TW201438582A

TW201438582A - 細黃鏈黴菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｉｃｒｏｆｌａｖｕｓ）株及使用彼等來控制植物疾病和害蟲之方法

Info

Publication number: TW201438582A
Application number: TW102136778A
Authority: TW
Inventors: Brian Campbell; Damian Curtis; Shaohua Guan; Magalie R Guilhabert-Goya; Daniel M Joo; Tara Lu; Jonathan Margolis; Reed Nathan Royalty; Gerardo Bueno Salazar; David Sesin; Frisby Davis Smith; Colleen Taylor; Hong Zhu
Original assignee: Bayer Cropscience Lp
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2014-10-16
Also published as: JP2015534950A; PE20151080A1; WO2014059275A3; BR112015008045A2; US20140105862A1; CN104968794A; KR20150071011A; AU2013329026A1; EP2906710A2; MX2015004401A; WO2014059275A2; EP2765200A1

Abstract

本發明關於新穎之細黃鏈黴菌(Streptomyces microflavus)株及使用彼等來控制植物疾病和害蟲之方法。本發明亦關於藉由培養產製谷氏菌素(gougerotin)之鏈黴菌株所獲得的醱酵基質，其中該醱酵基質含有至少約1克/升之谷氏菌素。本發明亦關於製造產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質之方法，其中該醱酵基質含有至少約1克/升之谷氏菌素，該方法包含在有氧條件下，在含有可消化之碳源及可消化之氮源的培養基中培養鏈黴菌株，其中該培養基含有能有效達成至少1克/升之谷氏菌素濃度的胺基酸濃度。本揭露內容亦關於從細黃鏈黴菌進行谷氏菌素生物合成基因簇之分子選殖，及鑑定該基因簇中之個別基因和由其編碼之蛋白質。包含13個開放閱讀框(ORFs)之谷氏菌素基因簇係位在細黃鏈黴菌之基因位點內。

Description

細黃鏈黴菌(Streptomyces microflavus)株及使用彼等來控制植物疾病和害蟲之方法

本發明關於細菌菌株及彼等於控制植物疾病和害蟲之能力的領域。

關於以電子方式提交之序列表

該序列表之正式複本係經由EFS網路以電子方式提交，其係在2013年10月10日以ASCII格式之序列表形式創建，檔案名稱為“250-US_ST25.txt”，檔案大小為175KB，且與專利說明書同時提交。包含在此ASCII格式之文檔中的序列表為該專利說明書的一部分，其全部內容以引用方式被納入本文。

植食性蟎類，尤其是蛛蟎，為果園、溫室及許多蔬菜和水果作物，包括辣椒、番茄、馬鈴薯、南瓜、茄子、黃瓜和草莓之主要農業害蟲。蟎類使用其尖銳的口器損害葉和/或水果表面。除了直接損壞植物部分(稱為繪斑(stippling))，蟎蟲以此為食亦造成對植物疾病的感受性增加。

蟎蟲為蜱蟎類(acari)，而非昆蟲，一些廣譜殺蟲劑對蟎類亦有效。蟎蟲的特性及可用之殺蟎劑的特性為控制蟎蟲帶來挑戰。例如，蛛蟎(最具經濟重要性的蟎族之一)一般係生活在植物葉子下方，從而使其難以處理。此外，已知蟎類在二至四年內會對目前可用之殺蟎劑(其中多種具單一作用模式)發展出抗藥性。可用之殺蟎劑中對蟎卵具有活性的很少，因而必須要重複施用。因此，除了具有良好的擊倒活性外，還具有透層、殺卵及強大之殘留活性的新殺蟎劑是有需要的。

本發明提供細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變體(菌株)。於一實施例中，該植食性殺蟎和/或殺真菌突變株為細黃鏈黴菌株M。本發明亦提供紫紅鏈黴菌(Streptomyces puniceus)菌株A或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變體(菌株)。

本發明亦提供含有細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變體(菌株)之組成物。於一觀點中，該組成物為細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變株的醱酵產物。本發明亦提供含有紫紅鏈黴菌株A或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變體(菌株)之組成物。於一觀點中，該組成物為紫紅鏈黴菌株A或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變株的醱酵產物。

本發明亦提供藉由培養產製谷氏菌素(gougerotin)之鏈黴菌株取得的醱酵產物，其中該醱酵產物含有至少約1克/升之谷氏菌素。

本發明亦提供含有至少約1克/升谷氏菌素之醱酵基質。於一實施例中，該醱酵基質未經過任何下游加工。於一特殊實施例中，該醱酵基質係來自鏈黴菌株。適合用於本發明之鏈黴菌株的類型詳細描述於本文中。

本發明亦提供產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵產物，其中該醱酵產物包含至少約1克/升之谷氏菌素。於一實施例中，該醱酵產物為醱酵基質。本發明亦提供含有至少約1克/升、至少約2克/升、至少約3克/升、至少約4克/升、至少約5克/升、至少約6克/升、至少約7克/升、或至少約8克/升之谷氏菌素的醱酵基質。於一實施例中，該醱酵基質含有濃度為約1克/升至約15克/升的谷氏菌素。於一實施例中，該產製谷氏菌素之鏈黴菌株為細黃鏈黴菌、灰色鏈黴菌(S.griseus)、環圈鏈黴菌(S.anulatus)、糞生鏈黴菌(S.fimicarius)、小鏈黴菌(S.parvus)、淡紫灰鏈黴菌(S.lavendulae)、白綠鏈黴菌(S.alboviridis)、紫紅鏈黴菌或禾粟鏈黴菌(S.graminearus)。於另一實施例中，該產製谷氏菌素之鏈黴菌株包含編碼與選自以下群組之至少一種胺基酸序列具有至少約80%之序列同一性、至少約85%之序列同一性、至少約90%之序列同一性、或至少約95%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。於另一實施例中，該產製谷氏菌素之鏈黴菌株包含編碼與選自以下群組之至少一種胺基酸序列具有至少約80%之序列同一性、至少約85%之序列同一性、至少約90%之序列同一性、或至少約95%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88。再於另一實施例中，該產製谷氏菌素之鏈黴菌株為細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變株。於另一實施例中，其為紫紅鏈黴菌株A或由其衍生之植食性殺蟎突變株。再於另一實施例中，其為細黃鏈黴菌株M。

本發明亦提供製造產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質之方法(其中該醱酵基質含有至少約0.5克/升之谷氏菌素)，該方法包含：在有氧條件下，將鏈黴菌株培養在含有可消化之碳源和可消化之氮源的培養基中，其中該培養基含有之胺基酸濃度能有效取得濃度為至少0.5 克/升之谷氏菌素。本發明亦提供製造產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質之方法(其中該醱酵基質含有至少約1克/升之谷氏菌素)，該方法包含：在有氧條件下，將鏈黴菌株培養在含有可消化之碳源和可消化之氮源的培養基中，其中該培養基含有之胺基酸濃度能有效取得濃度為至少1克/升之谷氏菌素。本發明亦提供處理植物以控制植物疾病或害蟲的方法，其中該方法包含將細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變株施用在植物、植物之一部分和/或植物的位點。於一實施例中，該菌株之醱酵產物或由其衍生之突變體的醱酵產物係施用在植物和/或植物的位點。

本發明亦提供處理植物以控制植物疾病或害蟲的方法，其中該方法包含將細黃鏈黴菌株，包括細黃鏈黴菌株NRRL-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變株施用在植物、植物之一部分和/或植物的位點。於一實施例中係將該菌株之醱酵產物或由其衍生之突變體的醱酵產物施用在植物和/或植物的位點。

本發明亦提供控制植食性蜱蟎或昆蟲的方法，其包含將細黃鏈黴菌株，包括細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎菌株施用在植物或植物周圍之土壤。於一實施例中係將該菌株之醱酵產物或由其衍生之突變體的醱酵產物施用在植物和/或植物的位點。

本發明亦提供製造產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質之方法，其中該醱酵基質含有至少約1克/升之谷氏菌素，該方法包含在有氧條件下，將鏈黴菌株培養在含有可消化之碳源和可消化之氮源的培養基中，其中該培養基含有之胺基酸濃度能有效取得濃度為至少1克/升之谷氏菌素。於一實施例中係將鏈黴菌株培養在培養基中，直到培養基中含有之谷氏菌素濃度為至少約2克/升之谷氏菌素、至少約3克/升之谷氏菌素、至少約4克/升之谷氏菌素、至少約5克/升之谷氏菌素、至少約6克/升、至少約7克/升、或至少約8克/升之谷氏菌素。於另一實施例中係將鏈黴菌株培養在培養基中，直到培養基中含有之谷氏菌素濃度為約1克/升至約15克/升之谷氏菌素。

於該製造醱酵基質之方法的一種實施例中，該胺基酸係選自下列群組：甘胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、絲胺酸及彼等之混合物。於一種情況中，該培養基中所含有之胺基酸的初始濃度為至少約2克/升。於一特定之情況中，該培養基中所含有之甘胺酸的初始濃度和/或麩胺酸的初始濃度為至少約5克/升至約15克/升之甘胺酸。

於一實施例中，如上述之培養基中含有葡萄糖和寡聚醣之混合物作為碳源。於一種情況中，該寡醣為麥芽糖糊精或糊精。於一特殊之情況中，該培養基中之初始麥芽糖糊精的濃度為約50克/升至約100克/升。在另一種情況中，該初始麥芽糖糊精濃度為約60克/升至約80克/升。

於一實施例中，該培養基中之初始葡萄糖的濃度為約20克/升至60克/升或約30克/升至約50克/升。

於一實施例中，該培養基中所含有之碳酸鈣的初始濃度為約1克/升至3克/升。

於一實施例中，該氮源係至少部分選自下列群組：大豆蛋白腖、大豆酸水解產物、大豆粉水解產物、酪蛋白水解產物、酵母萃取物，及彼等之混合物。

上述之任何產製谷氏菌素之鏈黴菌株均可用於實行此方法。

本發明亦提供增進產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質中之谷氏菌素水準的方法，其包含在有氧條件下，將鏈黴菌株培養在含有可消化之碳源和可消化之氮源的培養基中，其中該培養基含有之胺基酸濃度能有效取得濃度至少兩倍高於在含有少於約1克/升、約2克/升、約3克/升、約4克/升、約5克/升、約6克/升、約7克/升、約8克/升、約9克/升、或約10克/升之一或多種胺基酸的培養基中所取得之谷氏菌素濃度。於一實施例中，用於培養基中之胺基酸為麩胺酸、絲胺酸和/或甘胺酸。於一實施例中，用於培養基中以取得增進水準之谷氏菌素(即，增強之培養基)的胺基酸濃度為約2克/升至約15克/升，且所取得之谷氏菌素濃度為在起始培養基中所取得者的至少兩倍，其中，於一實施例中，該起始培養基含有不超過該增強之培養基中所含有者的約1/2胺基酸濃度。

上述之任何產製谷氏菌素之鏈黴菌株可用於實行本方法。

本發明亦提供來自細黃鏈黴菌株(具體而言，來自細黃鏈黴菌株NRRL B-50550)之谷氏菌素生物合成基因簇、在該基因簇中之個別基因的特徵及由其編碼之蛋白質。來自細黃鏈黴菌株之谷氏菌素基因簇被揭露，該基因簇所包含之14個開放閱讀框(ORFs)分別稱為ORFs 4251至4253、4255至4259、4261至4265，和4271(分別為SEQ ID NO：1、3、5、9、11、13、15、17、21、23、25、27、29和41)，且在此分別稱為GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM及GouN。該對應之蛋白質分別提供在SEQ ID NO：2、4、6、10、12、14、16、18、22、24、26、28、30和42中。包含該來自細黃鏈黴菌株之谷氏菌素生物合成基因簇及一些側翼區之基因組DNA序列係提供於SEQ ID NO：43，且描述該基因GouA至GouN之位置。

本發明亦提供來自紫紅鏈黴菌(具體地說，來自紫紅鏈黴菌株A)之部分谷氏菌素生物合成基因簇、該基因簇中之個別基因的特徵及由其編碼之蛋白質。一種來自紫紅鏈黴菌之部分谷氏菌素基因簇被揭露，該基因簇包含12個開放閱讀框(ORFs)(分別為SEQ ID NO：89-100)，且在此分別稱為GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM。這些為分別提供於SEQ ID NO：3、5、9、11、13、15、17、21、23、25、27及29中之基因的直系同源物，且在此分別稱為GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL及GouM。對應之蛋白質分別提供在SEQ ID NO：77-88中。包含該來自紫紅鏈黴菌株之谷氏菌素生物合成基因簇之基因組DNA序列提供於SEQ ID NO：76中。

本發明亦提供與SEQ ID NO：43之核苷酸序列具有至少70%之序列同一性的核酸序列，其係可操作地連接至少一種用於指導該序列表現之外源性和/或異源性調控元件。該核酸序列可進一步包含SEQ ID NO：43之位置10820至位置12013的核苷酸序列，和/或可進一步包含SEQ ID NO：43之位置13219至位置14334的核苷酸序列。該核酸序列可從細黃鏈黴菌、灰色鏈黴菌、環圈鏈黴菌、糞生鏈黴菌、小鏈黴菌、淡紫灰鏈黴菌、白綠鏈黴菌、紫紅鏈黴菌或禾粟鏈黴菌分離出。

本發明亦提供包含本文所描述之任一核酸序列(包括在該緊接在前之段落中所描述者)的宿主細胞。本發明亦提供包含任一該核酸序列之表現載體，以及包含該載體之宿主細胞。

本發明提供用於產製谷氏菌素或谷氏菌素類似物的方法，其包含：在培養基中培養谷氏菌素或產製谷氏菌素的鏈黴菌屬細菌以製造並將該谷氏菌素或谷氏菌素類似物分泌入培養基中，並從培養基中收集該谷氏菌素或谷氏菌素類似物，其中該細菌已經過修改以增加與SEQ ID NO：43之核苷酸序列具有至少70%之序列同一性的核酸序列之表現。該細菌可能選自下列群組：細黃鏈黴菌、灰色鏈黴菌、環圈鏈黴菌、糞生鏈黴菌、小鏈黴菌、淡紫灰鏈黴菌、白綠鏈黴菌、紫紅鏈黴菌及禾粟鏈黴菌。

本發明提供用於製備谷氏菌素或谷氏菌素類似物的方法，其包含以下步驟：a)構建含有SEQ ID NO：43之核酸序列，進一步含有SEQ ID NO：43之位置10820至位置12013的核苷酸序列，和/或進一步含有SEQ ID NO：43之位置13219至位置14334的核苷酸序列之重組表現載體；b)以含有步驟a)之核酸序列的表現載體將宿主細胞轉化以製造轉化株；c)培養該步驟b)之轉化株；及d)將該谷氏菌素或谷氏菌素類似物從步驟c)之轉化株的培養產物中分離出並純化。

本發明提供一種轉基因之原核細胞，其包含編碼與選自以下群組之至少一種胺基酸序列具有至少70%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。於另一實施例中係提供一種轉基因之原核細胞，其包含編碼與選自以下群組之至少一種胺基酸序列具有至少75%之序列同一性、至少80%之序列同一性、至少85%之序列同一性、至少90%之序列同一性、至少95%之序列同一性、或至少99%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。

本發明亦提供一種轉基因之原核細胞，其包含編碼與選自以下群組之至少一種胺基酸序列具有至少70%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88。於另一實施例中係提供一種轉基因之原核細胞，其包含編碼與選自以下群組之至少一種胺基酸序列具有至少70%之序列同一性、至少80%之序列同一性、至少85%之序列同一性、至少90%之序列同一性、至少95%之序列同一性、或至少99%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88。

本發明亦提供與選自以下群組之核酸序列具有至少70%之序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：41，還包含含有外源性限制性內切酶裂解部位之核酸序列。

序列表

發明之詳細說明

本文中之所有出版物、專利及專利申請案，包括任何附圖及附錄在此以引用方式被納入本文中，其程度如同各個別出版物、專利及專利申請案被具體指定且個別指明以引用方式被納入本文中。

下列描述包括可用來理解本發明之信息。其並非承認本文中所提供之任何信息為先前技藝或與目前聲稱之發明有所相關、或任何具體指明或隱含引用之出版物為先前技藝。

本發明提供細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變株。現已發現，菌株NRRL B-50550具有各種有利性能。菌株NRRL B-50550(或其醱酵產物)不僅具有這類殺蟎活性，亦顯示出，例如高紫外線穩定性、良好的透層活性、良好的殺卵活性、長殘留活性、浸液活性以及對抗範圍廣泛之蟎蟲的活性(見實例部分)，因此，符合有效殺蟎劑之要求。此外，菌株NRRL B-50550(或其醱酵產物)具有殺昆蟲活性及對抗各種真菌性植物病原(諸如葉銹病和霜黴病)之活性。此種獨特的活性組合使菌株NRRL B-50550為高度通用之候選菌株，並使該菌株適合被廣泛用於處理植物以控制植物疾病和/或植物害蟲的方法中。已知之鏈黴菌株未曾被報導過具有這類廣範圍活性及在農業中之可能應用。關於可能的農業用途，鏈黴菌株曾被大幅描述於1960年代末及1970年代初之出版物。參見，例如英國專利號GB 1 507 193中，其描述產製抗微生物化合物B-98891之龜裂鏈黴菌(Streptomyces rimofaciens)菌株B-98891號(保藏編號為ATCC 31120)。根據1975年3月提交之GB 1 507 193，抗微生物化合物B-98891為提供龜裂鏈黴菌株B-98891抗真菌活性對抗白粉病的活性成分。1972年8月2日提交之美國專利第3,849,398號描述菌株豐加鏈黴菌無刺黴素變種(Streptomyces toyocaensis var.aspiculamyceticus)產製抗微生物化合物無刺黴素(aspiculamycin)，亦稱為谷氏菌素(參見，Toru Ikeuchi et al.,25 J.Antibiotics 548(1972年9月))。根據美國專利第3,849,398號，谷氏菌素具有對抗動物身上之寄生蟲(諸如蟯蟲，等)的殺寄生蟲作用，雖然谷氏菌素被認為顯示出弱的對抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及結核桿菌的抗菌活性。類似地，1978年出版之日本專利申請案第JP 53109998(A)號報告菌株豐加鏈黴菌(LA-681)及其產製谷氏菌素作為殺蟎劑之能力。然而，需注意的是，目前並無以這類鏈黴菌株為基礎的殺蟎醱酵產物的市售商品。因此，細黃鏈黴菌株NRRL B-50550憑藉其廣泛之對抗蟎(基於產製谷氏菌素)、真菌和昆蟲的效力，及其在作用模式方面之有利性質(如透層活性及殘留活性)而成為在生物和有利性質方面之重要且出人意表的進步代表，已知之鏈黴菌株仍未曾有這類生物和有利性質之報導。本申請者已解決製造含有高濃度谷氏菌素之醱酵基質的問題，而使該醱酵基質成為商業殺蟲劑或作為用於商業殺蟲劑之谷氏菌素來源的終極用途可行。因此，本發明包含含有濃度為至少約0.5克/升之谷氏菌素的醱酵基質。此外，本發明包含含有濃度為至少約1克/升、至少約2克/升、至少約3克/升、至少約4克/升、至少約5克 /升、至少約6克/升、至少約7克/升、或至少約8克/升之谷氏菌素的醱酵基質。於其它實施例中，該醱酵基質含有濃度在約2克/升至約15克/升範圍內之谷氏菌素，包括約3克/升、約4克/升、約5克/升、約6克/升、約7克/升、約8克/升、約9克/升、約10克/升、約11克/升、約12克/升、約13克/升，及約14克/升之濃度。於一些實施例中，該醱酵基質係來自鏈黴菌種。於特定之實施例中，該醱酵基質係來自細黃鏈黴菌。再於其他特定之實施例中，該醱酵基質係來自細黃鏈黴菌NRRL-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變體。此外，本申請者鑑定和操縱負責產製谷氏菌素之細黃鏈黴菌基因簇。參見下圖及第5圖中之谷氏菌素的結構。

除非另外具體註明，本文所描述之微生物和特殊菌株均從自然界中分離出(即，隔離出)且生長在人工條件下，諸如在搖瓶培養中或透過規模擴增之製造過程，諸如在生物反應器中(諸如本文所描述者)。於一實施例中係提供細黃鏈黴菌NRRL B-50550之植食性殺蟎突變株。細黃鏈黴菌為屬於鏈黴菌屬的嗜溫、腐生細菌，常在土壤和腐爛之植物中找到。NRRL B-50550為從美國大陸之土壤中分離出的細黃鏈黴菌株。細黃鏈黴菌為好氧之革蘭氏陽性絲狀菌，其產生發育良好之絲狀營養菌絲(~1.0微米寬及10-100微米長)，且能產生分生孢子(conidia)-無性孢子。菌絲係由長、直絲所組成，其以多多少少有點規律之間隔，以旋渦狀之排列(環生體)方式攜帶米色、光滑的孢子。每個生體的分支在其頂點產生帶有二至數個孢子鏈的繖形花序。

術語“突變體”係指從細黃鏈黴菌株NRRL B-50550衍生的遺傳變異體。於一實施例中，該突變體具有細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之一或多種或全部的識別(功能性)特性。於一特殊之情況中，該突變體或其醱酵產物至少如親代細黃鏈黴菌株NRRL B-50550般良好地控制(為一種識別的功能特性)蟎蟲。此外，該突變體或其醱酵產物可能具有一、二、三、四或全部五種以下特點：與殺蟎活性相關之透層活性、與殺蟎活性相關之殘留活性、殺卵活性、殺蟲(尤其是對抗葉甲)活性、或是對抗真菌植物病原之活性(尤其是對抗霜黴病及銹病)。這類突變體可能為其基因組序列與細黃鏈黴菌株NRRL B-50550具有超過約85%、超過約90%、超過約95%、超過約98%、或超過約99%之序列同一性的遺傳變異體。突變體可經由以下方式取得：以化學物質或輻射處理細黃鏈黴菌株NRRL B-50550細胞或從NRRL B-50550細胞之群體選擇自發性突變體(諸如具噬菌體抗性或抗生素抗性之突變體)，或藉由本技藝中之技術人士所熟知的其他方式取得。

用於使細黃鏈黴菌產生突變的合適化學品包括(僅舉幾個例子)：鹽酸羥胺、甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、4-硝基喹啉1-氧化物(NQO)、絲裂黴素C或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)(參照，例如Stonesifer & Baltz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第82册，1180-1183頁，1985年2月)。使用各別鏈黴菌株之孢子溶液，藉由，例如NTG來引起鏈黴菌株突變已為熟習本技藝之人士所周知。見，例如Delic et al,Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,Volume 9,Issue 2,1970年2月，167-182頁，或Chen et al.,J Antibiot(Tokyo)，2001年11月；54(11)，967-972頁)。更詳細地說，可使用Kieser,T.,et al.,2000,supra.Practical Streptomyces Genetics,Ch.5 John Innes Centre,Norwich Research Park,England(2000),99-107頁中描述的方案，藉由NTG使細黃鏈黴菌發生突變。藉由紫外線(UV)使細黃鏈黴菌孢子發生突變可使用標準方案來進行。例如，可將鏈黴菌株之孢子懸浮液(新鮮配製的或冷凍在20%甘油中的)懸浮在波長254nm下，不吸收UV光的培養基中(例如水或20%甘油是合適的)。然後，將孢子懸浮液置於玻璃培養皿中，以低壓汞蒸汽燈照射(該低壓汞蒸汽燈在254nm發射出其大部分能源)，並在30℃下持續攪拌一段合適的時間(最合適之照射時間可經由先繪製劑量存活曲線來測定)。然後，例如可在非選擇性斜面培養基或培養盤上接種密集之經照射的孢子懸浮液，由此取得之突變株可依下文中之解釋評估其性質。見Kieser,T.，等人，2000，同上文。

該突變株可為任何具有細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之一或多種或全部特性的突變株，尤其是相當於或優於細黃鏈黴菌NRRL B-50550之殺蟎活性。該殺蟎活性可，例如依實例2中之說明針對二斑蛛蟎(“TSSM”)測定，意指可將細黃鏈黴菌NRRL B-50550之突變株的培養貯存液生長在20-30℃，實例2之1升搖瓶的培養基1或培養基2中3-5天，然後可將稀釋之醱酵產物施用在兩株植物之利馬豆葉的頂部和底部，經過此處理後，可在同一天以50-100 TSSM侵染植物並將植物留在溫室中五天。

實例16提供用於產生細黃鏈黴菌NRRL B-50550之突變株的方法之具體實例。藉由此方法產生之一種突變株為細黃鏈黴菌株M(其將更充分地描述於實例中)。該細黃鏈黴菌M之谷氏菌素生物合成基因簇與細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之谷氏菌素生物合成基因簇(即，SEQ ID NO：43)具有約99%之序列同一性。

於本發明之一種觀點中，該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎的突變株具有透層活性。本文所使用之術語“透層活性”為其在本技藝中的習知含義，因此，“透層活性”意指化合物或組成物(此處之組成物為諸如含有細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其突變株之醱酵產物)移動通過欲處理之植物的葉組織之能力。透層化合物/組成物滲透葉組織並在葉內形成活性成分之貯集庫。因此，此透層活性亦提供對抗進食葉子之昆蟲和蟎蟲的殘留活性。由於該組成物(或其一或多種活性成分)可以移動通過葉片，徹底的噴灑覆蓋對控制蜱蟎，諸如蟎(其通常在葉子下方進食)較不重要。單獨之突變株的透層活性或與細黃鏈黴菌NRRL B-50550的比較可，例如依本文中實例6之說明，對二斑蛛蟎(“TSSM”)進行測定。在實例6的條件下數天(例如約5天)後仍然可以觀察到透層活性。於本發明之一種觀點中，可在處理後至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天觀察(存在)到透層活性。

於本發明之另一觀點中，該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株具有殘留活性。本文所使用之術語“殘留活性”為其在本技藝中的習知含義，因此，“殘留活性”意指化合物或組成物(此處之組成物為諸如含有細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其突變株之醱酵產物)在施用後之一段延長的時間內保持有效(即，對比於未施用該化合物或組成物之條件，造成較高之蟎蟲死亡率或導致蟎蟲之總數減少)的能力。時間的長度可能取決於該調和物(粉塵、液體，等)、植物之類型或施用含有細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其突變株之組成物的位置及該植物表面或土壤表面之條件(濕、乾，等)。單獨之突變株的殘留活性或與細黃鏈黴菌NRRL B-50550的比較可，例如依本文實例2或7中之說明，對二斑蛛蟎 (“TSSM”)進行測定，且在殺蟎作用方面意指在實例5的條件下數天(例如約12天)後仍然可以觀察到抗蟎效果。於本發明之一種觀點中，可在處理後至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40天後觀察(存在)到殘留活性。

於本發明之另一觀點中，該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株具有殺卵活性。本文所使用之術語“殺卵活性”為其在本技藝中的習知含義，意指“造成卵子破壞或死亡的能力”，且在本文中係關於蟎蜱(諸如蟎)之卵。單獨之細黃鏈黴菌NRRL B-50550突變株的殺卵活性或與細黃鏈黴菌NRRL B-50550之比較可使用如實例7中所描述之方法測定。在實例7的條件下幾天(例如約5天)後仍然可以觀察到殺卵活性。於本發明之一種觀點中，在處理後至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天仍能觀察(存在)到殺卵活性。

於本發明之另一觀點中，該細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株可能具有浸液活性。本文所使用之術語“浸液活性”為其在本技藝中的習知含義，意指從土壤或其它生長培養基經由木質部，向上通過植物之殺蟲活性。該單獨之細黃鏈黴菌NRRL B-50550突變株的“浸液活性”或與細黃鏈黴菌NRRL B-5055之比較可使用如實例8中所描述之方法測定。於本發明之一種觀點中，在實例8的條件下幾天(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11天)後仍然可以觀察(存在)到浸液活性。

於本發明之另一觀點中，細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株具有對抗各種蟎種的殺蟎活性，包括如實例中所說明(但不限於)之對抗二斑蛛蟎之活性、對抗柑桔銹蟎(柑橘銹癭蟎(Phyllocoptruta oleivora))、癭蟎(枯葉色)和廣明蟎的活性。

因此，該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株可能具有對抗選自下列群組之蟎的活性：三葉蟎(clover mite)、棕色蟎(brown mite)、榛子蛛蟎(hazelnut spider mite)、蘆筍蛛蟎(asparagus spider mite)、棕色小麥蟎(brown wheat mite)、豆蟎(legume mite)、酢漿草蟎(oxalis mite)、黃楊木蟎(boxwood mite)、德州柑橘蟎(Texas citrus mite)、東方紅蟎(Oriental red mite)、柑桔紅蟎(citrus red mite)、歐洲紅蟎(European red mite)、黃蛛蟎(yellow spider mite)、無花果蛛蟎(fig spider mite)、劉易斯蛛蟎(Lewis spider mite)、六斑蛛蟎(six-spotted spider mite)、威拉米特蟎(Willamette mite)、尤馬蛛蟎(Yuma spider mite)、紡網絡蟎(web-spinning mite)、菠蘿蟎(pineapple mite)、柑橘綠蟎(citrus green mite)、美洲皂莢蛛蟎(honey-locust spider mite)、茶紅蛛蟎(tea red spider mite)、南方紅蟎(southern red mite)、鱷梨棕蟎(avocado brown mite)、雲杉蛛蟎(spruce spider mite)、鱷梨紅蟎(avocado red mite)、草地小爪蟎(Banks grass mite)、硃砂蛛蟎(carmine spider mite)、沙漠蛛蟎(desert spider mite)、蔬菜蜘蟎(vegetable spider mite)、隆突蛛蟎(tumid spider mite)、草莓蛛蟎(strawberry spider mite)、二斑蛛蟎(two-spotted spider mite)、丹尼爾蟎(McDaniel mite)、太平洋蛛蟎(Pacific spider mite)、山楂蛛蟎(hawthorn spider mite)、四斑蛛蟎(four-spotted spider mite)、肖氏蛛蟎(Schoenei spider mite)、智利假蛛蟎(Chilean false spider mite)、柑橘平蟎(citrus flat mite)、女貞蟎(privet mite)、平猩紅蟎(flat scarlet mite)、白尾蟎(white-tailed mite)、菠蘿跗線蟎(pineapple tarsonemid mite)、西印度甘蔗蟎(West Indian sugar cane mite)、鱗莖鱗蟎(bulb scale mite)、仙客來蟎(cyclamen mite)、廣明蟎(broad mite)、麥圓葉爪蟎(winter grain mite)、紅足泥蟎(red-legged earth mite)、榛小植刺癭蟎(filbert big-bud mite)、葡萄癭蟎(grape erineum mite)、梨腫葉蟎(pear blister leaf mite)、蘋果捲葉緣蟎(apple leaf edgeroller mite)、桃植羽癭蟎(peach mosaic vector mite)、赤楊珠癭蟎(alder bead gall mite)、佩里安核桃葉癭蟎(Perian walnut leaf gall mite)、胡桃葉捲緣蟎(pecan leaf edgeroll mite)、無花果癭蟎(fig bud mite)、橄欖油癭蟎(olive bud mite)、柑橘癭蟎(citrus bud mite)、荔枝癭蟎(litchi erineum mite)、小麥曲蟎(wheat curl mite)、椰子花核癭蟎(coconut flower and nut mite)、甘蔗腫癭蟎(sugar cane blister mite)、野牛草癭蟎(buffalo grass mite)、百慕達草癭蟎(bermuda grass mite)、胡蘿蔔癭蟎(carrot bud mite)、紅薯葉癭蟎(sweet potato leaf gall mite)、石榴葉曲蟎(pomegranate leaf curl mite)、ash sprangle癭蟎(ash sprangle gall mite)、槭斜背瘤癭蟎(maple bladder gall mite)、alder erineum蟎(alder erineum mite)、紅莓蟎(redberry mite)、棉花腫蟎(cotton blister mite)、藍莓癭蟎(blueberry bud mite)、粉紅茶銹蟎(pink tea rust mite)、茶紫癭蟎(ribbed tea mite)、灰色柑橘蟎(grey citrus mite)、紅薯銹蟎(sweet potato rust mite)、七葉樹銹蟎(horse chestnut rust mite)、柑桔銹蟎(citrus rust mite)、蘋果銹蟎(apple rust mite)、葡萄銹蟎(grape rust mite)、梨銹蟎(pear rust mite)、扁針鞘松蟎(flat needle sheath pine mite)、野玫瑰芽果蟎(wild rose bud and fruit mite)、乾莓癭蟎(dryberry mite)、芒果銹蟎(mango rust mite)、杜鵑銹蟎(azalea rust mite)、梅銹蟎(plum rust mite)、桃銀色刺癭蟎(peach silver mite)、蘋果銹蟎(apple rust mite)、番茄葉赤皮癭蟎(tomato russet mite)、粉紅柑桔銹蟎(pink citrus rust mite)、穀物銹蟎(cereal rust mite)、水稻銹蟎(rice rust mite)及彼等之組合。此外，該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株具有對抗那些對其他蟎控制劑具抗性之蟎蟲的活性。於一實施例中，該菌株具有對抗具阿維菌素(abamectin)抗性之蟎蟲的活性。

於本發明之另一觀點中，該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株可能亦具有殺蟲活性。該靶的昆蟲可能為葉甲(diabrotica)。該葉甲可能為帶狀黃瓜甲蟲(banded cucumber beetle)(食蚜蠅葉甲(Diabrotica balteata))、西斑黃瓜甲蟲(Western spotted cucumber beetle)(黃瓜十一星葉甲(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata))、或玉米根蟲，諸如北方玉米根蟲(Northern corn rootworm)(巴氏根葉甲(Diabrotica barberi))、南方玉米根蟲(Southern corn rootworm)(黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabrotica undecimpunctata howardi))、西黃瓜甲蟲(Western cucumber beetle)(黃瓜十一星葉甲(Diabrotica undecimpunctata tenella))、西玉米根蟲(Western corn rootworm)(玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera))、墨西哥玉米根蟲(Mexican corn rootworm)(墨西哥玉米根葉甲(Diabrotica virgifera zeae))及這類葉甲之組合。單獨之細黃鏈黴菌NRRL B-50550的突變株之殺蟲活性或與細黃鏈黴菌NRRL B-50550的比較可使用實例10中所描述之方法對玉米根蟲測定。

於本發明之另一觀點中，該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株具有殺真菌劑活性，意指對抗由真菌引起之植物疾病的活性。該植物疾病可為霜黴病或銹病。可以細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株處理之霜黴病的實例包括，但不限於白粉病，諸如由黃瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)引起的黃瓜白粉病，或霜霉病，諸如由寄生霜黴菌(Peronospora parasitica)引起的甘藍型油菜霜霉病。可以細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株處理之銹病的實例包括，但不限於由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)(亦稱為P.recondita)引起之小麥葉銹病、由麥稈銹菌(Puccinia grammis)引起之麥稈銹病、由條銹病菌(Puccinia striiformis)引起之小麥條銹病、由大麥柄銹菌(Puccinia hordei)引起之大麥葉銹病、由隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)引起之裸麥葉銹病、棕葉銹病、冠銹病及稈銹病。單獨之細黃鏈黴菌NRRL B-50550突變株的殺真菌活性或與細黃鏈黴菌NRRL B-50550之比較可使用如實例9中所描述之方法對黃瓜白粉病進行測定。在實例9的條件下幾天(例如約7天)後仍然可觀察到殺真菌活性。於本發明之一種觀點中，可在處理後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和/或15天觀察(存在)到殺真菌活性。

本發明亦提供紫紅鏈黴菌株A或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌的突變株。紫紅鏈黴菌為鏈黴菌屬細菌之灰色鏈黴菌(S.griseus)分化枝的成員。紫紅鏈黴菌為需氧革蘭氏陽性、絲狀菌。其產生每鏈具有10至多於50個孢子的中等長度之成熟孢子鏈。當生長在以燕麥為底質的瓊脂上時，該孢子質地光滑且菌落之顏色為淡黃色至淡紅色。紫紅鏈黴菌株A係自美國大陸採集之土壤樣本中分離出。如實例18中之描述，菌株A之醱酵產物具有殺蟎性能。於一實施例中係提供紫紅鏈黴菌株A之植食性殺蟎和/或殺真菌突變株。術語“突變體”係指衍生自紫紅鏈黴菌株A之遺傳變異體。於一實施例中，該突變體具有紫紅鏈黴菌株A之一或多種或全部的識別(功能性)特性。於一特殊之情況中，該突變體或其醱酵產物至少如親代紫紅鏈黴菌株A般良好地控制(為一種識別的功能特性)蟎。這類突變體可能為其基因組序列與紫紅鏈黴菌株A具有超過約85%、超過約90%、超過約95%、超過約98%、或超過約99%之序列同一性的遺傳變異體。突變體可經由以下方式取得：以化學物質或輻射處理紫紅鏈黴菌株A細胞或從A細胞之群體選擇自發性突變體(諸如具噬菌體抗性或抗生素抗性之突變體)，或藉由本技藝中之技術人士所熟知的其他方式選擇，包括上文及實例16中所描述之關於細黃鏈黴菌NRRL B-50550的方式。紫紅鏈黴菌株A含有編碼蛋白質GouB-GouM之谷氏菌素基因簇，且被預期含有GouA。紫紅鏈黴菌株A之蛋白質GouB-GouM與來自細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之直系同源蛋白質具有至少90%之序列同一性。

本發明亦包含處理植物以控制植物害蟲和疾病的方法，其係經由將一或多種含有谷氏菌素之鏈黴菌、細黃鏈黴菌株NRRL B-50550、或由其衍生之植食性殺蟎或殺真菌突變株、或其無細胞製劑、或其代謝物、或紫紅鏈黴菌株A或由其衍生之植食性殺蟎突變株、或其無細胞製劑、或其代謝物的醱酵基質投予植物或植物部分(諸如葉、莖、花、果實、根、或種子)，或施用在植物或植物部分生長的位點，諸如土壤。適合用於本發明之方法的其他產製谷氏菌素的菌株和醱酵產物描述於本文中。

本文所使用之術語“植物”係指屬於植物界之任何生物體(即，植物界中之任何屬/種)。這包括熟悉之生物體，諸如，但不限於樹木、草本植物、灌木、草、藤本植物、蕨類植物、苔蘚及綠藻。此術語係指單子葉植物(monocotyledonous plants亦稱為monocots)和雙子葉植物(dicotyledonous plants亦稱為dicots)兩者。於一些實施例中，植物具經濟重要性。於一些實施例中，該植物為人工種植之植物，例如栽培之植物，其可能為農業、造林或園藝用植物。舉些例子，特殊植物之實例包括，但不限於玉米、馬鈴薯、玫瑰、蘋果樹、向日葵、小麥、水稻、香蕉、番茄、opo、南瓜、西葫蘆、豆類(例如，利馬豆)生菜、白菜、橡樹、擎天鳳梨(guzmania)、天竺葵、扶桑、威靈仙(clematis)、一品紅(poinsettias)、甘蔗、芋頭、鴨雜草、松樹、肯塔基藍草、結縷草、椰子樹、芸苔屬葉菜類蔬菜(例如西蘭花、球花甘藍、布魯塞爾豆芽、白菜、中國白菜(Bok Choy和Napa)、菜花、cavalo、芥蘭菜、羽衣甘藍、大頭菜、芥菜、油菜及其他芸苔屬葉菜類蔬菜作物)、鱗莖類蔬菜(例如大蒜、韭菜、洋蔥(洋蔥乾鱗莖、大葱、長葱)、蔥及其他鱗莖蔬菜作物)、柑橘類果實(例如葡萄柚、檸檬、萊姆、柳橙、桔子、柑桔雜交種、柚子及其他柑橘類果實作物)、瓜類蔬菜(例如小黃瓜、枸櫞西瓜、食用葫蘆、西印度黃瓜、甜瓜(包括黃瓜瓜類之雜交種和/或栽培變種)、西瓜、哈密瓜及其他瓜類蔬菜作物)、果類蔬菜(包括茄子、鵝莓、人參果、辣椒、番茄、樹蕃茄及果類蔬菜作物)、葡萄、葉菜類蔬菜(例如萵苣)、根/塊莖和球莖蔬菜(例如馬鈴薯)、扁豆、苜蓿芽、三葉草及樹堅果(杏仁、胡桃、開心果及核桃)、漿果(例如番茄、伏牛花、葡萄乾、接骨木果、醋栗、金銀花、鬼臼根、莢迷、奧勒岡葡萄、沙棘、朴樹果、熊果、越橘、草莓、海葡萄、黑莓、黃梅、楊莓、覆盆子、美莓、糙莓及酒莓)、禾穀類作物(例如玉米、水稻、小麥、大麥、高粱、小米、燕麥、黑麥、黑小麥、蕎麥、非洲小米(fonio)及藜麥)、梨果類果實(例如蘋果、梨)、核果(例如咖啡、棗、芒果、橄欖、椰子、油棕、開心果、杏仁、杏、櫻桃、西洋李子、油桃、桃子及李子)、藤(例如食用葡萄、釀酒葡萄)、麻類作物(例如麻、棉)、觀賞植物。於一些實施例中，該植物可能為住宅/家內植物、溫室植物、農業植物或園藝植物。如上文所指出者，於一些實施例中，該植物可能為硬木，諸如合歡、桉樹、角樹、櫸木、紅木、胡桃木、橡木、梣樹、柳、胡桃木、樺木、板栗、楊樹、榿木、楓樹、梧桐、銀杏、棕櫚樹和楓香。於一些實施例中，該植物可能為針葉樹，諸如柏樹、道格拉斯冷杉、樅、紅杉、鐵杉、雪松、刺柏、落葉松、松樹、紅木、雲杉及紅豆杉。於一些實施例中，該植物可能為產果實之木本植物，諸如蘋果、李子、梨、香蕉、橙、奇異果、檸檬、櫻桃、葡萄、木瓜、花生及無花果。於一些實施例中，該植物可能為木本植物，諸如棉、竹及橡膠植物。於一些實施例中，該植物可能為農業、造林和/或觀賞用植物，即，常用於園藝(例如在公園、花園和陽台)之植物。在大量之觀賞植物間可舉出之一些例子有草皮、天竺葵(geranium)、天竺葵(pelargonia)、矮牽牛、秋海棠及燈籠海棠。術語“植物”亦意欲包括任何植物繁殖體。

術語“植物”一般包括已藉由一或多次育種、誘變和基因工程修改之植物。基因工程係指使用重組DNA技術。重組DNA技術令那些無法輕易地經由在自然環境下交叉育種、基因突變或自然重組取得之修改成為可行。於一些實施例中，藉由基因工程取得之植物可能為轉基因植物。

如本文所使用之術語“植物部分”係指植物之任何部分，包括，但不限於幼芽、根、莖、種子、托葉、葉、花瓣、花、胚珠、苞、枝條、葉柄、節間、樹皮、木材、塊莖、軟毛、分蘗、根莖、藻體、葉片、花粉、雄蕊、孢子、果實和種子。生長在本技藝所使用之典型基質(諸如土壤)中的兩種植物之主要部分通常被稱為“地上”部分(亦常被稱為“新枝”)及“地下”部分(亦常被稱為“根”)。

於根據本發明之方法中可將含有細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株之組成物施用於生長在長成植物所使用之任何類型的基質(例如土壤、蛭石、碎紙板及水)中之任何植物或任何植物之任何部分，或施用於架空種植的植物或植物部分，諸如蘭花或鹿角蕨上。該組成物可，例如藉由噴灑、噴霧、蒸發、撒、噴粉、澆水、噴、灑、澆注、或熏蒸施用。如上文已經指出，施用程序可在所欲植物放置之任何需要的地點進行，諸如農業、園藝、森林、農園、果園、苗圃、有機種植之作物、草皮及城市環境。

本發明之組成物可經由使用傳統之大規模微生物醱酵過程培養細黃鏈黴菌NRRL B-50550或由其衍生之突變體取得，該醱酵過程為，諸如深層醱酵、固態醱酵或液體表面培養，包括，例如美國專利第3,849,398號；英國專利GB 1 507 193號；Toshiko Kanzaki，等人，Journal of Antibiotics,Ser.A,Vol.15,No.2,1961年6月，93至97頁；或Toru Ikeuchi，等人，Journal of Antibiotics(1972年9月)，548至550頁中所描述的方法。設置醱酵，以在醱酵容器中取得高水準之活生物量(包括孢子)及理想之二次代謝產物。適合用於本發明之菌株，以取得高水準之孢子形成、cfu(菌落形成單位)及二次代謝產物的特定醱酵方法描述於實例部分中。

從醱酵產生之培養基質(“全基質”或“醱酵基質”)中的細菌細胞、孢子和代謝產物可直接使用或藉由習知之工業方法，諸如離心、過濾及蒸發濃縮，或藉由，例如噴霧乾燥、滾筒乾燥及冷凍乾燥加工成乾燥粉末和顆粒。

如本文所使用之術語“全基質”和“醱酵基質”係指在任何下游處理之前從醱酵(包括製造含有濃度為至少約1克/升之谷氏菌素的培養基質)產生之培養基質。該全基質包含微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)及其組成部分、未使用之原料基質及在醱酵過程中由微生物產生之代謝產物。如本文所使用之術語“基質濃縮物”係指已藉由如上述之習知工業方法濃縮，但仍為液體形式之全基質(醱酵基質)。如本文所使用之術語“醱酵固體”係指乾燥的醱酵基質。如本文所使用之術語“醱酵產物”係指全基質、基質濃縮物、和/或醱酵固體。本發明之組成物包括醱酵產物。於一些實施例中，濃縮之醱酵基質係，例如經由滲濾過程洗滌，以除去殘留的醱酵基質和代謝產物。

於一實施例中，該醱酵基質之每毫升基質中含有至少約1×10⁵個菌落形成單位(CFU)之微生物(例如，細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)。於另一實施例中，該醱酵基質之每毫升基質中含有至少約1×10⁶個菌落形成單位(CFU)之微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)。再於另一實施例中，該醱酵基質之每毫升基質中含有至少約1×10⁷個菌落形成單位(CFU)之微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)。於另一實施例中，該醱酵基質之每毫升基質中含有至少約1×10⁸個菌落形成單位(CFU)之微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)。於另一實施例中，該醱酵基質之每毫升基質中含有至少約1×10⁹個菌落形成單位(CFU)之微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL R-50550或其植食性殺蟎突變株)。於另一實施例中，該醱酵基質之每毫升基質中含有至少約1×10¹⁰個菌落形成單位(CFU)之微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)。於另一實施例中，該醱酵基質之每毫升基質中含有至少約1×10¹¹個菌落形成單位(CFU)之微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)。熟習本技藝之人士將理解上述濃度與醱酵完成後不久所測量之CFU有關，但該CFU水準將根據儲存條件而隨著時間降低。當將產物保持在冷藏(例如，約4℃)下，本文所描述的微生物之未經配製的醱酵產物之CFU水準是穩定的，但在室溫下會下降。

於一實施例中，該醱酵基質或基質濃縮物可在添加穩定劑、防腐劑、佐劑、和/或著色劑下配製成液態懸浮液、液態濃縮物、乳劑濃縮物、或可濕性粉末。

於另一實施例中，該醱酵基質或基質濃縮物可在添加或不添加載體、惰性劑、或添加劑下使用習知之乾燥過程或方法(諸如噴霧乾燥、冷凍乾燥、托盤乾燥、流化床乾燥、滾筒乾燥或蒸發)進行乾燥。

於一些實施例中，該醱酵基質、基質濃縮物或醱酵固體係經處理，以殺死微生物，產生由被殺死之微生物、其代謝產物和殘留之醱酵培養基所組成的醱酵產物。完成此目的之合適的處理方法為熟習本技藝之人士所已知且包括熱處理。

於其中該醱酵基質或基質濃縮物被冷凍乾燥的實施例中，一加侖之醱酵基質產生約0.2磅至約1磅的凍乾粉末。於特定之情況中，一加侖之醱酵基質產生約0.4磅至約0.6磅的凍乾粉末。於另一情況中，一加侖之醱酵基質產生約0.5磅的凍乾粉末。

於進一步之實施例中，可在添加或不添加惰性劑之情況下將所得之乾燥產物進一步加工，諸如藉由研磨或粒化來取得用於農業施用所需之特定顆粒尺寸、或物理格式、或物理性質。

除了使用全基質或濃縮基質外，可藉由本技藝中已知之任何方式(諸如萃取、離心和/或過濾醱酵基質)取得本發明之鏈黴菌的新穎變體和菌株之醱酵基質的無細胞製劑。熟習本技藝之人士將會理解所謂的無細胞製劑可能不會完全喪失細胞，但大部分為無細胞或基本上無細胞，這取決於用來除去細胞所使用之技術(例如，離心速度)。所得到之無細胞製劑可與協助其施用之組分一起乾燥和/或配製。上文中所描述之用於醱酵基質的濃縮方法和乾燥技術亦適用於無細胞製劑。

本發明之組成物可包括添加在包含細胞、無細胞製劑或代謝物之組成物中的配製成分，以提高效力、穩定性和物理性能、可用性和/或便於加工、包裝和最終施用。這類配製成分可包括載體、惰性劑、穩定劑、防腐劑、營養素或物理性能改質劑，其可以單獨添加或組合加入。於一些實施例中，該載體可包括液態物質，諸如水、油和其他有機或無機溶劑，以及固態物質，諸如礦物質、聚合物或從生物衍生或藉由化學合成之聚合物複合物。於一些實施例中，該成分為促進該組成物黏附至植物部分(諸如葉、種子或根)的結合劑、佐劑，或黏合劑。見，例如Taylor,A.G.,et al.,"Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments" Annu.Rev.Phytopathol.28：321-339(1990)。該穩定劑可包括防結塊劑、抗氧化劑、乾燥劑、保護劑或防腐劑。該營養素可包括碳、氮及磷源，諸如糖、多醣、油、蛋白質、胺基酸、脂肪酸和磷酸鹽。該物理性能改質劑可包括填充劑、潤濕劑、增稠劑、pH改質劑、流變改質劑、分散劑、佐劑、表面活性劑、抗凍劑或著色劑。於一些實施例中，該藉由醱酵產生之包含細胞、無細胞製劑或代謝物的組成物可在無任何其他配製劑，有或無作為稀釋劑之水的存在下直接使用。於一特定之實施例中係在醱酵固體(諸如冷凍乾燥或噴霧乾燥粉末)中添加潤濕劑。當將潤濕劑施用至活性成分之表面時，其可增加該活性成分之擴散和滲透性能(一旦稀釋時)。示例性之潤濕劑為熟習本技藝之人士所已知且包括磺基琥珀酸酯和衍生物，諸如MONAWET MO-70(Croda公司，紐澤西州Edison)；trsiloxanes，諸如BREAKTHRU(德國Evonik)；非離子性化合物，諸如ALTOX 4894(Croda公司，紐澤西州Edison)；烷基多糖苷，諸如TERWET 3001(Huntsman國際有限責任公司，德州，The Woodlands)；C12-C14二級醇乙氧基化物，諸如TERGITOL 15-s-15(道氏化學公司，密西根州Midland)；磷酸酯，諸如RHODAFAC BG-510(Rhodia公司)；和烷基醚羧酸酯，諸如EMULSOGEN-LS (Clariant公司，北卡羅萊納州)。

於一些實施例中，該配製惰性劑係在濃縮醱酵基質後，及乾燥期間和/或乾燥後加入。

本發明包含含有濃度為至少約1克/升之谷氏菌素的醱酵基質。於一些實施例中，這類全基質培養來自產製谷氏菌素之鏈黴菌株。於特殊之實施例中，這類產製谷氏菌素之菌株為細黃鏈黴菌、紫紅鏈黴菌、或禾粟鏈黴菌。於另一實施例中，該產製谷氏菌素之菌株為灰色鏈黴菌、環圈鏈黴菌、糞生鏈黴菌、小鏈黴菌、淡紫灰鏈黴菌、白綠鏈黴菌、或紫紅鏈黴菌。再於另一特殊實施例中，這類產製谷氏菌素之菌株為禾粟鏈黴菌CGMCC 4.506，其存放於中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC。

本發明亦提供來自細黃鏈黴菌之谷氏菌素生物合成基因簇、該基因簇中之個別基因的表徵及由其編碼之蛋白質。谷氏菌素基因簇被揭露，該基因簇包含14個開放閱讀框(ORFs)，分別稱為ORFs 4251至4253、4255至4259、4261至4265，和4271(分別為SEQ ID NO：1、3、5、9、11、13、15、17、21、23、25、27、29和41)，且在此分別稱為GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM及GouN。對應之蛋白質分別提供在SEQ ID NO：2、4、6、10、12、14、16、18、22、24、26、28、30和42中。包含該谷氏菌素生物合成基因簇及一些側翼區之基因組DNA序列提供於SEQ ID NO：43中，且描述基因GouA至GouN之位置。本揭露內容提供位於遺傳位點內之谷氏菌素基因簇的核酸序列、其中所含之ORFs及由其編碼之蛋白質。此信息可使，例如編碼谷氏菌素基因簇及對應之ORFs之同源物的相關核酸分子(諸如在其他鏈黴菌屬中)分離出成為可行。

從細黃鏈黴菌株鑑定出之包含在SEQ ID NO：43(核苷酸殘基1-21933)內的谷氏菌素基因簇包括24個ORFs，稱為ORFs 4248至4271。ORFs 4251、4252、4253、4255、4256、4257、4258、4259、4261、4262、4263、4264、4265和4271分別為13個基因gouA、gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM及gouN。需注意的是SEQ ID NO：89-100(從紫紅鏈黴菌株鑑定出)分別提供直系同源基因gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM。這些基因在谷氏菌素合成反應中之潛在功能及其可能的角色提供於表2中。

因此，再於另一實施例中，本發明之醱酵產物(包括具有至少約0.5克/升之谷氏菌素或至少約1克/升之谷氏菌素的醱酵基質)係來自產製谷氏菌素之鏈黴菌株，該鏈黴菌株具有編碼與選自以下群組之胺基酸序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：42。再於另一實施例中，該醱酵產物(包括具有至少約0.5克/升之谷氏菌素或至少約1克/升之谷氏菌素的醱酵基質)係來自產製谷氏菌素之鏈黴菌株，該鏈黴菌株具有與SEQ ID NO：43之核酸序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%之序列同一性的核苷酸序列。

於特殊之實施例中，具有上述核酸序列之這類產製谷氏菌素的菌株為細黃鏈黴菌或紫紅鏈黴菌。一種特殊之實例為細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變體。於一種情況中，其這類植食性殺蟎突變體為細黃鏈黴菌株M。於另一實例中，這類產製谷氏菌素的菌株為紫紅鏈黴菌株A或其植食性殺蟎突變體。

含有至少約1克/升之谷氏菌素的醱酵基質可以數種方式取得，諸如醱酵優化和/或使產製谷氏菌素之親代菌株發生突變以取得產製較親代菌株所產生者更高水準之谷氏菌素的突變株。

因此，本發明亦包含製造產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質之方法，其中該醱酵基質含有至少約0.5克/升之谷氏菌素。該方法包含將鏈黴菌株在有氧條件下，培養在含有可消化之碳源和可消化之氮源的培養基中培養，其中該培養基中含有谷氏菌素之先質，諸如胞嘧啶；核酸鹼基；和/或其濃度可有效取得至少0.5克/升之谷氏菌素濃度的胺基酸。

於一些實施例中係將該鏈黴菌株培養在培養基中，直到該培養基中含有之谷氏菌素的濃度為至少約0.5克/升、至少約1克/升、至少約2克/升、至少約3克/升、至少約4克/升、至少約5克/升、至少約6克/升、至少約7克/升、或至少約8克/升之谷氏菌素。

於其它實施例中係將該鏈黴菌株培養在培養基中，直到該培養基中含有之谷氏菌素的濃度為約0.5克/升至約25克/升之谷氏菌素，意指在醱酵完成後，該醱酵基質中所含有之谷氏菌素的濃度通常係在約0.5克/升至約15克/升之谷氏菌素的範圍內。

在此背景下，應注意的是該胺基酸(其添加濃度為可有效取得至少約0.5克/升或至少約1克/升之谷氏菌素濃度)係以限定之濃度，以分開之個別組分形式提供，而非組成物之一部分，諸如酵母萃取物或蛋白質水解產物(例如，僅舉幾例，酪蛋白水解產物、大豆粉水解產物，大豆蛋白腖，大豆酸水解產物))，其中胺基酸可存在於與其它化合物(諸如寡肽和經部分水解之蛋白質)之混合物中。因此，在醱酵基質中，“有效取得至少1克/升之谷氏菌素濃度的濃度”係指經特別選擇以在培養基中提供這類谷氏菌素濃度之胺基酸濃度。於一些實施例中，在培養基中用於取得所需之谷氏菌素濃度的有效胺基酸濃度為至少約1克/升。因此，此“有效濃度”可為高於2克/升且可能在，例如約2克/升至約15克/升之範圍內。該濃度可為約3克/升、約4克/升、約5克/升、約6克/升、約7克/升、約8克/升、約9克/升、約10克/升、約11克/升、約12克/升、約13克/升、或約14克/升。

該胺基酸可為任何能提供至少約0.5克/升或更高之谷氏菌素濃度(諸如至少為約1克/升、至少約2克/升、至少約3克/升、至少約4克/升、至少約5克/升、至少約6克/升)的胺基酸。於一些實施例中，該胺基酸為甘胺酸、L-麩胺酸、L-麩胺醯胺，L-天門冬胺酸、L-絲胺酸，或彼等之混合物。於一些實施例中，該培養基含有濃度為約5克/升至約15克/升之甘胺酸，而於其它實施例中，該培養基含有初始濃度為約5克/升至約15克/升之麩胺酸。亦可能為該培養基同時含有濃度為約5克/升至約15克/升之甘胺酸和麩胺酸(或L-麩胺醯胺)。

對鏈黴菌株而言為可消化(從而可利用)之任何碳源均可用於製造如本文所描述之醱酵基質的方法(或醱酵法)中。合適之碳源的實例(僅舉幾例)包括葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、澱粉(為多醣的一種實例)、糊精、麥芽糊精(為寡醣的一種實例)或甘油。該碳源之總初始濃度可為能提供合適之鏈黴菌生長並產製所需濃度之谷氏菌素的任何濃度，且可藉由實驗測定(測定醱酵基質中之谷氏菌素的最終濃度係取決於所用之碳源的濃度)。總初始碳源濃度可為，例如在約10克/升至約150克/升之範圍內，例如約10克/升、約20克/升、約30克/升、約40克/升、約50克/升、約60克/升、約70克/升、約80克/升、約90克/升、100克/升、約110克/升或約120克/升。於一些實施例中，該碳源可為二或多種碳源之混合物，例如葡萄糖與多醣(諸如澱粉)之混合物、葡萄糖和寡醣(諸如糊精或麥芽糖糊精)之混合物、或葡萄糖、澱粉和糊精的混合物。於一些實施例中，該培養基含有葡萄糖和寡醣之混合物作為碳源。該寡醣可為麥芽糊精或糊精。於這類實施例中，培養基中之初始麥芽糊精濃度可為約50克/升至約100克/升，或約60克/升至約80克/升。培養基中之初始葡萄糖濃度可為約20克/升至約80克/升，例如約30克/升、約40克/升、約50克/升、約60克/升或約70克/升。於其它其中使用葡萄糖與麥芽糖糊精或糊精作為碳源之實施例中，該葡萄糖濃度可為約20克/升至60克/升、或約30克/升至約50克/升。

任何可消化之氮源均可用於本文所描述之醱酵過程中。該氮源可為單獨之來源或來源之混合物。於說明性實施例中，該氮源(至少部分地)係選自下列群組：大豆蛋白腖、大豆酸水解產物、大豆粉水解產物、酪蛋白水解產物、酵母萃取物、及彼等之混合物。該氮源之總初始濃度可為能提供合適之鏈黴菌生長並產製所需濃度之谷氏菌素的任何濃度，且可藉由實驗測定。例如，培養基中之合適的總濃度可在約10克/升至約60克/升之範圍內，例如約20克/升、約30克/升、約40克/升、約50克/升。於說明性實施例中，該氮源可能為酪蛋白水解產物與大豆粉水合物之混合物、或酵母萃取物與大豆酸水解產物之混合物，其中，例如培養基中所使用之酵母萃取物的濃度(或量)為10克/升，且所使用之大豆酸水解產物的濃度/量為20克/升。

該培養基可進一步含有鈣源，諸如氯化鈣或碳酸鈣。若存在時，該培養基中可含有鈣源，諸如初始濃度為約1克/升至3克/升之碳酸鈣。

需注意的是，在此背景下，除非另有說明，所給予之該培養基中的所有成分之濃度為醱酵開始時的濃度(初始濃度)。該濃度係依據用於醱酵之接種後體積。此處所給予之初始濃度可經由在醱酵過程中連續餵入營養素來保持，或者，僅在醱酵開始時添加成分(碳源、氮源、胺基酸)。然而，該培養基/醱酵基質之pH值通常係經由添加合適之酸(諸如硫酸或檸檬酸)和/或合適之鹼(諸如氫氧化鈉或氨溶液或氫氧化鉀)來連續監測和控制。適當之pH值可以根據經驗來確定。於典型之實施例中，該培養基/醱酵基質之pH值係在6.5至7.5之範圍內，例如6.8至7.0。處理參數，諸如溫度及通氣量通常在醱酵過程之整個過程中均受到控制。由於鏈黴菌株之培養係在有氧條件下進行，該醱酵基質通常係以空氣、富含氧之空氣，或者，若需要時，純氧通氣。所選擇之溫度通常係在20℃至30℃的範圍內，然而，此處亦考慮更高之溫度。亦可持續添加標準的醱酵試劑，諸如消泡劑。醱酵基質可使用習知之大規模微生物醱酵過程製造，諸如深層醱酵、固態醱酵或液體表面培養，包括，例如美國專利第3,849,398號；英國專利第GB 1 507 193號；Toshiko Kanzaki et al.,Journal of Antibiotics,Ser.A,Vol.15,No.2,1961年6月，93至97頁；或Toru Ikeuchi et al.,Journal of Antibiotics,(1972年9月)，548至550頁中所描述之方法。

任何產製谷氏菌素之鏈黴菌株均可用於製造本文所揭露之含有谷氏菌素的醱酵基質。於說明性實施例中，該鏈黴菌株為細黃鏈黴菌株、紫紅鏈黴菌株、或禾粟鏈黴菌株。該細黃鏈黴菌株可為，例如細黃鏈黴菌菌株NRRL B-50550，或由其衍生之植食性殺蟎突變株。此外，能夠產製谷氏菌素(即使在低水準下)的親代菌株，諸如各種鏈黴菌(包括，但不限於細黃鏈黴菌、紫紅鏈黴菌及禾粟鏈黴菌)和芽孢桿菌可經過誘變以增進谷氏菌素之產製。實例14中描述一種用來製造這類突變體並產生含有至少1克/升之谷氏菌素的醱酵基質之方法。

在醱酵期間選擇特定之碳源和氮源，及其他營養素可用來優化谷氏菌素之產製。用於增進谷氏菌素之產製的合適碳源為澱粉、麥芽糖糊精、糊精、糖和葡萄糖。於一特定之實施例中係使用葡萄糖與寡醣之組合物作為碳源和/或先質。用於增進谷氏菌素之產製的合適氮源為大豆蛋白水解產物、酪蛋白水解產物、大豆蛋白腖、酵母萃取物，及其他營養素較不豐富之氮源。其它合適之氮源包括胺基羧酸和/或谷氏菌素先質，諸如甘胺酸、麩胺酸，包括L-麩胺酸、天門冬胺酸(包括L-天門冬胺酸)、絲胺酸(包括L-絲胺酸)及胞嘧啶。胞嘧啶可以具有高濃度之胞嘧啶的基質組分(諸如具有高核鹼基含量之酵母萃取物)之一部分的形式添加。能夠製造具有提高之谷氏菌素水準的醱酵基質之醱酵培養基的實例提供於實例11、12和13中。

於另一實施例中，本發明之醱酵產物(例如醱酵基質或醱酵固體)具有至少40%、至少50%、或至少60%之效價，其中該效價係依下述方法測定。將醱酵產物在水表面活性劑溶液中稀釋(使用表面活性劑產品標籤上建議之表面活性劑的量)以取得5%之全基質(或者，若處理衍生自全基質之醱酵固體時，則為如下述之全基質同等物)。將該稀釋之溶液施用在葉子(諸如利馬豆之葉子)頂部和底部表面直到兩個表面均濕潤，但不要施用至流掉。讓植物乾燥，然後以10-20隻二斑蛛蟎(Tetranychus urticae Koch)侵染之。處理後四天，檢查處理過之葉子並計算葉子上之存活及死亡的成年雌蹣和二期若蟲。使用Sun-Shepard公式計算效價(即，經校正之死亡率)。校正%=100(經處理之小塊地區中減少之%±未經處理之族群中的變化%)/(100±未經處理之族群中的變化%)。在此施用中，藉由上述方法計算之效價將稱為“蛛蟎效價”。

於一些實施例中係使用本發明之組成物處理各種各樣之農業和/或園藝作物，包括那些長成以供結籽、生產、園林綠化者，以及那些長成以供生產種子者。可使用本發明之組成物處理的代表性植物，包括，但不限於下列者：芸苔屬蔬菜、鱗莖類蔬菜、穀物、柑橘、棉花、葫蘆科植物、果菜類、葉菜類、豆類、油籽作物、花生、梨果、根類蔬菜、塊莖類蔬菜、球莖類蔬菜、核果、煙草、草莓和其他漿果，及各種觀賞植物。

本發明之組成物可以葉面噴霧、土壤處理劑、和/或種子處理劑/敷料之形式投予。於一實施例中，當作為葉面處理劑時係每英畝施用約1/16至約5加侖之全基質。於一實施例中，當作為土壤處理劑時係每英畝施用約1至約15加侖，或約1至約5加侖之全基質，或根據欲處理之種子大小和該醱酵產物(諸如凍乾產物)中之菌落形成單位的濃度為約0.1毫克至約14毫克、或約0.2毫克至約10毫克、或約0.2毫克至約8毫克。當作為種子劑時係每英畝施用約1/32至約1/4加侖之全基質。為了處理種子，該最終調和物每克含有至少1×10⁸個菌落形成單位。

於一些實施例中，將本發明之組成物施用在植物、植物部分或植物位點之前先鑑定需要處理的位點。

將微生物(例如細黃鏈黴菌NRRL B-50550或其植食性殺蟎突變株)之醱酵產物，諸如全基質培養或醱酵固體(包括凍乾粉末)/毫升稀釋施用於植物葉面。施用率係以每英畝之加侖數或磅數來提供，且可按比例調整為較小量之施用(諸如實例中所描述之微小區試驗)。如實例中所描述者，在較大量之施用方面，該醱酵產物係在施用前在100加侖的水中先稀釋。於一實施例中係將每英畝約0.5加侖至約15加侖、約1加侖至約12加侖、或約1.25加侖至約10加侖之全基質培養物(在水中稀釋及，可選擇地，表面活性劑)施用在植物葉面。於另一實施例中係將凍乾粉末(在水中稀釋及，可選擇地，表面活性劑)以每英畝約0.2磅至約8磅、約0.4磅至約7磅、或約0.4磅至約6磅之比率施用於植物葉面。於一特定之情況中，該醱酵產物具有至少約40%、至少約50%、或至少約60%之“蛛蟎效價”。於另一情況中，該醱酵產物為具有約0.5%至約15%之谷氏菌素、約1%至約12%之谷氏菌素、或約2%至約10%之谷氏菌素的醱酵粉末(包括噴霧乾燥或冷凍乾燥之粉末)，其中所有百分比為重量比。於另一另一情況中，該醱酵產物為具有約0.01%至約0.5%(重量/重量)之谷氏菌素的醱酵基質。

於特殊之實施例中係將每英畝1.25磅之醱酵產物，諸如凍乾粉末或噴霧乾燥粉末(在水中稀釋及，可選擇地，表面活性劑)施用在植物葉面。於這些實施例中，該最終用途之調和物係以每毫升含有至少約1×10⁶之菌落形成單位、每毫升含有至少約1×10⁷之菌落形成單位、每毫升含有至少約1×10⁸之菌落形成單位、每毫升含有至少約1×10⁹之菌落形成單位、或每毫升含有至少約1×10¹⁰之菌落形成單位的起始醱酵基質為底質。於另一實例中，該醱酵產物含有至少約1重量%之谷氏菌素、至少約2重量%之谷氏菌素、至少約3重量%之谷氏菌素、至少約4重量%之谷氏菌素、至少約5重量%之谷氏菌素、至少約6重量%之谷氏菌素、至少約7重量%之谷氏菌素、或至少約8重量%之谷氏菌素。

谷氏菌素基因簇、ORFs及由此編碼之蛋白質

本揭露內容提供位於基因位點內之谷氏菌素基因簇的核酸序列、其中所含之ORFs及由其編碼之蛋白質。此信息使，例如分離出，諸如在其他鏈黴菌屬中之編碼谷氏菌素基因簇之同系物的相關核酸分子及對應之ORFs成為可行。本揭露內容進一步使製造由谷氏菌素基因簇或其部分編碼之蛋白質(包括，但不限於GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM和/或GouN)的變異體，及編碼這些變異體的核酸分子成為可行。

包含在從細黃鏈黴菌株鑑定出的SEQ ID NO：43內之谷氏菌素基因簇(核苷酸殘基1-21933)包括 24個ORFs，稱為ORFs 4248至4271。ORFs 4251、4252、4253、4255、4256、4257、4258、4259、4261、4262、4263、4264、4265和4271分別為13個基因gouA、gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM及gouN。需注意的是SEQ ID NOs：89-100(從紫紅鏈黴菌株鑑定出)分別提供直系同源基因gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM。這些基因在谷氏菌素合成反應中之潛在功能及其可能的角色提供於表2中。

藉由本文所提供之所揭露的基因位點之序列(SEQ ID NO：43)及其中所含之ORF，可採用體外核酸擴增(包括，但不限於PCR)作為用於製造編碼一或多種上述表1中所列之谷氏菌素生物合成蛋白質的核酸序列之簡單方法。下文中提供用於以此方式製備編碼蛋白質之核酸分子的代表性技術。

藉由本技藝之一般技術人士所熟知之各種方法中的任一著從細胞中萃取RNA或DNA。Sambrook，等人(在Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989中)及Ausubel，等人(在Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences,1992中)提供用於分離RNA或DNA之方法的代表性描述。谷氏菌素生物合成酶係表現在(至少在)細黃鏈黴菌中。因此，於一些實例中，可從細黃鏈黴菌細胞萃取RNA或DNA。萃取出之RNA可用於，例如作為用於進行逆轉錄(RT)-PCR擴增之模板以製造cDNA。用於RT-PCR之代表性方法和條件描述於Kawasaki，等人(在PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Innis et al.(eds.)21-27 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1990中)。

擴增引物可根據欲擴增之DNA部分選擇。於一實施例中，引物可經過選擇以擴增DNA片段(例如特定ORF或一組相鄰的ORFs)，或者，於另一實施例中，整個DNA分子。為了適應具不同長度之引物和擴增子以及組成物，可能需要改變擴增條件。這類考量為本技藝所熟知且討論於，例如在Innis，等人(PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1990))中。舉例而言，編碼經過選擇之谷氏菌素生物合成蛋白質的核酸分子(諸如gouA至gouN的其中任一，或其組合)可使用針對原型細黃鏈黴菌gouA、gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM和/或gouN序列之5’-及3’-端的擴增引物。可理解的是，從所提供之核酸序列可衍生出許多不同之引物。建議將藉由任何擴增程序擴增之產物重新定序，以加速確認該經擴增之序列，並提供谷氏菌素與經擴增之序列之間的自然變異的信息。從任一谷氏菌素序列衍生之寡核苷酸可用於決定，例如該對應之谷氏菌素(或谷氏菌素相關的)擴增子的序列。

此外，可採用習知之雜交和PCR擴增程序二者來選殖編碼該谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORFs(例如一或多種之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27，29、31、33、35、37、39及41)之直系同源物。此兩種技術之共通點為衍生自具有或不具有上游和下游側翼區的谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORF核酸序列之探針或引物的雜交作用。此外，雜交可能會發生在北方印跡、南方印跡或PCR之背景下。

直接PCR擴增可在從所討論之細菌菌種製備的DNA集合庫上進行，或者可採用標準方法，使用從細菌細胞萃取之RNA進行RT-PCR。PCR引物將包含至少10個帶有或不帶有上游和下游側翼區之谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORF核酸序列的連續核苷酸。熟習本技藝之人士將會理解介於谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORF核酸序列與欲擴增之靶的核酸序列之間的序列差異可能會導致擴增效率較低。為了彌補此點，可在擴增循環期間使用較長之PCR引物或較低的黏合溫度(annealing temperature)。每當使用較低之黏合溫度時，使用巢式引物對之擴增順序循環對增進擴增特異性可能有用。

所揭露之谷氏菌素生物合成蛋白質之直系同源基因可能存在於一些其他鏈黴菌屬的成員中、細黃鏈黴菌種的其他菌株中，及其他產製谷氏菌素之生物體中。藉由提供該揭露之谷氏菌素基因簇和其ORFs 4251-4253、4255-4259、4261-4265和4271，以及鄰接和插入之ORFs 4248-4250和4266-4270的核酸序列，藉由標準方法將編碼蛋白質之DNA(諸如ORFs)和編碼谷氏菌素生物合成酶直系同源物的基因簇選殖在這些其他生物體中已成為可行。該揭露之谷氏菌素生物合成酶和蛋白質的直系同源物具有如本文所揭露之生物活性或功能，包括，例如胞嘧啶合成酶(ORF 4258；gouG；SEQ ID NO：15和16)或CGA合成酶(ORF 4261；gouI；SEQ ID NO：21和22)。

直系同源物通常與編碼所揭露之谷氏菌素生物合成蛋白質之核酸序列(例如一或多種之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41)共享至少65%的序列同一性。於特定之實施例中，當適用時，直系同源之谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORFs可能與該揭露之細黃鏈黴菌或紫紅鏈黴菌核苷酸或胺基酸序列共享至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%，至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之序列同一性。

在習知之雜交技術方面，較佳地，將雜交探針與可檢測之標記(諸如放射性標記)結合，且該探針之長度較佳為至少10個核苷酸。如本技藝中眾所周知的，增加雜交探針之長度傾向增進特異性。使用本技藝中已知之方法可將自谷氏菌素基因簇或自谷氏菌素ORF核酸序列衍生之經標示的探針與細菌DNA集合庫雜交，並偵測雜交信號。該雜交之株落或噬斑(取決於所使用之集合庫的類型)可經過純化，而包含在該菌落或噬斑中之選殖的序列可被分離出及決定其特徵。

於特定之實例中可使用各種市售(例如Stratagene、Epicentre)之柯斯質粒(cosmid)或福斯質粒(fosmid)系統迅速構建基因組集合庫。有利的是，這些系統將該經選殖之DNA的不穩定性降至最低。在這類實例中，篩選基因組集合庫後，再接著分離出柯斯質粒或福斯質粒，將其分組成具有重疊之選殖株的族群，並分析之以建立群簇特性。柯斯質粒末端定序可用於依據從天然產物結構及其經推測之生物合成來源預測之預期的通路特徵取得關於特殊選殖株之相關性的初步信息。

或者，可藉由免疫篩選表現集合庫來取得谷氏菌素基因簇(+/-上游或下游側翼區)或谷氏菌素ORF核酸序列之直系同源物。藉由本文中提供之揭露的基因位點(SEQ ID NO：43)，可在異源表現系統(例如大腸桿菌)中表現並純化對應之蛋白質，並使用其產生特異於谷氏菌素生物合成酶或蛋白質(諸如GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM和/或GouN)之抗體(單株或多株抗體)。亦可能產生針對從本文呈現之谷氏菌素胺基酸序列(SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、和42、和/或SEQ ID NO：77-88)所衍生的合成肽之抗體。產生抗體之方法為本技藝所周知，且大致描述於Harlow and Lane,Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor,1988中。這類抗體可用於篩檢從細菌製造之表現集合庫。例如，此篩檢將可鑑定谷氏菌素直系同源物。所選定之DNA可藉由定序和酶活性分析確認。

衍生自谷氏菌素基因簇(SEQ ID NO：43)或編碼該基因簇之ORFs的核酸序列(SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、和41)、或這些核酸序列之片段的寡核苷酸亦包含在本揭露內容之範圍內。這類寡核苷酸可作為，例如探針或引物。於一實施例中，寡核苷酸可包含具有至少10個谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游側翼區)或谷氏菌素ORF核酸序列之連續核苷酸的序列。若將這些寡核苷酸與體外擴增程序(諸如PCR)一起使用可在延長寡核苷酸時增進擴增特異性。因此，於其他實施例中可使用包含至少15、20、25、30、35、40、45、50、或更多個這些序列的連續寡核苷酸之寡核苷酸引物。於其他實例中，包含30個編碼谷氏菌素生物合成酶之核酸分子(諸如，例如SEQ ID NO：15或21)的連續核苷酸之引物將以高於僅具有15個核苷酸之對應引物的特異性黏合至靶的序列，諸如谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游側翼區)或存在於來自另一鏈黴菌種(或其他產製谷氏菌素之物種)之DNA集合庫中的谷氏菌素同源物。為了取得較高之特異性，可選擇包含至少17、20、23、25、30、35、40、45、50或更多個谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游側翼區)或谷氏菌素ORF 核苷酸序列之探針和引物。於特殊之實例中，探針或引物可具有至少100、250、500、600或1000個所揭露之谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游側翼區)或谷氏菌素ORF序列的連續核苷酸。

寡核苷酸(諸如引物或探針)可從所揭露之谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游側翼區)或谷氏菌素ORF核酸序列的任何區取得。舉例而言，谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游側翼區)或谷氏菌素ORF序列可根據序列長度被分配成約二等分、三等分、或四等分，且該分離出之核酸分子(例如寡核苷酸)可衍生自該分子之第一或第二半、該三個三等分之任一者、或該四個四等分之任一者。所欲之核酸序列亦可被分到為具類似效果之較小區域，例如約八等分、十六等分、二十等分、五十等分，等。或者，其可被分割成編碼保存結構域之數個區域。

藉由本文提供之谷氏菌素生物合成蛋白質及對應之核酸序列可使創建這些序列之變異體成為可行。變異型谷氏菌素生物合成酶包括其胺基酸序列與所揭露之原型酶不同，但仍然保留如表1中所列之原型蛋白的生物活性/功能之蛋白質。變異型酶亦可能被剝奪其製造谷氏菌素之生物合成先質或新穎類似物的活性/功能。

於一實施例中，變異型谷氏菌素生物合成蛋白質包括其胺基酸序列與所揭露之谷氏菌素生物合成蛋白質序列(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、及42、和/或SEQ ID NO：77-88)不同，但與這類酶序列共享至少65%胺基酸序列同一性之蛋白質。於其它實施例中，其他變異體將共享至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之胺基酸序列同一性。使用標準程序(例如定點誘變或PCR)操縱所揭露之谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游側翼區)及谷氏菌素ORF核苷酸序列可以用來製造這類變異體。最簡單之修改涉及以一或多個胺基酸取代具有類似之生化性質的胺基酸。這些所謂的保存取代對所產生之蛋白質的活性可能具有最小的影響。

谷氏菌素之生物合成製造方法

用於創建谷氏菌素之生物合成方法由於能有效製造谷氏菌素且可同樣用於製造谷氏菌素及其類似物因而很有用。因此，在異源宿主，諸如大腸桿菌或其它鏈黴菌屬中選殖和表現谷氏菌素生物合成基因簇或由此而來之ORF可用來增加谷氏菌素、谷氏菌素先質、谷氏菌素中間體、或包含在該基因簇中之酶或蛋白質的產製。此外，基因重組和結構域交換之構造物可允許創建使用習知合成方法將很難製造的谷氏菌素結構。

於一實施例中，重組表現系統係選自原核宿主。細菌細胞可從許多來源取得，包括熟習本技藝之人士已知的公共來源，諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC；維吉尼亞州Manassas)。用於重組蛋白表現之細胞的商業來源亦提供這類細胞用途之說明。

一種用於在鏈黴菌屬中表現谷氏菌素基因簇之代表性異源宿主系統。於特定之實例中，鏈黴菌屬已被用來作為表現非常大尺寸之天然產物生物合成基因簇的人工宿主(見，例如Stutzman-Engwall and Hutchinson Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3135-3139,1989；Motamedi and Hutchinson Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4445-4449,1987；Grim et al.Gene 151：1-10 1994；Kao et al.Science 265：509-512,1994：及Hopwood et al.Meth.Enzymol.153：116-166,1987)。鏈黴菌屬為有用之異源宿主系統，因為其容易生長，用於表現和/或整合生物合成基因簇之質粒和柯斯質粒己被完善表徵且其庇有許多產生功能性途徑所需之修飾酶和輔酶(Donadio et al.J.Biotechnol.99：187-198,2002)。具有分段菌絲體之宿主細胞可能表現出保持低黏度之優點；宿主細胞之其他有利特點(除了表現大量谷氏菌素之能力外)包括快速生長及在簡單基質上生長。

另一用於表現谷氏菌素基因簇(或一或多個其ORFs)之代表性異源宿主系統為大腸桿菌。大腸桿菌為具有吸引力之人工表現系統，因為其生長快速且易於以遺傳工程方式操縱。以大腸桿菌為基礎之表現系統的最新進展對在單一宿主生物體中同時表現多個基因具有很大的助力。來自複雜之生物合成系統的多個ORFs現在可以同時在大腸桿菌中表現。

然而，表現系統之選擇將取決於表現之多肽所需的特性。用任何可轉導之選殖載體均可作為目前揭露之核酸構造物的選殖載體。若欲表現大的基因簇，較佳地，使用噬菌粒、柯斯質粒、福斯質粒、P1s、YACs、BACs、PACs、HACs、或類似之選殖載體來將核苷酸序列選殖入宿主細胞中。與M13噬菌體及λ噬菌體分別比較，這些載體之利處係由於能夠插入較大之DNA片段並穩定地增殖。

於一實施例中可使用那些熟習本技藝之人士已知的方法將一或多種揭露之ORFs和/或其變異體插入一或多個表現載體中。使用載體將谷氏菌素生物合成基因或谷氏菌素基因簇引入宿主細胞中。原核宿主細胞或其它具有堅固細胞壁之宿主細胞可使用本技藝中已知之任何方法轉形，包括，例如磷酸鈣沉澱法或電穿孔。代表性原核轉形技術描述於，例如Dower(Genetic Engineering,Principles and Methods 12：275-296,Plenum Publishing Corp.,1990)及Hanahan，等人(Meth.Enzymol.204：63,1991)中。載體包括一或多個可操作地連接至所需之ORF的控制序列。然而，表現匣之選擇可能取決於所選擇之宿主系統及表現多肽或天然產物所需的特性。通常，該表現匣包括在選定之宿主系統中具有功能之啟動子且可為構造性或可誘導的。於一實施例中，除了所需之DNA分子和終止密碼子外，該表現匣包括啟動子、核糖體結合位置、起始密碼子 (若需要時)，及可選擇地，編碼前導肽之區域。另外，3’端區(轉譯和/或轉錄終止子)可被包含在該表現匣內。構造在DNA分子中之ORF可能僅受啟動子控制，從而使轉錄和翻譯發生在宿主細胞中。熟習本技藝之人士熟知且可取得啟動子編碼區。啟動子之實例可包括細菌啟動子(諸如那些衍生自糖代謝酶者，諸如半乳糖、乳糖、麥芽糖)、衍生自生物合成酶之啟動子序列，諸如色胺酸、β-內醯胺酶啟動子系統、噬菌體λ PL，及TF和病毒啟動子。

表現匣內存在額外之調控序列可能有利於調控一或多個與宿主細胞生長相關之ORFs的表現。這些調控序列為本技藝所熟知。調控序列之實例包括回應化學或物理刺激，以及增強子序列而開啟或關閉基因表現的序列。除了調控序列外，可包含可選擇之標記以協助選擇轉形之細胞。例如，賦予質粒抗生素抗性或敏感性之基因可用來作為可選擇的標記。

可設想的是，可將谷氏菌素基因簇或一或多個所欲之谷氏菌素ORF以個別匣之形式，藉由不同之控制元件，或受單一控制元件(例如啟動子)之控制選殖入一或多個重組載體中。於一實施例中，該ORFs包括二或多個限制性酶切位點以允許容易地删除和插入其他開放閱讀框，從而可產生雜交合成途徑。這類限制性酶切位點之設計和用途為熟習本技藝之人士所熟知，且可經由使用上述技術，諸如PCR或定點誘變進行。由轉形細胞表現之蛋白質可根據熟習本技藝之人士所熟知之標準方法回收。例如，可加上習知之標籤來表現蛋白質以促進分離。此外，可使用結合多肽之配體，藉由親和性色層析法來純化所產生之多肽。

進一步考慮的為藉由前述之產製谷氏菌素的醱酵條件來製造各種谷氏菌素ORFs、基因簇、或所欲之谷氏菌素蛋白質。製造後，可藉由熟習本技藝之人士所熟知之方法(例如高壓液相色層分析法(HPLC))純化和/或分析該化合物。

本發明亦包含經由以下步驟用於識別和/或製造殺蟎和/或殺真菌之細菌產物的方法：(i)篩選鏈黴菌種之菌株，(ii)選擇具有編碼胺基酸序列之與SEQ ID NO：43具有至少約65%、至少約66%、至少約67%、至少約68%、至少約69%、至少約70%之序列同一性、至少約80%之序列同一性、至少約90%之序列同一性、至少約95%之序列同一性、至少約96%之序列同一性、至少約97%之序列同一性、至少約98%之序列同一性、或至少約99%之序列同一性的核苷酸序列之菌株，及(iii)從所選擇之菌株製造殺蟎醱酵產物。於一些其它實施例中，該選擇步驟涉及選擇那些具有編碼與至少一種選自以下群組之胺基酸序列具有至少70%之序列同一性的胺基酸序列之核苷酸序列的菌株：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：42。於一些實施例中係篩選下列鏈黴菌種之菌株：細黃鏈黴菌、灰色鏈黴菌、環圈鏈黴菌、糞生鏈黴菌、小鏈黴菌、淡紫灰鏈黴菌、白綠鏈黴菌、紫紅鏈黴菌或禾粟鏈黴菌。於一些實施例中，篩選之鏈黴菌種為親代鏈黴菌株之突變體。於一觀點中，這類突變體係以本申請案中描述的方式，或藉由本技藝中已知之其它方法，包括實例16中所描述之方法產生。於一些實施例中，篩選步驟前先進行產生親代鏈黴菌株之突變體的步驟。本文中描述用於產生突變體之方法。於一些實施例中，該篩選步驟亦涉及製備菌株之醱酵基質及選擇亦具有至少約60%之蛛蟎效價的菌株。這類選擇步驟可在依據序列同一性之百分比的選擇步驟之前或之後發生。本文中列舉用於製造醱酵產物及用於測試殺蟎活性之方法。於一實施例中，該製造步驟(步驟(iii))之醱酵產物具有濃度為至少約1克/升、至少約2克/升、至少約3克/升、至少約4克/升、至少約5克/升、至少約6克/升、至少約7克/升、至少約8克/升、至少約9克/升、或至少約10克/升之谷氏菌素。用於測量谷氏菌素濃度之方法為熟習本技藝之人士所已知。

保藏信息

本發明之細黃鏈黴菌株樣本已根據布達佩斯條約的規定在2011年8月19日保藏在位於61604美國伊利諾州皮奧里亞市北大學街1815號，美國農業部農業研究服務，全國農業利用研究中心之農業研究服務培養物保藏中心，且已指派以下保藏編號：NRRL B-50550。

細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之突變體(本文命名為細黃鏈黴菌株M，亦稱為AQ6121.002)的樣本已根據布達佩斯條約的規定在2013年9月27日保藏在位於61604美國伊利諾州皮奧里亞市北大學街1815號，美國農業部農業研究服務，全國農業利用研究中心之農業研究服務培養物保藏中心。此菌株亦根據布達佩斯條約的規定在2013年10月8日保藏在位於20110美國維吉尼亞州馬納薩斯大學大道10801號，美國典型培養物保藏中心。此菌株亦在2013年10月9日保藏在位於R3E 3R2加拿大曼尼托巴省溫尼伯阿靈頓街1015號之加拿大國際保藏管理局且已被指派編號091013-02。

本文中稱為紫紅鏈黴菌株A(亦稱為AQ7439)之紫紅鏈黴菌株樣本已根據布達佩斯條約的規定在2013年10月8日保藏在位於20110美國維吉尼亞州馬納薩斯大學大道10801號，美國典型培養物保藏中心。此菌株亦在2013年10月9日保藏在位於R3E 3R2加拿大曼尼托巴省溫尼伯阿靈頓街1015號之加拿大國際保藏管理局且已被指派編號091013-01。

第1圖顯示當將稀釋後之菌株的醱酵產物噴灑在被二斑蛛蟎(two spotted spider mites)侵染之利馬豆植物葉子上時，以細菌候選菌株進行之UV穩定性試驗結果。淺灰色之柱條(各菌株之較低柱條)代表無UV光照射時之抗殺蟎活性，深灰色之柱條(每一菌株之較高柱條)代表以UV光照射24小時後之抗殺蟎活性。第五天，按1至4之級別評估存在於植物上的蟎蟲和卵。

第2圖顯示當將稀釋後之菌株的醱酵產物噴灑在被二斑蛛蟎侵染之利馬豆植物葉子上時，以測試之細菌候選菌株進行的透層活性試驗之結果。淺灰色之柱條(各菌株之較低柱條)代表透層(抗殺蟎)活性，深灰色之柱條(各菌株之較高柱條)代表總體抗殺蟎活性。第六天，按1至4之級別評估存在於植物上的蟎蟲和卵。

第3圖顯示相對於親代菌株，生長在1升搖瓶中之細黃鏈黴菌株NRRL B-50550突變體所增加之谷氏菌素產製。

第4圖顯示相對於親代菌株，生長在5升生物反應器中之細黃鏈黴菌株NRRL B-50550突變體所增加之谷氏菌素產製。

第5圖顯示谷氏菌素之化學結構，及其絲胺酸、糖、胞嘧啶和肌胺酸次結構域。

第6圖顯示谷氏菌素之可能的生物合成途徑。

第7圖顯示谷氏菌素之化學結構，標註出可能涉及和/或負責谷氏菌素之特殊次結構域結構的開放閱讀框(ORF)編號。

第8圖顯示谷氏菌素生物合成基因簇之組織。

第9圖顯示經由瓊脂糖凝膠電泳解析之經命名的引物對之PCR產物(見引物對名稱之序列表)。MW=1kDa分子量階梯。C=16S陽性對照組。gouC1係來自SEQ ID NO：44和45之引物。gouC2係來自SEQ ID NO：46和47之引物。gouD係來自SEQ ID NO：48和49之引物。gouG1係來自SEQ ID NO：50和51之引物。gouG2係來自SEQ ID NO：52和53之引物。gouI1係來自54和55之引物。gouF2係來自SEQ ID NO：56和57之引物。

第10圖顯示pUC118載體之示意圖。

第11圖顯示pKC1139轉運載體(shuttle vector)之示意圖。

第12圖顯示來自使用不同引物對之PCR的PCR產物，經由瓊脂糖凝膠電泳解析之結果。I=gouI引物；G=gouG引物；Ia=具有安普黴素(Apramycin)抗性之單次交換；IKI(具GouIup及gouldown)，CKW(具gouCup及gouwholeclusterdown)，及CKI(具gouCup及gouIdown)均為卡那黴素抗性雙重交換。

下列實例僅用於說明，而非用於限制本發明。

實例1-選擇細黃鏈黴菌NRRL B-50550

菌株係取自內部菌株收集處，並進行初步篩選試驗以測定潛在候選菌株對抗二斑蛛蟎(“TSSM”)(此為常用來篩選一般殺蟎活性之典型生物體)的效力。先選擇具有有利於實驗室或人工培養的性質之微生物，諸如在瓊脂盤上生長迅速之變異體。將選定之菌株的培養貯存物生長在適合各別菌株之培養基中，諸如實例2中描述之培養基1和培養基2。使用水和0.03%之表面活性劑BREAK-THRU FIRST CHOICE^®聚醚-聚甲基矽氧烷共聚物將由此產生之醱酵產物(全基質)稀釋成25%溶液。然後，將8毫升稀釋後之醱酵產物施用於兩株植物之利馬豆葉(該利馬豆植物為1至1.5週齡)的頂部和底部直至滴落。經過這類處理後，在同一天，以50-100隻TSSM侵染植物並留置在溫室中五天。在第五天以1至4之級別評估存在於植物上之蟎蟲和卵。使用殺蟎劑AVID^®(阿維菌素，Syngenta)作為陽性對照組。在蟎和卵方面，1表示100%死亡率，1.5表示90%至95%死亡率，2.0代表75%至90%死亡率；2.5代表40%至55%死亡率；3.0代表20%至35%死亡率且4.0代表0%至10%死亡率。除了NRRL B-50550之外，其他鏈黴菌株及一些芽孢桿菌株被發現具有對抗蟎類之活性。

為了進一步選擇，在其他活性中，檢查篩選出之菌株的UV穩定性和透層活性，因為殺蹣劑應該對UV光穩定且擁有透層活性，以有效施用於田野。

為了評估UV穩定性，將上述之醱酵產物的25%稀釋液噴灑在利馬豆植物之上表面上。經過這類處理後，在同一天，以50-100隻TSSM侵染植物並暴露在紫外線下24小時，再留置在溫室中五天。藉由施放在葉片之凡士林環將蟎蟲限制在葉子之近軸(上方)表面並作為不讓蟎逾越之界限。依上述，在第五天以1至4之級別評估存在於植物上之蟎蟲和卵。使用殺蟎劑AVID^®(阿維菌素，Syngenta)及OBERON^®(螺甲蟎酯(spiromesifen)，Bayer CropScience AG)作為對照組。結果顯示於第1圖中。菌株NRRL B-50550之醱酵產物顯示出所有測試菌株中最佳之紫外線穩定性。

為了評估透層活性，依上述培養菌株，並使用水和0.35%表面活性劑將所得之全基質稀釋且施用於兩株植物之利馬豆葉的下表面直至滴落。處理後一天，將50-100隻TSSM放置在葉子的上表面上並依上述使用凡士林環/物理屏障將其包含在內，以侵染處理過之葉子的上表面。在第六天依上述之1至4之級別評估存在於植物上之蟎蟲和卵。使用殺蟎劑AVID^®(阿維菌素，Syngenta)及OBERON^®(螺甲蟎酯，Bayer CropScience AG)作為對照組。結果顯示於第2圖中。菌株NRRL B-50550之醱酵產物顯示出所有測試菌株中最佳之透層活性。

實例2-抗蛛蟎活性

進行進一步測試以更嚴密地測定細黃鏈黴菌株NRRL B-50550對抗二斑蛛蟎(“TSSM”)之效力。將細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之培養貯存液生長在28℃，1 升搖瓶中之培養基1和培養基2中5天。培養基1係由2.0%澱粉、1.0%右旋糖、0.5%酵母萃取物、0.5%酪蛋白水解產物及0.1%碳酸鈣所組成。培養基2係由2%ProFlo棉籽餅、2%麥芽萃取物、0.6%磷酸二氫鉀及0.48%磷酸氫二鉀所組成。使用水和0.03%表面活性劑BREAK-THRU FIRST CHOICE^®(聚醚-聚甲基矽氧烷共聚物)將由此產生之醱酵產物稀釋成25%溶液，取6毫升施用於兩株植物之利馬豆葉的頂部和底部直至滴落。經過這類處理後，在同一天，以50-100隻TSSM侵染植物並留置在溫室中五天。在第六天，以1至4之級別評估存在於植物上之蟎蟲和卵。使用殺蟎劑AVID^®(阿維菌素，Syngenta)作為陽性對照組。在蟎蟲和卵方面，1表示100%死亡率，1.5表示90%至95%死亡率，2.0代表75%至90%死亡率；2.5代表40%至55%死亡率；3.0代表20%至35%死亡率且4.0代表0%至10%死亡率。結果顯示於下列表3中。細黃鏈黴菌NRRL B-50550之兩種醱酵產物造成蟎蟲90%或更高之死亡率。

針對杏仁中之太平洋蛛蟎、葡萄中之太平洋蛛蟎及草莓中之二斑蛛蟎進行的田野試驗確認了上述之溫室結果。針對杏仁中之太平洋蛛蟎的田野試驗結果報告於下列表4-6中。使用殺蟎劑AGRI-MEK^®(阿維菌素，Syngenta)作為陽性對照組。在含有培養基1之搖瓶中接種NRRL B-50550之冷凍培養並在28-30℃下生長1-2天。使用所產生之醱酵產物接種含有以下培養基之20升生物反應器：6.0%澱粉、3.0%右旋糖、1.5%酵母萃取物和1.5%酪蛋白水解產物，及0.3%碳酸鈣。將此培養基在28℃之間醱酵7天。將所產生之全基質與佐劑，0.03%之BREAK-THRU FIRST CHOICE^®(聚醚-聚甲基矽氧烷共聚物)混合後建立凍乾粉末(“FDP”)，然後用於試驗中。

實例3-對抗柑橘蟎蟲之田野活性

進行田野試驗以測定NRRL B-50550對抗巴倫西亞橙上之柑桔銹蟎(柑橘銹癭蟎(Phyllocoptruta oleivora))的效力。在含有培養基1(見實例2)之搖瓶中接種NRRL B-50550之冷凍培養並在20-30℃下生長1-2天。重複此過程。使用所產生之醱酵產物接種含有以下培養基之20升生物反應器中：6.0%澱粉、3.0%右旋糖、1.5%酵母萃取物、2.0%大豆水解產物、0.6%甘胺酸，及0.2%碳酸鈣。將此培養基在28℃之間醱酵8天。使用所產生之全基質創建凍乾粉末(“FDP”)，然後用於下列試驗中。將凍乾粉末在水中稀釋，並依下表7中所顯示之比率，以100加侖/英畝施用。使用殺蟎劑ENVIDOR^®(螺甲蟎酯，Bayer CropScience，德國)作為陽性對照。在處理1-3中，以0.66%體積/體積之比率添加BREAK-THRU FIRST CHOICE^®佐劑(聚醚-聚甲基矽氧烷共聚物，見上文)。以0.625磅/英畝之比率施用的醱酵產物顯示出較以16液盎司/英畝之比率施用的ENVIDOR^®螺甲蟎酯更佳之殺蟎活性。

實例4-對抗其他蟎蟲之活性

研究顯示出NRRL B-50550具有對抗各種其他蟎蟲，包括癭蟎(eriophyid)(赤褐色)及廣明蟎之活性。依實例2中所描述之用於田野試驗的方法製備醱酵基質。使用水和0.35%表面活性劑將所產生之醱酵基質稀釋成各種濃度，再將10毫升之稀釋基質施用於兩株植物之利馬豆葉的頂部和底部直至滴落。在處理的同一天以赤褐色蟎侵染植物，並在處理後六天依上述之級別評估赤褐色蟎之存在情形。積分為4表示沒有控制且在評估時存在至少100 隻赤褐色蟎。使用殺蟎劑AVID^®(阿維菌素)作為陽性對照組。

實例5-殘留活性

其他研究透露出NRRL B-50550具有殘留活性。在含有實例2之培養基1的搖瓶中接種以Luria基質為底質之NRRL B-50550培養物(其已接種NRRL B-50550之冷凍培養)並在28℃下生長1-2天。使用所產生之醱酵產物接種含有以下培養基之20升的生物反應器中：8.0%右旋糖、1.5%酵母萃取物、1.5%酪蛋白水解產物及0.1%碳酸鈣。將培養基在28℃之間醱酵7-8天。使用水和0.35%表面活性劑將所產生之醱酵產物稀釋成3.13%溶液，再將8毫升稀釋後之基質施用於兩株植物之利馬豆葉的頂部和底部直至滴落。在這類處理後六天，以50-100隻TSSM侵染植物，並在處理後12天依上述之級別評估存在之蟎蟲和卵。使用殺蟎劑AVID^®(阿維菌素)作為陽性對照組。結果顯示於下表9中。

除了對初次接觸經過處理之植物的蟎蟲之作用外，亦評估對那些可能在稍後之時間點遷移至處理過之葉子上的蟎蟲之效果。在第0天，以依類似於實例13中描述之方式製造的6.25%或1.56%全基質處理全部植物。然後，在處理後一週之時間間隔下將蟎蟲加入植物群體中。此處理組包括用於比較之其他殺蟎劑。處理後，每週添加一次蟎蟲，共5週。活性在該5週之期間內持續維持著且活性降低之速率類似OBERON^®(螺甲蟎酯)產品，並略快於AVID^®產品。此研究亦顯示出當處理利馬豆植物之初生葉時，稍後冒出之葉子不受保護。

實例6-透層活性

進行研究以測定NRRL B-50550是否具有透層活性。依實例5中之描述製備全基質。使用水和0.35%表面活性劑將所得之全基質稀釋且將10毫升之稀釋基質施用於兩株植物之利馬豆葉的下表面直至滴落。處理後一天，將50-100隻TSSM放置在葉子的上表面上並使用放置在該葉片之上表面的凡士林環/物理屏障將其包含在內以侵染該經過處理之葉子的上表面。處理後五天依上述之級別評估存在於植物上之蟎蟲和卵。結果顯示於下列表 10中。

實例7-殺卵活性

依下述測試NRRL B-50550之殺卵活性。依實例5中之描述製備全基質。在處理前48小時，允許成年雌蟎在葉片表面上產卵，以TSSM卵預侵染兩株利馬豆植物。然後，以8毫升全基質之各種稀釋液處理植物。處理後5天評估植物。存在於各處理組和對照組中之存活和死亡的卵之數目顯示於下列表11中。

實例8-浸液活性

使用生長在泥沙中之利馬豆研究NRRL B-50550之浸液活性。依實例3中之描述製備全基質。將每次10毫升之12.5%全基質稀釋液施用在泥沙二次。小心為植物澆水，以防止全基質從盆底濾出。全基質係在種植後四天和種植後五天施用。在第2次處理後三天以能動的TSSM侵染較下方之葉片。下方之葉片被侵染後9天，侵染上方之葉片。在侵染後4、5、8及11天評估下方之葉片。在侵染後2天評估上方之葉片。依據實例2中描述之評分系統所得之結果顯示於下列表12中。

實例9-對抗真菌性植物病原的活性

測試NRRL B-50550對抗各種植物真菌性病原之活性。其被發現對小麥葉銹病和黃瓜白粉病均具有活性。在含有培養基1之搖瓶中接種NRRL B-50550之冷凍培養物並在20-30℃下生長1-2天。將所得之醱酵產物接種在含有類似之培養基的20升生物反應器中，並在28℃下生長1-2天。接著，使用所得之醱酵產物接種含有以下培養基之200升醱酵器：7.0%澱粉、3.0%右旋糖、1.5%酵母萃取物、2.0%大豆酸水解產物、0.8%甘胺酸及0.2%碳酸鈣。將此培養基在26℃之間醱酵8天。以顯示於下列表13中之在具有0.03%佐劑(BREAK-THRU FIRST CHOICE^®聚醚-聚甲基矽氧烷共聚物)的蒸餾水中製備的各種NRRL-50550全基質稀釋液處理六天大之麥苗，這是以全基質覆蓋葉子的上、下表面並使其乾燥。在這類處理後一天將小麥葉銹病的懸浮液接種在籽苗。處理後約一週，使用下列級別將植物以0-100%控制分級，其中0%為無控制，而100%為完全控制。

另外，當將全基質施用在下方葉片之表面，而病原體施放在上方葉片之表面時，NRRL B-50550顯示出對抗黃瓜白粉病之活性。

在治病試驗中NRRL B-50550亦顯示出對抗黃瓜白粉病之活性。當植物已在微小區上形成茂密之樹冠，而自然白粉病才剛剛在相鄰之地基開始發展之時點，在黃瓜微小區上接種黃瓜白粉病。感染後六天，沒有來自接種之疾病的可見證據。從依類似於實例13中所描述的方式製備之醱酵基質取得NRRL B-50550之凍乾粉末。然後，將凍乾粉末與惰性成分(潤濕劑、穩定劑、載體、助流劑和分散劑)一起配製，以製造可濕性粉末。該配製之產品包含75重量%之凍乾粉末。將可濕性粉末在水中稀釋，並以下列表14中所示之比率，以100加侖/英畝之比率施用。(注意，每英畝100加侖換算為每一微小區200毫升之噴霧量)。依據上述之相同級別分級。

實例10-玉米根蟲活性

進行測試，以測定NRRL B-50550對抗玉米根蟲之效力。依實例2中之描述在培養基1或培養基2中製備NRRL B-50550全基質。將NRRL B-50550全基質稀釋並餵予西斑黃瓜甲蟲(黃瓜十一星葉甲)，以在微量滴定盤中進行以飲食為基礎之分析。依實例2中之描述評估活性並在1至4之級別上評定等級。使用殺白蟻劑/殺蟲劑TERMIDOR^® SC(5-胺基-1-(2,6-二氯-4(三氟甲基)苯基)-4-((1,R,S)-(三氟甲基)亞磺醯基)-1-H-吡唑-3-甲腈，俗稱氟蟲腈(fipronil)BASF)作為陽性對照組。結果顯示於表15中。NRRL B-50550顯示出與殺蟲劑TERMIDOR^® SC(其包含活性成分氟蟲腈)相同的殺蟲活性。

實例11-劑量/反應實驗室分析

進行研究以測定TSSM對不同劑量之NRRL B-50550的反應。依實例5中之描述製備全基質。使用水和0.35%表面活性劑將所產生之全基質稀釋成如下表13中所示之百分比。使用水和0.35%表面活性劑作為對照處理組。在兩個分開的試驗中，將全基質溶液和對照處理組施用於利馬豆葉之下表面直至滴落，每一劑量重複四次。經過這類處理後，以50-100隻TSSM侵染植物，並在處理後五天以上述之級別評估蟎蟲和卵之存在情形。結果顯示於下列表16中。

依據處理之誤差線，與對照處理組相比較時，在測試之最低濃度(0.20%全基質)下可觀察到明顯之死亡率。據觀察，與施用NRRL B-50550相關之部分效果為其造成蟎蟲離開植物。因此，即使在亞致死劑量下，NRRL B-50550可能減少植物上之蟎蟲族群。

實例12-對抗具阿維菌素抗性之蛛蟎的活性

進行研究以測定與野生型蛛蟎(二點葉蟎(Tetranychus urticae)RW品種)相比較時，NRRL B-50550對抗具阿維菌素抗性之蛛蟎(二點葉蟎NL品種)的活性。以依實例9之最後一段製備的NRRL B-50550醱酵產物之可濕性粉末處理法國豆植物，稀釋後依下列表17中所示之比率施用。處理前一天，以50-100隻品種NL或RW侵染植物，並在處理後7至14天評估蟎蟲之存在。結果顯示出下列表17中。

實例13-含有提高之谷氏菌素水準的醱酵產物-使用甘胺酸

進行醱酵以優化谷氏菌素之產製和NRRL B-50550之殺蟎活性。在2升搖瓶中，使用由10.0克/升澱粉、15.0克/升葡萄糖、10.0克/升酵母萃取物、10.0克/升酪蛋白水解產物(或10.0克/升大豆蛋白腖)和2.0克/升碳酸鈣所組成之培養基，在20-30℃下依實例1中之描述製備初級種子培養物。約1-2天後，當搖瓶中長出大量菌絲後，將內容物轉移到400升醱酵器中之新鮮培養基(與上述者相同，具0.1%之消泡劑)中並在20-30℃下在生長。約20-30小時後，當搖瓶中長出大量菌絲後，將內容物轉移到3000升醱酵器中，並在由80.0克/升(8.0%)之麥芽糊精、30.0克/升(3.0%)之葡萄糖、15.0克/升(1.5%)之酵母萃取物、20.0克/升(2.0%)之大豆酸水解產物、10.0克/升(1.0%)之甘胺酸和2.0克/升(0.2%)之碳酸鈣和2.0毫升/升之消泡劑所組成之培養基中，在20-30℃下生長160-200小時。

使用第一批3000升醱酵作為實例，依下述計算醱酵器中谷氏菌素之產量。3397公斤×1.7毫克/克醱酵基質=5774.90克谷氏菌素=5.78公斤。在醱酵器中之初始重量為3496公斤(3256公斤培養基+240公斤種子)，這造成最終體積多於目標體積3000升。由於目標體積3000升為用於計算生產培養基中的所有成分之量的基礎，該標準化之體積生產率為：5774.9克/3000升=1.9克/升。此谷氏菌素濃度類似於使用如上述之相同培養基，及最後之醱酵步驟和含甘胺酸(作為胺基酸)之培養基進行20升醱酵時所取得之1.8克/升。

在本申請案之全文中，依下列實例17和19中之描使用分析型HPLC色層分析法檢測谷氏菌素水準。

實例14-含有提高之谷氏菌素水準的醱酵產物-使用麩胺酸

進行醱酵以優化谷氏菌素之產製和NRRL B-50550之殺蟎活性。在1升搖瓶中，使用由10.0克/升澱粉、15.0克/升葡萄糖、10.0克/升酵母萃取物、10.0克/升酪蛋白水解產物(或10.0克/升大豆蛋白腖)和2.0克/升碳酸鈣所組成之培養基，在20-30℃下依實例1中之描述製備初級種子培養物。約1-2天後，當搖瓶中長出大量菌絲後，將內容物轉移到1升醱酵器中之新鮮培養基(與上述者相同，具0.1%之消泡劑)中並在20-30℃下在生長。約20-30小時後，當搖瓶中長出大量菌絲後，將內容物轉移到20升醱酵器中，在由60.0克/升(8.0%)之澱粉、30.0克/升(3.0%)之右旋糖、15.0克/升(1.5%)之酵母萃取物、20.0克/升(2.0%)之大豆酸水解產物、12.0克/升(1.0%)之L-麩胺酸和2.0克/升(0.2%)之碳酸鈣，及2.0毫升/升之消泡劑所組成之培養基中，在20-30℃下生長160-200小時。

使用L-麩胺酸作為胺基酸之本醱酵中的谷氏菌素濃度為1.1克/升。

實例15-含有提高之谷氏菌素水準的醱酵產物-使用核苷酸

不欲受限於學理，如第6圖之假設的合成途徑所示，本申請者假設胞嘧啶之可用性對產製谷氏菌素具關鍵性。因此，藉由在培養基中提供提高之胞嘧啶水準，所得之谷氏菌素的量也應增加。本申請者測試在添加胞嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶之培養基中由細黃鏈黴菌B- 50550產製之谷氏菌素。具體地說，將細黃鏈黴菌B-50550在2升搖瓶中，生長在由20.0克/升之麥芽糊精、10.0克/升之葡萄糖、5.0克/升之酵母萃取物、6.0克/升大豆酸水解產物、2.0克/升之甘胺酸、1.0克/升之碳酸鈣和濃度各為0或0.50克/升之胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶所組成的培養基中，在20-30℃下生長6天。結果顯示於下列表19中。

實例16-谷氏菌素-過量產製突變體

以增加谷氏菌素產製和生物活性為目標，透過具抗生素抗性突變體篩選計劃(其中產生對個別抗生素(慶大黴素、利福平、鏈黴素、巴龍黴素或妥布黴素)具抗性之突變體集合庫)從親代菌株細黃鏈黴菌NRRL B-50550創建突變體。見，Okamoto-Hosoya,Y.，等人，The Journal of Antibiotics 43(12)2000年12月。使用N- 甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(“NTG”)令親代菌株發生突變，再選擇和篩選所產生之具抗生素抗性的突變體。用來選擇供進一步研發之過量產製谷氏菌素之菌株的突變體集合庫之創建和篩選方法詳細說明於下。

從含有生長約14天或將形成孢子之B-50550的大豆粉麥芽糖(SFM)瓊脂盤製備細黃鏈黴菌B-50550之孢子懸浮液並儲存在-80℃，20%甘油中。將溶解在合適之緩衝液中的合適量之NTG加入孢子懸浮液中，以取得50%滅殺(在37℃下，0.5毫克/毫升，pH為8.5，慢慢地搖動1小時)。然後，將經NTG處理之孢子懸浮液平皿接種在輔以下列濃度之抗生素的GYM(4克/升之葡萄糖、4克/升之酵母萃取物、10克/升之麥芽萃取物及12克/升之瓊脂)上。見，下列表20。

見Kieser,T.,et al.,Practical Streptomyces Genetics，第5章John Ines Centre Norwich Research Park，英國(2000)，第99-107頁。依下述分離、純化並篩選約350可具抗生素抗性之個別菌落。

將從GYM抗生素盤移出之各分離菌落重新平皿接種在SFM瓊脂盤上。使用含有具抗生素抗性之細菌的瓊脂塞接種含有2.5毫升種子培養基之24孔積木。讓在這些經接種的積木中之細菌生長3天並使用所產生之培養基質接種含有生產培養基的24孔積木。讓在生產積木中之細菌在28℃下生長七天。在種子積木中之每個孔中含有胰蛋白腖大豆基質(TSB)(每升之DI H₂O：17克Bacto Tryptone(酪蛋白胰酶消化物)、3克Bacto Soytone(豆粕胰酶消化物)、2.5克右旋糖、5克氯化鈉、2.5克磷酸氫二鉀)，而在生產積木中之每個孔中含有實例2之培養基2(Proflo 20克/升、麥芽萃取物20克/升、KH₂PO₄一鹼價6克/升、K₂HPO₄二鹼價4.8克/升)。

依下述使用分析性HPLC色層分析法測試來自生產積木之每個孔之全基質的谷氏菌素產量。在生產積木之每個孔中加入2.4毫升水。將積木震盪混合並離心。將0.8毫升上清液轉移入每孔含有4毫升水之萃取積木中。將3.2毫升水加入生產積木之各孔中的細胞沉澱小丸中，再次將積木震盪混合並離心。然後，將此3.2毫升之洗滌水加入各萃取積木之適當的孔中。然後，使用分析性HPLC色層分析法分析萃取積木中之水性萃取物的谷氏菌素含量。具體而言，將樣本注入安裝Diamond氫化物保護柱之Cogent Diamond氫化物柱(100A，4微米，150×4.6毫米)上。以乙腈/NH₄OAC梯度(見下文)洗提該柱30分鐘。流速為1毫升/分鐘。在254nm檢測谷氏菌素。谷氏菌素洗提液為單一尖峰，近似保留時間為19分鐘。經由重新生長在24孔積木和250毫升培養瓶中來確認谷氏菌素水準，以確認頂尖之過量產製突變體。一旦確認後，將經確認之一些分離株再進行至少一輪以上之誘變和抗生素抗性篩選。使用在前一輪中衍生之分離株尚未對其發展出抗性之剩餘抗生素來進行接下去之各輪誘變加抗生素篩選。在單輪篩選後發現谷氏菌素之產製有小量(1.2倍)增加，而隨後的幾輪導致從相同之原始低水準過交生產者產生的分離株所產製之谷氏菌素大為增加。見第3圖。

令所選出之具有較高之谷氏菌素產量及在SFM瓊脂盤上形成孢子之能力的突變體生長在1升之帶檔板的搖瓶中，隨後在含有培養劑2之5升Sartorius B-plus生物反應器和/或20升生物反應器中擴增規模。見第4圖。

選擇在第3圖和第4圖中被定名為第3輪第4分離株之菌株來根據實例13中描述的過程擴增規模。此菌株製造含有3.8毫克/克之谷氏菌素的醱酵基質。

實例17-轉換率：全基質至凍乾粉末

表21顯示出依實例13中之描述製備的數批B-50550的全基質從全基質轉換成凍乾粉末的轉換率。這些計算假設全基質完全被轉換成凍乾粉末且全基質之密度為1克/毫升。“平均%”為從某一批全基質取得之凍乾粉末的平均重量百分比。

實例18-其他鏈黴菌株-醱酵和用於控制蟎之方法

使用類似於實例13中所描述之那些條件培養數種鏈黴菌株。所有菌株具有編碼與細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之GouA-M或GouB-M蛋白質(例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：30)具有至少約90%之序列同一性的胺基酸序列之生物合成基因簇。菌株之命名和谷氏菌素濃度顯示於下列表22中。

將甘胺酸添加到醱酵培養基中，當將上述之紫紅鏈黴菌株A生長在該醱酵培養基中時可取得2倍之谷氏菌素產量，但此醱酵培養基對生長在其中之細黃鏈黴菌株B或紫紅鏈黴菌株B之谷氏菌素產量僅有很小的影響。

使用上述之二斑蛛蟎(TSSM)實驗室分析，採用如實例2中之以水和表面活性劑稀釋之全基質篩選用於紫紅鏈黴菌株A之生物反應器材料。紫紅鏈黴菌株A及細黃鏈黴菌株NRRL B-50550之結果顯示於下列表23中。

實例19-剔除NRRL B-50550中之谷氏菌素基因簇以確認其功能

進行研究以確認該推測之基因簇負責谷氏菌素的表現。從NRRL B-50550基因組DNA產生三個構造物，其含有類似於殺稻瘟菌素之胞啶嚀(cytosinine)合成酶的胺基轉移酶基因(ORF 4258)、胞嘧啶葡糖醛酸合成酶基因(ORF 4261)及脫氫酶/異丁酸羥基酯(ORF 4253)(其可能涉及製造UDP-葡糖醛酸)加上編碼區上游之300個核苷酸。不希望受限於學理，本申請者假設胺基轉移酶基因 (ORF 4258)及胞嘧啶葡糖醛酸合成酶基因(ORF 4261)在谷氏菌素生物合成途徑中之相當早期是必要的。因為ORF 4258和ORF 4261在基因組中靠近彼此，亦因為它們位於基因簇的中間，該脫氫酶基因(ORF 4253)可能涉及製造UDP-葡糖醛酸。本申請者假設在該途徑之早期亦應需要此酶。

所使用之細菌菌株和載體顯示於表24中。用於將DNA片段分殖到質粒載體中之含有限制性內切酶位點的引物提供於SEQ ID NO：44-75中。

為了確認該谷氏菌素基因簇序列正確，設計7對用於PCR及序列確認之引物(SEQ ID NO：44-57)。依照Qiagen基因組DNA萃取套組議訂計劃進行PCR產物之DNA萃取。用於基因組DNA和不同引物對之熱循環參數為：95℃下15分鐘，接著為35個循環之95℃下1分鐘、58℃下1分鐘及72℃下1分鐘，然後為72℃下10分鐘，再儲存在4℃。藉由在瓊脂糖凝膠上電泳來解析PCR產物(見第9圖)，並將PCR產物送去進行序列確認。PCR 產物之大小和序列結果確認該谷氏菌素基因簇序列正確，因此，設計引物以進行剔除實驗。

構建用於交換之基因匣

為了剔除特定基因，設計含有特定限制性內切酶位點之上游和下游引物(見SEQ ID NO：60-75)。在基因上游方面，正向引物使用EcoRI位點(GAATTC)，而反向引物使用KpnI位點(GGTACC)。在基因下游方面，正向引物使用XbaI位點(TCTAGA)，而反向引物使用HindIII位點(AAGCTT)網站。將卡那黴素抗性基因加在中間以作為選擇標記。將所有構建體選殖入pUC 118載體(第10圖)。經由測定上游和下游序列來確認含有卡那黴素抗性和剔除基因，上游及下游的基因匣。以HindIII和EcoRI分解基因匣，以卡那黴素作為選擇標記，選殖入pKC1139轉運載體中pKC1139：：C_upKI_down；pKC1139：C_upKW_down；pKC1139：I_upKI_down，pKC1139W_upKW_down(第11圖)。在限制性內切酶分析、PCR和序列驗證後，將基因簇電穿孔入大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中。經由在安普黴素(apramycin)和卡那黴素之存在下選擇來選擇轉化株並藉由PCR確認選擇上游和下游引物。

為了確保基因之破壞，設計實驗以執行單次交換同源重組。從基因組DNA擴增約1kb之HindIII/EcoRI片段並插入pKC1139之HindIII/EcoRI位點，以產生pKC1139：C、pKC1139：G及pKC1139：I。

接合作用

用於本實驗之供體為含有在該pKC1139轉運載體上之剔除盒的大腸桿菌株(ET12567/pUZ8002)。依循用於透過細菌接合轉移質粒之經過修改的實驗計劃(解釋於下文中)，該基因匣被成功地引入NRRL B-50550中。

將含有質粒pUZ8002 w/pkc1139：：I_upKI_down的大腸桿菌(菌株ET12567)劃線接種在盧里亞(Luria)基質(LB)瓊脂盤上，並在30℃或37℃下培育一整夜以取得單一菌落。在至少兩根含有10毫升其中輔以25微克/毫升氯黴素Cm、25微克/毫升卡那黴素及100微克/毫升安普黴素之LB(LB_{Cm25k-Kan25-Apr100})的50毫升試管中接種單一菌落。令菌落在37℃，搖動培育箱中生長一整夜(20-24小時)。將隔夜培養物在50毫升LB_Apr100中稀釋100倍，再在37℃之搖動培育箱中生長至OD₆₀₀為0.4-0.6，通常需要4-5個小時。然後，令細胞在約5000RCF和4℃下形成小丸15-20分鐘。將所得之上清液傾析並丟棄。將細胞小丸盡力重新懸浮並以LB洗滌兩次，以除去殘留的抗生素。雖然形成小丸之大腸桿菌細胞被洗滌，將足量之甘油貯存孢子準備管解凍以提供細胞予欲測試之各受體菌株/條件。由於鏈黴菌孢子很小且非常難以計數，使用視覺密度製品。此外，當洗滌細胞時，在層流罩中選擇瓊脂盤並放置乾燥。在每一次接合時，將500微升孢子製品與500微升2×YT基質在無菌2.0毫升微量離心管中混合，然後在50℃下進行熱休克約20分鐘(實驗上，熱休克時間在10分鐘至1小時之範圍內生存能力並無可檢測到之差異)。YT基質為較盧里亞基質更豐富之培養基(含有兩倍於LB之酵母萃取物且較LB多出60%蛋白腖)。然後，將混合物冷卻至室溫，再將500微升形成小丸之大腸桿菌細胞加入每個試管中，再充分混合。將細胞在5000RCF和室溫下離心5分鐘。傾空上清液。將形成沈澱小丸之細胞重新懸浮並平皿接種在瓊脂盤上。使用4-10個12毫米之玻璃珠或Lazy L塗佈器將細胞塗佈開。將瓊脂盤在30℃下培育一整夜(16-20小時)。在1毫升水中製備用於每一瓊脂盤之5毫克的卡那黴素和0.5毫克之萘啶酸(來自氫氧化鈉貯存物)，然後以Lazy L塗佈器加至瓊脂盤上以將溶液分佈均勻，這需要反復塗佈幾分鐘並風乾。然後，將瓊脂盤進一步培育在30℃下。培育4-6天後，選擇白色卡那黴素抗性之菌落以進行PCR確認和谷氏菌素產製分析。

PCR確認

將選出之用於進行PCR確認之卡那黴素抗性菌落培養在具有卡那黴素抗生素之胰蛋白酶大豆基質(TSB)培養基中，依照製造商之議定計劃，使用ZYGEM套組(來自ZyGEM股份有限公司(NZ))，使用88微升之培養、10微升之10x綠緩衝劑、1微升之prepGEM及1微升之溶菌酶來萃取DNA，在37℃下培育15分鐘，75℃下培育15分鐘，及95℃下培育5分鐘。然後，以合適之引物及下列循環參數來進行PCR：95℃下15分鐘，再進行35個循環之95℃下1分鐘，58℃下1分鐘，及72℃下1分鐘，然後在72℃下10分鐘，再儲存於4℃。經由在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳來解析PCR產物(第12圖)。

pKC1139：I為插入pKC1139轉運載體之gouI片段，其再經由單次同源交換被整合入染色體中。此方法產生側面鄰接兩個突變型等位基因之整合載體複本。PCR結果仍顯示出gouI及gouG帶(第12圖)。雙重交換之pKC1139：IKI PCR未顯示gouI之PCR產物(第12圖)。雖然pKC1139：CKW，gouG之PCR產物顯示出較小之分子量帶，這可能是由於該基因的部分缺失。

谷氏菌素產製

使用分析性HPLC色層分析法測量谷氏菌素產量。簡單地說，將試驗樣品(1.0克)移入離心管中，並以3毫升水萃取。藉由震盪混合及超音波處理將組分混合，然後使用離心分離。將上清液傾析到乾淨之燒瓶中。額外重複此程序一次，將上清液與先前分離之上清液合併。使水性萃取液之最終體積成為10毫升，並使用分析型HPLC色層分析法分析谷氏菌素之含量。

將稀釋之樣本過濾並使用安裝了Diamond氫化物保護柱之Cogent Diamond氫化物柱(100A，4微米，150×4.6毫米)藉由HPLC進行分析。以乙腈/NH₄OAC梯度洗提該柱30分鐘(見下文)。流速為1毫升/分鐘。在254 nm檢測所需之代謝產物。谷氏菌素洗提液為單一尖峰之形式，其近似保留時間為17-19分鐘。野生型NRRL B-50550可製造0.5毫克/克之谷氏菌素，而若gouI基因被去活化，則不產製谷氏菌素(見表25)。單次交換去活化之gouI及gouG亦顯示出未產製谷氏菌素。將整個谷氏菌素基因簇去活化亦導致不產製谷氏菌素。

除非另有定義，本文中所有技術和科學術語具有與本發明所屬之技藝領域中之一般技術人士所通常理解者相同的含義。雖然可使用類似或等同於本文所描述者之任何方法和材料來實行或測試本發明，本文所描述者為較佳之方法和材料。本文所列舉之所有出版物、專利及專利出版物的全部內容以引用方式併入本文以用於所有目的。

本文所討論的出版物僅提供其在本申請案提交日之前的揭露內容。本文中之任何信息均不應被解釋為承認本發明無權憑藉以往的發明而早於這類出版物。

雖然本發明已結合其特定實施例描述，須理解的是，本發明能夠進一步修改，且本申請案意在涵蓋依循，一般而言，本發明之原則的任何變化、用途或改編，且包括偏離本揭露內容，但在本發明所屬之技藝內的公知或習慣做法內者，且可能適用於前文所載之基本特徵及以下所附之申請專利範圍。

<110> Bayer CropScience LP CAMPBELL,Brian CURTIS,Damian GUAN,Shaohua GUILHABERT-GOYA,Magalie JOO,Daniel M. LU,Tara MARGOLIS,Jonathan ROYALTY,Reed N. SALAZAR,Gerardo B. SESIN,David SMITH,Frisby D. TAYLOR,Colleen ZHU,Hong

<120> 細黃鏈黴菌株及使用彼等來控制植物疾病和害蟲之方法

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<160> 100

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 426

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(426)

<223> orf4251；甲基轉移酶結構域家族；GouA

<400> 1

<210> 2

<211> 141

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(141)

<223> orf4251；甲基轉移酶結構域家族；GouA

<400> 2

<210> 3

<211> 462

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(462)

<223> orf4252；主要協助轉運子；GouB

<400> 3

<210> 4

<211> 153

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(153)

<223> orf4252；主要協助轉運子；GouB

<400> 4

<210> 5

<211> 516

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(516)

<223> orf4253；3-羥基異丁酸脫氫酶；GouC

<400> 5

<210> 6

<211> 171

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(171)

<223> orf4253；3-羥基異丁酸脫氫酶；GouC

<400> 6

<210> 7

<211> 357

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(357)

<223> orf4254；假定蛋白

<400> 7

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(118)

<223> orf4254；假定蛋白

<400> 8

<210> 9

<211> 141

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(141)

<223> orf4255；含有CoA-結合域蛋白質；GouD

<400> 9

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(46)

<223> orf4255；含有CoA-結合域蛋白質；GouD

<400> 10

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<211> 915

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

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<400> 11

<210> 12

<211> 304

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(304)

<223> orf4256；假定蛋白；GouE

<400> 12

<210> 13

<211> 981

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(981)

<223> orf4257；DegT/DnrJ/EryCl/StrS胺基轉移酶；GouF

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(326)

<223> orf4257；DegT/DnrJ/EryCl/StrS胺基轉移酶；GouF

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<210> 15

<211> 1194

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(1194)

<223> orf4258；DegT/DnrJ/EryCl/StrS胺基轉移酶，胞啶嚀樣合成酶；GouG

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(397)

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<211> 1137

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(378)

<223> orf4259；磷酸甘油酸變位酶；GouH

<400> 18

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<211> 120

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(120)

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<400> 19

<210> 20

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(39)

<223> orf4260；假定蛋白

<400> 20

<210> 21

<211> 1116

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(1116)

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<400> 21

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(371)

<223> orf4261；胞嘧啶葡糖醛酸合成酶；GouI

<400> 22

<210> 23

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<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(714)

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<210> 24

<211> 237

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(237)

<223> orf4262；假定蛋白；GouJ

<400> 24

<210> 25

<211> 636

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(636)

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<400> 25

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<211> 211

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(211)

<223> orf4263；糖基轉移酶；GouK

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<211> 1341

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

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<223> orf4264；假定蛋白；GouL

<400> 28

<210> 29

<211> 1764

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

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<223> orf4265；天門冬醯胺合成酶類似性；GouM

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<210> 30

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(587)

<223> orf4265；天門冬醯胺合成酶類似性；GouM

<400> 30

<210> 31

<211> 114

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(114)

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<400> 31

<210> 32

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(37)

<223> orf4266；假定蛋白

<400> 32

<210> 33

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<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(405)

<223> orf4267；假定蛋白

<400> 33

<210> 34

<211> 134

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(134)

<223> orf4267；假定蛋白

<400> 34

<210> 35

<211> 1281

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(1281)

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<400> 35

<210> 36

<211> 426

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(426)

<223> orf4268；假定蛋白

<400> 36

<210> 37

<211> 1137

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(1137)

<223> ORF4269；可動元件；-

<400> 37

<210> 38

<211> 378

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(378)

<223> orf4269；可動元件蛋白質

<400> 38

<210> 39

<211> 564

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(564)

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<400> 39

<210> 40

<211> 188

<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(188)

<223> orf4270；轉錄調控子，MarR族

<400> 40

<210> 41

<211> 1107

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(1107)

<223> orf4271；單加氧酶；+；GouN

<400> 41

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<212> PRT

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> MISC_特性

<222> (1)..(368)

<223> orf4271；單加氧酶；GouN

<400> 42

<210> 43

<211> 24959

<212> DNA

<213> 細黃鏈黴菌

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(21933)

<223> 谷氏菌素基因簇加一些側翼序列之基因組DNA序列

<220>

<221> misc_特性

<222> (1)..(177)

<223> orf4248；假定蛋白；+

<220>

<221> misc_特性

<222> (605)..(2311)

<223> orf4249；內-1,4-β-木聚糖酶A先質(EC 3.2.1,8)；-

<220>

<221> misc_特性

<222> (2492)..(2787)

<223> orf4250；可動元件蛋白質；-

<220>

<221> misc_特性

<222> (4455)..(4880)

<223> orf4251；甲基轉移酶結構域家族；-；gouA

<220>

<221> misc_特性

<222> (6340)..(6801)

<223> orf4252；主要協助轉運子；+；gouB

<220>

<221> misc_特性

<222> (7197)..(7712)

<223> orf4253；羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)；+；gouC

<220>

<221> misc_特性

<222> (8130)..(8486)

<223> orf4254；假定蛋白；-

<220>

<221> misc_特性

<222> (8589)..(8729)

<223> orf4255；含有CoA結合域蛋白質；+；部分結合gouD

<220>

<221> misc_特性

<222> (8912)..(9826)

<223> orf4256；假定蛋白；+；gouE

<220>

<221> misc_特性

<222> (9827)..(10823)

<223> orf4257；DegT/DnrJ/EryCl/StrS胺基轉移酶；+；gouF

<220>

<221> misc_特性

<222> (10820)..(12013)

<223> orf4258；DegT/DnrJ/EryCl/StrS synthase；+；gouG胺基轉移酶，胞啶嚀樣合成酶；+；gouG

<220>

<221> misc_特性

<222> (12020)..(13145)

<223> orf4259；磷酸甘油酸變位酶；+；gouH

<220>

<221> misc_特性

<222> (13146)..(13265)

<223> orf4260；；-

<220>

<221> misc_特性

<222> (13219)..(14334)

<223> orf4261；胞嘧啶葡糖醛酸(CGA)合成酶；+；gouI

<220>

<221> misc_特性

<222> (14350)..(15063)

<223> orf4262；核苷酸結合蛋白質；+；gouJ

<220>

<221> misc_特性

<222> (15411)..(16046)

<223> orf4263；糖基轉移酶；+；gouK

<220>

<221> misc_特性

<222> (16142)..(17482)

<223> orf4264；假定蛋白；+；gouL

<220>

<221> misc_特性

<222> (17549)..(19312)

<223> orf4265；天門冬醯胺合成酶類似性；+；gouM

<220>

<221> misc_特性

<222> (19461)..(19574)

<223> orf4266；假定蛋白；+

<220>

<221> misc_特性

<222> (20147)..(20551)

<223> orf4267；假定蛋白；+

<220>

<221> misc_特性

<222> (20650)..(21933)

<223> orf4268；轉位酶；+

<400> 43

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物1F

<400> 44

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物1R

<400> 45

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物2F

<400> 46

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物2R

<400> 47

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物3F

<400> 48

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物3R

<400> 49

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物4F

<400> 50

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物4R

<400> 51

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物5F

<400> 52

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物5R

<400> 53

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物6F

<400> 54

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物6R

<400> 55

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物7F

<400> 56

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物7R

<400> 57

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Kan-F引物

<400> 58

<210> 59

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Kan-R引物

<400> 59

<210> 60

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouL-1-F(-2056)引物

<400> 60

<210> 61

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouL-1-R(-880)：引物

<400> 61

<210> 62

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouL-2-F(+522)引物

<400> 62

<210> 63

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouL-2-R(+2364)引物

<400> 63

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouH-1-F(-1827)：引物

<400> 64

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouH-1-R(-845)：引物

<400> 65

<210> 66

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouH-2-F(+1184)：引物

<400> 66

<210> 67

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouH-2-R(+2985)：引物

<400> 67

<210> 68

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouF-1-F(-1831)：引物

<400> 68

<210> 69

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouF-1-R(-41)：引物

<400> 69

<210> 70

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouF-2-F(+1126)：引物

<400> 70

<210> 71

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouF-2-R(+2919)：引物

<400> 71

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouWcluster-F(+4)引物

<400> 72

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouWcluster-R(+1897)引物

<400> 73

<210> 74

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouWcluster-F(-1373end)引物

<400> 74

<210> 75

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gouWcluster-R(-92end)引物

<400> 75

<210> 76

<211> 11883

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 76

<210> 77

<211> 399

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 77

<210> 78

<211> 213

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 78

<210> 79

<211> 143

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 79

<210> 80

<211> 304

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 80

<210> 81

<211> 326

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 81

<210> 82

<211> 397

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 82

<210> 83

<211> 378

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 83

<210> 84

<211> 393

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 84

<210> 85

<211> 101

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 85

<210> 86

<211> 131

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 86

<210> 87

<211> 170

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 87

<210> 88

<211> 446

<212> PRT

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 88

<210> 89

<211> 1200

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 89

<210> 90

<211> 642

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 90

<210> 91

<211> 432

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 91

<210> 92

<211> 915

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 92

<210> 93

<211> 981

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 93

<210> 94

<211> 1194

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 94

<210> 95

<211> 1137

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 95

<210> 96

<211> 1182

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 96

<210> 97

<211> 306

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 97

<210> 98

<211> 396

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 98

<210> 99

<211> 513

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 99

<210> 100

<211> 1341

<212> DNA

<213> 紫紅鏈黴菌

<400> 100

Claims

一種組成物，其包含植食性殺蟎和/或殺真菌細黃鏈黴菌(Streptomyces microflavus)株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變株的生物上純培養物。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該突變株具有透層活性。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該突變株具有殺卵活性。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該突變株具有殘留活性。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該突變株具有殺真菌活性。
如申請專利範圍第5項之組成物，其中該突變株具有抗黴菌活性。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該突變株具有殺蟲活性。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該突變株具有抗玉米根蟲活性。
如申請專利範圍第1項之組成物，其包含每毫升培養物至少約1×10⁶CFU之菌株。
如申請專利範圍第1項之組成物，其進一步包含調和物成分。
如申請專利範圍第10項之組成物，其中該調和物成分為濕潤劑。
如申請專利範圍第1項之組成物，其具有至少約50%之葉蟎(Spider Mite)效力。
如申請專利範圍第12項之組成物，其具有至少約60%之葉蟎效力。
一種組成物，其包含殺蟎和/或殺真菌細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變株的醱酵產物。
如申請專利範圍第14項之組成物，其中該醱酵產物進一步包含調和物成分。
如申請專利範圍第15項之組成物，其中該調和物成分為潤濕劑。
如申請專利範圍第14項之組成物，其具有至少約50%之葉蟎效力。
一種處理植物以控制植物疾病或害蟲之方法，其中該方法包含將細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎和/或突變株施用在植物、植物之一部分和/或植物之所在地上。
如申請專利範圍第18項之方法，其中該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎和/或殺真菌突變株係以包含該細黃鏈黴菌株NRRL B-50550，或由其衍生之植食性殺蟎突變株的組成物施用。
如申請專利範圍第19項之方法，其中該組成物為細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變株的醱酵產物。
如申請專利範圍第19項之方法，其中該方法包含將該組成物施用在葉面植物部分。
如申請專利範圍第19項之方法，其中該欲控制之害蟲係選自蟎及葉甲(Diabrotica)。
如申請專利範圍第22項之方法，其中該蟎係選自以下群組：三葉蟎(clover mite)、棕色蟎(brown mite)、榛子蛛蟎(hazelnut spider mite)、蘆筍蛛蟎(asparagus spider mite)、棕色小麥蟎(brown wheat mite)、豆蟎(legume mite)、酢漿草蟎(oxalis mite)、黃楊木蟎(boxwood mite)、德州柑橘蟎(Texas citrus mite)、東方紅蟎(Oriental red mite)、柑桔紅蟎(citrus red mite)、歐洲紅蟎(European red mite)、黃蛛蟎(yellow spider mite)、無花果蛛蟎(fig spider mite)、劉易斯蛛蟎(Lewis spider mite)、六斑蛛蟎(six-spotted spider mite)、威拉米特蟎(Willamette mite)、尤馬蛛蟎(Yuma spider mite)、紡網絡蟎(web-spinning mite)、菠蘿蟎(pineapple mite)、柑橘綠蟎(citrus green mite)、美洲皂莢蛛蟎(honey-locust spider mite)、茶紅蛛蟎(tea red spider mite)、南方紅蟎(southern red mite)、鱷梨棕蟎(avocado brown mite)、雲杉蛛蟎(spruce spider mite)、鱷梨紅蟎(avocado red mite)、草地小爪蟎(Banks grass mite)、硃砂蛛蟎(carmine spider mite)、沙漠蛛蟎(desert spider mite)、蔬菜蜘蟎(vegetable spider mite)、隆突蛛蟎(tumid spider mite)、草莓蛛蟎(strawberry spider mite)、二斑蛛蟎(two-spotted spider mite)、丹尼爾蟎(McDaniel mite)、太平洋蛛蟎(Pacific spider mite)、山楂蛛蟎(hawthorn spider mite)、四斑蛛蟎(four-spotted spider mite)、肖氏蛛蟎(Schoenei spider mite)、智利假蛛蟎(Chilean false spider mite)、柑橘平蟎(citrus flat mite)、女貞蟎(privet mite)、平猩紅蟎(flat scarlet mite)、白尾蟎(white-tailed mite)、菠蘿跗線蟎(pineapple tarsonemid mite)、西印度甘蔗蟎(West Indian sugar cane mite)、鱗莖鱗蟎(bulb scale mite)、仙客來蟎(cyclamen mite)、廣明蟎(broad mite)、麥圓葉爪蟎(winter grain mite)、紅足泥蟎(red-legged earth mite)、榛小植刺癭蟎(filbert big-bud mite)、葡萄癭蟎(grape erineum mite)、梨腫葉蟎(pear blister leaf mite)、蘋果捲葉緣蟎(apple leaf edgeroller mite)、桃植羽癭蟎(peach mosaic vector mite)、赤楊珠癭蟎(alder bead gall mite)、佩里安核桃葉癭蟎(Perian walnut leaf gall mite)、胡桃葉捲緣蟎(pecan leaf edgeroll mite)、無花果癭蟎(fig bud mite)、橄欖油癭蟎(olive bud mite)、柑橘癭蟎(citrus bud mite)、荔枝癭蟎(litchi erineum mite)、小麥曲蟎(wheat curl mite)、椰子花核癭蟎(coconut flower and nut mite)、甘蔗腫癭蟎(sugar cane blister mite)、野牛草癭蟎(buffalo grass mite)、百慕達草癭蟎(bermuda grass mite)、胡蘿蔔癭蟎(carrot bud mite)、紅薯葉癭蟎(sweet potato leaf gall mite)、石榴葉曲蟎(pomegranate leaf curl mite)、ash sprangle癭蟎(ash sprangle gall mite)、槭斜背瘤癭蟎 (maple bladder gall mite)、alder erineum蟎(alder erineum mite)、紅莓蟎(redberry mite)、棉花腫蟎(cotton blister mite)、藍莓癭蟎(blueberry bud mite)、粉紅茶銹蟎(pink tea rust mite)、茶紫癭蟎(ribbed tea mite)、灰色柑橘蟎(grey citrus mite)、紅薯銹蟎(sweet potato rust mite)、七葉樹銹蟎(horse chestnut rust mite)、柑桔銹蟎(citrus rust mite)、蘋果銹蟎(apple rust mite)、葡萄銹蟎(grape rust mite)、梨銹蟎(pear rust mite)、扁針鞘松蟎(flat needle sheath pine mite)、野玫瑰芽果蟎(wild rose bud and fruit mite)、乾莓癭蟎(dryberry mite)、芒果銹蟎(mango rust mite)、杜鵑銹蟎(azalea rust mite)、梅銹蟎(plum rust mite)、桃銀色刺癭蟎(peach silver mite)、蘋果銹蟎(apple rust mite)、番茄葉赤皮癭蟎(tomato russet mite)、粉紅柑桔銹蟎(pink citrus rust mite)、穀物銹蟎(cereal rust mite)、水稻銹蟎(rice rust mite)及彼等之組合。
如申請專利範圍第22項之方法，其中該葉甲係選自以下群組：帶狀黃瓜甲蟲(Banded cucumber beetle)(食蚜蠅葉甲)(Diabrotica balteata)、北方玉米根蟲(Northern corn rootworm)(巴氏根葉甲)(Diabrotica barberi)、南方玉米根蟲(Southern corn rootworm)(黃瓜十一星葉甲食根亞種)(Diabrotica undecimpunctata howardi)、西黃瓜甲蟲(Western cucumber beetle)(黃瓜十一星葉甲)(Diabrotica undecimpunctata tenella)、西斑黃瓜甲蟲(Western spotted cucumber beetle)(黃瓜十一星葉甲)(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata)、西玉米根蟲(Western corn rootworm)(玉米根螢葉甲)(Diabrotica virgifera virgifera)、墨西哥玉米根蟲(Mexican corn rootworm)(墨西哥玉米根葉甲)(Diabrotica virgifera zeae)及彼等之組合。
如申請專利範圍第20項之方法，其中該醱酵產物為經冷凍乾燥之粉末或經噴霧乾燥之粉末，且其中該醱酵產物係以約0.625磅/英畝至約5磅/英畝之比率施用。
如申請專利範圍第25項之方法，其中該醱酵產物包含至少約2重量%之谷氏菌素。
如申請專利範圍第26項之方法，其中該醱酵產物包含至少約4重量%之谷氏菌素。
如申請專利範圍第23項之方法，其中該蟎為抗阿維菌素(abamectin)蟎。
如申請專利範圍第19項之方法，其中該植物疾病係由真菌引起。
如申請專利範圍第29項之方法，其中該植物疾病為黴病或銹病。
如申請專利範圍第30項之方法，其中該黴病為白粉病或霜黴病。
如申請專利範圍第30項之方法，其中該銹病係選自以下群組：由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起之小麥葉銹葉銹病、由大麥柄銹菌(Puccinia hordei)引起之大麥葉銹病、由隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)引起之裸麥葉銹病、棕葉銹病、冠銹病及稈銹病。
一種產製谷氏菌素之鏈黴菌株之醱酵基質，其中該醱酵基質包含至少約1克/升之谷氏菌素。
如申請專利範圍第33項之醱酵基質，其中該產製谷氏菌素之鏈黴菌株包含編碼與選自以下群組之胺基酸序列具有至少約80%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。
如申請專利範圍第34項之醱酵基質，其中該產製谷氏菌素之鏈黴菌株包含編碼與選自以下群組之胺基酸序列具有至少約90%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：42。
如申請專利範圍第33項之醱酵基質，其中該醱酵基質含有至少約1克/升、至少約2克/升、至少約3克/升、至少約4克/升、至少約5克/升、至少約6克/升、至少約7克/升、或至少約8克/升之谷氏菌素。
如申請專利範圍第33項之醱酵基質，其中該醱酵基質含有濃度為約1克/升至約15克/升之谷氏菌素。
如申請專利範圍第34項之醱酵基質，其中該鏈黴菌株為細黃鏈黴菌株或紫紅鏈黴菌(Streptomyces puniceus)株。
如申請專利範圍第38項之醱酵基質，其中該細黃鏈黴菌株係選自以下群組：細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變株。
如申請專利範圍第39項之醱酵基質，其中該紫紅鏈黴菌株係選自以下群組：紫紅鏈黴菌株A或由其衍生之植食性殺蟎突變株。
一種製造產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質之方法，其中該醱酵基質含有至少約1克/升之谷氏菌素，該方法包含：在有氧條件下，將鏈黴菌株培養在含有可消化之碳源和可消化之氮源的培養基中，其中該培養基含有之胺基酸濃度能有效達成濃度為至少1克/升之谷氏菌素。
如申請專利範圍第41項之方法，其中係將該鏈黴菌株培養在培養基中直到該培養基中含有之谷氏菌素濃度為至少約2克/升、至少約3克/升、至少約4克/升、為至少約5克/升、至少約6克/升、至少約7克/升、或至少約8克/升之谷氏菌素。
如申請專利範圍第41項之方法，其中係經該鏈黴菌株係培養在培養基中直到該培養基中含有之谷氏菌素濃度在約1克/升至約15克/升之範圍內。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該胺基酸係選自以下群組：甘胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、絲胺酸及彼等之混合物。
如申請專利範圍第44項之方法，其中該培養基含有初始濃度為至少約2克/升之胺基酸。
如申請專利範圍第45項之方法，其中該培養基含有初始濃度為約5克/升至約15克/升之甘胺酸。
如申請專利範圍第45項之方法，其中該培養基含有初始濃度為約5克/升至約15克/升之麩胺酸。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該培養基含有葡萄糖和寡醣之混合物作為碳源。
如申請專利範圍第48項之方法，其中該寡醣為麥芽糊精或糊精。
如申請專利範圍第49項之方法，其中該培養基中之麥芽糊精的初始濃度為約50克/升至約100克/升。
如申請專利範圍第50項之方法，其中該培養基中之麥芽糊精的初始濃度為約60克/升至約80克/升。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該培養基中之葡萄糖的初始濃度為約20克/升至約60克/升。
如申請專利範圍第52項之方法，其中該培養基中之葡萄糖的初始濃度為約30克/升至約50克/升。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該培養基中含有初始濃度為約1克/升至3克/升之碳酸鈣。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該氮源係至少部分選自以下群組：大豆蛋白腖、大豆酸水解產物、大豆粉水解產物、酪蛋白水解產物、酵母萃取物及彼等之混合物。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該鏈黴菌株包含編碼與選自以下群組之胺基酸序列具有至少約80%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該鏈黴菌株為細黃鏈黴菌株。
如申請專利範圍第56項之方法，其中該細黃鏈黴菌株係選自細黃鏈黴菌株NRRL B-50550或由其衍生之植食性殺蟎突變株。
如申請專利範圍第56項之方法，其中該鏈黴菌株為紫紅鏈黴菌株。
如申請專利範圍第59項之方法，其中該紫紅鏈黴菌株為紫紅鏈黴菌株A或由其衍生之植食性殺蟎突變株。
一種增加產製谷氏菌素之鏈黴菌株的醱酵基質中之谷氏菌素量的方法，其包含在有氧條件下，在含有可消化之碳源及可消化之氮源的培養基中培養鏈黴菌株，其中該培養基中含有之胺基酸濃度能有效達成較該在含有少於約1克/升之一或多種胺基酸的培養基中所達成者至少高出兩倍之谷氏菌素濃度。
如申請專利範圍第61項之方法，其中該培養基中所含有之胺基酸濃度為約2克/升之一或多種胺基酸。
如申請專利範圍第62項之方法，其中該胺基酸是麩胺酸、絲胺酸或甘胺酸。
如申請專利範圍第61項之方法，其中該鏈黴菌株包含編碼與選自以下群組之胺基酸序列具有至少約80%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。
一種與SEQ ID NO：43之核苷酸序列具有至少70%之序列同一性之核酸序列，其係可操作地連接至少一種用於指導該序列表現之外源性和/或異源性調控元件。
如申請專利範圍第65項之核酸序列，其進一步包含SEQ ID NO：43之位置10820至位置12013的核苷酸序列。
如申請專利範圍第65項中任一項之核酸序列，其進一步包含SEQ ID NO：43之位置13219至位置14334的核苷酸序列。
如申請專利範圍第65-67項中任一項之核酸序列，其中該核酸序列係從細黃鏈黴菌、灰色鏈黴菌(S.griseus)、環圈鏈黴菌(S.anulatus)、糞生鏈黴菌(S.fimicarius)、小鏈黴菌(S.parvus)、淡紫灰鏈黴菌(S.lavendulae)、白綠鏈黴菌(S.alboviridis)、紫紅鏈黴菌或禾粟鏈黴菌(S.graminearus)分離出。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第65-68項中任一項之核酸序列。
一種用於產製谷氏菌素或谷氏菌素類似物之方法，其包含：在培養基中培養谷氏菌素或鏈黴菌族中產製谷氏菌素的細菌以製造並將該谷氏菌素或谷氏菌素類似物分泌入培養基中，從培養基中收集該谷氏菌素或谷氏菌素類似物，其中該細菌已經過修改以增加如申請專利範圍第65-68項中任一項之核酸序列之基因表現。
如申請專利範圍第70項之方法，其中該細菌係選自以下群組：細黃鏈黴菌、灰色鏈黴菌、環圈鏈黴菌、糞生鏈黴菌、小鏈黴菌、淡紫灰鏈黴菌、白綠鏈黴菌、紫紅鏈黴菌及禾粟鏈黴菌。
如申請專利範圍第70項之方法，其中該細菌為細黃鏈黴菌。
一種表現載體，其包含編碼選自如申請專利範圍第65-68項中任一項之核酸序列的多肽亞單位之基因。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第73項之載體。
一種用於製備谷氏菌素或谷氏菌素類似物之方法，其包含以下步驟： a)構建含有如申請專利範圍第65-68項中任一項之核酸序列的重組表現載體；b)以含有步驟a)之核酸序列的表現載體將宿主細胞轉化以產製轉化株；c)培養該步驟b)之轉化株；及d)將該谷氏菌素或谷氏菌素類似物從步驟c)之轉化株的培養產物中分離出並純化。
一種基因轉殖之原核細胞，其包含編碼與選自以下群組之至少一種胺基酸序列具有至少70%之序列同一性的胺基酸序列之核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。
一種與SEQ ID NO：13之核苷酸序列具有至少70%之序列同一性之核酸序列，其係可操作地連接至少一種用於指導該序列表現之外源性和/或異源性調控元件。
如申請專利範圍第77項之核酸序列，其進一步包含與SEQ ID NO：17之核苷酸序列具有至少70%之序列同一性的核酸序列。
如申請專利範圍第77或78項之核酸序列，其進一步包含與選自以下群組之核苷酸序列具有至少70%之序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：41。
一種與選自以下群組之核酸序列具有至少70%之序列同一性之核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：41，其進一步包含含有外源性限制性內切酶裂解部位之核酸序列。