CN1275649C - 抗o型和a型口蹄疫病毒双价多肽疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种抗O型和A型口蹄疫病毒的二价多肽疫苗，用化学合成法合成编码O型口蹄疫病毒VP1蛋白中21～40、141～160位氨基酸的小肽基因，将其组成串联结构；编码A型口蹄疫病毒VP1蛋白21～40、138～160位氨基酸的小肽基因，将其组成串联结构；加入编码适当氨基酸多肽的核苷酸作为接头，然后将这两个串连重复序列连接构成一编码O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原决定簇的融合基因，将此融合基因插入表达载体，经发酵制备成疫苗，该疫苗安全性好，效果显著，对豚鼠有理想的保护效果。
Description
技术领域
本发明属遗传工程技术领域，具体涉及一种以O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的VP1蛋白的主要抗原决定簇构成的能抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的二价多肽疫苗及其制备方法。
背景技术
国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。家畜口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。预防接种是控制该病毒的主要手段。根据免疫原性，有A、O、C、SATI、SATII、SATIII及Asia I共7个血清型及65个以上的亚型。口蹄疫病毒(FMDV)各型之间无交叉免疫反应，一种类型的疫苗不能保护家畜免受另一种类型病毒的感染，已经发现在许多地区会有一个以上病毒流行，如果用一个型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性，为了克服这种免疫的局限性，因此研制抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒二价多肽疫苗有重要的实践意义。
在各种预防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果稳定等优点具有广阔的应用前景，与口蹄疫病毒免疫原性密切相关的是其外壳蛋白VP1基因，该蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位，本发明以O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的VP1蛋白的主要抗原决定簇构成多肽疫苗。
发明内容
本发明的目的是提出一种能同时抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的二价多肽疫苗及其制备方法。
本发明提出的抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒二价多肽疫苗，是以编码O型口蹄疫病毒的VP1蛋白21ヘ40、141ヘ160位氨基酸的DNA序列，以及A型口蹄疫病毒的VP1蛋白21ヘ40、138ヘ160位氨基酸的DNA序列构成一个串联基因。
FMDV抗原多肽采用O型口蹄疫病毒VP1蛋白中2个主要抗原表位，即21ヘ40、141ヘ160二个氨基酸肽段，并将其组成141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的串联结构，A型口蹄疫病毒VP1蛋白中2个主要抗原表位，即21ヘ40、138ヘ160二个氨基酸肽段，并将其组成138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA的串联结构并且在肽段连接处加入一些氨基酸多肽作为接头，如后述实施例中采用141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的抗原多肽结构，前后两个接头分别是2个和11个氨基酸，其中前一接头的2个氨基酸为Pro-Gly，后一接头的11个氨基酸为Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg。
然后将抗O型FMDV结构为141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的抗原多肽和抗A型FMDV结构为138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA的抗原多肽连结成融合蛋白，其结构分别为138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA-141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的融合蛋白或141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA-138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA的融合蛋白，两个抗原多肽间的接头氨基酸序列为Gly-Ser-Met-Leu，该融合基因在大肠杆菌中可表达抗O型和A型口蹄疫病毒的二价多肽抗原蛋白，其结构如图1所示。
本发明中，所采用的串联结构的O型FMDV抗原基因序列为SEQ ID NO.1，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2，A型FMDV抗原基因序列为SEQ ID NO.3，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.4；抗O型FMDV和A型FMDV抗原基因序列其一种为SEQ ID NO.5，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.6；抗O型FMDV和A型FMDV抗原基因序列其一种为SEQ ID NO.7，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
其结构特征为：
抗原基因的两端各有一个拷贝的编码141ヘ160或138ヘ160位氨基酸的DNA序列，中间是一个拷贝的编码21ヘ40位氨基酸的DNA序列；连接这些序列的两个接头分别是2个和11个氨基酸。
在基因水平上将二个串联结构连接形成融合基因，表达获得融合蛋白。该融合蛋白具有下列特点：
(1)在基因水平上，整个融合基因大小约为500bp。
(2)在蛋白水平上，其中21ヘ40位氨基酸肽段是一针对T细胞的抗原表位，141ヘ160位，138ヘ160氨基酸肽段是一种对B细胞的抗原表位。整个融合蛋白分子量约为18kDa。
(3)本发明中，为了选择最佳肽段，保持高的抗病毒免疫原性，FMDV抗原多肽中21ヘ40AA可任意改动1个氨基酸；141ヘ160AA可任意改动1-5个氨基酸。
(4)本发明提出的新型疫苗用于免疫易感动物，预防口蹄疫的发生。该双价口蹄疫病毒多肽疫苗最适用于预防猪，牛，羊O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的感染。
本发明还提出了上述抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒双价多肽疫苗的制备方法，包括基因制备、重组和融合蛋白的表达等，其步骤如下：用化学合成方法合成编码VP1蛋白21ヘ40、141ヘ160、138ヘ160位氨基酸的DNA序列，在DNA水平上连接成完整抗原基因，然后将上述融合基因插入表达质粒载体，并转入大肠杆菌菌株。将菌株置于细菌培养基中，培养温度在30℃到37℃之间，培养时间8到25小时，然后收集菌体；若所用质粒为原核表达质粒，则将菌体破碎，离心收集含有融合蛋白的包含体，将包含体配成油乳剂，即可获得双价多肽疫苗，用于直接注射家畜。
本发明提出的疫苗在制备过程中，采用了化学合成，基因克隆与序列测定、序列分析、基因重组等基因工程技术与方法。并用SDS-PAGE蛋白检测方法，Western blotting、T细胞增殖实验、豚鼠及猪抗病毒能力检测等免疫学方法检测了该疫苗的功效。
SDS-PAGE电泳检测证明表达获得的融合蛋白分子量与预期一致(见图2)。图中条带“1”是蛋白质分子量marker；条带“2”是空白质粒pTrcHis转化Top10蛋白表达条带。条带“3”是重组质粒pTrcHis-O-A转化Top10的蛋白表达条带，可见表达出分子量为20KD的蛋白质条带。
Western blotting检测证明该融合蛋白具有很强的抗原性，能分别与A型口蹄疫病毒标准抗体和O型口蹄疫病毒标准抗体发生特异的抗原抗体反应。条带“4”，“6”与条带“2”对应，说明菌体及载体自身蛋白与A型口蹄疫病毒标准抗体和O型口蹄疫病毒标准抗体之间无特异性的抗原抗体反应。条带“5”和“7”与条带“3”对应，可见该融合蛋白既能与O型口蹄疫病毒发生特异的免疫反应其中(条带“5”)，又能与A型口蹄疫病毒发生特异的免疫反应(条带“7”)，结果见图2。
用该疫苗免疫豚鼠，取免疫豚鼠血清，用中国农科院兰州兽医研究所免疫诊断室生产的A型FMDV Elisa试剂盒和O型FMDV Elisa试剂盒测定特异性抗体的滴度，结果见表1。
用该疫苗免疫豚鼠，一定时间后以O型口蹄疫病毒，A型口蹄疫病毒进行攻击。结果证明该疫苗对豚鼠具有较好的保护效果(A型口蹄疫病毒的保护率为71％，O型口蹄疫病毒的保护率为85％)，保护效果见表2。
附图说明
图1为本发明多肽疫苗的串联基因结构图示。
图2为本发明多肽疫苗的融合蛋白的性能图示。
具体实施方式
下面以抗O型口蹄疫病毒，A型口蹄疫病毒双价多肽疫苗为例进一步具体描述本发明。
化学合成O型口蹄疫病毒VP1基因中编码21ヘ40、141ヘ160位氨基酸片段的DNA序列，串联成为141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA(见序列表Seq1及Seq2)，和A型口蹄疫病毒VP1基因中编码21ヘ40、138ヘ160位氨基酸片段的DNA序列，串联成为138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA(Seq3及Seq4)的一级结构。将抗O型FMDV结构为141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的抗原多肽和抗A型FMDV结构为138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA的抗原多肽连结成融合蛋白，其结构分别为138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA-141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的融合蛋白(Seq5及Seq6)，两个抗原多肽间的接头氨基酸序列为Gly-Ser-Met-Leu，该融合基因在大肠杆菌中可表达抗O型和A型口蹄疫病毒的二价多肽抗原蛋白，将质粒载体pTrcHis以限制性内切酶酶切，将该片段与串联抗原基因混合，在T4Ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA，转化大肠杆菌Top10菌株的感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板中，37℃倒置过夜。随意挑取转化子，分别以酶切鉴定，DNA测序分析鉴定转化子，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因序列与设计相符。将此克隆命名为pTrcHis-O-A。
将pTrcHis以含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，30℃下通气培养8-25小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5分钟。超声后5000rpm离心20分钟收集包涵体。并配成油乳剂，即可获得一种新型的抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的双价多肽疫苗。
该疫苗所涉及的融合蛋白SDS-PAGE电泳检测结果表明融合蛋白在大肠杆菌Top10中得到高效表达结果(附图2)，Western blotting检测结果表明该融合蛋白具有很强的抗原性，能分别与A型口蹄疫病毒标准抗体和O型口蹄疫病毒标准抗体发生特异的抗原抗体反应(附图2)。该疫苗免疫豚鼠后检测FMDV特异性抗体的滴度，结果表明该融合蛋白诱导豚鼠产生高滴度的抗A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的特异性抗体，见表1。抗A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒能力检测结果表明该疫苗免疫豚鼠后对A型口蹄疫病毒的保护率为70％，O型口蹄疫病毒的保护率为85％，见表2。
表1 免疫后豚鼠FMDV特异性抗体的滴度
| Test samples | 豚鼠个数 | 免疫后天数 | |
| 21 | 42 | ||
| 对照组免疫组 | 77 | 0 | 0(titers to FMDV type A) |
| 02.1 | 0(titers to FMDV type O)4.3(titers to FMDV type A) | ||
| 2.2 | 3.9(titers to FMDV type O) | ||
表2 融合蛋白对豚鼠的免疫保护效果
| 疫苗 | 疫苗免疫剂量 | 病毒攻击剂量 | 实验豚鼠数 | 被保护豚鼠数 | 保护率 |
| 免疫组1免疫组2对照组1对照组2 | 400ug400ug00 | 100ID50/0.2ml(A型FMDV)100ID50/0.2ml(O型FMDV)100ID50/0.2ml(A型FMDV)100ID50/0.2ml(O型FMDV) | 7777 | 5600 | 70％85％00 |
本发明涉及的基因序列及其编码的氨基酸序列
SEQ ID NO.1：
GTG AGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT
CAC TCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA
CTG CCC CCC GGT GAG ACA CAG GTC CAG AGA CGC CAG CAC ACG GAT ATC TCG TTT
GAC GGG GGG CCA CTC TGT GTC CAG GTC TCT GCG GTC GTG TGC CTA TAG AGC AAA
ATA CTA GAC AGA TTT GTG CAG TTT GAG CTG GAG TTT ATG GTG CCC AGC AGG GTG
TAT GAT CTG TCT AAA CAC GTC AAA CTC GAC CTC AAA TAC CAC GGG TCG TCC CAC
AGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTG
TCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GAC
CCC
GGG
SEQ ID NO.2：
N端-VSNVRGDLQVLAQKAERVLPPGETQVQRRQHTDISFILDRFVQFELEFMVPSRVSNVRGDLQVLAQ
KAERVLP-C端
SEQ ID NO.3：
ATG ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG CGC GTT
TAC TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC GCG CAA
GCT GCA CAG TTT CCC GCT CCC GGC GAG ACA CAA GTT CAA CGC CGC CAG CAC ACC
CGA CGT GTC AAA GGG CGA GGG CCG CTC TGT GTT CAA GTT GCG GCG GTC GTG TGG
AAT GTT GGC TTC ATC ATG GAC CGC TTT GTT CAA TTC GAG CTG GAG TTC ATG GTT
TTA CAA CCG AAG TAG TAC CTG GCG AAA CAA GTT AAG CTC GAC CTC AAG TAC CAA
CCC TCC CGT ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG
GGG AGG GCA TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC
CGC GTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT TGA GGA TCG AAG CTT
GCG CAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA ACT CCT AGC TTC GAA
SEQ ID NO.4：
N端-MTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAPGETQVQRRQHTNVGFIMDRFVQFELEFMVPSRTGNAGRRGDLGSLA
ARVAAQFPAZGSKL-C端
SEQ ID NO.5：
ATG ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG CGC GTT
TAC TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC GCG CAA
GCT GCA CAG TTT CCC GCT CCC GGC GAG ACA CAA GTT CAA CGC CGC CAG CAC ACC
CGA CGT GTC AAA GGG CGA GGG CCG CTC TGT GTT CAA GTT GCG GCG GTC GTG TGG
AAT GTT GGC TTC ATC ATG GAC CGC TTT GTT CAA TTC GAG CTG GAG TTC ATG GTT
TTA CAA CCG AAG TAG TAC CTG GCG AAA CAA GTT AAG CTC GAC CTC AAG TAC CAA
CCC TCC CGT ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG
GGG AGG GCA TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC
CGC GTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT TGA GGA TCG CTC GAG GTG AGC AAC GTG AGG
GCG CAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA ACT CCT AGC GAG CTC CAC TCG TTG CAC TCC
GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTG CCC CCC GGT GAG
CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GAC GGG GGG CCA CTC
ACA CAG GTC CAG AGA CGC CAG CAC ACG GAT ATC TCG TTT ATA CTA GAC AGA TTT
TGT GTC CAG GTC TCT GCG GTC GTG TGC CTA TAG AGC AAA TAT GAT CTG TCT AAA
GTG CAG TTT GAG CTG GAG TTT ATG GTG CCC AGC AGG GTG AGC AAC GTG AGG GGT
CAC GTC AAA CTC GAC CTC AAA TAC CAC GGG TCG TCC CAC TCG TTG CAC TCC CCA
GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTG CCC AAG CTT
CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GAC GGG TTC GAA
SEQ ID NO.6：
N端-MTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAPGETQVQRRQHTNVGFIMDRFVQFELEFMVPSRTGNAGRRGDLGSLAA
RVAAQFPAZGSGSLVVSNVRGDLQVLAQKAERVLPPGETQVQRRQHTDISFILDRFVQFELEFMVPSRVSNVRGDLQVLAQKA
ERVLPML-C端
SEQ ID NO.7：
GTG AGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT
CAC TCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA
CTG CCC CCC GGT GAG ACA CAG GTC CAG AGA CGC CAG CAC ACG GAT ATC TCG TTT
GAC GGG GGG CCA CTC TGT GTC CAG GTC TCT GCG GTC GTG TGC CTA TAG AGC AAA
ATA CTA GAC AGA TTT GTG CAG TTT GAG CTG GAG TTT ATG GTG CCC AGC AGG GTG
TAT GAT CTG TCT AAA CAC GTC AAA CTC GAC CTC AAA TAC CAC GGG TCG TCC CAC
AGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTG
TCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GAC
CCC GGA TCG CTC GAG ATG ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG
GGG CCT AGC GAG CTC TAC TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC
GCG CGC GTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT CCC GGC GAG ACA CAA GTT CAA CGC CGC CAG CAC
CGC GCG CAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA GGG CCG CTC TGT GTT CAA GTT GCG GCG GTC GTG
ACC AAT GTT GGC TTC ATC ATG GAC CGC TTT GTT CAA TTC GAG CTG GAG TTC ATG GTT
TGG TTA CAA CCG AAG TAG TAC CTG GCG AAA CAA GTT AAG CTC GAC CTC AAG TAC CAA
CCC TCC CGT ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG CGC
GGG AGG GCA TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC GCG
GTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT TGA GGA TCG AAG CTT
CAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA ACT CCT AGC TTC GAA
SEQ ID NO.8：
N端-VSNVRGDLQVLAQKAERVLPPGETQVQRRQHTDISFILDRFVQFELEFMVPSRVSNVRGDLQVLAQKA
ERVLPGSLVMTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAPGETQVQRRQHTNVGFIMDRFVQFELEFMVPSRTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAZGSKL-C端
Claims (3)
1、抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒二价多肽疫苗，其特征在于抗O型FMDV抗原多肽采用O型口蹄疫病毒VP1蛋白中21ヘ40、141ヘ160位氨基酸肽段，并组成141ヘ160AA-21ヘ40AA--141ヘ160AA的串联结构；抗A型FMDV抗原多肽采用A型口蹄疫病毒VP1蛋白中21ヘ40、138ヘ160位氨基酸肽段，并组成138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA的串联结构；并在肽段前一连接处加入2个氨基酸(Pro-Gly)，在后一连接处加入11个氨基酸(Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg)多肽作为接头构成串联重复多肽；
抗O型FMDV结构为141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的抗原多肽和抗A型FMDV结构为138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA的抗原多肽连结成融合蛋白，其结构分别为138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA-141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的融合蛋白或141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA-138ヘ160AA-21ヘ40AA-138ヘ160AA的融合蛋白，两个抗原多肽间的接头氨基酸序列为Gly-Ser-Met-Leu；
其中，具有串联结构的O型口蹄疫病毒FMDV抗原基因序列为：SEQ ID NO.1，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2；A型口蹄疫病毒FMDV抗原基因序列为：SEQ ID NO.3，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
2、根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒抗原基因序列一种为：SEQ ID NO.5，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ IDNO.6。
3、根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒抗原基因序列另一种为：SEQ ID NO.7，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ IDNO.8。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20060920 Termination date: 20091207 |