宿主として、ｙｒｆＧ遺伝子が破壊されたＢＮ８株を作製した。遺伝子破壊プラスミドとしてｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｙｒｆＧΔＫｍを用いること、およびコンピテントセルとしてＢＮ６株コンピテントセルを用いること以外は、上述のＢＮ１株の作製と同様の操作により作製した。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号５１）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号５２）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。
　元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約０．４ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約１．１ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子、ｐｎｃＡ遺伝子、ｐｎｃＣ遺伝子およびｙｒｆＧ遺伝子が破壊された宿主として、ＢＮ８株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　Ｍｉｘ　＆　Ｇｏ（ＺＹＭＯ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ８株のコンピテントセルを作製した。
　（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　本実施例では、Ｐｒｓとして、実施例３記載のＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓを用いること、および酵素発現の宿主として、本実施例（１）記載のＢＮ３株およびＢＮ８株を用いること以外は、実施例１（２）～（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。
　（３）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表２０に示す組成で調製すること、およびサンプリングを反応開始直後（０時間後）、６時間後、および２４時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　（４）実験結果
　実験結果を図７に示す。反応６時間時点では、通常のＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７－１）、１．９ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．１９μｍｏｌ）の０．０５２当量であった。一方、ｕｓｈＡ遺伝子およびｐｎｃＡ遺伝子を破壊したＢＮ３株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７－２）、２．３ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２３μｍｏｌ）の０．０４３当量であった。ｕｓｈＡ遺伝子、ｐｎｃＡ遺伝子、ｐｎｃＣ遺伝子およびｙｒｆＧ遺伝子を破壊したＢＮ８株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合も（サンプルＮｏ．７－３）、同様に２．３ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２３μｍｏｌ）の０．０４３当量であった。すなわち、ＮＭＮの生成が進行する段階では、ＢＮ３株およびＢＮ８株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いる方が、ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として調製した無細胞抽出液を用いるよりも、ＮＭＮの生産量が高くなることがわかった。
　さらに、反応２４時間時点では、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＮ３株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７－１、Ｎｏ．７－２）、ＮＭＮが検出できなかった。ＢＮ８株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７－３）、２．０ｍＭのＮＭＮが残存していた。すなわち、ＮＭＮが一定量生成した後の段階では、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＮ３株を宿主として調製した無細胞抽出液よりも、ＢＮ８を宿主として調製した無細胞抽出液を用いる方が、生成したＮＭＮの分解が格段に抑えられることがわかった。ただし、ＮＭＮの分解が進行する前の時点（例えば６時間）で、生成したＮＭＮを適切に回収する工程を行えば、いずれの宿主由来の無細胞抽出液を用いた場合でも、生成したＮＭＮを適切に取得することができる。
［実施例８］＜ＰＰａｓｅを用いた精製酵素によるＮＭＮ合成＞
　本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
　Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＨｄＮａｍｐｔ－Ｈｉｓ）
　Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）ＰｒｓのＡｓｎ１２０Ｓｅｒ変異体にＨｉｓタグを付加したもの（ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ－Ｈｉｓ）
　Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）ＰｐｋにＨｉｓタグを付加したもの（ＤｒＰｐｋ－Ｈｉｓ）
　Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）ＲｂｋにＨｉｓタグを付加したもの（ＳｃＲｂｋ－Ｈｉｓ）
　（１）Ｈｉｓタグ付加Ｐｒｓ、ＰｐｋおよびＲｂｋ発現プラスミドの作製
　Ｐｒｓ、ＰｐｋおよびＲｂｋにＨｉｓタグが付加されたタンパク質を発現するプラスミドを以下のように作製した。実施例３で作製したpEBsPrsN120S、実施例１で作製したpEDrPpkおよびpEScRbkを鋳型として、各酵素にＨｉｓタグを付加するための変異導入ＰＣＲ反応を行った。鋳型プラスミド名、変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Ｈｉｓタグ付加酵素発現プラスミド名を表２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　Ｈｉｓタグ付加酵素発現プラスミドの作製は、表２１に示す各種鋳型プラスミドと変異導入プライマーを用いる以外は、実施例３（１）と同様の操作により、変異導入ＰＣＲ反応から塩基配列確認までを行った。正しくＨｉｓタグが付加されたプラスミドを表２１に記載した各プラスミドとした。
　（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
　上記（１）でＨｉｓタグ付加酵素発現プラスミドを用い、実施例４（１）と同様の操作により、組換え体の作製、培養および無細胞抽出物の調製を行った。その際、菌体を懸濁するバッファーとしては、ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ－Ｈｉｓ以外は、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ　８．０）を用いた。ただし、ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ－Ｈｉｓについては、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて行った。
　（３）精製酵素の調製
　（２）で調製したＨｉｓタグ付加酵素を含む無細胞抽出物を用いて、実施例５（３）と同様に、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、各Ｈｉｓタグ付加酵素の精製を行った。ただし、ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ－Ｈｉｓについては、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて用透析を行った。
　（４）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
　（３）で得られた各種精製酵素を用い、ＰＰａｓｅ（酵母由来、シグマ・アルドリッチ社、製品番号10108987001）の存在下または非存在下で、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表２２に示す組成で調製すること、サンプリングを反応開始直後（０時間後）、６時間後、２４時間後および４８時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　（５）実験結果
　実験結果を図８に示す。第３反応のみの場合、ＰＰａｓｅを添加した場合（サンプルＮｏ．８－１）では、反応４８時間で４．０ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．４０μｍｏｌ）の０．２５当量であった。一方、ＰＰａｓｅを添加しなかった場合（サンプルＮｏ．８－２）、０．５２ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０５２μｍｏｌ）の１．９当量であった。第２反応＋第３反応の場合、ＰＰａｓｅを添加した場合（サンプルＮｏ．８－３）では、反応４８時間で４．１ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．４１μｍｏｌ）の０．２４当量であった。一方、ＰＰａｓｅを添加しなかった場合（サンプルＮｏ．８－４）、０．３４ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０３４μｍｏｌ）の２．９当量であった。さらに、第１反応＋第２反応＋第３反応の場合、ＰＰａｓｅを添加した場合（サンプルＮｏ．８－５）では、反応４８時間で３．６ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．３６μｍｏｌ）の０．２８当量であった。一方、ＰＰａｓｅを添加しなかった場合（サンプルＮｏ．８－６）、０．２５ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０２５μｍｏｌ）の４．０当量であった。以上の結果から、精製酵素反応系にＰＰａｓｅを添加することで、効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。
配列番号１５：Prs変異体BsPrsN120Sの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号１６：Prs変異体BsPrsN120Sの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号１７：Prs変異体BsPrsL135Iの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号１８：Prs変異体BsPrsL135Iの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号１９：プライマーＴ７－ＰＰ
配列番号２０：プライマーＴ７－ＴＰ
配列番号２５：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEHdNampt-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号２６：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEHdNampt-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号２７：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrNampt-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号２８：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrNampt-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号２９：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpESoNampt-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号３０：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpESoNampt-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号３１：ｕｓｈＡ用ＩＢＳプライマー
配列番号３２：ｕｓｈＡ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号３３：ｕｓｈＡ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号３４：ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡΔＫｍ調製用プライマー（フォワード）
配列番号３５：ｐＡＣＤ４Ｋ－Ｃ－ｕｓｈＡΔＫｍ調製用プライマー（リバース）
配列番号３６：ｕｓｈＡ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号３７：ｕｓｈＡ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号３８：ｐｎｃＡ用ＩＢＳプライマー
配列番号３９：ｐｎｃＡ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号４０：ｐｎｃＡ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号４１：ｐｎｃＡ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号４２：ｐｎｃＡ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号４３：ｐｎｃＣ用ＩＢＳプライマー
配列番号４４：ｐｎｃＣ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号４５：ｐｎｃＣ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号４６：ｐｎｃＣ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号４７：ｐｎｃＣ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号４８：ｙｒｆＧ用ＩＢＳプライマー
配列番号４９：ｙｒｆＧ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号５０：ｙｒｆＧ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号５１：ｙｒｆＧ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号５２：ｙｒｆＧ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号５３：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEBsPrsN120S-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号５４：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEBsPrsN120S-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号５５：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrPpk-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号５６：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrPpk-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号５７：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEScRbk-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号５８：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEScRbk-Hisの変異導入用プライマー（リバース）

Claims (15)

  1. 　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
  2. 　リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、請求項１に記載のＮＭＮの製造方法。
  3. 　実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、請求項１または２に記載のＮＭＮの製造方法。
  4. 　前記Ｎａｍｐｔがバクテリア由来のものである、請求項１～３のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
  5. 　前記Ｐｐｋが、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
  6. 　前記形質転換体の宿主が、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、または酵母である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
  7. 　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体。
  8. 　リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体。
  9. 　ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）の存在下で、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
  10. 　実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、請求項９に記載のＮＭＮの製造方法。
  11. 　前記処理物が精製酵素である、請求項９または１０に記載のＮＭＮの製造方法。
  12. 　（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させる工程を含む、ＮＭＮの製造方法。
    （ａ）EC 3.1.3.5
    （ｃ）EC 2.4.2.1
    （ｇ）EC 3.2.2.1
    （ｈ）EC 3.2.2.3
    （ｉ）EC 3.2.2.14
  13. 　反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
  14. 　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）およびホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびＡＴＰと接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法であって、反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、ＮＭＮの製造方法。
  15. 　リボキナーゼ（Ｒｂｋ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボースおよびＡＴＰと接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、請求項１４に記載のＮＭＮの製造方法。
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