KR20150071011A - 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주를 사용하여 고제로틴을 생산하는 방법 - Google Patents

스트렙토미세스 미크로플라부스 균주를 사용하여 고제로틴을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 및 식물의 질병 또는 해충을 방제하기 위한 그의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것에 의해 수득되는 발효 브로쓰에 관한 것이며, 여기서 발효 브로쓰는 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유한다. 본 발명은 또한 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰를 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 발효 브로쓰는 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유하고, 상기 방법은 호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 적어도 1 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 아미노산을 함유한다. 본 개시내용은 또한 스트렙토미세스 미크로플라부스로부터의 고제로틴 생합성 유전자 클러스터의 분자적 클로닝 및 유전자 클러스터 내의 개개의 유전자 뿐만 아니라 그에 의해 코딩되는 단백질의 확인에 관한 것이다. 13개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 고제로틴 유전자 클러스터는 스트렙토미세스 미크로플라부스의 유전자좌 내에 위치한다.

Description

스트렙토미세스 미크로플라부스 균주를 사용하여 고제로틴을 생산하는 방법 {PROCESS FOR PRODUCING GOUGEROTIN EMPLOYING STREPTOMYCES MICROFLAVUS STRAINS}
본 발명은 식물 질병 및 해충을 방제하는 박테리아 균주 및 그의 능력의 분야에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 복사물은 2013년 10월 10일에 작성되고 175 킬로바이트의 크기를 갖는 것으로 파일명 "250-US_ST25.txt"로 ASCII-포맷의 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었고, 본 명세서와 함께 제공된다. 이러한 ASCII-포맷의 문서에 담긴 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
초식응애, 특히 잎응애는 과수원, 온실, 및 페퍼, 토마토, 감자, 호박, 가지, 오이 및 딸기를 비롯한 많은 채소 및 과실 작물의 주요 농업 해충이다. 응애는 그의 날카로운 구기를 사용하여 잎 및/또는 과실 표면을 손상시킨다. 식물 부분에 대한 직접적인 손상 (반점화로 지칭됨) 이외에도, 응애 섭식은 또한 식물 질병에 대한 증가된 감수성을 또한 유발한다.
응애는 곤충보다는 진드기이고, 소수의 광범위한 살곤충제가 응애에 대해 또한 효과적이다. 응애 및 이용가능한 살응애제의 특성은 응애 방제에 대한 도전과제를 제안한다. 예를 들어, 응애의 가장 경제적으로 중요한 패밀리 중 하나인 잎응애는 일반적으로 식물 잎의 아랫면에 살아서 처리하기 곤란하다. 또한, 응애는 2 내지 4년 이내의 현재 이용가능한 살응애제에 대해 내성이 생긴 것으로 공지되어 있고, 살응애제 중 많은 것은 단일 작용 방식을 갖는다. 소수의 이용가능한 살응애제는 응애 충란에 대한 활성을 가지며, 반복적인 적용을 필요로 한다. 따라서, 양호한 녹다운 활성에 더하여 엽신통과, 살란 및 강력한 잔효 활성을 갖는 신규 살응애제에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 스트렙토미세스 미크로플라부스(Streptomyces microflavus) 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 (균주)를 제공한다. 한 실시양태에서, 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 M이다. 본 발명은 스트렙토미세스 푸니세우스(Streptomyces puniceus) 균주 A 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균 돌연변이체 (균주)를 또한 제공한다.
본 발명은 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균 돌연변이체 (균주)를 함유하는 조성물을 또한 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주의 발효 생성물이다. 본 발명은 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균 돌연변이체 (균주)를 함유하는 조성물을 또한 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주의 발효 생성물이다.
본 발명은 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주을 배양하는 것에 의해 수득되는 발효 생성물을 또한 제공하며, 여기서 발효 생성물은 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유한다.
적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유하는 발효 브로쓰가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 발효 브로쓰는 어떤 하류 프로세싱도 거치지 않는다. 특정한 실시양태에서, 발효 브로쓰는 스트렙토미세스 균주로부터의 것이다. 본 발명에 적합한 스트렙토미세스 균주의 유형이 본원에 보다 상세하게 기재된다.
고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주의 발효 생성물이 또한 제공되며, 여기서 발효 생성물은 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 포함한다. 한 실시양태에서, 발효 생성물은 발효 브로쓰이다. 적어도 약 1 g/L, 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L, 적어도 약 6 g/L, 적어도 약 7 g/L 또는 적어도 약 8 g/L 고제로틴을 함유하는 발효 브로쓰가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 발효 브로쓰는 고제로틴을 약 1 g/L 내지 약 15 g/L의 농도로 함유한다. 한 실시양태에서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 에스. 미크로플라부스(S. microflavus), 에스. 그리세우스(S. griseus), 에스. 아눌라투스(S. anulatus), 에스. 피미카리우스(S. fimicarius), 에스. 파르부스(S. parvus), 에스. 라벤둘라에(S. lavendulae), 에스. 알보비리디스(S. alboviridis), 에스. 푸니세우스(S. puniceus) 또는 에스. 그라미네아루스(S. graminearus)이다. 또 다르게는, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 예에서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 모든 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 및 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 모든 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다르게는, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 및 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 모든 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 및 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 예에서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 및 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 모든 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주이다. 또 다르게는, 이는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주이다. 또 다르게는, 이는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 M이다.
본 발명은 호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 적어도 0.5 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 아미노산을 함유하는 것인, 적어도 약 0.5 g/L 고제로틴을 함유하는 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰를 생산하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 적어도 1 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 아미노산을 함유하는 것인, 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유하는 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰를 생산하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 돌연변이체 균주를 식물, 식물의 부분 및/또는 식물의 생육지에 적용하는 것을 포함하는, 식물 질병 또는 해충을 방제하기 위해 식물을 처리하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 균주의 발효 생성물 또는 그로부터 유래된 돌연변이체의 발효 생성물이 식물 및/또는 식물의 생육지에 적용된다.
본 발명은 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주를 비롯한 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주를 식물, 식물의 부분 및/또는 식물의 생육지에 적용하는 것을 포함하는, 식물 질병 또는 해충을 방제하기 위해 식물을 처리하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 균주의 발효 생성물 또는 그로부터 유래된 돌연변이체의 발효 생성물이 식물 및/또는 식물의 생육지에 적용된다.
본 발명은 식물 또는 식물 주위의 토양에 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 균주를 비롯한 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주를 적용하는 것을 포함하는, 초식진드기 또는 곤충을 방제하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 균주의 발효 생성물 또는 그로부터 유래된 돌연변이체의 발효 생성물이 식물 및/또는 식물의 생육지에 적용된다.
호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 적어도 1 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 아미노산을 함유하는 것인, 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유하는 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 배양 배지가 고제로틴을 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5g/L, 적어도 약 6 g/L, 적어도 약 7 g/L 또는 적어도 약 8 g/L 고제로틴의 농도로 함유할 때까지 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양한다. 또 다르게는, 배양 배지가 고제로틴을 약 1 g/L 내지 약 15 g/L 고제로틴 범위의 농도로 함유할 때까지 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양한다.
발효 브로쓰를 생산하는 상기 방법의 한 실시양태에서, 아미노산은 글리신, 글루탐산, 글루타민, 세린 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 예에서, 배양 배지는 아미노산을 적어도 약 2 g/L의 초기 농도로 함유한다. 특정한 예에서, 배양 배지는 글리신 및/또는 글루탐산을 약 5 g/L 내지 약 15 g/L의 초기 농도로 함유한다.
상기 기재된 바와 같은 배양 배지는, 한 실시양태에서, 탄소원으로서 글루코스 및 올리고사카라이드의 혼합물을 함유한다. 한 예에서, 올리고사카라이드는 말토덱스트린 또는 덱스트린이다. 특정한 예에서, 배양 배지 중 초기 말토덱스트린 농도는 약 50 g/L 내지 약 100 g/L이다. 또 다르게는, 초기 말토덱스트린 농도는 약 60 g/L 내지 약 80 g/L이다.
한 실시양태에서, 배양 배지 중 초기 글루코스 농도는 약 20 g/L 내지 60 g/L 또는 약 30 g/L 내지 약 50 g/L이다.
한 실시양태에서, 배양 배지는 탄산칼슘을 약 1 g/L 내지 3 g/L의 초기 농도로 함유한다.
한 실시양태에서, 질소원은 대두 펩톤, 대두 산 가수분해물, 대두 분말 가수분해물, 카세인 가수분해물, 효모 추출물 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 적어도 부분적으로 선택된다.
상기 기재된 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주 중 임의의 것이 본 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.
호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 하나 이상의 아미노산을 약 1 g/L, 약 2 g/L, 약 3 g/L, 약 4 g/L, 약 5 g/L, 약 6 g/L, 약 7 g/L, 약 8 g/L, 약 9 g/L, 또는 약 10 g/L 미만으로 함유하는 배양 배지에서 달성된 고제로틴 농도보다 적어도 2배 더 높은 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 아미노산을 함유하는 것인, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰 내에서 고제로틴 수준을 증진시키는 방법이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 배양 배지에 사용되는 아미노산은 글루탐산, 세린 및/또는 글리신이다. 한 실시양태에서, 증진된 수준의 고제로틴을 수득하는데 사용되는 배양 배지 (즉, 증진된 배양 배지) 중의 아미노산 농도는 약 2 g/L 내지 약 15 g/L이고, 달성되는 고제로틴 농도는 출발 배양 배지에서 달성되는 것보다 적어도 2배이며, 한 실시양태에서 출발 배양 배지는 증진된 배양 배지에 함유되어 있는 아미노산의 약 ½ 이하의 농도를 함유한다.
상기 기재된 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주 중 임의의 것이 본 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 스트렙토미세스 미크로플라부스로부터의 (구체적으로 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550으로부터의) 고제로틴 생합성 유전자 클러스터, 유전자 클러스터 내의 개개의 유전자의 특성, 및 그에 의해 코딩된 단백질을 또한 제공한다. 스트렙토미세스 미크로플라부스로부터의 고제로틴 유전자 클러스터가 개시되며, 유전자 클러스터는 각각 오픈 리딩 프레임 (ORF) 4251 내지 4253, 4255 내지 4259, 4261 내지 4265, 및 4271 (각각 서열 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 및 41)로 지칭되고, 본원에서 각각 GouA, GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, GouM, 및 GouN으로 지칭되는 14개의 ORF를 포함한다. 상응하는 단백질은 각각 서열 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 30, 및 42로 제공된다. 스트렙토미세스 미크로플라부스로부터의 고제로틴 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 게놈 DNA 서열 및 일부 플랭킹 영역이 서열 43으로 제공되고, 유전자 GouA에서 GouN까지의 위치를 기재한다.
본 발명은 스트렙토미세스 푸니세우스로부터의 (구체적으로 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A로부터의) 부분적인 고제로틴 생합성 유전자 클러스터, 유전자 클러스터 내의 개개의 유전자의 특성, 및 그에 의해 코딩된 단백질을 또한 제공한다. 스트렙토미세스 푸니세우스로부터의 부분적인 고제로틴 유전자 클러스터가 개시되며, 개시된 유전자 클러스터는 각각 오픈 리딩 프레임 (ORF) (각각 서열 89-100)로 지칭되고, 본원에서 각각 GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, GouM으로 지칭되는 12개의 ORF를 포함한다. 이들은 각각 서열 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 및 29로 제공되고 본원에서 각각 GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, 및 GouM으로 지칭되는 유전자의 오르토로그이다. 상응하는 단백질은 각각 서열 77-88로 제공된다. 스트렙토미세스 푸니세우스로부터의 고제로틴 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 게놈 DNA 서열은 서열 76으로 제공된다.
서열 43의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로서, 상기 서열의 발현을 지시하는 적어도 하나의 외인성 및/또는 이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된 핵산 서열이 또한 제공된다. 핵산 서열은 서열 43의 위치 10820 내지 위치 12013의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있고/거나, 서열 43의 위치 13219 내지 위치 14334의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 에스. 미크로플라부스, 에스. 그리세우스, 에스. 아눌라투스, 에스. 피미카리우스, 에스. 파르부스, 에스. 라벤둘라에, 에스. 알보비리디스, 에스. 푸니세우스, 또는 에스. 그라미네아루스로부터 단리될 수 있다.
직전 단락에서의 그것을 비롯한, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 상기 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 발현 벡터, 뿐만 아니라 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
스트렙토미세스 속의 고제로틴 또는 고제로틴-생산 박테리아를 배지에서 배양하여 상기 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 생산하고 배지로 배출하게 하는 단계, 및 배지로부터 상기 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 수집하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 박테리아는 서열 43의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 발현을 증진시키기 위해 변형된 것인, 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 생산하는 방법이 제공된다. 박테리아는 에스. 미크로플라부스, 에스. 그리세우스, 에스. 아눌라투스, 에스. 피미카리우스, 에스. 파르부스, 에스. 라벤둘라에, 에스. 알보비리디스, 에스. 푸니세우스, 및 에스. 그라미네아루스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하기 단계: a) 서열 43의 핵산 서열을 함유하고, 서열 43의 위치 10820 내지 위치 12013의 뉴클레오티드 서열을 추가로 함유하고/거나, 서열 43의 위치 13219 내지 위치 14334의 뉴클레오티드 서열을 추가로 함유하는 재조합 발현 벡터를 구축하는 단계; b) 단계 a)의 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환체를 생산하는 단계; c) 단계 b)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 d) 단계 c)의 형질전환체의 배양 생성물로부터 상기 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 단리 및 정제하는 단계를 포함하는 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 제조하는 방법이 제공된다.
서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 원핵 세포가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 원핵 세포가 제공된다.
서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 원핵 세포가 또한 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 서열 88로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 원핵 세포가 제공된다.
서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로서, 외인성 제한 효소 절단 부위를 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산 서열이 또한 제공된다.
도 1은 균주의 희석된 발효 생성물을 2-점박이응애로 감염된 리마콩 식물의 잎에 분무한 경우의, 박테리아 후보 균주의 UV 안정성 테스트의 결과를 나타낸다. 연회색 칼럼 (각각의 균주에 대해 아래의 칼럼)은 UV 광 조사가 없는 경우의 항-살응애 활성을 나타내고, 진회색 칼럼 (각각의 균주에 대해 위의 칼럼)은 24시간 동안 UV 광 조사 후의 항-살응애 활성을 나타낸다. 제5일에, 응애 및 충란의 존재에 대해 1 내지 4의 척도로 식물을 평가하였다.
도 2는 균주의 희석된 발효 생성물을 2-점박이응애로 감염된 리마콩 식물의 잎에 분무한 경우의, 테스트된 박테리아 후보 균주의 엽신통과 활성에 대한 테스트 결과를 나타낸다. 연회색 칼럼 (각각의 균주에 대해 아래의 칼럼)은 엽신통과 (항-살응애) 활성을 나타내고, 진회색 칼럼 (각각의 균주에 대해 위의 칼럼)은 전반적인 항-살응애 활성을 나타낸다. 제6일에, 응애 및 충란의 존재에 대해 1 내지 4의 척도로 식물을 평가하였다.
도 3은 모 균주와 비교하여 1 L 진탕 플라스크에서 성장시킨 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 돌연변이체에서의 증가된 고제로틴 생산을 나타낸다.
도 4는 모 균주와 비교하여 5 L 생물반응기에서 성장시킨 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 돌연변이체에서의 증가된 고제로틴 생산을 나타낸다.
도 5는 고제로틴, 뿐만 아니라 그의 세린, 당, 시토신, 및 사르코신 서브도메인의 화학 구조를 나타낸다.
도 6은 고제로틴에 대한 잠재적인 생합성 경로를 나타낸다.
도 7은 고제로틴의 특정한 서브도메인 구조에 잠재적으로 관여하고/거나 그를 담당하는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 번호를 표시한 고제로틴의 화학 구조를 나타낸다.
도 8은 고제로틴 생합성 유전자 클러스터의 구성을 나타낸다.
도 9는 아가로스 겔 전기영동을 통해 분해된 명명된 프라이머 쌍 (프라이머 쌍 명칭에 대해서는 서열 목록 참조)의 PCR 산물을 나타낸다. MW = 1 kDa 분자량 래더. C = 16S 양성 대조군. gouC1은 서열 44 및 45의 프라이머로부터의 것이다. gouC2는 서열 46 및 47의 프라이머로부터의 것이다. gouD는 서열 48 및 49의 프라이머로부터의 것이다. gouG1은 서열 50 및 51의 프라이머로부터의 것이다. gouG2는 서열 52 및 53의 프라이머로부터의 것이다. gouI1은 서열 54 및 55의 프라이머로부터의 것이다. gouF2는 서열 56 및 57의 프라이머로부터의 것이다.
도 10은 pUC118 벡터의 개략적 다이어그램이다.
도 11은 pKC1139 셔틀 벡터의 개략적 다이어그램이다.
도 12는 아가로스 겔 전기영동을 통해 분해된, 상이한 프라이머 세트를 사용한 PCR로부터의 PCR 산물을 나타낸다. I = gouI 프라이머; G = gouG 프라이머; Ia = 아프라마이신 내성과의 단일 교차; IKI (GouIup 및 gouIdown 함유), CKW (gouCup 및 gouwholeclusterdown 함유), 및 CKI (gouCup 및 gouIdown 함유)는 모두 카나마이신-내성 이중 교차이다.
서열 목록
<표 1>
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

Figure pct00004
임의의 도면 및 첨부물을 비롯한 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은, 각각의 개별 공개문헌 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타내어지는 것과 같은 정도로 본원에 참고로 포함된다.
하기 기재는 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 현재 본원에 청구된 발명과 관련된 것임을 인정하거나, 또는 구체적으로 또는 명백히 참조된 임의의 공개문헌이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
본 발명은 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주를 제공한다. 균주 NRRL B-50550은 다양한 유리한 특성을 갖는 것으로 발견되었다. 균주 NRRL B-50550 (또는 그의 발효 생성물)은 그 자체가 살진드기 활성을 가질 뿐만 아니라, 예를 들어 높은 UV 안정성, 양호한 엽신통과 활성, 양호한 살란 활성, 긴 잔효 활성, 드렌치 활성 뿐만 아니라 광범위한 응애에 대한 활성을 또한 나타내고 (실시예 섹션 참조), 따라서 효과적인 살진드기제에 대한 요구사항을 충족시킨다. 또한, 균주 NRRL B-50550 (또는 그의 발효 생성물)은 살곤충 활성 및 다양한 진균 식물병원체, 예컨대 잎 녹병 및 밀듀균병에 대한 활성을 둘 다 보유한다. 이러한 독특한 활성의 조합은 균주 NRRL B-50550이 매우 용도가 많은 후보이게 하고, 균주가 식물 질병 및/또는 식물 해충을 방제하기 위해 식물을 처리하는 방법에 널리 사용하는데 적합하게 한다. 이러한 넓은 범위의 활성 및 농업에서의 가능한 적용은 공지된 스트렙토미세스 균주에 대해 아직 보고된 바 없다. 가능한 농업상 용도와 관련하여, 스트렙토미세스 균주는 1960년대 말 및 1970년대 초의 공개문헌에 주로 기재되어 있다. 예를 들어, 미생물 화합물 B-98891을 생산하는 ATCC 31120으로 기탁된 스트렙토미세스 리모파시엔스(Streptomyces rimofaciens) 균주 번호 B-98891이 기재되어 있는 영국 특허 번호 GB 1 507 193을 참조한다. 1975년 3월에 제출된 GB 1 507 193에 따르면, 미생물 화합물 B-98891은 스트렙토미세스 리모파시엔스 균주 번호 B-98891의 흰가루병에 대한 항진균 활성을 제공하는 활성 성분이다. 1972년 8월 2일에 제출된 미국 특허 번호 3,849,398은 균주 스트렙토미세스 토이오카엔시스 변종 아스피쿨라미세티쿠스(Streptomyces toyocaensis var. aspiculamyceticus)가 고제로틴으로도 공지되어 있는 미생물 화합물 아스피쿨라마이신을 생산하는 것으로 기재하고 있다 ([Toru Ikeuchi et al., 25 J. Antibiotics 548 (Sept. 1972)] 참조]. 미국 특허 번호 3,849,398에 따르면, 고제로틴은 그람-양성, 그람-음성 박테리아 및 투베르쿨 바실루스(tubercule bacillus)에 대해 약한 항박테리아 활성을 나타내는 것으로 언급되고 있지만 고제로틴은 동물에 대한 기생충, 예컨대 요충 등에 대해 살기생충 작용을 갖는다. 유사하게, 1978년에 공개된 일본 특허 공개 번호 JP 53109998 (A)은 살응애제로서 사용하기 위한 균주 스트렙토미세스 토이오카엔시스 (LA-681) 및 그의 고제로틴 생산 능력을 보고한다. 그러나, 이러한 스트렙토미세스 균주에 기초한 살응애성 발효 생성물은 전혀 상업적으로 입수가능하지 않음에 주목한다. 따라서, 진드기 (고제로틴 생산에 기초함), 진균 및 곤충에 대한 넓은 효능 및 작용 방식과 관련하여 바람직한 특성 (예를 들어, 엽신통과 활성 및 잔효 활성)을 갖는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550은 공지된 스트렙토미세스 균주에 대해 보고된 바 없는 생물학적 및 유리한 특성과 관련하여 유의하고 예상치 못한 진전을 나타낸다. 본 출원인은 고 농도의 고제로틴을 함유하는 발효 브로쓰를 생산하는 문제점을 해결하여 발효 브로쓰의 상업적 살충제로서의, 또는 상업적 살충제로서 사용하기 위한 고제로틴 공급원으로서의 궁극적인 사용을 실현가능하게 하였다. 따라서, 본 발명은 고제로틴을 적어도 약 0.5 g/L의 농도로 함유하는 발효 브로쓰를 포괄한다. 또한, 본 발명은 고제로틴을 적어도 약 1 g/L, 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L 적어도 약 6 g/L, 적어도 약 7 g/L 또는 적어도 약 8 g/L 또는 적어도 약 1 mg/g, 적어도 약 2 mg/g, 적어도 약 3 mg/g, 적어도 약 4 mg/g, 적어도 약 5 mg/g, 적어도 약 6 mg/g, 적어도 약 7 mg/g 또는 적어도 약 8 mg/g의 농도로 함유하는 발효 브로쓰를 포괄한다. 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰는 고제로틴을 약 3 g/L, 약 4 g/L, 약 5 g/L, 약 6 g/L, 약 7 g/L, 약 8 g/L, 약 9 g/L, 10 g/L, 약 11 g/L, 약 12 g/L, 약 13 g/L, 및 약 14 g/L의 농도를 비롯하여 약 2 g/L 내지 약 15 g/L 범위의 농도로, 또는 약 2 mg/g 내지 약 15 mg/g 범위의 농도로 함유한다. 일부 실시양태에서, 발효 브로쓰는 스트렙토미세스 종으로부터의 것이다. 구체적 실시양태에서, 발효 브로쓰는 스트렙토미세스 미크로플라부스로부터의 것이다. 다른 구체적 실시양태에서, 발효 브로쓰는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체로부터의 것이다. 추가로, 본 출원인은 고제로틴 생산을 담당하는 스트렙토미세스 미크로플라부스 유전자 클러스터를 확인하고 이를 조작하였다. 하기 및 도 5의 고제로틴 구조를 참조한다.
Figure pct00005
본원에 기재된 미생물 및 특정한 균주는, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 모두 자연에서 분리되고 (즉, 단리되고) 본원에 기재된 바와 같은 인공 조건 하에, 예컨대 진탕 플라스크 배양에서 또는 규모-확대 제조 공정을 통해, 예컨대 생물반응기에서 성장된다. 한 실시양태에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 살초식응애성 돌연변이체 균주가 제공된다. 스트렙토미세스 미크로플라부스는 토양 및 부패 중인 식생에서 흔히 발견되는 속 스트렙토미세스에 속하는 중온성 부생 박테리아이다. NRRL B-50550은 미 대륙의 토양으로부터 단리되는 스트렙토미세스 미크로플라부스의 균주이다. 스트렙토미세스 미크로플라부스는 잘 발달된 필라멘트형 영양 균사 (~ 1.0 μm 너비 및 10-100 μm 길이)를 생산하고 분생포자 - 무성 포자를 생산할 수 있는 호기성, 그람-양성, 필라멘트형 박테리아이다. 균사는 나선형으로 배열된 (윤생체), 거의 규칙적인 간격으로 베이지색의 매끈한 포자를 보유하는 긴 직쇄형의 필라멘트로 이루어진다. 각각의 윤생체 가지는 그의 정점에서 2개 내지 여러 개의 포자 쇄를 보유하는 산형화를 생산한다.
용어 "돌연변이체"는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550으로부터 유래된 유전적 변이체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 돌연변이체는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 확인된 (기능적) 특성을 하나 이상 또는 모두 갖는다. 특정한 예에서, 돌연변이체 또는 그의 발효 생성물은 (확인된 기능적 특성으로서) 적어도 응애 뿐만 아니라 모 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 균주를 방제한다. 또한, 돌연변이체 또는 그의 발효 생성물은 하기 특성: 살응애 활성과 관련하여 엽신통과 활성, 살응애 활성과 관련하여 잔효 활성, 살란 활성, 특히 디아브로티카에 대한 살곤충 활성, 또는 진균 식물병원체, 특히 밀듀균병 및 녹병에 대한 활성 중 1, 2, 3, 4개 또는 모든 5개의 특성을 가질 수 있다. 이러한 돌연변이체는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550에 대해 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 게놈 서열을 갖는 유전적 변이체일 수 있다. 돌연변이체는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 세포를 화학물질 또는 조사로 처리하는 것에 의해 또는 NRRL B-50550 세포 집단으로부터 자발적 돌연변이체 (예컨대 파지 내성 또는 항생제 내성 돌연변이체)를 선택하는 것에 의해 또는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 다른 수단에 의해 수득될 수 있다.
스트렙토미세스 미크로플라부스의 돌연변이유발을 위해 적합한 화학물질은 히드록실아민 히드로클로라이드, 메틸 메탄술포네이트 (MMS), 에틸 메탄술포네이트 (EMS), 4-니트로퀴놀린 1-옥시드 (NQO), 미토마이신 C 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 등을 포함한다 (예를 들어, [Stonesifer & Baltz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 82, pp. 1180-1183, February 1985] 참조). 예를 들어 각각의 스트렙토미세스 균주의 포자 용액을 사용한 NTG에 의한 스트렙토미세스 균주의 돌연변이유발은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [Delic et al., Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Volume 9, Issue 2, February 1970, pages 167-182, 또는 Chen et al., J Antibiot (Tokyo), 2001 Nov; 54(11), pages 967-972]을 참조한다. 보다 상세하게는, 스트렙토미세스 미크로플라부스는 상기 문헌 [Kieser, T., et al., 2000]에 기재되어 있는 프로토콜을 사용하여 NTG에 의해 돌연변이될 수 있다. [Practical Streptomyces Genetics, Ch. 5 John Innes Centre, Norwich Research Park, England (2000), pp. 99-107]. 자외선 (UV)에 의한 스트렙토미세스 미크로플라부스의 포자의 돌연변이유발은 표준 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토미세스 균주의 포자 현탁액 (새롭게 제조된 것 또는 20% 글리세롤 중에 동결된 것)을 254 nm 파장의 UV 광을 흡수하지 않는 배지에 현탁시킬 수 있다 (예를 들어, 물 또는 20% 글리세롤이 적합함). 이어서 포자 현탁액을 유리 페트리 디쉬에 놓고, 30℃에서 적절한 시간 동안 일정하게 교반하면서 254 nm에서 그의 대부분의 에너지를 방출하는 저압 수은 증기 램프로 조사한다 (가장 적절한 조사 시간은 용량-생존 곡선을 제1 플롯팅함으로써 결정될 수 있음). 이어서 비-선택 배지의 슬랜트 또는 플레이트는, 예를 들어 고밀도의 조사된 포자 현탁액으로 접종될 수 있고, 이렇게 수득된 돌연변이체 균주는 하기 설명된 바와 같이 그의 특성에 대해 평가될 수 있다. 상기 문헌 [Kieser, T., et al., 2000]을 참조한다.
돌연변이체 균주는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 확인된 특성을 하나 이상 또는 모두 갖고, 특히 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 비슷하거나 그보다 나은 살응애 활성을 갖는 임의의 돌연변이체 균주일 수 있다. 살응애 활성은, 예를 들어 본원의 실시예 2에 설명된 바와 같이 2-점박이응애 ("TSSM")에 대해 결정될 수 있으며, 즉 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 돌연변이체 균주의 배양 원액을 1 L 진탕 플라스크에서 실시예 2의 배지 1 또는 배지 2에서 20-30℃에서 3-5일 동안 성장시킬 수 있고, 이어서 희석된 발효 생성물을 2그루의 식물의 리마콩 잎의 상부 및 하부에 적용할 수 있고, 처리 후 같은 날에 식물을 50-100마리의 TSSM으로 감염시키고, 온실에서 5일 동안 둘 수 있다.
실시예 16은 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 돌연변이체를 생성하는 방법의 구체적인 예를 제공한다. 이러한 방법에 의해 생성된 하나의 돌연변이체는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 M으로, 이는 실시예에 보다 충분히 기재되어 있다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 M의 고제로틴 생합성 유전자 클러스터는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 고제로틴 생합성 유전자 클러스터 (즉, 서열 43)에 대해 약 99% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 한 측면에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 엽신통과 활성을 갖는다. 용어 "엽신통과 활성"은 관련 기술분야에서의 통상의 의미로 본원에 사용되고, 따라서 "엽신통과 활성"은 처리하고자 하는 식물의 잎 조직을 통과하는 화합물 또는 조성물 (여기서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 돌연변이체 균주를 함유하는 발효 생성물과 같은 조성물)의 능력을 의미한다. 엽신통과 화합물/조성물은 잎 조직에 침투하여, 잎 내에 활성 성분의 저장소를 형성한다. 따라서 이러한 엽신통과 활성은 엽면-섭식 곤충 및 응애에 대해 잔효 활성을 또한 제공한다. 조성물 (또는 그의 하나 이상의 활성 성분)이 잎을 통과할 수 있기 때문에, 보통 잎의 밑면을 섭식하는 진드기, 예컨대 응애를 방제하기 위해 완전히 분무 피복하는 것은 덜 중요하다. 돌연변이체 균주 단독의 또는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 비교하여 엽신통과 활성은, 예를 들어 본원의 실시예 6에 설명된 바와 같이 2-점박이응애 ("TSSM")에 대해 결정될 수 있다. 엽신통과 활성은 실시예 6의 조건 하에 수일 (예를 들어, 약 5일) 후에도 여전히 관찰될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 엽신통과 활성은 처리 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및/또는 10일째에 관찰될 수 있다 (존재함).
본 발명의 또 다른 측면에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 잔효 활성을 갖는다. 용어 "잔효 활성"은 관련 기술분야에서의 통상의 의미로 본원에 사용되고, 따라서 "잔효 활성"은 화합물 또는 조성물 (여기서 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 돌연변이체 균주를 함유하는 발효 생성물과 같은 조성물)의, 그것이 적용된 후 연장된 기간 동안 효과 (즉, 화합물 또는 조성물이 적용되지 않은 조건 대비 응애의 더 높은 사멸률을 유발하거나 또는 응애의 총 개체수의 감소를 유발하는 것)를 지속시키는 능력을 의미한다. 시간의 길이는 제제 (분진, 액체 등), 식물의 유형 또는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 돌연변이체 균주를 함유하는 조성물이 적용되는 식물 표면 또는 토양 표면의 위치 및 상태 (습식, 건식 등)에 의존할 수 있다. 돌연변이체 균주 단독의 또는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 비교하여 잔효 활성은, 예를 들어 본원의 실시예 2 또는 7에 설명된 바와 같이 2-점박이응애 ("TSSM")에 대해 결정될 수 있으며, 즉 살응애 효과와 관련하여 항-살응애 효과는 실시예 5의 조건 하에 수일 (예를 들어, 약 12일) 후에도 여전히 관찰될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 잔효 활성은 처리 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 및/또는 40일째에 관찰될 수 있다 (존재함).
본 발명의 또 다른 측면에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 살란 활성을 갖는다. 용어 "살란 활성"은 "알의 파괴 또는 사멸을 유발하는 능력"을 의미하는 것으로 관련 기술분야에서의 통상의 의미로 본원에 사용되고, 진드기, 예컨대 응애의 충란과 관련하여 본원에 사용된다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 돌연변이체 균주 단독의 또는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 비교하여 살란 활성은 실시예 7에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 살란 활성은 실시예 7의 조건 하에 수일 (예를 들어, 약 5일) 후에도 여전히 관찰될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 살란 활성은 처리 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및/또는 10일째에 관찰될 수 있다 (존재함).
본 발명의 또 다른 측면에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 드렌치 활성을 가질 수 있다. 용어 "드렌치 활성"은 토양 또는 다른 성장 배지로부터 목질부를 통해 식물을 통과하여 위쪽으로 이동하는 살충 활성을 의미하는 것으로 관련 기술분야에서의 통상의 의미로 본원에 사용된다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 돌연변이체 균주 단독의 또는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 비교하여 드렌치 활성은 실시예 8에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 드렌치 활성은 실시예 8의 조건 하에 수일 (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11일) 후에도 여전히 관찰될 수 있다 (존재함).
본 발명의 또 다른 측면에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 실시예에 예시된 바와 같은, 2-점박이응애에 대한 활성, 시트러스 녹응애 (필로코프트루타 올레이보라(Phyllocoptruta oleivora)), 에리오피드 (적갈색) 응애 및 차먼지 응애에 대한 활성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 응애 종에 대해 살응애 활성을 갖는다.
스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 따라서 클로버 응애, 갈색 응애, 헤이즐넛 잎응애, 아스파라거스 잎응애, 갈색 밀 응애, 콩과식물 응애, 괭이밥 응애, 회양목 응애, 텍사스 시트러스 응애, 오리엔탈 적색 응애, 시트러스 적색 응애, 유럽 적색 응애, 황색 잎응애, 무화과 잎응애, 루이스 잎응애, 6-점박이 잎응애, 윌라메트 응애, 유마 잎응애, 거미줄-생산 응애, 파인애플 응애, 시트러스 녹색 응애, 주엽나무 잎응애, 차응애, 남부 적색 응애, 아보카도 갈색 응애, 가문비나무 잎응애, 아보카도 적색 응애, 뱅크스 그래스 응애, 카르민 잎응애, 사막 잎응애, 채소 잎응애, 팽창 잎응애, 딸기 잎응애, 2-점박이 잎응애, 맥다니엘 응애, 퍼시픽 잎응애, 산사나무 잎응애, 4-점박이 잎응애, 쉐네이 잎응애, 칠레 가성 잎응애, 시트러스 플랫 응애, 쥐똥나무 응애, 플랫 스칼렛 응애, 백색-꼬리 응애, 파인애플 먼지 응애, 웨스트 인디안 사탕수수 응애, 구근 스케일 응애, 시클라멘 응애, 차먼지 응애, 윈터 그레인 응애, 붉은-다리 땅 응애, 개암나무 빅-버드 응애, 포도 에리늄 응애, 배 블리스터 잎 응애, 사과 잎 에지롤러 응애, 복숭아 모자이크 벡터 응애, 알더 비드 혹응애, 페리안 호두 잎 혹응애, 피칸 잎 에지롤 응애, 무화과 버드 응애, 올리브 버드 응애, 시트러스 버드 응애, 여지 에리늄 응애, 밀 오갈 응애, 코코넛 꽃 및 너트 응애, 사탕수수 블리스터 응애, 버팔로 그래스 응애, 버뮤다 그래스 응애, 당근 버드 응애, 고구마 잎 혹응애, 석류나무 잎 오갈 응애, 애쉬 스프랭글 혹응애, 메이플 블래더 혹응애, 알더 에리늄 응애, 레드베리 응애, 목화 블리스터 응애, 블루베리 버드 응애, 핑크 티 녹응애, 리브드 티 응애, 회색 시트러스 응애, 고구마 녹응애, 칠엽수 녹응애, 시트러스 녹응애, 사과 녹응애, 포도 녹응애, 배 녹응애, 플랫 니들 시스 소나무 응애, 야생 장미 버드 및 과실 응애, 드라이베리 응애, 망고 녹응애, 진달래 녹응애, 자두 녹응애, 복숭아 은 응애, 사과 녹응애, 토마토 적갈색 응애, 핑크색 시트러스 녹응애, 곡류 녹응애, 벼 녹응애 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 응애에 대해 활성을 가질 수 있다. 또한, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 다른 응애 방제제에 대해 내성을 갖는 응애에 대해 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, 균주는 아바멕틴-내성 응애에 대해 활성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 살곤충 활성을 또한 가질 수 있다. 표적 곤충은 디아브로티카일 수 있다. 디아브로티카는 줄무늬 오이 딱정벌레 (디아브로티카 발테아타(Diabrotica balteata)), 서부 점박이 오이 딱정벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 운데심푼크타타(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata)), 또는 옥수수 뿌리벌레, 예컨대 북부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi)), 남부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi)), 서부 오이 딱정벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 테넬라(Diabrotica undecimpunctata tenella)), 서부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)), 멕시칸 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 제아에(Diabrotica virgifera zeae)) 및 이러한 디아브로티카의 조합일 수 있다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 돌연변이체 균주 단독의 또는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 비교하여 살곤충 활성은 옥수수 뿌리벌레에 대해 실시예 10에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주는 살진균 활성을 가지며, 즉 진균에 의해 유발되는 식물 질병에 대한 활성을 갖는다. 식물 질병은 밀듀균병 또는 녹병일 수 있다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주로 처리될 수 있는 밀듀균병의 예는 흰가루병, 예컨대 스파에로테카 풀리기네아(Sphaerotheca fuliginea)에 의해 유발되는 오이 흰가루병, 또는 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica)에 의해 유발되는 노균병, 예컨대 브라시카 노균병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주로 처리될 수 있는 녹병의 예는 푹시니아 트리티시나(Puccinia triticina) (피. 레콘디타(P. recondita)로도 또한 공지됨)에 의해 유발되는 밀 잎 녹병, 푹시니아 그람미스(Puccinia grammis)에 의해 유발되는 밀 줄기 녹병, 푹시니아 스트리이포르미스(Puccinia striiformis)에 의해 유발되는 밀 줄 녹병, 푹시니아 호르데이(Puccinia hordei)에 의해 유발되는 보리 잎 녹병, 푹시니아 레콘디타에 의해 유발되는 호밀 잎 녹병, 갈색 잎 녹병, 관녹병, 및 줄기 녹병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 돌연변이체 균주 단독의 또는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 비교하여 살진균 활성은 오이 흰가루병에 대해 실시예 9에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 살진균 활성은 실시예 9의 조건 하에 수일 (예를 들어, 약 7일) 후에도 여전히 관찰될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 살진균 활성은 처리 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및/또는 15일째에 관찰될 수 있다 (존재함).
본 발명은 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주를 또한 제공한다. 스트렙토미세스 푸니세우스는 스트렙토미세스 박테리아의 에스. 그리세우스 계통군의 구성원이다. 에스. 푸니세우스는 호기성, 그람 양성, 필라멘트형 박테리아이다. 이는 중간 정도로 긴 성숙한 포자 쇄를 생산하며, 쇄당 10 내지 50개 초과의 포자를 갖는다. 포자 텍스쳐는 매끈하고, 콜로니는 오트밀 기반 한천에서 성장시 색상이 황색빛 내지 적색빛이다. 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A는 미 대륙에서 수집된 토양 샘플로부터 단리되었다. 균주 A의 발효 생성물은 실시예 18에 기재된 바와 같이 살응애 특성을 갖는다. 한 실시양태에서, 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A의 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주가 제공된다. 용어 "돌연변이체"는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A로부터 유래된 유전적 변이체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 돌연변이체는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A의 확인된 (기능적) 특성을 하나 이상 또는 모두 갖는다. 특정한 예에서, 돌연변이체 또는 그의 발효 생성물은 (확인된 기능적 특성으로서) 적어도 응애 뿐만 아니라 모 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A를 방제한다. 이러한 돌연변이체는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A에 대해 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 게놈 서열을 갖는 유전적 변이체일 수 있다. 돌연변이체는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 세포를 화학물질 또는 조사로 처리하는 것에 의해 또는 A 세포 집단으로부터 자발적 돌연변이체 (예컨대 파지 내성 또는 항생제 내성 돌연변이체)를 선택하는 것에 의해 또는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550과 관련하여 상기 및 실시예 16에 기재된 수단을 비롯한 다른 수단에 의해 수득될 수 있다. 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A는 단백질 GouB-GouM을 코딩하는 고제로틴 유전자 클러스터를 함유하고, GouA를 함유하는 것으로 예상된다. 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A의 단백질 GouB-GouM은 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550으로부터의 오르토로그 단백질과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 스트렙토미세스, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 또는 살진균성 돌연변이체 균주 또는 그의 무세포 제조물 또는 그의 대사물 또는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주 또는 그의 무세포 제조물 또는 그의 대사물의 하나 이상의 고제로틴 함유 발효 브로쓰를 식물 또는 식물 부분, 예컨대 잎, 줄기, 꽃, 과실, 뿌리 또는 종자에 투여하는 것에 의해 또는 식물 또는 식물 부분이 성장하는 생육지, 예컨대 토양에 적용하는 것에 의해 식물을 처리하여 식물 해충 및 질병을 방제하는 방법을 또한 포괄한다. 본 발명의 방법 및 발효 생성물에 적합한 추가의 고제로틴-생산 균주를 본원에 기재한다.
본원에 사용된 용어 "식물"은 식물계에 속하는 임의의 살아있는 유기체 (즉, 식물계 내의 임의의 속/종)를 지칭한다. 이는 나무, 허브, 관목, 목초, 덩굴, 양치식물, 이끼 및 녹조류와 같으나 이에 제한되지는 않는 친숙한 유기체를 포함한다. 상기 용어는 외떡잎식물로도 불리는 단자엽 식물 및 쌍떡잎식물로도 불리는 쌍자엽 식물을 둘 다 지칭한다. 식물은 일부 실시양태에서, 경제적으로 중요하다. 일부 실시양태에서, 식물은 인간이 성장시키는 식물, 예를 들어 농업용, 조림용 또는 원예용 식물일 수 있는 재배 식물이다. 특정한 식물의 예는 옥수수, 감자, 장미, 사과 나무, 해바라기, 밀, 벼, 바나나, 토마토, 오포, 호박, 스쿼시, 콩 (예를 들어, 리마콩), 상추, 양배추, 오크 나무, 구즈마니아, 제라늄, 히비스쿠스, 클레마티스, 포인세티아, 사탕수수, 토란, 좀개구리밥, 소나무, 켄터키 블루 그래스, 잔디, 코코넛 나무, 브라시카 잎 채소 (예를 들어, 브로콜리, 브로콜리 라브, 브뤼셀 스프라우트, 양배추, 배추 (복 초이(Bok Choy) 및 나파(Napa)), 콜리플라워, 카발로, 콜라드, 케일, 콜라비, 겨자 녹색채소, 평지 녹색채소, 및 다른 브라시카 잎 채소 작물), 구근 채소 (예를 들어, 마늘, 리크, 양파 (건조 구근, 녹색채소 및 웰치), 샬롯 및 다른 구근 채소 작물), 감귤류 (예를 들어, 그레이프프루트, 레몬, 라임, 오렌지, 탄제린, 시트러스 잡종, 유자 및 다른 감귤류 작물), 조롱박 채소 (예를 들어, 오이, 시트론 멜론, 식용 박, 게르킨, 머스크멜론 (쿠쿠미스 멜론의 잡종 및/또는 재배품종 포함), 수박, 칸탈루프 및 다른 조롱박 채소 작물), 과실 채소 (가지, 꽈리, 페피노, 페퍼, 토마토, 토마틸로 및 다른 과실 채소 작물 포함), 포도, 잎 채소 (예를 들어, 로메인), 뿌리/괴경 및 구경 채소 (예를 들어, 감자), 렌틸, 알팔파 스프라우트, 클로버 및 각과류 (아몬드, 피칸, 피스타치오 및 호두), 장과류 (예를 들어, 토마토, 바르베리, 커런트, 엘더베리, 구스베리, 허니서클, 메이애플, 나니베리, 오레곤-포도, 씨-벅톤, 핵베리, 베어베리, 린곤베리, 딸기, 바다 포도, 블랙베리, 클라우드베리, 로간베리, 라즈베리, 살몬베리, 팀블베리 및 와인베리), 곡류 작물 (예를 들어, 옥수수, 벼, 밀, 보리, 수수, 기장, 귀리, 호밀, 트리티케일, 메밀, 포니오 및 퀴노아), 이과류 (예를 들어, 사과, 배), 핵과류 (예를 들어, 커피, 대추, 망고, 올리브, 코코넛, 기름 야자, 피스타치오, 아몬드, 살구, 체리, 담손, 넥타린, 복숭아 및 자두), 덩굴 (예를 들어, 테이블 포도, 와인 포도), 섬유 작물 (예를 들어, 대마, 목화), 관상식물 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 식물은 일부 실시양태에서, 가정용/가축용 식물, 온실용 식물, 농업용 식물 또는 원예용 식물일 수 있다. 상기에 이미 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태에서, 식물은 아카시아, 유칼립투스, 서나무, 너도밤나무, 마호가니, 호두, 오크, 애쉬, 버드나무, 히코리, 자작나무, 밤나무, 포플러, 오리나무, 단풍나무, 플라타너스, 은행나무, 야자나무 및 풍나무 중 하나와 같은 활엽수일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물은 사이프러스, 미송, 전나무, 세쿼이아, 솔송나무, 시더, 향나무, 낙엽송, 소나무, 삼나무, 가문비나무 및 주목과 같은 침엽수일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물은 사과, 자두, 배, 바나나, 오렌지, 키위, 레몬, 체리, 포도덩굴, 파파야, 땅콩 및 무화과와 같은 과실을 맺는 목본성 식물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물은 목화, 대나무 및 고무 나무와 같은 목본성 식물일 수 있다. 식물은 일부 실시양태에서 농업용, 조림용 및/또는 관상용 식물, 즉 예를 들어 공원, 정원 및 발코니에서 조원에 흔히 사용되는 식물일 수 있다. 예는 많은 수의 관상식물 중 일부로서 잔디, 제라늄, 펠라르고늄, 페튜니아, 베고니아 및 푸크시아 등이다. 용어 "식물"은 또한 임의의 식물 번식체를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "식물"은 일반적으로 육종, 돌연변이유발 및 유전 공학 중 하나 이상에 의해 변형된 식물을 포함한다. 유전 공학은 재조합 DNA 기술의 사용을 지칭한다. 재조합 DNA 기술은 천연 환경 하의 교배 육종, 돌연변이 또는 천연 재조합에 의해 용이하게 수득될 수 없는 변형을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 유전 공학에 의해 수득되는 식물은 트랜스제닉 식물일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "식물 부분"은 싹, 뿌리, 줄기, 종자, 탁엽, 잎, 화판, 꽃, 배주, 포엽, 가지, 엽병, 절간, 목피, 목재, 괴경, 연모, 분얼경, 근경, 엽상체, 엽신, 화분, 수술, 소포자, 과실 및 종자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 식물의 임의의 부분을 지칭한다. 관련 기술분야에서 사용되는 전형적인 배지, 예컨대 토양에서 성장되는 식물의 2가지의 주요 부분은 종종 "싹"으로도 지칭되는 "지상부" 부분, 및 종종 "뿌리"로도 지칭되는 "지하부" 부분으로 종종 지칭된다.
본 발명에 따른 방법에서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주를 함유하는 조성물은 식물을 성장시키기 위해 사용된 임의의 유형의 배지 (예를 들어, 토양, 버미큘라이트, 절단된 카드보드 및 물)에서 성장된 임의의 식물 또는 임의의 식물의 임의의 부분에 적용될 수 있거나, 또는 난초 또는 박쥐난과 같이 공중에서 성장된 식물 또는 식물 부분에 적용될 수 있다. 조성물은 예를 들어 분무, 분사, 기화, 산란, 살분, 급수, 분출, 살포, 투하 또는 훈증에 의해 적용될 수 있다. 상기에 이미 나타낸 바와 같이, 적용은 관심 식물이 위치한 임의의 원하는 위치, 예컨대 농업, 원예, 산림, 농장, 과수원, 묘포, 유기적 성장 작물, 잔디 및 도심 환경에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 조성물은 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 돌연변이체를 예를 들어 미국 특허 번호 3,849,398; 영국 특허 번호 GB 1 507 193; [Toshiko Kanzaki et al., Journal of Antibiotics, Ser. A, Vol. 15, No.2, Jun. 1961, pages 93 to 97; 또는 Toru Ikeuchi et al., Journal of Antibiotics, (Sept. 1972), pages 548 to 550]에 기재되어 있는 방법을 비롯한 통상의 대규모 미생물 발효 공정, 예컨대 액내 발효, 고체 상태 발효 또는 액체 표면 배양을 사용하여 배양하는 것에 의해 수득될 수 있다. 발효 용기 내에서 높은 수준의 포자를 비롯한 생 바이오매스 및 바람직한 이차 대사물을 수득하기 위해 발효 환경이 설정된다. 본 발명의 균주가 높은 수준의 포자형성, cfu (콜로니 형성 단위), 및 이차 대사물을 달성하는데 적합한 구체적인 발효 방법은 실시예 섹션에 기재되어 있다.
발효로 인해 생성된 배양 브로쓰 내의 박테리아 세포, 포자 및 대사물 ("전체 브로쓰" 또는 "발효 브로쓰")은 바로 사용될 수 있거나, 또는 통상의 산업적 방법, 예컨대 원심분리, 여과 및 증발에 의해 농축될 수 있거나, 또는 예를 들어 분무 건조, 드럼 건조 및 동결 건조에 의해 건조 분말 및 과립으로 가공될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전체 브로쓰" 및 "발효 브로쓰"는 임의의 하류 처리 전의 발효로 인해 생성된 배양 브로쓰를 지칭한다 (고제로틴을 적어도 약 1 g/L의 농도로 함유하는 배양 브로쓰의 생산을 포함). 전체 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주) 및 그의 성분 부분, 미사용 원료 기질, 및 발효 동안 미생물에 의해 생산된 대사물을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "브로쓰 농축물"은 상기 기재된 바와 같이 통상의 산업적 방법에 의해 농축되었지만 액체 형태를 유지하는 전체 브로쓰 (발효 브로쓰)를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "발효 고체"는 건조된 발효 브로쓰를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "발효 생성물"은 전체 브로쓰, 브로쓰 농축물 및/또는 발효 고체를 지칭한다. 본 발명의 조성물은 발효 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 농축된 발효 브로쓰는 잔여 발효 브로쓰 및 대사물을 제거하기 위해 예를 들어 정용여과 공정을 통해 세척된다.
한 실시양태에서, 발효 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 적어도 약 1 x 105 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL 브로쓰를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 적어도 약 1 x 106 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL 브로쓰를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 적어도 약 1 x 107 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL 브로쓰를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 적어도 약 1 x 108 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL 브로쓰를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 적어도 약 1 x 109 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL 브로쓰를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 적어도 약 1 x 1010 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL 브로쓰를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰는 미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 적어도 약 1 x 1011 콜로니 형성 단위 (CFU)/mL 브로쓰를 함유한다. 통상의 기술자는 상기 기재된 농도가 발효의 완료 직후에 측정된 CFU에 관한 것이지만, CFU 수준은 저장 조건에 의존하여 시간의 경과에 따라 감소할 것임을 이해할 것이다. 본원에 기재된 미생물의 미제제화된 발효 생성물의 CFU 수준은 생산물이 냉 저장소 (예를 들어, 약 4℃)에서 유지될 경우에 안정적이지만, 실온에서는 감소된다.
한 실시양태에서, 발효 브로쓰 또는 브로쓰 농축물은 액체 현탁액, 액체 농축물, 에멀젼 농축물 또는 습윤성 분말로 제제화될 수 있고, 안정화제, 보존제, 아주반트 및/또는 착색제가 첨가된다.
또 다른 실시양태에서, 발효 브로쓰 또는 브로쓰 농축물은 담체, 불활성물질 또는 첨가제의 첨가의 존재 또는 부재하에 통상의 건조 공정 또는 방법, 예컨대 분무 건조, 동결 건조, 트레이 건조, 유동층 건조, 드럼 건조 또는 증발을 사용하여 건조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발효 브로쓰, 브로쓰 농축물 또는 발효 고체는 미생물을 사멸하기 위해 처리되어, 사멸된 미생물, 그의 대사물 및 잔여 발효 배지로 이루어진 발효 생성물이 생성된다. 이를 달성하는데 적합한 처리는 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 열 처리를 포함한다.
발효 브로쓰 또는 브로쓰 농축물이 동결 건조되는 실시양태에서, 1 갤런의 발효 브로쓰는 약 0.2 lb 내지 약 1 lb 동결 건조된 분말을 생성한다. 특정한 예에서, 1 갤런의 발효 브로쓰는 약 0.4 lb 내지 약 0.6 lb 동결 건조된 분말을 생성한다. 또 다른 예에서, 1 갤런의 발효 브로쓰는 약 0.5 lb 동결 건조된 분말을 생성한다.
추가 실시양태에서, 생성된 건조 생성물은 농업상 적용에 바람직한 특정 입자 크기 또는 물리적 포맷 또는 물리적 특성을 달성하기 위해 불활성물질 또는 첨가의 첨가의 존재 또는 부재하에 예컨대 밀링 또는 과립화에 의해 추가로 가공될 수 있다.
전체 브로쓰 또는 브로쓰 농축물의 용도에 더하여, 본 발명의 스트렙토미세스의 신규 변이체 및 균주의 발효 브로쓰의 무세포 제조물은 발효 브로쓰의 추출, 원심분리 및/또는 여과와 같은 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 수득될 수 있다. 통상의 기술자는 소위 무세포 제조물이 세포를 전혀 갖지 않을 수는 없으며, 세포를 제거하는데 사용된 기술 (예를 들어, 원심분리의 속도)에 따라 대체로 무세포이거나 본질적으로 무세포라는 것을 이해할 것이다. 생성된 무세포 제조물은 그의 적용을 보조하는 성분과 함께 건조 및/또는 제제화될 수 있다. 발효 브로쓰에 대해 상기 기재된 농축 방법 및 건조 기술은 또한 무세포 제조물에도 적용가능하다.
본 발명의 조성물은 효능, 안정성, 및 물리적 특성, 유용성을 개선하고/거나 가공, 포장 및 최종 용도 적용을 용이하게 하기 위해 세포, 무세포 제조물 또는 대사물을 포함하는 조성물에 첨가되는 제제 성분을 포함할 수 있다. 이러한 제제 성분은 개별적으로 또는 조합되어 첨가될 수 있는 담체, 불활성물질, 안정화제, 보존제, 영양분, 또는 물리적 특성 개질제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체는 액체 물질, 예컨대 물, 오일, 및 다른 유기 또는 무기 용매 및 고체 물질, 예컨대 미네랄, 중합체, 또는 생물학적으로 또는 화학적 합성에 의해 유도된 중합체 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 성분은 조성물의 식물 부분, 예컨대 잎, 종자 또는 뿌리에 대한 부착을 용이하게 하는 결합제, 아주반트 또는 접착제이다. 예를 들어, [Taylor, A.G., et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments" Annu. Rev. Phytopathol. 28: 321-339 (1990)]을 참조한다. 안정화제는 케이킹방지제, 항산화제, 건조제, 보호제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 영양분은 탄소, 질소, 및 인 공급원, 예컨대 당, 폴리사카라이드, 오일, 단백질, 아미노산, 지방산 및 포스페이트를 포함할 수 있다. 물리적 특성 개질제는 벌킹제, 습윤제, 증점제, pH 조절제, 레올로지 개질제, 분산제, 아주반트, 계면활성제, 동결방지제 또는 착색제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발효에 의해 생산된 세포, 무세포 제조물 또는 대사물을 포함하는 조성물은 임의의 다른 제제 제조물없이 희석제로서 물의 존재 또는 부재하에 바로 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 습윤제는 발효 고체, 예컨대 동결-건조되거나 분무-건조된 분말에 첨가된다. 습윤제는 그것이 표면에 적용된 경우에 (일단 희석되면) 활성 성분의 확산 및 침투 특성을 증가시킨다. 예시적인 습윤제는 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 술포시네이트 및 유도체, 예컨대 모나웨트 모-70(MONAWET MO-70) (크로다 인크.(Croda Inc.), 뉴저지주 에디슨); 트리실록산, 예컨대 브레이크스루(BREAKTHRU) (에보닉(Evonik), 독일); 비이온성 화합물, 예컨대 알톡스(ALTOX) 4894 (크로다 인크., 뉴저지주 에디슨); 알킬 폴리글루코시드, 예컨대 테르웨트(TERWET) 3001 (헌츠만 인터내셔널 엘엘씨(Huntsman International LLC), 텍사스주 더 우드랜즈); C12-C14 2급 알콜 에톡실레이트, 예컨대 테르지톨(TERGITOL) 15-s-15 (더 다우 케미칼 캄파니(The Dow Chemical Company), 미시간주 미들랜드); 포스페이트 에스테르, 예컨대 로다팍(RHODAFAC) BG-510 (로디아, 인크.(Rhodia, Inc.)); 및 알킬 에테르 카르복실레이트, 예컨대 에물소겐-LS(EMULSOGEN-LS) (클라리언트 코포레이션(Clariant Corporation), 노스캐롤라이나주)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제제 불활성물질은 발효 브로쓰를 농축시킨 후 및 건조 동안 및/또는 건조 후에 첨가된다.
본 발명은 고제로틴을 적어도 약 1 g/L의 농도로 함유하는 발효 브로쓰를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 이러한 전체 브로쓰 배양물은 스트렙토미세스의 고제로틴-생산 균주로부터 유래한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 고제로틴-생산 균주는 스트렙토미세스 미크로플라부스, 스트렙토미세스 푸니세우스, 또는 스트렙토미세스 그라미네아루스이다. 또 다른 실시양태에서, 고제로틴-생산 균주는 에스. 그리세우스, 에스. 아눌라투스, 에스. 피미카리우스, 에스. 파르부스, 에스. 라벤둘라에, 에스. 알보비리디스, 또는 에스. 푸니세우스이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 이러한 고제로틴-생산 균주는 차이나 제너럴 마이크로바이올로지컬 컬쳐 콜렉션 센터(China General Microbiological Culture Collection Center: CGMCC)에 기탁된 스트렙토미세스 그라미네아루스 CGMCC 4.506이다.
본 발명은 스트렙토미세스 미크로플라부스로부터의 고제로틴 생합성 유전자 클러스터, 유전자 클러스터 내의 개개의 유전자의 특성, 및 그에 의해 코딩된 단백질을 또한 제공한다. 고제로틴 유전자 클러스터가 개시되며, 유전자 클러스터는 각각 오픈 리딩 프레임 (ORF) 4251 내지 4253, 4255 내지 4259, 4261 내지 4265, 및 4271 (각각 서열 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 및 41)로 지칭되고, 본원에서 각각 GouA, GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, GouM, 및 GouN으로 지칭되는 14개의 ORF를 포함한다. 상응하는 단백질은 각각 서열 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 30, 및 42로 제공된다. 고제로틴 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 게놈 DNA 서열 및 일부 플랭킹 영역이 서열 43으로 제공되고, 유전자 GouA에서 GouN까지의 위치를 기재한다. 본 개시내용은 유전자좌 내에 위치한 고제로틴 유전자 클러스터의 핵산 서열, 그 내에 함유된 ORF, 및 그에 의해 코딩된 단백질을 제공한다. 이러한 정보는, 예를 들어 예컨대 다른 스트렙토미세스 종에서 고제로틴 유전자 클러스터의 상동체 및 상응하는 ORF를 코딩하는 관련 핵산 분자의 단리를 가능하게 한다.
스트렙토미세스 미크로플라부스 균주로부터 확인되는, 서열 43 (뉴클레오티드 잔기 1-21933) 내에 포함된 고제로틴 유전자 클러스터는 ORF 4248 내지 4271로 지칭되는 24개의 ORF를 포함한다. ORF 4251, 4252, 4253, 4255, 4256, 4257, 4258, 4259, 4261, 4262, 4263, 4264, 4265, 및 4271은 각각 13개의 유전자 gouA, gouB, gouC, gouD, gouE, gouF, gouG, gouH, gouI, gouJ, gouK, gouL, gouM, 및 gouN이다. 서열 89-100 (스트렙토미세스 푸니세우스 균주로부터 확인되는 것)은 각각의 오르토로그 유전자 gouB, gouC, gouD, gouE, gouF, gouG, gouH, gouI, gouJ, gouK, gouL, gouM을 제공함에 주목한다. 이들 유전자의 잠재적인 기능 및 고제로틴 합성에서의 그의 가능한 역할이 표 2에 제공된다.
<표 2> 고제로틴 생합성 유전자의 가능한 역할
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따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 적어도 약 0.5 g/L 고제로틴 또는 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 갖는 발효 브로쓰를 포함하는 발효 생성물은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주로부터의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 약 0.5 g/L 고제로틴 또는 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 갖는 발효 브로쓰를 포함하는 발효 생성물은 단백질 GouA, GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, 및/또는 GouM을 코딩하는 서열 43의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 43의 뉴클레오티드 서열의 영역에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주로부터의 것이다.
특정한 실시양태에서, 상기 핵산 서열을 갖는 이러한 고제로틴-생산 균주는 스트렙토미세스 미크로플라부스 또는 스트렙토미세스 푸니세우스이다. 하나의 특정한 예는 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체이다. 한 예에서, 이러한 그의 살초식응애성 돌연변이체는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 M이다. 또 다른 예에서, 이러한 고제로틴-생산 균주는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체이다.
적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유하는 발효 브로쓰는 여러 방법, 예컨대 발효 최적화 및/또는 모 균주보다 더 높은 고제로틴 수준을 생산하는 돌연변이체 균주를 수득하기 위한 모 고제로틴-생산 균주의 돌연변이유발로 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명은 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰를 생산하는 방법으로서, 여기서 발효 브로쓰는 적어도 약 0.5 g/L 고제로틴을 함유하는 것인 방법을 또한 포괄한다. 방법은 호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 적어도 0.5 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 고제로틴에 대한 전구체, 예컨대 시토신; 핵염기; 및/또는 아미노산을 함유한다.
일부 실시양태에서, 스트렙토미세스 균주는 배양 배지가 고제로틴을 적어도 약 0.5 g/L, 적어도 약 1 g/L, 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L, 적어도 약 6 g/L, 약 적어도 7 g/L 또는 적어도 약 8 g/L 고제로틴의 농도로 함유할 때까지 배양 배지에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 스트렙토미세스 균주는 배양 배지가 고제로틴을 약 0.5 g/L 내지 약 25 g/L 고제로틴 범위의 농도로 함유할 때까지, 즉 발효 브로쓰가 약 0.5 mg/g 내지 약 15 mg/g 고제로틴의 발효 완료 후 고제로틴을 전형적으로 약 0.5 g/L 내지 약 15 g/L 고제로틴 범위의 농도로 함유할 때까지 배양 배지에서 배양된다.
이러한 문맥에서, 적어도 약 0.5 g/L 또는 적어도 약 1 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 첨가되는 아미노산은 별개의 개별 성분으로서 규정된 농도로 배양 배지에 제공되며, 아미노산이 올리고펩티드 및 부분 가수분해된 단백질과 같은 다른 성분과의 혼합물로 존재할 수 있는 효모 추출물 또는 단백질 가수분해물 (예를 들어 카세인 가수분해물, 대두 분말 가수분해물, 대두 펩톤, 대두 산 가수분해물 등)과 같은 조성물의 일부로 제공되지 않음에 주목한다. 따라서, 발효 브로쓰에서 "적어도 1 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도"는 이러한 고제로틴 농도를 제공하기 위해 특별히 선택된 배양 배지 중의 아미노산의 농도를 의미한다. 일부 실시양태에서, 목적하는 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도는 배양 배지 중의 적어도 약 1 g/L의 아미노산 농도이다. 이러한 "효과적인 농도"는 따라서 2 g/L 초과일 수 있고, 예를 들어 약 2 g/L 내지 약 15 g/L의 범위일 수 있다. 농도는 약 3 g/L, 약 4 g/L, 약 5 g/L, 약 6 g/L, 약 7 g/L, 약 8 g/L, 약 9 g/L, 약 10 g/L, 약 11 g/L, 약 12 g/L, 약 13 g/L, 또는 약 14 g/L일 수 있다.
청구범위 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에서 아미노산은 적어도 약 0.5 g/L 또는 그 초과의 농도, 예컨대 적어도 약 1 g/L, 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L, 적어도 약 6 g/L의 고제로틴 농도를 제공하는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 글리신, L-글루탐산, L-글루타민, L-아스파르트산, L-세린 또는 그의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 글리신을 약 5 g/L 내지 약 15 g/L의 농도로 함유하고, 반면에 다른 실시양태에서 배양 배지는 글루탐산을 약 5 g/L 내지 약 15 g/L의 초기 농도로 함유한다. 배양 배지가 글리신 및 L-글루탐산 (또는 L-글루타민) 둘 다를 약 5 g/L 내지 약 15 g/L의 농도로 함유하는 것이 또한 가능하다.
스트렙토미세스 균주를 위한 소화가능한 (및 따라서 이용가능한) 임의의 탄소원은 본원에 기재된 바와 같은 발효 브로쓰를 생산하는 방법 (또는 발효 방법)에서 사용될 수 있다. 적합한 탄소원의 예는 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 당밀, (폴리사카라이드의 경우의 예로서) 전분, 덱스트린, (올리고사카라이드의 예로서) 말토덱스트린 또는 글리세린 등을 포함한다. 탄소원 (또는 공급원)의 전체 초기 농도는 적합한 스트렙토미세스의 성장 및 목적하는 농도의 고제로틴의 생산을 제공하는 임의의 농도일 수 있고, 실험적으로 결정될 수 있다 (사용된 탄소원(들)의 농도로부터 의존하여 발효 브로쓰 중의 고제로틴의 최종 농도를 결정함). 전체 초기 탄소원 농도는, 예를 들어 약 10 g/L 내지 약 150 g/L의 범위 내, 예를 들어 약 10 g/L, 약 20 g/L, 약 30 g/L, 약 40 g/L, 약 50 g/L, 약 60 g/L, 약 70 g/L, 약 80 g/L, 약 90 g/L, 약 100 g/L, 약 110 g/L 또는 약 120 g/L일 수 있다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 2종 이상의 탄소원의 혼합물, 예를 들어 글루코스와 폴리사카라이드, 예컨대 전분의 혼합물, 글루코스와 올리고사카라이드, 예컨대 덱스트린 또는 말토덱스트린의 혼합물, 또는 글루코스, 전분 및 덱스트린의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 탄소원으로서 글루코스와 올리고사카라이드의 혼합물을 함유한다. 올리고사카라이드는 말토덱스트린 또는 덱스트린일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 배양 배지 중의 초기 말토덱스트린 농도는 약 50 g/L 내지 약 100 g/L 또는 약 60 g/L 내지 약 80 g/L일 수 있다. 배양 배지 중의 초기 글루코스 농도는 약 20 g/L 내지 약 80 g/L, 예를 들어, 약 30 g/L, 약 40 g/L, 약 50 g/L, 약 60 g/L 또는 약 70 g/L일 수 있다. 글루코스가 탄소원으로서 말토덱스트린 또는 덱스트린과 함께 사용되는 다른 실시양태에서, 글루코스 농도는 약 20 g/L 내지 60 g/L 또는 약 30 g/L 내지 약 50 g/L일 수 있다.
소화가능한 임의의 질소원이 본원에 기재된 발효 공정에서 사용될 수 있다. 질소원은 단일 공급원 또는 공급원의 혼합물일 수 있다. 예시적 실시양태에서, 질소원은 대두 펩톤, 대두 산 가수분해물, 대두 분말 가수분해물, 카세인 가수분해물, 효모 추출물 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 (적어도 부분적으로) 선택된다. 질소원(들)의 전체 초기 농도는 적합한 스트렙토미세스의 성장 및 목적하는 농도의 고제로틴의 생산을 제공하는 임의의 농도일 수 있고, 실험적으로 결정될 수 있다. 배양 배지 중의 적합한 전체 농도는, 예를 들어 약 10 g/L 내지 약 60 g/L의 범위 내, 예를 들어 약 20 g/L, 약 30 g/L, 약 40 g/L, 약 50 g/L일 수 있다. 예시적 실시양태에서, 질소원은 카세인 가수분해물과 대두 분말 수화물의 혼합물 또는 효모 추출물과 대두 산 가수분해물의 혼합물일 수 있으며, 여기서 예를 들어 효모 추출물은 배양 배지 중에 10 g/L의 농도 (또는 양)으로 사용되고 대두 산 가수분해물은 20 g/L의 농도/양으로 사용된다.
배양 배지는 칼슘 공급원, 예컨대 염화칼슘 또는 탄산칼슘을 추가로 함유할 수 있다. 존재하는 경우에, 배양 배지는 칼슘 공급원, 예컨대 탄산칼슘을 약 1 g/L 내지 3 g/L의 초기 농도로 함유할 수 있다.
이러한 문맥에서, 배양 배지의 모든 성분의 농도는 달리 나타내지 않는 한 발효 개시시의 농도 (초기 농도)로 주어짐을 주목한다. 농도는 발효를 위해 사용되는 접종 후 부피에 기초한다. 여기서 주어지는 바와 같은 초기 농도는 연속 영양분 공급에 의해 발효 동안 유지될 수 있거나, 대안적으로 성분 (탄소원, 질소원, 아미노산)은 발효 개시시에만 첨가될 수 있다. 그러나, 배양 배지/발효 브로쓰의 pH는 전형적으로 계속적으로 모니터링되고, 적합한 산 (예컨대 황산 또는 시트르산) 및/또는 적합한 염기 (예컨대 수산화나트륨 또는 암모니아 용액 또는 수산화칼륨)의 첨가에 의해 제어된다. 적절한 pH는 실험적으로 결정될 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 배양 배지/발효 브로쓰의 pH는 6.5 내지 7.5, 예를 들어 6.8 내지 7.0의 범위 내이다. 또한 공정 파라미터, 예컨대 온도 및 통기율은 발효 공정의 과정에 걸쳐 통상적으로 제어된다. 스트렙토미세스 균주의 배양이 호기성 조건 하에 수행되기 때문에, 발효 브로쓰는 전형적으로 공기, 산소 풍부 공기, 또는 필요한 경우에 순수 산소로 통기된다. 온도는 통상적으로 20℃ 내지 30℃의 범위 내에서 선택되지만, 더 높은 온도가 또한 본원에서 고려된다. 표준 발효 시약, 예컨대 소포제가 또한 계속적으로 첨가될 수 있다. 발효 브로쓰의 생산은 통상의 대규모 미생물 발효 공정, 예컨대 예를 들어, 미국 특허 번호 3,849,398; 영국 특허 번호 GB 1 507 193; [Toshiko Kanzaki et al., Journal of Antibiotics, Ser. A, Vol. 15, No.2, Jun. 1961, pages 93 to 97; 또는 Toru Ikeuchi et al., Journal of Antibiotics, (Sept. 1972), pages 548 to 550]에 기재된 방법을 비롯하여 액내 발효, 고체 상태 발효 또는 액체 표면 배양을 사용하여 수행될 수 있다.
임의의 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주는 본원에 개시된 고제로틴 함유 발효 브로쓰를 생산하는데 사용될 수 있다. 예시적 실시양태에서, 스트렙토미세스 균주는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주, 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 또는 스트렙토미세스 그라미네아루스 균주이다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주는, 예를 들어 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주일 수 있다. 또한, 낮은 수준일지라도 고제로틴을 생산할 수 있는 모 박테리아 균주, 예컨대 다양한 스트렙토미세스 (스트렙토미세스 미크로플라부스, 스트렙토미세스 푸니세우스 및 스트렙토미세스 그라미네아루스를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 및 바실루스는 증진된 고제로틴 생산을 위해 돌연변이화될 수 있다. 실시예 14는 이러한 돌연변이체를 생산하는 하나의 방법 및 적어도 1 g/L 고제로틴을 함유하는 생성된 발효 브로쓰를 기재한다.
발효 동안 특정 탄소 및 질소원 및 다른 영양분의 선택은 고제로틴의 생산을 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 고제로틴 생산을 증진시키는데 적합한 탄소원은 전분, 말토덱스트린, 덱스트린, 당 및 글루코스이다. 구체적 실시양태에서, 글루코스 및 올리고사카라이드의 조합물이 탄소원으로서 사용될 수 있고/거나 획득된다. 고제로틴 생산을 증진시키는데 적합한 질소원은 대두 단백질 가수분해물, 카세인 가수분해물, 대두 펩톤, 효모 추출물 및 영양분이 덜 풍부한 다른 질소원이다. 다른 적합한 질소원은 아미노산 및/또는 고제로틴에 대한 전구체, 예컨대 글리신, L-글루탐산을 비롯한 글루탐산, L-아스파르트산을 비롯한 아스파르트산, L-세린을 비롯한 세린 및 시토신을 포함한다. 시토신은 고농도의 시토신을 갖는 배지 성분의 일부, 예컨대 높은 핵염기 함량을 갖는 효모 추출물로서 첨가될 수 있다. 증가된 수준의 고제로틴을 갖는 발효 브로쓰를 생산할 수 있는 발효 배지의 예가 실시예 11, 12 및 13에 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 발효 생성물 (예를 들어, 발효 브로쓰 또는 발효 고체)은 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%의 효력을 가지며, 여기서 효력은 다음과 같이 측정된다. 발효 생성물을 물 및 계면활성제 용액 중에 희석하여 (계면활성제 제품 라벨에 권고되어 있는 계면활성제의 양을 사용함) 5% 전체 브로쓰 (또는 전체 브로쓰로부터 유래된 발효 고체의 경우에 하기 기재된 바와 같은 전체 브로쓰 당량)인 용액을 수득한다. 희석된 용액을 양쪽 표면이 젖을 때까지 잎 (예컨대 리마콩의 잎)의 상부 및 하부 표면에 적용하되, 흘러내릴 때까지 적용하지 않는다. 식물이 건조되게 한 다음, 10-20마리의 2-점박이응애 (테트라니쿠스 우르티카에 코흐(Tetranychus urticae Koch))로 감염시킨다. 처리 후 4일째에, 처리된 잎을 조사하고, 잎 상의 살이있는 성체 암컷 및 제이약충과 죽은 것을 계수한다. 선-셰파드(Sun-Shepard) 공식을 사용하여 효력 (즉 보정된 사멸률)을 계산한다. 보정된 % = 100 (처리된 플롯에서의 % 감소 ± 비처리된 집단에서의 % 변화)/(100 ± 비처리된 집단에서의 % 변화). 이러한 적용에서, 상기 기재된 방법에 의해 계산된 효력은 "잎응애 효력"으로 지칭될 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 종자, 생산, 조경을 위해 성장되는 것 및 종자 생산을 위해 성장되는 것을 비롯하여 폭넓은 다양한 농업용 및/또는 원예용 작물을 처리하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 사용하여 처리될 수 있는 대표적인 식물은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 브라시카, 구근 채소, 곡물, 시트러스, 목화, 조롱박, 과실 채소, 잎 채소, 콩과식물, 오일 종자 작물, 땅콩, 이과류, 뿌리 채소, 괴경 채소, 구경 채소, 핵과류, 담배, 딸기 및 다른 장과류, 및 다양한 관상식물.
본 발명의 조성물은 엽면 분무로서, 토양 처리물로서, 및/또는 종자 처리물/드레싱으로서 투여될 수 있다. 엽면 처리물로서 사용되는 경우에, 한 실시양태에서 약 1/16 내지 약 5 갤런의 전체 브로쓰가 에이커당 적용된다. 토양 처리물로서 사용되는 경우에, 한 실시양태에서 처리할 종자의 크기 및 발효 생성물 중에서의 콜로니 형성 단위의 농도에 의존하여 약 1 내지 약 15 갤런 또는 약 1 내지 약 5 갤런의 전체 브로쓰가 에이커당 적용되거나, 또는 약 0.1 mg 내지 약 14 mg, 또는 약 0.2 mg 내지 약 10 mg, 또는 약 0.2 mg 내지 약 8 mg 발효 생성물, 예컨대 동결 건조된 생성물이 에이커당 적용된다. 종자 처리물이 사용되는 경우에, 약 1/32 내지 약 1/4 갤런의 전체 브로쓰가 에이커당 적용된다. 종자 처리물의 경우에, 최종 용도 제제는 그램당 적어도 1 x 108 콜로니 형성 단위를 함유한다.
일부 실시양태에서, 식물, 식물 부분 또는 식물 생육지에 대한 본 발명의 조성물의 적용에 선행하여 처리를 필요로 하는 생육지를 확인한다.
미생물 (예를 들어, 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550 또는 그의 살초식응애성 돌연변이체 균주)의 발효 생성물, 예컨대 전체 브로쓰 배양물 또는 동결-건조된 분말을 비롯한 발효 고체/mL를 희석하고, 식물 엽면에 적용한다. 적용률은 에이커당 갤런 또는 파운드로 제공되고, 보다 적은 적용 (예컨대 실시예에 기재된 마이크로플롯 시험)에 대해 비례적으로 조정될 수 있다. 실시예에 기재된 바와 같이, 보다 큰 적용을 위해, 발효 생성물을 적용 전 물 100 갤런에 희석한다. 한 실시양태에서, 약 0.5 갤런 내지 약 15 갤런, 약 1 갤런 내지 약 12 갤런 또는 약 1.25 갤런 내지 약 10 갤런 전체 브로쓰 배양물 (물, 및 임의로 계면활성제 중에 희석된 것)이 에이커당 식물 엽면에 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 약 0.2 lb 내지 약 8 파운드의 동결-건조된 분말, 약 0.4 lb 내지 약 7 파운드, 또는 약 0.4 lb 내지 약 6 lb (물, 및 임의로 계면활성제 중에 희석된 것)가 에이커당 식물 엽면에 적용된다. 특정한 예에서, 발효 생성물은 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60%의 잎응애 효력을 갖는다. 또 다른 예에서, 발효 생성물은 약 0.5% 내지 약 15% 고제로틴, 약 1% 내지 약 12% 고제로틴, 또는 약 2% 내지 약 10% 고제로틴을 갖는 발효 분말 (분무-건조되거나 동결-건조된 분말을 포함)이며, 여기서 모든 백분율은 중량 기준의 중량이다. 또 다른 예에서, 발효 생성물은 중량 기준 중량으로 약 0.01% 내지 약 0.5% 고제로틴을 갖는 발효 브로쓰이다.
특정한 실시양태에서, 1.25 파운드의 발효 생성물, 예컨대 동결-건조된 분말 또는 분무-건조된 분말 (물, 및 임의로 계면활성제 중에 희석된 것)이 에이커당 식물 엽면에 적용된다. 이들 실시양태에서, 최종 용도 제제는 mL당 적어도 약 1 x 106 콜로니 형성 단위, mL당 적어도 약 1 x 107 콜로니 형성 단위, mL당 적어도 약 1 x 108 콜로니 형성 단위, mL당 적어도 약 1 x 109 콜로니 형성 단위, 또는 mL당 적어도 약 1 x 10 10 콜로니 형성 단위를 함유하는 출발 발효 브로쓰를 기초로 한다. 또 다른 예에서, 이러한 발효 생성물은 적어도 약 1 중량% 고제로틴, 적어도 약 2 중량% 고제로틴, 적어도 약 3 중량% 고제로틴, 적어도 약 4 중량% 고제로틴, 적어도 약 5 중량% 고제로틴, 적어도 약 6 중량% 고제로틴, 적어도 약 7 중량% 고제로틴, 또는 적어도 약 8 중량% 고제로틴을 함유한다.
고제로틴 유전자 클러스터, ORF, 및 그에 의해 코딩된 단백질
본 개시내용은 유전자좌 내에 위치한 고제로틴 유전자 클러스터의 핵산 서열, 그 내에 함유된 ORF, 및 그에 의해 코딩된 단백질을 제공한다. 이러한 정보는, 예를 들어 예컨대 다른 스트렙토미세스 종에서 고제로틴 유전자 클러스터의 상동체 및 상응하는 ORF를 코딩하는 관련 핵산 분자의 단리를 가능하게 한다. 본 개시내용은 고제로틴 유전자 클러스터 또는 그의 부분에 의해 코딩되는 단백질 변이체 (Gou A, GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, GouM, 및/또는 GouN을 포함하나 이에 제한되지 않음), 및 이러한 변이체를 코딩하는 핵산 분자의 생산을 추가로 가능하게 한다.
스트렙토미세스 미크로플라부스 균주로부터 확인되는, 서열 43 (뉴클레오티드 잔기 1-21933) 내에 포함된 고제로틴 유전자 클러스터는 ORF 4248 내지 4271로 지칭되는 24개의 ORF를 포함한다. ORF 4251, 4252, 4253, 4255, 4256, 4257, 4258, 4259, 4261, 4262, 4263, 4264, 4265, 및 4271은 각각 13개의 유전자 gouA, gouB, gouC, gouD, gouE, gouF, gouG, gouH, gouI, gouJ, gouK, gouL, gouM, 및 gouN이다. 서열 89-100 (스트렙토미세스 푸니세우스 균주로부터 확인되는 것)은 각각의 오르토로그 유전자 gouB, gouC, gouD, gouE, gouF, gouG, gouH, gouI, gouJ, gouK, gouL, gouM을 제공함에 주목한다. 이들 유전자의 잠재적인 기능 및 고제로틴 합성에서의 그의 가능한 역할이 표 2에 제공된다.
본원의 개시된 유전자좌의 서열 (서열 43) 및 그 내에 함유된 ORF를 기초로, 시험관내 핵산 증폭 (PCR을 포함하나 이에 제한되지는 않음)은 상기 표 1에 열거된 고제로틴 생합성 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 서열을 생산하기 위한 간단한 방법으로서 사용될 수 있다. 하기는 이러한 방식으로 단백질-코딩 핵산 분자를 제조하기 위한 대표적인 기술을 제공한다.
RNA 또는 DNA는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 다양한 방법 중 어느 하나에 의해 세포로부터 추출된다. [Sambrook et al. (in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) 및 Ausubel et al. (in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992)]은 RNA 또는 DNA 단리를 위한 방법의 대표적인 설명을 제공한다. 고제로틴 생합성 효소는 스트렙토미세스 미크로플라부스 내에서 적어도 발현된다. 따라서, 일부 예에서, RNA 또는 DNA는 스트렙토미세스 미크로플라부스 세포로부터 추출될 수 있다. 추출된 RNA는 예를 들어 cDNA를 생산하기 위한 역전사 (RT)-PCR 증폭을 수행하기 위한 주형으로서 사용될 수 있다. RT-PCR을 위한 대표적인 방법 및 조건이 [Kawasaki et al. (in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds.) 21-27 Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1990)]에 기재되어 있다.
증폭 프라이머의 선택은 증폭시키고자 하는 DNA의 부분(들)에 따라 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 DNA의 절편 (예를 들어, 특정 ORF 또는 인접 ORF 세트)을, 또는 또 다른 실시양태에서 전체 DNA 분자를 증폭시키기 위해 선택될 수 있다. 상이한 길이 및 조성의 프라이머 및 앰플리콘을 수용하기 위해 증폭 조건에서 변화가 요구될 수 잇다. 이러한 고려사항은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 [Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1990)]에 논의되어 있다. 예로서, 선택된 고제로틴 생합성 단백질을 코딩하는 핵산 분자 (예컨대 gouA 내지 gouN 중 어느 하나 또는 그의 조합)는 원형 스트렙토미세스 미크로플라부스 gouA, gouB, gouC, gouD, gouE, gouF, gouG, gouH, gouI, gouJ, gouK, gouL, gouM, 및/또는 gouN 서열의 5'- 및 3'-말단에 지시된 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 많은 상이한 프라이머가 제공된 핵산 서열로부터 유래될 수 있음이 인식될 것이다. 증폭된 서열의 확인을 용이하게 하고 고제로틴과 증폭된 서열 사이의 천연 변이에 대한 정보를 제공하기 위해 임의의 증폭 절차에 의해 수득된 증폭 산물의 재-서열분석이 권고된다. 임의의 고제로틴 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드가 예를 들어 상응하는 고제로틴 (또는 고제로틴-관련) 앰플리콘의 서열분석에 사용될 수 있다.
또한, 통상의 혼성화 및 PCR 증폭 절차 둘 다를 사용하여 고제로틴 유전자 클러스터, 또는 고제로틴 ORF (예를 들어, 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 및 41 중 하나 이상)의 오르토로그를 코딩하는 서열을 클로닝할 수 있다. 이들 양쪽 기술의 공통점은 상류 및 하류 플랭킹 영역을 함유하거나 함유하지 않는 고제로틴 유전자 클러스터 또는 고제로틴 ORF 핵산 서열로부터 유래된 프로브 또는 프라이머의 혼성화이다. 또한, 혼성화는 노던 블롯, 서던 블롯 또는 PCR과 관련하여 일어날 수 있다.
해당 박테리아 종으로부터 제조된 DNA 라이브러리에 대해 직접 PCR 증폭이 수행될 수 있거나, 또는 표준 방법을 사용하여 박테리아 세포로부터 추출된 RNA를 사용하여 RT-PCR이 수행될 수 있다. PCR 프라이머는 상류 및 하류 플랭킹 영역을 함유하거나 함유하지 않는 고제로틴 유전자 클러스터 또는 고제로틴 ORF 핵산 서열의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 통상의 기술자는 고제로틴 유전자 클러스터 또는 고제로틴 ORF 핵산 서열 및 증폭시키고자 하는 표적 핵산 사이의 서열 차이가 보다 낮은 증폭 효율을 야기할 수 있음을 인식할 것이다. 이를 보완하기 위해, 증폭 사이클 동안 보다 긴 PCR 프라이머 또는 보다 낮은 어닐링 온도를 사용할 수 있다. 보다 낮은 어닐링 온도가 사용될 경우에, 증폭 특이성을 증진시키기 위해 네스티드 프라이머 쌍을 사용한 순차적인 증폭 라운드가 유용할 수 있다.
개시된 고제로틴 생합성 단백질의 오르토로그는 스트렙토미세스 속의 다수의 다른 구성원 내에, 스트렙토미세스 미크로플라부스 종의 다른 균주 내에, 및 다른 고제로틴-생산 유기체 내에 존재할 수 있다. 개시된 고제로틴 유전자 클러스터의 핵산 서열 및 그의 ORF 4251-4253, 4255-4259, 4261-4265 및 4271, 뿐만 아니라 플랭킹 및 개재 ORF 4248-4250 및 4266-4270을 기초로, 이들 다른 유기체 내의 고제로틴 생합성 효소 오르토로그를 코딩하는 단백질-코딩 DNA (예컨대, ORF) 및 유전자 클러스터의 표준 방법에 의한 클로닝이 현재 가능하다. 예를 들어 시토신 신타제 (ORF 4258; gouG; 서열 15 & 16) 또는 CGA 신타제 (ORF 4261; gouI; 서열 21 & 22)를 비롯하여 개시된 고제로틴 생합성 효소 및 단백질의 오르토로그는 본원에 개시된 바와 같은 생물학적 활성 또는 기능을 갖는다.
오르토로그는 개시된 고제로틴 생합성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 및 41 중 하나 이상)과 적어도 65% 서열 동일성을 일반적으로 공유할 것이다. 구체적 실시양태에서, 오르토로그 고제로틴 유전자 클러스터 또는 고제로틴 ORF는 개시된 스트렙토미세스 미크로플라부스 또는 스트렙토미세스 푸니세우스 뉴클레오티드 또는 적용가능한 경우에 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
통상의 혼성화 기술을 위한 혼성화 프로브는 검출가능한 표지, 예컨대 방사성 표지와 바람직하게 접합되고, 프로브는 바람직하게는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 혼성화 프로브의 길이를 증가시키는 것은 증진된 특이성을 제공하는 경향이 있다. 고제로틴 유전자 클러스터로부터 또는 고제로틴 ORF 핵산 서열로부터 유래된 표지된 프로브는 박테리아 DNA 라이브러리에 혼성화될 수 있고, 혼성화 신호는 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 혼성화 콜로니 또는 플라크 (사용되는 라이브러리의 유형에 의존함)는 정제될 수 있고, 콜로니 또는 플라크 내에 함유되어 있는 클로닝된 서열은 단리 및 특성화될 수 있다.
구체적 예에서, 게놈 라이브러리 구축은 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 스트라타진(Stratagene), 에픽센터(Epicentre)) 다양한 코스미드 또는 포스미드 시스템을 사용하여 신속하게 달성될 수 있다. 유리하게는, 이들 시스템은 클로닝된 DNA의 불안정성을 최소화한다. 이러한 예에서, 게놈 라이브러리 스크리닝 후 코스미드 또는 포스미드를 단리하고, 중복되는 클론 패밀리로 그룹화하고, 클러스터 정체 확립을 위해 분석한다. 코스미드 단부 서열분석을 사용하여 천연 생성물 구조 및 그의 추정 생합성 기원으로부터 예측되는 예상 경로 특성에 기초하여 특정한 클론의 관련성에 대한 사전 정보를 수득할 수 있다.
고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 또는 하류 플랭킹 영역) 또는 고제로틴 ORF 핵산 서열의 오르토로그가 발현 라이브러리의 면역스크리닝에 의해 대안적으로 수득될 수 있다. 본원에 제공되는 개시된 유전자좌 (서열 43)를 기초로, 상응하는 단백질이 이종 발현 시스템 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli))에서 발현 및 정제될 수 있고, 고제로틴 생합성 효소 또는 단백질, 예컨대 GouA, GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, GouM, 및/또는 GouN에 특이적인 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 생성하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 본원에 제시된 고제로틴 아미노산 서열 (서열 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 42 및/또는 서열 77-88)로부터 유래된 합성 펩티드에 대해 생성될 수 있다. 항체를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, [Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, 1988]에 일반적으로 기재되어 있다. 이러한 항체는 박테리아로부터 생산된 발현 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 스크리닝은 고제로틴 오르토로그를 확인할 것이다. 선택된 DNA는 서열분석 및 효소 활성 검정에 의해 확인될 수 있다.
고제로틴 유전자 클러스터 (서열 43) 또는 유전자 클러스터의 ORF를 코딩하는 핵산 서열 (서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 및 41), 또는 이들 핵산 서열의 단편으로부터 유래된 올리고뉴클레오티드는 본 개시내용의 범위 내에 포괄된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 및 하류 플랭킹 영역) 또는 고제로틴 ORF 핵산 서열의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드가 시험관내 증폭 절차 (예컨대 PCR)와 함께 사용되는 경우에, 올리고뉴클레오티드 길이를 늘리는 것은 증폭 특이성을 증진시킬 수 있다. 따라서, 다른 실시양태에서, 이들 서열의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 고제로틴 생합성 효소를 코딩하는 핵산 분자의 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 (예컨대 예를 들어 서열 15 또는 21)는 표적 서열, 예컨대 또 다른 스트렙토미세스 종 (또는 다른 고제로틴-생산 종)으로부터의 DNA 라이브러리 내에 존재하는 고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 및 하류 플랭킹 영역) 또는 고제로틴 상동체에, 단지 15개의 뉴클레오티드의 상응하는 프라이머보다 더 높은 특이성으로 어닐링할 것이다. 더 큰 특이성을 수득하기 위해, 프로브 및 프라이머는 고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 및 하류 플랭킹 영역) 또는 고제로틴 ORF 뉴클레오티드 서열의 적어도 17, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드를 포함하도록 선택될 수 있다. 특정한 예에서, 프로브 또는 프라이머는 개시된 고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 및 하류 플랭킹 영역) 또는 고제로틴 ORF 서열의 적어도 100, 250, 500, 600 또는 1000개의 연속 핵산일 수 있다.
올리고뉴클레오티드 (예컨대 프라이머 또는 프로브)는 개시된 고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 및 하류 플랭킹 영역) 또는 고제로틴 ORF 핵산 서열의 임의의 영역으로부터 수득될 수 있다. 예로서, 고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 및 하류 플랭킹 영역) 또는 고제로틴 ORF 서열은 서열 길이에 기초하여 약 1/2, 1/3 또는 1/4로 배분될 수 있고, 단리된 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 분자의 1/2 또는 2/2로부터, 3개의 1/3 중 임의의 것으로부터, 또는 4개의 1/4 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 관심 핵산 서열은 유사한 효과를 갖는 보다 작은 영역, 예를 들어 약 1/8, 1/16, 1/20, 1/50 등으로 세분화될 수 있다. 대안적으로, 이는 보존 도메인을 코딩하는 영역으로 세분될 수 있다.
본원의 고제로틴 생합성 단백질 및 상응하는 핵산 서열을 기초로, 이들 서열의 변이체의 생성이 현재 가능하다. 변이체 고제로틴 생합성 효소는 개시된 원형 효소로부터의 아미노산 서열과는 상이하고 표 1에 열거된 바와 같은 원형 단백질의 생물학적 활성/기능을 여전히 보유하는 단백질을 포함한다. 변이체 효소는 고제로틴에 대한 생합성 전구체 또는 고제로틴의 신규 유사체를 생산하는 그의 활성/기능이 또한 제거될 수 있다.
한 실시양태에서, 변이체 고제로틴 생합성 단백질은 개시된 고제로틴 생합성 단백질 서열 (예를 들어, 서열 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 42 및/또는 서열 77-88)과 아미노산 서열이 상이하지만 이러한 효소 서열과 적어도 65% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, 다른 변이체는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 공유할 것이다. 표준 절차 (예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR)를 사용한 개시된 고제로틴 유전자 클러스터 (+/- 상류 및 하류 플랭킹 영역) 및 고제로틴 ORF 뉴클레오티드 서열의 조작을 사용하여 이러한 변이체를 생산할 수 있다. 가장 단순한 변형은 하나 이상의 아미노산의 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로의 치환을 수반한다. 이들 소위 보존적 치환은 생성되는 단백질의 활성에 최소한의 영향을 가질 수 있다.
고제로틴의 생합성 생산
고제로틴을 생성하기 위한 생합성 방법은 그의 효율적인 생산을 위해 유용하고, 고제로틴 및 그의 유사체의 생산을 위해 유사하게 사용될 수 있다. 따라서, 고제로틴, 고제로틴 전구체(들), 고제로틴 중간체(들), 또는 유전자 클러스터 내에 포함된 효소 또는 단백질의 생산을 증가시키기 위해 이종 숙주, 예컨대 이. 콜라이 또는 다른 스트렙토미세스 종에서의 고제로틴 생합성 유전자 클러스터 또는 그로부터의 ORF의 클로닝 및 발현을 사용할 수 있다. 또한, 유전자 재조합 및 도메인-교환 구축물은 종래의 합성 방법론을 사용하여 제조하기 곤란할 고제로틴 구조의 생성을 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 재조합 발현 시스템은 원핵 숙주로부터 선택된다. 박테리아 세포는 통상의 기술자에게 공지되어 있는 공공 공급원, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC; 버지니아주 마나사스)을 비롯한 수많은 공급원으로부터 입수가능하다. 재조합 단백질 발현을 위해 사용되는 세포의 상업적 공급원은 이러한 세포의 용법에 대한 지침을 또한 제공한다.
고제로틴 유전자 클러스터의 발현을 위한 하나의 대표적인 이종 숙주 시스템은 스트렙토미세스 종이다. 구체적 예에서, 스트렙토미세스 종은 매우 큰 크기의 천연 생성물 생합성 유전자 클러스터를 발현시키기 위한 인공 숙주로서 사용되어 왔다 (예를 들어, [Stutzman-Engwall and Hutchinson Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3135-3139, 1989; Motamedi and Hutchinson Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4445-4449, 1987; Grim et al. Gene 151: 1-10 1994; Kao et al. Science 265: 509-512, 1994: 및 Hopwood et al. Meth. Enzymol. 153: 116-166, 1987] 참조). 스트렙토미세스 종은 쉽게 성장하고, 생합성 유전자 클러스터의 발현 및/또는 통합을 위한 플라스미드 및 코스미드가 널리 특성화되어 있고, 기능적 경로를 생산하는데 요구되는 많은 변형 및 보조 효소를 보유하고 있기 때문에 유용한 이종 숙주 시스템이다 (Donadio et al. J. Biotechnol. 99:187-198, 2002). 단편화 균사체를 갖는 숙주 세포는 점도를 낮게 유지하는 이점을 나타낼 수 있고; (다량의 고제로틴을 발현하는 능력에 더하여) 숙주 세포의 추가의 바람직한 특성은 신속한 성장 및 단순 기질 상에서의 성장을 포함한다.
고제로틴 유전자 클러스터 (또는 그의 ORF 중 하나 이상)의 발현을 위한 또 다른 대표적인 이종 숙주 시스템은 이. 콜라이이다. 이. 콜라이는 신속하게-성장하고, 유전자 조작이 용이하기 때문에 매력적인 인공 발현 시스템이다. 이. 콜라이 기반 발현 시스템에서의 최근의 진전은 단일 숙주 유기체 내에서의 다중 유전자의 동시 발현을 위한 노력에 매우 도움이 된다. 복합 생합성 시스템으로부터의 다중 ORF가 현재 이. 콜라이 내에서 동시 발현될 수 있다.
발현 시스템의 선택은, 그러나 발현되는 폴리펩티드에 대해 목적하는 특성에 의존할 것이다. 임의의 형질도입가능한 클로닝 벡터가 본원에 개시된 핵산 구축물에 대한 클로닝 벡터로서 사용될 수 있다. 대형 클러스터를 발현시키고자 하는 경우에, 파지미드, 코스미드, 포스미드, P1, YAC, BAC, PAC, HAC 또는 유사한 클로닝 벡터를 뉴클레오티드 서열의 숙주 세포로의 클로닝을 위해 사용하는 것이 바람직하다. 이들 벡터는 각각 M13 파지 및 람다 파지와 비교하여 보다 큰 DNA 단편을 삽입하고 안정적으로 번식하는 그의 능력으로 인해 유리하다.
한 실시양태에서, 개시된 ORF 및/또는 그의 변이체 중 하나 이상을 통상의 기술자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 하나 이상의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 벡터는 고제로틴 생합성 유전자 또는 고제로틴 유전자 클러스터를 숙주 세포에 도입하기 위해 사용된다. 단단한 세포벽을 갖는 원핵 숙주 세포 또는 다른 숙주 세포는 예를 들어 인산칼슘 침전 또는 전기천공을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 형질전환될 수 있다. 대표적인 원핵생물 형질전환 기술은 예를 들어 [Dower (Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296, Plenum Publishing Corp., 1990) 및 Hanahan et al. (Meth. Enzymol. 204:63, 1991)]에 기재되어 있다. 벡터는 목적하는 ORF에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 제어 서열을 포함한다. 그러나, 발현 카세트의 선택은 선택된 숙주 시스템 및 발현되는 폴리펩티드 또는 천연 생성물에 대해 목적하는 특성에 의존할 수 있다. 전형적으로, 발현 카세트는 선택된 숙주 시스템에서 기능적인 프로모터를 포함하고, 이는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 한 실시양태에서, 발현 카세트는 목적하는 DNA 분자 및 정지 코돈에 더하여 프로모터, 리보솜 결합 부위, 필요한 경우에 개시 코돈, 및 임의로 리더 펩티드를 코딩하는 영역을 포함한다. 또한, 3' 말단 영역 (번역 및/또는 전사 종결인자)이 카세트 내에 포함될 수 있다. DNA 분자를 구성하는 ORF는 전사 및 번역이 숙주 세포 내에서 일어나도록 프로모터에 의해 단독으로 제어될 수 있다. 프로모터-코딩 영역은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 이용가능하다. 프로모터의 예는 박테리아 프로모터 (예컨대 당 대사 효소로부터 유래된 것, 예컨대 갈락토스, 락토스 및 말토스), 트립토판과 같은 생합성 효소로부터 유래된 프로모터 서열, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 박테리오파지 람다 PL 및 TF 및 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
발현 카세트 내의 추가의 조절 서열의 존재는 숙주 세포의 성장과 관련하여 하나 이상의 ORF의 발현 조절을 가능하게 하기 위해 바람직할 수 있다. 이들 조절 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 조절 서열의 예는 화학물질 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자 발현을 온 또는 오프하는 서열 뿐만 아니라 인핸서 서열을 포함한다. 조절 서열에 더하여, 형질전환된 세포의 선택을 보조하기 위해 선택 마커가 포함될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드에 대한 항생제 내성 또는 감수성을 부여하는 유전자를 선택 마커로서 사용할 수 있다.
관심 고제로틴 유전자 클러스터 또는 하나 이상의 고제로틴 ORF를 하나 이상의 재조합 벡터에, 별개의 제어 요소를 갖는 또는 단일 제어 요소 (예를 들어, 프로모터)의 제어 하의 개개의 카세트로서 클로닝될 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, ORF는 하이브리드 합성 경로가 생성될 수 있도록 다른 오픈 리딩 프레임의 용이한 결실 및 삽입을 가능하게 하는 2개 이상의 제한 부위를 포함한다. 이러한 제한 부위의 설계 및 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, PCR 또는 부위-지정 돌연변이유발과 같은 상기 기재된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 형질전환된 세포에 의해 발현되는 단백질은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 표준 방법에 따라 회수될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 단리를 용이하게 하는 편리한 태그와 함께 발현될 수 있다. 또한, 생성된 폴리펩티드는 폴리펩티드에 결합하는 리간드를 사용하는 것에 의한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
다양한 관심 고제로틴 ORF, 유전자 클러스터, 또는 고제로틴 단백질이 고제로틴의 생산에 대해 앞서 기재된 바와 같은 발효 조건을 사용하는 것에 의해 생산될 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 생산 후, 화합물은 예를 들어 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 비롯한 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 방법에 의해 정제되고/거나 분석될 수 있다.
본 발명은 (i) 스트렙토미세스 종의 균주를 스크리닝하는 단계, (ii) 단백질 GouA, GouB, GouC, GouD, GouE, GouF, GouG, GouH, GouI, GouJ, GouK, GouL, 및/또는 GouM을 코딩하는 서열 43 또는 서열 43의 뉴클레오티드 서열의 영역에 대해 적어도 약 65% 서열 동일성, 적어도 약 66% 서열 동일성, 적어도 약 67% 서열 동일성, 적어도 약 68% 서열 동일성, 적어도 약 69% 서열 동일성, 적어도 약 70% 서열 동일성, 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 적어도 약 95% 서열 동일성, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 균주를 선택하는 단계, 및 (iii) 선택된 균주로부터 살응애성 발효 생성물을 생산하는 단계에 의한, 살응애성 및/또는 살진균성 박테리아 생성물을 확인 및/또는 생산하는 방법을 또한 포괄한다. 일부 다른 실시양태에서, 선택하는 단계는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 균주를 선택하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 하기 스트렙토미세스 종의 균주가 스크리닝된다: 에스. 미크로플라부스, 에스. 그리세우스, 에스. 아눌라투스, 에스. 피미카리우스, 에스. 파르부스, 에스. 라벤둘라에, 에스. 알보비리디스, 에스. 푸니세우스, 또는 에스. 그라미네아루스. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 스트렙토미세스 종은 모 스트렙토미세스 균주의 돌연변이체이다. 한 측면에서, 이러한 돌연변이체는 실시예 16에 기재된 방법을 비롯한 본원에 기재된 방식으로, 또는 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 스크리닝 단계에 앞서 모 스트렙토미세스 균주의 돌연변이체를 생성하는 단계가 선행된다. 돌연변이체를 생성하는 방법은 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 선택하는 단계는 균주의 발효 브로쓰를 제조하는 단계 및 적어도 약 60%의 잎응애 효력을 또한 갖는 균주를 선택하는 단계를 또한 수반한다. 이러한 선택하는 단계는 서열 동일성에 기초하여 선택하는 단계 전 또는 후에 이루어질 수 있다. 발효 생성물을 생산하고 살응애 활성을 테스트하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 생산하는 단계 (단계 (iii))의 발효 생성물은 적어도 약 1 g/L, 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L, 적어도 약 6 g/L, 적어도 약 7 g/L, 적어도 약 8 g/L, 적어도 약 9 g/L, 또는 적어도 약 10 g/L의 고제로틴 농도를 갖는다. 고제로틴 농도를 측정하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
기탁 정보
본 발명의 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주의 샘플은 2011년 8월 19일자로 부다페스트 조약 하에 미국 61604 일리노이주 피오리아 노스 유니버시티 스트리트 1815의 미국 농무부 농업 연구소 국립 농업 이용 연구 센터에 위치한 아그리컬쳐럴 리서치 서비스 컬쳐 콜렉션(Agricultural Research Service Culture Collection)에 기탁되었고, 하기 수탁 번호: NRRL B-50550을 할당받았다.
스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 돌연변이체의 샘플 (본원에서 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 M으로 지정되며, 또한 AQ6121.002로도 공지됨)은 2013년 9월 27일자로 부다페스트 조약 하에 미국 61604 일리노이주 피오리아 노스 유니버시티 스트리트 1815의 미국 농무부 농업 연구소 국립 농업 이용 연구 센터에 위치한 아그리컬쳐럴 리서치 서비스 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 이 균주는 2013년 10월 8일자로 부다페스트 조약 하에 미국 20110 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에도 또한 기탁되었다. 이 균주는 2013년 10월 9일자로 캐나다 알3이 3알2 매니토바 윈니페그 알링턴 스트리트 1015에 위치한 캐나다 국제 기탁 기관에도 또한 기탁되었고, (임시) 수탁 번호 091013-02를 할당받았다.
본원에서 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A로 지칭되는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주의 샘플 (및 또한 AQ7439로도 공지됨)은 2013년 10월 8일자로 부다페스트 조약 하에 미국 20110 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 이 균주는 2013년 10월 9일자로 캐나다 알3이 3알2 매니토바 윈니페그 알링턴 스트리트 1015에 위치한 캐나다 국제 기탁 기관에도 또한 기탁되었고, (임시) 수탁 번호 091013-01을 할당받았다.
하기 실시예는 본 발명을 단지 예시하기 위해 비제한적인 목적으로 제공된다.
실시예
실시예 1 - 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 선택
균주를 균주의 내부 수집물로부터 채취하고, 일반적인 살응애 활성을 스크리닝하기 위해 통상적으로 사용되는 모델 유기체인 2-점박이응애 ("TSSM")에 대한 잠재적인 후보 균주의 효능을 결정하기 위해 초기 스크리닝 테스트를 수행하였다. 미생물은 먼저 한천 플레이트 상에서 신속하게 성장하는 변이체와 같은, 실험실 또는 인공 배양을 선호하는 특성에 대해 선택되었다. 선택된 균주의 배양 원액을 각각의 균주에 대해 적합한 배지, 예컨대 실시예 2에 기재된 배지 1 및 배지 2에서 성장시켰다. 생성된 발효 생성물 (전체 브로쓰)을 물 및 0.03%의 계면활성제 브레이크-스루 퍼스트 초이스(BREAK-THRU FIRST CHOICE)® 폴리에테르-폴리메틸실록산-공중합체를 사용하여 25% 용액으로 희석시켰다. 그 후, 8 mL의 희석된 발효 생성물을 2그루의 식물의 리마콩 잎의 상부 및 하부에 흘러내릴 때까지 적용하였다 (리마콩 식물은 1 내지 1.5주령임). 이러한 처리 후 같은 날에 식물을 50-100마리의 TSSM으로 감염시키고, 온실에서 5일 동안 두었다. 제5일에, 응애 및 충란의 존재에 대해 1 내지 4의 척도로 식물을 평가하였다. 살응애제 아비드(AVID)® (아바멕틴, 신젠타(Syngenta))를 양성 대조군으로서 사용하였다. 응애 및 충란에 대해, 1은 100% 사멸률을 나타내고, 1.5는 90% 내지 95% 사멸률을 나타내고, 2.0은 75% 내지 90% 사멸률을 나타내고; 2.5는 40% 내지 55% 사멸률을 나타내고; 3.0은 20% 내지 35% 사멸률을 나타내고; 4.0은 0% 내지 10% 사멸률을 나타낸다. NRRL B-50550 이외에도, 다른 스트렙토미세스 균주 및 일부 바실루스 균주가 응애에 대해 활성임을 발견하였다.
필드 적용에 효과적이기 위해서는 살진드기제가 UV 광에 대해 안정하고 엽신통과 활성을 보유해야 하므로, 추가의 선택을 위해 다른 활성 중에서, 스크리닝된 균주의 UV 안정성 및 엽신통과 활성을 조사하였다.
UV 안정성의 평가를 위해, 상기-기재된 발효 생성물의 25% 희석물을 리마콩 식물의 상부 표면에 분무하였다. 이러한 처리 후 같은 날에 식물을 50-100마리의 TSSM으로 감염시키고, UV 광에서 24시간 동안 노출시키고, 온실에서 5일 동안 두었다. 잎에 적용되어 응애가 지나갈 수 없는 경계로서 작용하는 바셀린 고리에 의해 응애는 잎의 향축성 (상부) 표면으로 국한되었다. 제5일에, 응애 및 충란의 존재에 대해 상기 기재된 바와 같이 1 내지 4의 척도로 식물을 평가하였다. 살응애제 아비드® (아바멕틴, 신젠타) 및 오베론(OBERON)® (스피로메시펜, 바이엘 크롭사이언스 아게(Bayer CropScience AG))을 대조군으로서 사용하였다. 결과를 도 1에 제시한다. 균주 NRRL B-50550의 발효 생성물은 테스트된 모든 균주 중에서 최고의 UV 안정성을 나타내었다.
엽신통과 활성의 평가를 위해, 균주를 상기 기재된 바와 같이 배양하고, 생성된 전체 브로쓰를 물 및 0.35% 계면활성제를 사용하여 희석하고, 2그루의 식물의 리마콩 잎의 하부 표면에 흘러내릴 때까지 적용하였다. 처리 후 1일째에 처리된 잎의 상부 표면을 50-100마리의 TSSM으로 감염시켰고, 이들은 잎의 상부 표면에 놓고 상기 기재된 바와 같이 바세린 고리/물리적 장벽을 사용하여 함유시켰다. 제6일에, 응애 및 충란의 존재에 대해 1 내지 4의 상기 기재된 척도로 식물을 평가하였다. 살응애제 아비드® (아바멕틴, 신젠타) 및 오베론® (스피로메시펜, 바이엘 크롭사이언스 아게)을 대조군으로서 사용하였다. 결과를 도 2에 제시한다. 균주 NRRL B-50550의 발효 생성물은 테스트된 모든 균주 중에서 최고의 엽신통과 활성을 나타내었다.
실시예 2 - 잎응애에 대한 활성
2-점박이응애 ("TSSM")에 대한 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 효능을 보다 면밀하게 결정하기 위해 추가의 테스트를 수행하였다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 배양 원액을 1 L 진탕 플라스크에서 배지 1 또는 배지 2에서 28℃에서 5일 동안 성장시켰다. 배지 1은 2.0% 전분, 1.0% 덱스트로스, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 카세인 가수분해물 및 0.1% CaCO3으로 구성되었다. 배지 2는 2% 프로플로(ProFlo) 목화 종자분, 2% 맥아 추출물, 0.6% KH2PO4 및 0.48% K2HPO4로 구성되었다. 생성된 발효 생성물을 물 및 0.03% 계면활성제 브레이크-스루 퍼스트 초이스® (폴리에테르-폴리메틸실록산-공중합체)를 사용하여 25% 용액으로 희석시키고, 6 mL를 2그루의 식물의 리마콩 잎의 상부 및 하부에 흘러내릴 때까지 적용하였다. 이러한 처리 후 같은 날에 식물을 50-100마리의 TSSM으로 감염시키고, 온실에서 5일 동안 두었다. 제6일에, 응애 및 충란의 존재에 대해 1 내지 4의 척도로 식물을 평가하였다. 살응애제 아비드® (아바멕틴, 신젠타)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 응애 및 충란에 대해, 1은 100% 사멸률을 나타내고, 1.5는 90% 내지 95% 사멸률을 나타내고, 2.0은 75% 내지 90% 사멸률을 나타내고; 2.5는 40% 내지 55% 사멸률을 나타내고; 3.0은 20% 내지 35% 사멸률을 나타내고; 4.0은 0% 내지 10% 사멸률을 나타낸다. 결과를 하기 표 3에 제시한다. 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL B-50550의 발효 생성물은 둘 다 90% 이상의 응애의 사멸률을 야기하였다.
<표 3>
Figure pct00008
아몬드 내의 퍼시픽 잎응애, 포도 내의 퍼시픽 잎응애, 및 딸기 내의 2-점박이응애에 대한 필드 시험은 상기 온실 결과를 확인시켜주었다. 아몬드 내의 퍼시픽 잎응애에 대한 필드 시험의 결과를 하기 표 4-6에 보고한다. 살응애제 아그리-멕(AGRI-MEK)® (아바멕틴, 신젠타)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 배지 1을 함유하는 진탕 플라스크에 NRRL B-50550의 동결 배양물을 접종하고, 28-30℃에서 1-2일 성장시켰다. 생성된 발효 생성물을 사용하여 하기 배지: 6.0% 전분, 3.0% 덱스트로스, 1.5% 효모 추출물 및 1.5% 카세인 가수분해물 및 0.3% 탄산칼슘을 함유하는 20 L 생물반응기에 시딩하였다. 이러한 배지를 28℃ 사이에서 7일 동안 발효시켰다. 생성된 전체 브로쓰를 사용하여 동결 건조된 분말 ("FDP")을 생성하였고, 이를 0.03%의 아주반트, 브레이크-스루 퍼스트 초이스® (폴리에테르-폴리메틸실록산-공중합체)와 혼합한 다음 시험에 사용하였다.
<표 4> 성체 응애에 대한 활성
Figure pct00009
<표 5> 유생 응애에 대한 활성
Figure pct00010
<표 6> 응애 충란에 대한 활성
Figure pct00011
실시예 3 - 시트러스 응애에 대한 필드 활성
발렌시아 오렌지 상의 시트러스 녹응애 (필로코프트루타 올레이보라)에 대한 NRRL B-50550의 효능을 결정하기 위해 필드 시험을 수행하였다. 배지 1 (실시예 2 참조)을 함유하는 진탕 플라스크에 NRRL B-50550의 동결 배양물을 접종하고, 20-30℃에서 1-2일 성장시켰다. 이를 반복하였다. 생성된 발효 생성물을 사용하여 하기 배지: 6.0% 전분, 3.0% 덱스트로스, 1.5% 효모 추출물, 2.0% 대두 산 가수분해물, 0.6% 글리신, 및 0.2% 탄산칼슘을 함유하는 20 L 생물반응기에 시딩하였다. 이 배지를 28℃ 사이에서 8일 동안 발효시켰다. 생성된 전체 브로쓰를 사용하여 하기 시험에 사용되는 동결 건조된 분말 ("FDP")을 생성하였다. 동결 건조된 분말을 물 중에 희석하고, 100 gal/에이커로 하기 표 7에 제시된 비율로 적용하였다. 살응애제 엔비도르(ENVIDOR)® (스피로디클로펜, 바이엘 크롭사이언스, 독일)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 처리 1-3에서, 브레이크-스루 퍼스트 초이스® 아주반트 (폴리에테르-폴리메틸실록산-공중합체, 상기 참조)를 0.66% v/v로 첨가하였다. 0.625 lb/A의 비율로 적용된 발효 생성물이 16-fl oz/A의 비율로 적용된 엔비도르® 스피로디클로펜보다 더 우수한 살응애 활성을 나타내었다.
<표 7>
Figure pct00012
실시예 4 - 다른 응애에 대한 활성
연구는 NRRL B-50550이 에리오피드 (적갈색) 응애 및 차먼지 응애를 비롯한 다양한 다른 응애에 대해 활성임을 보여주었다. 발효 브로쓰를 실시예 2에 기재된 필드 시험을 위한 것과 같이 제조하였다. 생성된 발효 브로쓰를 물 및 0.35% 계면활성제를 사용하여 다양한 농도로 희석하고, 10 mL의 희석된 브로쓰를 2그루의 식물의 리마콩 잎의 상부 및 하부에 흘러내릴 때까지 적용하였다. 식물을 처리 당일에 감염시키고, 처리 후 6일째에 적갈색 응애의 존재에 대해 상기 기재된 척도로 평가하였다. 점수 4는 평가시 비방제 및 적어도 100마리의 적갈색 응애의 존재를 나타낸다. 살응애제 아비드® (아바멕틴)를 양성 대조군으로서 사용하였다.
<표 8>
Figure pct00013
실시예 5 - 잔효 활성
다른 연구는 NRRL B-50550이 잔효 활성을 가짐을 밝혀내었다. 실시예 2의 배지 1을 함유하는 진탕 플라스크에 NRRL B-50550의 루리아 브로쓰 기반 배양물 (NRRL B-50550의 동결 배양물을 접종한 것)을 접종하고, 28℃에서 1-2일 성장시켰다. 생성된 발효 생성물을 사용하여 하기 배지: 8.0% 덱스트로스, 1.5% 효모 추출물, 1.5% 카세인 가수분해물 및 0.1% 탄산칼슘을 함유하는 20 L 생물반응기에 시딩하였다. 이러한 배지를 28℃ 사이에서 7-8일 동안 발효시켰다. 생성된 발효 생성물을 물 및 0.35% 계면활성제를 사용하여 3.13% 용액으로 희석하고, 8 mL의 희석된 브로쓰를 2그루의 식물의 리마콩 잎의 상부 및 하부에 흘러내릴 때까지 적용하였다. 식물을 이러한 처리 후 6일째에 50-100마리의 TSSM으로 감염시키고, 처리 후 12일째에 응애 및 충란의 존재에 대해 상기 기재된 척도로 평가하였다. 살응애제 아비드® (아바멕틴)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 결과를 하기 표 9에 제시한다.
<표 9>
Figure pct00014
처리된 식물에 초기에 노출된 응애에 대한 효과 이외에, 나중의 시점에 처리된 잎으로 이동할 수 있는 응애에 대한 효과를 또한 평가하였다. 모든 식물을 제0일에 실시예 13에 기재된 것과 유사한 방식으로 생산된 6.25% 또는 1.56% 전체 브로쓰로 처리하였다. 이어서, 처리 후 1-주 간격으로 식물 군에 응애를 첨가하였다. 이러한 처리 세트에는 비교를 위한 다른 살응애제를 포함시켰다. 처리 후 각각 5주 동안 응애를 첨가하였다. 활성은 5주의 기간에 걸쳐 유지되었고, 활성 감소 속도는 오베론® (스피로메시펜) 제품과 유사하고 아비드® 제품보다는 약간 더 높았다. 이 연구는 리마콩 식물의 초생엽을 처리한 경우에, 나중에 출아되는 잎은 보호되지 않음을 또한 보여주었다.
실시예 6 - 엽신통과 활성
NRRL B-50550이 엽신통과 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 전체 브로쓰를 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하였다. 생성된 전체 브로쓰를 물 및 0.35% 계면활성제를 사용하여 희석하고, 10 mL의 희석된 브로쓰를 2그루의 식물의 리마콩 잎의 하부 표면에 흘러내릴 때까지 적용하였다. 처리된 잎의 상부 표면을 처리 후 1일째에 50-100마리의 TSSM으로 감염시켰고, 이들은 잎의 상부 표면에 놓고 잎의 상부 표면 상에 배치한 바세린 고리/물리적 장벽을 사용하여 함유시켰다. 처리 후 5일째에 응애 및 충란의 존재에 대해 상기 기재된 척도로 식물을 평가하였다. 결과를 하기 표 10에 제시한다.
<표 10>
Figure pct00015
실시예 7 - 살란 활성
NRRL B-50550에 대해 하기와 같이 살란 활성을 테스트하였다. 전체 브로쓰를 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하였다. 성체 암컷 응애가 처리전 48시간 동안 잎 표면 상에 산란하도록 허용함으로써 2그루의 리마콩 식물을 TSSM 충란으로 예비감염시켰다. 이어서 식물을 8 mL의 전체 브로쓰의 다양한 희석물로 처리하였다. 식물을 처리 후 5일째에 평가하였다. 각각의 처리군 및 대조군에 존재하는 살아있는 충란 및 죽은 충란의 개수를 하기 표 11에 제시한다.
<표 11>
Figure pct00016
실시예 8 - 드렌치 활성
모래에서 성장시킨 리마콩을 사용하여 NRRL B-50550의 드렌치 활성을 연구하였다. 전체 브로쓰를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 전체 브로쓰의 12.5% 희석물의 각각 10 mL의 2회의 적용을 모래에 대해 적용하였다. 전체 브로쓰가 포트의 하부로부터 침출되는 것을 방지하기 위해 식물에 조심스럽게 급수하였다. 식재 후 4일째 및 식재 후 5일째에 적용을 행하였다. 처리 2일 후 3일째에 운동성 TSSM로 하엽을 감염시켰다. 하엽을 감염시킨 후 9일째에 상엽 삼출엽을 감염시켰다. 감염 후 4, 5, 8 및 11일째에 하엽에 대한 평가를 수행하였다. 감염 후 2일째에 상엽에 대한 평가를 수행하였다. 실시예 2에 기재된 점수화 시스템에 기초한 결과를 하기 표 12에 제시한다.
<표 12>
Figure pct00017
실시예 9 - 진균 식물병원체에 대한 활성
NRRL B-50550에 대해 다양한 식물 진균 병원체에 대한 활성을 테스트하였다. 이는 밀 잎 녹병 및 오이 흰가루병 둘 다에 대해 활성임을 발견하였다. 배지 1을 함유하는 진탕 플라스크에 NRRL B-50550의 동결 배양물을 접종하고, 20-30℃에서 1-2일 성장시켰다. 생성된 발효 생성물을 사용하여 유사한 배지를 함유하는 20 L 생물반응기에 시딩하고, 28℃에서 1-2일 성장시켰다. 차례로, 생성된 발효 생성물을 사용하여 하기 배지: 7.0% 전분, 3.0% 덱스트로스, 1.5% 효모 추출물, 2.0% 대두 산 가수분해물, 0.8% 글리신, 및 0.2% 탄산칼슘을 함유하는 200 L 발효기에 시딩하였다. 이 배지를 26℃ 사이에서 8일 동안 발효시켰다. 6일령 밀 묘목을 하기 표 13에 제시된 0.03% 아주반트 (브레이크-스루 퍼스트 초이스® 폴리에테르-폴리메틸실록산-공중합체)를 함유하는 증류수 중의 다양한 희석물로 제조된 NRRL-50550 전체 브로쓰로, 양쪽 잎 표면이 전체 브로쓰로 피복되고 건조되게 함으로써 처리하였다. 이러한 처리 후 1일째에 묘목에 밀 잎 녹병 현탁액을 접종하였다. 처리 후 약 1주째에 하기 0-100% 방제의 척도를 사용하여 식물을 평가하였고, 여기서 0%은 비방제를 나타내고 100%는 완벽한 방제를 나타낸다.
<표 13>
Figure pct00018
또한, NRRL B-50550은 전체 브로쓰를 하엽 표면에 적용하고 병원체를 상엽 표면에 적용한 경우에 오이 흰가루병에 대해 활성을 나타내었다.
NRRL B-50550은 오이 흰가루병에 대한 치유 테스트에서도 또한 활성을 나타내었다. 식물이 마이크로플롯 위에 우거진 수관을 형성한 시점에 오이 마이크로플롯에 오이 흰가루병을 접종하였고, 천연 흰가루병은 인접한 플로츠리드에서 바로 발생을 시작하였다. 감염 후 6일째에, 접종으로 인한 질병의 어떤 가시적 증거도 존재하지 않았다. NRRL B-50550의 동결-건조된 분말을 실시예 13에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조된 발효 브로쓰로부터 수득하였다. 이어서 동결-건조된 분말을 불활성 성분 (습윤제, 안정화제, 담체, 유동 보조제 및 분산제)와 함께 제제화하여 습윤성 분말을 제조하였다. 제제화된 생성물은 75 중량% 동결-건조된 분말을 포함하였다. 습윤성 분말을 물 중에 희석하고, 하기 표 14에 제시된 비율로 100 gal/에이커로 적용하였다. (에이커당 100 갤런은 마이크로플롯당 200 mL의 분무 부피로 해석됨에 주목한다.) 상기 기재된 것과 동일한 척도로 평가를 수행하였다.
<표 14>
Figure pct00019
실시예 10 - 옥수수 뿌리벌레 활성
옥수수 뿌리벌레에 대한 NRRL B-50550의 효능을 결정하기 위한 테스트를 수행하였다. NRRL B-50550 전체 브로쓰를 실시예 2에 기재된 바와 같이 배지 1 또는 배지 2 중에서 제조하였다. NRRL B-50550 전체 브로쓰를 희석하고, 마이크로타이터 플레이트에서 수행되는 식이-기반 검정에서 서부 점박이 오이 딱정벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타)의 유충에 공급하였다. 활성을 평가하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 1 내지 4의 척도로 평가하였다. 살흰개미제/살곤충제 테르미도르(TERMIDOR)® SC (5-아미노-1-(2,6-디클로로-4(트리플루오로메틸)페닐)-4-((1,R,S)-(트리플루오로메틸)술피닐)-1-H-피라졸-3-카르보니트릴, 통상적으로 피프로닐로 공지됨, 바스프(BASF))를 양성 대조군으로서 사용하였다. 결과를 표 15에 제시한다. NRRL B-50550은 활성 성분 피프로닐을 함유하는 살곤충제 테르미도르® SC와 동일한 살곤충 활성을 나타내었다.
<표 15>
Figure pct00020
실시예 11 - 용량/반응 실험실 검정
상이한 용량의 NRRL B-50550에 대한 TSSM의 반응을 결정하기 위한 연구를 수행하였다. 전체 브로쓰를 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하였다. 생성된 전체 브로쓰를 물 및 0.35% 계면활성제를 사용하여 하기 표 13에 제시된 백분율로 희석하였다. 물 및 0.35% 계면활성제를 대조군 처리물로서 사용하였다. 2개의 개별 시험에서, 전체 브로쓰 용액 및 대조군 처리물을 리마콩 잎의 하부 표면에 흘러내릴 때까지 용량당 4회 반복하여 적용하였다. 이러한 처리 후 1일째에 식물을 50-100마리의 TSSM으로 감염시키고, 처리 후 5일째에 응애 및 충란의 존재에 대해 상기 기재된 척도로 평가하였다. 결과를 하기 표 16에 제시한다.
<표 16>
Figure pct00021
테스트된 가장 낮은 농도 (0.20% 전체 브로쓰)에서, 대조군 처리물과 비교하여 처리의 오차 막대를 기준으로 유의한 사멸률이 관찰되었다. NRRL B-50550의 적용과 연관된 효과의 일부는 그것이 응애로 하여금 식물을 벗어나게 하기 때문인 것으로 관찰되었다. 따라서, 준치사 용량에서도 NRRL B-50550은 식물 상의 응애 집단을 감소시킬 수 있다.
실시예 12 - 아바멕틴-내성 잎응애에 대한 활성
야생형 잎응애 (테트라니쿠스 우르티카에 균주 RW)와 비교하여, 아바멕틴-내성 잎응애 (테트라니쿠스 우르티카에 균주 NL)에 대한 NRRL B-50550의 활성을 결정하기 위한 연구를 수행하였다. 강낭콩 식물을 실시예 9의 마지막 단락에 기재된 바와 같이 제조한 NRRL B-50550의 발효 생성물의 습윤성 분말로, 희석 후 하기 표 17에 제시된 바와 같은 비율로 처리하였다. 처리 하루 전에 식물을 50-100마리의 균주 NL 또는 RW로 감염시키고, 처리 후 7일 및 14일째에 응애의 존재에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표 17에 제시한다.
<표 17>
Figure pct00022
실시예 13 - 증가된 수준의 고제로틴을 함유하는 발효 생성물 - 글리신의 사용
NRRL B-50550의 고제로틴 생산 및 살응애 활성을 최적화하기 위해 발효를 수행하였다. 2 L 진탕 플라스크 내에서 20-30℃에서 10.0 g/L 전분, 15.0 g/L 글루코스, 10.0 g/L 효모 추출물, 10.0 g/L 카세인 가수분해물 (또는 10.0 g/L 대두 펩톤) 및 2.0 g/L CaCO3으로 구성된 배지를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 일차 시드 배양물을 제조하였다. 진탕 플라스크 내에 풍부한 균사체 성장이 존재하는 경우에, 약 1-2일 후, 내용물을 새로운 배지 (상기와 같음, 0.1% 소포제 함유)로 옮기고 400 L 발효기 내에서 20-30℃에서 성장시켰다. 풍부한 균사체 성장이 존재하는 경우에, 약 20-30시간 후, 내용물을 3000 L 발효기로 옮기고, 80.0 g/L (8.0%) 말토덱스트린, 30.0 g/L (3.0%) 글루코스, 15.0 g/L (1.5%) 효모 추출물, 20.0 g/L (2.0%) 대두 산 가수분해물, 10.0 g/L (1.0%) 글리신 및 2.0 g/L (0.2%) 탄산칼슘 및 2.0 ml/L 소포제로 구성된 배지 중에서 160-200시간 동안 20-30℃에서 성장시켰다.
<표 18> 수율 및 정규화된 고제로틴 생산성
Figure pct00023
예로서 제1 3000 L 발효를 사용하는 경우에, 발효기 내의 고제로틴의 수율은 다음과 같이 계산된다. 3397 kg x 1.7 mg/g 발효 브로쓰 = 5774.90 g 고제로틴 = 5.78 kg. 발효기 내의 초기 중량은 3496 kg이었고 (3256 kg 배지 + 240 kg 시드), 이는 표적 부피 3000 L보다 더 큰 최종 부피를 생성시켰다. 표적 부피 3000 L는 생산 배지 내의 모든 성분의 양을 계산한 것을 기준으로 하기 때문에, 정규화된 부피 생산성은 5774.9 g/3000 L = 1.9 g/L이다. 이러한 고제로틴 농도는 최종 발효 단계 및 (아미노산으로서) 글리신을 함유하는 배지에 의한, 상기 기재된 것과 동일한 배지를 사용하여 수행한 20 L 발효에서 달성된 1.8 g/L과 유사하였다.
본원 전체에 걸쳐 하기 실시예 16 및 19에 기재된 바와 같은 분석용 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 고제로틴 수준을 검출하였다.
실시예 14 - 증가된 수준의 고제로틴을 함유하는 발효 생성물 - 글루탐산의 사용
NRRL 번호 B-50550의 고제로틴 생산 및 살응애 활성을 최적화하기 위해 발효를 수행하였다. 1 L 진탕 플라스크 내에서 20-30℃에서 10.0 g/L 전분, 15.0 g/L 글루코스, 10.0 g/L 효모 추출물, 10.0 g/L 카세인 가수분해물 (또는 10.0 g/L 대두 펩톤) 및 2.0 g/L CaCO3으로 구성된 배지를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 일차 시드 배양물을 제조하였다. 진탕 플라스크 내에 풍부한 균사체 성장이 존재하는 경우에, 약 1-2일 후, 내용물을 새로운 배지 (상기와 같음, 0.1% 소포제 함유)로 옮기고 1 L 진탕 플라스크 내에서 20-30℃에서 성장시켰다. 풍부한 균사체 성장이 존재하는 경우에, 약 20-30시간 후, 내용물을 20 L 발효기로 옮기고, 60.0 g/L (8.0%) 전분, 30.0 g/L (3.0%) 덱스트로스, 15.0 g/L (1.5%) 효모 추출물, 20.0 g/L (2.0%) 대두 산 가수분해물, 12.0 g/L (1.0%) L-글루탐산 및 2.0 g/L (0.2%) 탄산칼슘 및 2.0 mL/L 소포제로 구성된 배지 중에서 160-200시간 동안 20-30℃에서 성장시켰다.
이러한 발효에서 아미노산으로서 L-글루탐산을 사용한 이러한 고제로틴 농도는 1.1 g/L였다.
실시예 15 - 증가된 수준의 고제로틴을 함유하는 발효 생성물 - 뉴클레오티드의 사용
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 출원인은 도 6의 가설 합성 경로에 의해 제시된 바와 같이, 고제로틴의 생산에 시토신의 이용가능성이 중요한 것으로 가정하였다. 따라서, 배양 배지 내에 제공되는 시토신의 수준이 증가함에 따라, 수득되는 고제로틴의 양이 또한 증가해야 한다. 본 출원인은 시토신, 티민 및/또는 우라실이 첨가된 배지에서 스트렙토미세스 미크로플라부스 B-50550에 의한 고제로틴 생산을 테스트하였다. 구체적으로, 스트렙토미세스 미크로플라부스 B-50550을 2 L 진탕 플라스크 내의 20.0 g/L 말토덱스트린, 10.0 g/L 글루코스, 5.0 g/L 효모 추출물, 6.0 g/L 대두 단백질 산 가수분해물, 2.0 g/L 글리신, 1.0 g/L CaCO3, 및 각각 0 또는 0.50 g/L의 농도의 시토신, 우라실 및/또는 티민으로 구성된 배지에서 20-30℃에서 6일 동안 성장시켰다. 결과를 하기 표 19에 제시한다.
<표 19>
Figure pct00024
실시예 16 - 고제로틴-과다생산 돌연변이체
고제로틴 생산 및 생물활성을 증가시키는 것을 목표로, 개개의 항생제 (겐타미신, 리팜피신, 스트렙토마이신, 파로모마이신 또는 토브라마이신)에 대해 내성인 돌연변이체의 라이브러리를 생산하는 항생제-내성 돌연변이체 스크리닝 프로그램을 통해 모 균주 스트렙토미세스 미크로플라부스 NRRL 번호 B-50550으로부터 돌연변이체를 생성하였다. [Okamoto-Hosoya, Y., et al., The Journal of Antibiotics 43(12) Dec 2000]을 참조한다. N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 ("NTG")를 사용하여 모 균주를 돌연변이유발한 다음, 생성된 항생제 내성 돌연변이체를 선택하고 스크리닝하였다. 추가의 개발을 위해 고제로틴-과다생산 균주를 선택하는 것으로부터의 돌연변이체 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 대한 상세한 설명은 하기 기재한다.
대략 14일 동안 또는 포자형성시까지 성장시킨 B-50550을 함유하는 대두 분말 말토스 (SFM) 한천 플레이트로부터 스트렙토미세스 미크로플라부스 B-50550의 포자 현탁액을 제조하고, 20% 글리세롤 중에서 -80℃에서 저장하였다. 적합한 완충제 중에 용해시킨 NTG를, 50% 사멸률을 수득하는데 적합한 양으로 포자 현탁액에 첨가하였다 (pH 8.5에서 0.5 mg/mL, 1시간 동안 37℃에서 천천히 진탕됨). 이어서 NTG-처리된 포자 현탁액을 하기 농도의 항생제가 보충된 GYM (글루코스 4 g/L, 효모 추출물 4 g/L, 맥아 추출물 10 g/L, 및 한천 12 g/L) 상에 플레이팅하였다. 하기 표 20을 참조한다.
<표 20>
Figure pct00025
[Kieser, T., et al., Practical Streptomyces Genetics, Ch. 5 John Ines Centre Norwich Research Park, England (2000), pp. 99-107]을 참조한다. 대략 350개의 개별 항생제-내성 콜로니를 단리하고, 정제하고, 하기 기재된 바와 같이 스크리닝하였다.
GYM 항생제 플레이트로부터 떼어낸 각각의 단리물을 SFM 한천 플레이트 상에 재-플레이팅하였다. 항생제-내성 박테리아를 함유하는 한천 플러그를 사용하여 2.5 mL의 시드 배지를 함유하는 24-웰 블록에 접종하였다. 이들 접종된 블록 내의 박테리아를 3일 동안 성장시키고, 생성된 배양 브로쓰를 사용하여 생산 배지를 함유하는 24-웰 블록에 접종하였다. 생산 블록 내의 박테리아를 7일 동안 28℃에서 성장시켰다. 시드 블록 내의 각각의 웰은 트립티카제 대두 브로쓰 (TSB) (DI H20의 리터당: 17 g 박토 트립톤 (카세인의 췌장 소화물), 3 g 박토 소이톤 (대두분의 췌장 소화물), 2.5 g 덱스트로스, 5 g NaCl, 2.5 g 인산이칼륨)를 함유하였고, 생산 블록 내의 각각의 웰은 실시예 2의 배지 2 (프로플로 20 g/L, 맥아 추출물 20 g/L, KH2PO4 일염기성 6 g/L, K2HPO4 이염기성 4.8 g/L)를 함유하였다.
생산 블록의 각각의 웰로부터의 전체 브로쓰에 대해 분석용 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 하기와 같이 고제로틴 생산을 테스트하였다. 2.4 mL 물을 생산 블록의 각각의 웰에 첨가하였다. 블록을 볼텍싱하고 원심분리하였다. 0.8 mL 상청액을 웰당 4 mL의 물을 함유하는 추출 블록으로 옮겼다. 3.2 mL 물을 생산 블록의 각각의 웰 내의 세포 펠릿에 첨가하고, 블록을 볼텍싱하고 다시 원심분리하였다. 이러한 3.2 mL의 세척 물을 이어서 각각의 추출 블록의 적절한 웰에 첨가하였다. 이어서 분석용 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 추출 블록 내의 수성 추출물에 대해 고제로팅 함량을 검정하였다. 구체적으로, 샘플을 다이아몬드 하이브리드 가드 칼럼이 구비된 코그네트 다이아몬드(Cogent Diamond) 하이브리드 칼럼 (100A, 4 μm, 150 x 4.6 mm)에 주입하였다. 칼럼을 30분 아세토니트릴/NH4OAC 구배로 용리시켰다 (하기 참조). 유량은 1 mL/분이었다. 고제로틴은 254 nm에서 검출되었다. 고제로틴은 단일 피크로서 대략 19분의 체류 시간으로 용리되었다. 최고의 과다-생산 돌연변이체는 고제로틴 수준을 확인하기 위해 24 웰 블록 및 250 mL 플라스크 둘 다에서 재-성장시켜 확인하였다. 일단 확인되면, 이어서 일부 단리물을 적어도 1회 추가의 라운드로 돌연변이유발시키고, 항생제-내성 스크리닝하였다. 앞선 라운드에서 유래된 단리물이 내성을 생성하지 못한 나머지 항생제를 사용하여 항생제-스크리닝과 커플링된 돌연변이유발의 각각의 후속 라운드를 수행하였다. 단일 라운드의 스크리닝 후에 고제로틴 생산에서 약간 (1.2x)의 증가가 발견되었고, 후속 라운드는 동일한 본래 낮은 수준의 과다생산자로부터 생성된 단리물로부터 더 큰 증가를 야기하였으며, 이들 연구에서 염기성 배지를 사용하여 소규모로 배양한 경우에 약 0.3 mg/g 고제로틴이 생산되었다. 도 3을 참조한다.
SFM 한천 플레이트 상에서 고제로틴을 더 많이 생산하고 포자형성 능력을 갖는 선택된 돌연변이체를 1 L 배플 진탕 플라스크에서 성장시킨 후, 배지 2를 함유하는 5 L 사르토리우스(Sartorius) B-플러스 생물반응기 및/또는 20 L 생물반응기로 규모 확대시켰다. 도 4를 참조한다.
도 3 및 4의 라운드 3 단리물 4로서 지정된 균주를 실시예 13에 기재된 공정에 따른 규모-확대를 위해 선택하였다. 이러한 균주는 3.8 mg/g의 고제로틴을 함유하는 발효 브로쓰를 생산하였다.
실시예 17 - 전환 비율: 전체 브로쓰에서 동결-건조된 분말로
표 21은 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조된 B-50550의 전체 브로쓰의 여러 로트에 대한, 전체 브로쓰에서 동결-건조된 분말 사이의 전환 비율을 나타낸다. 이들 계산치는 전체 브로쓰가 동결-건조된 분말로 완전히 전환되고 전체 브로쓰의 밀도가 1 g/mL인 것으로 추정한다. (임의의 하류 프로세싱 이전의 발효 브로쓰의 밀도가 약 1 g/ml임에 주목한다.) "평균 %"는 전체 브로쓰의 특정 로트로부터 수득된 동결 건조된 분말의 중량을 기준으로 한 평균 백분율이다.
<표 21>
Figure pct00026
실시예 18 - 다른 스트렙토미세스 균주 - 발효 및 응애 방제 방법
실시예 13에 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 몇몇 스트렙토미세스 균주를 배양하였다. 모든 균주는 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550의 GouA-M 또는 GouB-M 단백질 (예를 들어, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 및 서열 30)에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 고제로틴 생합성 유전자 클러스터를 갖는다. 균주 명칭 및 실시예 13에 지개된 방법에 따라 (그러나 보다 작은 규모로) 제조된 발효 브로쓰의 고제로틴 농도를 하기 표 22에 제시한다. (농도 (g/L)의 경우에, 발효 브로쓰의 밀도는 임의의 하류 프로세싱 전에 약 1 g/ml인 것으로 추정한다.)
<표 22>
Figure pct00027
상기 균주를 글리신의 존재 및 부재하의 발효 배지에서 성장시키는 별개의 실험을 수행하였다. 글리신의 첨가는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A의 경우에 고제로틴 생산을 배가시켰지만, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 B 또는 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 B의 경우에는 고제로틴 생산에 대한 효과가 거의 없었다.
물 및 계면활성제로 희석된 상기-기재된 전체 브로쓰 (약 1.0 mg/g 고제로틴을 가짐)를 사용하여 상기 실시예 2에 기재된 2-점박이응애 (TSSM) 실험실 검정을 사용하여 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A의 발효 브로쓰를 스크리닝하였다. 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 및 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550에 대한 결과를 하기 표 23에 제시한다.
<표 23>
Figure pct00028
실시예 19 - 그의 기능을 확인하기 위한, NRRL B-50550에서의 고제로틴 유전자 클러스터의 녹 아웃
추정 유전자 클러스터가 고제로틴 발현을 담당하는 것임을 확인하기 위한 연구를 수행하였다. UDP-글루쿠론산의 생산에 관여할 수 있는, 블라스티시딘의 시토시닌 신타제와 유사한 아미노트랜스퍼라제 유전자 (ORF 4258), 시토실글루쿠론산 신타제 유전자 (ORF 4261), 및 데히드로게나제/히드록시이소부티레이트 (ORF 4253)에 더하여 코딩 영역 상류의 300개의 뉴클레오티드를 함유하는 3개의 구축물을 NRRL B-50550 게놈 DNA로부터 생성하였다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 출원인은 아미노트랜스퍼라제 유전자 (ORF 4258) 및 시토실글루쿠론산 신타제 유전자 (ORF 4261)는 고제로틴 생합성 경로의 비교적 초기에 요구되는 것으로 상정하였다. ORF 4258 및 ORF 4261이 게놈 내에서 서로 근접하기 때문에, 및 또한 이들은 유전자 클러스터의 중간에 위치하기 때문에, 데히드로게나제 유전자 (ORF 4253)는 UDP-글루쿠론산의 생산에 관여할 수 있다. 본 출원인은 이러한 효소가 또한 경로의 초기에 요구될 것으로 상정하였다.
사용되는 박테리아 균주 및 벡터를 표 24에 제시한다. DNA 단편의 플라스미드 벡터로의 서브클로닝을 위한 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머가 서열 44-75로서 제공된다.
<표 24> 박테리아 균주 & 벡터
Figure pct00029
고제로틴 유전자 클러스터 서열이 정확한지 확인하기 위해, PCR 및 서열 확인을 위한 7개의 쌍의 프라이머를 설계하였다 (서열 44-57). PCR 산물의 DNA 추출은 퀴아젠(Qiagen) 게놈 DNA 추출 키트 프로토콜에 따랐다. 게놈 DNA 및 상이한 프라이머 쌍에 대한 열 사이클 파라미터는 다음과 같다: 15분 동안 95℃, 이어서 1분 동안 95℃, 1분 동안 58℃, 및 1분 동안 72℃의 35 사이클, 이어서 10분 동안 72℃, 4℃에서 보관. PCR 산물을 아가로스 겔 상에서의 전기영동에 의해 분해하고 (도 9 참조), 또한 서열 확인을 위해 전달하였다. PCR 산물의 크기 및 서열 결과는 고제로틴 유전자 클러스터 서열이 정확하며, 이와 같이 프라이머는 녹아웃 실험을 수행하기 위해 설계되었음을 확인시켜주었다.
교차를 위한 카세트 구축
특정 유전자를 녹아웃시키기 위해, 특정 제한 효소 부위를 함유하는 상류 및 하류 프라이머를 설계하였다 (서열 60-75 참조). 유전자 상류의 경우에, 정방향 프라이머는 EcoRI 부위 (GAATTC)를 사용하였고 역방향 프라이머는 KpnI 부위 (GGTACC)를 사용하였다. 유전자 하류의 경우에, 정방향 프라이머는 XbaI 부위 (TCTAGA)를 사용하였고 역방향 프라이머는 HindIII (AAGCTT) 부위를 사용하였다. 중간에는, 카나마이신 내성 유전자를 선택 마커로서 첨가하였다. 모든 구축물을 pUC118 벡터로 클로닝하였다 (도 10). 카나마이신 내성 및 상하류의 녹아웃 유전자를 함유하는 카세트를 상류 및 하류 서열의 서열분석에 의해 확인하였다. 카세트를 HindIII 및 EcoRI로 소화하고, 선택 마커가 카나마이신인 pKC1139 셔틀 벡터로 클로닝하였다 (도 11); pKC1139::CupKIdown; pKC1139:CupKWdown; pKC1139:IupKIdown, pKC1139WupKWdown. 제한 효소 분석, PCR, 및 서열 확인 후, 클러스터를 이. 콜라이 ET12567 (pUZ8002)로 전기천공하였다. 아프라마이신 및 카나마이신의 존재 하에서의 선택에 의해 형질전환체를 선택하고, 상하류 프라이머에 대해 PCR에 의해 확인하였다.
유전자의 파괴를 보장하기 위해, 단일-교차 상동 재조합을 수행하기 위한 실험을 설계하였다. 게놈 DNA로부터 약 1 kb의 HindIII/EcoRI 단편을 증폭시키고, pKC1139의 HindIII/EcoRI 부위에 삽입하여 pKC1139:C, pKC1139:G, 및 pKC1139: I를 생성하였다.
접합
본 실험의 공여자는 pKC1139 셔틀 벡터 상에 녹아웃 카세트를 함유하는 이. 콜라이 (ET12567/pUZ8002) 균주이다. 하기 설명되는 박테리아 접합을 통한 플라스미드 전달을 위한 변형된 프로토콜에 따라, 카세트를 NRRL B-50550에 성공적으로 도입하였다.
플라스미드 pUZ8002 w/ pkc1139:: IupKIdown을 함유하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (균주 ET12567)를 루리아 브로쓰 (LB) 한천 플레이트 상에 스트리킹하고, 30℃ 또는 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 단일 콜로니를 수득하였다. 25μg/mL 클로람페니콜 Cm, 25 μg/mL 카나마이신, 및 100 μg/mL 아프라마이신이 보충된 10 mL LB (LBCm25K - Kan25 - Apr100)를 함유하는 적어도 2개의 50 mL 튜브에 단일 콜로니를 접종하였다. 콜로니가 37℃ 진탕 인큐베이터 내에서 밤새 (20-24시간) 성장하게 두었다. 밤샘 배양물을 50 mL LBApr100에 1:100으로 희석한 다음, 37℃ 진탕 인큐베이터 내에서 OD600 0.4-0.6까지 성장하게 두었고, 전형적으로 4-5시간이 요구되었다. 이어서 세포를 대략 5000RCF 및 4℃에서 15-20분 동안 펠릿화하였다. 생성된 상청액을 경사분리하여 버렸다. 펠릿을 허물어 재현탁시키고, LB로 2회 세척하여 잔여 항생제를 제거하였다. 펠릿화된 이. 콜라이 세포를 세척하는 동안, 충분한 글리세롤 원액 포자 정제용 튜브를 해동하여 테스트하고자 하는 각각의 수용자 균주/조건에 세포를 제공하였다. 스트렙토미세스 포자가 작고 계수하기 극히 곤란하기 때문에, 가시적으로 고밀도인 제조물을 사용하였다. 또한, 세포를 세척하는 동안, 한천 플레이트를 선택하고 층류 후드 내에서의 건조를 위한 설정을 하였다. 각각의 접합을 위해, 500 μL 포자 제조물을 멸균 2.0 mL 미세원심분리기 튜브 내의 500 μL 2x YT 브로쓰와 혼합한 다음, 50℃에서 대략 20분 동안 열 쇼크를 가하였다 (실험적으로, 10분 내지 1시간 범위의 열 쇼크 시간은 생존율에 어떤 검출가능한 차이도 야기하지 않았다). YT 브로쓰는 루리아 브로쓰보다 더 풍부한 배지이다 (LB보다 효모 추출물을 2배만큼 더 많이, 그리고 LB보다 펩톤을 약 60% 더 많이 함유함). 이어서 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 500 μL의 펠릿화된 이. 콜라이 세포를 각각의 튜브에 첨가한 다음 완전히 혼합하였다. 세포를 5000RCF 및 실온에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하였다. 펠릿화된 세포를 재현탁시키고, 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 4-10개의 12-mm 유리 비드 또는 레이지 L(Lazy L) 스프레더를 사용하여 세포를 스프레딩하였다. 플레이트를 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다 (16-20시간). 각각의 플레이트에 대해, 1 mL 물 중에서 5 mg 카나마이신 및 0.5 mg 날리딕스산 (NaOH 원액으로부터의 것)을 제조한 다음 플레이트에 첨가하고, 레이지 L 스프레더를 사용하여 용액을 균일하게 분포시켰고, 반복되는 스프레딩 및 공기-건조에 수분이 소요되었다. 이어서 플레이트를 30℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4-6일 후, PCR 확인 및 고제로틴 생산 검정을 위해 백색 카나마이신-내성 콜로니를 선택하였다.
PCR 확인
PCR 확인을 위해 선택된 백색 카나마이신-내성 콜로니를 카나마이신 항생제를 함유하는 트립틱 대두 브로쓰 (TSB) 배지에서 배양하고, DNA 추출을 위해 지겜(ZYGEM) 키트 (지겜 코포레이션 리미티드(ZyGEM Corporation Ltd.) (NZ))를 제조업체의 지침에 따라, 88 μL의 배양물, 10 μL 10x 그린 완충제, 1 μL prepGEM, 및 1 μL 리소자임을 사용하여 37℃에서 15분, 75℃에서 15분 및 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하여 사용하였다. 이어서, 적절한 프라이머 및 하기 사이클 파라미터를 사용하여 PCR을 수행하였다: 15분 동안 95℃, 이어서 1분 동안 95℃, 1분 동안 58℃, 및 1분 동안 72℃의 35 사이클, 이어서 10분 동안 72℃, 4℃에서 보관. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 통해 분해하였다 (도 12).
pKC1139:I는 pKC1139 셔틀 벡터 내에 삽입된 gouI 단편으로, 이는 이어서 단일 상동 교차에 의해 염색체에 통합된다. 이러한 접근법은 벡터의 통합된 복제물이 유전자의 2개의 돌연변이체 대립유전자에 플랭킹되게 하였다. PCR 결과는 gouI 및 gouG 밴드를 여전히 나타내었다 (도 12). 이중 교차의 pKC1139:IKI PCR은 gouI PCR 산물을 나타내지 않았다 (도 12). pKC1139:CKW, gouG의 PCR 산물은 보다 작은 분자량 밴드를 나타내었고, 이는 유전자의 부분적인 결실로 인한 것일 수 있다.
고제로틴 생산
분석용 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 고제로틴 생산을 측정하였다. 간략하게, 테스트 샘플 (1.0 g)을 원심분리 튜브로 옮기고 3 mL의 물로 추출하였다. 성분을 볼텍싱에 의해 혼합하고, 초음파처리한 다음, 원심분리를 사용하여 분리하였다. 상청액을 깨끗한 플라스크로 경사분리하였다. 이러한 절차를 1회 더 반복하고, 상청액을 앞서 분리해 둔 상청액과 조합하였다. 수성 추출물을 최종 부피 10 mL로 만들고, 분석용 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 고제로틴 함량에 대해 검정하였다.
희석된 샘플을 여과하고, 다이아몬드 하이브리드 가드 칼럼이 구비된 코그네트 다이아몬드 하이브리드 칼럼 (100A, 4 μm, 150 x 4.6mm)을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 칼럼을 30분 아세토니트릴/NH4OAC 구배로 용리시켰다 (하기 참조). 유량은 1mL/분이었다. 목적하는 대사물의 검출은 254nm에서 이루어졌다. 고제로틴은 단일 피크로서 대략 17-19분의 체류 시간으로 용리되었다. 야생형 NRRL B-50550은 0.5 mg/g 고제로틴을 생산할 수 있지만, gouI 유전자가 불활성화된 경우에 고제로틴 생산은 부재하였다 (표 25 참조). gouI 및 gouG의 단일 교차 불활성화도 또한 어떤 고제로틴 생산도 나타내지 않았다. 전체 고제로틴 유전자 클러스터의 불활성화도 또한 고제로틴 생산의 부재를 야기하였다.
<표 25> 고제로틴 생산
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달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재되어 있다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 논의되는 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 따른 그러한 공개에 선행한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명이 그의 구체적 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 이에 대한 추가의 변형이 가능하며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르면서 본 발명이 속하는 기술분야 내에 공지된 또는 통상의 실시에 속하며 전술된 및 첨부된 특허청구범위의 범위에 나타난 본질적 특징에 적용될 수 있는 바의 본 개시내용으로부터 벗어나는 부분을 포함하는 본 발명에 대한 임의의 변경, 사용 또는 개조를 모두 포괄하는 것으로 의도된 것임은 이해될 것이다.
NRRL NRRLB-50550 20110819 IDAC 091013-01 20131009 IDAC 091013-02 20131009
SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience LP CAMPBELL, Brian CURTIS, Damian GUAN, Shaohua GUILHABERT-GOYA, Magalie JOO, Daniel M. LU, Tara MARGOLIS, Jonathan ROYALTY, Reed N. SALAZAR, Gerardo B. SESIN, David SMITH, Frisby D. TAYLOR, Colleen ZHU, Hong <120> STREPTOMYCES MICROFLAVUS STRAINS AND METHODS OF THEIR USE TO CONTROL PLANT DISEASES AND PESTS <130> 250-US <150> US 61/712,626 <151> 2012-10-11 <150> US 61/714,267 <151> 2012-10-16 <150> US 61/718,674 <151> 2012-10-25 <150> US 61/734,541 <151> 2012-12-07 <150> US 61/759,955 <151> 2013-02-01 <150> US 61/759,977 <151> 2013-02-01 <150> EP 13154355.5 <151> 2013-02-07 <150> US 61/879,601 <151> 2013-09-18 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 426 <212> DNA <213> Streptomyces microflavus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(426) <223> orf4251; Methyltransferase domain family; GouA <400> 1 gtgatcccct actccacgtt ccagttactc cggaccgtcg aggaccggga gcgagcactg 60 acggaagccg tacgcgccat gaggccaggt gccacagtcc acatcgatgt cagcagcaac 120 ttcgacctgc gggagagcag cgactggcag cgggtactgt ccgccccctg cgaagaagtg 180 agcaggcagc ccgtcgagga atgggaacga acaaggtccc acccagacca catcctcatc 240 gacaaaacct tccgaacaga cagaagcgtt ctcctccggt tcacggagca ttggacccac 300 ctgcgggcac 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acggtggacg ctcatgtccc cgaggctcag aaggccgccc aggtggggga gatcaaccag 900 ctgctggcaa ggaacgccgg ctacacgacg gcctatgtgg acctggcccg gacggcactg 960 gccgaagctc gagtaccgga cgtgggcgca ccgttcgacg gggcgcgcgt cgtggccgct 1020 gccattgcag acgatctcac caagggaaaa tcgcgttacg gacggggctc gcatacggat 1080 ttgaaagacc acggcacacc gactggtgaa ctctga 1116 <210> 22 <211> 371 <212> PRT <213> Streptomyces microflavus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(371) <223> orf4261; cytosylglucuronic acid synthase; GouI <400> 22 Met Ala Thr Pro Phe Gly Phe Gly Pro Ala Ser Lys Ala Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Gly Glu Val Leu His Thr His Trp Gly Val Asp Val Gln Tyr Tyr Gly 20 25 30 Thr Asp Ser Ala Arg Asp Phe Phe Ser Ala Gln Pro Asp Val Arg Pro 35 40 45 Leu Ala Pro Glu Ala Val Gly Asp Thr Gly Ala Ile Asp Ala Val Leu 50 55 60 Asn Val Leu Ala Pro Asp Leu Ile Arg Ser Ser Glu Glu Ala Ala Arg 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu Gly Phe Met Trp Gln Pro Ser Asp Ile 85 90 95 Pro Asp Gly Ser Leu Leu Lys Arg Val His Arg Tyr Phe Ala Gln Asp 100 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Tyr Ala Gln Lys Lys Ala Arg Val Glu His Leu Tyr Ala Ile Ala 165 170 175 Asp Gly Glu Val Ile Pro Glu Asp Gly Glu Pro Glu Ile Ile Phe Cys 180 185 190 Met Asp Glu Phe Gly Pro Leu Asn Leu Gln Pro His Pro Gly Arg Gln 195 200 205 Trp Ala Glu Arg Ser Gly Arg His Lys Asn Pro Asp Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Pro Arg Arg Arg Ala Thr Tyr Thr Arg Pro His Gly Val Arg His Leu 225 230 235 240 Phe Ala Ala Tyr Asp Leu Gly Lys Asp Gln Leu Tyr Gly His Ile Lys 245 250 255 Lys Thr Lys Asn Arg Ser Lys Tyr Leu Glu Phe Cys Arg Tyr Leu Arg 260 265 270 Ser Leu His Pro Ala Lys Val Arg Ile Ala Ile Ile Cys Asp Asn Tyr 275 280 285 Ser Pro His Leu Thr Thr Lys Arg Cys Gln Arg Val Ala Thr Trp Ala 290 295 300 Asp Ala Asn Asn Val Glu Ile Ala Tyr Thr Pro Thr Asn Ser Ser Trp 305 310 315 320 Leu Asn Arg Ile Glu Ala Gln Phe Thr Ala Ala Leu Arg Tyr Phe Thr 325 330 335 Leu Asp Gly Thr Asp His Ala Ser His Lys Glu Gln Gly Ser Met Ile 340 345 350 Arg Arg Tyr Ile Ile Trp Arg Asn His His Thr His Asp Gln Gln Leu 355 360 365 Arg Thr 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regulator, MarR family <400> 40 Met Gly Asn Pro Ala Gln Glu Pro Trp Glu Thr Ser Gln Val Lys Met 1 5 10 15 Met Glu Ala Leu Arg Glu Trp Ala Thr Gly Phe Ala Glu Ile Asn Leu 20 25 30 Tyr Met Ser Gln Trp Met Arg Leu Pro Gly Ser Asp Ala Asn Ala Val 35 40 45 Gly Gln Ile Val Trp Ala Ala Gln Ser Gly Thr Pro Leu Ser Pro Ala 50 55 60 Ala Leu Ser Arg Arg Ile Gly Met Ser Thr Gly Ser Thr Ala Val Leu 65 70 75 80 Leu Asn Arg Leu Glu Arg Ala Gly Leu Val Val Arg Ser Arg Glu His 85 90 95 Gln Asp Arg Arg Arg Val Thr Leu Arg Pro Thr Pro Ala Ala Ser Glu 100 105 110 Gln Ala His Ala Phe Met Ala Ile Ala Gly Thr Glu Ile Ala Ala Thr 115 120 125 Leu Arg Gln Ala Thr Glu Ala Glu Leu Ser Thr Ala Thr Ser Val Leu 130 135 140 Asp Arg Met Asn Asp Ala Ala Lys Gln Ala Ile Gln Arg Leu His Thr 145 150 155 160 Val Gly Thr Arg Thr Pro Xaa Pro Glu Lys Arg Ser Ser Ile Pro Gln 165 170 175 Pro Leu Met Pro His Gln Thr Thr Phe Ala Leu Leu 180 185 <210> 41 <211> 1107 <212> DNA <213> Streptomyces microflavus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1107) <223> orf4271; monooxygenase; +; GouN <400> 41 gtgatcgagc gcgcaccgga gttccgcgat ggcgggcaga acatcgacgt gcgcggcgtc 60 gcgcgggagg ttcttgtccg tatgggtctg ttcgatgcgg tcaaggcgcg caacacgacc 120 gagacgggcg ccgtcatcgt ggacgggaat ggccaggcga ttgcgaccct gccagacggc 180 ggaggcaccg gggcgacggc ggagctggag attctgcggg gcgatctcgc cggtgttctg 240 cgcgatcacc tccccgaggg ggtggagttc gtctacggcg acaccatcga ggacgtgagc 300 gagcatgccg ggcatgcccg cctgacgacg gcgggcggcc gggagctgcg gtgcgatctg 360 ctggtgatcg ccgaaggggt ccgctccacg accagggggc gcgtcttcgc ccaagacacc 420 gtcgaggagc gcgagctggg ggtgacgatg gtgttcggca cgatcccccg cgtgccgggt 480 gacgacgacc gatggcgctg gtacaacgcg cctggcgggc ggcaggccca tctgcgcccg 540 gacccctacg gcacgacgcg gaccatcctg tcctacagcc ccggcgacga cctgctgtcc 600 atgagccgca atgaggcctt ggcccaggtc cggtcgcggt accgcggcgc gggatgggag 660 acatcacgca tccttgacgc gctggagacc tcgcaggacg tctacatcga ccagctcgcg 720 cagatccgga tgaaaacttg gcaccaagga cacgtcgtga tgctgggaga cgccgcatgg 780 tgcgtgaccc ccatgggtgg cggaggcgct tccctggcgc tgaccagcgc gtacgttctg 840 gcggcacagc tctccgcaca ttccggcgat ctcgctgccg cgctggcggc atacgagcgg 900 tggatgcgcc cgctcgtgcg ggacgcgcag aacatgccgg gctggctgac gcgtttcgcc 960 tacccccaga gccgggcggg actggcgctg cgccacgtcg ccgaccgcgt gttcacctcc 1020 gcccccttcc ggcccctagc tgcaaagctc acccaggtcg ccgagactga acggacgctt 1080 cccacgctcc gcccgaccac cggataa 1107 <210> 42 <211> 368 <212> PRT <213> Streptomyces microflavus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(368) <223> orf4271; monoxygenase; GouN <400> 42 Met Ile Glu Arg Ala Pro Glu Phe Arg Asp Gly Gly Gln Asn Ile Asp 1 5 10 15 Val Arg Gly Val Ala Arg Glu Val Leu Val Arg Met Gly Leu Phe Asp 20 25 30 Ala Val Lys Ala Arg Asn Thr Thr Glu Thr Gly Ala Val Ile Val Asp 35 40 45 Gly Asn Gly Gln Ala Ile Ala Thr Leu Pro Asp Gly Gly Gly Thr Gly 50 55 60 Ala Thr Ala Glu Leu Glu Ile Leu Arg Gly Asp Leu Ala Gly Val Leu 65 70 75 80 Arg Asp His Leu Pro Glu Gly Val Glu Phe Val Tyr Gly Asp Thr Ile 85 90 95 Glu Asp Val Ser Glu His Ala Gly His Ala Arg Leu 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Arg Phe Ala 305 310 315 320 Tyr Pro Gln Ser Arg Ala Gly Leu Ala Leu Arg His Val Ala Asp Arg 325 330 335 Val Phe Thr Ser Ala Pro Phe Arg Pro Leu Ala Ala Lys Leu Thr Gln 340 345 350 Val Ala Glu Thr Glu Arg Thr Leu Pro Thr Leu Arg Pro Thr Thr Gly 355 360 365 <210> 43 <211> 24959 <212> DNA <213> Streptomyces microflavus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21933) <223> Genomic DNA sequence of gougerotin gene cluster plus some flanking sequences <220> <221> misc_feature <222> (1)..(177) <223> orf4248;hypothetical protein;+ <220> <221> misc_feature <222> (605)..(2311) <223> orf4249;Endo-1,4-beta-xylanase A precursor (EC 3.2.1.8);- <220> <221> misc_feature <222> (2492)..(2787) <223> orf4250;Mobile element protein;- <220> <221> misc_feature <222> (4455)..(4880) <223> orf4251; Methyltransferase domain family; -; gouA <220> <221> misc_feature <222> (6340)..(6801) <223> orf4252; major facilitator transporter;+; gouB <220> <221> misc_feature <222> (7197)..(7712) <223> orf4253;3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31);+; gouC <220> <221> misc_feature <222> (8130)..(8486) <223> orf4254;hypothetical protein;- <220> <221> misc_feature <222> (8589)..(8729) <223> orf4255; CoA-binding domain-containing protein;+; partial to gouD <220> <221> misc_feature <222> (8912)..(9826) <223> orf4256;hypothetical protein;+;gouE <220> <221> misc_feature <222> (9827)..(10823) <223> orf4257; DegT/DnrJ/EryC1/StrS aminotransferase;+;gouF <220> <221> misc_feature <222> (10820)..(12013) <223> orf4258; DegT/DnrJ/EryC1/StrS aminotransferase, cytosinine-like synthase;+; gouG <220> <221> misc_feature <222> (12020)..(13145) <223> orf4259; phosphoglycerate mutase;+; gouH <220> <221> misc_feature <222> (13146)..(13265) <223> orf4260;;- <220> <221> misc_feature <222> (13219)..(14334) <223> orf4261; cytosylglucuronic acid (CGA)synthase;+;gouI <220> <221> misc_feature <222> (14350)..(15063) <223> orf4262;nucleotide binding protein;+; gouJ <220> <221> misc_feature <222> (15411)..(16046) <223> orf4263; glycosyltransferase;+; gouK <220> <221> misc_feature <222> (16142)..(17482) <223> orf4264; hypothetical protein;+; gouL <220> <221> misc_feature <222> (17549)..(19312) <223> orf4265; similarity to asparagine synthase;+; gouM <220> <221> misc_feature <222> (19461)..(19574) <223> orf4266; hypothetical protein;+ <220> <221> misc_feature <222> (20147)..(20551) <223> orf4267; hypothetical protein;+ <220> <221> misc_feature <222> (20650)..(21933) <223> orf4268; transposase;+ <400> 43 atggtccccg cggaccggga cacgctggtc cgccgctggt acgtgcgcca gatccgtctg 60 gacagcgagg gcacggtccg cccggaacgg atcgagaccg aggccttcgc acggcccacc 120 gacacctacg ctcgcgtgga gagcagtcgg agaccggcat cgtcgcggcc ggcgtgatcg 180 gcttacctcc gcgagcactt cccgcgatct tgatggatct cggcgttccg gtcgacctcc 240 gcttacgcgg agagcacacg atgaccatct tcggcctgct cgtgcgcttc ggctcacctc 300 cgctcgcgcg gagagcacga tccctgggtg gtctccacca gcccctcggt cggctcacct 360 ccgctgacgc ggaggtgtac cggacgcggg tgttctggag aaagacgctc aggtgtggtc 420 cttgccgagg cggggatggc cccgcctgag atcacacctg agggctgtcc cgtagtcctg 480 gtggatcagc gcgcggcgtc agatgcgggg catcgtaagg cgtaggggcg ttcgcgtact 540 ggatgatttc gtgcgcggag aatgcggtga ggtgccgtag ctgtcgtggt gcgcccgcca 600 ggggttacgg ggcagcccga agggcttcga gcaggtgttc gtacgcccgc ttcggccgca 660 ggtccgtgtc ccatggcagg gaatcggccg tgcgcggggg atagatcttg gtgtcgctgg 720 tggagccgta ccggtcggtg aatccccagg tggagaatga tgtgcagttc ggctcctcca 780 ggcagactcg cagcttgcct gccatctcga cagcctgggt ctctcgcccg tcctcctcgt 840 cctcacctat ggggacgtcc atctccgaca cccgcgcctg aaccccgagt tccgccagat 900 cctgcacatg gctgcggaag gtctccgggg cggtgcggtc gccgggtgtg tactcatggt 960 tctggaaacc gacgccgtcg atcggtacgc cgcgttcttt gagtcgtttg atcagatcgt 1020 agagggcgtc ccatcgctcg ccttcctcct cgaccccgta ttcgttgagg aacagctctg 1080 ccttcggatc ggcccggtgg gcggccctga aggcctcgtc gatgtactcc tcgcccatgg 1140 cctcgtacca cgggctctgc tcggatcgca gaccgaggtt cccattggtg tagctcttct 1200 cgtcgtcgga catgggctcg ttgaccacat cccattctgc gacttttccc ttgaagtgcc 1260 ctgcgacggt ggcgatgtgc cggagcatgg tccggcgtac ctcctcgggg tcgtcgtcct 1320 cccgcatcca gttgggcaga gcctcgtgcc agacgagggt gtgcgcgtga accttcatgt 1380 cgtttgcgcg ggcgaaacgt acgagtaggt ccgcgtcgcg gaagtcgtag acgccgcggc 1440 gtgggtggag aaactgtggc ttgaacgcgt tctccggagt gagcatggag aactggctcc 1500 ccgcgagcgc ccggtaacgt gagtcggtga gcagcgggtt ctcagccagg gcggttccga 1560 cgtcgaaggg tcgttccaca tctgcggccc gcgcacgcag cgtgtcgtcg gactgcgcct 1620 ggcgtagctg gggggccttg atcacgcgga gcgagtcacc gctctctggc cgcgcgatca 1680 gttgggtcag acgccatccc tcgcggcgct cgttttcgcc cgcgtccgcc tccagaccga 1740 accagacagc gccctcggcg aacaccccag ggtcctgcac ggttcctagc tgccgcccgt 1800 cggcttttac gcggaatgtg tctccgatgc tcgacacagc gagcgtcacc gtcccggagc 1860 agccgcagtc gaagtccttg gaggtggccg gctcatcgcc ctcgccgtcc catatctgca 1920 cccttactcg tccgtcggcg gtcacgccga cgcggagtga gggccgctcc tgcctccact 1980 cgtcgtagat gaccggtacg cgtccgtaca gccgcagcca tgagtcgccg tcatcgtcac 2040 caacaccgga catgcgcgcg gtgacggtga agtcgccatc ggatctgaga tgcgggccgg 2100 ccagattcag cggggggttg ggctggccgc cggaggagtc ctgctccacg atgtgccgat 2160 ccgatgcgct gacccgcagg atgccgttct gtgcggtggt gcccggcatc tgcgtccagt 2220 tgtggttccg cagcaggtct tcgtcgcttc tgccgccgat gctttcgccc tgccccgtac 2280 aaccggccgc caccgccatg acgagcagca tggcgcccag tcggcgccac gtctccccac 2340 taagatccac ggttccccac tctcttgttc gagacgaggt caacgtctcg aagctgggca 2400 gtagttcatc acggatgagg tatggctgcc ttgtggggca cgtcccagcc agggactgtc 2460 aaatgagcgg tgtaactcgg gttgttgagg gttactggcg tgctgcggag agtcggccgt 2520 cgaaggtgat atcgaaggcg ttcagaacgg ttttccagcg catggtccag cgggcttggc 2580 ccttgccggt cgggtcgagc gacatgatcg ccatgtagac gcacttcagg gcagcctgtt 2640 cgttcgggaa gtgcccccgg gctttcaccg cccggcggat cctggcgtag acggactcga 2700 tcgcgttggt ggtgcagacg atgcggcgga tctcggtgtc gaagcgcagg aacggggtga 2760 actcctccca cgcgttctcc cagagcctga cgatcgccgg atacttcttg ccccatgcgt 2820 cggcgaactc cgcgaaccga tcgagggccg cgtcctcggt cgccgcggtg tagacgggct 2880 tgaggacctt ggcgatcttg tcccagtcct ggcgggcggc atagcggaag gagttccnnn 2940 nnnnnnnatg gaccacgcat gtctgcacga cggtgcgggg ccagacggtc tcgaccgcgt 3000 caggaagccc cttcagcccg tcgcagacga gcatgaggac gtcgctcacg ccgcggttct 3060 tgatctcggt gaggatgtgc atccagtgct tggcgccctc gccgccgtcg ccgacccaca 3120 gcccgagaat gtcccgccgg ccctcgacgg tgaccgccag ggcgacgtag atgggccggt 3180 tggcgaccgc gccgtcgcgg atctttacgt ggatggcgtc gatgaacacc accggataga 3240 cggcgtccag gggccggttc tgccattcgg ccatgccttc gaagaccttg tcggtgatcg 3300 tggagatcgt ctggcgcgac acgtcggcgc tatagacctc ggccaggtgg gcctggacct 3360 cgccggtgtt caggcccttg gccgcgagtg agatgaccat ctcgtcgacg ccggacaaac 3420 gcttctggcg cttcttgacg atcttcggtt cgaaggagcc ctcgcggtcg cggggcacgg 3480 ttatctccac agggcccacg tcggtcagta cggtcttggc gcgggtgccg ttgcgggagt 3540 tgccgccgtt cttccccgcc ggatcgtgcg tgtcatagcc gaggtggtcg gtgctctcgc 3600 cctcgagggc cgactccagg agtcgtttgg tcagctgctg gagcagcccg ccctcgccgg 3660 tcagctgcag gccctccgcc tgagcctggc ccaccaactc gtcgatcagc cggtcgtcaa 3720 cagacttcga cggcaccgtc tcagacggct cgacgggctc ggccttggtc acgttgtttt 3780 tggtcatcga tgcatcttcc atgatcggga 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gtggaatgcc agaagaaggg agactcgcga tggaaatagc cctttacggt 1320 ctgggagaga tgggctcgga gatagcgcgc tgcctggcac ggggcggtgc gcgggtccac 1380 acgtacgatc catccgaatc ggtggaagtg gaggagcaga acctcgttcg gtggggcagc 1440 gtccggcatg ccgcagagaa ggcctccgtg cacctggtca tcgcgaagca cctttccgac 1500 gtggagtcac ttctcttctc cgccgacggg ataggcccga atgcttctca aaagtccctg 1560 atcgcgctgc acaccacact caccccggag gttgtgcggg acctgcacac ccggatgggg 1620 gacacccacg gacacatgct ggtggatgcc gcgctcagcc gccgcggcgg tgctgtgcgc 1680 gagggttcgt tgtccctgtt cgtcggggca ggagacgagg ccttcgccgt agcccggccg 1740 gtcttcgacc gctacgccga caacgtcgtc cacgccggag acgtcggtgc cggcatgacg 1800 gtcaagctct gcaacaactg gctgctctac gcgaatcggc actccgcact ccaggccatc 1860 cgaacgggcc gtcagctcgg cgtggacccg gctgtgctca cggacgcgct cgcctcctcc 1920 accggatcca gctgggccct gtctcactac tccgacctgg acgaagccat cgtcaccggg 1980 cggggcgcac cagcggtcat ccgggacagg acggcttcgg agctcggtat ggcgaagcag 2040 atggcggcac gggatggtgt ggtgcccacc agccttcagg agaccttcgc tcttctggac 2100 gtgatgtagc 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tcaccggagt gactcccgtc tcgggaatcg tcgccgaaac agcgccgacc 8040 gacatctcgc cgggcccacg ctccgtgagg cggctgctcg tccagctcgg cggcctgagc 8100 aacccggccg ggcgctcttc cggagaggtc tacctcgcac tcgccgcggg actgctcacg 8160 gctctgcggc aggacccgta cgaactgagc attgccatga accgcgcggg cggcacgttc 8220 tccctggggt cgctcggcca ggcccgccag ttgtccggcc gcgacttcca ccgtgaactg 8280 gccacctgcg ccggtgtcct cagctcaccc ggcatgacca ccctcatcga ggtgtcgcgc 8340 gccaagtgcc cctatgttcc cttaccgcct caaaactgga gccaagtatt aatatcgcgc 8400 catatggcgc gacattcacg cctggggatc tgggactttc tgatcggtcc gtacgccacg 8460 gtggacgccc gtgcccccga ggctcagaag gcggcccagg tgggggagat caaccagttg 8520 ctggcggggg acaccggcta cacgacggcc tatgtggacc tggcccggac ggcactggcc 8580 gaagctcgag tacccgacgt gggggcaccg ttcgacgggg cgcatgtcgt ggccgcctcc 8640 atcgcagacg atctcatcaa gggcacatcg cgttgcgggc ggggctcgcg tacggagttg 8700 aaggaccacg gcacaccgac cggtgaactc tgaagaaaag ggattccgat gacgcagcac 8760 atcgacagcg gcctcgtggc cgtgcttcag tcgctcgcgc acgaggtgga aaccgcgcgc 8820 gagtggagcc 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ataaatcctg tggaagaagt catcccgtag 1200 <210> 90 <211> 642 <212> DNA <213> Streptomyces puniceus <400> 90 gtgcacctgg tcatcgcgaa gcacctttcc gacgtggagt cacttctctt ctccgccgac 60 gggataggcc cgaatgcttc tcaaaagtcc ctgatcgcgc tgcacaccac actcaccccg 120 gaggttgtgc gggacctgca cacccggatg ggggacaccc acggacacat gctggtggat 180 gccgcgctca gccgccgcgg cggtgctgtg cgcgagggtt cgttgtccct gttcgtcggg 240 gcaggagacg aggccttcgc cgtagcccgg ccggtcttcg accgctacgc cgacaacgtc 300 gtccacgccg gagacgtcgg tgccggcatg acggtcaagc tctgcaacaa ctggctgctc 360 tacgcgaatc ggcactccgc actccaggcc atccgaacgg gccgtcagct cggcgtggac 420 ccggctgtgc tcacggacgc gctcgcctcc tccaccggat ccagctgggc cctgtctcac 480 tactccgacc tggacgaagc catcgtcacc gggcggggcg caccagcggt catccgggac 540 aggacggctt cggagctcgg tatggcgaag cagatggcgg cacgggatgg tgtggtgccc 600 accagccttc aggagacctt cgctcttctg gacgtgatgt ag 642 <210> 91 <211> 432 <212> DNA <213> Streptomyces puniceus <400> 91 gtggaggccg cagatccgtg tgagttcgac ttcgctcgcg ccgtcgtcgg ccagtccgag 60 gcggctgttg 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tggcaccgga 240 gcgatcgacg ccgtgctgaa cgtgctggct ccggatctga tccgaagttc cgaggaggca 300 gcccggacgt actacgtcga cagcctcggc ttcatgtggc agccctcgga cattccggac 360 ggcagtctgc tcacaagggt gcatcggtac ttcgcccagg acgtcttcgg cagcgttgac 420 catctcaccg cgctcgggat caccggagtg actcccgtct cgggaatcgt cgccgaaaca 480 gcgccgaccg acatctcgcc gggcccacgc tccgtgaggc ggctgctcgt ccagctcggc 540 ggcctgagca acccggccgg gcgctcttcc ggagaggtct acctcgcact cgccgcggga 600 ctgctcacgg ctctgcggca ggacccgtac gaactgagca ttgccatgaa ccgcgcgggc 660 ggcacgttct ccctggggtc gctcggccag gcccgccagt tgtccggccg cgacttccac 720 cgtgaactgg ccacctgcgc cggtgtcctc agctcacccg gcatgaccac cctcatcgag 780 gtgtcgcgcg ccaagtgccc ctatgttccc ttaccgcctc aaaactggag ccaagtatta 840 atatcgcgcc atatggcgcg acattcacgc ctggggatct gggactttct gatcggtccg 900 tacgccacgg tggacgcccg tgcccccgag gctcagaagg cggcccaggt gggggagatc 960 aaccagttgc tggcggggga caccggctac acgacggcct atgtggacct ggcccggacg 1020 gcactggccg aagctcgagt acccgacgtg ggggcaccgt tcgacggggc gcatgtcgtg 1080 gccgcctcca tcgcagacga tctcatcaag ggcacatcgc gttgcgggcg gggctcgcgt 1140 acggagttga aggaccacgg cacaccgacc ggtgaactct ga 1182 <210> 97 <211> 306 <212> DNA <213> Streptomyces puniceus <400> 97 atgacgcagc acatcgacag cggcctcgtg gccgtgcttc agtcgctcgc gcacgaggtg 60 gaaaccgcgc gcgagtggag ccaggcatcg cagacgctgg cacaggagcg ggtggccact 120 gtcttcggct cggcccgtac gcgccgcggc gaaccggcgt acaccctggc gtatgaactc 180 gccacggcac tggccgcggc gaagtggacc acgatcaccg gcggtggccc cggcatcatg 240 caggccgcgc gggacggcag tggggagggc ttgtcccgag cggtgcgggt ggggatcccc 300 cggtga 306 <210> 98 <211> 396 <212> DNA <213> Streptomyces puniceus <400> 98 gtgctggacc cgtccaggtc catcaccgtc gcgaccttcg cactgcgcaa gttactcctg 60 acccacgaca tcgacgctct gttcgtcttc cccggtggtg tcggcacctt cgacgagctg 120 tacgaggtgc tggtccacca ggacaccaac cgacttgcct ggttcccggt cgtcctgatg 180 cagccggccg gtgagagtct ctggtcggcc tggctggagt tcatggagaa gcacttggtc 240 agcacgggac tggccagctc ctccgtgatc aagcggctgg ttgtggccga gtcggtggaa 300 gaggccctgg cagccgccga ggggccgcgt 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tcgtcgacga ctgcgcgccg 180 ccggtgtcac gggccaaccg ccaggtgacc gagcgggtag cccgtgaatc gggcctgcgc 240 gtacacacac tggaccaaca ggcctggcgt cgtctggcca ccacactgat cgcggctgcc 300 gggctgaccg gggccgaccg agccacggcg cagaccgccc tggtcaaacc caccggttcc 360 tacggggcag gtcccaacaa ggccgccctg gtcgccgccc tggaaggtgc ggtctccctg 420 catcgccggg acagcgacca gatcacgacc gtagaccccg acaccggagc ctctccgctc 480 cgtctggaag ccgacctcct cagtcgcgcc cgccccgagg gcggcgctgc ggcctactgc 540 gcaggctcct tcctcacggg tcgcccaacg cgagaccgaa gggacctgga acgcgactcg 600 acggagtacg cggcccgtat cgacgcgctg agccaactcc cctccgcccc ggcccgacgc 660 ccacctctcc cgcctgtccg ggaacgggcg gcgctcctgg gagggcagca cgccgagcgc 720 gacctgacag gtgtggtcga gatggggatc gcagccatgc gaagcgtgta cgagtggatt 780 ccagagatgc ccgccgtggg catcctcggc agcgactact tccagaaggg actgctctat 840 cagctcgacc tcccggtctt ccaccacagc ctcccagccc ggcacaccta cgaatcctgg 900 cgcacggagc agcgcgacga ttcccatctg gcctggtacg tgcgggcgga ggtgcgctac 960 gccgtactgc gccgccactg gaacagcttc aaccacctgc tcgtggccga 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Claims (80)

  1. 살초식응애성 및/또는 살진균성 스트렙토미세스 미크로플라부스(Streptomyces microflavus) 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 돌연변이체 균주가 엽신통과 활성을 갖는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 돌연변이체 균주가 살란 활성을 갖는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 돌연변이체 균주가 잔효 활성을 갖는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 돌연변이체 균주가 살진균 활성을 갖는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 돌연변이체 균주가 밀듀균병에 대해 활성을 갖는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 돌연변이체 균주가 살곤충 활성을 갖는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 돌연변이체 균주가 옥수수 뿌리벌레에 대해 활성을 갖는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 적어도 약 1 x 106 CFU 균주/mL 배양물을 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 제제 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 제제 성분이 습윤제인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 적어도 약 50%의 잎응애 효력을 갖는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 약 60%의 잎응애 효력을 갖는 조성물.
  14. 살응애성 및/또는 살진균성 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주의 발효 생성물을 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 발효 생성물이 제제 성분을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 제제 성분이 습윤제인 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 적어도 약 50%의 잎응애 효력을 갖는 조성물.
  18. 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 돌연변이체 균주를 식물, 식물의 부분 및/또는 식물의 생육지에 적용하는 것을 포함하는, 식물 질병 또는 해충을 방제하기 위해 식물을 처리하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 및/또는 살진균성 돌연변이체 균주를 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주를 포함하는 조성물 중에 적용하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 조성물이 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주의 발효 생성물인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 조성물을 엽면 식물 부분에 적용하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 방제하고자 하는 해충이 응애 및 디아브로티카(Diabrotica)로부터 선택된 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 응애가 클로버 응애, 갈색 응애, 헤이즐넛 잎응애, 아스파라거스 잎응애, 갈색 밀 응애, 콩과식물 응애, 괭이밥 응애, 회양목 응애, 텍사스 시트러스 응애, 오리엔탈 적색 응애, 시트러스 적색 응애, 유럽 적색 응애, 황색 잎응애, 무화과 잎응애, 루이스 잎응애, 6-점박이 잎응애, 윌라메트 응애, 유마 잎응애, 거미줄-생산 응애, 파인애플 응애, 시트러스 녹색 응애, 주엽나무 잎응애, 차응애, 남부 적색 응애, 아보카도 갈색 응애, 가문비나무 잎응애, 아보카도 적색 응애, 뱅크스 그래스 응애, 카르민 잎응애, 사막 잎응애, 채소 잎응애, 팽창 잎응애, 딸기 잎응애, 2-점박이 잎응애, 맥다니엘 응애, 퍼시픽 잎응애, 산사나무 잎응애, 4-점박이 잎응애, 쉐네이 잎응애, 칠레 가성 잎응애, 시트러스 플랫 응애, 쥐똥나무 응애, 플랫 스칼렛 응애, 백색-꼬리 응애, 파인애플 먼지 응애, 웨스트 인디안 사탕수수 응애, 구근 스케일 응애, 시클라멘 응애, 차먼지 응애, 윈터 그레인 응애, 붉은-다리 땅 응애, 개암나무 빅-버드 응애, 포도 에리늄 응애, 배 블리스터 잎 응애, 사과 잎 에지롤러 응애, 복숭아 모자이크 벡터 응애, 알더 비드 혹응애, 페리안 호두 잎 혹응애, 피칸 잎 에지롤 응애, 무화과 버드 응애, 올리브 버드 응애, 시트러스 버드 응애, 여지 에리늄 응애, 밀 오갈 응애, 코코넛 꽃 및 너트 응애, 사탕수수 블리스터 응애, 버팔로 그래스 응애, 버뮤다 그래스 응애, 당근 버드 응애, 고구마 잎 혹응애, 석류나무 잎 오갈 응애, 애쉬 스프랭글 혹응애, 메이플 블래더 혹응애, 알더 에리늄 응애, 레드베리 응애, 목화 블리스터 응애, 블루베리 버드 응애, 핑크 티 녹응애, 리브드 티 응애, 회색 시트러스 응애, 고구마 녹응애, 칠엽수 녹응애, 시트러스 녹응애, 사과 녹응애, 포도 녹응애, 배 녹응애, 플랫 니들 시스 소나무 응애, 야생 장미 버드 및 과실 응애, 드라이베리 응애, 망고 녹응애, 진달래 녹응애, 자두 녹응애, 복숭아 은 응애, 사과 녹응애, 토마토 적갈색 응애, 핑크색 시트러스 녹응애, 곡류 녹응애, 벼 녹응애 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 디아브로티카가 줄무늬 오이 딱정벌레 (디아브로티카 발테아타(Diabrotica balteata)), 북부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi)), 남부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi)), 서부 오이 딱정벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 테넬라(Diabrotica undecimpunctata tenella)), 서부 점박이 오이 딱정벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 운데심푼크타타(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata)), 서부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)), 멕시칸 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 제아에(Diabrotica virgifera zeae)) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 발효 생성물이 동결-건조된 분말 또는 분무-건조된 분말이고, 발효 생성물이 약 0.625 파운드/에이커 내지 약 5 파운드/에이커의 비율로 적용되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 발효 생성물이 적어도 약 2 중량% 고제로틴을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 발효 생성물이 적어도 약 4 중량% 고제로틴을 포함하는 것인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 응애가 아바멕틴-내성 응애인 방법.
  29. 제19항에 있어서, 식물 질병이 진균에 의해 유발된 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 식물 질병이 밀듀균병 또는 녹병인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 밀듀균병이 흰가루병 또는 노균병인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 녹병이 푹시니아 트리티시나(Puccinia triticina)에 의해 유발되는 밀 잎 녹병, 푹시니아 호르데이(Puccinia hordei)에 의해 유발되는 보리 잎 녹병, 푹시니아 레콘디타(Puccinia recondita)에 의해 유발되는 호밀 잎 녹병, 갈색 잎 녹병, 관녹병 및 줄기 녹병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  33. 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 포함하는, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰.
  34. 제33항에 있어서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주가 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 발효 브로쓰.
  35. 제34항에 있어서, 고제로틴-생산 스트렙토미세스 균주가 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 발효 브로쓰.
  36. 제33항에 있어서, 적어도 약 1 g/L, 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L, 적어도 약 6 g/L, 적어도 약 7 g/L 또는 적어도 약 8 g/L 고제로틴을 함유하는 발효 브로쓰.
  37. 제33항에 있어서, 고제로틴을 약 1 g/L 내지 약 15 g/L의 농도로 함유하는 발효 브로쓰.
  38. 제34항에 있어서, 스트렙토미세스 균주가 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 또는 스트렙토미세스 푸니세우스(Streptomyces puniceus) 균주인 발효 브로쓰.
  39. 제38항에 있어서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주가 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 발효 브로쓰.
  40. 제39항에 있어서, 스트렙토미세스 푸니세우스 균주가 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 발효 브로쓰.
  41. 호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 적어도 1 g/L의 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 아미노산을 함유하는 것인, 적어도 약 1 g/L 고제로틴을 함유하는, 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰를 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 배양 배지가 고제로틴을 적어도 약 2 g/L, 적어도 약 3 g/L, 적어도 약 4 g/L, 적어도 약 5 g/L, 적어도 약 6 g/L, 적어도 약 7 g/L 또는 적어도 약 8 g/L 고제로틴의 농도로 함유할 때까지 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 배양 배지가 고제로틴을 약 1 g/L 내지 약 15 g/L 고제로틴 범위의 농도로 함유할 때까지 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 아미노산이 글리신, 글루탐산, 글루타민, 세린 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 배양 배지가 아미노산을 적어도 약 2 g/L의 초기 농도로 함유하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 배양 배지가 글리신을 약 5 g/L 내지 약 15 g/L의 초기 농도로 함유하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 배양 배지가 글루탐산을 약 5 g/L 내지 약 15 g/L의 초기 농도로 함유하는 것인 방법.
  48. 제41항에 있어서, 배양 배지가 탄소원으로서 글루코스 및 올리고사카라이드의 혼합물을 함유하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 올리고사카라이드가 말토덱스트린 또는 덱스트린인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 배양 배지 내의 초기 말토덱스트린 농도가 약 50 g/L 내지 약 100 g/L인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 배양 배지 내의 초기 말토덱스트린 농도가 약 60 g/L 내지 약 80 g/L인 방법.
  52. 제41항에 있어서, 배양 배지 내의 초기 글루코스 농도가 약 20 g/L 내지 60 g/L인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 배양 배지 내의 초기 글루코스 농도가 약 30 g/L 내지 약 50 g/L인 방법.
  54. 제41항에 있어서, 배양 배지가 탄산칼슘을 약 1 g/L 내지 3 g/L의 초기 농도로 함유하는 것인 방법.
  55. 제41항에 있어서, 질소원이 대두 펩톤, 대두 산 가수분해물, 대두 분말 가수분해물, 카세인 가수분해물, 효모 추출물 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 적어도 부분적으로 선택된 것인 방법.
  56. 제41항에 있어서, 스트렙토미세스 균주가 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  57. 제41항에 있어서, 스트렙토미세스 균주가 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주인 방법.
  58. 제56항에 있어서, 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주가 스트렙토미세스 미크로플라부스 균주 NRRL B-50550 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 스트렙토미세스 균주가 스트렙토미세스 푸니세우스 균주인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 스트렙토미세스 푸니세우스 균주가 스트렙토미세스 푸니세우스 균주 A 또는 그로부터 유래된 살초식응애성 돌연변이체 균주인 방법.
  61. 호기성 조건 하에 소화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양 배지에서 스트렙토미세스 균주를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 하나 이상의 아미노산을 약 1 g/L 미만으로 함유하는 배양 배지에서 달성된 고제로틴 농도보다 적어도 2배 더 높은 고제로틴 농도를 달성하는데 효과적인 농도로 아미노산을 함유하는 것인, 고제로틴 생산 스트렙토미세스 균주의 발효 브로쓰 내에서 고제로틴 수준을 증진시키는 방법.
  62. 제55항에 있어서, 배양 배지가 아미노산을 약 2 g/L의 하나 이상의 아미노산의 농도로 함유하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 아미노산이 글루탐산, 세린 또는 글리신인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 스트렙토미세스 균주가 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  65. 서열 43의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로서, 상기 서열의 발현을 지시하는 적어도 하나의 외인성 및/또는 이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된 핵산 서열.
  66. 제65항에 있어서, 서열 43의 위치 10820 내지 위치 12013의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 핵산 서열.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 서열 43의 위치 13219 내지 위치 14334의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 핵산 서열.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 미크로플라부스(S. microflavus), 에스. 그리세우스(S. griseus), 에스. 아눌라투스(S. anulatus), 에스. 피미카리우스(S. fimicarius), 에스. 파르부스(S. parvus), 에스. 라벤둘라에(S. lavendulae), 에스. 알보비리디스(S. alboviridis), 에스. 푸니세우스(S. puniceus) 또는 에스. 그라미네아루스(S. graminearus)로부터 단리된 것인 핵산 서열.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포.
  70. 스트렙토미세스 패밀리의 고제로틴 또는 고제로틴-생산 박테리아를 배지에서 배양하여 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 생산하고 배지로 배출하게 하는 단계, 및 배지로부터 상기 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 수집하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 박테리아는 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항의 핵산 서열의 유전자의 발현을 증진시키기 위해 변형된 것인, 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 생산하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 박테리아가 에스. 미크로플라부스, 에스. 그리세우스, 에스. 아눌라투스, 에스. 피미카리우스, 에스. 파르부스, 에스. 라벤둘라에, 에스. 알보비리디스, 에스. 푸니세우스 및 에스. 그라미네아루스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 박테리아가 에스. 미크로플라부스인 방법.
  73. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항의 핵산 서열로부터 선택된 폴리펩티드 서브유닛을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  74. 제73항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  75. a) 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터를 구축하는 단계;
    b) 단계 a)의 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환체를 생산하는 단계;
    c) 단계 b)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    d) 단계 c)의 형질전환체의 배양 생성물로부터 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 단리 및 정제하는 단계
    를 포함하는, 고제로틴 또는 고제로틴 유사체를 제조하는 방법.
  76. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 원핵 세포.
  77. 서열 13의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로서, 상기 서열의 발현을 지시하는 적어도 하나의 외인성 및/또는 이종 조절 요소에 작동가능하게 연결된 핵산 서열.
  78. 제77항에 있어서, 서열 17의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산 서열.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 9, 서열 11, 서열 15, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산 서열.
  80. 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로서, 외인성 제한 효소 절단 부위를 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산 서열.
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