KR20230160222A

KR20230160222A - 개변형 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제

Info

Publication number: KR20230160222A
Application number: KR1020237001898A
Authority: KR
Inventors: 다카히로 하야시; 다카노리 아키야마
Original assignee: 미쯔비시 케미컬 주식회사
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2023-11-23
Also published as: EP4317191A1; WO2022202952A1; CN116113645A; US20230332114A1; JPWO2022202952A1

Abstract

본 발명은, 개변형(변이형) 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제, 및 그것을 사용한 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개변형 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)는, 하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있다.
(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃
(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅
[X₁ 내지 X₅는 명세서내에서 규정한 대로이다]

Description

개변형 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제

관련 출원

본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2021-52555(2021년 3월 26일 출원)의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.

기술 분야:

본 발명은, 개변형(변이형) 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제, 및 그것을 사용한 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다.

니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)는 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드(NAD+)의 합성 중간체이다. 근년, NMN은 NAD+로의 변환을 통하여 장수 유전자 「서투인」의 활성을 컨트롤하는 것, NMN을 마우스에 투여하면 항노화 작용이 나타나는 것이 밝혀졌다. 또한, NMN은 당뇨병, 알츠하이머병, 심부전 등의 질환의 예방이나 증상의 개선에 효과가 있는 것도 보고되어 있다. 이러한 NMN에는, 기능성 식품, 의약품, 화장품 등의 성분으로서의 용도가 기대되고 있으며, 생산성의 향상을 목표로 하여, 효율적인 제조 방법의 연구 개발이 진행되고 있다.

NMN의 제조 방법으로서는, 유기 합성에 의한 방법 외에도, 발효법이나 효소법 등의 생물학적 방법이 알려져 있다. 효소법에 의한 NMN의 제조는, 일반적으로, (1) 리보오스로부터 리보오스-5-인산(R5P)을 생성하는 제1 반응, (2) R5P로부터 포스포리보실피로인산(PRPP)을 생성하는 제2 반응, (3) PRPP와 니코틴아미드(NAM)로부터 NMN을 생성하는 제3 반응의, 3단계의 효소 반응을 포함하는 메인 반응과, ATP 재생이나 피로인산 분해의 서포트 반응으로 구성된다.

니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)는, 포유류 NAD+ 합성계에 있어서의 율속 효소이며, 상기 제조 루트의 제3 반응을 촉매하는 효소이다(비특허문헌 1). 야생형 Nampt의 활성은 다른 효소와 비교하여 낮고, NMN의 공업적 생산에는 충분한 것이라고는 할 수 없기 때문에, 그 개선이 요구되고 있다. 예를 들어, 활성이 높은 Nampt(HdNampt)의 탐색(비특허문헌 2 및 3)이나, 소분자 화합물을 이용한 Nampt 활성화(비특허문헌 4), NMN 분화 경로 녹다운에 의해 세포내 축적 NMN 농도의 향상(비특허문헌 5)에 의해, NMN의 생산 효율을 개선하는 시도가 이루어지고 있다.

발명자들도, 고활성의 Nampt의 탐색이나, Nampt에 더하여 상기 제1 및 제2 반응을 촉매하는 포스포리보실피로인산 신타아제(Prs) 및 폴리인산 키나아제(Ppk)의 발현을 강화함으로써, NMN의 생산 효율을 개선하는 방법을 보고하였다(특허문헌 1).

한편, 야생형의 Nampt의 서열에 돌연변이를 도입한 변이형 Nampt에 의한, NMN의 생산 효율의 개선도 보고되어 있다(특허문헌 2). 그러나, 이 보고예에서는 사용하는 야생형 Nampt의 활성이 매우 낮기 때문에, 얻어지는 변이형 Nampt의 활성은, 발명자들이 사용하고 있는 야생형 고활성 Nampt보다도 낮다.

WO2019/065876 WO2020/129997

Garten et al., "Physiological and pathophysiological roles of NAMPT and NAD metabolism" Nature Reviews Endocrinology volume 11, pa535-546(2015) Marinescu et al., "β-nicotinamide mononucleotide (NMN) production in Escherichia coli" Scientific Reports volume 8, Article number:12278(2018) Shoji et al., "Metabolic design for selective production of nicotinamide mononucleotide from glucose and nicotinamide" Metab Eng. 2020 Nov 18;S1096-7176(20)30176-2. Gardell et al., "Boosting NAD+ with a small molecule that activates NAMPT" Nat Commun. 2019 Jul 19;10(1):3241 Black et al., "Engineering a nicotinamide mononucleotide redox cofactor system for biocatalysis" Nat Chem Biol., 2020 Jan;16(1):87-94.

본 발명은, 활성이 높은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)를 제공하고, 이에 의해 NMN의 생산 효율을 개선하는 것을 과제로 한다.

발명자들은, 야생형의 고활성 Nampt의 활성 중심 근방 잔기에 대해서, 개별로 포화 변이 라이브러리를 작성하고, 활성 스크리닝을 실시함으로써, 효소 활성이 높은 개변형(변이형) Nampt를 제작하는 것에 성공하였다.

즉, 본 발명은 이하의 [1] 내지 [15]를 제공한다.

[1] 개변형 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)이며, 하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하고,

야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있는, 개변형 Nampt.

(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃

(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅

단, X₁ 내지 X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₂는 A 및 Q 이외의 아미노산이며, X₃은 M 이외의 아미노산을 나타낸다. 또한, []는 [] 내의 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다.

[2] 하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는, 개변형 Nampt이며:

야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있는, 개변형 Nampt.

(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃

(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅

단, X₁ 내지 X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₁은 중성 아미노산 및 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₂는 지방족 아미노산, 산성 아미노산 및 중성의 친수성 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₃은 비극성 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₄는 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₅는 방향족 아미노산 이외의 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산을 나타낸다. 또한, []는 [] 내의 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다.

[3] 개변형 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)이며, 하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하고,

야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있는, 개변형 Nampt.

(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃

(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅

단, X₁, X₄, X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₁은 중성 아미노산 및 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₄는 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₅는 방향족 아미노산 이외의 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산을 나타낸다. X₂ 및 X₃은 어느 아미노산이어도 된다. 또한, []는 [] 내의 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다.

[4] 개변형 Nampt의 아미노산 서열을, 서열 번호 3으로 나타내지는 아미노산 서열과 얼라인먼트했을 때,

상기 서열 번호 1로 나타내지는 아미노산 서열이, 서열 번호 3의 243번째 내지 253번째에 해당하는 위치에 존재하고,

상기 서열 번호 2로 나타내지는 아미노산 서열이, 서열 번호 3의 278번째 내지 281번째에 해당하는 위치에 존재하는, [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 개변형 Nampt.

[5] 이하의 1) 내지 5)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 치환을 갖는, [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 개변형 Nampt.

1) X₁에 있어서의 야생형 아미노산의 T로의 치환

2) X₂에 있어서의 야생형 아미노산의 G로의 치환

3) X₃에 있어서의 야생형 아미노산의 G 또는 A로의 치환

4) X₄에 있어서의 야생형 아미노산의 A로의 치환

5) X₅에 있어서의 야생형 아미노산의 S, A, N 또는 I로의 치환

[6] 상기 개변형 Nampt의 야생형 서열이, 이하의 (1) 또는 (2)의 아미노산 서열을 갖는, [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 개변형 Nampt.

(1) 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 것으로 나타내지는 아미노산 서열

(2) 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 것으로 나타내지는 아미노산 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖고, Nampt 활성을 갖는 단백을 코딩하는 아미노산 서열

[7] 상기 개변형 Nampt가, 헤모필루스(Haemophilus)속, 메이오써무스(Meiothermus)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 스핑고픽시스(Sphingopyxis)속, 스핑고픽시스속, 키티노파가(Chitinophaga)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 페도박터(Pedobacter)속, 마이크로불비퍼(Microbulbifer)속, 라브렌지아(Labrenzia)속, 루테이박터(Luteibacter)속 유래인, [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 개변형 Nampt.

[8] [1] 내지 [7] 중 어느 것에 기재된 개변형 Nampt의 존재 하에서, 포스포리보실피로포스파이트 및 니코틴아미드를 접촉시킴으로써, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 제조하는 방법.

[9] 포스포리보실피로포스파이트가 포스포리보실피로인산 신타아제의 존재 하에 리보오스-5-인산으로 제조된 것인, [8]에 기재된 방법.

[10] 리보오스-5-인산이 리보키나아제의 존재 하에 리보오스로 제조된 것인, [9]에 기재된 방법.

[11] [1] 내지 [7] 중 어느 것에 기재된 개변형 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)를 코딩하는 DNA.

[12] [11]에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.

[13] [12]에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체;

[14] [13]에 기재된 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)를 채취하는, Nampt의 제조 방법.

[15] [1] 내지 [7] 중 어느 것에 기재된 개변형 Nampt 또는 [9]에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물 혹은 당해 배양물의 처리물의 존재 하에서, 포스포리보실피로포스파이트 및 니코틴아미드를 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 제조하는 방법.

본 발명의 Nampt는, 이에 의해 NMN의 생산 효율이 향상됨과 함께, 원료 비용의 삭감이 가능해진다.

도 1은 각종 미생물 유래의 Nampt의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 약어의 정의는 각각 다음과 같다.

Nampt(Nicotinamide phosphoribosyltransferase): 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제

Prs(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase): 포스포리보실피로인산 신타아제

Rbk(Ribokinase): 리보키나아제

Ppk(Polyphosphate kinase): 폴리인산 키나아제

PPase(Pyrophosphatase): 피로포스파타아제

NMN(Nicotinamide mononucleotide): 니코틴아미드 모노뉴클레오티드

PRPP(Phosphoribosyl pyrophosphate): 포스포리보실피로인산

NAM(Nicotinamide): 니코틴아미드

R5P(Ribose-5-phosphate): 리보오스-5-인산

NR(Nicotinamide riboside): 니코틴아미드 리보시드

NaMN(Nicotinic acid mononucleotide): 니코틴산 모노뉴클레오티드

NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide): 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드

PPi(Pyrophosphate): 피로인산

PolyP(Polyphosphate): 폴리인산

1. 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)

1.1 야생형 Nampt

Nampt(EC number: 2.4.2.12)는, 일반적으로 NAD(니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드) 솔베이지 경로에 관여하는 것이 알려져 있고, 본 발명에 있어서, PRPP 및 NAM으로부터 NMN을 생성시키는 반응(제3 반응)을 위해 이용되는 효소이다. Nampt에 의한 PRPP와 NAM으로부터의 NMN 합성 반응에 있어서, 본래 ATP는 필수는 아니다. 그러나, Nampt에는 ATP 가수 분해 활성이 있고, ATP의 가수 분해에 의해 Nampt가 자기 인산화됨으로써, NMN 생성에 유리한 방향으로 효소학적 파라미터나 화학 평형이 변화되는 것이 보고되어 있다(Biochemistry 2008, 47, 11086-11096).

Nampt로서는, 예를 들어 인간(호모 사피엔스(Homo sapiens)) 유래의 것(NP_005737), 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus)) 유래의 것(NP_067499), 래트(라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)) 유래의 것(NP_808789), 제브라피쉬(다니오 레리오(Danio rerio)) 유래의 것(NP_997833), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi)(AAR87771), 데이노콕쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)(AE001890), 오에노코커스 오에니(Oenococcus oeni)(KZD13878), 쉬와넬라 오나이덴시스(Shewanella oneidensis)(NP_717588) 등 박테리아 유래의 것을 들 수 있다. 이들 중, NMS 합성에 있어서의 효소 활성의 점에서는, 박테리아 유래의 것이 바람직하다. 여기서, 박테리아란, 핵막을 갖지 않는 원핵 생물의 한 무리이며, 대장균, 고초균, 시아노박테리아 등을 포함하는 생물군이다.

구체적으로는, Nampt는 헤모필루스속, 메이오써무스속, 크산토모나스속, 스핑고픽시스속, 스핑고픽시스속, 키티노파가속, 버크홀데리아속, 페도박터속, 마이크로불비퍼속, 라브렌지아속 유래의 것이 바람직하다.

표 1에 본 발명에서 이용 가능한 Nampt의 유래와 GenBank 액세션 번호, 및 서열표의 서열 번호를 나타낸다. 또한, 도 1에 각 Nampt의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다.

본 발명에 관한 Nampt는, 상기 서열을 갖는 것에 한정되는 것은 아니며, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 보다 바람직하게는 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 특히 바람직하게는 약 95％ 이상, 가장 바람직하게는 약 98％ 이상의 상동성 혹은 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 Nampt 활성을 갖는 단백질도 본 발명의 Nampt에 포함된다.

또한, 본 발명의 Nampt에는, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개, 구체적으로는 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 Nampt 활성을 갖는 단백질도 본 발명의 Nampt에 포함된다.

본 발명에 관한 Nampt의 유전자는, 상기한 아미노산 서열을 코딩하는 것이다. 일례로서, Nampt 유전자는 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24 중 어느 것에 기재된 염기 서열을 갖는다. 그러나, 상기 염기 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 보다 바람직하게는 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 특히 바람직하게는 약 95％ 이상, 가장 바람직하게는 약 98％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 또한 Nampt 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자도 본 발명의 Nampt 유전자에 포함된다.

또한, 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24 중 어느 것에 기재된 염기 서열과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이징하고, 또한 Nampt 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자도 본 발명의 Nampt 유전자에 포함된다. 엄격한 조건으로서는, 예를 들어 DNA를 고정한 나일론막을, 6×SSC(1×SSC는 염화나트륨 8.76g, 시트르산나트륨 4.41g을 1리터의 물에 녹인 것), 1％ SDS, 100μg/ml 연어 정자 DNA, 0.1％ 소혈청 알부민, 0.1％ 폴리비닐피롤리돈, 0.1％ 피콜을 포함하는 용액 중에서 65℃에서 20시간 프로브와 함께 보온하여 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 당업자라면 이러한 버퍼의 염 농도, 온도 등의 조건에 더하여, 기타 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간 등의 여러 조건을 가미하여, 하이브리다이제이션의 조건을 설정할 수 있다. 하이브리다이제이션 후의 세정 조건으로서, 예를 들어 「2×SSC, 0.1％ SDS, 42℃」, 「1×SSC, 0.1％ SDS, 37℃」, 보다 엄격한 조건으로서는, 예를 들어 「1×SSC, 0.1％ SDS, 65℃」, 「0.5×SSC, 0.1％ SDS, 50℃」 등의 조건을 들 수 있다.

1.2 개변형 Nampt

본 발명의 개변형 Nampt는, 적어도 하나의 아미노산 잔기의 변이를 포함하고, 그 활성이 야생형의 활성보다도 향상되어 있는 것을 특징으로 하는, 신규의 개변형 Nampt이다.

본 발명의 개변형 Nampt의 유래는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 미국 생물 공학 정보 센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)에 의해 제공되는 젠뱅크(GenBank) 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein)에 있어서 등록되어 있는 Nampt나, 공지 문헌에 기재되어 있는 Nampt를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 상기 1.1에 기재한 공지된 Nampt를 이용할 수 있다.

본 발명의 개변형 Nampt는, 하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함한다.

(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃

(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅

단, X₁ 내지 X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, []는 [] 내의 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다.

제1 양태에 있어서, X₁ 내지 X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₂는 A 및 Q 이외의 아미노산이며, X₃은 M 이외의 아미노산을 나타낸다.

제2 양태에 있어서, X₁ 내지 X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₁은 중성 아미노산 및 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₂는 지방족 아미노산, 산성 아미노산 및 중성의 친수성 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₃은 비극성 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₄는 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₅는 방향족 아미노산 이외의 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산을 나타낸다.

제3 양태에 있어서, X₁, X₄, X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₁은 중성 아미노산 및 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₄는 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₅는 방향족 아미노산 이외의 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산을 나타낸다. X₂ 및 X₃은 어느 아미노산이어도 된다.

여기서, 「산성 아미노산」이란, 예를 들어 아스파르트산(D), 글루탐산(E)이며, 바람직하게는 글루탐산(E)이다.

「중성 아미노산」이란, 예를 들어 글리신(G), 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 류신(L), 이소류신(I), 시스테인(C), 메티오닌(M), 티로신(Y), 발린(V), 트레오닌(T), 세린(S), 프롤린(P), 트립토판(W), 아스파라긴(N), 글루타민(Q)이며, 바람직하게는 발린(V), 트레오닌(T), 알라닌(A), 글리신(G), 류신(L), 세린(S), 아스파라긴(N), 이소류신(I), 보다 바람직하게는 트레오닌(T), 알라닌(A), 글리신(G), 류신(L), 세린(S), 아스파라긴(N), 이소류신(I)이다.

「지방족 아미노산」이란, 예를 들어 알라닌(A), 류신(L), 이소류신(I), 발린(V), 페닐알라닌(F)이며, 바람직하게는 알라닌(A), 류신(L), 이소류신(I), 발린(V), 보다 바람직하게는 알라닌(A), 이소류신(I)이다.

「친수성 아미노산」이란, 예를 들어 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 리신(K), 아르기닌(R), 트레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 히스티딘(H)이며, 바람직하게는 트레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 보다 바람직하게는 트레오닌(T), 세린(S)이다.

「비극성 아미노산」이란, 예를 들어 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 프롤린(P), 글리신(G), 시스테인(C)이며, 바람직하게는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 글리신(G), 보다 바람직하게는 알라닌(A), 발린(V), 글리신(G)이다.

「방향족 아미노산산」이란, 예를 들어 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 티로신(Y)이며, 바람직하게는 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 보다 바람직하게는 트립토판(W)이다.

상기 서열 번호 1 및 2에 나타내지는 서열은, 공지된 Nampt의 아미노산 서열에 공통되게 존재하는 모티프 서열이다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 개변형 Nampt의 아미노산 서열을, 서열 번호 3으로 나타내지는 헤모필루스 듀크레이 유래(AAR87771)의 아미노산 서열과 얼라인먼트했을 때,

(a) 상기 서열 번호 1로 나타내지는 아미노산 서열은, 서열 번호 3의 243번째 내지 253번째에 해당하는 위치에 존재하고,

(b) 상기 서열 번호 2로 나타내지는 아미노산 서열은, 서열 번호 3의 278번째 내지 281번째에 해당하는 위치에 존재한다.

X₁ 내지 X₅는, Nampt의 활성이 야생형보다도 향상되는 한, 적어도 하나가 야생형의 아미노산과 다른 것이면 된다.

X₁ 내지 X₅에 있어서의 바람직한 치환으로서는 이하의 것을 들 수 있다.

1) X₁: 야생형 아미노산의 T 또는 V로의 치환, 보다 바람직하게는 T로의 치환

2) X₂: 야생형 아미노산의 A 또는 G로의 치환, 보다 바람직하게는 G로의 치환

3) X₃: 야생형 아미노산의 V, G 또는 A로의 치환, 보다 바람직하게는 G 또는 A로의 치환

4) X₄: 야생형 아미노산의 A 또는 L로의 치환, 보다 바람직하게는 A로의 치환

5) X₅: 야생형 아미노산의 G, S, A, N 또는 I로의 치환, 보다 바람직하게는 야생형 아미노산의 S, A, N 또는 I로의 치환

본 발명의 개변형 Nampt는, 상기 X₁ 내지 X₅ 중 2 이상에 있어서 변이를 갖는 것이어도 된다(복합 치환(변이)). 이렇게 하여 복수의 변이를 도입함으로써, 단일 변이보다도 높은 활성이 달성될 수 있는 경우가 있다.

그러한 복합 치환으로서는, 이하의 조합을 들 수 있다.

2 치환: X₁과 X₂, X₁과 X₃, X₁과 X₄, X₁과 X₅, X₂와 X₃, X₂와 X₄, X₂와 X₅, X₃과 X₄, X₃과 X₅, X₄와 X₅

3 치환: X₁과 X₂와 X₃, X₁과 X₂와 X₄, X₁과 X₂와 X₅, X₁과 X₃과 X₄, X₁과 X₃과 X₅, X₁과 X₄와 X₅, X₂와 X₃과 X₄, X₂와 X₃과 X₅, X₂와 X₄와 X₅, X₃과 X₄와 X₅

4 치환: X₁과 X₂와 X₃과 X₄, X₁과 X₂와 X₃과 X₅, X₁과 X₂와 X₄와 X₅, X₁과 X₃과 X₄와 X₅, X₂와 X₃과 X₄와 X₅

5 치환: X₁과 X₂와 X₃과 X₄와 X₅

이들 중에서도, X₁과 X₃, X₁과 X₄, X₁과 X₅의 복합 치환이 바람직하고, X₃과 X₅, X₄와 X₅ 복합 치환이 보다 바람직하다.

보다 구체적으로는, X₁의 T로의 치환과 X₃의 G로의 치환의 조합, X₁의 T로의 치환과 X₄의 A로의 치환의 조합, X₁의 T로의 치환과 X₅의 S로의 치환의 조합, X₃의 G로의 치환과 X₅의 S로의 치환의 조합, X₁의 T로의 치환과 X₃의 T로의 치환의 조합이 바람직하고, X₃의 A로의 치환과 X₅의 S로의 치환의 조합, X₄의 G로의 치환과 X₅의 S로의 치환의 조합이 보다 바람직하다.

상기 X₁ 내지 X₅는, 각각 서열 번호 3의 아미노산 서열의 247번째, 248번째, 253번째, 278번째 및 281번째의 아미노산에 해당한다. 따라서, 본 발명의 개변형 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)는 그 아미노산 서열을, 서열 번호 3으로 나타내지는 헤모필루스 듀크레이 유래(AAR87771)의 Nampt의 아미노산 서열과 얼라인먼트했을 때, 서열 번호 3의 247번째, 248번째, 253번째, 278번째 및 281번째에 각각 해당하는 위치의 아미노산에서 선택되는 적어도 하나가 야생형의 아미노산과는 다른 아미노산으로 치환되어 있으며, 야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있는, 개변형 Nampt라고 기재할 수도 있다.

상기의 경우, 바람직한 치환은, 이하와 같이 기재할 수 있다.

1) 서열 번호 3의 247번째에 해당하는 위치 (X₁)에 있어서의 야생형 아미노산의 T 또는 V로의 치환, 보다 바람직하게는 T로의 치환

2) 서열 번호 3의 248번째에 해당하는 위치 (X₂)에 있어서의 야생형 아미노산의 A 또는 G로의 치환, 보다 바람직하게는 G로의 치환

3) 서열 번호 3의 253번째에 해당하는 위치 (X₃)에 있어서의 야생형 아미노산의 V, G 또는 A로의 치환, 보다 바람직하게는 G 또는 A로의 치환

4) 서열 번호 3의 278번째에 해당하는 위치 (X₄)에 있어서의 야생형 아미노산의 A 또는 L로의 치환, 보다 바람직하게는 A로의 치환

5) 서열 번호 3의 281번째에 해당하는 위치 (X₅)에 있어서의 야생형 아미노산의 G, S, A, N 또는 I로의 치환, 보다 바람직하게는 S, A, N 또는 I로의 치환

본 발명의 개변형 Nampt는, 야생형보다도 높은 활성, 바람직하게는 1.2배 이상 높은 활성, 보다 바람직하게는 1.4배 이상 높은 활성을 갖는다.

여기서, 「활성」이란, Nampt 활성, 즉, PRPP 및 NAM으로부터 NMN을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소 활성을 의미한다. 활성 측정은, 기질인 PRPP 및 NAM을 Nampt와 접촉시켜, NMN으로 변환한 후, 당해 NMN을 정량함으로써 산출할 수 있다.

반응 조건은, 기질 농도는 10 내지 100mM, 반응 온도는 10℃ 내지 40℃, 반응 시간은 1시간 내지 40시간의 범위이다. 메탄올 및 EDTA(에틸렌디아민4아세트산)를 첨가하여 정지시킨다. 그 후, HPLC(고속 액체 크로마토그래피)에 의해, 생성된 NMN을 분석함으로써 정량을 행할 수 있다.

본 발명의 개변형 Nampt는, 기지의 Nampt에 상술한 아미노산 치환을 도입하고, 그 효소 활성을 야생형과 비교하여 선택함으로써 얻어진다. 변이의 도입법으로서는, 부위 특이적 변이 유발이나 부위 특이적 뉴클레아제를 사용한 게놈 편집을 들 수 있다.

부위 특이적 변이 유발에 대해서는, 퀵체인지(QuikChange)법 외에도, 쿤켈(Kunkel)법, 갭드 듀플렉스(Gapped duplex)법 등 각종 방법이 알려져 있고, 시판되는 돌변이 도입용 키트를 사용하여 간편하게 실시할 수 있다.

부위 특이적 뉴클레아제를 사용한 게놈 편집으로서는, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 액티베이터 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 CRISPR/Cas9 등을 사용한 게놈 편집 등, 공지된 방법을 이용할 수 있고, 시판되고 있는 키트를 사용하여 실시할 수 있다.

2. 개변형 Nampt를 코딩하는 유전자(DNA)

본 발명은, 본 발명의 개변형 Nampt를 코딩하는 유전자(DNA)도 제공한다.

본 발명의 「개변형 Nampt를 코딩하는 DNA」에는, 상기 개변형 Nampt를 코딩하는 DNA와 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이징하고, 야생형보다도 높은 Nampt 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA도 포함된다.

「엄격한 조건」이란, 하이브리다이제이션 후의 세정 시의 조건이며 염 농도가 300 내지 2000mM, 온도가 40 내지 75℃, 바람직하게는 염 농도가 600 내지 900mM, 온도가 65℃인 조건을 의미한다. 예를 들어, 2×SSC에서 50℃ 등의 조건을 들 수 있다. 당업자라면, 이러한 버퍼의 염 농도, 온도 등의 조건에 더하여, 기타 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간 등의 여러 조건을 가미하여, 본 발명의 Nampt를 코딩하는 DNA를 얻기 위한 조건을 적절히 설정할 수 있다.

하이브리다이제이션법의 상세한 수순에 대해서는, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))] 등을 참조할 수 있다. 하이브리다이징하는 DNA로서는, 본 발명의 유전자 DNA에 대하여 적어도 40％ 이상, 바람직하게는 60％, 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA 또는 그 부분 단편을 들 수 있다.

3. 발현 벡터

본 발명은, 본 발명의 개변형 Nampt를 코딩하는 유전자(DNA)를 포함하는 발현 벡터도 제공한다. 전술한 바와 같이, 효소법에 의한 NMN의 합성에는 복수의 효소가 관여한다. 본 발명의 발현 벡터는, 개변형 Nampt를 코딩하는 유전자에 더하여, NMN 생산 경로에서 작용하는 다른 효소를 코딩하는 유전자(DNA)를 포함하는 것이어도 된다. 예를 들어, Nampt에 더하여, 후술하는 Prs 및 Ppk를 코딩하는 유전자를 모두 포함하고 있어도 되고, Nampt와 Prs를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터, 혹은 Nampt와 Ppk를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터여도 된다.

본 발명에서 사용되는 발현 벡터는, 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다. 일반적으로는, 소정의 효소를 코딩하는 유전자의 상류에 전사 프로모터, 경우에 따라서는 하류에 터미네이터를 삽입하여 발현 카세트를 구축하고, 이 카세트를 발현 벡터에 삽입하면 된다. 혹은, 발현 벡터에 전사 프로모터 및/또는 터미네이터가 이미 존재하는 경우에는, 발현 카세트를 구축하지 않고, 그 벡터의 전사 프로모터 및/또는 터미네이터를 이용하여, 그 사이에 소정의 효소를 코딩하는 유전자를 삽입하면 된다. 상술한 바와 같이, 1개의 발현 벡터에 2개 이상의 효소를 코딩하는 유전자를 포함할 경우, 그들 유전자는 모두 동일한 프로모터 하에 삽입되어 있어도 되고, 다른 프로모터 하에 삽입되어 있어도 된다. 프로모터의 종류는 숙주에 있어서 적절한 발현을 가능하게 하는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 대장균 숙주에 있어서 이용할 수 있는 것으로서는, T7 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, 람다 파지 유래 PL 프로모터 및 PR 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터를 들 수 있다.

소정의 각 효소를 코딩하는 유전자는, 예를 들어 (i) 염기 서열 정보에 따라서, 프라이머를 제작하고, 게놈 등을 주형으로 하여 증폭시킴으로써 얻을 수도 있고, (ii) 효소의 아미노산 서열 정보에 따라서, 유기 합성적으로 DNA를 합성함으로써 얻을 수도 있다. 형질 전환체의 숙주가 되는 세포에 따라서, 유전자는 최적화되어 있어도 된다.

발현 벡터에 소정의 효소를 코딩하는 유전자를 삽입하기 위해서는, 제한 효소를 사용하는 방법, 토포이소머라아제를 사용하는 방법 등을 이용할 수 있다. 삽입 시에 필요하다면, 적당한 링커를 부가해도 된다. 또한, 아미노산에의 번역에 있어서 중요한 염기 서열로서, SD 서열이나 코작(Kozak) 서열 등의 리보솜 결합 서열이 알려져 있고, 이들 서열을 유전자의 상류에 삽입해도 된다. 삽입에 수반하여, 유전자가 코딩하는 아미노산 서열의 일부를 치환해도 된다. 또한, 벡터에는 목적으로 하는 형질 전환체를 선별하기 위한 인자(선택 마커)가 포함되는 것이 바람직하다. 선택 마커로서는, 약제 내성 유전자나 영양 요구성 상보 유전자, 자화성 부여 유전자 등을 들 수 있고, 목적이나 숙주에 따라서 선택될 수 있다. 대장균에서 선택 마커로서 사용되는 약제 내성 유전자로서는, 예를 들어 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자를 들 수 있다.

발현 벡터는, 숙주에 따라서, 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA, 레트로트랜스포존 DNA, 인공 염색체 DNA 등에서 선택되는 적절한 것을 사용하면 된다. 예를 들어, 대장균을 숙주로 할 경우에는, pTrc99A(GE 헬스 케어 바이오사이언스), pACYC184(닛폰 진), pMW118(닛폰 진), pET 시리즈 벡터(노바젠(Novagen)) 등을 들 수 있다. 또한 2 이상의 삽입 개소를 갖는 벡터로서는 pETDuet-1(노바젠) 등을 들 수 있다. 필요에 따라서, 이들 벡터를 개변한 것을 사용할 수도 있다.

발현 벡터는, 소정의 효소를 코딩하는 유전자에, 적절한 프로모터나 터미네이터, 마커 유전자 등을 연결시킨 발현 카세트를 숙주의 게놈 상에 삽입함으로써, 소정의 효소의 발현을 강화할 수 있다. 발현 카세트가 게놈 상에 삽입된 형질 전환체를 취득하는 방법으로서는, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상동 재조합에 의해 발현 카세트를 게놈 상에 삽입할 경우에는, 소정의 효소의 발현 카세트와 임의의 게놈 영역의 서열을 갖고, 숙주내에서 복제 불가능한 플라스미드를 사용하여 형질 전환을 행함으로써, 당해 플라스미드 전체 또는 발현 카세트가 삽입된 형질 전환체를 얻을 수 있다. 그 때, SacB 유전자(레반수크라아제를 코딩) 등의 네거티브 선택 마커를 탑재한 플라스미드나, 복제 기구가 온도 감수성(ts)의 플라스미드를 사용함으로써, 2회의 상동 재조합에 의해 발현 카세트만이 게놈 상에 된 형질 전환체를 효율적으로 취득할 수도 있다. 또한, 발현 카세트만을 포함하는 DNA 단편을 사용하여 형질 전환을 행함으로써, 게놈 상의 랜덤한 위치에 발현 카세트가 삽입된 형질 전환체를 얻을 수도 있다.

Nampt 이외의 효소에 대해서, 숙주가 게놈 상에 원래 갖는 효소(내인성 효소)를 이용하는 경우에는, 게놈 상의 당해 효소 유전자의 프로모터를 강력한 것으로 치환함으로써, 그 발현을 강화할 수도 있다. 프로모터로서는, 상술한 발현 벡터에 있어서 사용하는 프로모터를 마찬가지로 이용할 수 있다.

4. 형질 전환체

본 발명은, 본 발명의 개변형 Nampt를 코딩하는 유전자(DNA) 혹은 상기 발현 벡터를 포함하는 형질 전환체도 제공한다. 본 발명의 형질 전환체는, 전항에 기재한 바와 같이, 개변형 Nampt를 코딩하는 DNA에 더하여, NMN 생산 경로에서 작용하는 다른 효소를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이어도 된다.

형질 전환체의 숙주는, 발현 벡터 등을 이용한 단백질 발현 시스템에 의해 소정의 효소를 발현할 수 있는 세포라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 대장균(에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)), 고초균(바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 방선균(예를 들어 로도코커스속(Rhodococcus), 코리네박테리움속(Corynebacterium)) 등의 세균; 효모(예를 들어 사카로마이세스속(Saccharomyces), 칸디다속(Candida), 피키아속(Pichia)); 사상균; 식물 세포; 곤충 세포, 포유류 세포 등의 동물 세포를 들 수 있다. 이들 중에서도, 대장균, 코리네박테리움속 세균 및 로도코커스속 세균, 그리고 사카로마이세스속 효모, 칸디다속 효모 및 피키아속 효모가 바람직하고, 대장균이 보다 바람직하다.

대장균으로서는, 예를 들어 대장균 K12주 및 B주, 그리고 그들의 야생주 유래의 파생주인 W3110주, JM109주, XL1-Blue주(예를 들어, XL1-BlueMRF'), K802주, C600주, BL21주, BL21(DE3)주, BN8주(WO2019/065876) 등을 들 수 있다.

숙주에의 발현 벡터의 도입 방법은, 숙주에 적합한 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 이용 가능한 방법으로서는, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 칼슘 이온을 사용하는 방법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법, 인산칼슘법, 리포펙션법을 들 수 있다.

발현 벡터가 도입된 형질 전환체는, 숙주로서 사용한 세포(균체)에 적합한 방법으로 배양하여, 소정의 각 효소를 발현시키면 된다. 전술한 바와 같이, 소정의 각 효소를 코딩하는 유전자를 별개로 포함하는 형질 전환체끼리 조합하는 경우, 예를 들어 Nampt와 Prs를 발현하는 형질 전환체와 Ppk를 발현하는 형질 전환체를 제작하여 조합시킬 경우에는, 각각의 형질 전환체를 동일한 배지에서 배양해도 되고, 따로따로의 배지에서 배양한 후에 혼합해도 된다.

형질 전환체, 형질 전환체로 조제한 휴지 균체, 막투과성 향상 균체, 불활성화 균체, 파쇄 균체, 파쇄 균체로 조제한 무세포 추출물 및 이들에 대하여 안정화 처리를 행한 안정화 처리물(상세한 것은 후기 제2 공정에 관한 사항을 참조)을 사용하여 NMN의 생성 반응을 행하는 경우, 반응물(기질)인 리보오스나 NAM, 생성물인 NMN의 분해 또는 부반응이 일어나서, NMN을 효율적으로 제조할 수 없는 경우가 있다. 그 경우, 분해나 부반응의 원인이 되는 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 이하의 (a) 내지 (i)에 나타내지는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자가, 결손 또는 파괴되어 있는 숙주를 사용할 수 있다.

(a) EC 3.1.3.5

(b) EC 3.5.1.19

(c) EC 2.4.2.1

(d) EC 3.5.1.42

(e) EC 1.17.2.1

(f) EC 1.17.1.5

(g) EC 3.2.2.1

(h) EC 3.2.2.3

(i) EC 3.2.2.14

(a) EC 3.1.3.5로 분류되는 효소는, 5'-뉴클레오다아제이며, NMN을 가수 분해하여 니코틴아미드 리보시드(NR)와 인산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소가 포함된다. 예를 들어, 대장균의 ushA, surE, yrfG, yjjG 등을 들 수 있고, 특히 UshA 또는 그 호몰로그가 바람직하다.

(b) EC 3.5.1.19로 분류되는 효소는, 니코티나미다아제이며, NAM의 분해에 관여하는 효소가 포함된다. 예를 들어, 대장균의 pncA를 들 수 있다.

(c) EC 2.4.2.1로 분류되는 효소는, 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라아제이며, NR을 가인산 분해하여, NAM과 리보오스-1-인산(R1P)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소가 포함된다. 예를 들어, 대장균의 deoD 또는 그 호몰로그 유전자를 들 수 있다.

(d) EC 3.5.1.42로 분류되는 효소는, 니코티나미드 모노뉴클레오티드 데아미나아제이며, NMN을 가수 분해하여, NaMN과 암모니아를 생성하는 반응을 촉매하는 효소가 포함된다. 예를 들어, 대장균의 pncC 또는 그 호몰로그 유전자를 들 수 있다.

(e) EC 1.17.2.1 및 (f) EC 1.17.1.5로 분류되는 효소는, 니코티네이트 데히드로게나아제이며, NAM으로부터의 히드록시니코틴산의 부생에 관여할 수 있는 효소가 포함된다.

(g) EC 3.2.2.1로 분류되는 효소는, 퓨린 뉴클레오시다아제이며, NR을 가수 분해하여, NAM과 리보오스를 생성하는 반응을 촉매하는 효소가 포함된다. 예를 들어, Pu-N 또는 그 호몰로그를 들 수 있다.

(h) EC 3.2.2.3로 분류되는 효소는, 우리딘 뉴클레오시다아제이며, NR을 가수 분해하여, NAM과 리보오스를 생성하는 반응을 촉매할 수 있는 효소가 포함된다. 예를 들어, URH1 또는 그 호몰로그를 들 수 있다.

(i) EC 3.2.2.14로 분류되는 효소는, NMN 뉴클레오시다아제이며, NMN을 가수 분해하여, NAM과 R5P를 생성하는 반응을 촉매하는 효소가 포함된다. 본 발명에 있어서는, NMN 뉴클레오시다아제를 코딩하는 유전자를 파괴 또는 결실시키는 것이 바람직하다.

결손 또는 파괴되는 것은, (d)에 나타내지는 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자와, (a) (c) (g) (h) (i)에 나타내지는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자인 것이 바람직하고, (d)에 나타내지는 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자와, (a)에 나타내지는 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자인 것이 보다 바람직하다.

유전자를 파괴 또는 결실시키는 방법은, 특별 한정되는 것은 아니며, 공지된 유전자 파괴 또는 결실 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 선상으로 된 유전자 파괴 또는 결실용 단편을 사용하는 방법, 복제 기점을 포함하지 않는 환상의 유전자 파괴 또는 결실 플라스미드를 사용하는 방법, 그룹 II 인트론을 사용하는 방법, Red-ET 상동 재조합법, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 등의 게놈 편집을 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

5. 개변형 Nampt의 제조 방법

개변형 Nampt는, 상기 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 Nampt 활성을 갖는 단백질을 채취함으로써 제조할 수 있다. 본 발명은, 그러한 개변형 Nampt의 제조 방법도 제공한다.

본 발명에 있어서, 「배양물」에는, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 혹은 균체의 파쇄물 중 어느 것도 포함한다.

형질 전환체의 배양은, 숙주의 배양에 통상 사용되는 방법에 따라서 행한다. 본 발명의 형질 전환체를 배양하는 배지는, 숙주균이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지라면, 천연 배지, 합성 배양지 중 어느 것을 사용해도 된다. 탄소원으로서는, 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 전분 등의 탄수화물, 아세트산 및 프로피온산 등의 유기산, 에탄올 및 프로판올 등의 알코올류를 들 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄 및 인산암모늄 등의 무기산, 혹은 유기산의 암모늄염, 또는 기타 질소 함유 화합물을 들 수 있다.

그 밖에도, 펩톤, 효모 엑기스, 육 엑기스, 옥수수 침지액, 각종 아미노산 등을 사용해도 된다. 무기물로서는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산아연, 황산구리, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라서 배양 중의 발포를 방지하기 위해 소포제를 첨가해도 된다. 또한, 배지에는 효소 발현의 유도제가 되는 화합물을 첨가해도 된다.

배양 중, 벡터 및 목적 유전자의 탈락을 방지하기 위해 선택압을 건 상태에서 배양해도 된다. 즉, 선택 마커가 약제 내성 유전자일 경우에 상당하는 약제를 배지에 첨가하거나, 선택 마커가 영양 요구성 상보 유전자일 경우에 상당하는 영양 인자를 배지로부터 제거하거나 해도 된다.

또한, 선택 마커가 자화성 부여 유전자일 경우에는, 상당하는 자화 인자를 필요에 따라서 유일하게 인자로서 첨가할 수 있다. 예를 들어, 암피실린 내성 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환한 대장균을 배양할 경우, 배양 중, 필요에 따라서 암피실린을 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 경우에는, 필요에 따라서 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)로 유도 가능한 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때에는, IPTG 등을 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 인돌아세트산(IAA)으로 유도 가능한 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때에는, IAA 등을 배지에 첨가할 수 있다.

형질 전환체의 배양 조건은, 목적으로 하는 개변형 Nampt의 생산성 및 숙주의 생육을 방해할 수 없는 조건이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 37℃에서 5 내지 100시간 행한다. pH의 조정은, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용하여 행하고, 예를 들어 로도코커스균이라면 pH 6 내지 9로 조정한다.

배양 방법으로서는, 고체 배양, 정치 배양, 진탕 배양, 통기 교반 배양 등을 들 수 있지만, 특히 로도코커스균의 형질 전환체를 배양할 경우에는, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양(병 퍼멘터)에 의해 호기적 조건 하에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 배양 조건에서 배양하면, 고수율로 본 발명의 개변형 Nampt를 상기 배양물 중, 즉, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 혹은 균체의 파쇄물 중 적어도 어느 것에 축적할 수 있다.

배양 후, 개변형 Nampt가 균체내 또는 세포내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써, 목적으로 하는 개변형 Nampt를 채취할 수 있다. 균체 또는 세포의 파쇄 방법으로서는, 프렌치 프레스 또는 균질기에 의한 고압 처리, 초음파 처리, 글래스 비즈 등에 의한 마쇄 처리, 리소자임, 셀룰라아제 또는 펙티나아제 등을 사용하는 효소 처리, 동결 융해 처리, 저장액 처리, 파지에 의한 용균 유도 처리 등을 이용할 수 있다.

파쇄 후, 필요에 따라서 균체 또는 세포의 파쇄 잔사(세포 추출액 불용성 분획을 포함함)를 제거할 수 있다. 잔사를 제거하는 방법으로서는, 예를 들어 원심 분리나 여과 등을 들 수 있고, 필요에 따라서 응집제나 여과 보조제 등을 사용하여 잔사 제거 효율을 높일 수도 있다. 잔사를 제거한 후에 얻어진 상청은, 세포 추출액 가용성 분획이며, 조정제한 개변형 Nampt 용액으로 할 수 있다.

또한, 개변형 Nampt가 균체내 또는 세포내에 생산되는 경우, 균체나 세포 그 자체를 원심 분리, 막분리 등으로 회수하여, 미파쇄인채로 사용하는 것도 가능하다.

개변형 Nampt가 균체외 또는 세포외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리나 여과 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 필요에 따라서 황산암모늄 침전에 의한 추출 등에 의해 상기 배양물 중에서 개변형 Nampt를 채취하고, 또한 필요에 따라서 투석, 각종 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 그래피 등)를 사용하여 단리 정제할 수도 있다.

형질 전환체를 배양하여 얻어진 Nampt의 생산 수율은, 예를 들어 배양액당, 균체 습중량 또는 건조 중량당, 조효소액 단백질당 등의 단위로, SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)나 Nampt 활성 측정 등에 의해 확인할 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. SDS-PAGE는 당업자라면 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 또한, Nampt 활성은 상술한 활성의 값을 적용할 수 있다.

상기한 방법 이외에도, 무세포 단백질 합성계를 채용하여 개변형 Nampt를 산생하는 것도 가능하다. 무세포 단백질 합성계란, 세포 추출액을 사용하여 시험관 등의 인공 용기내에서 단백질을 합성하는 계이다. 또한, 본 발명에 있어서 사용되는 무세포 단백질 합성계에는, DNA를 주형으로 하여 RNA를 합성하는 무세포 전사계도 포함된다.

이 경우, 상기 숙주에 대응하는 생물은, 하기 세포 추출액이 유래하는 생물에 상당한다. 여기서, 상기 세포 추출액은, 진핵 세포 유래 또는 원핵 세포 유래의 추출액, 예를 들어 소맥 배아, 대장균 등의 추출액을 사용할 수 있다. 또한, 이들 세포 추출액은 농축된 것이어도 농축되지 않은 것이어도 된다.

세포 추출액은, 예를 들어 한외 여과, 투석, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전 등에 의해 얻을 수 있다. 또한 본 발명에 있어서, 무세포 단백질 합성은 시판되고 있는 키트를 사용하여 행할 수도 있다. 그러한 키트로서는, 예를 들어 시약 키트 PROTEIOSTM(도요보), TNTTM 시스템(TNTTM System)(프로메가), 합성 장치의 PG-메이트TM(PG-MateTM)(도요보), RTS(로슈·다이아그노스틱스) 등을 들 수 있다.

상기와 같이 무세포 단백질 합성에 의해 얻어지는 개변형 Nampt는, 전술한 바와 같이 적절히 크로마토그래피를 선택하여 정제할 수 있다.

6. 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법

6.1 개변형 Nampt에 의한 NMN의 제조

본 발명의 개변형 Nampt는, 효소 촉매로서 물질 생산에 이용할 수 있다. 예를 들어, 개변형 Nampt의 존재 하에서, 포스포리보실피로포스파이트(PRPP) 및 니코틴아미드(NAM)를 접촉시켜, 생성하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)를 채취함으로써, NMN 화합물을 제조할 수 있다.

효소 촉매로서는, 분리 정제된 Nampt 이외에도, 본 발명의 형질 전환체를 배양한 후의 배양물, 또는 당해 배양물의 처리물을 이용할 수 있다. 처리물로서는, 예를 들어 배양 후의 세포(형질 전환체)를 아크릴아미드 등의 겔로 포함한 것, 글루타르알데히드로 처리한 것, 수지, 알루미나, 실리카, 제올라이트 및 규조토 등의 무기 담체에 담지한 것 등을 들 수 있다.

여기서, 「접촉」이란, 개변형 Nampt와 PRPP 및 NAM을 동일한 반응계 또는 배양계에 존재시키는 것을 의미하고, 예를 들어 분리 정제한 개변형 Nampt와 PRPP 및 NAM을 혼합하는 것, 개변형 Nampt 유전자를 발현하는 세포(형질 전환체)의 배양 용기에 PRPP 및 NAM을 첨가하는 것, 당해 세포를 PRPP 및 NAM의 존재 하에서 배양하는 것, 당해 세포의 추출액을 PRPP 및 NAM과 혼합하는 것 등이 포함된다.

포스포리보실피로포스파이트는, 예를 들어 포스포리보실피로인산 신타아제의 존재 하에서 리보오스-5-인산으로 제조할 수 있다. 포스포리보실피로인산 신타아제로서는, 예를 들어 인간(호모 사피엔스) 유래의 것(NP_002755), 고초균(바실루스 서브틸리스) 유래의 것(BAA05286), 바실루스 칼돌라이티쿠스(Bacillus caldolyticus) 유래의 것(CAA58682), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래의 것(Q680A5), 메타노칼도콕쿠스 잔나스키(Methanocaldococcus jannaschii) 유래의 것(Q58761)을 들 수 있다. 필요에 따라서 변이형 포스포리보실피로인산 신타아제를 사용할 수도 있다. 변이형 포스포리보실피로인산 신타아제로서는, 예를 들어 인간 유래의 Prs에 관한, Asp51His(51위의 ASP의 His로의 치환, 이하 마찬가지), Asn113Ser, Leu128Ile, Aspl82His, Ala189Val 및 Hisl92Gln 등의 변이형, 그리고 그들에 대응하는 다른 생물 유래의 Prs에 있어서의 변이형, 예를 들어 고초균 유래의 Prs에 대해서, Asn120Ser(상기 Asn113Ser에 대응), Leu135Ile(상기 Leu128Ile에 대응) 등의 변이형을 들 수 있다.

리보오스-5-인산은, 리보키나아제의 존재 하에 리보오스로 제조할 수 있다. 리보키나아제로서는, 각종 생물에서 유래하는 천연형 리보키나아제, 또는 그 아미노산 서열을 개변하여 제작된 변이형 리보키나아제를 사용할 수 있고, 예를 들어 인간(호모 사피엔스) 유래의 것(NP_002755), 효모(사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)) 유래의 것(P25332), 고초균(바실루스 서브틸리스) 유래의 것(P36945), 대장균(에스케리키아 콜라이) 유래의 것(AAA51476), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 유래의 것(P44331)을 들 수 있다.

6.2 효소의 발현 강화

본 발명의 NMN의 제조 방법은, 예를 들어 WO2020/129997에 기재된 방법에 따라서 실시해도 된다. 즉, Nampt, Prs 및 Ppk의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, R5P, NAM, ATP 및 폴리인산과 접촉시키는 공정을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 NMN의 제조 방법은, 상기 R5P의 제조 공정으로서, Rbk 및 Ppk의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, 리보오스, ATP 및 폴리인산을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 공정을 더 포함한다. 즉, 본 발명에서는, ATP 재생 반응을 이용하면서, 소정의 효소 반응을 진행시킴으로써 NMN을 제조한다.

이러한 NMN의 제조 방법은, 전형적으로는, 하기 (1) 내지 (3)의 공정(본 명세서에 있어서, 각각 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정이라고 칭함)을 순차로 행함으로써 실시된다. 이들 공정은 동일한 사람이 실시해도 되고, 다른 사람이 실시해도 된다. 또한, 이들 공정은 연속적으로 행해도 되고, 각 공정 사이에 소정의 기간을 두고 단계적으로 행해도 된다.

(1) Nampt, Prs, Rbk 및 Ppk의 각 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질 전환체를 제작하여 배양하거나, 또는 당해 각 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액에서 단백질 합성 반응을 행하여, 당해 각 효소를 발현시키는 공정(제1 공정);

(2) 필요에 따라서, 제1 공정을 거친 형질 전환체 또는 무세포 단백질 합성 반응액으로부터, 처리물을 조제하는 공정(제2 공정); 및

(3) 제1, 제2 공정을 거친 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, 각 기질 화합물과 접촉시키는 공정(제3 공정).

이하, 본 발명의 NMN의 제조 방법에 대해서, 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 행하는 실시 형태에 따라서, 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명의 NMN의 제조 방법은, 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 범위에서, 이하에 구체적으로 기재하는 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 적절히 개변한 실시 형태에서 행하는 것도 가능하다.

[제1 공정]

제1 공정은, Nampt, Prs, Rbk 및 Ppk의 각 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질 전환체를 제작하여 배양하거나, 또는 당해 각 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액에서 단백질 합성 반응을 행하여, 당해 각 효소를 발현시키는 공정이다.

본 실시 형태에서는, Nampt, Prs 및 Ppk와, 필요에 따라서 또한 Rbk의 4 효소를 이용한다. Nampt, Prs, Ppk 및 Rbk는 모두 기지의 효소이며, 그 아미노산 서열 및 그것을 코딩하는 유전자의 염기 서열은 당업자라면 용이하게 입수 가능하다. 상기 소정의 4 효소는, 각각의 목적 반응을 촉매할 수 있는 것이면, 천연형의 효소여도 되고, 천연형의 효소의 아미노산 서열을 개변함으로써 제작된, 바람직하게는 발현량이나 효소 활성이 향상된, 변이형의 효소여도 된다. 또한, 정제의 간략화나 가용성 발현의 촉진, 항체에 의한 검출 등을 목적으로 하여, 각 효소에는 각종 태그(단백질 또는 펩티드)가 부가되어 있어도 된다. 태그의 종류로서는, His 태그(히스티딘 태그), Strep(II)-tag, GST 태그(글루타티온-S-트랜스퍼라아제 태그), MBP 태그(말토오스 결합 단백질 태그), GFP 태그(녹색 형광 단백질 태그), SUMO 태그(Small Ubiquitin-related(like) Modifier 태그) FLAG 태그, HA 태그, myc 태그 등을 들 수 있다. 또한, 4 효소는 서로 융합 단백질로서 발현되어 있어도 된다.

Prs로서는, 예를 들어 인간(호모 사피엔스) 유래의 것(NP_002755), 고초균(바실루스 서브틸리스) 유래의 것(BAA05286), 바실루스 칼돌라이티쿠스 유래의 것(CAA58682), 아라비돕시스 탈리아나 유래의 것(Q680A5), 메타노칼도콕쿠스 잔나스키 유래의 것(Q58761)을 들 수 있다. 장시간에 걸쳐, 특히 제조계내의 기질 농도가 높은 경우에, 제2 반응에 의한 PRPP의 생성 및 그것에 이어지는 제3 반응에 의한 NMN의 생성을 계속시킬(즉, 최종 산물인 NMN의 제조계내의 농도를 계속 상승시킬) 수 있도록, WO2020/129997에 기재되어 있는 변이형 Prs를 사용할 수도 있다. 변이형 Prs로서는, 예를 들어 인간 유래의 Prs에 관한, Asp51His(51위의 ASP의 His로의 치환, 이하 마찬가지), Asn113Ser, Leu128Ile, Aspl82His, Ala189Val 및 Hisl92Gln 등의 변이형, 그리고 그들에 대응하는 다른 생물 유래의 Prs에 있어서의 변이형, 예를 들어 고초균 유래의 Prs에 대해서, Asn120Ser(상기 Asn113Ser에 대응), Leu135Ile(상기 Leu128Ile에 대응) 등의 변이형을 들 수 있다.

Rbk로서는, 각종 생물에서 유래하는 천연형 Rbk, 또는 그 아미노산 서열을 개변하여 제작된 변이형 Rbk를 사용할 수 있고, 예를 들어 인간(호모 사피엔스) 유래의 것(NP_002755), 효모(사카로마이세스 세레비시아) 유래의 것(P25332), 고초균(바실루스 서브틸리스) 유래의 것(P36945), 대장균(에스케리키아 콜라이) 유래의 것(AAA51476), 헤모필루스 인플루엔자에 유래의 것(P44331)을 들 수 있다.

Ppk(EC number: 2.7.4.1)는, 본 발명에 있어서, 제1 반응에서 생성되는 ADP 또는 제2 반응에서 생성되는 AMP와, 폴리인산으로부터, ATP를 재생하는 반응(ATP 재생 반응)을 위해 이용되는 효소이다.

Ppk는 아미노산 서열 및 키네틱스의 차이에 의해 2개의 패밀리, 폴리인산 키나아제 1형 패밀리(Ppk1) 및 폴리인산 키나아제 2형 패밀리(Ppk2)로 분류할 수 있다. 폴리인산을 기질로 하여 ATP를 재생하는 활성으로서는, Ppk1보다도 Ppk2의 쪽이 높다. 따라서, 본 발명에 있어서의 Ppk로서는, Ppk2를 사용하는 것이 바람직하다.

Ppk2는 또한, 3개의 서브패밀리, 클래스 1, 클래스 2 및 클래스 3으로 분류할 수 있다. 클래스 1 및 클래스 2의 Ppk2는 각각, ADP를 인산화하여 ATP를 생성하는 반응, 및 AMP를 인산화하여 ADP를 생성하는 반응을 촉매한다. 이에 비해 클래스 3의 Ppk2는, AMP의 인산화 반응 및 ADP의 인산화 반응의 양쪽을 촉매할 수 있기 때문에, 단독으로 AMP로부터 ATP를 생성할 수 있다.

본 발명에 있어서의 Ppk로서는, ADP로부터 ATP를 재생하기 위한 Ppk2 클래스 1과, AMP로부터의 ADP를 재생하기 위한 Ppk2 클래스 2의 조합을 사용할 수 있다. 또는, AMP로부터의 ADP를 재생하기 위해 아데닐산 키나아제(AMP+ATP→2ADP라는 반응을 촉매함)를 병용하는 경우에는, ADP로부터 ATP를 재생하기 위한 Ppk2 클래스 1 또는 Ppk1만을 본 발명에 있어서의 Ppk로서 사용하는 것도 가능하다. 그러나, ADP로부터의 ATP의 재생과, AMP로부터의 ATP의 재생의, 양쪽의 반응을 단독으로 촉매할 수 있다는 효율성이 양호한 점에서, Ppk2 클래스 3을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 PpK를 사용하는 경우에는, 제1 반응의 Ppk와 제2 반응의 Ppk를 공통화할 수 있다.

Ppk2 클래스 3으로서는, 예를 들어 데이노콕쿠스 라디오두란스 유래의 것(NP_293858), 파에나르트로박터 아우레슨스(Paenarthrobacter aurescens) 유래의 것(ABM08865), 메이오써무스 루베(Meiothermus rube) 유래의 것(ADD29239), 데이노콕쿠스 제오써말리스(Deinococcus geothermalis) 유래의 것(WP_011531362), 서모시네코코커스 엘롱카투스(Thermosynechococcus elongatus) 유래의 것(NP_682498)을 들 수 있다. 한편, Ppk2 클래스 1로서는, 예를 들어 로도박터 스페어로이디스(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 것(CS253628), 시노르히조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti) 유래의 것(NP_384613), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 PA0141(NP_248831), 슈도모나스 애루지노사 유래의 PA2428(NP_251118), 프란시셀라 투라렌시스(Francisella tularensis) 유래의 것(AJI69883)을 들 수 있다. Ppk2 클래스 2로서는, 예를 들어 슈도모나스 애루지노사 유래의 PA3455(NP_252145)를 들 수 있다. 또한, 아데닐산 키나아제로서는, 예를 들어 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 유래의 것(AAP07232)을 들 수 있다.

[제2 공정]

제2 공정은, 필요에 따라서 제1 공정을 거친 형질 전환체 또는 무세포 단백질 합성 반응액으로 처리물을 조제하는 공정이다. 형질 전환체의 처리물로서는, 형질 전환체로 조제한 휴지 균체, 막투과성 향상 균체, 불활성화 균체, 파쇄 균체 등을 들 수 있다. 또한, 파쇄 균체로 조제한 무세포 추출물 및 정제 효소도 본 발명의 처리물에 포함된다. 무세포 단백질 합성 반응액의 처리물로서는, 무세포 단백질 합성 반응액으로 조제한 정제 효소를 들 수 있다. 나아가, 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액 및 이들 처리물에 대하여 안정화 처리를 행한 안정화 처리물도, 본 발명의 처리물에 포함된다.

휴지 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 휴지 균체란, 그 증식이 실질적으로 정지된 상태에 놓인 균체를 의미한다. 구체적으로는, 배양에 의해 증식시킨 형질 전환체를 배지로부터 회수한 후, 형질 전환체가 용이하게 이용 가능한 탄소원 등을 포함하지 않는 완충액 등에 현탁시키거나, 회수한 형질 전환체를 동결시키거나, 건조시켜 분말화하거나 함으로써 조제할 수 있다. 형질 전환체를 배지로부터 회수하는 방법은 어떤 방법이어도 되고, 예를 들어 원심 분리를 사용한 방법, 막여과를 사용한 방법 등을 들 수 있다. 원심 분리는, 형질 전환체를 침강시키는 원심력을 공급할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 원통형이나 분리판형 등을 이용할 수 있다. 원심력으로서는, 예를 들어 500G 내지 20,000G 정도로 행할 수 있다. 막여과는, 형질 전환체를 배지로부터 회수할 수 있으면, 정밀 여과(MF)막, 한외 여과(UF)막 중 어느 것을 사용하여 행해도 된다. 형질 전환체를 현탁하는 완충액으로서는, 형질 전환체의 증식이 실질적으로 정지되고, 또한 소정의 각 효소의 기능이 유지되는 것이면 어떠한 것이어도 되고, 예를 들어 인산 완충액, 아크릴산 완충액, 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노메탄)-염산 완충액, HEPES(2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid)나 기타 굿 완충액(Good's buffers) 등을 사용할 수 있다. 형질 전환체를 동결할 경우에는, 상기 원심 분리 등의 조작에 의해 대부분의 수분을 제거한 상태, 또는 적당한 완충액에 현탁된 상태에서 동결하면 된다. 동결하는 온도는, 형질 전환체를 현탁하는 완충액의 성분에 따라서도 다르지만, 실질적으로 형질 전환체가 동결되는 온도라면 어떠한 온도여도 되고, 예를 들어 -210℃ 내지 0℃ 등의 범위에서 행하면 된다. 또한, 형질 전환체를 건조시키는 경우, 그 건조 방법으로서는, 형질 전환체의 증식이 실질적으로 정지되고, 또한 소정의 각 효소의 기능이 유지되는 방법이면 어떠한 방법이어도 되고, 동결 건조법이나 분무 건조법 등을 들 수 있다.

막투과성 향상 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매나 계면 활성제로 형질 전환체를 처리함으로써, 기질이나 생성물이, 형질 전환체의 세포막이나 세포벽을 통과하기 쉬워진다. 사용하는 유기 용매나 계면 활성제의 종류로서는, 막투과성이 향상되고, 또한 소정의 각 효소의 기능이 유지되는 것이면 특별 한정되지 않고, 유기 용매라면 톨루엔이나 메탄올 등, 계면 활성제라면 트리톤-X 100(Triton-X 100)이나 염화벤제토늄 등을 들 수 있다.

불활성화 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어 약제 처리나 가열 처리에 의해 행할 수 있다. 약제에 의한 처리는, 예를 들어 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 염화메틸스테아로일, 브롬화세틸트리메틸암모늄 등의 양이온계 계면 활성제, 염산알킬디아미노에틸글리신 등의 양성 이온계 계면 활성제 등을 사용할 수 있다. 또한, 에탄올 등의 알코올류, 2-머캅토에탄올 등의 티올류, 에틸렌디아민 등의 아민류, 시스테인, 오르니틴, 시트룰린 등의 아미노산류 등도 들 수 있다. 가열에 의한 처리는, 목적으로 하는 효소가 실활되지 않는 온도와 시간에서 열처리를 행하면 된다.

파쇄 균체의 조제는, 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 초음파 처리, 프렌치 프레스나 균질기에 의한 고압 처리, 비즈 밀에 의한 마쇄 처리, 충격 파쇄 장치에 의한 충돌 처리, 리소자임, 셀룰라아제, 펙티나아제 등을 사용하는 효소 처리, 동결 융해 처리, 저장액 처리, 파지에 의한 용균 유도 처리 등을 들 수 있고, 어느 방법을 단독 또는 필요에 따라서 조합하여 이용할 수 있다. 공업적 규모에서 세포의 파쇄를 행하는 경우에는, 조작성, 회수율, 비용 등을 감안하여, 예를 들어 고압 처리나 마쇄 처리, 충돌 처리 혹은 이들 처리에 효소 처리 등을 조합한 처리를 행하는 것이 바람직하다.

비즈 밀에 의한 마쇄 처리를 행하는 경우, 사용되는 비즈는, 예를 들어 밀도 2.5 내지 6.0g/cm³, 사이즈 0.1 내지 1.0mm의 것을 통상 80 내지 85％ 정도 충전함으로써 파쇄를 행할 수 있고, 운전 방식으로서는 회분식, 연속식 중 어느 것도 채용할 수 있다.

고압 처리를 행하는 경우, 처리 압력은, 세포로부터의 목적 단백질 회수율이 충분히 높은 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 40 내지 200MPa 정도, 바람직하게는 60 내지 150MPa 정도, 보다 바람직하게는 80 내지 120MPa 정도의 압력에서 파쇄를 행할 수 있다. 필요에 따라서, 장치를 직렬로 배치하거나, 복수 스테이지 구조의 장치를 사용하거나 함으로써, 다단계 처리를 행하여, 파쇄 및 조작 효율을 향상시키는 것도 가능하다. 통상, 처리 압력 10MPa당 2 내지 3℃의 온도 상승이 발생하는 점에서, 필요에 따라서 냉각 처리를 행하는 것이 바람직하다.

충돌 처리의 경우, 예를 들어 세포 슬러리를 미리 분무 급속 동결 처리(동결속도: 예를 들어 1분간당 수천℃) 등에 의해 동결 미세 입자(예를 들어 50㎛ 이하)로 해두고, 이것을 고속(예를 들어 약 300m/s)의 반송 가스에 의해 충돌판에 충돌시킴으로써 효율적으로 세포를 파쇄할 수 있다.

무세포 추출물은, 파쇄 균체로부터 파쇄 잔사(세포막이나 세포벽 등을 포함하는 불용성 분획)를 제거함으로써 조제할 수 있다. 파쇄 잔사의 제거는 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들어 원심 분리나 막여과, 여과포 여과 등을 이용할 수 있다. 원심 분리 조작은 상술한 바와 같이 행할 수 있지만, 형질 전환체의 파쇄 잔사가 미세하여, 용이하게 침강하기 어려운 경우에는, 필요에 따라서 응집제 등을 사용하여 잔사 침전 효율을 높일 수도 있다. 막여과도, 상술한 바와 같이 행할 수 있지만, 형질 전환체의 파쇄 잔사가 미세할 경우에는, 특히 한외 여과(UF)막을 사용할 수 있다. 여과포 여과를 행하는 경우에는, 여과 보조제나 응집제를 병용하여 행할 수 있다. 여과 보조제로서는, 규조토나 셀룰로오스 파우더, 활성탄 등을 들 수 있다. 응집제로서는, 양이온 응집제, 음이온계 응집제, 양성계 응집제, 비이온계 응집제 등을 들 수 있다. 상기 어느 조작에 의해, 균체가 존재하지 않는 상청을 회수하여, 무세포화함(셀 프리로 함)으로써, 소정의 각 효소를 포함하는 무세포 추출물을 조제할 수 있다.

정제 효소의 조제는, 일반적인 생화학적 방법, 예를 들어 황산암모늄 침전, 각종 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피(세파덱스(Sephadex) 칼럼 등), 이온 교환 크로마토그래피(DEAE-토요펄(DEAE-Toyopearl) 등), 친화성 크로마토그래피(탈론 메탈 어피니티 레진(TALON Metal Affinity Resin) 등), 소수성 크로마토그래피(부틸 토요펄(butyl Toyopearl) 등), 음이온 크로마토그래피(모노큐(MonoQ) 칼럼 등)), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 등을, 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써 행할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 상술한 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액 및 그들 처리물에 대하여, 안정화 처리를 행한 것(안정화 처리물)을 사용할 수도 있다. 안정화 처리는, 미처리의 상태보다도, 환경 인자(온도, pH, 화학 물질 농도 등)에 대한 소정의 각 효소의 안정성, 혹은 보존 시의 안정성이 향상되는 처리라면 어떠한 처리여도 된다. 예를 들어 아크릴아미드 등의 겔에의 포함, 글루타르알데히드 등의 알데히드류에 의한 처리(CLEA: Cross-linked enzyme aggregate를 포함함), 무기 담체(알루미나, 실리카, 제올라이트, 규조토 등)에의 담지 처리 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용하는 기질이나 생성물은, 극성이 비교적 높고, 세포막이나 세포벽이 물질 이동의 율속이 될 가능성이 있다. 따라서, 기질이나 생성물의 투과성의 관점에서, 본 발명에서는, 특히 파쇄 균체, 무세포 추출물, 정제 효소, 또는 그들의 안정화 처리물을 사용하는 것이 바람직하다.

상술한 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물은, 그 효소 활성이 유지되는 한, 어떠한 조건에서 보존할 수도 있다. 원한다면 적절한 조건 하에서(예를 들어 -80℃ 내지 -20℃, 1일 내지 1년) 그들 용액을 동결하여, 사용 시(제3 공정의 실시 시)까지 보존하도록 해도 된다.

전술한 바와 같이, 소정의 각 효소를 코딩하는 유전자를 별개로 포함하는 형질 전환체끼리를 조합하는 경우, 예를 들어 Nampt와 Prs의 발현이 강화된 형질 전환체, 및 Ppk의 발현이 강화된 형질 전환체를 제작하여 조합하는 경우에는, (i) 각각의 형질 전환체에 대하여 따로따로 각 처리를 행한 후, 그들 처리물을 혼합하도록 해도 되고, (ii) 그들 형질 전환체를 혼합한 후, 일괄하여 당해 각 처리를 행해도 된다.

[제3 공정]

제3 공정은, 제1 공정을 거친 형질 전환체 또는 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 필요에 따라서 또한 제2 공정을 거친 그들 처리물을, 효소 반응의 각종 원료가 되는 기질과 접촉시키는 공정이다. 이 공정에 있어서는, Prs에 의한 제2 반응과 Nampt에 의한 제3 반응이 Ppk에 의한 ATP 재생 반응과 공액하여 행해진다. Prs에 의한 제2 반응에서는, ATP를 인산원으로 하여 기질이 인산화되기 때문에, 또한 Nampt에 의한 제3 반응에서는, Nampt 자신이 갖는 ATP 가수 분해 활성에 의해 자기 인산화되기 때문에, ATP가 소비된다. 따라서, 양쪽 반응을 ATP 재생 반응과 공액하여 행함으로써, 소비된 ATP를 보충하면서 효율적으로 반응을 진행시킬 수 있다. 또한, Prs에 의한 제2 반응의 생성물인 포스포리보실피로인산(PRPP)은 비교적 불안정한 화합물이기 때문에, 제2 반응과 제3 반응을 동일계내에서 행함으로써, PRPP 생성 후, 빠르게 Nampt에 의한 제3 반응을 행할 수 있다. 본 발명에 있어서는, ATP 재생 반응에 의해 ADP 및/또는 AMP로부터 ATP가 재생되므로, ATP는 고갈될 일은 없지만, 반응 중에 유지하고자 하는 ATP 농도에 따라서, 적당한 양의 ATP를 반응 용매 중에 첨가하는 것이 필요해진다. 이 때, 필요에 따라서 ATP 대신에, ADP 또는 AMP를 반응 용매 중에 첨가해도 된다. 첨가한 ADP나 AMP는, ATP 재생계에 의해 계내에서 바로 ATP로 재생되기 때문에, 실질적으로 적당한 양의 ATP를 첨가한 것과 동일한 상태가 되기 때문이다. 또한, 이들을 임의의 비율로 함유하는 혼합물을 첨가해도 된다.

제2 반응 및 제3 반응은, 필요에 따라서 Ppk에 의한 ATP 재생 반응을 공액시킨 Rbk에 의한 제1 반응과 조합해도 된다. 양자를 조합하는 경우, Rbk에 의한 제1 반응을 먼저 행하고, 그 반응액을 원료로 하여, Prs에 의한 제2 반응과 Nampt에 의한 제3 반응을 행해도 되고, Rbk에 의한 제1 반응과, Prs에 의한 제2 반응 및 Nampt에 의한 제3 반응을 동일한 반응계에서 행해도 된다.

Prs에 의한 제2 반응과 Nampt에 의한 제3 반응은, Nampt, Prs 및 Ppk의 3 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 3 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, R5P, NAM, ATP 및 폴리인산과 접촉시킴으로써 행해진다.

Rbk에 의한 제1 반응은, Rbk 및 Ppk의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, 리보오스, ATP 및 폴리인산과 접촉시킴으로써 행해진다.

제3 공정에서 사용하는 상기 원료는, 일반적인 공급업자에게 구입한 것을 사용할 수도 있고, 자체 반응을 행하여 합성한 것을 사용할 수도 있다. 예를 들어, R5P는 시판품을 사용할 수도 있지만, 원료 비용의 관점에서, Rbk에 의한 제1 반응, 즉, Rbk 및 Ppk의 2 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 2 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, 리보오스 및 폴리인산과 접촉시킴으로써 합성한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 원료의 하나인 폴리인산은, 각종 쇄 길이의 것이 알려져 있다. 본 발명에 있어서 사용하는 폴리인산의 쇄 길이는, ATP 재생 반응을 효율적으로 실시할 수 있는 것이면 어떠한 쇄 길이의 것이어도 되지만, 용해시켰을 때의 용액의 점도나 비용의 관점에서, 쇄 길이는 3 내지 100 정도가 바람직하고, 3 내지 30 정도가 더욱 바람직하다.

제3 공정에서는, 필요에 따라서 상기 원료 이외의 화합물을, 소정의 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 소정의 각 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물과 접촉시키거나, 혹은 반응 용매 중(제조계내)에 포함하도록 해도 된다. 예를 들어, 각 효소가 기능을 발휘하기 위한 성분으로서, 마그네슘 이온 등의 금속 이온을 포함하는 것이 적절하다. 또한, 버퍼 성분을 포함하는 것도 바람직하다.

사용하는 형질 전환체가 실질적으로 살아 있을 경우, 즉, 세포 증식능을 유지하고 있을 경우, 실질적으로 형질 전환체가 증식되지 않는 조건에서 반응을 행하는 것이 바람직하다. 그러한 조건에서 반응을 행함으로써, 본 반응에 있어서의 기질이나 생성물이, 형질 전환체의 증식에 이용되거나, 분해되거나 하지 않고, 높은 수율로 목적 생성물로서 생산될 것을 기대할 수 있다. 실질적으로 형질 전환체가 증식되지 않는 조건이란, 실질적으로 반응계내의 형질 전환체의 수가 증가하지 않는 조건이면 어떠한 조건이어도 된다. 예를 들어, 형질 전환체가 용이하게 이용 가능한 탄소원(글루코오스 등)을 포함하지 않는 용액 중에서 반응을 행하는 것을 들 수 있다.

반응 용매 중(제조계내)에 포함되는, 소정의 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 소정의 각 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물의 양, 즉, 보다 구체적으로는 Nampt, Prs, Rbk 및 Ppk 각각의 양은, 적절히 조절할 수 있다. 마찬가지로, 반응 매체 중에 포함되는, R5P, NAM, ATP, 폴리인산, 리보오스, 또한 필요에 따라서 사용되는 기타 원료의 양도, 적절히 조절할 수 있다. 반응 용매 중(제조계내)의 상기 각 물질의 농도는 다음과 같다.

Nampt의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 5g/L이다. Prs의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 1g/L이다. Rbk의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 1g/L이다. Ppk의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 5g/L이다. 소정의 각 효소의 발현이 강화된 형질 전환체, 소정의 각 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물의 반응 용매에의 첨가량을 적절히 조정함으로써, 각 효소의 반응 용매 중의 농도를 상기 범위로 조절하는 것이 가능하다.

R5P의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 100g/L이다. 리보오스의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 100g/L이다. NAM의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 500g/L이다. ATP의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 100g/L이다. 폴리인산의 농도는, 예를 들어 1μg/L 내지 200g/L이다. 이들 원료의 반응 용매에의 첨가량 등의 조정에 의해, 각 원료의 반응 용매 중의 농도를 상기 범위로 조절하는 것이 가능하다. 반응 용매에의 첨가는, 원료에 따라서, 제3 공정의 최초에 일괄적으로 소정량을 투입하도록 해도 되고, 제3 공정의 최초 및/또는 도중의 적절한 단계에서, 순차로 소정량을 첨가하도록 해도 된다.

상술한 바와 같은 각 물질의 농도 이외의, 효소 반응을 진행시키기 위한 조건, 예를 들어 온도, 시간 등도, 적절히 조절할 수 있다. 반응 온도는, 각 효소의 촉매 효율이 최적이 되는 범위에서 조절하는 것이 바람직하다. 반응 시간은, 목적 화합물인 NMN의 생성량이 소정의 양에 도달할 때까지로 할 수 있다.

생성된 NMN은, 통상법에 따라서 제조계로부터 회수하고, 적절히 농축, 정제할 수 있다. 회수·정제의 방법은, NMN의 순도를 향상시킬 수 있으며, 또한 효율적으로 NMN을 회수할 수 있는 방법이면, 어떠한 방법을 사용할 수도 있지만, 예를 들어 이하와 같은 방법을 들 수 있다. NMN 합성 반응 후, 균체를 사용하여 반응을 행한 경우에는, 원심 분리나 막여과 등의 수단에 의해, 균체를 제거할 수 있다. 혹은, 무세포 추출물이나 정제 효소를 사용하여 반응을 행한 경우에는, 한외 여과막에 의한 여과나, 과염소산 등을 첨가하여 침전시킨 후에 원심 분리를 행하는 것 등에 의해 단백질 등을 제거할 수 있다. 과염소산에 의한 처리를 행한 경우에는, 수산화칼륨 등에 의해 pH를 약산성으로 되돌리고, 발생한 과염소산칼륨의 침전을 다시 원심 분리에 의해 제거한다. 균체 또는 단백질을 제거한 후, 필요에 따라서 활성탄 흡착에 의한 세정 처리를 행할 수 있다. NMN을 포함하는 수용액을 활성탄과 접촉시켜, NMN을 흡착시킨다. 여과지 등을 사용하여 NMN이 흡착된 활성탄을 여과한 후, 이소아밀알코올 등의 용매로 세정함으로써, 일정한 불순물을 제거할 수 있다. 계속해서, 음이온 교환 수지에 의해 처리함으로써, 추가로 정제를 행할 수 있다. NMN을 포함하는 용액을 도웩스(Dowex) 등의 음이온 교환 수지에 통과시키고, 흡착된 NMN을 물로 용출시킬 수 있다. 또한, 얻어진 NMN 수용액의 pH를 산성으로 하고, 대량의 아세톤을 가함으로써, NMN을 침전으로서 얻을 수 있다. 이 침전을 건조시킴으로써, 정제된 NMN을 얻을 수 있다.

본 발명은, 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합이, 생성되는 NMN의 몰수의 0.5 당량 이하가 되도록 행할 수 있다. 이것을 행하기 위한 수단으로서는, 결과적으로, NMN 제조를 위해 첨가하는 ATP 등의 사용량을 삭감시킬 수 있으면, 어떠한 방법을 사용할 수도 있지만, 예를 들어 이하에 나타내는 수단을 단독으로 또는 적절히 조합하여, 실시할 수 있다.

(1) ATP 재생계의 공액

(2) PPase의 공존

(3) 박테리아 유래 Nampt의 이용

(4) 불필요 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주의 이용

(5) 적절한 기질 농도

6.3 PPase의 존재 하에서의 Nampt의 발현 강화

본 발명의 NMN의 제조 방법은, PPase의 존재 하에서, Nampt의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, NAM 및 PRPP와 접촉시키는 공정을 포함하는 것이어도 된다.

본 실시 형태의 공정은, 이하의 점을 제외하고, 6.2의 실시 형태와 마찬가지로, 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 순차로 행함으로써 실시된다. 즉, 제1 공정 및 제2 공정은, 적어도 Nampt의 발현이 강화된 형질 전환체, 당해 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을 조제함과 함께, PPase의 발현이 강화된 형질 전환체 내지 특별히 발현은 강화되지 않지만 내재성 효소로서 PPase를 발현하고 있는 미생물 등, 당해 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을 조제하기 위한 공정으로 하고, 제3 공정에 있어서, 그러한 제1 공정 및 제2 공정을 거친 형질 전환체, 무세포 단백질 합성 반응액 또는 그들 처리물을, 적어도 NAM 및 PRPP와 접촉시키면 되는 점이다.

PPase(EC number: 3.6.1.1)는, 피로인산을 2분자의 인산으로 가수 분해하는 효소이다. 본 발명의 NMN의 제조 방법 중, 제2 발명군에서는, PPase의 존재 하에서, 제3 반응을 행함으로써, 제3 반응을 매우 효율적으로 진행시킬 수 있다.

Nampt에 의한 제3 반응에서는, NMN과 함께 피로인산이 부생한다. 일반적인 효소 반응의 견지에서는, 제3 반응계에 PPase를 가함으로써, 부생물인 피로인산이 인산으로 분해되어, NMN 생성 방향의 반응이 촉진되는 것은 예측된다. 그러나, Nampt의 경우, 반드시 그것은 자명하지는 않다. 왜냐하면, 피로인산을 분해해버리면, Nampt 반응이 계속적으로 진행되지 않을 가능성이 있기 때문이다. Nampt는, ATP를 가수 분해하여, 자기 인산화에 의해 활성화되는 것이 알려져 있다. Nampt에 의한 제3 반응이 계속하기 위해서는, 반응마다 자기 인산화된 Nampt의 탈인산화가 필요하고, 피로인산은 그 탈인산화의 트리거 물질이라고 여겨진다(문헌[Biochemistry 47, 11086-11096(2008)]). 따라서, PPase에 의해 피로인산을 제거해버리면, Nampt의 탈인산화가 일어나지 않고, 반응이 계속되지 않을 가능성을 충분히 생각할 수 있다. 그러나, 제2 발명군에서는, 제3 반응을 PPase의 존재 하에서 행함으로써, 현저하게 제3 반응을 촉진시킬 수 있다.

PPase로서는, 예를 들어 효모 유래의 것(P00817), 대장균 유래의 것(NP_418647), 고초균 유래의 것(P37487), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) 유래의 것(P38576), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii) 유래의 것(P95765), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)(O68579) 등을 들 수 있다.

PPase는, 제3 반응계에 첨가하는 것이 가능하면 어떠한 형태여도 되고, 또한 어떠한 방법으로 조제해도 된다. 구체적으로는, 먼저, 제1 발명군에 있어서의 제1 공정과 마찬가지로, PPase를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질 전환체를 제작하여 배양하거나, 또는 당해 각 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액에서 단백질 합성 반응을 행하여, 당해 각 효소를 발현시킨다. 또한, PPase는, 통상의 미생물 등에 있어서는, 생존에 필요한 효소로서 일정량 발현되고 있기 때문에, 특별 발현이 강화되지 않은 미생물 등을 배양하여, 그대로 사용할 수 있다. 계속해서, 제1 발명군에 있어서의 제2 공정과 마찬가지로, 제1 공정을 거친 형질 전환체, 특별 발현이 강화되지 않은 미생물 등 또는 무세포 단백질 합성 반응액으로 처리물을 조제할 수 있다. 혹은, 처리물의 1 양태로서 시판되고 있는 PPase 정제 효소를 이용할 수도 있다. 시판되고 있는 PPase 정제 효소로서는, 시그마·알드리치사의 효모 유래 PPase 정제 효소(제품 번호 10108987001) 등을 들 수 있다.

상기와 같이 하여 얻어진 PPase의 존재 하에서, Nampt의 발현이 강화된 형질 전환체, 상기 효소를 발현시킨 무세포 단백질 합성 반응액, 또는 그들 처리물을, NAM 및 PRPP와 접촉시킴으로써, 제2 발명군에 의한 NMN의 제조 방법을 실시할 수 있다. 제2 발명군에 의해, 제3 반응을 매우 효율적으로 진행시킬 수 있어, NMN을 효율적으로 제조할 수 있다. 제2 발명군에 의한 제3 반응은, 제3 반응 단독으로 행할 수도 있지만, 제1 반응, 제2 반응 및 ATP 재생 반응의 하나 이상 반응과 조합하여, 동일한 반응계에서 행할 수도 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 제1 발명군에 있어서의 제3 반응의 실시 형태를, 본 발명의 제2 발명군에서 규정하는 제3 반응으로 함으로써, 제1 발명군 및 제2 발명군을 통합한 NMN의 제조 방법을 실시하는 것도 가능하다.

사용하는 형질 전환체가 실질적으로 살아 있을 경우, 즉, 세포 증식능을 유지하고 있을 경우, 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 반응을 행하는 것이 바람직하다. 그러한 조건에서 반응을 행함으로써, 본 반응에 있어서의 기질이나 생성물이, 형질 전환체의 증식에 이용되거나, 분해되거나 하지 않고, 높은 수율로 목적 생성물로서 생산될 것을 기대할 수 있다. 실질적으로 형질 전환체가 증식하지 않는 조건이란, 실질적으로 반응계내의 형질 전환체의 수가 증가하지 않는 조건이면 어떠한 조건이어도 된다. 예를 들어, 형질 전환체가 용이하게 이용 가능한 탄소원(글루코오스 등)을 포함하지 않는 용액 중에서 반응을 행하는 것을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 제2 공정의 형태로서는, 특히 처리물이 정제 효소인 것이 바람직하다. 정제 효소를 사용함으로써 반응물(기질)이나 생성물의 분해 또는 부반응을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명에 의한 제3 반응의 촉진 효과를 보다 향수할 수 있다.

6.4 특정 효소의 파괴

본 발명의 NMN의 제조 방법은, (d) EC 3.5.1.42에 나타내지는 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자와, 이하의 (a) (c) (g) (h) (i)에 나타내지는 어느 하나 이상의 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴 또는 결실되고, 또한 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화되어 있는 형질 전환체 또는 그들 처리물을, 적어도 니코틴아미드(NAM)와 접촉시키는 공정을 포함하는 것이어도 된다.

(a) EC 3.1.3.5

(c) EC 2.4.2.1

(g) EC 3.2.2.1

(h) EC 3.2.2.3

(i) EC 3.2.2.14

본 실시 형태의 공정은, 이하의 점을 제외하고, 6.2의 실시 형태와 마찬가지로, 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 순차로 행함으로써 실시된다. 즉, 제1 공정 및 제2 공정은, 각종 EC 번호로 분류되는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴 또는 결실되고, 또한 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)의 발현이 강화되어 있는 형질 전환체 또는 그들 처리물을 조제하기 위한 공정으로 하고, 제3 공정에 있어서, 그러한 제1 공정 및 제2 공정을 거친 형질 전환체 또는 그들 처리물을, 적어도 NAM과 접촉시키면 되는 점이다.

6.5 ATP 사용량의 삭감

본 발명의 NMN의 제조 방법은, NMN의 제조를 위해 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을, 생성되는 NMN의 몰수의 0.5 당량 이하로 하는 것이어도 된다.

Nampt가 촉매하는 반응 자체에 ATP가 필수는 아니다. 그러나, 상술과 같이, Nampt에는 ATP 가수 분해 활성이 있고, ATP의 가수 분해에 의해 Nampt가 자기 인산화되어, NMN 생성에 유리한 방향으로 효소학적 파라미터나 화학 평형이 변화된다. 따라서, 제3 반응계내에 ATP가 충분히 존재하는 경우에는, PRPP로부터의 NMN의 생성에 수반하여, 실질적으로 1몰의 PRPP의 생성에 대해서, 1몰 이상의 ATP가 사용되게 된다. 즉, R5P를 원료로 한 제2 반응 및 제3 반응에 의한 NMN의 제조에 있어서는, 1몰의 NMN의 생성에 대해서, 계 2몰 이상의 ATP가, 리보오스를 원료로 한 제1 반응, 제2 반응 및 제3 반응에 의한 NMN의 제조에 있어서는, 1몰의 NMN의 생성에 대해서, 계 3몰 이상의 ATP가 사용되게 된다.

ATP는 고가인 화합물이기 때문에, NMN을 저렴하게 제조하고자 하는 경우, 그 사용량은 가능한 한 적은 쪽이 바람직하다. 즉, 본 발명의 NMN의 제조 방법에 있어서, NMN의 제조를 위해 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을, 생성되는 NMN의 몰수의 0.5 당량 이하로 하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 이하에 나타내는 수단을, 단독으로 또는 적절히 조합하여, ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을, 생성되는 NMN의 몰수의 0.5 당량 이하로 한다.

(1) ATP 재생계의 공액

부생한 ADP 또는 AMP를 ATP로 재생할 수 있는 계를, 적어도, 제2 반응 및 제3 반응을 포함하는 NMN 생성 반응계와 공액시킴으로써, NMN 제조를 위해 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. ATP 재생계로서는, AMP 및 ADP로부터 ATP를 재생할 수 있는 계라면 어떠한 계여도 되고, 예를 들어 폴리인산을 인산원으로 하여 Ppk를 사용하는 계, 포스포에놀피루브산을 인산원으로 하여 피루브산 키나아제를 사용하는 계, 크레아틴인산을 인산원으로 하여 크레아틴인산 키나아제를 사용하는 계 등을 들 수 있지만, 인산원의 비용의 관점에서는, 폴리인산을 인산원으로 하여 Ppk를 사용하는 계가 바람직하다. 폴리인산과 Ppk를 사용한 ATP 재생계를 공액시킨 NMN 생성 반응은, 구체적으로는 제1 발명군에 있어서의 제3 공정에 기재된 대로 실시할 수 있다.

(2) PPase의 공존

NMN 생성 반응계에 PPase를 공존시킴으로써, 부생물인 피로인산이 인산으로 분해되어, NMN 생성 방향의 반응이 촉진됨으로써, 결과적으로, NMN 제조를 위해 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. PPase를 공존시킨 NMN 생성 반응은, 구체적으로는 제2 발명군에 기재된 대로 실시할 수 있다.

(3) 박테리아 유래 Nampt의 이용

제3 반응을 촉매하는 효소 Nampt로서, 박테리아 유래의 Nampt를 사용함으로써, NMN의 생성이 효율적으로 진행되고, 결과적으로, NMN 제조를 위해 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. 박테리아 유래의 Nampt로서는, 제1 발명군에 있어서의 제1 공정에 기재된 것을 이용할 수 있다.

(4) 불필요 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주의 이용

형질 전환체, 형질 전환체로 조제한 휴지 균체, 막투과성 향상 균체, 불활성화 균체, 파쇄 균체, 파쇄 균체로 조제한 무세포 추출물, 및 이들에 대하여 안정화 처리를 행한 안정화 처리물을 사용하여 NMN의 생성 반응을 행하는 경우, 반응물(기질)이나 생성물의 분해, 혹은 부반응의 원인이 되는 유전자를 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 제1 발명군에 있어서의 제1 공정에 기재된 유전자 중 어느 하나 이상을, 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 6.4에 기재된 유전자 파괴 또는 결실시킨 숙주를 사용할 수 있다.

(5) 적절한 기질 농도

화학 평형이나 효소의 기질 친화성의 관점에서, 반응계내의 리보오스나 NAM 농도를 높임으로써, NMN 생성 속도나 생성량의 향상을 기대할 수 있으며, 결과적으로, NMN 제조를 위해 반응계에 첨가하는 ATP, ADP 및 AMP 각 몰수의 총합을 삭감할 수 있다. 한편, ATP도, 반응계내의 농도를 높임으로써, 마찬가지의 효과는 기대할 수 있지만, 필요 이상으로 ATP를 첨가해도, 거기에 적당한 NMN 생성량의 증가가 없으면, NMN을 1몰 생성시키기 위해 사용하는 ATP의 몰수는 증가해버린다. 즉, 적절한 양의 ATP를 반응계에 첨가함으로써, 효율적으로 NMN을 제조할 수 있다. 반응계에 첨가하는 ATP의 몰수는, 생성되는 NMN의 몰수의 1 당량 이하가 바람직하고, 0.5 당량 이하가 보다 바람직하고, 0.1 당량 이하가 더욱 바람직하다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] Nampt 라이브러리의 제작 및 스크리닝

본 실시예에서는, 소정의 각 효소로서 WO2019/065876에 기재되어 있는 하기의 것을 사용하였다.

Nampt: 헤모필루스 듀크레이 유래(AAR87771)

Prs: 고초균(바실루스 서브틸리스) 유래 Leu135Ile 변이체(BsPrsL135I)

Ppk: 데이노콕쿠스 라디오두란스 유래(NP_293858)

Rbk: 사카로미세스 세레비시아 유래(P25332)

PPase: 대장균(에스케리키아 콜라이) 유래(NP_418647)

(1) Nampt 변이체 라이브러리의 구축

표 1에 기재된 pEHdNampt(WO2019/065876, 서열 번호 3)를 주형으로 하여, 지정한 아미노산 잔기에 대응하는 염기 서열에 랜덤 변이를 도입하였다. 변이 도입용 프라이머명 및 그 염기 서열을 나타내는 서열 번호, Nampt 변이체명을 표 2에 나타낸다.

변이 도입 PCR 반응은, 표 3에 나타내는 반응액 조성 및 표 4에 나타내는 반응 조건에서 행하였다.

PCR 반응 종료 후, QIA퀵 PCR 퓨리피케이션 키트(QIAquick PCR Purification Kit)(퀴아젠)를 사용하여, 첨부 프로토콜을 따라서 PCR산물을 정제하였다. 생성된 PCR산물을 DpnI(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로 소화한 반응액을 사용하여, 대장균 JM109(다카라 바이오)를 형질 전환하였다. 출현한 콜로니를 회수 후, 플라스미드 추출을 행하고, 프라이머 T7-PP(서열 번호 35) 및 T7-TP(서열 번호 36)를 사용하여 염기 서열의 확인을 행하였다. 올바르게 라이브러리가 도입된 각 플라스미드를 표 2에 기재된 각 Nampt 라이브러리 플라스미드로 하였다.

(2) Nampt 라이브러리의 발현 및 무세포 추출물의 조제

대장균(이. 콜라이) BN8주의 적격 세포(WO2019/065876)를 빙상에서 융해시키고, (1)에서 제작한 각 플라스미드 DNA 용액을 혼합하여 빙상에서 10분간 정치하였다. 42℃에서 20초간 히트 쇼크를 가한 후, 다시 빙랭시키고, SOC 배지를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 진탕 배양을 행한 후, LB 한천 배지(카나마이신황산염 50mg/L 함유)에 도포하고, 37℃에서 밤새 정치 배양을 행하였다. 얻어진 콜로니를 각 효소의 발현이 강화된 재조합체로 하였다. 싱글 콜로니를 LB 배지(카나마이신황산염 50mg/L 함유)가 200uL 들어간 96웰의 딥웰 플레이트에 있어서, 37℃에서 밤새 진탕 배양을 행하였다. 70uL 전배양을 사용하여 630uL의 본배양(LB 배지, 카나마이신황산염 50mg/L 및 IPTG0.5mM 최종 농도를 함유)을 식균하고, 16℃, 1250rpm, 24시간 혹은 25℃, 1250rpm, 18시간 배양하였다. 배양한 대장균을 원심(5000rpm, 4℃, 15분)에 의해 집균하고, 상청을 제거하였다. 회수한 펠릿을 200uL의 용해 버퍼(100mM Kpi pH 8.5, 1mg/ml 리소자임, 0.5mg/ml 폴리믹신 B, 0.05mg/ml DNase)에 현탁시키고, 실온, 900rpm으로 20분간 진탕하였다. 원심(4900rpm, 10min, 4℃)에 의해 불용물을 제거하여, 상청을 무세포 추출액으로서 반응에 사용하였다.

(3) Prs, Rbk, Ppk의 발현 및 무세포 추출물의 조제

(2)와 마찬가지로 각 플라스미드 pEBsPrs, pEScRbk, pESDrPpk(WO2019/065876)를 대장균(E. coli) BN8주의 적격 세포에 더하여, 빙상에서 10분간 정치하였다. 42℃에서 20초간 히트 쇼크를 가한 후, 다시 빙랭시키고, SOC 배지를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 진탕 배양을 행한 후, LB 한천 배지(카나마이신황산염 50mg/L 함유)에 도포하고, 37℃에서 밤새 정치 배양을 행하였다. 얻어진 콜로니를 각 효소의 발현이 강화된 재조합체로 하였다. 싱글 콜로니를 LB 배지(카나마이신황산염 50mg/L 함유)가 2mL 들어간 배양 튜브에 있어서, 37℃에서 밤새 진탕 배양을 행하였다. 1mL 전배양을 사용하여 100mL의 본배양(LB 배지, 카나마이신황산염 50mg/L 함유)을 식균하고, 37℃에서 진탕 배양하였다. OD600이 0.8에 달한 시점에서, 최종 농도가 0.5mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 25℃, 1250rpm, 18시간 배양하였다. 배양한 대장균을 원심(8000rpm, 4℃, 15분)에 의해 집균하고, 상청을 제거하였다. 회수한 펠릿을 10mL의 용해 버퍼(100mM Kpi pH 8.5, 1mg/ml 리소자임, 0.5mg/ml 폴리믹신 B, 0.05mg/ml DNase)에 현탁시키고, 실온, 900rpm으로 20분간 진탕하였다. 원심(8000rpm, 10min, 4℃)에 의해 불용물을 제거하고, 상청을 무세포 추출액으로서 반응에 사용하였다.

(4) NMN 합성 반응

(2), (3)에서 조제한 무세포 추출물을 사용하여 NMN 합성 반응을 행하였다. 반응액량을 100μL로 하고, 이하에 나타내는 조성에서 각 반응액을 조제하여, 37℃에서 정치 반응을 행하였다.

반응 시간 2시간 및 17시간에 있어서, 각 샘플 5μL를 새로운 플레이트에 옮기고, 이것을 245uL의 50％ 메탄올 수용액(1mM EDTA)으로 희석하여, HPLC 분석을 행하였다.

(5) NMN의 분석

NMN 합성 반응 샘플의 분석은, HPLC에 의해 이하의 조건에서 행하였다.

칼럼: 쇼덱스 아사히팩(Shodex Asahipak) NH2P-50 4B

가드 칼럼: 쇼덱스 아사히팩 NH2P-50G 4A

이동상: 25mM 포름산암모늄 수용액

유속: 1ml/min(3.2-3.3Mpa)

검출: UV 261nm

칼럼 온도: 40℃

각 샘플에 대하여 NAM과 NMN의 비로부터 NMN 변환율(％)을 산출하고, NMN 변환율이 야생형의 그것보다도 높았던 것에 대해서는, 변이 개소에 있어서의 염기 서열의 결정을 행하였다.

(6) 실험 결과

야생형의 NMN 변환율을 100％로 한 경우의 각 변이체의 활성 상대비를 표 6에 나타낸다.

상기 결과로부터 각 라이브러리로부터 야생형 Nampt보다도 고활성인 개량형 Nampt를 얻었다. Nampt를 사용한 NMN 합성에 있어서, Nampt가 율속 효소로 되어 있으며, 그 원료 비용이 높아, 문제가 되었다. 본 발명의 개량형 Nampt는, 상기와 같이 야생형보다도 고활성이기 때문에, 그 사용량을 억제하는 것이 가능하다. 이에 의해, Nampt 원료 비용을 30 내지 40％ 정도 삭감하는 것이 가능하다.

[실시예 2] <Nampt 우량 변이의 조합>

실시예 1의 우량 변이의 조합을 행하였다.

(1) Nampt 우량 변이 조합 라이브러리의 구축

표 1에 기재한 pEHdNampt를 주형으로 하여, 지정한 아미노산 잔기에 대응하는 염기 서열에 축퇴 코돈을 사용하여 랜덤 변이를 도입하였다. 변이 도입용 프라이머명 및 그 염기 서열을 나타내는 서열 번호, Nampt 변이체명을 표 7에 나타낸다.

변이 도입 PCR 반응, Nampt 라이브러리의 발현 및 무세포 추출물의 조제, 및 NMN 합성 반응은 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 행하였다.

(2) 실험 결과

야생형의 NMN 변환율을 100％로 한 경우의 각 변이체의 활성 상대비를 표 8에 나타낸다.

상기 결과로부터 우량 변이를 조합함으로써, 야생형 Nampt보다도 고활성인 개량형 Nampt를 얻었다. 상기와 마찬가지로, 이에 의해 Nampt 원료 비용을 30 내지 40％ 정도 삭감하는 것이 가능하다.

[실시예 3] <기타 종 유래 Nampt에의 우량 변이 도입>

본 실시예에서는, 소정의 각 효소로서 하기의 것을 사용하였다.

Nampt: 메이오써무스 루버(Meiothermus ruber) 유래(A0A0S7ALY5) Nampt: 스핑고픽시스속 C-1 유래(A0A0M9TZ33)

(1) Nampt 변이체의 구축

각 효소의 발현 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다. 표 1의 「유래」에 기재된 생물종 유래의 각 효소에 대해서, 동 표 중의 「아미노산 서열」에 기재된 각 서열 번호로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 각 효소 단백질을 코딩하는 DNA(표 1의 「염기 서열」에 기재된 각 서열 번호로 나타내지는 염기 서열을 포함함)를 합성하고, 각각 발현 벡터 pET-26b(+)(노바젠)의 NdeI-XhoI 사이트에 클로닝하였다(유전자 합성은 젠스크립트 재팬에서 실시, 대장균 발현용으로 코돈을 최적화). 얻어진 각 플라스미드를, 각 효소의 「발현 플라스미드」라고 명명하였다. 전술 플라스미드를 주형으로 하여, 지정한 아미노산 잔기에 변이를 도입하였다. 변이 도입용 프라이머명 및 그 염기 서열을 나타내는 서열 번호, Nampt 변이체명을 표 8에 나타낸다.

변이 도입 PCR 반응, Nampt 라이브러리의 발현 및 무세포 추출물의 조제, 및 NMN 합성 반응은 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 행하였다. 각 야생형 Nampt의 NMN 변환율을 100％로 한 경우의 각 변이체의 활성 상대비를 표 9에 나타낸다.

본 발명은, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 공업적 생산에 있어서 유용하다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서 중에 있어서 도입하는 것으로 한다.

서열표 프리텍스트

서열 번호 1: 모티프 서열

서열 번호 2: 모티프 서열

서열 번호 25: 프라이머(Nampt_S247X-F)

서열 번호 26: 프라이머(Nampt_S247X-R)

서열 번호 27: 프라이머(Nampt_E248X-F)

서열 번호 28: 프라이머(Nampt_E248X-R)

서열 번호 29: 프라이머(Nampt_S253X-F)

서열 번호 30: 프라이머(Nampt_S253X-R)

서열 번호 31: 프라이머(Nampt_V278X-F)

서열 번호 32: 프라이머(Nampt_V278X-R)

서열 번호 33: 프라이머(Nampt_T281X-F)

서열 번호 34: 프라이머(Nampt_T281X-R)

서열 번호 35: 프라이머(T7-PP)

서열 번호 36: 프라이머(T7-TP)

서열 번호 37: 프라이머(Nampt_S247Z-F)

서열 번호 38: 프라이머(Nampt_S247Z-R)

서열 번호 39: 프라이머(Nampt_S253U-F)

서열 번호 40: 프라이머(Nampt_S253U-R)

서열 번호 41: 프라이머(Nampt_V278J_T281B-F)

서열 번호 42: 프라이머(Nampt_V278J_T281B-R)

서열 번호 43: 프라이머(MrNampt_M230T-F)

서열 번호 44: 프라이머(MrNampt_M230T-R)

서열 번호 45: 프라이머(MrNampt_E231G-F)

서열 번호 46: 프라이머(MrNampt_E231G-R)

서열 번호 47: 프라이머(MrNampt_V264A-F)

서열 번호 48: 프라이머(MrNampt_V264A-R)

서열 번호 49: 프라이머(SpNampt_E227G-F)

서열 번호 50: 프라이머(SpNampt_E227G-R)

SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> Improved nicotinamide phosphoribosyltransferase <130> PMC-9028WO <150> JP2021-052555 <151> 2021-03-26 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> motif sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for Thr, Val, or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for Met, Val, or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Ser Xaa Pro Ala Xaa Xaa His Ser Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> motif sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for Ser or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Xaa Xaa Asp Xaa 1 <210> 3 <211> 501 <212> PRT <213> Haemophilus ducreyi <400> 3 Met Asp Asn Leu Leu Asn Tyr Ser Ser Arg Ala Ser Ala Ile Pro Ser 1 5 10 15 Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Lys Thr Ser His Arg Ile Met Tyr Pro Glu 20 25 30 Cys Ser Gln Ile Ile Tyr Ser Thr Phe Thr Pro Arg Ser Asn Glu Gln 35 40 45 Ala Pro Tyr Leu Thr Gln Val Val Ser Phe Gly Phe Gln Ala Phe Ile 50 55 60 Ile Lys Tyr Leu Ile His Tyr Phe Asn Asp Asn Phe Phe Ser Arg Asp 65 70 75 80 Lys His Asp Val Val Thr Glu Tyr Ser Ala Phe Ile Glu Lys Thr Leu 85 90 95 Gln Leu Glu Asp Thr Gly Glu His Ile Ala Lys Leu His Glu Leu Gly 100 105 110 Tyr Leu Pro Ile Arg Ile Lys Ala Ile Pro Glu Gly Lys Thr Val Ala 115 120 125 Ile Lys Val Pro Val Met Thr Ile Glu Asn Thr His Ser Asp Phe Phe 130 135 140 Trp Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Thr Leu Ile Asn Val Ser Leu Trp Gln 145 150 155 160 Pro Met Thr Ser Ala Ser Ile Ala Phe Ala Tyr Arg Thr Ala Leu Ile 165 170 175 Lys Phe Ala Asn Glu Thr Cys Asp Asn Gln Glu His Val Pro Phe Gln 180 185 190 Ser His Asp Phe Ser Met Arg Gly Met Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu 195 200 205 Thr Ser Gly Ala Gly His Leu Thr Ser Phe Leu Gly Thr Asp Thr Ile 210 215 220 Pro Ala Leu Ser Phe Val Glu Ala Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ile 225 230 235 240 Gly Thr Ser Ile Pro Ala Ser Glu His Ser Val Met Ser Ser His Gly 245 250 255 Val Asp Glu Leu Ser Thr Phe Arg Tyr Leu Met Ala Lys Phe Pro His 260 265 270 Asn Met Leu Ser Ile Val Ser Asp Thr Thr Asp Phe Trp His Asn Ile 275 280 285 Thr Val Asn Leu Pro Leu Leu Lys Gln Glu Ile Ile Ala Arg Pro Glu 290 295 300 Asn Ala Arg Leu Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asn Phe Phe Ala Ile 305 310 315 320 Ile Cys Gly Asp Pro Thr Ala Asp Thr Glu His Glu Arg Lys Gly Leu 325 330 335 Ile Glu Cys Leu Trp Asp Ile Phe Gly Gly Thr Val Asn Gln Lys Gly 340 345 350 Tyr Lys Val Ile Asn Pro His Ile Gly Ala Ile Tyr Gly Asp Gly Val 355 360 365 Thr Tyr Glu Lys Met Phe Lys Ile Leu Glu Gly Leu Gln Ala Lys Gly 370 375 380 Phe Ala Ser Ser Asn Ile Val Phe Gly Val Gly Ala Gln Thr Tyr Gln 385 390 395 400 Arg Asn Thr Arg Asp Thr Leu Gly Phe Ala Leu Lys Ala Thr Ser Ile 405 410 415 Thr Ile Asn Gly Glu Glu Lys Ala Ile Phe Lys Asn Pro Lys Thr Asp 420 425 430 Asp Gly Phe Lys Lys Ser Gln Lys Gly Arg Val Lys Val Leu Ser Arg 435 440 445 Asp Thr Tyr Val Asp Gly Leu Thr Ser Ala Asp Asp Phe Ser Asp Asp 450 455 460 Leu Leu Glu Leu Leu Phe Glu Asp Gly Lys Leu Leu Arg Gln Thr Asp 465 470 475 480 Phe Asp Glu Ile Arg Gln Asn Leu Leu Val Ser Arg Thr Thr Leu His 485 490 495 His His His His His 500 <210> 4 <211> 1506 <212> DNA <213> Haemophilus ducreyi <400> 4 atggacaatc tgctgaacta ctcctcacgc gcctcggcaa tcccgtccct gctgtgcgac 60 ttctacaaaa cctctcatcg tattatgtat ccggaatgct ctcagattat ctatagtacc 120 tttacgccgc gttcgaacga acaggcaccg tacctgaccc aagtggttag cttcggcttc 180 caagctttca tcatcaaata cctgatccat tacttcaacg ataacttttt cagccgtgat 240 aaacacgacg tcgtgaccga atatagtgcg tttattgaaa aaaccctgca gctggaagac 300 acgggcgaac atatcgccaa actgcacgaa ctgggttacc tgccgattcg tatcaaagca 360 attccggaag gtaaaaccgt tgctattaaa gttccggtca tgaccatcga aaatacgcat 420 tctgatttct tttggctgac caactatctg gaaacgctga tcaatgtcag tctgtggcag 480 ccgatgacca gcgcgtcaat tgcgtttgcc taccgtaccg cactgatcaa attcgctaac 540 gaaacgtgtg ataatcagga acatgtgccg tttcaatccc acgacttctc aatgcgcggc 600 atgagctctc tggaatcggc ggaaaccagc ggcgccggtc atctgacgtc ctttctgggt 660 accgatacga ttccggcgct gtcattcgtt gaagcctatt acggcagttc ctcactgatt 720 ggtaccagca tcccggcatc ggaacatagc gttatgtcga gccacggcgt cgatgaactg 780 agcacgtttc gctatctgat ggctaaattc ccgcataaca tgctgtctat tgtcagtgat 840 accacggact tttggcacaa catcaccgtg aatctgccgc tgctgaaaca ggaaattatc 900 gcacgtccgg aaaacgctcg tctggtgatt cgcccggata gcggcaactt tttcgcgatt 960 atctgcggtg atccgaccgc cgacacggaa catgaacgca aaggtctgat tgaatgtctg 1020 tgggatatct ttggcggtac cgtgaaccag aaaggctata aagttatcaa tccgcacatt 1080 ggtgcaatct atggcgacgg tgttacgtac gaaaaaatgt tcaaaatcct ggaaggcctg 1140 caagcgaaag gttttgcctc tagtaacatc gtcttcggcg tgggtgcgca gacctaccaa 1200 cgtaataccc gcgatacgct gggctttgca ctgaaagcta ccagcattac gatcaacggt 1260 gaagaaaaag ccatcttcaa aaacccgaaa accgatgacg gcttcaaaaa atcgcagaaa 1320 ggtcgtgtga aagttctgag ccgcgatacc tatgtggacg gcctgacgtc cgccgatgac 1380 ttttcagatg acctgctgga actgctgttc gaagatggta aactgctgcg tcagaccgac 1440 tttgatgaaa tccgtcagaa cctgctggtt agccgcacga ccctgcacca ccaccaccac 1500 cactga 1506 <210> 5 <211> 463 <212> PRT <213> Meiothermus ruber <400> 5 Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser 20 25 30 Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe 35 40 45 Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu 50 55 60 Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro 65 70 75 80 Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg 85 90 95 Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val 100 105 110 His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp 115 120 125 Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro 130 135 140 Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu 145 150 155 160 Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys 165 170 175 Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly 180 185 190 Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val 195 200 205 Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly 210 215 220 Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg 225 230 235 240 Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys 245 250 255 Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His 260 265 270 Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln 275 280 285 Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe 290 295 300 Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr 305 310 315 320 Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln 325 330 335 Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu 340 345 350 Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Met Gly Gly 355 360 365 Ala Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys 370 375 380 Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser 385 390 395 400 Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val 405 410 415 Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala 420 425 430 Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly 435 440 445 Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala 450 455 460 <210> 6 <211> 1389 <212> DNA <213> Meiothermus ruber <400> 6 atgaaaaccc tgaatccgca taacctgatc ctgaataccg atagctacaa agcgagccac 60 ttcgcgcagt tcccgaaagg catgacctac gcgagctggt acatcgaaag ccgtggtggc 120 gacagcaact tcgtgcgttt ctttggtctg caggcgtttc tgattgagta tctgagcaag 180 ggcgtgagcc tggcggatgt tgaggaagcg caagaggttt tcctggcgca cggtctgccg 240 tttccgaccg aaggctggcg ttacattgcg caggacctgg gtggccgtct gccggtgcgt 300 attcgtgcgg ttccggaggg caaggtggtt ccggtgcaca acccgctggt tatcattgaa 360 agcaccgatc cgaaagttcc gtggctgccg ggttggctgg aaaccgcgct gctgcgtgcg 420 gtttggtacc cgaccaccgt gtgcaccgtt agctggggca tccgtaacac cattaaggag 480 tatctggaaa aaaccgcgga tgatccggag gcggaactgc cgttcaagct gcacgacttt 540 ggtgcgcgtg gcgtgagcag cctggaaagc gcgggtctgg gtggcatggc gcacctggtg 600 aacttcatgg gcaccgatac cgttaccgcg ctgatctacg cgcgtaacta ctatggtgcg 660 gagatggcgg gctatagcat tccggcgatg gaacacagca ccgttaccag ctttggtcgt 720 accggtgaag cgcaggcgta ccgtcaaatg ctggaaacct ttgcgaaacc gggtgcgctg 780 atggcgatgg tgatcgacag ctataaccgt gagcacgcgg ttggtcaaat cattggcgag 840 gaactgcgtg aactgatcca gcaaagcggt gcgaccgtgg ttattcgtcc ggacagcggc 900 gatccgccgt ttgtggttct gcgtaccgtg cagaccctgg aagcgaagtt tggtgcgacc 960 ctgaaccgta agggttacaa agttctgaac ggcgtgcgtg ttatccaagg tgacggcgtg 1020 aacgcggata gcattcgtaa agttctgttc ctgctggagc agtggggtta tagcgcgagc 1080 aacgtggcgt ttggtatggg tggcgcgctg ctgcaacacc cgcaccgtga tacccagaag 1140 tttgcgcaaa aactgcacct ggtgaccgtt aacggtgaaa cctatggtgt gggcaagagc 1200 ccggttgacg atccgggtaa actgagcaag aaaggccgtc tggacgtgat ccaggatgag 1260 cgtggcattc gtaccgttga actgccgctg gaagcggcgc agccgcaccc gcaaagcatc 1320 ctgcagaccg tttttgaaaa tggcagcatc acccgtcgct atacctggga agaagttcgt 1380 aataatgcg 1389 <210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Xanthomonas translucens <400> 7 Met Gln Cys Leu Asn Asn Leu Leu Leu Asn Thr Asp Ser Tyr Lys Ala 1 5 10 15 Ser His Trp Leu Gln Tyr Pro Ala Gly Thr Asp Ala Thr Phe Phe Tyr 20 25 30 Val Glu Ser Arg Gly Gly Val Tyr Asp Arg Thr Val Phe Phe Gly Leu 35 40 45 Gln Ser Ile Leu Lys Glu Ala Leu Gly Arg Ala Val Thr His Ala Asp 50 55 60 Ile Asp Glu Ala Arg Asp Leu Phe Ala Ala His Gly Glu Pro Phe Asn 65 70 75 80 Glu Ala Gly Trp Arg Asp Ile Val Asp Arg Leu Gly Gly Gln Leu Pro 85 90 95 Ile Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Ser Val Val Pro Thr His Asn 100 105 110 Ala Leu Met Thr Ile Glu Ser Thr Asp Ala Gln Ala Tyr Trp Val Pro 115 120 125 Ser Tyr Leu Glu Thr Leu Leu Leu Arg Ile Trp Tyr Pro Val Thr Val 130 135 140 Ala Thr Val Ser Trp His Ala Lys Gln Thr Leu Arg Gln Phe Leu Glu 145 150 155 160 Arg Thr Ser Asp Asp Pro Glu Gly Gln Leu Pro Phe Lys Leu His Asp 165 170 175 Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Ala Ile Gly Gly 180 185 190 Ala Ala His Leu Val Asn Phe Leu Gly Thr Asp Thr Val Ser Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Ala Arg Ala His Tyr His Glu Pro Met Ala Gly Tyr Ser Ile 210 215 220 Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ser Trp Gly Arg Glu Arg Glu 225 230 235 240 Val Asp Ala Tyr Arg Asn Met Leu Lys Gln Phe Gly Lys Pro Gly Gly 245 250 255 Ile Val Ala Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Phe His Ala Ile Arg 260 265 270 Glu His Trp Gly Thr Thr Leu Arg Glu Glu Val Ile Ala Ser Gly Ala 275 280 285 Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Val Ala Val Val His 290 295 300 Gln Cys Leu Glu Leu Leu Asp Glu Ala Phe Gly His Arg Val Asn Gly 305 310 315 320 Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn His Val Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly 325 330 335 Val Asn Pro Thr Ser Ile Arg Ala Ile Leu Glu Arg Val Thr Ser Ala 340 345 350 Gly Tyr Ala Thr Asp Asn Val Ala Phe Gly Met Gly Gly Ala Leu Leu 355 360 365 Gln Arg Leu Asp Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Leu Lys Cys Ser Ala 370 375 380 Ala Arg Val Asp Gly Thr Trp Ile Asp Val Tyr Lys Asp Pro Val Thr 385 390 395 400 Asp Lys Gly Lys Leu Ser Lys Arg Gly Arg Met Ser Leu Leu Arg His 405 410 415 Arg Glu Tyr Gly Gly Tyr Arg Thr Glu Pro Val Pro Ala Thr Ala Ala 420 425 430 Ser Leu Asp Ala Leu Ala Arg Pro Thr Gly Tyr Asp Asp Ala Met Val 435 440 445 Thr Val Trp Glu Asn Gly Arg Leu Leu His Asp Trp Ser Leu Ala Gln 450 455 460 Val Arg Asp Arg Ala Asn Ala Ala Arg Leu 465 470 <210> 8 <211> 1422 <212> DNA <213> Xanthomonas translucens <400> 8 atgcagtgcc tgaacaatct gctgctgaac actgattctt ataaagcatc tcactggctg 60 cagtacccgg caggtactga cgctaccttc ttttacgtag aatcccgtgg tggcgtttac 120 gatcgtaccg ttttttttgg tctgcagagc atcctgaaag aagcactggg tcgtgcggtt 180 acgcacgctg atatcgatga agcgcgtgac ctgtttgctg cgcacggcga accgtttaac 240 gaagcaggtt ggcgtgacat cgttgaccgt ctgggtggcc aactgccgat tcgtatccgt 300 gcggttccgg aaggttccgt ggttccgact cacaacgcac tgatgactat cgagagcacg 360 gacgcacagg cttactgggt gccgtcctat ctggagaccc tgctgctgcg tatctggtac 420 ccggttactg ttgcaaccgt gtcttggcac gcgaaacaga ccctgcgtca attcctggaa 480 cgtacttccg atgatccgga aggtcagctg ccgttcaaac tgcatgattt cggtgcacgt 540 ggtgtttcta gcctggaatc tgcagctatt ggtggcgcgg ctcatctggt taacttcctg 600 ggcactgaca ccgtatctgg tctgctgctg gcacgtgccc attatcacga accgatggcg 660 ggctatagca ttccagcggc cgaacacagc accatcacct cctggggccg cgaacgtgaa 720 gttgacgcat atcgcaacat gctgaagcag ttcggtaagc cgggcggtat cgttgcggtc 780 gtatccgact cttacgacat ttttcacgcg atccgcgaac actggggcac taccctgcgc 840 gaagaagtaa tcgcatctgg tgccaccgtt gtgattcgtc cggactctgg tgatccggtt 900 gcggttgtcc accagtgtct ggaactgctg gatgaagctt tcggtcaccg cgtgaacggc 960 aaaggctaca aggtcctgaa ccacgtccgt gttatccagg gcgacggtgt taacccgacc 1020 agcatccgtg cgatcctgga gcgtgttacg agcgcaggct acgcgaccga taacgtagct 1080 ttcggtatgg gtggtgctct gctgcaacgt ctggatcgtg acacccagaa atttgctctg 1140 aagtgttctg cggcacgcgt cgatggcacc tggattgacg tgtacaaaga tccagtgacc 1200 gataaaggta agctgtctaa acgtggccgt atgtctctgc tgcgtcatcg tgaatatggt 1260 ggttatcgta ctgagccagt tccagcgact gctgccagcc tggatgctct ggctcgtcca 1320 accggttacg acgacgcaat ggtgaccgtg tgggaaaacg gtcgtctgct gcacgattgg 1380 tctctggccc aggttcgtga tcgtgcaaat gcagcccgtc tg 1422 <210> 9 <211> 461 <212> PRT <213> Sphingopyxis sp. C-1 <400> 9 Met Lys Asn Leu Ile Leu Ala Thr Asp Ser Tyr Lys Gln Ser His Phe 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Pro Pro Glu Ala Arg Val Ile Ser Ala Tyr Val Glu Ala 20 25 30 Arg Pro Asn Pro Phe Ser Glu Glu Ile Val Phe Leu Gly Leu Gln Pro 35 40 45 Leu Leu Val Asp Tyr Phe Ser Gln Pro Ile Asn Ala Ala Asp Ile Asp 50 55 60 Glu Ala Glu Ala Ile Cys Ile Ala His Gly Val Pro Phe Asn Arg Ala 65 70 75 80 Gly Trp Glu Ala Ile Val Ala Asp His Gly Gly Tyr Leu Pro Leu Glu 85 90 95 Ile Lys Ala Leu Pro Glu Gly Ala Ile Val Pro Ala Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Gln Leu Glu Asn Thr Asp Pro Arg Met Pro Trp Leu Thr Thr Phe 115 120 125 Ile Glu Thr Ala Met Leu Arg Ala Ile Trp Tyr Pro Thr Thr Val Ala 130 135 140 Thr Leu Ser Trp Lys Cys Lys Gln Val Ile Arg Ala Gly Leu Glu Lys 145 150 155 160 Thr Ser Asp Asp Val Glu Gly Gln Leu Pro Phe Lys Leu His Asp Phe 165 170 175 Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Ala Glu Ser Ala Gly Leu Gly Gly Leu 180 185 190 Ala His Leu Val Asn Phe Gln Gly Thr Asp Thr Met Glu Ala Leu Val 195 200 205 Ala Ala Arg Arg Tyr Tyr Gly Ala Asp Met Ala Gly Phe Ser Ile Pro 210 215 220 Ala Ala Glu His Ser Thr Met Thr Ser Trp Gly Arg Asp Arg Glu Glu 225 230 235 240 Asp Ala Tyr Arg Asn Met Leu Asp Arg Phe Glu Gly Glu Gly Arg Ile 245 250 255 Val Ala Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Leu Asp Thr Ala Val Thr Asp 260 265 270 Ile Trp Gly Gly Ser Leu Arg Glu Lys Val Leu Gly Arg Ala Gly Thr 275 280 285 Leu Val Val Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Ile Glu Thr Pro Leu Arg 290 295 300 Thr Val Lys Thr Leu Trp Glu Lys Phe Gly Gly His Val Asn Gly Lys 305 310 315 320 Gly Tyr Arg Val Leu Asp Pro His Val Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly 325 330 335 Met Thr Val Asp Ser Ile Gly Arg Leu Val Gln Arg Met Ile Glu Glu 340 345 350 Gly Phe Ala Ile Asp Asn Ile Ala Phe Gly Met Gly Gly Gly Met Leu 355 360 365 Gln His Val Asn Arg Asp Thr Leu Arg Phe Ala Met Lys Ala Asn Ala 370 375 380 Met Leu Gly Ser Asp Gly Val Trp His Asp Val Phe Lys Met Pro Ser 385 390 395 400 Thr Asp Pro Gly Lys Ala Ser Lys Ala Gly Arg Gln Ala Val Val Leu 405 410 415 Lys Asp Gly Arg Met Ala Ala Ala Arg Leu Asp Ser Val Ala Val Gly 420 425 430 Glu Asp Leu Leu Val Pro Val Trp Arg Asn Gly Glu Leu Leu Val Arg 435 440 445 His Asp Phe Asp Ala Val Arg Lys Arg Ser Glu Gly Arg 450 455 460 <210> 10 <211> 1383 <212> DNA <213> Sphingopyxis sp. C-1 <400> 10 atgaagaatc tgattctggc caccgatagc tataaacaga gccattttct gcagtatccg 60 cctgaagcac gtgttattag cgcatatgtt gaagcccgtc cgaatccgtt tagcgaagaa 120 attgtttttc tgggtctgca gccgctgctg gttgattatt tcagccagcc gattaatgca 180 gccgatattg atgaagcaga agccatttgt attgcacatg gtgttccgtt taatcgtgca 240 ggttgggaag caattgttgc agatcatggt ggttatctgc cgctggaaat taaagcactg 300 ccggaaggtg caattgttcc ggcaggcgtt ccgctggttc agctggaaaa taccgatccg 360 cgtatgccgt ggctgaccac ctttattgaa accgcaatgc tgcgtgcaat ttggtatccg 420 accaccgttg caaccctgag ctggaaatgc aaacaggtta ttcgtgccgg tctggaaaaa 480 accagtgatg atgttgaagg tcagctgccg tttaaactgc atgattttgg tgcacgtggt 540 gttagcagcg cagaaagcgc aggtttaggt ggtctggcac atctggttaa ttttcagggc 600 accgatacca tggaagcact ggttgcagcc cgtcgttatt atggtgcaga tatggcaggt 660 tttagcattc cggcagcaga acatagcacc atgaccagct ggggtcgtga tcgtgaagaa 720 gatgcatatc gtaatatgct ggatcgcttt gaaggtgaag gtcgtattgt tgccgttgtt 780 agcgatagtt atgatctgga taccgcagtt accgatattt ggggtggtag cctgcgtgaa 840 aaagttctgg gtcgtgcggg tacactggtt gttcgtccgg atagcggtga tccgattgaa 900 acaccgctgc gtaccgttaa aaccctgtgg gaaaaatttg gtggtcatgt gaatggtaaa 960 ggttatcgtg ttctggatcc gcatgttcgt gttattcaag gtgatggtat gaccgttgat 1020 agcattggtc gtctggtgca gcgtatgatt gaagaaggtt ttgccattga taacattgcc 1080 tttggtatgg gtggtggtat gctgcaacat gttaatcgtg ataccctgcg ttttgcaatg 1140 aaagcaaatg caatgctggg tagtgatggt gtttggcatg atgtgtttaa aatgccgagc 1200 accgatccgg gtaaagcaag caaagcaggt cgtcaggcag ttgttctgaa agatggtcgt 1260 atggcagcag cacgtctgga tagcgttgca gttggtgaag atctgctggt tccggtttgg 1320 cgtaatggtg aactgctggt gcgtcacgat tttgatgcag ttcgtaaacg tagcgaaggt 1380 cgt 1383 <210> 11 <211> 471 <212> PRT <213> Chitinophaga pinensis <400> 11 Met Thr Lys Glu Asn Leu Ile Leu Leu Ala Asp Ala Tyr Lys Tyr Ser 1 5 10 15 His His Lys Leu Tyr Ile Pro Gly Thr Glu Tyr Ile Tyr Ser Tyr Phe 20 25 30 Glu Ser Arg Gly Gly Lys Phe Asn Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Phe Leu Met Glu Tyr Leu Gln Gly Ala Val Ile Thr Lys Glu Lys 50 55 60 Leu Asp Glu Ala Glu Ala Thr Leu Leu Glu Val Phe Gly Arg Asn Asp 65 70 75 80 Val Phe Asp Arg Thr Arg Phe Glu Tyr Ile Ile Glu Lys His Gly Gly 85 90 95 Arg Leu Pro Val Arg Ile Lys Ala Val Pro Glu Gly Thr Val Thr Gly 100 105 110 Val Arg Asn Val Leu Met Thr Ile Glu Asn Thr Asp Pro Asn Cys Tyr 115 120 125 Trp Val Thr Asn Phe Leu Glu Thr Leu Leu Met Gln Ile Trp Tyr Pro 130 135 140 Cys Thr Val Ala Thr Leu Ser Arg Glu Ile Lys Lys Thr Val Lys Gln 145 150 155 160 Tyr Tyr Asn Glu Thr Ala Ser Glu Ala Ala Phe Ala Gly Ile Asp Phe 165 170 175 Val Leu Asn Asp Phe Gly Phe Arg Gly Ala Ser Ser Val Glu Ser Ala 180 185 190 Gly Ile Gly Gly Ser Ala His Leu Ile Asn Phe Ser Gly Ser Asp Thr 195 200 205 Leu Ile Gly Ser Thr Phe Ala Lys Arg Tyr Tyr Gln Ala Pro Val Ala 210 215 220 Pro Gly Leu Ser Ile Pro Ala Thr Glu His Ser Ile Val Thr Met Leu 225 230 235 240 Gly Glu Glu Gly Glu Leu Glu Ile Phe Arg His Ile Leu Asn Ala Phe 245 250 255 Pro Thr Gly Thr Ile Ala Cys Val Ser Asp Ser Tyr Asn Ile Leu Arg 260 265 270 Ala Cys Arg Glu Tyr Trp Gly Thr Glu Leu Lys Glu Gln Ile Leu Ser 275 280 285 Arg Gln Gly Thr Leu Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Ala Ile Gln 290 295 300 Thr Leu Leu Lys Val Phe Glu Ile Leu Met Glu Thr Phe Gly Tyr Thr 305 310 315 320 Val Asn Glu Lys Gly Tyr Lys Val Leu Pro Pro Gln Val Arg Val Ile 325 330 335 Gln Gly Asp Gly Ile Ser Tyr Ser Ser Ile Pro Pro Ile Phe Glu Ala 340 345 350 Leu Lys Gln Ala Gly Ile Ser Ala Glu Asn Leu Val Leu Gly Met Gly 355 360 365 Gly Ala Leu Leu Gln Arg Val Asn Arg Asp Thr Gln Glu Tyr Ala Leu 370 375 380 Lys Cys Ser Phe Ala Gln Val Asn Gly Lys Ala Ile Asn Val Gln Lys 385 390 395 400 Asn Pro Leu Glu Leu Asp Ala Asn Gly Asn Thr Arg Val Ser Phe Lys 405 410 415 Lys Ser Lys Ser Gly Lys Gln Lys Leu Val Val Glu Asn Gly Ile Tyr 420 425 430 Thr Ser Leu Pro Glu Asn Glu Ala Pro Ala Leu Ala Asp Gln Leu Val 435 440 445 Thr Val Phe Glu Asp Gly Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Ser Phe Glu Gln 450 455 460 Ile Arg Lys Asn Ala Thr Ile 465 470 <210> 12 <211> 1413 <212> DNA <213> Chitinophaga pinensis <400> 12 atgaccaaag aaaacctgat tctgctggca gatgcataca aatatagcca ccacaaactg 60 tatattccgg gaaccgaata tatctacagc tattttgaaa gccgtggtgg caaatttaac 120 gaaaccgttt tttatggcct gcagtacttc ctgatggaat atctgcaggg tgcagttatc 180 acaaaagaaa aactggatga agcagaagca accctgctgg aagtttttgg tcgtaatgat 240 gtttttgatc gcacccgctt tgaatacatc attgaaaaac atggtggtcg tctgccggtt 300 cgtattaaag cagttccgga aggcaccgtt accggtgttc gtaatgttct gatgaccatt 360 gaaaataccg atccgaattg ttattgggtg accaattttc tggaaacact gctgatgcag 420 atttggtatc cgtgtaccgt tgcaaccctg agccgtgaaa tcaaaaaaac cgttaaacag 480 tattacaatg aaaccgcaag cgaagcagca tttgcaggta ttgattttgt gctgaacgat 540 tttggttttc gtggtgcaag cagcgttgaa agtgccggta ttggtggtag cgcacatctg 600 attaacttta gcggtagcga taccctgatt ggtagcacct ttgcaaaacg ttattatcag 660 gcaccggttg caccgggtct gagcattccg gcaacagaac attcaattgt taccatgctg 720 ggtgaagaag gtgaactgga aatttttcgc catattctga atgcatttcc gaccggcacc 780 attgcatgtg ttagcgatag ctataacatt ctgcgtgcat gtcgtgaata ttggggcacc 840 gaactgaaag agcagattct gagccgtcag ggcaccctgg ttattcgtcc ggatagcggt 900 gatgcaattc agacgctgct gaaagtgttt gaaattctga tggaaacctt tggctatacc 960 gtgaacgaaa aaggctataa agttctgcct ccgcaggttc gtgttattca aggtgatggt 1020 attagctata gcagcattcc gcctattttt gaagcactga aacaggcagg tattagcgca 1080 gaaaatctgg ttttaggtat gggtggtgca ctgctgcagc gtgttaatcg tgatacccaa 1140 gaatatgcac tgaaatgtag ctttgcacag gttaatggca aagccattaa tgtgcagaaa 1200 aatccgctgg aactggatgc aaatggtaat acccgtgtga gtttcaaaaa aagcaaaagc 1260 ggtaaacaga aactggtggt ggaaaatggt atttatacca gcctgccgga aaatgaagca 1320 ccggcactgg cagatcagct ggttaccgtt tttgaagatg gcgaaattaa gaaagcctat 1380 agctttgagc agatccgtaa aaacgcaacc atc 1413 <210> 13 <211> 471 <212> PRT <213> Chitinophaga arvensicola <400> 13 Met Thr Lys Glu Asn Leu Ile Leu Leu Ala Asp Ala Tyr Lys Tyr Ser 1 5 10 15 His His Lys Leu Tyr Ile Pro Gly Thr Gln Phe Ile Tyr Ser Tyr Leu 20 25 30 Glu Ser Arg Gly Gly Lys Phe Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Phe Leu Lys Glu Tyr Leu Ser Gly Val Val Phe Thr Lys Glu Lys 50 55 60 Leu Asp Glu Ala Glu Thr Met Leu Thr Glu Val Phe Gly Arg Ser Asp 65 70 75 80 Val Phe Asp Arg Ser Arg Phe Glu Tyr Ile Ile Asp Lys Tyr Gly Gly 85 90 95 Lys Leu Pro Val Arg Ile Lys Ala Val Ala Glu Gly Thr Val Val Pro 100 105 110 Val Arg Asn Val Leu Met Thr Ile Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Phe 115 120 125 Trp Leu Thr Asn Phe Leu Glu Thr Leu Leu Met Gln Val Trp Tyr Pro 130 135 140 Cys Thr Val Ala Ser Val Ser Arg Glu Ile Lys Lys Val Val Lys Gln 145 150 155 160 Tyr Tyr Glu Ala Thr Ala Ser Gln Glu Ala Phe Thr Gly Ile Asp Phe 165 170 175 Val Leu Asn Asp Phe Gly Phe Arg Gly Ala Ser Ser Val Glu Ser Ala 180 185 190 Gly Ile Gly Gly Ser Ala His Leu Val Asn Phe Ala Gly Ser Asp Thr 195 200 205 Ile Pro Gly Ser Val Phe Ala Lys Arg Tyr Tyr Gly Ala Thr Thr Ala 210 215 220 Pro Gly Leu Ser Ile Pro Ala Thr Glu His Ser Val Val Thr Leu Leu 225 230 235 240 Gly Glu Glu Gly Glu Leu Glu Ile Phe Lys His Ile Leu Asp Thr Tyr 245 250 255 Pro Thr Gly Thr Ile Ala Cys Val Ser Asp Ser Tyr Asn Ile Phe Arg 260 265 270 Ala Cys Glu Gln Tyr Trp Gly Thr Glu Leu Lys Glu Gln Ile Leu Lys 275 280 285 Arg Glu Gly Thr Leu Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Val Gln 290 295 300 Thr Leu Leu Arg Ile Phe Asn Ile Leu Met Asp Lys Phe Gly Tyr Thr 305 310 315 320 Thr Asn Glu Lys Gly Phe Lys Val Leu Pro Pro Gln Val Arg Val Ile 325 330 335 Gln Gly Asp Gly Ile Ser Tyr Ser Ser Ile Pro Gly Ile Phe Glu Ala 340 345 350 Leu Lys Gln Ala Gly Ile Ser Ala Glu Asn Leu Val Leu Gly Met Gly 355 360 365 Gly Ala Leu Leu Gln Arg Val Asn Arg Asp Thr Gln Glu Phe Ala Leu 370 375 380 Lys Cys Ala Tyr Ala Val Val Asn Gly Glu Ala Ile Asn Val Gln Lys 385 390 395 400 Met Pro Val Glu Leu Asp Ala Thr Gly Gln Leu Arg Thr Ser Phe Lys 405 410 415 Lys Ser Lys Ala Gly Lys Leu Arg Leu Ile Lys Asp Asn Asn Thr Phe 420 425 430 Lys Thr Val Gly Glu Gly Glu Ala Pro Ala Ser Ala Asp Leu Leu His 435 440 445 Thr Val Phe Glu Asn Gly Glu Val Val His Ser Tyr Thr Phe Asp Glu 450 455 460 Val Arg Lys Thr Ala Ala Leu 465 470 <210> 14 <211> 1413 <212> DNA <213> Chitinophaga arvensicola <400> 14 atgaccaagg agaacctgat cctgctggct gacgcgtaca aatactccca ccacaaactg 60 tacattccag gcacgcagtt catttactct tacctggaat ctcgcggcgg caaattcgag 120 gaaaccgttt tttatggcct gcagtacttt ctgaaggaat acctgagcgg cgttgtattc 180 acgaaagaaa agctggatga agctgaaacg atgctgaccg aggtattcgg ccgctccgat 240 gtattcgatc gctcccgttt cgaatatatc atcgataagt acggtggtaa gctgccggtg 300 cgcatcaagg cggtcgctga aggtactgtg gtgcctgttc gcaacgttct gatgaccatc 360 gaaaacaccg atcctgaatg cttttggctg actaactttc tggaaaccct gctgatgcag 420 gtgtggtatc catgcactgt ggcatctgta agccgcgaaa tcaaaaaagt ggtgaaacag 480 tactacgagg ctacggccag ccaggaagca ttcaccggta tcgacttcgt actgaacgat 540 tttggcttcc gtggcgcctc ctctgtggaa tctgcaggta ttggtggttc cgcacatctg 600 gttaattttg ccggctccga taccatccca ggctctgttt tcgctaaacg ttattatggt 660 gctaccaccg ctccgggtct gtctattccg gctactgaac actccgtggt tacgctgctg 720 ggcgaagagg gtgaactgga aatcttcaag cacatcctgg atacctatcc gactggtact 780 atcgcttgcg tgtccgacag ctacaacatc tttcgtgcgt gtgaacaata ctggggtacc 840 gaactgaaag aacagatcct gaagcgcgaa ggcaccctgg taatccgtcc tgattctggc 900 gacccggttc agactctgct gcgtatcttc aacatcctga tggacaagtt cggttacacc 960 actaacgaaa aaggcttcaa agtactgccg ccacaggtac gcgtgatcca gggtgacggt 1020 atcagctaca gcagcatccc gggcatcttt gaggcactga aacaggctgg catcagcgct 1080 gaaaacctgg tactgggcat gggtggtgca ctgctgcagc gtgtcaatcg tgatacccaa 1140 gagttcgccc tgaaatgcgc atacgcagtt gtcaatggtg aggccatcaa cgtccagaaa 1200 atgccagtag aactggatgc aaccggtcag ctgcgtacct ccttcaaaaa atccaaagca 1260 ggtaagctgc gcctgatcaa agataacaat accttcaaga ccgtgggtga aggcgaagca 1320 cctgcgtctg cagacctgct gcatacggtc ttcgagaacg gtgaggttgt gcattcctac 1380 acctttgacg aagtacgtaa aaccgctgca ctg 1413 <210> 15 <211> 477 <212> PRT <213> Burkholderia pyrrocinia <400> 15 Met Gln Asn Asp Pro Gly Gly Phe Ala Ala Val Leu Ala Asn Pro Ile 1 5 10 15 Leu Asn Thr Asp Ser Tyr Lys Ala Ser His Phe Leu Gln Tyr Pro Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Ala Met Phe Ser Tyr Val Glu Ser Arg Gly Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Arg Thr Leu Phe Phe Gly Leu Gln Met Leu Leu Lys Glu Tyr Leu 50 55 60 Cys Lys Pro Val Thr His Ala Met Ile Asp Asp Ala Arg Asp Phe Phe 65 70 75 80 Thr Val His Gly Val Pro Phe Asn Glu Ala Gly Trp Arg Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Arg Tyr Asp Gly Tyr Leu Pro Val Lys Ile Arg Ala Val Pro Glu 100 105 110 Gly Ser Val Val Pro Val His Asn Val Leu Met Thr Val Glu Cys Asp 115 120 125 Asp Pro Gln Val Phe Trp Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Thr Met Leu Leu 130 135 140 Arg Val Trp Tyr Pro Val Thr Val Ala Thr Arg Ser Trp His Leu Arg 145 150 155 160 Gln Thr Ile Arg Arg Phe Leu Glu Arg Thr Asp Asp Asp Leu Ala Gln 165 170 175 Leu Pro Phe Lys Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Ala 180 185 190 Glu Ser Ala Ala Ile Gly Gly Ala Ala His Leu Val Ser Phe Met Gly 195 200 205 Ser Asp Thr Val Leu Gly Val Leu Ala Ala Asn Arg Phe Tyr Arg Glu 210 215 220 Pro Met Ala Ala Tyr Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Ser Trp Gly Arg Glu Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Asn Met Ile Arg 245 250 255 Arg Phe Gly Leu Pro Gly Ala Ile Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr 260 265 270 Asp Leu Phe Ala Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gly Glu Leu Arg Gln Ala 275 280 285 Val Ile Asp Ser Gly Ala Thr Leu Val Val Arg Pro Asp Ser Gly Asp 290 295 300 Pro Val Lys Ile Val Met Gln Thr Val Arg Ala Leu Asp Val Ser Phe 305 310 315 320 Gly Ser Thr Leu Asn Gly Lys Gly Arg Arg Val Leu Asn Arg Val Arg 325 330 335 Val Ile Gln Gly Asp Gly Val Asp Glu Leu Ser Ile Asp Ala Ile Leu 340 345 350 Ser Ala Leu Asp Asp Ala Gly Tyr Ala Ala Gly Asn Val Val Phe Gly 355 360 365 Met Gly Gly Ala Leu Leu Gln Gln Val Asn Arg Asp Thr Gln Arg Phe 370 375 380 Ala Met Lys Cys Ser Ala Ile Arg Arg Asp Gly Val Trp His Asp Val 385 390 395 400 Arg Lys Asp Pro Val Thr Asp Gln Gly Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg 405 410 415 Leu Thr Leu Leu Arg Asn Arg Arg Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Thr 420 425 430 Leu Pro Val Ala Trp Asp Asp Arg Ala Leu Glu Gly Glu Trp Asp Glu 435 440 445 Ala Leu Glu Thr Val Phe Asp Thr Gly Arg Leu Leu Val Asp Thr Thr 450 455 460 Phe Ala Glu Val Arg Ala Arg Ala His Ala Gly Glu Val 465 470 475 <210> 16 <211> 1431 <212> DNA <213> Burkholderia pyrrocinia <400> 16 atgcagaatg atccaggcgg ttttgctgca gttctggcta accctatcct gaacaccgac 60 tcctacaaag catcccattt tctgcaatac ccgcctgacg cctctgcgat gttctcctac 120 gttgaatccc gtggcggtcg ttatgaccgt accctgttct tcggtctgca gatgctgctg 180 aaggaatacc tgtgtaaacc ggtgactcac gcgatgattg atgatgcgcg tgacttcttt 240 accgtacacg gtgtgccttt caacgaagca ggttggcgct atatcgttga acgttatgat 300 ggctacctgc ctgtaaagat ccgcgctgtt ccagaaggca gcgttgtacc ggtccacaac 360 gtactgatga ccgttgaatg tgatgatccg caggtattct ggctggctag ctacctggaa 420 actatgctgc tgcgtgtttg gtatcctgtt actgtcgcga cccgttcctg gcatctgcgt 480 caaactatcc gccgtttcct ggagcgtacc gatgacgacc tggcgcaact gccgtttaaa 540 ctgcacgact ttggcgctcg tggtgtttcc tccgcggaat ctgctgccat tggtggtgct 600 gcgcatctgg tttcctttat gggcagcgat actgtactgg gtgtcctggc tgctaaccgt 660 ttttaccgtg aaccgatggc agcgtattct gtaccagccg ctgaacactc caccatcacc 720 tcttggggtc gtgaaggtga agctgatgcc taccgtaaca tgatccgtcg tttcggcctg 780 ccgggtgcta ttgtctccgt agtctctgac tcttatgacc tgttcgctgc tctggatctg 840 tggggtggtg aactgcgtca ggctgtgatc gattccggcg cgaccctggt tgttcgtccg 900 gattccggtg acccagtgaa aattgtgatg cagactgtgc gtgcgctgga cgtttctttc 960 ggttccacgc tgaacggtaa aggtcgccgt gtgctgaacc gtgtgcgtgt gattcagggc 1020 gacggcgttg atgaactgag catcgacgct atcctgtctg cactggacga tgcgggttat 1080 gcggcaggca acgttgtgtt cggtatgggt ggcgccctgc tgcagcaagt caaccgtgac 1140 acccaacgtt ttgcaatgaa atgctccgcg atccgtcgcg acggtgtatg gcacgacgta 1200 cgtaaagatc cggtcaccga ccagggcaag cgctctaaaa aaggtcgtct gacgctgctg 1260 cgtaaccgtc gcactggtga atatcgcacc accactctgc cggttgcttg ggatgaccgt 1320 gctctggagg gtgaatggga cgaagcgctg gaaactgttt ttgacactgg tcgcctgctg 1380 gtagatacga ccttcgcgga agttcgtgca cgtgcacatg ctggtgaagt g 1431 <210> 17 <211> 485 <212> PRT <213> Pedobacter alluvionis <400> 17 Met Asn Pro Leu Leu Leu Thr Asp Gly Tyr Lys Val Asp His Arg Arg 1 5 10 15 Gln Tyr Pro Glu Asn Thr Thr Leu Val Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Arg 20 25 30 Lys Ser Arg Leu Glu Asn Val Asn His Val Val Leu Phe Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Phe Ile Lys Lys Tyr Ile Ile Glu Asp Phe Asn Gln Asn Phe Phe 50 55 60 Lys Gln Pro Lys Glu Glu Ile Leu Lys Lys Tyr Ala Arg Arg Ile Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Leu Gly Glu Asn Leu Val Gly Thr Gln His Ile Ala Asp Leu 85 90 95 His Asp Leu Gly Tyr Ile Pro Met Val Phe Lys Ser Leu Pro Glu Gly 100 105 110 Ala Glu Val Pro Leu Arg Val Pro Met Phe Thr Met Tyr Asn Thr Lys 115 120 125 Pro Glu Phe Phe Trp Leu Thr Asn Tyr Phe Glu Thr Leu Leu Ser Ala 130 135 140 Val Val Trp Leu Pro Cys Asn Ser Ala Thr Ile Ala Lys Gln Tyr Arg 145 150 155 160 Thr Ile Leu Asp Arg Tyr Ala Ala Glu Thr Ser Ser Val Pro Glu Phe 165 170 175 Val Asp Trp Gln Gly His Asp Phe Ser Met Arg Gly Met Gly Gly Ile 180 185 190 Glu Ala Ala Val Thr Ser Ala Ala Gly His Leu Leu Ser Phe Thr Gly 195 200 205 Thr Asp Thr Ile Pro Ala Ile Asp Phe Leu Glu Glu Tyr Tyr Asn Ala 210 215 220 Asp Ser Asp Lys Glu Leu Ile Gly Gly Ser Val Ala Ala Thr Glu His 225 230 235 240 Ser Val Met Cys Met Gly Thr Asn Thr Gly Glu Leu Glu Thr Phe Lys 245 250 255 Arg Leu Ile Leu Glu Val Tyr Pro Lys Gly Ile Val Ser Ile Val Ser 260 265 270 Asp Thr Trp Asp Leu Trp Lys Val Leu Thr Glu Tyr Leu Pro Ile Leu 275 280 285 Lys Asp Asp Ile Ile Ala Arg Pro Gly Lys Val Val Ile Arg Pro Asp 290 295 300 Ser Gly Asp Pro Val Asp Ile Ile Cys Gly Asn Pro Asp Gly Lys Ser 305 310 315 320 Glu Asn Glu Lys Lys Gly Val Ile Glu Leu Leu Trp Asp Val Phe Gly 325 330 335 Gly Lys Thr Asn Asp Lys Gly Phe Lys Glu Leu Val Pro Gln Ile Gly 340 345 350 Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Ile Thr Thr Glu Arg Ala Thr Gln Ile Cys 355 360 365 Glu Arg Leu Lys Ala Lys Gly Phe Ala Ser Thr Asn Val Val Phe Gly 370 375 380 Ile Gly Ser Phe Thr Tyr Gln Tyr Asn Thr Arg Asp Thr Phe Gly Phe 385 390 395 400 Ala Met Lys Ala Thr Tyr Gly Glu Val Asp Gly Glu Gly Arg Glu Ile 405 410 415 Phe Lys Asp Pro Ile Thr Asp Asp Gly Thr Lys Lys Ser Ala Lys Gly 420 425 430 Leu Leu Gln Ile Phe Lys Asn Ala Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Lys Asp 435 440 445 Gln Cys Thr Trp Glu Glu Glu Ala Gln Gly Glu Leu Lys Glu Val Phe 450 455 460 Arg Asp Gly Lys Leu Leu Ile Asp Tyr Ser Leu Ala Glu Ile Arg Glu 465 470 475 480 Arg Leu Lys Asn Ser 485 <210> 18 <211> 1455 <212> DNA <213> Pedobacter alluvionis <400> 18 atgaatccgc tgctgctgac tgatggctac aaagtcgatc accgccgcca gtacccggaa 60 aacacgacgc tggtatatag caactggacc ccgcgcaaat cccgtctgga gaacgttaat 120 cacgtcgttc tgtttggcct gcagtatttc atcaaaaaat acatcatcga agactttaac 180 caaaactttt tcaaacagcc gaaggaagaa attctgaaaa aatacgctcg tcgtatcaac 240 aactacctgg gtgaaaatct ggtgggtacc cagcacatcg cagacctgca cgacctgggt 300 tacattccga tggtgttcaa atctctgcca gaaggtgcgg aagtgcctct gcgtgtgccg 360 atgttcacga tgtacaacac caaacctgaa ttcttctggc tgaccaacta cttcgaaacc 420 ctgctgtccg ctgttgtttg gctgccgtgc aactctgcga ccatcgcaaa acagtatcgt 480 accatcctgg atcgctatgc cgcagagacc tctagcgttc cggaattcgt ggattggcag 540 ggtcacgact tctctatgcg tggcatgggc ggtattgaag cagcggtaac ctctgcagcg 600 ggccatctgc tgtcctttac tggcaccgac acgattccag ccattgactt tctggaagaa 660 tactataacg cagacagcga taaagaactg attggcggct ccgttgctgc aactgaacac 720 tccgtcatgt gtatgggtac caacactggt gaactggaaa ccttcaaacg tctgatcctg 780 gaggtttatc caaaaggtat cgtgtctatt gtatctgata cttgggacct gtggaaagtg 840 ctgacggaat atctgccgat tctgaaggat gatatcattg cccgcccagg caaagttgtg 900 atccgtccgg atagcggtga cccggtcgat atcatttgcg gcaacccgga cggtaaatct 960 gaaaacgaaa agaagggcgt tatcgagctg ctgtgggatg ttttcggcgg taaaaccaac 1020 gacaaaggtt ttaaagagct ggtaccacag atcggcgcta tctatggcga ttccatcacc 1080 actgaacgcg cgacccagat ctgtgaacgc ctgaaagcaa aaggttttgc ttccactaac 1140 gtagtttttg gtatcggcag cttcacttac cagtacaaca cccgcgacac cttcggtttc 1200 gcaatgaaag cgacgtatgg cgaagtagat ggtgaaggcc gtgagatctt taaagatccg 1260 attaccgatg acggcaccaa aaaatctgct aaaggtctgc tgcagatctt caagaacgct 1320 tctggtgact atgaactgaa agaccaatgc acctgggaag aagaggcgca gggcgaactg 1380 aaggaggtgt tccgtgacgg caaactgctg atcgattact ctctggcaga aattcgcgag 1440 cgtctgaaaa actct 1455 <210> 19 <211> 473 <212> PRT <213> Microbulbifer thermotolerans <400> 19 Met Gln Asp Tyr Asn Pro Ile Leu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Thr Ser 1 5 10 15 His Tyr Leu Gln Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Ser Tyr Ile 20 25 30 Glu Ser Arg Gly Gly Gln Phe Lys Glu Ala Val Phe Phe Gly Leu Gln 35 40 45 Ala Phe Ile Thr Gln Tyr Leu Ser Gln Pro Ile Thr Arg Asn Asp Ile 50 55 60 Glu Glu Ala Glu Glu Leu Cys Leu Ala His Gly Val Pro Phe Asn Arg 65 70 75 80 Ala Gly Trp Glu Tyr Ile Leu Glu Ala His Gln Gly Tyr Leu Pro Ile 85 90 95 Glu Ile Gln Ala Val Pro Glu Gly Thr Val Val Pro Val Gln Asn Val 100 105 110 Leu Ala Gln Val Val Asn Thr Asp Pro Lys Cys Phe Trp Ile Thr Ser 115 120 125 Tyr Val Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Ile Trp Tyr Pro Thr Thr Val 130 135 140 Ala Thr Gln Ser Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Gln Arg Tyr Leu Glu 145 150 155 160 Glu Thr Ala Asp Thr Leu Asp Gly Leu Pro Phe Lys Leu His Asp Phe 165 170 175 Gly Ala Arg Gly Ala Ser Ser Gly Glu Thr Ala Ala Leu Gly Gly Leu 180 185 190 Ala His Leu Val Asn Phe Gln Gly Thr Asp Thr Val Ala Ala Leu Val 195 200 205 Ala Gly Arg Arg Phe Tyr Asn Ala Pro Met Ala Gly Phe Ser Ile Pro 210 215 220 Ala Ala Glu His Ser Thr Met Thr Ser Trp Gly Arg Glu His Glu Thr 225 230 235 240 Glu Ala Tyr Ala Asn Met Leu Thr Gln Phe Ala Gly Asp Gly Arg Val 245 250 255 Val Ala Val Val Ser Asp Ser Tyr Asn Leu Trp Asn Ala Ile Asp Asn 260 265 270 Ile Trp Gly Gly Glu Leu Lys Glu Arg Val Glu Asn Asn Gly Gly Thr 275 280 285 Leu Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Val Asp Val Val Thr Gln 290 295 300 Thr Ile Glu Arg Leu Met Arg Ile Phe Gly Ala Arg Ile Asn Ser Lys 305 310 315 320 Gly Tyr Arg Val Leu Pro Asp Tyr Ile Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly 325 330 335 Ile Ser Leu His Thr Ile Glu Gly Ile Leu Ala Ala Met Lys Ala Arg 340 345 350 Lys Gln Ser Ala Asp Asn Ile Ala Phe Gly Met Gly Ala Glu Leu Leu 355 360 365 Gln Lys Val His Arg Asp Thr Met Lys Phe Ala Met Lys Ala Ser Ala 370 375 380 Val Arg Val Asn Gly Leu Trp Arg Asp Val Phe Lys Asp Pro Val Thr 385 390 395 400 Asp Thr Gly Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ala Leu Ile Arg Arg 405 410 415 Gly Asn Gly Glu Leu Arg Thr Ile Arg Glu Gln Asp Leu Gly Asn Arg 420 425 430 Gln Asn Leu Leu Gln Pro Val Phe Arg Asn Gly Lys Leu Leu Thr Glu 435 440 445 Gln Ser Leu Glu Asp Ile Arg Arg Arg Ala Ala Val Pro His Asn Glu 450 455 460 Asp Glu Leu Val Met Ala Ala Val Ser 465 470 <210> 20 <211> 1419 <212> DNA <213> Microbulbifer thermotolerans <400> 20 atgcaggact acaacccgat cctgaacgta gattcctaca aaaccagcca ttacctgcag 60 tatccagagg gcacccagta cgtttcttct tatatcgaat cccgtggcgg tcagttcaaa 120 gaagctgtgt tttttggtct gcaggcgttc atcacccagt acctgagcca gccaatcacc 180 cgcaatgaca tcgaagaggc tgaagaactg tgcctggcac acggtgttcc gttcaaccgt 240 gcaggttggg aatatatcct ggaggcgcac cagggctatc tgccgatcga aatccaagcc 300 gtgccggaag gcaccgttgt cccggtgcag aacgttctgg cgcaggtagt taacactgat 360 ccgaaatgct tttggatcac cagctacgta gaaacggcac tgctgcgcgc gatctggtac 420 ccgactactg tggcgaccca gagccgcgag gctaagaaga tcattcaacg ttacctggaa 480 gagactgcag acaccctgga tggtctgcct tttaaactgc acgacttcgg cgcgcgtggc 540 gcatcttctg gcgaaacggc ggccctgggt ggtctggctc acctggtcaa cttccaaggt 600 accgatacgg ttgcggcact ggttgcgggc cgtcgttttt ataacgcgcc aatggctggt 660 ttttccatcc cagcagctga gcactctact atgaccagct ggggccgcga gcacgaaacc 720 gaggcctacg caaacatgct gacccagttt gctggcgatg gtcgtgtggt tgctgtggtg 780 tctgactcct acaacctgtg gaacgctatc gacaatattt ggggcggtga actgaaagag 840 cgcgtggaaa acaacggcgg taccctggta atccgtccgg atagcggcga tccagttgat 900 gtagttaccc agactatcga acgtctgatg cgtattttcg gcgctcgcat caactctaaa 960 ggttatcgcg tcctgccgga ctacatccgt gtgatccagg gtgacggtat ctctctgcac 1020 actatcgagg gcatcctggc ggcaatgaag gcccgcaaac agagcgcaga taacattgct 1080 tttggcatgg gcgctgaact gctgcaaaaa gtgcaccgcg ataccatgaa attcgcgatg 1140 aaagcatccg ccgtacgcgt taacggcctg tggcgtgatg tgttcaaaga tccggttact 1200 gataccggta aacgttctaa gaagggccgt ctggcactga tccgtcgcgg caacggcgaa 1260 ctgcgtacca tccgtgaaca ggatctgggt aaccgccaaa acctgctgca gccagttttc 1320 cgcaacggta agctgctgac cgaacagtcc ctggaggata ttcgtcgtcg tgcggcggtt 1380 ccacacaacg aggatgaact ggtgatggcg gctgtctcc 1419 <210> 21 <211> 468 <212> PRT <213> Labrenzia aggregata <400> 21 Met Thr Asn Pro Leu Leu Ala Thr Asp Ser Tyr Lys Gln Ser His Phe 1 5 10 15 Lys Gln Tyr Pro Pro Glu Ala Arg Arg Ile Ser Ala Tyr Leu Glu Ala 20 25 30 Arg Pro Asn Pro Phe Ser Asp Ser Val Leu Phe Phe Gly Leu Gln Thr 35 40 45 Tyr Leu Lys Asp Val Leu Leu Lys Pro Ile Thr Ala Ser Asp Ile Ala 50 55 60 Ala Ala Asp Arg Ile Cys Ala Ala His Gly Val Pro Phe Asn Arg Glu 65 70 75 80 Gly Trp Glu Gln Ile Leu Thr Asp His Gly Gly Leu Phe Pro Leu Glu 85 90 95 Ile Lys Ala Leu Pro Glu Gly Thr Leu Ala Pro Ser Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Gln Val Glu Asn Thr Asp Glu Arg Met Pro Trp Leu Thr Thr Trp 115 120 125 Val Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ser Val Trp Tyr Pro Ser Thr Val Ala 130 135 140 Thr Leu Ser Phe Lys Cys Lys Glu Ile Leu Tyr Arg Gly Leu Leu Asp 145 150 155 160 Thr Ser Asp Asp Pro Asp Ser Gln Ile Pro Phe Lys Leu His Asp Phe 165 170 175 Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ala Leu Gly Gly Met 180 185 190 Ala His Leu Val Asn Phe Ala Gly Thr Asp Thr Met Glu Ala Leu Glu 195 200 205 Ala Ala Met Thr Trp Tyr Gly Ala Asp Val Ala Gly Phe Ser Ile Pro 210 215 220 Ala Ala Glu His Ser Thr Met Thr Ser Trp Gly Arg Glu Arg Glu Val 225 230 235 240 Asp Ala Tyr Arg Asn Met Leu Val Gln Phe Gly Arg Pro Asn Ala Pro 245 250 255 Val Ala Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Leu Gly Asn Ala Val Glu Asn 260 265 270 Leu Trp Cys Gly Arg Leu Lys Asp Glu Val Leu Lys Ser Gly Ala Thr 275 280 285 Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Val Glu Met Pro Leu Lys 290 295 300 Val Met Glu Thr Leu Trp Gln His Tyr Gly Gly Ser Glu Asn Ser Lys 305 310 315 320 Gly Ala Arg Val Leu His Pro Ser Val Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly 325 330 335 Met Lys Leu Asp Thr Ile Arg Gln Leu Val Glu Glu Leu Val Arg Arg 340 345 350 Asn Trp Ser Val Asp Asn Ile Ala Val Gly Met Gly Gly Gly Leu Leu 355 360 365 Gln Gln Val Asn Arg Asp Thr Met Arg Phe Ala Met Lys Ala Asn Ala 370 375 380 Met Lys Thr Ala Asp Gly Thr Trp His Asp Val Ser Lys Asn Pro Ala 385 390 395 400 Thr Asp Pro Gly Lys Ala Ser Lys Ala Gly Arg Gln Ala Thr Val Leu 405 410 415 Glu Asn Gly Val Leu Ser Ala Val Arg Leu Glu Ala Val Gly Gly Arg 420 425 430 Thr Asp Gln Leu Gln Thr Val Tyr Arg Asn Gly Val Leu Val Lys Asp 435 440 445 Trp Thr Phe Glu Glu Val Arg Ala Leu Ala Arg Lys His Leu Leu Glu 450 455 460 Arg Val Ala Ser 465 <210> 22 <211> 1404 <212> DNA <213> Labrenzia aggregata <400> 22 atgactaacc cactgctggc gactgattct tacaaacaga gccacttcaa acagtacccg 60 ccggaagcgc gtcgtatttc cgcgtacctg gaagcacgtc cgaacccgtt ctctgactct 120 gtactgttct tcggtctgca gacctacctg aaagacgttc tgctgaaacc gatcaccgca 180 agcgatatcg cagctgcgga tcgtatttgt gcggcacacg gtgttccatt caatcgcgaa 240 ggctgggagc agatcctgac tgatcacggt ggtctgttcc cactggaaat caaagcgctg 300 ccggaaggca ctctggcacc atctggtgta cctctggtgc aggtagaaaa caccgatgaa 360 cgtatgccgt ggctgaccac ctgggtggaa actgctctgc tgcgttctgt atggtacccg 420 tccactgtag ctaccctgag cttcaaatgt aaagaaattc tgtatcgtgg cctgctggat 480 acgagcgatg atccggattc tcagattcca tttaagctgc acgactttgg tgcgcgtggt 540 gtttcctccg cggaatccgc tgcactgggt ggtatggcac atctggtaaa ctttgccggc 600 accgacacga tggaagctct ggaagcggca atgacctggt atggtgctga tgtagccggt 660 ttctccattc cggcagcaga acactccacc atgacttctt ggggtcgtga acgtgaggtt 720 gatgcgtatc gcaacatgct ggttcagttc ggtcgcccga acgctccggt tgctgttgta 780 tctgactcct acgatctggg taacgctgtt gaaaacctgt ggtgcggccg tctgaaagac 840 gaagtgctga aatctggtgc aacggtcgtc atccgtccag attctggcga cccggttgaa 900 atgccactga aagtgatgga aaccctgtgg cagcactacg gcggcagcga aaactccaaa 960 ggtgcacgtg tgctgcatcc ttctgtccgt gtgatccagg gtgacggcat gaagctggat 1020 accatccgcc agctggtcga agagctggta cgtcgcaact ggtctgttga caacattgca 1080 gtaggtatgg gcggcggtct gctgcaacag gtgaaccgtg ataccatgcg cttcgctatg 1140 aaagcaaacg cgatgaaaac cgctgacggc acctggcacg atgtttccaa aaacccggct 1200 accgatcctg gtaaggcttc taaagcaggc cgtcaagcca ctgtgctgga aaacggcgta 1260 ctgtccgcgg ttcgcctgga agcagttggc ggtcgtactg atcagctgca gacggtctac 1320 cgtaacggtg ttctggtaaa ggactggacc ttcgaagaag ttcgcgcact ggcgcgcaaa 1380 cacctgctgg aacgcgttgc ttct 1404 <210> 23 <211> 482 <212> PRT <213> Luteibacter <400> 23 Met Leu Trp Val Met Thr Thr His Ser Val Ser Tyr Leu Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ile Leu Asp Thr Asp Ser Tyr Lys Ala Ser His Trp Leu Gln Tyr Pro 20 25 30 Pro Asn Thr Asp Ala Thr Phe Phe Tyr Val Glu Ser Arg Gly Gly Thr 35 40 45 Tyr Asp Arg Thr Leu Phe Phe Gly Leu Gln Ala Val Leu Lys Ala Arg 50 55 60 Leu Glu Arg Pro Val Thr His Ala Asp Val Asp Glu Ala Arg Asp Phe 65 70 75 80 Phe Ala Ala His Gly Glu Pro Phe Asn Asp Glu Gly Trp Arg Tyr Ile 85 90 95 Val Asp Thr His Gly Gly Arg Leu Pro Val Arg Val Arg Ala Val Pro 100 105 110 Glu Gly Ser Val Val Pro Thr His Gln Ala Leu Val Thr Ile Glu Ser 115 120 125 Thr Asp Pro Arg Thr Tyr Trp Leu Pro Ser Tyr Leu Glu Thr Arg Leu 130 135 140 Leu Arg Leu Trp Tyr Pro Val Thr Val Ala Thr Thr Ser Trp His Ala 145 150 155 160 Arg Gln Thr Ile Ala His Tyr Leu Asp Thr Thr Ser Asp Asp Pro Ala 165 170 175 Ala Gln Ile Pro Phe Lys Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser 180 185 190 Ser Ala Glu Ser Ala Gly Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe 195 200 205 Leu Gly Thr Asp Thr Val Ser Gly Val Leu Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr 210 215 220 Gly Glu Pro Met Ala Gly Phe Ser Ile Pro Ala Ala Glu His Ser Thr 225 230 235 240 Ile Thr Ser Trp Gly Arg Asp His Glu Val Asp Ala Tyr Arg Asn Met 245 250 255 Leu Arg His Phe Ala Lys Pro Gly Ser Leu Val Ala Val Val Ser Asp 260 265 270 Ser Tyr Asp Ile Tyr His Ala Ile Lys Glu His Trp Gly Lys Thr Leu 275 280 285 Arg Asp Glu Val Ile Ala Ser Gly Ala Thr Val Val Val Arg Pro Asp 290 295 300 Ser Gly Asp Pro Val Glu Val Val His Arg Cys Val Ser Leu Leu Asp 305 310 315 320 Glu Ala Phe Gly Ser Thr Val Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Val Leu Asn 325 330 335 His Val Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly Val Asn Pro Asp Ser Ile Arg 340 345 350 Ala Ile Leu Glu Arg Ile Thr Thr Ala Gly Tyr Ser Ala Asp Asn Leu 355 360 365 Ala Phe Gly Met Gly Gly Ala Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Thr 370 375 380 Gln Lys Phe Ala Leu Lys Cys Ser Ala Ala Arg Val Asp Gly Ala Trp 385 390 395 400 Arg Asp Val Trp Lys Asp Pro Val Thr Asp Gln Gly Lys Leu Ser Lys 405 410 415 Arg Gly Arg Met Thr Leu Leu His His Arg Glu Ser Gly Thr Tyr Arg 420 425 430 Thr Val Pro Leu Pro Gly Asp Ala Ile Ala Met Pro Pro Glu Ala Ile 435 440 445 Glu Pro Gly Trp Glu Glu Ala Met Val Thr Val Trp Glu Asn Gly Glu 450 455 460 Pro Val Arg Glu Trp Ser Phe Ala Asp Val Arg Glu Arg Ala Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly <210> 24 <211> 1446 <212> DNA <213> Luteibacter sp. <400> 24 atgctgtggg ttatgaccac ccactctgtt tcttacctgg acaacccgat cctggacacc 60 gactcttaca aagcttctca ctggctgcag tacccgccga acaccgacgc taccttcttc 120 tacgttgaat ctcgtggtgg tacctacgac cgtaccctgt tcttcggtct gcaggctgtt 180 ctgaaagctc gtctggaacg tccggttacc cacgctgacg ttgacgaagc tcgtgacttc 240 ttcgctgctc acggtgaacc gttcaacgac gaaggttggc gttacatcgt tgacacccac 300 ggtggtcgtc tgccggttcg tgttcgtgct gttccggaag gttctgttgt tccgacccac 360 caggctctgg ttaccatcga atctaccgac ccgcgtacct actggctgcc gtcttacctg 420 gaaacccgtc tgctgcgtct gtggtacccg gttaccgttg ctaccacctc ttggcacgct 480 cgtcagacca tcgctcacta cctggacacc acctctgacg acccggctgc tcagatcccg 540 ttcaaactgc acgacttcgg tgctcgtggt gtttcttctg ctgaatctgc tggtctgggt 600 ggtatggctc acctggttaa cttcctgggt accgacaccg tttctggtgt tctggctgct 660 cgtgcttact acggtgaacc gatggctggt ttctctatcc cggctgctga acactctacc 720 atcacctctt ggggtcgtga ccacgaagtt gacgcttacc gtaacatgct gcgtcacttc 780 gctaaaccgg gttctctggt tgctgttgtt tctgactctt acgacatcta ccacgctatc 840 aaagaacact ggggtaaaac cctgcgtgac gaagttatcg cttctggtgc taccgttgtt 900 gttcgtccgg actctggtga cccggttgaa gttgttcacc gttgcgtttc tctgctggac 960 gaagctttcg gttctaccgt taacggtaaa ggttaccgtg ttctgaacca cgttcgtgtt 1020 atccagggtg acggtgttaa cccggactct atccgtgcta tcctggaacg tatcaccacc 1080 gctggttact ctgctgacaa cctggctttc ggtatgggtg gtgctctgct gcagaaactg 1140 acccgtgaca cccagaaatt cgctctgaaa tgctctgctg ctcgtgttga cggtgcttgg 1200 cgtgacgttt ggaaagaccc ggttaccgac cagggtaaac tgtctaaacg tggtcgtatg 1260 accctgctgc accaccgtga atctggtacc taccgtaccg ttccgctgcc gggtgacgct 1320 atcgctatgc cgccggaagc tatcgaaccg ggttgggaag aagctatggt taccgtttgg 1380 gaaaacggtg aaccggttcg tgaatggtct ttcgctgacg ttcgtgaacg tgctgctgct 1440 ggtggt 1446 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S247X-F) <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 ccagcatccc ggcannsgaa catagcgtta tgtcgagcc 39 <210> 26 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S247X-R) <400> 26 gccgggatgc tgg 13 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_E248X-F) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 gcatcgnnsc atagcgttat gtcgagc 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_E248X-R) <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 28 gctatgsnnc gatgccggga tgctggt 27 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S253X-F) <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 catcggaaca tagcgttatg nnsagccacg gcgtcg 36 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S253X-R) <400> 30 cataacgcta tgttccgatg 20 <210> 31 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_V278X-F) <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 31 cccgcataac atgctgtcta ttnnsagtga taccacggac ttttgg 46 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_V278X-R) <400> 32 aatagacagc atgttatgcg gg 22 <210> 33 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_T281X-F) <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 catgctgtct attgtcagtg atnnsacgga cttttggcac aac 43 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_T281X-R) <400> 34 atcactgaca atagacagca tg 22 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (T7-PP) <400> 35 taatacgact cactataggg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (T7-TP) <400> 36 atgctagtta ttgctcagcg 20 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S247Z-F) <400> 37 ccagcatccc ggcawcygaa catagcgtta tgtcgagcc 39 <210> 38 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S247Z-R) <400> 38 gccgggatgc tgg 13 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S253U-F) <400> 39 catcggaaca tagcgttatg rstagccacg gcgtcg 36 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_S253U-R) <400> 40 cataacgcta tgttccgatg 20 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_V278J_T281B-F) <400> 41 ccgcataaca tgctgtctat tgyyagtgat wcyacggact tttggcacaa c 51 <210> 42 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Nampt_V278J_T281B-R) <400> 42 gacagcatgt tatgcgggaa tttagccatc agatagcgaa acgtgctcag ttcatcgacg 60 ccgtggc 67 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (MrNampt_M230T-F) <400> 43 tccggcgacc gaacacagca ccgttacc 28 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (MrNampt_M230T-R) <400> 44 tgtgttcggt cgccggaatg ctatagc 27 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (MrNampt_E231G-F) <400> 45 ggcgatgggc cacagcaccg ttaccag 27 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (MrNampt_E231G-R) <400> 46 gtgctgtggc ccatcgccgg aatgctata 29 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (MrNampt_V264A-F) <400> 47 ggcgatggcg atcgacagct ataaccgtg 29 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (MrNampt_V264A-R) <400> 48 tgtcgatcgc catcgccatc agcgcac 27 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (SpNampt_E227G-F) <400> 49 ggcagcaggc catagcacca tgaccag 27 <210> 50 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (SpNampt_E227G-R) <400> 50 tgctatggcc tgctgccgga atgctaaa 28

Claims

개변형 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)이며, 하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하고,
야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있는, 개변형 Nampt.
(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃
(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅
단, X₁ 내지 X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₂는 A 및 Q 이외의 아미노산이며, X₃은 M 이외의 아미노산을 나타낸다. 또한, []는 [] 내의 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다.
하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는, 개변형 Nampt이며:
야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있는, 개변형 Nampt.
(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃
(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅
단, X₁ 내지 X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₁은 중성 아미노산 및 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₂는 지방족 아미노산, 산성 아미노산 및 중성의 친수성 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₃은 비극성 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₄는 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₅는 방향족 아미노산 이외의 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산을 나타낸다. 또한, []는 [] 내의 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다.
개변형 니코틴아미드·포스포리보실트랜스퍼라아제(Nampt)이며, 하기 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열 및/또는 하기 서열 번호 2에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하고,
야생형 Nampt보다도 활성이 향상되어 있는, 개변형 Nampt.
(a) 서열 번호 1: S-[V/I]-P-A-X₁-X₂-H-S-[T/V/I]-[M/V/I]-X₃
(b) 서열 번호 2: X₄-[S/I]-D-X₅
단, X₁, X₄, X₅ 중 적어도 하나는 야생형의 아미노산과는 다르고, X₁은 중성 아미노산 및 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₄는 지방족 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산, X₅는 방향족 아미노산 이외의 아미노산에서 선택되는 어느 아미노산을 나타낸다. X₂ 및 X₃은 어느 아미노산이어도 된다. 또한, []는 [] 내의 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 개변형 Nampt의 아미노산 서열을, 서열 번호 3으로 나타내지는 아미노산 서열과 얼라인먼트했을 때,
상기 서열 번호 1로 나타내지는 아미노산 서열이, 서열 번호 3의 243번째 내지 253번째에 해당하는 위치에 존재하고,
상기 서열 번호 2로 나타내지는 아미노산 서열이, 서열 번호 3의 278번째 내지 281번째에 해당하는 위치에 존재하는, 개변형 Nampt.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이하의 1) 내지 5)에서 선택되는 1 또는 2 이상의 치환을 갖는, 개변형 Nampt.
1) X₁에 있어서의 야생형 아미노산의 T로의 치환
2) X₂에 있어서의 야생형 아미노산의 G로의 치환
3) X₃에 있어서의 야생형 아미노산의 G 또는 A로의 치환
4) X₄에 있어서의 야생형 아미노산의 A로의 치환
5) X₅에 있어서의 야생형 아미노산의 S, A, N 또는 I로의 치환
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개변형 Nampt의 야생형 서열이, 이하의 (1) 또는 (2)의 아미노산 서열을 갖는, 개변형 Nampt.
(1) 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 것으로 나타내지는 아미노산 서열
(2) 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 것으로 나타내지는 아미노산 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖고, Nampt 활성을 갖는 단백을 코딩하는 아미노산 서열
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개변형 Nampt가, 헤모필루스속, 메이오써무스속, 크산토모나스속, 스핑고픽시스속, 스핑고픽시스속, 키티노파가속, 버크홀데리아속, 페도박터속, 마이크로불비퍼속, 라브렌지아속, 루테이박터속 유래인, 개변형 Nampt.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 개변형 Nampt의 존재 하에서, 포스포리보실피로포스파이트 및 니코틴아미드를 접촉시킴으로써, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 포스포리보실피로포스파이트가 포스포리보실피로인산 신타아제의 존재 하에 리보오스-5-인산으로 제조된 것인, 방법.
제9항에 있어서, 리보오스-5-인산이 리보키나아제의 존재 하에 리보오스로 제조된 것인, 방법.