WO2022202952A1 - 改変型ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ - Google Patents

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隆宏 林
卓理 秋山
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    • C12Y204/02012—Nicotinamide phosphoribosyltransferase (2.4.2.12), i.e. visfatin

Definitions

  • the present invention relates to a modified (mutant) nicotinamide phosphoribosyltransferase and a method for producing nicotinamide mononucleotide using the same.
  • Nicotinamide mononucleotide is a synthetic intermediate of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+).
  • NAD+ nicotinamide adenine dinucleotide
  • NMN controls the activity of the longevity gene "sirtuin” through conversion to NAD+, and that administration of NMN to mice exhibits an anti-aging effect.
  • NMN is effective in preventing and improving symptoms of diseases such as diabetes, Alzheimer's disease, and heart failure.
  • Such NMN is expected to be used as a component of functional foods, pharmaceuticals, cosmetics, etc., and research and development of efficient production methods are underway with the aim of improving productivity.
  • NMN ribose-5-phosphate
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate
  • It consists of a main reaction consisting of three steps of enzymatic reactions, (3) a third reaction in which NMN is produced from PRPP and nicotinamide (NAM), and support reactions for ATP regeneration and pyrophosphate degradation.
  • Nicotinamide phosphoribosyltransferase is a rate-limiting enzyme in the mammalian NAD+ synthesis system, and is an enzyme that catalyzes the third reaction in the above production route (Non-Patent Document 1).
  • the activity of wild-type Nampt is lower than that of other enzymes and cannot be said to be sufficient for industrial production of NMN, and therefore its improvement is desired.
  • searching for highly active Nampt HdNampt
  • Non-Patent Documents 2 and 3 activating Nampt using a small molecule compound
  • Non-Patent Document 5 have attempted to improve the production efficiency of NMN.
  • Patent Document 1 A method for improving the production efficiency of NMN has been reported.
  • An object of the present invention is to provide a highly active nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt), thereby improving the production efficiency of NMN.
  • Nampt nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • the inventors individually create a saturation mutation library for residues near the active center of wild-type highly active Nampt, and perform activity screening to create a modified (mutant) Nampt with high enzymatic activity. succeeded in
  • a modified nicotinamide phosphoribosyltransferase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 below and/or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 below, A modified Nampt that has improved activity over wild-type Nampt.
  • SEQ ID NO: 1 S-[V/I]-P-A-X1-X2 - HS-[T/V/I]-[M/V/ I ] -X3
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: X4-[S/I]-D- X5
  • X 1 to X 5 is different from the wild-type amino acid
  • X 2 is an amino acid other than A and Q
  • X 3 represents an amino acid other than M.
  • [ ] represents any one of the amino acids in [ ].
  • SEQ ID NO: 1 S-[V/I]-P-A-X1-X2 - HS-[T/V/I]-[M/V/ I ] -X3
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 2 : X4-[S/I]-D- X5
  • at least one of X 1 to X 5 is different from a wild-type amino acid
  • X 1 is any amino acid selected from neutral amino acids and aliphatic amino acids
  • X 2 is aliphatic amino acids
  • acidic amino acids and neutral amino acids Any amino acid selected from hydrophilic amino acids
  • X3 is any amino acid selected from nonpolar amino acids
  • X4 is any amino acid selected from aliphatic amino acids
  • X5 is from amino acids other than aromatic
  • [ ] represents any one of the amino acids in [ ].
  • a modified nicotinamide phosphoribosyltransferase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 below and/or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 below, A modified Nampt that has improved activity over wild-type Nampt.
  • SEQ ID NO: 1 S-[V/I]-P-A-X1-X2 - HS-[T/V/I]-[M/V/ I ] -X3
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: X4-[S/I]-D- X5 provided that at least one of X 1 , X 4 and X 5 is different from a wild-type amino acid
  • X 1 is any amino acid selected from neutral amino acids and aliphatic amino acids
  • X 4 is selected from aliphatic amino acids
  • Any amino acid X5 represents any amino acid selected from amino acids other than aromatic amino acids. Any amino acid may be sufficient as X2 and X3.
  • [ ] represents any one of the amino acids in [ ].
  • the wild-type sequence of the modified Nampt has the following amino acid sequence (1) or (2) The modified Nampt according to any one of [1] to [5].
  • [8] A method for producing nicotinamide mononucleotide by contacting phosphoribosylpyrophosphate and nicotinamide in the presence of the modified Nampt according to any one of [1] to [7].
  • [9] The method of [8], wherein the phosphoribosylpyrophosphate is produced from ribose-5-phosphate in the presence of phosphoribosylpyrophosphate synthase.
  • [10] The method of [9], wherein ribose-5-phosphate is produced from ribose in the presence of ribokinase.
  • a method for producing Nampt comprising culturing the transformant of [13] and collecting nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) from the resulting culture.
  • a method for producing nicotinamide mononucleotide comprising contacting ribosylpyrophosphate and nicotinamide.
  • the Nampt of the present invention improves NMN production efficiency and reduces raw material costs.
  • Figure 2 shows an alignment of Nampt amino acid sequences from various microorganisms.
  • Nampt Nicotinamide phosphoribosyltransferase: Nicotinamide phosphoribosyltransferase Prs (Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase): Phosphoribosyl pyrophosphate synthase Rbk (Ribokinase): Ribokinase Ppk (Polyphosphate kinase): Polyphosphate kinase PPase (Pyrophosphatase): Pyrophosphatase NMN (Nicotinamide mononucleotide ): nicotinamide mononucleotide PRPP (Phosphoribosyl pyrophosphate): phosphoribosyl pyrophosphate NAM (Nicotinamide): nicotinamide R5P (Ribose-5-phosphate)
  • nicotinamide phosphoribosyltransferase 1.1 Wild-type Nampt Nampt (EC number: 2.4.2.12) is generally known to be involved in the NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) salvage pathway, and in the present invention, a reaction (third reaction).
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • ATP is not essential in NMN synthesis reaction from PRPP and NAM by Nampt.
  • Nampt has ATP hydrolysis activity, and autophosphorylation of Nampt by ATP hydrolysis changes enzymatic parameters and chemical equilibrium in a direction that favors NMN production. (Biochemistry 2008, 47, 11086-11096).
  • Nampt examples include human (Homo sapiens)-derived (NP_005737), mouse (Mus musculus)-derived (NP_067499), rat (Rattus norvegicus)-derived (NP_808789), zebrafish (Danio rerio)-derived (NP_997833), Haemophilus ducreyi (AAR87771), Deinococcus radiodurans (AE001890), Oenococcus oeni (KZD13878), and Shewanella oneidensis (NP_717588).
  • bacteria are a group of prokaryotes that do not have a nuclear membrane, and are a group of organisms including Escherichia coli, Bacillus subtilis, cyanobacteria, and the like.
  • Nampt is preferably derived from the genus Haemophilus, Meiothermus, Xanthomonas, Sphingopyxis, Sphingopyxis, Chitinophaga, Burkholderia, Pedobacter, Microbulbifer, and Labrenzia.
  • Table 1 shows the origin of Nampt that can be used in the present invention, the GenBank accession number, and the sequence number of the sequence listing. In addition, FIG. 1 shows the alignment of the amino acid sequences of each Nampt.
  • Nampt according to the present invention is not limited to those having the above sequences, and any of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, and 23.
  • a protein containing an identical amino acid sequence and having Nampt activity is also included in the Nampt of the present invention.
  • the Nampt of the present invention includes one or several amino acid sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, and 23, specifically Specifically, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2 amino acid deletions, substitutions or additions include an amino acid sequence, and Nampt Proteins with activity are also included in the Nampt of the present invention.
  • the Nampt gene according to the present invention encodes the amino acid sequence described above.
  • the Nampt gene has the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, and 24. However, about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 98% or more of the base sequence
  • the Nampt gene of the present invention also includes a gene containing a nucleotide sequence having identity and a nucleotide sequence encoding a protein having Nampt activity.
  • a gene containing a nucleotide sequence encoding a protein is also included in the Nampt gene of the present invention.
  • a DNA-immobilized nylon membrane is treated with 6 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC is a solution of 8.76 g of sodium chloride and 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water), 1% Conditions for hybridization in a solution containing SDS, 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, and 0.1% Ficoll, incubating with the probe at 65° C. for 20 hours can be mentioned, but are not limited to these.
  • a person skilled in the art would be able to set hybridization conditions by taking into consideration other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. in addition to conditions such as buffer salt concentration and temperature. can be done.
  • Washing conditions after hybridization include, for example, “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42° C.” and "1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37° C.”; more stringent conditions include, for example, Conditions such as “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65° C.” and “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 50° C.” can be mentioned.
  • the modified Nampt of the present invention is a novel modified Nampt characterized in that it contains at least one amino acid residue mutation and has improved activity compared to the wild-type activity.
  • the modified Nampt of the present invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 below and/or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 below.
  • SEQ ID NO: 1 S-[V/I]-P-A-X1-X2 - HS-[T/V/I]-[M/V/ I ] -X3
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: : X4-[S/I]-D- X5
  • at least one of X 1 to X 5 is different from the wild-type amino acid, and [ ] represents any one of the amino acids in [ ].
  • At least one of X 1 -X 5 is different from the wild-type amino acid, X 2 is an amino acid other than A and Q, and X 3 represents an amino acid other than M.
  • At least one of X 1 to X 5 is different from a wild-type amino acid
  • X 1 is any amino acid selected from neutral amino acids and aliphatic amino acids
  • X 2 is an aliphatic amino acid
  • X3 any amino acid selected from nonpolar amino acids
  • X4 any amino acid selected from aliphatic amino acids
  • X5 aromatic amino acids represents any amino acid selected from amino acids other than
  • At least one of X 1 , X 4 and X 5 is different from a wild-type amino acid
  • X 1 is any amino acid selected from neutral amino acids and aliphatic amino acids
  • X 4 is aliphatic Any amino acid selected from amino acids
  • X5 represents any amino acid selected from amino acids other than aromatic amino acids. Any amino acid may be sufficient as X2 and X3.
  • acidic amino acids are, for example, aspartic acid (D) and glutamic acid (E), preferably glutamic acid (E).
  • Neutral amino acids include, for example, glycine (G), alanine (A), phenylalanine (F), leucine (L), isoleucine (I), cysteine (C), methionine (M), tyrosine (Y), valine (V), threonine (T), serine (S), proline (P), tryptophan (W), asparagine (N), glutamine (Q), preferably valine (V), threonine (T), alanine (A), glycine (G), leucine (L), serine (S), asparagine (N), isoleucine (I), more preferably threonine (T), alanine (A), glycine (G), leucine (L), serine (S), asparagine (N), isoleucine (I).
  • Aliphatic amino acid is, for example, alanine (A), leucine (L), isoleucine (I), valine (V), phenylalanine (F), preferably alanine (A), leucine (L), isoleucine (I) and valine (V), more preferably alanine (A) and isoleucine (I).
  • Hydrophilic amino acids include, for example, aspartic acid (D), glutamic acid (E), lysine (K), arginine (R), threonine (T), serine (S), asparagine (N), glutamine (Q) , histidine (H), preferably threonine (T), serine (S), asparagine (N) and glutamine (Q), more preferably threonine (T) and serine (S).
  • Non-polar amino acids include, for example, alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), methionine (M), phenylalanine (F), tryptophan (W), proline (P), Glycine (G) and cysteine (C), preferably alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I) and glycine (G), more preferably alanine (A) and valine ( V), glycine (G).
  • Aromatic amino acid is, for example, phenylalanine (F), tryptophan (W), tyrosine (Y), preferably phenylalanine (F), tryptophan (W), more preferably tryptophan (W). .
  • sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are motif sequences that are commonly present in known amino acid sequences of Nampt. As shown in FIG. 1, when the amino acid sequence of the modified Nampt was aligned with the amino acid sequence derived from Haemophilus ducreyi (AAR87771) shown in SEQ ID NO: 3, (a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is present at positions corresponding to positions 243 to 253 of SEQ ID NO: 3; (b) The amino acid sequence shown by SEQ ID NO:2 is present at positions corresponding to positions 278 to 281 of SEQ ID NO:3.
  • At least one of X 1 to X 5 may be different from the wild-type amino acid as long as the Nampt activity is improved over that of the wild-type.
  • Preferred substitutions for X 1 to X 5 include the following. 1) X 1 : substitution of wild-type amino acid to T or V, more preferably substitution to T 2) X 2 : substitution of wild-type amino acid to A or G, more preferably substitution to G 3) X 3 : wild-type amino acid substitution to V, G or A, more preferably G or A substitution 4) X 4 : wild-type amino acid substitution to A or L, more preferably substitution to A 5) X 5 : substitution of a wild-type amino acid with G, S, A, N, or I, more preferably substitution of a wild-type amino acid with S, A, N, or I
  • the modified Nampt of the present invention may have mutations in two or more of X 1 to X 5 (complex substitution (mutation)). By introducing multiple mutations in this way, higher activity than a single mutation may be achieved.
  • Such compound substitutions include combinations of the following. 2 substitutions: X 1 and X 2 , X 1 and X 3 , X 1 and X 4 , X 1 and X 5 , X 2 and X 3 , X 2 and X 4 , X 2 and X 5 , X 3 and X 4 , X3 and X5 , X4 and X5 3 substitutions: X 1 and X 2 and X 3 , X 1 and X 2 and X 4 , X 1 and X 2 and X 5 , X 1 and X 3 and X 4 , X 1 and X 3 and X 5 , X 1 and X 4 and X 5 , X 2 and X 3 and X 4 , X 2 and X 3 and X 5 , X 2 and X 3 and X 4 and , X 2 and X 3 and X 5 , X 2 and X 3 and X 4 and , X 2
  • compound substitution of X 1 and X 3 , X 1 and X 4 , and X 1 and X 5 are preferred, and compound substitution of X 3 and X 5 and X 4 and X 5 are more preferred.
  • a combination of substitution of X 1 to T and substitution of X 3 to G, a combination of substitution of X 1 to T and substitution of X 4 to A, substitution of X 1 to T and Combinations of substitutions of X 5 to S, combinations of substitutions of X 3 to G and substitutions of X 5 to S, combinations of substitutions of X 1 to T and substitutions of X 3 to T are preferred, X 3 A combination of A substitution and X 5 substitution with S, and a combination of X 4 substitution with G and X 5 substitution with S are more preferred.
  • X 1 to X 5 above correspond to the 247th, 248th, 253rd, 278th and 281st amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, respectively. Therefore, when the amino acid sequence of the modified nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) of the present invention is aligned with the amino acid sequence of Haemophilus ducreyi-derived (AAR87771) Nampt shown in SEQ ID NO: 3, At least one amino acid selected from amino acids at positions corresponding to positions 247, 248, 253, 278, and 281 is substituted with an amino acid different from the wild-type amino acid, and the activity is improved over wild-type Nampt. It can also be described as a modified Nampt.
  • Nampt modified nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • substitutions can be described as follows. 1) Substitution of the wild-type amino acid at position (X 1 ) corresponding to position 247 of SEQ ID NO: 3 to T or V, more preferably substitution to T 2) Position corresponding to position 248 of SEQ ID NO: 3 (X 2 ) of the wild - type amino acid to A or G, more preferably to G; More preferably, substitution to G or A 4) Substitution of the wild-type amino acid at position (X 4 ) corresponding to position 278 of SEQ ID NO: 3 to A or L, more preferably substitution to A 5) SEQ ID NO: 3 Substitution of the wild-type amino acid at position (X 5 ) corresponding to position 281 with G, S, A, N, or I, more preferably with S, A, N, or I
  • the modified Nampt of the present invention has an activity higher than that of the wild type, preferably 1.2 times or more, more preferably 1.4 times or more.
  • activity means Nampt activity, that is, enzymatic activity that catalyzes the reaction that produces NMN from PRPP and NAM.
  • the activity measurement can be calculated by contacting the substrates PRPP and NAM with Nampt, converting to NMN, and then quantifying the NMN.
  • the reaction conditions are a substrate concentration of 10 to 100 mM, a reaction temperature of 10°C to 40°C, and a reaction time of 1 hour to 40 hours. It is stopped by adding methanol and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). After that, by HPLC (High Performance Liquid Chromatography), the generated NMN can be analyzed and quantified.
  • the modified Nampt of the present invention is obtained by introducing the above-described amino acid substitution into a known Nampt and selecting its enzymatic activity compared with the wild type.
  • Methods for introducing mutations include site-directed mutagenesis and genome editing using site-directed nucleases.
  • ZFN zinc finger nuclease
  • TALEN transcription activator-like effector nuclease
  • CRISPR/Cas9 genome editing using CRISPR/Cas9
  • modified Nampt The present invention also provides a gene (DNA) encoding the modified Nampt of the present invention.
  • the "modified Nampt-encoding DNA" of the present invention includes a DNA having a nucleotide sequence complementary to the modified Nampt-encoding DNA under stringent conditions, and having higher Nampt activity than the wild type. Also included are DNAs encoding proteins having
  • stringent conditions refers to the conditions for washing after hybridization at a salt concentration of 300 to 2000 mM and a temperature of 40 to 75°C, preferably a salt concentration of 600 to 900 mM and a temperature of 65°C. means.
  • conditions such as 2 ⁇ SSC and 50° C. can be mentioned.
  • a person skilled in the art would consider the conditions such as the salt concentration and temperature of the buffer, as well as other conditions such as the probe concentration, probe length, reaction time, etc. Conditions for obtaining can be set as appropriate.
  • DNAs that hybridize include DNAs or partial fragments thereof that have a sequence identity of at least 40%, preferably 60%, more preferably 90% or more, with the gene DNA of the present invention.
  • the present invention also provides an expression vector containing a gene (DNA) encoding the modified Nampt of the present invention.
  • the expression vector of the present invention may contain, in addition to the gene encoding the modified Nampt, genes (DNA) encoding other enzymes acting in the NMN production pathway.
  • genes (DNA) encoding other enzymes acting in the NMN production pathway.
  • Nampt it may contain all the genes encoding Prs and Ppk described below, an expression vector containing genes encoding Nampt and Prs, or an expression vector containing genes encoding Nampt and Ppk. There may be.
  • the expression vector used in the present invention can be produced by a known technique.
  • an expression cassette is constructed by inserting a transcription promoter upstream of a gene encoding a given enzyme and optionally a terminator downstream, and this cassette is inserted into an expression vector.
  • the transcription promoter and/or terminator of the vector are used without constructing the expression cassette, and a gene encoding a given enzyme is in between. should be inserted.
  • all of these genes may be inserted under the same promoter or under different promoters. good.
  • the type of promoter is not particularly limited as long as it enables appropriate expression in the host. PL promoter, PR promoter, tac promoter, and trc promoter.
  • a gene encoding each predetermined enzyme can be obtained, for example, by (i) preparing primers according to the nucleotide sequence information and amplifying the genome or the like as a template, or (ii) according to the amino acid sequence information of the enzyme, It can also be obtained by synthesizing DNA through organic synthesis.
  • the gene may be optimized according to the host cell of the transformant.
  • a method using restriction enzymes, a method using topoisomerase, etc. can be used.
  • Appropriate linkers may be added if necessary during the insertion.
  • ribosome binding sequences such as SD sequences and Kozak sequences are known as nucleotide sequences important for translation into amino acids, and these sequences may be inserted upstream of genes.
  • part of the amino acid sequence encoded by the gene may be replaced.
  • the vector preferably contains a factor (selection marker) for selecting the desired transformant.
  • Selection markers include drug resistance genes, auxotrophic complementary genes, assimilation-conferring genes, and the like, and can be selected according to the purpose and host.
  • Drug resistance genes used as selectable markers in E. coli include, for example, ampicillin resistance gene, kanamycin gene, dihydrofolate reductase gene, and neomycin resistance gene.
  • An appropriate expression vector selected from plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, artificial chromosomal DNA, etc. may be used according to the host.
  • E. coli when E. coli is used as a host, pTrc99A (GE Healthcare Bioscience), pACYC184 (Nippon Gene), pMW118 (Nippon Gene), pET series vectors (Novagen) and the like can be mentioned.
  • a vector having two or more insertion sites includes pETDuet-1 (Novagen). If necessary, modified versions of these vectors can also be used.
  • the expression vector can enhance the expression of a given enzyme by inserting an expression cassette in which an appropriate promoter, terminator, marker gene, etc. are linked to a gene encoding a given enzyme, into the genome of the host. .
  • a known method can be used to obtain a transformant in which the expression cassette is inserted into the genome. For example, when inserting an expression cassette into the genome by homologous recombination, transformation should be performed using a plasmid that has an expression cassette for a given enzyme and an arbitrary genomic region sequence and is incapable of replicating in the host. , a transformant into which the whole plasmid or the expression cassette has been inserted can be obtained.
  • a plasmid carrying a negative selection marker such as the SacB gene (encoding levansucrase) or a plasmid with a temperature-sensitive (ts) replication mechanism only the expression cassette can be placed on the genome by two rounds of homologous recombination. It is also possible to efficiently obtain transformed transformants.
  • a transformant in which the expression cassette is inserted at a random position on the genome can also be obtained by transforming using a DNA fragment consisting only of the expression cassette.
  • enzymes other than Nampt when using an enzyme (endogenous enzyme) that the host originally has on the genome, its expression can be enhanced by replacing the promoter of the enzyme gene on the genome with a strong one. can.
  • the promoter the same promoters used in the expression vectors described above can be used.
  • Transformant also provides a transformant containing the gene (DNA) encoding the modified Nampt of the present invention or the expression vector.
  • the transformant of the present invention may contain, in addition to DNA encoding modified Nampt, DNA encoding other enzymes acting in the NMN production pathway.
  • the transformant host is not particularly limited as long as it is a cell that can express a given enzyme by a protein expression system using an expression vector or the like.
  • bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes (e.g. Rhodococcus, Corynebacterium); yeasts (e.g. Saccharomyces, Candida ( Candida, genus Pichia); filamentous fungi; plant cells; animal cells such as insect cells and mammalian cells.
  • bacteria belonging to the genus Corynebacterium and bacteria belonging to the genus Rhodococcus are preferred, and E. coli is more preferred.
  • E. coli includes, for example, E. coli K12 and B strains, and their wild strain-derived derivatives, W3110 strain, JM109 strain, XL1-Blue strain (e.g., XL1-BlueMRF'), K802 strain, C600 strain, BL21. strain, BL21(DE3) strain, BN8 strain (WO2019/065876), and the like.
  • W3110 strain JM109 strain
  • XL1-Blue strain e.g., XL1-BlueMRF'
  • K802 strain C600 strain
  • BL21. strain BL21(DE3) strain
  • BN8 strain WO2019/065876
  • the method of introducing the expression vector into the host is not particularly limited as long as it is suitable for the host. Available methods include, for example, the electroporation method, the method using calcium ions, the spheroplast method, the lithium acetate method, the calcium phosphate method, and the lipofection method.
  • the transformant into which the expression vector has been introduced can be cultured by a method suitable for the cells (bacteria) used as the host to express each predetermined enzyme.
  • bacteria used as the host to express each predetermined enzyme.
  • a transformant expressing Nampt and Prs and a transformant expressing Ppk are prepared and combined.
  • each transformant may be cultured in the same medium, or may be cultured in separate media and then mixed.
  • Transformants dormant cells prepared from transformants, membrane-permeability-improved cells, inactivated cells, disrupted cells, cell-free extracts prepared from disrupted cells, and stabilization treatments
  • NMN production reaction is performed using a stabilized product (for details, see the second step below)
  • decomposition or side reactions of ribose and NAM as reactants (substrates) and NMN as products may occur and NMN may not be produced efficiently.
  • a host in which a gene that causes degradation or a side reaction is disrupted or deleted can be used.
  • a host in which genes encoding enzymes classified by any one or more of the EC numbers shown in (a) to (i) below are deleted or disrupted can be used.
  • Enzymes classified under EC 3.1.3.5 are 5'-nucleidases and include enzymes that catalyze the reaction that hydrolyzes NMN to produce nicotinamide riboside (NR) and phosphoric acid.
  • NR nicotinamide riboside
  • Escherichia coli ushA, surE, yrfG, yjjG and the like can be mentioned, and UshA or a homologue thereof is particularly preferred.
  • Enzymes classified under EC 3.5.1.19 are nicotinamidases and include enzymes involved in NAM degradation.
  • E. coli pncA can be mentioned.
  • the enzyme classified under EC 2.4.2.1 is a purine-nucleoside phosphorylase, an enzyme that catalyzes the reaction that phosphorylates NR to produce NAM and ribose-1-phosphate (R1P). is included.
  • deoD of E. coli or its homologous gene can be mentioned.
  • Enzymes classified under EC 3.5.1.42 are nicotinamide mononucleotide deaminase, including enzymes that hydrolyze NMN to catalyze the reaction that produces NaMN and ammonia.
  • E. coli pncC or its homologous gene can be mentioned.
  • Enzymes classified into (e) EC 1.17.2.1 and (f) EC 1.17.1.5 are nicotinate dehydrogenases, and include enzymes that can participate in the by-production of hydroxynicotinic acid from NAM.
  • Enzymes classified under EC 3.2.2.1 are purine nucleosidases, including enzymes that hydrolyze NR to catalyze the reaction to produce NAM and ribose. Examples include Pu--N or its homologues.
  • Enzymes classified under EC 3.2.2.3 are uridine nucleosidases, including enzymes that can hydrolyze NR to catalyze the reaction to produce NAM and ribose. Examples include URH1 or homologues thereof.
  • Enzymes classified under EC 3.2.2.14 are NMN nucleosidases, including enzymes that hydrolyze NMN to catalyze the reaction to produce NAM and R5P. In the present invention, it is preferred to disrupt or delete the gene encoding NMN nucleosidase.
  • Deletion or disruption is a gene encoding an enzyme classified into the EC number shown in (d) and any one or more of (a), (c), (g), (h), and (i). and a gene encoding an enzyme classified by the EC number shown in (d) and a gene that encodes an enzyme classified by the EC number shown in (a). More preferably, it is a gene encoding an enzyme.
  • the method of disrupting or deleting a gene is not particularly limited, and known gene disruption or deletion methods can be used. For example, a method using a linearized fragment for gene disruption or deletion, a method using a circular gene disruption or deletion plasmid that does not contain an origin of replication, a method using a group II intron, a Red-ET homologous recombination method, ZFN. , TALEN, methods using genome editing such as CRISPR / Cas9.
  • Modified Nampt can be produced by culturing the above transformant and collecting a protein having Nampt activity from the resulting culture.
  • the present invention also provides a method for producing such modified Nampt.
  • culture includes any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells.
  • the medium for culturing the transformant of the present invention contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host fungus, and is a medium capable of efficiently culturing the transformant. Either medium or synthetic medium may be used.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, galactose, fructose, sucrose, raffinose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium salts of inorganic or organic acids, such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds.
  • peptone, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, various amino acids, etc. may be used.
  • inorganic substances include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • an antifoaming agent may be added to prevent foaming during culture.
  • the medium may be supplemented with a compound that acts as an inducer of enzyme expression.
  • the culture it may be cultured under selective pressure to prevent the loss of the vector and the target gene. That is, if the selection marker is a drug resistance gene, the corresponding drug may be added to the medium, or if the selection marker is the auxotrophic complementary gene, the corresponding trophic factor may be removed from the medium.
  • the selection marker is a drug resistance gene
  • the corresponding drug may be added to the medium, or if the selection marker is the auxotrophic complementary gene, the corresponding trophic factor may be removed from the medium.
  • the selection marker is a gene conferring assimilation
  • the corresponding assimilation factor can be added as the sole factor as necessary. For example, when culturing Escherichia coli transformed with a vector containing an ampicillin-resistant gene, ampicillin may be added during the culture, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside
  • IAA indoleacetic acid
  • the culture conditions for the transformant are not particularly limited as long as they do not interfere with the productivity of the modified Nampt of interest and the growth of the host. 5-100 hours at 37°C.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
  • Examples of the culture method include solid culture, stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture. Especially when culturing a transformant of Rhodococcus, shaking culture or aeration and agitation culture (jar fermenter) is used. Culturing under aerobic conditions is preferred.
  • the modified Nampt of the present invention When cultured under the above culture conditions, the modified Nampt of the present invention accumulates in the culture at a high yield, that is, in at least one of the culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells. can do.
  • the desired modified Nampt can be collected by disrupting the fungus or cells.
  • Methods for disrupting bacterial bodies or cells include high-pressure treatment using a French press or homogenizer, ultrasonic treatment, grinding treatment using glass beads or the like, enzymatic treatment using lysozyme, cellulase or pectinase, freeze-thaw treatment, hypotonic solution treatment, Lysis induction treatment by phage, etc. can be used.
  • the bacteria or cell crushing residue (including the cell extract-insoluble fraction) can be removed if necessary.
  • Methods for removing the residue include, for example, centrifugation and filtration, and if necessary, a coagulant, a filter aid, or the like can be used to increase the residue removal efficiency.
  • the supernatant obtained after removing the residue is the cell extract soluble fraction and can be used as a crude modified Nampt solution.
  • modified Nampt when produced in a fungus or a cell, it is possible to collect the fungus or the cells themselves by centrifugation, membrane separation, etc., and use them uncrushed.
  • the culture solution is used as is, or the bacterial cells or cells are removed by centrifugation, filtration, or the like. Then, if necessary, the modified Nampt is collected from the culture by extraction by ammonium sulfate precipitation, etc., and if necessary, dialysis, various chromatography (gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.) are used. It can also be isolated and purified by
  • the production yield of Nampt obtained by culturing the transformant is measured by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in units such as per culture solution, per wet weight or dry weight of cells, per crude enzyme solution protein, and the like. electrophoresis), Nampt activity measurement, etc., but is not particularly limited. SDS-PAGE can be performed using methods known to those skilled in the art. For the Nampt activity, the activity value described above can be applied.
  • a cell-free protein synthesis system is a system in which a protein is synthesized in an artificial container such as a test tube using a cell extract.
  • the cell-free protein synthesis system used in the present invention also includes a cell-free transcription system that synthesizes RNA using DNA as a template.
  • the organism corresponding to the above host corresponds to the organism from which the cell extract below is derived.
  • the cell extract a eukaryotic cell-derived or prokaryotic cell-derived extract, such as a wheat germ extract or an extract of E. coli, can be used. These cell extracts may be concentrated or non-concentrated.
  • Cell extracts can be obtained, for example, by ultrafiltration, dialysis, polyethylene glycol (PEG) precipitation, and the like.
  • cell-free protein synthesis can also be performed using a commercially available kit. Examples of such kits include reagent kit PROTEIOTM (Toyobo), TNTTM System (Promega), synthesizer PG-MateTM (Toyobo), and RTS (Roche Diagnostics).
  • the modified Nampt obtained by cell-free protein synthesis as described above can be purified by appropriately selecting chromatography as described above.
  • NMN nicotinamide
  • PRPP phosphoribosylpyrophosphate
  • NAM nicotinamide
  • PRPP phosphoribosylpyrophosphate
  • NAM nicotinamide
  • NMN nicotinamide mononucleotide
  • a culture after culturing the transformant of the present invention, or a processed product of the culture can be used.
  • the treated material include cultured cells (transformants) encapsulated in gel such as acrylamide, treated with glutaraldehyde, and supported on inorganic carriers such as resin, alumina, silica, zeolite and diatomaceous earth. etc.
  • the term “contact” means allowing modified Nampt, PRPP and NAM to exist in the same reaction system or culture system, for example, mixing separated and purified modified Nampt with PRPP and NAM; adding PRPP and NAM to a culture vessel of cells (transformant) expressing the type Nampt gene, culturing the cells in the presence of PRPP and NAM, and mixing the extract of the cells with PRPP and NAM etc. is included.
  • Phosphoribosyl pyrophosphate can be produced, for example, from ribose-5-phosphate in the presence of phosphoribosyl pyrophosphate synthase.
  • Examples of phosphoribosyl pyrophosphate synthase include those derived from humans (Homo sapiens) (NP_002755), those derived from Bacillus subtilis (BAA05286), those derived from Bacillus caldolyticus (CAA58682), those derived from Arabidopsis thaliana ( Q680A5) and Methanocaldococcus jannaschii (Q58761).
  • a mutant phosphoribosyl pyrophosphate synthase can also be used if desired.
  • mutant phosphoribosyl pyrophosphate synthases include, for example, human-derived Prs mutants such as Asp51His (substitution of ASP at position 51 with His, hereinafter the same), Asn113Ser, Leu128Ile, Aspl82His, Ala189Val, and Hisl92Gln; and corresponding variants of Prs derived from other organisms, such as variants of Prs derived from Bacillus subtilis, such as Asn120Ser (corresponding to Asn113Ser above) and Leu135Ile (corresponding to Leu128Ile above).
  • human-derived Prs mutants such as Asp51His (substitution of ASP at position 51 with His, hereinafter the same), Asn113Ser, Leu128Ile, Aspl82His, Ala189Val, and Hisl92Gln
  • variants of Prs derived from other organisms such as variants of Prs derived from Bacillus subtilis, such as Asn120Ser
  • Ribose-5-phosphate can be produced from ribose in the presence of ribokinase.
  • ribokinases natural ribokinases derived from various organisms or mutant ribokinases prepared by modifying their amino acid sequences can be used, for example, those derived from humans (Homo sapiens) (NP_002755). , derived from yeast (Saccharomyces cerevisiae) (P25332), derived from Bacillus subtilis (P36945), derived from Escherichia coli (AAA51476), derived from Haemophilus influenzae (P44331).
  • the method for producing NMN of the present invention may be carried out, for example, according to the method described in WO2020/129997. That is, a transformant in which the expression of the three enzymes Nampt, Prs and Ppk was enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution expressing the three enzymes, or a processed product thereof, R5P, NAM, ATP, and polyphosphate and contacting with.
  • Such a method for producing NMN typically involves sequentially performing the following steps (1) to (3) (herein referred to as the first step, the second step and the third step, respectively). be implemented. These steps may be performed by the same person or by different people. Moreover, these steps may be performed continuously, or may be performed stepwise with a predetermined period between each step.
  • a transformant containing a gene encoding each of the enzymes Nampt, Prs, Rbk and Ppk is produced and cultured, or a protein synthesis reaction is performed in a cell-free protein synthesis reaction solution containing a gene encoding each of the enzymes.
  • first step (2) If necessary, a step of preparing a processed product from the transformant or cell-free protein synthesis reaction solution that has undergone the first step (second step); and (3) transformation that has undergone the first and second steps.
  • second step a step of preparing a processed product from the transformant or cell-free protein synthesis reaction solution that has undergone the first step
  • third step A step of contacting the body, the cell-free protein synthesis reaction solution, or a processed product thereof with each substrate compound.
  • the method for manufacturing NMN of the present invention will be described in further detail along an embodiment in which the first step, second step and third step are performed.
  • the method for manufacturing NMN of the present invention can also be performed in an embodiment in which the first step, second step, and third step specifically described below are appropriately modified without departing from the spirit of the present invention. is.
  • Nampt is used in this embodiment, four enzymes, Nampt, Prs, Ppk, and, if necessary, Rbk, are used.
  • Nampt, Prs, Ppk and Rbk are all known enzymes, and their amino acid sequences and base sequences of genes encoding them are readily available to those skilled in the art.
  • the four predetermined enzymes may be naturally occurring enzymes, or may be prepared by modifying the amino acid sequences of naturally occurring enzymes, as long as they can catalyze their respective desired reactions. may be a mutant enzyme with improved expression level or enzyme activity.
  • various tags proteins or peptides
  • tags include His tag (histidine tag), Strep (II)-tag, GST tag (glutathione-S-transferase tag), MBP tag (maltose binding protein tag), GFP tag (green fluorescent protein tag), SUMO Tag (Small Ubiquitin-related (like) Modifier tag) FLAG tag, HA tag, myc tag and the like. Additionally, the four enzymes may be expressed as fusion proteins with each other.
  • Prs examples include those derived from humans (Homo sapiens) (NP_002755), those derived from Bacillus subtilis (BAA05286), those derived from Bacillus caldolyticus (CAA58682), those derived from Arabidopsis thaliana (Q680A5), Methanocaldococcus jannaschii (Q58761).
  • NP_002755 those derived from humans
  • BAA05286 Bacillus subtilis
  • CAA58682 Bacillus caldolyticus
  • Q680A5 derived from Arabidopsis thaliana
  • Methanocaldococcus jannaschii Q58761
  • mutant Prs include mutants of human-derived Prs, such as Asp51His (substitution of ASP at position 51 with His, hereinafter the same), Asn113Ser, Leu128Ile, Aspl82His, Ala189Val, and Hisl92Gln, and their corresponding variants.
  • Mutant types of Prs derived from other organisms, such as Bacillus subtilis-derived Prs include mutant types such as Asn120Ser (corresponding to Asn113Ser above) and Leu135Ile (corresponding to Leu128Ile above).
  • Rbk natural Rbk derived from various organisms, or mutant Rbk prepared by modifying its amino acid sequence can be used. Saccharomyces cerevisiae (P25332), Bacillus subtilis (P36945), Escherichia coli (AAA51476), and Haemophilus influenzae (P44331).
  • Ppk (EC number: 2.7.4.1) in the present invention is for the reaction (ATP regeneration reaction) to regenerate ATP from ADP generated in the first reaction or AMP generated in the second reaction and polyphosphoric acid. Enzyme used.
  • Ppks can be classified into two families, the polyphosphate kinase type 1 family (Ppk1) and the polyphosphate kinase type 2 family (Ppk2), depending on differences in amino acid sequence and kinetics.
  • Ppk2 has a higher activity to regenerate ATP using polyphosphate as a substrate than Ppk1. Therefore, it is preferable to use Ppk2 as Ppk in the present invention.
  • Ppk2 can be further divided into three subfamilies, class 1, class 2 and class 3.
  • Class 1 and class 2 Ppk2 catalyze the phosphorylation of ADP to ATP and the phosphorylation of AMP to ADP, respectively.
  • class 3 Ppk2 can catalyze both the phosphorylation of AMP and the phosphorylation of ADP, and thus can generate ATP from AMP by itself.
  • Ppk in the present invention a combination of Ppk2 class 1 for regenerating ATP from ADP and Ppk2 class 2 for regenerating ADP from AMP can be used.
  • adenylate kinase which catalyzes the reaction AMP + ATP ⁇ 2ADP
  • Ppk2 class 1 or Ppk1 for regenerating ATP from ADP is used as Ppk in the present invention.
  • Ppk2 class 3 because of its high efficiency in that both reactions of regeneration of ATP from ADP and regeneration of ATP from AMP can be catalyzed alone.
  • Ppk2 class 3 examples include those derived from Deinococcus radiodurans (NP_293858), those derived from Paenarthrobacter aurescens (ABM08865), those derived from Meiothermus rube (ADD29239), those derived from Deinococcus geothermalis (WP_011531362), those derived from Thermosynechococcus elongatus ( NP_682498).
  • Ppk2 class 1 includes, for example, those derived from Rhodobacter sphaeroides (CS253628), those derived from Sinorhizobium meliloti (NP_384613), those derived from Pseudomonas aeruginosa PA0141 (NP_248831), those derived from Pseudomonas aeruginosa PA2428 (NP_251118), and those derived from Francisella tularensis. (AJI69883).
  • Ppk2 class 2 includes, for example, PA3455 (NP_252145) derived from Pseudomonas aeruginosa.
  • examples of adenylate kinase include those derived from Bacillus cereus (AAP07232).
  • the second step is, if necessary, a step of preparing a processed product from the transformant or cell-free protein synthesis reaction mixture that has passed through the first step.
  • processed transformants include resting cells, membrane-permeability-enhancing cells, inactivated cells, and disrupted cells prepared from transformants.
  • cell-free extracts and purified enzymes prepared from disrupted cells are also included in the processed products of the present invention.
  • the processed product of the cell-free protein synthesis reaction solution include purified enzymes prepared from the cell-free protein synthesis reaction solution.
  • the processed product of the present invention also includes a transformant, a cell-free protein synthesis reaction solution, and a stabilized product obtained by subjecting these processed products to a stabilization treatment.
  • Resting cells can be prepared using known methods.
  • a resting cell means a cell whose growth has been substantially stopped. Specifically, after recovering the transformant grown by culture from the medium, the transformant is suspended in a buffer or the like that does not contain a carbon source that can be easily used, or the recovered transformant is frozen. or by drying and pulverizing. Any method may be used to recover the transformant from the medium, and examples thereof include a method using centrifugation, a method using membrane filtration, and the like. Centrifugation is not particularly limited as long as it can supply centrifugal force for sedimentation of the transformant, and a cylinder type, separation plate type, or the like can be used. The centrifugal force can be, for example, about 500G to 20,000G.
  • Membrane filtration may be performed using either a microfiltration (MF) membrane or an ultrafiltration (UF) membrane as long as the transformant can be recovered from the medium.
  • MF microfiltration
  • UF ultrafiltration
  • any buffer may be used as long as the growth of the transformant is substantially stopped and the function of each predetermined enzyme is maintained.
  • solution acrylic acid buffer, Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane)-hydrochloric acid buffer, HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl) ethanesulfonic acid) and other good buffers (Good 's buffers) or the like can be used.
  • the transformant When freezing the transformant, it may be frozen after most of the water has been removed by the above-mentioned centrifugation or the like, or after being suspended in an appropriate buffer.
  • the freezing temperature varies depending on the components of the buffer in which the transformant is suspended, but may be any temperature at which the transformant is substantially frozen, for example, in the range of -210°C to 0°C. You can do it with
  • any method may be used as long as the drying method substantially stops the growth of the transformant and maintains the function of each predetermined enzyme.
  • a drying method, a spray drying method, and the like can be mentioned.
  • the preparation of membrane permeability-enhancing bacterial cells can be performed using a known method.
  • treating the transformant with an organic solvent or surfactant facilitates passage of substrates and products through the cell membrane and cell wall of the transformant.
  • the type of organic solvent and surfactant to be used is not particularly limited as long as it improves membrane permeability and maintains the function of each predetermined enzyme. and methanol, and if it is a surfactant, Triton-X 100 or benzethonium chloride can be used.
  • Preparation of inactivated cells can be carried out using known methods. For example, it can be carried out by chemical treatment or heat treatment.
  • cationic surfactants such as benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride, methylstearoyl chloride, and cetyltrimethylammonium bromide
  • zwitterionic surfactants such as alkyldiaminoethylglycine hydrochloride
  • alcohols such as ethanol, thiols such as 2-mercaptoethanol, amines such as ethylenediamine, and amino acids such as cysteine, ornithine and citrulline.
  • the heat treatment may be performed at a temperature and for a time at which the target enzyme is not deactivated.
  • Preparation of disrupted cells can be carried out using known methods. For example, ultrasonic treatment, high-pressure treatment with a French press or homogenizer, grinding treatment with a bead mill, collision treatment with an impact crusher, enzymatic treatment using lysozyme, cellulase, pectinase, etc., freeze-thaw treatment, hypotonic solution treatment, lysis with phage Induction treatment and the like can be mentioned, and any of these methods can be used alone or in combination as necessary.
  • the beads used When performing grinding treatment with a bead mill, the beads used have a density of 2.5 to 6.0 g/cm 3 and a size of 0.1 to 1.0 mm, and are usually ground by filling about 80 to 85%. can be performed, and both a batch system and a continuous system can be adopted as the operation system.
  • the treatment pressure is not particularly limited as long as the target protein recovery rate from the cells is sufficiently high.
  • Crushing can be performed at a pressure of
  • multi-stage processing can be achieved by arranging equipment in series or using multi-stage equipment to improve crushing and operating efficiency. Normally, the temperature rises by 2 to 3° C. per 10 MPa of treatment pressure, so cooling treatment is preferably performed as necessary.
  • the cell slurry is previously frozen into fine particles (eg, 50 ⁇ m or less) by rapid spray freezing (freezing rate: several thousand ° C. per minute, for example), etc., and this is frozen at a high speed (eg, about 300 m / s ), the cells can be efficiently crushed by colliding with the collision plate with the carrier gas.
  • rapid spray freezing freezing rate: several thousand ° C. per minute, for example
  • a cell-free extract can be prepared by removing the crushed residue (insoluble fraction containing cell membranes, cell walls, etc.) from the crushed cells.
  • the crushing residue can be removed by a known method, for example, centrifugation, membrane filtration, filter cloth filtration, or the like can be used.
  • the centrifugation operation can be performed as described above, but if the crushed residue of the transformant is fine and difficult to sediment easily, a flocculant or the like is used as necessary to increase the residue sedimentation efficiency.
  • Membrane filtration can also be performed as described above, and ultrafiltration (UF) membranes can be used particularly when the disrupted residue of the transformant is fine.
  • UF ultrafiltration
  • filter aids include diatomaceous earth, cellulose powder, and activated carbon.
  • flocculants include cationic flocculants, anionic flocculants, amphoteric flocculants, and nonionic flocculants.
  • a cell-free extract containing each of the predetermined enzymes can be prepared by recovering the supernatant free of bacterial cells by any of the operations described above and making it acellular (cell-free).
  • Purified enzymes can be prepared by general biochemical methods, such as ammonium sulfate precipitation, various types of chromatography (e.g., gel filtration chromatography (Sephadex column, etc.), ion exchange chromatography (DEAE-Toyopearl, etc.), affinity chromatography (TALON Metal Affinity Resin, etc.), hydrophobic chromatography (butyl Toyopearl, etc.), anion chromatography (MonoQ column, etc.), SDS polyacrylamide gel electrophoresis, etc. can be used alone or in combination as appropriate.
  • chromatography e.g., gel filtration chromatography (Sephadex column, etc.), ion exchange chromatography (DEAE-Toyopearl, etc.), affinity chromatography (TALON Metal Affinity Resin, etc.), hydrophobic chromatography (butyl Toyopearl, etc.), anion chromatography (MonoQ column, etc.), SDS poly
  • the stabilizing treatment may be any treatment that improves the stability of each predetermined enzyme against environmental factors (temperature, pH, concentration of chemical substances, etc.) or the stability during storage compared to the untreated state.
  • a gel such as acrylamide
  • aldehydes such as glutaraldehyde (CLEA: including cross-linked enzyme aggregate)
  • support treatment on an inorganic carrier alumina, silica, zeolite, diatomaceous earth, etc.
  • the substrates and products used in the present invention have relatively high polarity, and cell membranes and cell walls may be rate-limiting for mass transfer. Therefore, in the present invention, it is particularly preferable to use lysed cells, cell-free extracts, purified enzymes, or stabilized products thereof from the viewpoint of substrate and product permeability.
  • the above transformant, cell-free protein synthesis reaction solution, or processed product thereof can be stored under any conditions as long as the enzymatic activity is maintained. If desired, these solutions may be frozen under appropriate conditions (eg, -80°C to -20°C, 1 day to 1 year) and stored until use (when performing the third step).
  • each transformant when transformants separately containing genes encoding each of the predetermined enzymes are combined, for example, a transformant with enhanced expression of Nampt and Prs and a transformant with enhanced expression of Ppk are combined, (i) each transformant may be treated separately and then the treated products may be mixed, or (ii) the transformants may be mixed After that, each processing may be performed collectively.
  • the third step is the step of contacting the transformant or the cell-free protein synthesis reaction solution that has undergone the first step, or, if necessary, the processed product thereof that has undergone the second step, with a substrate that serves as various raw materials for the enzymatic reaction. is.
  • the second reaction by Prs and the third reaction by Nampt are coupled with the ATP regeneration reaction by Ppk.
  • the substrate is phosphorylated using ATP as a phosphate source, and in the third reaction by Nampt, ATP is consumed because it is autophosphorylated by the ATP hydrolysis activity of Nampt itself. be.
  • the reactions can be efficiently advanced while compensating for the consumed ATP.
  • phosphoribosyl pyrophosphate which is the product of the second reaction by Prs, is a relatively unstable compound
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate
  • the ATP regeneration reaction regenerates ATP from ADP and/or AMP, so ATP is not depleted. It is necessary to add in At this time, ADP or AMP may be added to the reaction solvent instead of ATP, if necessary.
  • the second and third reactions may be combined with the first reaction by Rbk coupled with the ATP regeneration reaction by Ppk.
  • the first reaction by Rbk may be performed first, and then the second reaction by Prs and the third reaction by Nampt may be performed using the reaction solution as a raw material, or the first reaction by Rbk and the second reaction by Prs
  • the reaction and the tertiary reaction with Nampt may be performed in the same reaction system.
  • the second reaction with Prs and the third reaction with Nampt are transformants in which expression of the three enzymes Nampt, Prs and Ppk are enhanced, cell-free protein synthesis reaction solutions in which the three enzymes are expressed, or processed products thereof. with R5P, NAM, ATP, and polyphosphate.
  • a transformant in which the expression of the two enzymes Rbk and Ppk was enhanced a cell-free protein synthesis reaction solution in which the two enzymes were expressed, or a processed product thereof, was treated with ribose, ATP, and polyphosphate. It is carried out by contacting with an acid.
  • the raw materials used in the third step can be purchased from general suppliers, or can be synthesized by self-reaction.
  • R5P can be a commercially available product. It is preferable to use a cell-free protein synthesis reaction solution or a product synthesized by contacting a treated product thereof with ribose and polyphosphate.
  • Polyphosphoric acid one of the above raw materials, is known to have various chain lengths.
  • the polyphosphoric acid used in the present invention may have any chain length as long as the ATP regeneration reaction can be performed efficiently. About 100 is preferable, and about 3 to 30 is more preferable.
  • a compound other than the above raw materials is used, a transformant in which the expression of each predetermined enzyme is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which each predetermined enzyme is expressed, or a treatment thereof It may be brought into contact with a substance, or contained in a reaction solvent (within a production system).
  • a reaction solvent within a production system.
  • metal ions such as magnesium ions
  • a buffer component for each enzyme to exert its function.
  • the reaction is preferably carried out under conditions in which the transformant does not substantially proliferate.
  • the substrates and products in this reaction are not used for the growth of the transformant or degraded, and the target product can be produced at a high yield. I can expect it.
  • the conditions under which transformants do not substantially grow may be any conditions as long as the number of transformants in the reaction system does not substantially increase.
  • the reaction may be carried out in a solution that does not contain a carbon source (such as glucose) that is readily available to transformants.
  • concentrations of the above substances in the reaction solvent (within the manufacturing system) are as follows.
  • the concentration of Nampt is, for example, 1 ⁇ g/L to 5 g/L.
  • the concentration of Prs is, for example, 1 ⁇ g/L to 1 g/L.
  • the concentration of Rbk is, for example, 1 ⁇ g/L to 1 g/L.
  • the concentration of Ppk is, for example, 1 ⁇ g/L to 5 g/L.
  • the concentration of R5P is, for example, 1 ⁇ g/L to 100 g/L.
  • the concentration of ribose is, for example, 1 ⁇ g/L to 100 g/L.
  • the concentration of NAM is, for example, 1 ⁇ g/L to 500 g/L.
  • the concentration of ATP is, for example, 1 ⁇ g/L to 100 g/L.
  • the concentration of polyphosphoric acid is, for example, 1 ⁇ g/L to 200 g/L.
  • the concentration of each raw material in the reaction solvent can be adjusted within the above range by adjusting the amount of these raw materials added to the reaction solvent.
  • the reaction solvent may be added in a predetermined amount at once at the beginning of the third step, or at an appropriate stage at the beginning and/or in the middle of the third step, and sequentially added in predetermined amounts. You may do so.
  • the conditions for advancing the enzymatic reaction can also be adjusted as appropriate.
  • the reaction temperature is preferably adjusted within a range in which the catalytic efficiency of each enzyme is optimized.
  • the reaction time can be set until the production amount of NMN, which is the target compound, reaches a predetermined amount.
  • the produced NMN can be recovered from the production system, and can be appropriately concentrated and purified according to conventional methods. Any method can be used for recovery and purification as long as it can improve the purity of NMN and efficiently recover NMN. mentioned.
  • the NMN synthesis reaction when the reaction is performed using bacterial cells, the bacterial cells can be removed by means of centrifugation, membrane filtration, or the like. Alternatively, if the reaction is performed using cell-free extracts or purified enzymes, proteins, etc. are removed by filtration with an ultrafiltration membrane, or by centrifugation after precipitation by adding perchloric acid, etc. can do.
  • the pH is returned to weak acidity with potassium hydroxide or the like, and the resulting precipitate of potassium perchlorate is removed again by centrifugation.
  • washing treatment by activated charcoal adsorption can be carried out, if necessary.
  • An aqueous solution containing NMN is contacted with activated carbon to adsorb NMN.
  • Certain impurities can be removed by filtering the NMN-adsorbed activated carbon using a filter paper or the like and then washing it with a solvent such as isoamyl alcohol. Further purification can then be achieved by treatment with an anion exchange resin.
  • a solution containing NMN can be passed through an anion exchange resin such as Dowex and the adsorbed NMN can be eluted with water. Furthermore, NMN can be obtained as a precipitate by acidifying the pH of the resulting NMN aqueous solution and adding a large amount of acetone. Purified NMN can be obtained by drying the precipitate.
  • an anion exchange resin such as Dowex
  • NMN can be obtained as a precipitate by acidifying the pH of the resulting NMN aqueous solution and adding a large amount of acetone. Purified NMN can be obtained by drying the precipitate.
  • the present invention can be carried out so that the total number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system is 0.5 equivalent or less of the number of moles of NMN produced.
  • any method can be used as long as the amount of ATP or the like added for NMN production can be reduced as a result, but for example, the following means alone or It can be implemented by appropriately combining them.
  • Conjugation of ATP regeneration system (2) Coexistence of PPase (3) Utilization of bacteria-derived Nampt (4) Utilization of host in which unnecessary genes are disrupted or deleted (5) Appropriate substrate concentration
  • the method for producing NMN of the present invention comprises transformants in which Nampt expression is enhanced and cell-free protein synthesis reactions in which the enzyme is expressed in the presence of PPase.
  • a step of contacting the liquids, or their processed products, with NAM and PRPP may be included.
  • the steps of this embodiment are carried out by sequentially performing the first, second and third steps in the same manner as in the embodiment of 6.2. That is, in the first step and the second step, at least a transformant in which Nampt expression is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution in which the enzyme is expressed, or a processed product thereof is prepared, and PPase expression is prepared.
  • a cell-free protein synthesis reaction solution in which the enzyme is expressed such as an enhanced transformant or a microorganism expressing PPase as an endogenous enzyme, although the expression is not particularly enhanced, or a processed product thereof is prepared.
  • the transformant, cell-free protein synthesis reaction solution, or processed product thereof that has undergone the first and second steps should be brought into contact with at least NAM and PRPP. is.
  • PPase (EC number: 3.6.1.1) is an enzyme that hydrolyzes pyrophosphate into two molecules of phosphate.
  • the third reaction can proceed extremely efficiently by performing the third reaction in the presence of PPase.
  • Nampt In the third reaction by Nampt, pyrophosphate is by-produced along with NMN. From the standpoint of general enzymatic reactions, it is expected that the addition of PPase to the third reaction system will decompose pyrophosphate, which is a by-product, into phosphoric acid, promoting the reaction toward NMN production. But for Nampt, it's not always trivial. This is because if pyrophosphate is decomposed, the Nampt reaction may not proceed continuously. Nampt is known to hydrolyze ATP and be activated by autophosphorylation.
  • Dephosphorylation of autophosphorylated Nampt is required for each reaction to continue the third reaction by Nampt, and pyrophosphate is considered to be a trigger substance for the dephosphorylation (Biochemistry 47 , 11086-11096 (2008)). Therefore, if pyrophosphate is removed by PPase, dephosphorylation of Nampt may not occur and the reaction may not continue. However, in the second invention group, the third reaction can be remarkably promoted by carrying out the third reaction in the presence of PPase.
  • PPase examples include those derived from yeast (P00817), those derived from Escherichia coli (NP_418647), those derived from Bacillus subtilis (P37487), those derived from Thermus thermophilus (P38576), those derived from Streptococcus gordonii (P95765), and those derived from Streptococcus. mutans (O68579) and the like.
  • PPase may be in any form as long as it can be added to the third reaction system, and may be prepared by any method. Specifically, first, as in the first step in the first invention group, a transformant containing a gene encoding PPase is prepared and cultured, or a cell-free protein containing a gene encoding each of the enzymes is prepared and cultured. A protein synthesis reaction is performed in the synthesis reaction solution to express each of the enzymes. In addition, since PPase is expressed in a certain amount as an enzyme necessary for survival in normal microorganisms, it is possible to culture microorganisms whose expression is not particularly enhanced and use it as it is.
  • a processed product can be prepared from the transformant that has undergone the first step, the microorganism or the like whose expression is not particularly enhanced, or the reaction solution for cell-free protein synthesis.
  • a commercially available PPase-purified enzyme can be used as one aspect of the processed product.
  • Commercially available PPase-purified enzymes include yeast-derived PPase-purified enzyme (product number 10108987001) from Sigma-Aldrich.
  • a transformant in which expression of Nampt is enhanced, a cell-free protein synthesis reaction solution expressing the enzyme, or a processed product thereof is brought into contact with NAM and PRPP.
  • the method for manufacturing NMN according to the second invention group can be carried out.
  • the third reaction can proceed very efficiently, and NMN can be produced efficiently.
  • the third reaction according to the second invention group can be carried out alone, but it can be carried out in the same reaction system in combination with one or more of the first reaction, the second reaction and the ATP regeneration reaction. can also In other words, by making the embodiment of the third reaction in the first invention group of the present invention the third reaction defined in the second invention group of the present invention, the first invention group and the second invention It is also possible to implement a group-integrated NMN manufacturing method.
  • the reaction is preferably carried out under conditions in which the transformant does not substantially proliferate.
  • the substrates and products in this reaction are not used for the growth of the transformant or degraded, and the target product can be produced at a high yield. I can expect it.
  • the conditions under which transformants do not substantially grow may be any conditions as long as the number of transformants in the reaction system does not substantially increase.
  • the reaction may be carried out in a solution that does not contain a carbon source (such as glucose) that is readily available to transformants.
  • the processed product is a purified enzyme.
  • the purified enzyme By using the purified enzyme, decomposition of the reactant (substrate) or product or side reaction can be suppressed, so that the effect of promoting the third reaction according to the present invention can be more enjoyed.
  • the method for producing NMN of the present invention comprises (d) a gene encoding an enzyme classified into the EC number shown in EC 3.5.1.42 and the following (a) (c) (g) (h) a gene encoding an enzyme classified into one or more EC numbers shown in (i) is disrupted or deleted, and the expression of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is enhanced; It may include a step of contacting the present transformants or their processed products with at least nicotinamide (NAM).
  • EC 2.4.2.1 EC 3.2.2.1
  • EC 3.2.2.3 EC 3.2.2.14
  • the steps of this embodiment are carried out by sequentially performing the first, second and third steps in the same manner as in the embodiment of 6.2. That is, in the first step and the second step, a transformant in which a gene encoding an enzyme classified by various EC numbers is disrupted or deleted and expression of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is enhanced Or a step for preparing a processed product thereof, and in the third step, the transformants that have undergone such first and second steps or a processed product thereof may be contacted with at least NAM. be.
  • Nampt nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • the total number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system for the production of NMN is reduced to 0.5 of the number of moles of NMN produced. It may be the equivalent or less.
  • ATP is not essential for the reaction itself catalyzed by Nampt.
  • Nampt has ATP hydrolysis activity, and the hydrolysis of ATP leads to autophosphorylation of Nampt, which changes the enzymatic parameters and chemical equilibrium in favor of NMN production. Therefore, when a sufficient amount of ATP is present in the third reaction system, substantially 1 mol or more of ATP is used per 1 mol of PRPP as NMN is produced from PRPP. .
  • a total of 2 mol or more of ATP is generated per 1 mol of NMN produced in the first reaction, the second reaction and the reaction using ribose as a raw material.
  • a total of 3 mol or more of ATP is used per 1 mol of NMN produced.
  • the total number of moles of ATP, ADP, and AMP added to the reaction system for producing NMN should be 0.5 equivalent or less of the number of moles of NMN produced. preferable.
  • the means shown below are used singly or in combination to make the total number of moles of ATP, ADP and AMP equal to or less than 0.5 equivalents of the number of moles of NMN to be produced.
  • Conjugation of ATP regeneration system A system capable of regenerating by-produced ADP or AMP to ATP is coupled with an NMN generation reaction system including at least the second reaction and the third reaction for NMN production. can reduce the total number of moles of ATP, ADP and AMP added to the reaction system.
  • the ATP regeneration system may be any system as long as it can regenerate ATP from AMP and ADP.
  • the NMN production reaction in which the ATP regeneration system using polyphosphoric acid and Ppk is coupled can be carried out as described in the third step in the first invention group.
  • Nampt derived from bacteria By using Nampt derived from bacteria as the enzyme Nampt that catalyzes the third reaction, the production of NMN proceeds efficiently, and as a result, it is added to the reaction system for NMN production. The total number of moles of ATP, ADP and AMP can be reduced. As Nampt derived from bacteria, those described in the first step in the first invention group can be used.
  • a host in which is disrupted or deleted can be used.
  • a host in which any one or more of the genes described in the first step in the first invention group are disrupted or deleted can be used.
  • a host with the gene disruption or deletion described in 6.4 can be used.
  • NMN can be efficiently produced by adding an appropriate amount of ATP to the reaction system.
  • the number of moles of ATP added to the reaction system is preferably 1 equivalent or less, more preferably 0.5 equivalent or less, even more preferably 0.1 equivalent or less of the number of moles of NMN to be produced.
  • Nampt from Haemophilus ducreyi (AAR87771)
  • Prs Bacillus subtilis-derived Leu135Ile mutant (BsPrsL135I)
  • Ppk from Deinococcus radiodurans (NP_293858)
  • Rbk from Saccharomyces cerevisiae (P25332)
  • PPase derived from Escherichia coli (NP_418647)
  • the mutation-introducing PCR reaction was performed under the reaction solution composition shown in Table 3 and the reaction conditions shown in Table 4.
  • the PCR product was purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) according to the attached protocol.
  • E. coli JM109 (Takara Bio) was transformed with a reaction mixture obtained by digesting the generated PCR product with DpnI (New England Biolabs). After collecting the colonies that appeared, plasmid extraction was performed, and the base sequence was confirmed using primers T7-PP (SEQ ID NO: 35) and T7-TP (SEQ ID NO: 36). Each plasmid into which the library was correctly introduced was used as each Nampt library plasmid described in Table 2.
  • E. coli BN8 strain competent cells (WO2019/065876) were thawed on ice, and each plasmid DNA solution prepared in (1) was mixed. and left on ice for 10 minutes. After a heat shock was applied at 42°C for 20 seconds, the plate was ice-cooled again and SOC medium was added. After culturing with shaking at 37°C for 1 hour, the mixture was plated on an LB agar medium (containing 50 mg/L of kanamycin sulfate) and statically cultured overnight at 37°C. The resulting colonies were used as recombinants with enhanced expression of each enzyme.
  • a single colony was transferred to a 96-well deep well plate containing 200 uL of LB medium (containing 50 mg/L of kanamycin sulfate), and cultured overnight at 37°C with shaking.
  • 70 uL of preculture was used to inoculate 630 uL of main culture (LB medium, containing 50 mg/L kanamycin sulfate and IPTG 0.5 mM final concentration), 16°C, 1250 rpm, 24 hours or 25°C, 1250 rpm, 18 hours. cultured.
  • the cultured E. coli was collected by centrifugation (5000 rpm, 4°C, 15 minutes) and the supernatant was removed.
  • the recovered pellet was suspended in 200 uL of lysis buffer (100 mM Kpi pH8.5, 1 mg/ml Lysozyme, 0.5 mg/ml Polymyxin B, 0.05 mg/ml DNase) and shaken at room temperature at 900 rpm for 20 minutes. Insoluble matter was removed by centrifugation (4900 rpm, 10 min, 4° C.), and the supernatant was used as a cell-free extract for the reaction.
  • lysis buffer 100 mM Kpi pH8.5, 1 mg/ml Lysozyme, 0.5 mg/ml Polymyxin B, 0.05 mg/ml DNase
  • the resulting colonies were used as recombinants with enhanced expression of each enzyme.
  • a single colony was transferred to a culture tube containing 2 mL of LB medium (containing 50 mg/L of kanamycin sulfate) and cultured with shaking overnight at 37°C.
  • 100 mL of main culture LB medium containing 50 mg/L of kanamycin sulfate
  • OD600 reached 0.8
  • IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM and cultured at 25°C, 1250 rpm for 18 hours.
  • the cultured E E.
  • coli was collected by centrifugation (8000 rpm, 4°C, 15 minutes) and the supernatant was removed.
  • the recovered pellet was suspended in 10 mL of lysis buffer (100 mM Kpi pH8.5, 1 mg/ml Lysozyme, 0.5 mg/ml Polymyxin B, 0.05 mg/ml DNase) and shaken at room temperature at 900 rpm for 20 minutes.
  • Insoluble matter was removed by centrifugation (8000 rpm, 10 min, 4° C.), and the supernatant was used as a cell-free extract for the reaction.
  • NMN Synthesis Reaction Using the cell-free extracts prepared in (2) and (3), NMN synthesis reaction was carried out. The volume of the reaction solution was 100 ⁇ L, each reaction solution was prepared with the composition shown below, and allowed to stand at 37°C for reaction.
  • the NMN conversion rate (%) was calculated from the ratio of NAM and NMN, and for those whose NMN conversion rate was higher than that of the wild type, the base sequence at the mutation site was determined.
  • Nampt is the rate-limiting enzyme, and its raw material cost is high, which has been a problem. Since the improved Nampt of the present invention is more active than the wild type as described above, it is possible to reduce the amount used. This will reduce Nampt raw material costs by 30 to 40%.
  • Example 2 ⁇ Combination of excellent Nampt mutations> Combinations of the elite mutations of Example 1 were performed.
  • Example 3 ⁇ Introduction of excellent mutations into Nampt derived from other species>
  • the following enzymes were used as predetermined enzymes.
  • Nampt derived from Meiothermus ruber (A0A0S7ALY5)
  • Nampt derived from Sphingopyxis sp. C-1 (A0A0M9TZ33)
  • Each resulting plasmid was named the "expression plasmid" for each enzyme.
  • mutations were introduced into the designated amino acid residues.
  • Table 8 shows the name of the mutation-introducing primer, the sequence number indicating the nucleotide sequence thereof, and the name of the Nampt mutant.
  • the present invention is useful in industrial production of nicotinamide mononucleotide.
  • SEQ ID NO: 1 motif sequence SEQ ID NO: 2: motif sequence SEQ ID NO: 25: primer (Nampt_S247X-F) SEQ ID NO: 26: Primer (Nampt_S247X-R) SEQ ID NO: 27: Primer (Nampt_E248X-F) SEQ ID NO: 28: Primer (Nampt_E248X-R) SEQ ID NO: 29: Primer (Nampt_S253X-F) SEQ ID NO: 30: Primer (Nampt_S253X-R) SEQ ID NO: 31: Primer (Nampt_V278X-F) SEQ ID NO: 32: Primer (Nampt_V278X-R) SEQ ID NO: 33: Primer (Nampt_T281X-F) SEQ ID NO: 34: Primer (Nampt_T281X-R) SEQ ID NO: 35: Primer (T7-PP) SEQ ID NO: 36: Primer (T7-

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Abstract

本発明は、改変型（変異型）ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びそれを用いたニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法に関する。本発明の改変型ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）は、下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、 野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している。 （ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ１-Ｘ２-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ３ （ｂ）配列番号２：　Ｘ４-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ５ ［Ｘ１～Ｘ５は明細書内で規定したとおりである］

Description

改変型ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ
関連出願
　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０２１－５２５５５（２０２１年３月２６日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野：
　本発明は、改変型（変異型）ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びそれを用いたニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法に関する。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の合成中間体である。近年、ＮＭＮはＮＡＤ＋への変換を通じて長寿遺伝子「サーチュイン」の活性をコントロールすること、ＮＭＮをマウスに投与すると抗老化作用が示されることが明らかにされた。さらに、ＮＭＮは糖尿病、アルツハイマー病、心不全などの疾患の予防や症状の改善に効果があることも報告されている。このようなＮＭＮには、機能性食品、医薬品、化粧品等の成分としての用途が期待されており、生産性の向上を目指して、効率的な製造方法の研究開発が進められている。
　ＮＭＮの製造方法としては、有機合成による方法のほか、発酵法や酵素法などの生物学的方法が知られている。酵素法によるＮＭＮの製造は、一般的に、（１）リボースからリボース－５－リン酸（Ｒ５Ｐ）を生成する第１反応、（２）Ｒ５Ｐからホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）を生成する第２反応、（３）ＰＲＰＰとニコチンアミド（ＮＡＭ）からＮＭＮを生成する第３反応、の３段階の酵素反応からなるメイン反応と、ＡＴＰ再生やピロリン酸分解のサポート反応から構成される。
　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）は、哺乳類NAD+合成系における律速酵素であり、上記製造ルートの第３反応を触媒する酵素である（非特許文献１）。野生型Ｎａｍｐｔの活性は他の酵素と比較して低く、ＮＭＮの工業的生産には十分なものとは言えないため、その改善が求められている。例えば、活性の高いＮａｍｐｔ（ＨｄＮａｍｐｔ）の探索（非特許文献２及び３）や、小分子化合物を利用したＮａｍｐｔ活性化（非特許文献４）、ＮＭＮ分化経路ノックダウンにより細胞内蓄積ＮＭＮ濃度の向上（非特許文献５）により、ＮＭＮの生産効率を改善する試みがなれている。
　発明者らも、高活性なＮａｍｐｔの探索や、Ｎａｍｐｔに加えて上記第１及び第２反応を触媒するホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）及びポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の発現を強化することで、ＮＭＮの生産効率を改善する方法を報告している（特許文献１）。
　一方、野生型のＮａｍｐｔの配列に突然変異を導入した変異型Ｎａｍｐｔによる、ＮＭＮの生産効率の改善も報告されている（特許文献２）。しかしながら、この報告例では使用する野生型Ｎａｍｐｔの活性が極めて低いため、得られる変異型Ｎａｍｐｔの活性は、発明者らが使用している野生型高活性Ｎａｍｐｔよりも低い。
ＷＯ２０１９／０６５８７６ ＷＯ２０２０／１２９９９７
Garten et al., "Physiological and pathophysiological roles of NAMPT and NAD metabolism" Nature Reviews Endocrinology volume 11, pa535-546(2015) Marinescu et al., "β-nicotinamide mononucleotide (NMN) production in Escherichia coli" Scientific Reports volume 8, Article number: 12278 (2018) Shoji et al., "Metabolic design for selective production of nicotinamide mononucleotide from glucose and nicotinamide" Metab Eng. 2020 Nov 18;S1096-7176(20)30176-2. Gardell et al., "Boosting NAD+ with a small molecule that activates NAMPT" Nat Commun. 2019 Jul 19;10(1):3241 Black et al., "Engineering a nicotinamide mononucleotide redox cofactor system for biocatalysis" Nat Chem Biol., 2020 Jan;16(1):87-94.
　本発明は、活性の高いニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を提供し、これによりＮＭＮの生産効率を改善することを課題とする。
　発明者らは、野生型の高活性Ｎａｍｐｔの活性中心近傍残基に関して、個別に飽和変異ライブラリを作成し、活性スクリーニングを実施することで、酵素活性が高い改変型（変異型）Ｎａｍｐｔを作製することに成功した。
　すなわち、本発明は以下の［１］～［１５］を提供する。
［１］　改変型ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）であって、下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、
　野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している、改変型Ｎａｍｐｔ。
（ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ１-Ｘ２-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ３
（ｂ）配列番号２：　Ｘ４-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ５
　但し、Ｘ１～Ｘ５の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、 Ｘ２はＡ及びＱ以外のアミノ酸であり、Ｘ３はＭ以外のアミノ酸を表す。また、[　]は[　]内のアミノ酸のいずれか一つを表す。
［２］　下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、改変型Ｎａｍｐｔ：
　野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している、改変型Ｎａｍｐｔ。
（ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ１-Ｘ２-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ３
（ｂ）配列番号２：　Ｘ４-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ５
　但し、Ｘ1～Ｘ5の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ1は中性アミノ酸及び脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ2は脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸及び中性の親水性アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ3は非極性アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ4は脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ５は芳香族アミノ酸以外のアミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸を表す。また、[　]は[　]内のアミノ酸のいずれか一つを表す。
［３］　改変型ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）であって、下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、
　野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している、改変型Ｎａｍｐｔ。
（ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ1-Ｘ2-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ3
（ｂ）配列番号２：　Ｘ4-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ5
　但し、Ｘ1、Ｘ4、Ｘ5の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ1は中性アミノ酸及び脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ4は脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ5は芳香族アミノ酸以外のアミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸を表す。Ｘ2及びＸ3はいずれのアミノ酸でも良い。また、[　]は[　]内のアミノ酸のいずれか一つを表す。
［４］　改変型Ｎａｍｐｔのアミノ酸配列を、配列番号３で示されるアミノ酸配列とアライメントしたときに、
　前記配列番号１で示されるアミノ酸配列が、配列番号３の２４３番目～２５３番目に該当する位置に存在し、
　前記配列番号２で示されるアミノ酸配列が、配列番号３の２７８番目～２８１番目に該当する位置に存在する、［１］～［３］のいずれかに記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
［５］　以下の１）～５）から選ばれる１又は２以上の置換を有する、［１］
～［４］のいずれかに記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
１）Ｘ１における野生型アミノ酸のＴへの置換
２）Ｘ２における野生型アミノ酸のＧへの置換
３）Ｘ３における野生型アミノ酸のＧ又はＡへの置換
４）Ｘ４における野生型アミノ酸のＡへの置換
５）Ｘ５における野生型アミノ酸のＳ、Ａ、Ｎ、又はＩへの置換
［６］　前記改変型Ｎａｍｐｔの野生型配列が、以下の（１）又は（２）のアミノ酸配列を有する、［１］～［５］のいずれかに記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
（１）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれかに示されるアミノ酸配列
（２）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、Ｎａｍｐｔ活性を有するタンパクをコードするアミノ酸配列
［７］　前記改変型Ｎａｍｐｔが、Haemophilus属、Meiothermus属、Xanthomonas属、Sphingopyxis属、Sphingopyxis属、Chitinophaga属、Burkholderia属、Pedobacter属、Microbulbifer属、Labrenzia属、Luteibacter属由来である、［１］～［６］のいずれかに記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
［８］　［１］～［７］のいずれかに記載の改変型Ｎａｍｐｔの存在下で、ホスホリボシルピロホスファート及びニコチンアミドを接触させることにより、ニコチンアミドモノヌクレオチドを製造する方法。
［９］　ホスホリボシルピロホスファートがホスホリボシルピロリン酸シンターゼの存在下にリボース-５-リン酸から製造されたものである、［８］に記載の方法。
［１０］　リボース-５-リン酸がリボキナーゼの存在下にリボースから製造されたものである、［９］に記載の方法。
［１１］　［１］～［７］のいずれかに記載の改変型ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）をコードするＤＮＡ。
［１２］　［１１］に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
［１３］　［１２］に記載の組換えベクターを含む形質転換体；
［１４］　［１３］に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を採取する、Ｎａｍｐｔの製造方法。
［１５］　［１］～［７］のいずれかに記載の改変型Ｎａｍｐｔ又は［９］に記載の形質転換体を培養して得られる培養物若しくは当該培養物の処理物の存在下で、ホスホリボシルピロホスファート及びニコチンアミドを接触させることを特徴とする、ニコチンアミドモノヌクレオチドを製造する方法。
　本発明のＮａｍｐｔは、これによりＮＭＮの生産効率が向上するとともに、原料コストの削減が可能になる。
各種微生物由来のＮａｍｐｔのアミノ酸配列のアライメントを示す。
　本明細書で用いられる略語の定義はそれぞれ次の通りである。
　Ｎａｍｐｔ（Nicotinamide phosphoribosyltransferase）：ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ
　Ｐｒｓ（Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase）：ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ
　Ｒｂｋ（Ribokinase）：リボキナーゼ
　Ｐｐｋ（Polyphosphate kinase）：ポリリン酸キナーゼ
　ＰＰａｓｅ（Pyrophosphatase）：ピロホスファターゼ
　ＮＭＮ（Nicotinamide mononucleotide）：ニコチンアミドモノヌクレオチド
　ＰＲＰＰ（Phosphoribosyl pyrophosphate）：ホスホリボシルピロリン酸
　ＮＡＭ（Nicotinamide）：ニコチンアミド
　Ｒ５Ｐ（Ribose-5-phosphate）：リボース－５－リン酸
　ＮＲ（Nicotinamide riboside）：ニコチンアミドリボシド
　ＮａＭＮ（Nicotinic acid mononucleotide）：ニコチン酸モノヌクレオチド
　ＮＡＤ（Nicotinamide adenine dinucleotide）：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
　ＰＰｉ（Pyrophosphate）：ピロリン酸
　ＰｏｌｙＰ（Polyphosphate）：ポリリン酸
１．ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）
１．１　野生型Ｎａｍｐｔ
　Ｎａｍｐｔ（EC number: 2.4.2.12）は、一般的にＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）サルベージ経路に関与することが知られており、本発明において、ＰＲＰＰおよびＮＡＭからＮＭＮを生成させる反応（第３反応）のために利用される酵素である。ＮａｍｐｔによるＰＲＰＰとＮＡＭからのＮＭＮ合成反応において、本来、ＡＴＰは必須ではない。しかし、ＮａｍｐｔにはＡＴＰ加水分解活性があり、ＡＴＰの加水分解によってＮａｍｐｔが自己リン酸化されることで、ＮＭＮ生成に有利な方向に酵素学的パラメータや化学平衡が変化することが報告されている（Biochemistry 2008, 47, 11086-11096）。
　Ｎａｍｐｔとしては、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_005737）、マウス（Mus musculus）由来のもの（NP_067499）、ラット（Rattus norvegicus）由来のもの（NP_808789）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）由来のもの（NP_997833）、Haemophilus ducreyi（AAR87771）、Deinococcus radiodurans（AE001890）、Oenococcus oeni（KZD13878）、Shewanella oneidensis（NP_717588）等バクテリア由来のものが挙げられる。これらのうち、ＮＭＳ合成における酵素活性の点からは、バクテリア由来のものが好ましい。ここで、バクテリアとは、核膜を有さない原核生物の一群であり、大腸菌、枯草菌、シアノバクテリアなどを含む生物群である。
　具体的には、Ｎａｍｐｔは、Haemophilus属、Meiothermus属、Xanthomonas属、Sphingopyxis属、Sphingopyxis属、Chitinophaga属、Burkholderia属、Pedobacter属、Microbulbifer属、Labrenzia属由来のものが好ましい。
　表１に本発明で利用可能なＮａｍｐｔの由来とＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、及び配列表の配列番号を示す。また、図１に各Ｎａｍｐｔのアミノ酸配列のアライメントを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明に係るＮａｍｐｔは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれかに記載のアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＮａｍｐｔ活性を有するタンパク質も本発明のＮａｍｐｔに含まれる。
　また、本発明のＮａｍｐｔには、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１個または数個、具体的には、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎａｍｐｔ活性を有するタンパク質も本発明のＮａｍｐｔに含まれる。
　本発明に係るＮａｍｐｔの遺伝子は、上記したアミノ酸配列をコードするものである。一例として、Ｎａｍｐｔ遺伝子は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び２４のいずれかに記載の塩基配列を有する。しかし、前記塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＮａｍｐｔ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子も本発明のＮａｍｐｔ遺伝子に含まれる。
　また、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び２４のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮａｍｐｔ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子も本発明のＮａｍｐｔ遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」等の条件を挙げることができる。
１．２　改変型Ｎａｍｐｔ
　本発明の改変型Ｎａｍｐｔは、少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含み、その活性が、野生型の活性よりも向上していることを特徴とする、新規な改変型Ｎａｍｐｔである。
　本発明の改変型Ｎａｍｐｔの由来は特に限定されず、例えば、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ＣＭＤ＝ｓｅａｒｃｈ＆ＤＢ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）において登録されているＮａｍｐｔや、公知文献に記載されているＮａｍｐｔを利用することができる。具体的には、上記１．１に記載した公知のＮａｍｐｔを利用することができる。
　本発明の改変型Ｎａｍｐｔは、下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ１-Ｘ２-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ３
（ｂ）配列番号２：　Ｘ４-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ５
　但し、Ｘ１～Ｘ５の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、[　]は[　]内のアミノ酸のいずれか一つを表す。
　第１の態様において、Ｘ１～Ｘ５の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ２はＡ及びＱ以外のアミノ酸であり、Ｘ３はＭ以外のアミノ酸を表す。
　第２の態様において、Ｘ1～Ｘ5の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ1は中性アミノ酸及び脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ2は脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸及び中性の親水性アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ3は非極性アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ4は脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ５は芳香族アミノ酸以外のアミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸を表す。
　第３の態様において、Ｘ1、Ｘ4、Ｘ5の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ1は中性アミノ酸及び脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ4は脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ5は芳香族アミノ酸以外のアミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸を表す。Ｘ2及びＸ3はいずれのアミノ酸でも良い。
ここで、「酸性アミノ酸」とは、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）であり、好ましくは、グルタミン酸（Ｅ）である。
　「中性アミノ酸」とは、例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）であり、好ましくは、バリン（Ｖ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、イソロイシン（Ｉ）、より好ましくは、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、イソロイシン（Ｉ）である。
　「脂肪族アミノ酸」とは、例えば、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、より好ましくは、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、である。
　「親水性アミノ酸」とは、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）であり、好ましくは、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、より好ましくは、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）である。
　「非極性アミノ酸」とは、例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、システイン（Ｃ）であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、グリシン（Ｇ）より好ましくは、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）である。
　「芳香族アミノ酸酸」とは、例えば、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）であり、好ましくは、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）より好ましくは、トリプトファン（Ｗ）である。
　上記配列番号１及び２に示される配列は、公知のＮａｍｐｔのアミノ酸配列に共通して存在するモチーフ配列である。図１に示すように、改変型Ｎａｍｐｔのアミノ酸配列を、配列番号３で示されるHaemophilus ducreyi由来（AAR87771）のアミノ酸配列とアライメントしたときに、
（ａ）前記配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号３の２４３番目～２５３番目に該当する位置に存在し、
（ｂ）前記配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号３の２７８番目～２８１番目に該当する位置に存在する。
　Ｘ１～Ｘ５は、Ｎａｍｐｔの活性が野生型よりも向上する限り、少なくとも１つが野生型のアミノ酸と異なるものであればよい。
　Ｘ１～Ｘ５における好ましい置換としては以下のものが挙げられる。
１）Ｘ１：野生型アミノ酸のＴ又はＶへの置換、より好ましくはＴへの置換
２）Ｘ２：野生型アミノ酸のＡ又はＧへの置換、より好ましくはＧへの置換
３）Ｘ３：野生型アミノ酸のＶ、Ｇ又はＡへの置換、より好ましくはＧ又はＡへの置換
４）Ｘ４：野生型アミノ酸のＡ又はＬへの置換、より好ましくはＡへの置換
５）Ｘ５：野生型アミノ酸のＧ、Ｓ、Ａ、Ｎ、又はＩへの置換、より好ましくは野生型アミノ酸のＳ、Ａ、Ｎ、又はＩへの置換
　本発明の改変型Ｎａｍｐｔは、上記Ｘ１～Ｘ５の２以上において変異を有するものであってもよい（複合置換（変異））。こうして複数の変異を導入することにより、単一変異よりも高い活性が達成され得ることがある。
　そのような複合置換としては、以下の組合せが挙げられる。
２置換：Ｘ１とＸ２、Ｘ１とＸ３、Ｘ１とＸ４、Ｘ１とＸ５、Ｘ２とＸ３、Ｘ２とＸ４、Ｘ２とＸ５、Ｘ３とＸ４、Ｘ３とＸ５、Ｘ４とＸ５
３置換：Ｘ１とＸ２とＸ３、Ｘ１とＸ２とＸ４、Ｘ１とＸ２とＸ５、Ｘ１とＸ３とＸ４、Ｘ１とＸ３とＸ５、Ｘ１とＸ４とＸ５、Ｘ２とＸ３とＸ４、Ｘ２とＸ３とＸ５、Ｘ２とＸ４とＸ５、Ｘ３とＸ４とＸ５
４置換：Ｘ１とＸ２とＸ３とＸ４、Ｘ１とＸ２とＸ３とＸ５、Ｘ１とＸ２とＸ４とＸ５、Ｘ１とＸ３とＸ４とＸ５、Ｘ２とＸ３とＸ４とＸ５
５置換：Ｘ１とＸ２とＸ３とＸ４とＸ５
　これらの中でも、Ｘ１とＸ3、Ｘ１とＸ４、Ｘ１とＸ５の複合置換が好ましく、Ｘ3とＸ5、Ｘ4とＸ5複合置換がより好ましい。
　より具体的には、Ｘ１のＴへの置換とＸ3のＧへの置換の組合せ、Ｘ１のＴへの置換とＸ４のＡへの置換の組合せ、Ｘ１のＴへの置換とＸ5のＳへの置換の組合せ、Ｘ3のＧへの置換とＸ5のＳへの置換の組合せ、Ｘ１のＴへの置換とＸ3のＴへの置換の組合せが好ましく、Ｘ3のＡへの置換とＸ5のＳへの置換の組合せ、Ｘ4のＧへの置換とＸ5のＳへの置換の組合せがより好ましい。
　上記Ｘ１～Ｘ５は、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列の２４７番目、２４８番目、２５３番目、２７８番目、及び２８１番目のアミノ酸に該当する。したがって、本発明の改変型ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）は、そのアミノ酸配列を、配列番号３で示されるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ由来（ＡＡＲ８７７７１）のＮａｍｐｔのアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号３の２４７番目、２４８番目、２５３番目、２７８番目、及び２８１番目にそれぞれ該当する位置のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つが野生型のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されており、野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している、改変型Ｎａｍｐｔと記載することもできる。
　上記の場合、好ましい置換は、以下のように記載することができる。
１）配列番号３の２４７番目に該当する位置（Ｘ１）における野生型アミノ酸のＴ又はＶへの置換、より好ましくはＴへの置換
２）配列番号３の２４８番目に該当する位置（Ｘ２）における野生型アミノ酸のＡ又はＧへの置換、より好ましくはＧへの置換
３）配列番号３の２５３番目に該当する位置（Ｘ３）における野生型アミノ酸のＶ、Ｇ又はＡへの置換、より好ましくはＧ又はＡへの置換
４）配列番号３の２７８番目に該当する位置（Ｘ４）における野生型アミノ酸のＡ又はＬへの置換、より好ましくはＡへの置換
５）配列番号３の２８１番目に該当する位置（Ｘ５）における野生型アミノ酸のＧ、Ｓ、Ａ、Ｎ、又はＩへの置換、より好ましくはＳ、Ａ、Ｎ、又はＩへの置換
　本発明の改変型Ｎａｍｐｔは、野生型よりも高い活性、好ましくは１．２倍以上高い活性、より好ましくは１．４倍以上高い活性を有する。
　ここで、「活性」とは、Ｎａｍｐｔ活性、すなわち、ＰＲＰＰおよびＮＡＭからＮＭＮを生成させる反応を触媒する酵素活性を意味する。活性測定は、基質であるＰＲＰＰおよびＮＡＭをＮａｍｐｔと接触させ、ＮＭＮに変換した後、当該ＮＭＮを定量することにより算出することができる。
　反応条件は、基質濃度は１０から１００ｍＭ、反応温度は１０℃から４０℃、反応時間は１時間から４０時間の範囲である。メタノール及びＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を添加して停止させる。その後、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により、生成したＮＭＮを分析することで定量を行うことができる。
　本発明の改変型Ｎａｍｐｔは、既知のＮａｍｐｔに上述したアミノ酸置換を導入し、その酵素活性を野生型と比較して選択することにより得られる。変異の導入法としては、部位特異的変異誘発や部位特異的ヌクレアーゼを用いたゲノム編集が挙げられる。
　部位特異的変異誘発については、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法の他、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等様々な方法が知られており、市販の突変異導入用キットを用いて簡便に実施することができる。
　部位特異的ヌクレアーゼを用いたゲノム編集としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などを用いたゲノム編集など、公知の方法を利用することができ、市販のキットを用いて実施することができる。
２．改変型Ｎａｍｐｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）
　本発明は、本発明の改変型Ｎａｍｐｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）も提供する。
　本発明の「改変型ＮａｍｐｔをコードするＤＮＡ」には、上記改変型ＮａｍｐｔをコードするＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、野生型よりも高いＮａｍｐｔ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
　「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００～２０００ｍＭ、温度が４０～７５℃、好ましくは塩濃度が６００～９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のＮａｍｐｔをコードするＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
　ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、本発明の遺伝子ＤＮＡに対して少なくとも４０％以上、好ましくは６０％、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分断片が挙げられる。
３．発現ベクター
　本発明は、本発明の改変型Ｎａｍｐｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含む発現ベクターも提供する。前述のとおり、酵素法によるＮＭＮの合成には複数の酵素が関与する。本発明の発現ベクターは、改変型Ｎａｍｐｔをコードする遺伝子に加えて、ＮＭＮ生産経路で作用する他の酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含むものであってもよい。例えば、Ｎａｍｐｔに加えて、後述するＰｒｓおよびＰｐｋをコードする遺伝子を全て含んでいてもよいし、ＮａｍｐｔとＰｒｓをコードする遺伝子を含む発現ベクター、あるいはＮａｍｐｔとＰｐｋをコードする遺伝子を含む発現ベクターであってもよい。
　本発明で用いられる発現ベクターは、公知の手法により作製することができる。一般的には、所定の酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入すればよい。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、そのベクターの転写プロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に所定の酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。上述したように、１つの発現ベクターに２つ以上の酵素をコードする遺伝子を含める場合、それらの遺伝子は全て同一のプロモーター下に挿入されていてもよいし、異なるプロモーター下に挿入されていてもよい。プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌宿主において利用できるのものとしては、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来ＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターが挙げられる。
　所定の各酵素をコードする遺伝子は、例えば、（i）塩基配列情報に従い、プライマーを作製し、ゲノム等を鋳型として増幅することによって得ることもできるし、（ii）酵素のアミノ酸配列情報に従い、有機合成的にＤＮＡを合成することによって得ることもできる。形質転換体の宿主となる細胞に応じて、遺伝子は最適化されていてもよい。
　発現ベクターに所定の酵素をコードする遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入してもよい。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。また、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含めることが好ましい。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
　発現ベクターは、宿主に応じて、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどから選ばれる適切なものを用いればよい。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス）、ｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン）、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン）、ｐＥＴシリーズベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）などを挙げることができる。また２以上の挿入箇所を有するベクターとしてはｐＥＴＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）等を挙げることができる。必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
　発現ベクターは、所定の酵素をコードする遺伝子に、適切なプロモーターやターミネーター、マーカー遺伝子等を連結させた発現カセットを宿主のゲノム上に挿入することで、所定の酵素の発現を強化することができる。発現カセットがゲノム上に挿入された形質転換体を取得する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、相同組換えにより発現カセットをゲノム上に挿入する場合は、所定の酵素の発現カセットと任意のゲノム領域の配列を有し、宿主内で複製不可能なプラスミドを用いて形質転換を行うことで、当該プラスミド全体または発現カセットが挿入された形質転換体を得ることができる。その際、ＳａｃＢ遺伝子（レバンスクラーゼをコード）等のネガティブ選択マーカーを搭載したプラスミドや、複製機構が温度感受性（ｔｓ）のプラスミドを用いることで、２回の相同組換えにより発現カセットのみがゲノム上にされた形質転換体を効率的に取得することもできる。また、発現カセットのみから成るＤＮＡ断片を用いて形質転換を行うことで、ゲノム上のランダムな位置に発現カセットが挿入された形質転換体を得ることもできる。
　Ｎａｍｐｔ以外の酵素について、宿主がゲノム上に元々有する酵素（内因性酵素）を利用する場合は、ゲノム上の当該酵素遺伝子のプロモーターを強力なものに置換することで、その発現を強化することもできる。プロモーターとしては、上述した発現ベクターにおいて用いるプロモーターを同様に利用することができる。
４．形質転換体
　本発明は、本発明の改変型Ｎａｍｐｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）あるいは前記発現ベクターを含む形質転換体も提供する。本発明の形質転換体は、前項に記載したように、改変型ＮａｍｐｔをコードするＤＮＡに加えて、ＮＭＮ生産経路で作用する他の酵素をコードするＤＮＡを含むものであってもよい。
　形質転換体の宿主は、発現ベクター等を利用したタンパク質発現システムによって所定の酵素を発現することができる細胞であれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、放線菌（例えばロドコッカス属（Rhodococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium））などの細菌；酵母（例えばサッカロマイセス属（Saccharomyces）、キャンディダ属（Candida）、ピキア属（Pichia））；糸状菌；植物細胞；昆虫細胞、哺乳類細胞などの動物細胞が挙げられる。これらの中でも、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌およびロドコッカス属細菌、ならびにサッカロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母およびピキア属酵母が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　大腸菌としては、例えば、大腸菌Ｋ１２株およびＢ株、ならびにそれらの野生株由来の派生株であるＷ３１１０株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ株（例えば、ＸＬ１－ＢｌｕｅＭＲＦ'）、Ｋ８０２株、Ｃ６００株、ＢＬ２１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＮ８株(ＷＯ２０１９／０６５８７６)等が挙げられる。
　宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法が挙げられる。
　発現ベクターが導入された形質転換体は、宿主として用いた細胞（菌体）に適した方法で培養して、所定の各酵素を発現させればよい。前述したように、所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士を組み合わせる場合、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓを発現する形質転換体とＰｐｋを発現する形質転換体を作製して組みあわせる場合は、それぞれの形質転換体を同一の培地で培養してもよいし、別々の培地で培養した後に混合してもよい。
　形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物（詳細は後記第２工程に関する事項を参照）を用いてＮＭＮの生成反応を行う場合、反応物（基質）であるリボースやＮＡＭ、生成物であるＮＭＮの分解または副反応が起き、ＮＭＮが効率的に製造できないことがある。その場合、分解や副反応の原因となる遺伝子を破壊または欠失させた宿主を用いることができる。具体的には、以下の（ａ）～（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子が、欠損または破壊されている宿主を用いることができる。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｂ）EC 3.5.1.19
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｄ）EC 3.5.1.42
（ｅ）EC 1.17.2.1
（ｆ）EC 1.17.1.5
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
　（ａ）EC 3.1.3.5に分類される酵素は、５'－ヌクレオダーゼであり、ＮＭＮを加水分解してニコチンアミドリボシド（ＮＲ）とリン酸を生成する反応を触媒する酵素が含まれる。例えば、大腸菌のｕｓｈＡ、ｓｕｒＥ、ｙｒｆＧ、ｙｊｊＧ等が挙げられ、特にＵｓｈＡまたはそのホモログが好ましい。
　（ｂ）EC 3.5.1.19に分類される酵素は、ニコチナミダーゼであり、ＮＡＭの分解に関与する酵素が含まれる。例えば、大腸菌のｐｎｃＡが挙げられる。
　（ｃ）EC 2.4.2.1に分類される酵素は、プリン－ヌクレオシドホスホリラーゼであり、ＮＲを加リン酸分解して、ＮＡＭとリボース－１－リン酸（Ｒ１Ｐ）とを生成する反応を触媒する酵素が含まれる。例えば、大腸菌のｄｅｏＤまたはそのホモログ遺伝子が挙げられる。
　（ｄ）EC 3.5.1.42に分類される酵素は、ニコチナミドモノヌクレオチドデアミナーゼであり、ＮＭＮを加水分解して、ＮａＭＮとアンモニアを生成する反応を触媒する酵素が含まれる。例えば、大腸菌のｐｎｃＣまたはそのホモログ遺伝子が挙げられる。
　（ｅ）EC 1.17.2.1および（ｆ）EC 1.17.1.5に分類される酵素は、ニコチネートデヒドロゲナーゼであり、ＮＡＭからのヒドロキシニコチン酸の副生に関与しうる酵素が含まれる。
　（ｇ）EC 3.2.2.1に分類される酵素は、プリンヌクレオシダーゼであり、ＮＲを加水分解して、ＮＡＭとリボースを生成する反応を触媒する酵素が含まれる。例えば、Ｐｕ－Ｎまたはそのホモログが挙げられる。
　（ｈ）EC 3.2.2.3に分類される酵素は、ウリジンヌクレオシダーゼであり、ＮＲを加水分解して、ＮＡＭとリボースを生成する反応を触媒しうる酵素が含まれる。例えば、ＵＲＨ１またはそのホモログが挙げられる。
　（ｉ）EC 3.2.2.14に分類される酵素は、ＮＭＮヌクレオシダーゼであり、ＮＭＮを加水分解して、ＮＡＭとＲ５Ｐを生成する反応を触媒する酵素が含まれる。本発明においては、ＮＭＮヌクレオシダーゼをコードする遺伝子を破壊または欠失させることが好ましい。
　欠損または破壊されるのは、（ｄ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とであることが好ましく、（ｄ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、（ａ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とであることがより好ましい。
　遺伝子を破壊または欠失させる方法は、特段限定されるものではなく、公知の遺伝子破壊または欠失方法で行うことができる。例えば、線状にした遺伝子破壊または欠失用断片を用いる方法、複製起点を含まない環状の遺伝子破壊または欠失プラスミドを用いる方法、グループIIイントロンを用いる方法、Ｒｅｄ－ＥＴ相同組換え法、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集を用いる方法などが挙げられる。
５．改変型Ｎａｍｐｔの製造方法
　改変型Ｎａｍｐｔは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からＮａｍｐｔ活性を有するタンパク質を採取することにより製造することができる。本発明はそのような改変型Ｎａｍｐｔの製造方法も提供する。
　本発明において、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも包含する。
　形質転換体の培養は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行う。本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース及びデンプン等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、エタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸、若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物が挙げられる。
　その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地には酵素発現の誘導剤となる化合物を添加してもよい。
　培養中、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。
　また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
　プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。
　形質転換体の培養条件は、目的の改変型Ｎａｍｐｔの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定されるものではないが、通常、１０℃～４０℃、好ましくは２０℃～３７℃で５～１００時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、例えばロドコッカス菌であればｐＨ６～９に調整する。
　培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、特にロドコッカス菌の形質転換体を培養する場合には、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。
　上記培養条件で培養すると、高収率で本発明の改変型Ｎａｍｐｔを上記培養物中、すなわち、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。
　培養後、改変型Ｎａｍｐｔが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより、目的の改変型Ｎａｍｐｔを採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
　破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した改変型Ｎａｍｐｔ溶液とすることができる。
　また、改変型Ｎａｍｐｔが菌体内又は細胞内に生産される場合、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
　改変型Ｎａｍｐｔが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から改変型Ｎａｍｐｔを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
　形質転換体を培養して得られたＮａｍｐｔの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やＮａｍｐｔ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、Ｎａｍｐｔ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
　上記した方法のほか、無細胞タンパク質合成系を採用して改変型Ｎａｍｐｔを産生することも可能である。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
　この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
　細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ－ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
　上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改変型Ｎａｍｐｔは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
６．ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法
６．１　改変型ＮａｍｐｔによるＮＭＮの製造
　本発明の改変型Ｎａｍｐｔは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、改変型Ｎａｍｐｔの存在下で、ホスホリボシルピロホスファート（ＰＲＰＰ）及びニコチンアミド（ＮＡＭ）を接触させ、生成するニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を採取することにより、ＮＭＮ化合物を製造することができる。
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　酵素触媒としては、分離精製されたＮａｍｐｔのほか、本発明の形質転換体を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の細胞（形質転換体）をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、樹脂、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
　ここで、「接触」とは、改変型ＮａｍｐｔとＰＲＰＰ及びＮＡＭを同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、分離精製した改変型ＮａｍｐｔとＰＲＰＰ及びＮＡＭを混合すること、改変型Ｎａｍｐｔ遺伝子を発現する細胞（形質転換体）の培養容器にＰＲＰＰ及びＮＡＭを添加すること、当該細胞をＰＲＰＰ及びＮＡＭの存在下で培養すること、当該細胞の抽出液をＰＲＰＰ及びＮＡＭと混合することなどが含まれる。
　ホスホリボシルピロホスファートは、例えば、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼの存在下でリボース-５-リン酸から製造することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンターゼとしては、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（BAA05286）、Bacillus caldolyticus由来のもの（CAA58682）、Arabidopsis thaliana由来のもの（Q680A5）、Methanocaldococcus jannaschii由来のもの（Q58761）が挙げられる。必要に応じて変異型ホスホリボシルピロリン酸シンターゼを用いることもできる。変異型ホスホリボシルピロリン酸シンターゼとしては、例えば、ヒト由来のＰｒｓについての、Ａｓｐ５１Ｈｉｓ（５１位のＡＳＰのＨｉｓへの置換、以下同様）、Ａｓｎ１１３Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅ、Ａｓｐｌ８２Ｈｉｓ、Ａｌａ１８９Ｖａｌ、およびＨｉｓｌ９２Ｇｌｎなどの変異型、ならびにそれらに対応する他の生物由来のＰｒｓにおける変異型、例えば、枯草菌由来のＰｒｓについて、Ａｓｎ１２０Ｓｅｒ（上記Ａｓｎ１１３Ｓｅｒに対応）、Ｌｅｕ１３５Ｉｌｅ（上記Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅに対応）などの変異型が挙げられる。
　リボース-５-リン酸は、リボキナーゼの存在下にリボースから製造することができる。リボキナーゼとしては、各種の生物に由来する天然型リボキナーゼ、またはそのアミノ酸配列を改変して作製された変異型リボキナーゼを用いることができ、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のもの（P25332）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（P36945）、大腸菌（Escherichia coli）由来のもの（AAA51476）、Haemophilus influenzae由来のもの（P44331）が挙げられる。
６．２　酵素の発現強化
　本発明のＮＭＮの製造方法は、例えば、ＷＯ２０２０／１２９９９７に記載された方法にしたがって実施してもよい。すなわち、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させる工程を含む。好ましくは、本発明のＮＭＮの製造方法は、前記Ｒ５Ｐの製造工程として、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸を含む混合物と接触させる工程をさらに含む。つまり、本発明では、ＡＴＰ再生反応を利用しながら、所定の酵素反応を進行させることによりＮＭＮを製造する。
　このようなＮＭＮの製造方法は、典型的には、下記（１）～（３）の工程（本明細書において、それぞれ第１工程、第２工程および第３工程と称する）を順次行うことにより実施される。これらの工程は、同一の者が実施してもよいし、異なる者が実施してもよい。また、これらの工程は、連続的に行ってもよいし、各工程の間に所定の期間をおいて段階的に行ってもよい。
（１）Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋの各酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる工程（第１工程）；
（２）必要に応じ、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液から、処理物を調製する工程（第２工程）；および
（３）第１、第２工程を経た形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、各基質化合物と接触させる工程（第３工程）。
　以下、本発明のＮＭＮの製造方法について、第１工程、第２工程および第３工程を行う実施形態に沿って、さらに詳細に説明する。ただし、本発明のＮＭＮの製造方法は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、以下に具体的に記載する第１工程、第２工程および第３工程を適宜改変した実施形態で行うことも可能である。
　［第１工程］
　第１工程は、Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋの各酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる工程である。
　本実施形態では、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋと、必要によりさらにＲｂｋの４酵素を利用する。Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＰｐｋおよびＲｂｋはいずれも既知の酵素であり、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は当業者であれば容易に入手可能である。上記所定の４酵素は、それぞれの目的反応を触媒することができるものであれば、天然型の酵素であってもよいし、天然型の酵素のアミノ酸配列を改変することにより作製された、好ましくは発現量や酵素活性が向上した、変異型の酵素であってもよい。また、精製の簡略化や可溶性発現の促進、抗体による検出等を目的として、各酵素には種々のタグ（タンパク質またはペプチド）が付加されていてもよい。タグの種類としては、Ｈｉｓタグ（ヒスチジンタグ）、Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）－ｔａｇ、ＧＳＴタグ（グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼタグ）、ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質タグ）、ＧＦＰタグ（緑色蛍光タンパク質タグ）、ＳＵＭＯタグ（Ｓｍａｌｌ　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ（ｌｉｋｅ）　Ｍｏｄｉｆｉｅｒタグ）ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ等が挙げられる。さらに、４酵素は、互いに融合タンパク質として発現されていてもよい。
　Ｐｒｓとしては、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（BAA05286）、Bacillus caldolyticus由来のもの（CAA58682）、Arabidopsis thaliana由来のもの（Q680A5）、Methanocaldococcus jannaschii由来のもの（Q58761）が挙げられる。長時間にわたって、特に製造系内の基質濃度が高い場合に、第２反応によるＰＲＰＰの生成およびそれに続く第３反応によるＮＭＮの生成を継続させる（つまり最終産物であるＮＭＮの製造系内の濃度を上昇させ続ける）ことができるよう、ＷＯ２０２０／１２９９９７に記載されているような変異型Ｐｒｓを用いることもできる。変異型Ｐｒｓとしては、例えば、ヒト由来のＰｒｓについての、Ａｓｐ５１Ｈｉｓ（５１位のＡＳＰのＨｉｓへの置換、以下同様）、Ａｓｎ１１３Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅ、Ａｓｐｌ８２Ｈｉｓ、Ａｌａ１８９Ｖａｌ、およびＨｉｓｌ９２Ｇｌｎなどの変異型、ならびにそれらに対応する他の生物由来のＰｒｓにおける変異型、例えば、枯草菌由来のＰｒｓについて、Ａｓｎ１２０Ｓｅｒ（上記Ａｓｎ１１３Ｓｅｒに対応）、Ｌｅｕ１３５Ｉｌｅ（上記Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅに対応）などの変異型が挙げられる。
　Ｒｂｋとしては、各種の生物に由来する天然型Ｒｂｋ、またはそのアミノ酸配列を改変して作製された変異型Ｒｂｋを用いることができ、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のもの（P25332）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（P36945）、大腸菌（Escherichia coli）由来のもの（AAA51476）、Haemophilus influenzae由来のもの（P44331）が挙げられる。
　Ｐｐｋ（EC number: 2.7.4.1）は、本発明において、第１反応で生成するＡＤＰまたは第２反応で生成するＡＭＰと、ポリリン酸とから、ＡＴＰを再生する反応（ＡＴＰ再生反応）のために利用される酵素である。
　Ｐｐｋはアミノ酸配列およびキネティクスの違いにより２つのファミリー、ポリリン酸キナーゼ１型ファミリー（Ｐｐｋ１）およびポリリン酸キナーゼ２型ファミリー（Ｐｐｋ２）に分類することができる。ポリリン酸を基質としてＡＴＰを再生する活性としては、Ｐｐｋ１よりもＰｐｋ２のほうが高い。従って、本発明におけるＰｐｋとしては、Ｐｐｋ２を用いることが好ましい。
　Ｐｐｋ２はさらに、３つのサブファミリー、クラス１、クラス２およびクラス３に分類することができる。クラス１およびクラス２のＰｐｋ２はそれぞれ、ＡＤＰをリン酸化してＡＴＰを生成する反応、およびＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する反応を触媒する。これに対してクラス３のＰｐｋ２は、ＡＭＰのリン酸化反応およびＡＤＰのリン酸化反応の両方を触媒することができるため、単独でＡＭＰからＡＴＰを生成することができる。
　本発明におけるＰｐｋとしては、ＡＤＰからＡＴＰを再生するためのＰｐｋ２クラス１と、ＡＭＰからのＡＤＰを再生するためのＰｐｋ２クラス２の組み合わせを用いることができる。または、ＡＭＰからのＡＤＰを再生するためにアデニル酸キナーゼ（ＡＭＰ＋ＡＴＰ→２ＡＤＰという反応を触媒する）を併用する場合は、ＡＤＰからＡＴＰを再生するためのＰｐｋ２クラス１またはＰｐｋ１のみを本発明におけるＰｐｋとして用いることも可能である。しかし、ＡＤＰからのＡＴＰの再生と、ＡＭＰからのＡＴＰの再生の、両方の反応を単独で触媒することができるという効率性の良さから、Ｐｐｋ２クラス３を用いることが好ましい。このようなＰｐＫを用いる場合は、第１反応のＰｐｋと第２反応のＰｐｋを共通化することができる。
　Ｐｐｋ２クラス３としては、例えば、Deinococcus radiodurans由来のもの（NP_293858）、Paenarthrobacter aurescens由来のもの（ABM08865）、Meiothermus rube由来のもの（ADD29239）、Deinococcus geothermalis由来のもの（WP_011531362）、Thermosynechococcus elongatus由来のもの（NP_682498）が挙げられる。一方、Ｐｐｋ２クラス１としては、例えばRhodobacter sphaeroides由来のもの（CS253628）、Sinorhizobium meliloti由来のもの（NP_384613）、Pseudomonas aeruginosa由来のPA0141（NP_248831）、Pseudomonas aeruginosa由来のPA2428（NP_251118）、Francisella tularensis由来のもの（AJI69883）が挙げられる。Ｐｐｋ２クラス２としては、例えばPseudomonas aeruginosa由来のPA3455（NP_252145）が挙げられる。また、アデニル酸キナーゼとしては、例えばBacillus cereus由来のもの（AAP07232）が挙げられる。
　［第２工程］
　第２工程は、必要に応じ、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液から処理物を調製する工程である。形質転換体の処理物としては、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体等が挙げられる。また、破砕菌体から調製した無細胞抽出物および精製酵素も本発明の処理物に含まれる。無細胞タンパク質合成反応液の処理物としては、無細胞タンパク質合成反応液から調製した精製酵素が挙げられる。さらには、形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液およびこれら処理物に対して安定化処理を行った安定化処理物も、本発明の処理物に含まれる。
　休止菌体の調製は、公知の方法を用いて行うことができる。休止菌体とは、その増殖が実質的に停止した状態に置かれた菌体を意味する。具体的には、培養により増殖させた形質転換体を培地から回収した後、形質転換体が容易に利用可能な炭素源等を含まない緩衝液等に懸濁したり、回収した形質転換体を凍結させたり、乾燥させて粉末化したりすることにより調製することができる。形質転換体を培地から回収する方法は如何なる方法でもよく、例えば、遠心分離を用いた方法、膜ろ過を用いた方法等が挙げられる。遠心分離は、形質転換体を沈降させる遠心力が供給できるものであれば特に限定されることはなく、円筒型や分離板型などを利用することができる。遠心力としては、例えば、５００Ｇ～２０，０００Ｇ程度で行うことができる。膜ろ過は、形質転換体を培地から回収することができれば、精密ろ過（ＭＦ）膜、限外ろ過（ＵＦ）膜いずれを用いて行ってもよい。形質転換体を懸濁する緩衝液としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれるものであれば如何なるものでもよく、例えば、リン酸緩衝液、アクリル酸緩衝液、トリス（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）‐塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２－（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）やその他グッドの緩衝液（Ｇｏｏｄ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒｓ）等を用いることができる。形質転換体を凍結する場合は、上記の遠心分離等の操作により大半の水分を除去した状態、または適当な緩衝液に懸濁された状態で凍結すればよい。凍結する温度は、形質転換体を懸濁する緩衝液の成分によっても異なるが、実質的に形質転換体が凍結する温度であれば如何なる温度でもよく、例えば、－２１０℃～０℃等の範囲で行えばよい。また、形質転換体を乾燥する場合、その乾燥方法としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれる方法であれば如何なる方法でもよく、凍結乾燥法や噴霧乾燥法等が挙げられる。
　膜透過性向上菌体の調製は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、有機溶媒や界面活性剤で形質転換体を処理することにより、基質や生成物が、形質転換体の細胞膜や細胞壁を通過しやすくなる。使用する有機溶媒や界面活性剤の種類としては、膜透過性が向上し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれるものであれば特段限定されることはなく、有機溶媒であればトルエンやメタノール等、界面活性剤であればＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ　１００や塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
　不活化菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば薬剤処理や加熱処理により行うことができる。薬剤による処理は、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤、塩酸アルキルジアミノエチルグリシンなどの両性イオン系界面活性剤などを用いることができる。また、エタノール等のアルコール類、２－メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン、シトルリン等のアミノ酸類なども挙げられる。加熱による処理は、目的の酵素が失活しない温度と時間で熱処理を行えばよい。
　破砕菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ビーズミルによる磨砕処理、衝撃破砕装置による衝突処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等が挙げられ、いずれかの方法を単独または必要に応じ組み合わせて利用することができる。工業的規模で細胞の破砕を行う場合は、操作性、回収率、コスト等を勘案し、例えば、高圧処理や磨砕処理、衝突処理あるいはこれら処理に酵素処理等を組み合わせた処理を行うことが好ましい。
　ビーズミルによる磨砕処理を行う場合、用いられるビーズは、例えば、密度２．５～６．０ｇ／ｃｍ３、サイズ０．１～１．０ｍｍのものを通常８０～８５％程度充填することにより破砕を行うことができ、運転方式としては回分式、連続式いずれをも採用することができる。
　高圧処理を行う場合、処理圧力は、細胞からの目的タンパク質回収率が十分高いものであれば特段限定されないが、例えば、４０～２００ＭＰａ程度、好ましくは６０～１５０ＭＰａ程度、より好ましくは８０～１２０ＭＰａ程度の圧力で破砕を行うことができる。必要に応じて、装置を直列に配置したり、複数ステージ構造の装置を用いたりすることにより、多段階処理を行い、破砕および操作効率を向上させることも可能である。通常、処理圧力１０ＭＰａあたり２～３℃の温度上昇が生じることから、必要に応じて冷却処理を行うことが好ましい。
　衝突処理の場合、例えば、細胞スラリーを予め噴霧急速凍結処理（凍結速度：例えば１分間当たり数千℃）等によって凍結微細粒子（例えば５０μｍ以下）にしておき、これを高速（例えば約３００ｍ／ｓ）の搬送ガスによって衝突板に衝突させることで効率的に細胞を破砕することができる。
　無細胞抽出物は、破砕菌体から破砕残渣（細胞膜や細胞壁等を含む不溶性画分）を除去することによって調製することができる。破砕残渣の除去は、公知の手法により行うことができ、例えば、遠心分離や膜ろ過、ろ布ろ過等を利用することができる。遠心分離操作は、上述したように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細であり、容易に沈降し難い場合は、必要に応じて凝集剤等を使用して残渣沈殿効率を上げることもできる。膜ろ過も、上述のように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細である場合には、特に限外ろ過（ＵＦ）膜を使用することができる。ろ布ろ過を行う場合には、ろ過助剤や凝集剤を併用して行うことができる。ろ過助剤としては、珪藻土やセルロースパウダー、活性炭などが挙げられる。凝集剤としては、カチオン系凝集剤、アニオン系凝集剤、両性系凝集剤、ノニオン系凝集剤等が挙げられる。上記いずれかの操作により、菌体が存在しない上清を回収し、無細胞化する（セルフリーにする）ことで、所定の各酵素を含む無細胞抽出物を調製することができる。
　精製酵素の調製は、一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム等）、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ等）、アフィニティークロマトグラフィー（ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ等）、疎水性クロマトグラフィー（ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ等）、陰イオンクロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱカラム等））、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を、単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。
　本発明においては、上述した形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、およびそれらの処理物に対して、安定化処理を行ったもの（安定化処理物）を用いることもできる。安定化処理は、未処理の状態よりも、環境因子（温度、ｐＨ、化学物質濃度等）に対する所定の各酵素の安定性、あるいは保存時の安定性が向上する処理であればいかなる処理でもよい。例えばアクリルアミド等のゲルへの包含、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類による処理（ＣＬＥＡ：Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅを含む）、無機担体（アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等）への担持処理等が挙げられる。
　本発明で用いる基質や生成物は、極性が比較的高く、細胞膜や細胞壁が物質移動の律速となる可能性がある。従って、基質や生成物の透過性の観点から、本発明では、特に、破砕菌体、無細胞抽出物、精製酵素、またはそれらの安定化処理物を用いることが好ましい。
　上述した形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物は、その酵素活性が保持される限り、如何なる条件で保存することもできる。所望により適切な条件下で（例えば－８０℃～－２０℃、１日～１年）それらの溶液を凍結し、使用時（第３工程の実施時）まで保存するようにしてもよい。
　前述したように、所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士を組み合わせる場合、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓの発現が強化された形質転換体およびＰｐｋの発現が強化された形質転換体を作製して組み合わせる場合は、（i）それぞれの形質転換体について別々に各処理を行ったのち、それらの処理物を混合するようにしてもよいし、（ii）それらの形質転換体を混合した後、一括して当該各処理を行ってもよい。
　［第３工程］
　第３工程は、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液、または必要に応じてさらに第２工程を経たそれらの処理物を、酵素反応の各種原料となる基質と接触させる工程である。この工程においては、Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応がＰｐｋによるＡＴＰ再生反応と共役して行われる。Ｐｒｓによる第２反応では、ＡＴＰをリン酸源として基質がリン酸化されるため、また、Ｎａｍｐｔによる第３反応では、Ｎａｍｐｔ自身が有するＡＴＰ加水分解活性により自己リン酸化されるため、ＡＴＰが消費される。従って、両反応をＡＴＰ再生反応と共役して行うことで、消費されたＡＴＰを補いながら効率的に反応を進行させることができる。また、Ｐｒｓによる第２反応の生成物であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）は比較的不安定な化合物であるため、第２反応と第３反応を同一系内で行うことで、ＰＲＰＰ生成後、速やかにＮａｍｐｔによる第３反応を行うことができる。本発明においては、ＡＴＰ再生反応によりＡＤＰおよび／またはＡＭＰからＡＴＰが再生されるので、ＡＴＰは枯渇することはないが、反応中に維持したいＡＴＰ濃度に応じて、適度な量のＡＴＰを反応溶媒中に添加することが必要となる。この際、必要に応じて、ＡＴＰの代わりに、ＡＤＰまたはＡＭＰを反応溶媒中に添加してもよい。添加したＡＤＰやＡＭＰは、ＡＴＰ再生系によって系内ですぐにＡＴＰに再生されるため、実質的に、適度な量のＡＴＰを添加したのと同じ状態になるためである。また、これらを任意の割合で含有する混合物を添加してもよい。
　第２反応および第３反応は、必要に応じて、ＰｐｋによるＡＴＰ再生反応を共役させたＲｂｋによる第１反応と組み合わせてもよい。両者を組み合わせる場合、Ｒｂｋによる第１反応をまず行い、その反応液を原料として、Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応を行ってもよいし、Ｒｂｋによる第１反応と、Ｐｒｓによる第２反応およびＮａｍｐｔによる第３反応を同じ反応系で行ってもよい。
　Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応は、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させることにより行われる。
　Ｒｂｋによる第１反応は、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させることにより行われる。
　第３工程で用いる上記原料は、一般的な供給業者から購入したものを用いることもできるし、自ら反応を行って合成したものを用いることもできる。例えば、Ｒ５Ｐは、市販品を用いることもできるが、原料コストの観点から、Ｒｂｋによる第１反応、すなわち、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボースおよびポリリン酸と接触させることにより合成したものを用いることが好ましい。
　上記原料の一つであるポリリン酸は、種々の鎖長のものが知られている。本発明において使用するポリリン酸の鎖長は、ＡＴＰ再生反応が効率的に行えるものであれば如何なる鎖長のものでもよいが、溶解した際の溶液の粘度やコストの観点から、鎖長は３～１００程度が好ましく、３～３０程度がさらに好ましい。
　第３工程では、必要に応じて、上記原料以外の化合物を、所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物と接触させ、あるいは反応溶媒中（製造系内）に含めるようにしてもよい。例えば、各酵素が機能を発揮するための成分として、マグネシウムイオン等の金属イオンを含めることが適切である。また、バッファー成分を含めることも好ましい。
　用いる形質転換体が実質的に生きている場合、すなわち、細胞増殖能を維持している場合、実質的に形質転換体が増殖しない条件で反応を行うことが好ましい。そのような条件で反応を行うことにより、本反応における基質や生成物が、形質転換体の増殖に利用されたり、分解されたりすることなく、高い収率で目的生成物として生産されることが期待できる。実質的に形質転換体が増殖しない条件とは、実質的に反応系内の形質転換体の数が増加しない条件であれば如何なる条件でもよい。例えば、形質転換体が容易に利用可能な炭素源（グルコース等）を含まない溶液中で反応を行うことが挙げられる。
　反応溶媒中（製造系内）に含まれる、所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物の量、すなわち、より具体的にはＮａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋそれぞれの量は、適宜調節することができる。同様に、反応媒体中に含まれる、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、ポリリン酸、リボース、さらに必要に応じて用いられるその他の原料の量も、適宜調節することができる。反応溶媒中（製造系内）の上記各物質の濃度は次の通りである。
　Ｎａｍｐｔの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである。Ｐｒｓの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。Ｒｂｋの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。Ｐｐｋの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである。所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物の反応溶媒への添加量を適宜調整することにより、各酵素の反応溶媒中の濃度を上記の範囲に調節することが可能である。
　Ｒ５Ｐの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。リボースの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。ＮＡＭの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～５００ｇ／Ｌである。ＡＴＰの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。ポリリン酸の濃度は、例えば１μｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌである。これらの原料の反応溶媒への添加量などの調整により、各原料の反応溶媒中の濃度を上記範囲に調節することが可能である。反応溶媒への添加は、原料に応じて、第３工程の最初に一括で所定量を仕込むようにしてもよいし、第３工程の最初および／または途中の適切な段階で、順次所定量を添加するようにしてもよい。
　上述したような各物質の濃度以外の、酵素反応を進行させるための条件、例えば温度、時間なども、適宜調節することができる。反応温度は、各酵素の触媒効率が最適となる範囲で調節することが好ましい。反応時間は、目的化合物であるＮＭＮの生成量が所定の量に到達するまでとすることができる。
　生成したＮＭＮは、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。回収・精製の方法は、ＮＭＮの純度を向上させることができ、かつ効率的にＮＭＮを回収することができる方法であれば、如何なる方法を用いることもできるが、例えば、以下のような方法が挙げられる。ＮＭＮ合成反応後、菌体を用いて反応を行った場合は、遠心分離や膜ろ過等の手段により、菌体を除去することができる。あるいは、無細胞抽出物や精製酵素を用いて反応を行った場合は、限外ろ過膜によるろ過や、過塩素酸等を添加して沈殿させた後に遠心分離を行うこと等によってタンパク質等を除去することができる。過塩素酸による処理を行った場合は、水酸化カリウムなどによりpHを弱酸性に戻し、生じた過塩素酸カリウムの沈殿を再度遠心分離により除去する。菌体またはタンパク質を除去した後、必要に応じて、活性炭吸着による洗浄処理を行うことができる。ＮＭＮを含む水溶液を活性炭と接触させ、ＮＭＮを吸着させる。ろ紙等を用いてＮＭＮが吸着した活性炭をろ過した後、イソアミルアルコール等の溶媒で洗浄することで、一定の不純物を除去することができる。続いて、陰イオン交換樹脂により処理することで、さらに精製を行うことができる。ＮＭＮを含む溶液をＤｏｗｅｘ等の陰イオン交換樹脂に通し、吸着されたＮＭＮを水で溶出することができる。さらに、得られたＮＭＮ水溶液のｐＨを酸性にし、大量のアセトンを加えることで、ＮＭＮを沈殿として得ることができる。この沈殿を乾燥することで、精製されたＮＭＮを得ることができる。
　本発明は、反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下となるように行うことができる。これを行うための手段としては、結果として、ＮＭＮ製造のために添加するＡＴＰ等の使用量を削減することができれば、如何なる方法を用いることもできるが、例えば、以下に示す手段を単独でまたは適宜組み合わせて、実施することができる。
（１）ＡＴＰ再生系の共役
（２）ＰＰａｓｅの共存
（３）バクテリア由来Ｎａｍｐｔの利用
（４）不要遺伝子を破壊または欠失させた宿主の利用
（５）適切な基質濃度
６．３　ＰＰａｓｅの存在下でのＮａｍｐｔの発現強化
　本発明のＮＭＮの製造方法は、ＰＰａｓｅの存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させる工程を含むものであってもよい。
　本実施形態の工程は、以下の点を除き、６．２の実施形態と同様に、第１工程、第２工程および第３工程を順次行うことにより実施される。すなわち、第１工程および第２工程は、少なくともＮａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、当該酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を調製するとともに、ＰＰａｓｅの発現が強化された形質転換体乃至は特段発現は強化されていないが内在性酵素としてＰＰａｓｅを発現している微生物等、当該酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を調製するための工程とし、第３工程において、そのような第１工程および第２工程を経た形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液またはそれらの処理物を、少なくともＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させればよい点である。
　ＰＰａｓｅ（EC number: 3.6.1.1）は、ピロリン酸を２分子のリン酸に加水分解する酵素である。本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第二の発明群では、ＰＰａｓｅの存在下で、第３反応を行うことにより、第３反応を極めて効率的に進行させることができる。
　Ｎａｍｐｔによる第３反応では、ＮＭＮとともにピロリン酸が副生する。一般的な酵素反応の見地からは、第３反応系にＰＰａｓｅを加えることで、副生物であるピロリン酸がリン酸に分解され、ＮＭＮ生成方向の反応が促進されることは予測される。しかし、Ｎａｍｐｔの場合、必ずしもそれは自明ではない。なぜならば、ピロリン酸を分解してしまうと、Ｎａｍｐｔ反応が継続的に進行しない可能性があるからである。Ｎａｍｐｔは、ＡＴＰを加水分解して、自己リン酸化によって活性化されることが知られている。Ｎａｍｐｔによる第３反応が継続するためには、反応毎に自己リン酸化されたＮａｍｐｔの脱リン酸化が必要であり、ピロリン酸は、その脱リン酸化のトリガー物質であるとされている（Biochemistry 47, 11086-11096(2008)）。従って、ＰＰａｓｅによりピロリン酸を除去してしまうと、Ｎａｍｐｔの脱リン酸化が起きず、反応が継続しない可能性が十分に考えられる。しかし、第二の発明群では、第３反応をＰＰａｓｅの存在下で行うことにより、顕著に第３反応を促進することができる。
　ＰＰａｓｅとしては、例えば、酵母由来のもの（P00817）、大腸菌由来のもの（NP_418647）、枯草菌由来のもの（P37487）、Thermus thermophilus由来のもの（P38576）、Streptococcus gordonii由来のもの（P95765）、Streptococcus mutans（O68579）などが挙げられる。
　ＰＰａｓｅは、第３反応系に加えることが可能であればいかなる形態でもよく、またいかなる方法で調製してもよい。具体的には、まず、第一の発明群における第１工程と同様に、ＰＰａｓｅをコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる。また、ＰＰａｓｅは、通常の微生物等においては、生存に必要な酵素として一定量発現しているため、特段発現が強化されていない微生物等を培養して、そのまま用いることができる。続いて、第一の発明群における第２工程と同様に、第１工程を経た形質転換体、特段発現が強化されていない微生物等または無細胞タンパク質合成反応液から処理物を調製することができる。あるいは、処理物の一態様として市販のＰＰａｓｅ精製酵素を利用することもできる。市販のＰＰａｓｅ精製酵素としては、シグマ・アルドリッチ社の酵母由来ＰＰａｓｅ精製酵素（製品番号10108987001）などが挙げられる。
　上記のようにして得られたＰＰａｓｅの存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させることで、第二の発明群によるＮＭＮの製造方法を実施することができる。第二の発明群により、第３反応を極めて効率的に進行させることができ、ＮＭＮを効率的に製造することができる。第二の発明群による第３反応は、第３反応単独で行うこともできるが、第１反応、第２反応およびＡＴＰ再生反応の一つ以上の反応と組み合わせて、同一の反応系で行うこともできる。換言すれば、本発明の第一の発明群における第３反応の実施形態を、本発明の第二の発明群で規定する第３反応とすることにより、第一の発明群および第二の発明群を統合したＮＭＮの製造方法を実施することも可能である。
　用いる形質転換体が実質的に生きている場合、すなわち、細胞増殖能を維持している場合、実質的に形質転換体が増殖しない条件で反応を行うことが好ましい。そのような条件で反応を行うことにより、本反応における基質や生成物が、形質転換体の増殖に利用されたり、分解されたりすることなく、高い収率で目的生成物として生産されることが期待できる。実質的に形質転換体が増殖しない条件とは、実質的に反応系内の形質転換体の数が増加しない条件であれば如何なる条件でもよい。例えば、形質転換体が容易に利用可能な炭素源（グルコース等）を含まない溶液中で反応を行うことが挙げられる。
　本発明における第２工程の形態としては、特に処理物が精製酵素であることが好ましい。精製酵素を用いることで、反応物（基質）や生成物の分解または副反応が抑制できるため、本発明による第３反応の促進効果をより享受することができる。
６．４　特定酵素の破壊
　本発明のＮＭＮの製造方法は、（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させる工程を含むものであってもよい。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
　本実施形態の工程は、以下の点を除き、６．２の実施形態と同様に、第１工程、第２工程および第３工程を順次行うことにより実施される。すなわち、第１工程および第２工程は、各種ＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子が破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を調製するための工程とし、第３工程において、そのような第１工程および第２工程を経た形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともＮＡＭと接触させればよい点である。
６．５　ＡＴＰ使用量の削減
　本発明のＮＭＮの製造方法は、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にするものであってもよい。
　Ｎａｍｐｔが触媒する反応自体にＡＴＰは必須ではない。しかし、先述のように、ＮａｍｐｔにはＡＴＰ加水分解活性があり、ＡＴＰの加水分解によってＮａｍｐｔが自己リン酸化され、ＮＭＮ生成に有利な方向に酵素学的パラメータや化学平衡が変化する。従って、第３反応系内にＡＴＰが十分に存在する場合は、ＰＲＰＰからのＮＭＮの生成に伴い、実質的に、１モルのＰＲＰＰの生成につき、１モル以上のＡＴＰが使用されることになる。すなわち、Ｒ５Ｐを原料とした第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においては、１モルのＮＭＮの生成につき、計２モル以上のＡＴＰが、リボースを原料とした第１反応、第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においては、１モルのＮＭＮの生成につき、計３モル以上のＡＴＰが使用されることになる。
　ＡＴＰは高価な化合物であるため、ＮＭＮを安価に製造しようとする場合、その使用量はできるだけ少ないほうが望ましい。すなわち、本発明のＮＭＮの製造方法において、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にすることが好ましい。
　具体的には、以下に示す手段を、単独でまたは適宜組み合わせて、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にする。
（１）ＡＴＰ再生系の共役
　副生したＡＤＰまたはＡＭＰをＡＴＰに再生することができる系を、少なくとも、第２反応および第３反応を含むＮＭＮ生成反応系と共役させることで、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。ＡＴＰ再生系としては、ＡＭＰおよびＡＤＰからＡＴＰを再生できる系であればいかなる系でもよく、例えば、ポリリン酸をリン酸源としてＰｐｋを用いる系、ホスホエノールピルビン酸をリン酸源としてピルビン酸キナーゼを用いる系、クレアチンリン酸をリン酸源としてクレアチンリン酸キナーゼを用いる系等が挙げられるが、リン酸源のコストの観点からは、ポリリン酸をリン酸源としてＰｐｋを用いる系が好ましい。ポリリン酸とＰｐｋを用いたＡＴＰ再生系を共役させたＮＭＮ生成反応は、具体的には、第一の発明群における第３工程に記載されたように実施することができる。
（２）ＰＰａｓｅの共存
　ＮＭＮ生成反応系にＰＰａｓｅを共存させることにより、副生物であるピロリン酸がリン酸に分解され、ＮＭＮ生成方向の反応が促進されることで、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。ＰＰａｓｅを共存させたＮＭＮ生成反応は、具体的には、第二の発明群に記載されたように実施することができる。
（３）バクテリア由来Ｎａｍｐｔの利用
　第３反応を触媒する酵素Ｎａｍｐｔとして、バクテリア由来のＮａｍｐｔを用いることにより、ＮＭＮの生成が効率的に進行し、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。バクテリア由来のＮａｍｐｔとしては、第一の発明群における第１工程に記載されたものを利用することができる。
（４）不要遺伝子を破壊または欠失させた宿主の利用
　形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物を用いてＮＭＮの生成反応を行う場合、反応物（基質）や生成物の分解、あるいは副反応の原因となる遺伝子を破壊または欠失させた宿主を用いることができる。具体的には、第一の発明群における第１工程に記載された遺伝子のいずれか一つ以上を、破壊または欠失させた宿主を用いることができる。好ましくは、６．４に記載された遺伝子破壊または欠失させた宿主を用いることができる。
（５）適切な基質濃度
　化学平衡や酵素の基質親和性の観点から、反応系内のリボースやＮＡＭ濃度を高めることによって、ＮＭＮ生成速度や生成量の向上が期待でき、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。一方、ＡＴＰも、反応系内の濃度を高めることによって、同様の効果は期待できるが、必要以上にＡＴＰを添加しても、それに見合ったＮＭＮ生成量の増加がなければ、ＮＭＮを１モル生成させるために用いるＡＴＰのモル数は増加してしまう。すなわち、適切な量のＡＴＰを反応系に添加することで、効率的にＮＭＮを製造することができる。反応系に添加するＡＴＰのモル数は、生成するＮＭＮのモル数の１当量以下が好ましく、０．５当量以下がより好ましく、０．１当量以下がさらに好ましい。
　以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］Namptライブラリの作成及びスクリーニング
　本実施例では、所定の各酵素としてWO2019/065876に記載されている下記のものを用いた。
　Nampt：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）
　Prs：Bacillus subtilis由来Leu135Ile変異体（BsPrsL135I）
　Ppk：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）
　Rbk：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）
　PPase：Escherichia coli由来 (NP_418647)
（1）Nampt変異体ライブラリの構築
表１に記載したpEHdNampt(WO2019/065876、配列番号３)を鋳型として、指定したアミノ酸残基に対応する塩基配列にランダム変異を導入した。変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Nampt変異体名を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　変異導入PCR反応は、表３に示す反応液組成および表４に示す反応条件にて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　PCR反応終了後、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン）を用い、添付プロトコールに従ってPCR産物を精製した。生成したPCR産物をDpnI（New England Biolabs）で消化した反応液を用いて、大腸菌JM109（タカラバイオ）を形質転換した。出現したコロニーを回収後、プラスミド抽出を行い、プライマーT7-PP（配列番号35）およびT7-TP（配列番号36）を用いて塩基配列の確認を行った。正しくライブラリが導入された各プラスミドを表２に記載した各Namptライブラリプラスミドとした。
　（２）Namptライブラリの発現及び無細胞抽出物の調製
大腸菌（E. coli）BN8株のコンピテントセル(WO2019/065876)を氷上で融解し、（１）で作製した各プラスミドDNA溶液を混合して氷上で10分間静置した。42℃で20秒間ヒートショックを加えた後、再度氷冷し、SOC培地を添加した。37℃で１時間振とう培養を行った後、LB寒天培地（カナマイシン硫酸塩50mg/L含有）に塗布し、37℃で一晩静置培養を行った。得られたコロニーを各酵素の発現が強化された組換え体とした。シングルコロニーをLB培地（カナマイシン硫酸塩50mg/L含有）が200uL入った96ウェルのディープウェルプレートにとり、37℃で一晩振盪培養を行った。70uLの前培養を用いて630uLの本培養(LB培地、カナマイシン硫酸塩50mg/L及びIPTG0.5mＭ終濃度を含有)を植菌し、16℃、1250rpm、24時間若しくは25℃、1250rpm、18時間培養した。培養した大腸菌を遠心(5000rpm、 4℃、１５分)により集菌し、上清を除いた。回収したペレットを200uLの溶解バッファー (100 mM Kpi pH8.5, 1mg/ml Lysozyme, 0.5mg/ml Polymyxin B, 0.05mg/ml DNase)に懸濁し、室温、900rpmで20分間振盪した。遠心(4900rpm, 10min, 4℃)により不溶物を除き、上清を無細胞抽出液として反応に用いた。
（３）Prs, Rbk, Ppkの発現及び無細胞抽出物の調製
　（２）と同様に各プラスミドpEBsPrs、pEScRbk、pESDrPpk(WO2019/065876)を大腸菌（E. coli）BN8株のコンピテントセルに加え、氷上で10分間静置した。42℃で20秒間ヒートショックを加えた後、再度氷冷し、SOC培地を添加した。37℃で１時間振とう培養を行った後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン硫酸塩50mg/L含有）に塗布し、37℃で一晩静置培養を行った。得られたコロニーを各酵素の発現が強化された組換え体とした。シングルコロニーをＬＢ培地（カナマイシン硫酸塩50mg/L含有）が2mL入った培養チューブにとり、37℃で一晩振盪培養を行った。1mLの前培養を用いて100ｍＬの本培養(LB培地、カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌ含有)を植菌し、37℃で振盪培養した。OD600が0.8に達した時点で、終濃度が0.5mＭになるようIPTGを加え、25℃、1250rpm、18時間培養した。培養した大腸菌を遠心(8000rpm、 4℃、15分)により集菌し、上清を除いた。回収したペレットを10ｍＬの溶解バッファー (100 mM Kpi pH8.5, 1mg/ml Lysozyme, 0.5mg/ml Polymyxin B, 0.05mg/ml DNase)に懸濁し、室温、900rpmで20分間振盪した。遠心(8000rpm, 10min, 4℃)により不溶物を除き、上清を無細胞抽出液として反応に用いた。
（４）NMN合成反応
　（２）、（３）で調製した無細胞抽出物を用いてNMN合成反応を行った。反応液量を100μLとし、以下に示す組成で各反応液を調製し、37℃で静置反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　反応時間2時間及び17時間において、各サンプル5μLを新しいプレートに移し、これを245uLの50%メタノール水溶液(1mM EDTA)で希釈し、HPLC分析を行った。
　（５）NMNの分析
　NMN合成反応サンプルの分析は、HPLCにより以下の条件で行った。
カラム：　Shodex Asahipak NH2P-50 4B
ガードカラム：　Shodex Asahipak NH2P-50G 4A
移動相：　25mM ギ酸アンモニウム　水溶液
流速：　1ml/min　(3.2-3.3 Mpa)
検出：　UV261nm
カラム温度：４０℃
　各サンプルに関してNAMとNMNの比からNMN変換率(%)を算出し、NMN変換率が野生型のそれよりも高かったものについては、変異箇所における塩基配列の決定を行った。
　（６）実験結果
　野生型のNMN変換率を100％とした場合の各変異体の活性相対比を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記結果より各ライブラリから野生型Namptよりも高活性な改良型Namptを得た。Namptを使用したNMN合成において、Namptが律速酵素となっており、その原料コストが高く、問題となっていた。本発明の改良型Namptは、上記のように野生型よりも高活性な為、その使用量を抑えることが可能である。これにより、Nampt原料コストを30から40％程度削減することが可能である。
［実施例２］＜Nampt優良変異の組合せ＞
　実施例１の優良変異の組合せを行った。
（１）Nampt優良変異組合せライブラリの構築
　表１に記載したpEHdNamptを鋳型として、指定したアミノ酸残基に対応する塩基配列に縮退コドンを用いてランダム変異を導入した。変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Nampt変異体名を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　変異導入PCR反応、Namptライブラリの発現及び無細胞抽出物の調製、及びNMN合成反応は実施例１と同様の方法で行った。
（２）実験結果
　野生型のNMN変換率を100％とした場合の各変異体の活性相対比を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記結果より優良変異を組合わせることで、野生型Namptよりも高活性な改良型Namptを得た。上記と同様、これによりNampt原料コストを30から40％程度削減することが可能である。
［実施例３］＜他種由来Namptへの優良変異導入＞
　本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
　Nampt：Meiothermus ruber由来（A0A0S7ALY5）　Nampt：Sphingopyxis sp. C-1由来（A0A0M9TZ33）
（1）Nampt変異体の構築
各酵素の発現プラスミドを以下のように作製した。表1の「由来」に記載された生物種由来の各酵素について、同表中の「アミノ酸配列」に記載された各配列番号で示されるアミノ酸配列から成る各酵素タンパク質をコ一ドするDNA(表1の「塩基配列」に記載された各配列番号で示される塩基配列から成る）を合成し、それぞれ発現べクタ一pET-26b(+)(Novagen)のNdeI-XhoIサイ卜にクロ一ニングした（遺伝子合成はジェンスクリプトジャパンで実施、大腸菌発現用にコドンを最適化）。得られた各プラスミドを、各酵素の「発現プラスミド」と命名した。前述プラスミドを鋳型として、指定したアミノ酸残基に変異を導入した。変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Nampt変異体名を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　変異導入PCR反応、Namptライブラリの発現及び無細胞抽出物の調製、及びNMN合成反応は実施例１と同様の方法で行った。各野生型NamptのNMN変換率を100％とした場合の各変異体の活性相対比を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドの工業的生産において有用である。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
配列番号1：モチーフ配列
配列番号2：モチーフ配列
配列番号25：プライマー（Nampt_S247X-F）
配列番号26：プライマー（Nampt_S247X-R）
配列番号27：プライマー（Nampt_E248X-F）
配列番号28：プライマー（Nampt_E248X-R）
配列番号29：プライマー（Nampt_S253X-F）
配列番号30：プライマー（Nampt_S253X-R）
配列番号31：プライマー（Nampt_V278X-F）
配列番号32：プライマー（Nampt_V278X-R）
配列番号33：プライマー（Nampt_T281X-F）
配列番号34：プライマー（Nampt_T281X-R）
配列番号35：プライマー（T7-PP）
配列番号36：プライマー（T7-TP）
配列番号37：プライマー（Nampt_S247Z-F）
配列番号38：プライマー（Nampt_S247Z-R）
配列番号39：プライマー（Nampt_S253U-F）
配列番号40：プライマー（Nampt_S253U-R）
配列番号41：プライマー（Nampt_V278J_T281B-F）
配列番号42：プライマー（Nampt_V278J_T281B-R）
配列番号43：プライマー（MrNampt_M230T-F）
配列番号44：プライマー（MrNampt_M230T-R）
配列番号45：プライマー（MrNampt_E231G-F）
配列番号46：プライマー（MrNampt_E231G-R）
配列番号47：プライマー（MrNampt_V264A-F）
配列番号48：プライマー（MrNampt_V264A-R）
配列番号49：プライマー（SpNampt_E227G-F）
配列番号50：プライマー（SpNampt_E227G-R）

Claims (10)

  1. 　改変型ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）であって、下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、
    　野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している、改変型Ｎａｍｐｔ。
    （ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ１-Ｘ２-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ３
    （ｂ）配列番号２：　Ｘ４-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ５
    　但し、Ｘ１～Ｘ５の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ２はＡ及びＱ以外のアミノ酸であり、Ｘ３はＭ以外のアミノ酸を表す。また、[　]は[　]内のアミノ酸のいずれか一つを表す。
  2. 　下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、改変型Ｎａｍｐｔ：
    　野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している、改変型Ｎａｍｐｔ。
    （ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ１-Ｘ２-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ３
    （ｂ）配列番号２：　Ｘ４-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ５
    　但し、Ｘ1～Ｘ5の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ1は中性アミノ酸及び脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ2は脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸及び中性の親水性アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ3は非極性アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ4は脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ５は芳香族アミノ酸以外のアミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸を表す。また、[　]は[　]内のアミノ酸のいずれか一つを表す。
  3. 　改変型ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）であって、下記配列番号１に示されるアミノ酸配列及び／又は下記配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、
    　野生型Ｎａｍｐｔよりも活性が向上している、改変型Ｎａｍｐｔ。
    （ａ）配列番号１：　Ｓ-[Ｖ/Ｉ]-Ｐ-Ａ-Ｘ1-Ｘ2-Ｈ-Ｓ-[Ｔ/Ｖ/Ｉ]-[Ｍ/Ｖ/Ｉ]-Ｘ3
    （ｂ）配列番号２：　Ｘ4-[Ｓ/Ｉ]-Ｄ-Ｘ5
    　但し、Ｘ1、Ｘ4、Ｘ5の少なくとも１つは野生型のアミノ酸とは異なり、Ｘ1は中性アミノ酸及び脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ4は脂肪族アミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸、Ｘ5は芳香族アミノ酸以外のアミノ酸から選ばれるいずれかのアミノ酸を表す。Ｘ2及びＸ3はいずれのアミノ酸でも良い。また、[　]は[　]内のアミノ酸のいずれか一つを表す。
  4. 　改変型Ｎａｍｐｔのアミノ酸配列を、配列番号３で示されるアミノ酸配列とアライメントしたときに、
    　前記配列番号１で示されるアミノ酸配列が、配列番号３の２４３番目～２５３番目に該当する位置に存在し、
    　前記配列番号２で示されるアミノ酸配列が、配列番号３の２７８番目～２８１番目に該当する位置に存在する、請求項１～３のいずれか１項に記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
  5. 　以下の１）～５）から選ばれる１又は２以上の置換を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
    １）Ｘ１における野生型アミノ酸のＴへの置換
    ２）Ｘ２における野生型アミノ酸のＧへの置換
    ３）Ｘ３における野生型アミノ酸のＧ又はＡへの置換
    ４）Ｘ４における野生型アミノ酸のＡへの置換
    ５）Ｘ５における野生型アミノ酸のＳ、Ａ、Ｎ、又はＩへの置換
  6. 　前記改変型Ｎａｍｐｔの野生型配列が、以下の（１）又は（２）のアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
    （１）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれかに示されるアミノ酸配列
    （２）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、Ｎａｍｐｔ活性を有するタンパクをコードするアミノ酸配列
  7. 　前記改変型Ｎａｍｐｔが、 Haemophilus属、Meiothermus属、Xanthomonas属、Sphingopyxis属、Sphingopyxis属、Chitinophaga属、Burkholderia属、Pedobacter属、Microbulbifer属、Labrenzia属、Luteibacter属由来である、請求項１～６のいずれか１項に記載の改変型Ｎａｍｐｔ。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の改変型Ｎａｍｐｔの存在下で、ホスホリボシルピロホスファート及びニコチンアミドを接触させることにより、ニコチンアミドモノヌクレオチドを製造する方法。
  9. 　ホスホリボシルピロホスファートがホスホリボシルピロリン酸シンターゼの存在下にリボース-５-リン酸から製造されたものである、請求項８に記載の方法。
  10. 　リボース-５-リン酸がリボキナーゼの存在下にリボースから製造されたものである、請求項９記載の方法。
     

     
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