CN1357047A - 重组融合蛋白,含该重组融合蛋白的(疫苗)组合物及其制备方法 - Google Patents
重组融合蛋白,含该重组融合蛋白的(疫苗)组合物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1357047A CN1357047A CN00808467.XA CN00808467A CN1357047A CN 1357047 A CN1357047 A CN 1357047A CN 00808467 A CN00808467 A CN 00808467A CN 1357047 A CN1357047 A CN 1357047A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vaccine
- stx2e
- fragment
- end mark
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 35
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 28
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 27
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 24
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 22
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 101150012509 sub gene Proteins 0.000 claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 6
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 claims description 4
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 claims description 4
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 claims description 3
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 claims description 3
- 208000032923 Lobar pneumonia Diseases 0.000 claims description 3
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 claims description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 claims description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 claims description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 claims description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 239000008307 w/o/w-emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 3
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 108010091769 Shiga Toxin 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical class CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 201000008283 Atrophic Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 201000000297 Erysipelas Diseases 0.000 description 1
- 241000186811 Erysipelothrix Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010039088 Rhinitis atrophic Diseases 0.000 description 1
- 206010039361 Sacroiliitis Diseases 0.000 description 1
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 description 1
- 206010058556 Serositis Diseases 0.000 description 1
- 108010090763 Shiga Toxin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000000648 angioblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000010352 nasal breathing Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及重组融合蛋白,该蛋白质含有和末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)亚基因Stx2e片段,该末端标记物的大小约相当于该片段或该片段一部分的大小。
Description
本发明涉及一种重组融合蛋白，含该重组融合蛋白的(疫苗)组合物及该重细融合蛋白的制备方法。
猪的水肿病是由形成志贺菌毒素的大肠杆菌(STEC)引起的。这种病原体对这种临床疾病唯一负责的主要毒性因素是2e志贺菌毒素(Stx2e)(Mac Leod等人，1991)。由于这种疾病在大多数情况下发病甚急，开始治疗时又大多太迟，或者未取得预期的效果，因而研究一种有效的预防方法是很有意义的。但是，Stx2e的制备和彻底纯化都存在问题
Stx2e的B亚单位由于各种原因被考虑用作疫苗候选物。它是从康复猪仔的血清中鉴定的，即它具有抗原决定族。其次，该毒素的B-亚单位在胃肠外施用之后诱导中和毒素的抗体形成(Acheson等人1996；Boyd等人1991)。籍助基因工程方法成功地制备了一种重组融合蛋白，该融合蛋白由Stx2eB亚单位和Shistosoma Japonicum的谷胱甘肽-S-转移酶的片段组成(Franke等人1995)。对患水肿病的断奶仔猪的病原体排泄以及对STEC感染的免疫反应进行了长时间的研究。为证明Stx2e抗体存在所用的由Stx2eB亚单位和谷胱甘肽S-转移酶片段组成的重组融合蛋白很好地适宜于间接证明STEC感染，迄今被视为预防水肿病的潜在疫苗(Wieler L.H.，Franke Sylvia，Rose M.和Karch H.：用一种志贺菌类毒素IIe的重组B-亚单位表征猪水肿病的免疫响应，在BadNau-heim 21.DVG会议上的报告(1995.3))。
因此，本发明的目的在于，提供适用于接种目的的重组融合蛋白，编码它的质粒，用于与水肿，特别是猪水肿相关的各种不同用途的含该融合蛋白的(疫苗)组合物以及该重组融合蛋白的制备方法。
该目的是通过具有权利要求1特征的重组融合蛋白，具有权利要求5特征的(疫苗)组合物，符合权利要求18的含质粒的大肠杆菌菌株和具有权利要求20特征的方法来实现的。本发明的其它方面描述在从属权利要求中。
本发明提供一种重组融合蛋白和一种含有这种重组融合蛋白的(疫苗)组合物，它们可以用于有关水肿病，尤其是猪水肿病的各种用途。尤其考虑下列用途：
-证明抗Stx2e的抗体，
-诊断水肿病，
-产生抗水肿病病原体毒素的单克隆抗体，尤其是作为检查制备重组融合蛋白的收率的基础或通过免疫亲和层析纯化制备全毒素的基础，
-针对水肿病，尤其是猪水肿病的免疫。
重组融合蛋白是2e志贺菌毒素的亚基因Stx2e片段和一种末端标记物的融合物，该末端标记物大小大约相当于该片段的大小或该片段一部分的大小。末端标记物是该蛋白质氨基酸序列的标记的末端基团。该亚基因Stx2e片段优选是2e志贺菌毒素的B亚单位(Stx2eB)。末端标记物的大小最大优选为5kDa，其最大更优选为1kDa。该末端标记物还优选是氨基末端His-标记物。该His-标记物包含6个细氨酸。其大小约为0.66kDa。
重组融合蛋白具有天然蛋白质的实质性抗原域。这是其适宜于水肿病相关各种用途的原因。的确，这还是理论性的，在迄今所知的由Stx2eB亚单位和谷胱甘肽-S-转移酶的片段细成的重组融合蛋白已证明这点。但是，这里存在的问题是，按申请人的估计，必须考虑干扰性的免疫反应，它们防碍属间的融合蛋白(generic fusion protein)对，例如，治疗目的的应用。相反，本发明的融合蛋白的显著优点在于，这里由于专门选择的标记物，可不考虑干扰性的免疫反应，从而第一次提供了能在疫苗中应用的融合蛋白。如属间的融合蛋白一样，本发明所采用的标记物亦对制备重组融合蛋白有利，尤其对其纯化，例如通过亲和层析方法的纯化有利。
交联His-Stx2eB单体的低聚物能特别有效地形成融合蛋白。
按照一个有利的方面，(疫苗)组合物除了重组融合蛋白之外还包含至少一种外加抗原。疫苗组合物是免疫原性量的重组融合蛋白和免疫原性量的至少一种外加抗原的配方。用这种组合疫苗可同时实现对猪水肿病和至少一种其它疾病的免疫接种。
(变苗)组合物除了重组的融合蛋白之外可以包含至少一种外加抗原，该外加抗原选自含有与细胞结合的类毒素的多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)菌苗，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)菌苗，猪缸斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)抗原，多杀巴斯德氏菌D型和/或大肠杆菌和/或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的一种或多种可溶性非细胞类毒素(non-cell toxiods)，多杀巴斯德氏菌A或D型的灭活全细胞，大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、以及猪生殖和呼吸综合征病毒(Porcine Reproduction and Respiratory SyndromVirus)、流感病毒、假狂犬病病毒和猪环状病毒I和II的培养物。
已知前面所提及的抗原是下列疾病的原因：
-多杀巴斯德氏菌和支气管炎博德特氏菌引起猪进行性萎缩性鼻炎，亦称“吸鼻涕病”；在致病方面，主要是多杀巴斯德氏菌毒素起重要作用(商用疫苗中该类毒素成分是重要的)。
-多杀巴斯德氏菌A和D型引起猪的呼吸道疾病(肺炎)，多杀巴斯德氏菌D亦引起鼻呼吸阻塞病。
-猪红斑丹毒丝菌引起猪丹毒病
-大肠杆菌引起腹泻病(猪水肿病是其中一种特殊形式)(毒素起决定作用)
-产气荚膜梭菌引起乳猪坏死性肠炎(毒素起决定作用)
-大叶性肺炎放线杆菌引起出血坏死性胸膜肺炎
-副猪嗜血菌：格拉瑟病(纤维蛋白性浆膜炎和关节炎)
-猪链球菌：链球菌败血症
-猪肺炎支原体引起地方性兽肺炎，亦称“仔猪流感”
-猪生殖和呼吸综合征病毒：仔猪呼吸道病(肺炎)，母猪不育症
-流感病毒：呼吸道病
-假狂犬病病毒引起猪的奥耶斯基病(假狂犬病)
-猪环状病毒I和II：断奶后多系统消瘦(Post-weaningmultisystemicwasting)综合征。
该至少一种外加抗原优选这样选择，即它与一种疾病有关，该疾病典型地与水肿病在大致相同的年龄侵害猪。上面所引的抗原基本上是这种情况。因而此疫苗组合物使得可以特别有效地联合接种。
该疫苗组合物中优选含有重组融合蛋白和/或该至少一种外加抗原，每一种的量为免疫原性量，用于抗猪水肿病及其它病毒和/或细菌感染的猪接种。
此外，本发明涉及疫苗组合物，其成份和/或数量这样选择，即相关动物对至少一种疾病的免疫可通过先后和/或同时接种疫苗细合物实现。
对疫苗细合物，特别重要的是佐剂的选择。例如可采用W/O/W乳剂(例如ISA206)，W/O乳剂(例如iFA不完全弗氏佐剂)，水性悬浮剂(例如氢氧化铝)或0/W乳剂。
按照本发明的方法，为了重组制备与末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)的亚基因片段，在一合适的载体系统中从Stx2e操纵子克隆亚单位，产生的重组质粒转化至大肠杆菌菌株中，诱导所产生的表达系统，该融合蛋白被表达并被纯化。
将2e志贺菌毒素B-亚单位(Stx2eB)的基因克隆在不同的表达载体中。用这样产生的重细质粒转化各种大肠杆菌K12实验室菌株。将全部转化体在表达研究中在变化的条件下(温度，诱导水平，诱导时间)进行重组B-亚单位形成测试。确定这种转化体或克隆，其重组蛋白相对细胞总蛋白含量的产率最高。对由这种菌株形成的融合蛋白，即含有成熟的B-亚单位和N端His-标记物(His-Stx2eB)的融合蛋白，开发了一种纯化方法，并以实验室规模进行了试验。为了将这种纯化方法在大规模上实施，拟采用应用适宜缓冲体系的FPLC。
实施例
Stx2e重组B亚单位的制备
为了制备重组B亚单位，采用了菌种大肠杆菌Cux-Stx2eB，DSM编号12721(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg I b，D-38124 Brauschweig)。这种大肠杆菌实验室菌株含有质粒pHIT-24，这种质粒克隆了Stx2e的B-亚单位。
从此菌种建立种子分批体系并在-78℃冷藏于2ml低温小瓶中。
为了产生重组B亚单位，将1安瓿工作种子(2ml)融化以便培养预培养物1。
预培养物1的制备条件如下：
培养基：150ml无菌的标准I营养内汤+0.01％氨苄青霉素放入300ml的三角瓶中。培养：37℃，15小时，直立静置培养。
采用带有5升培养容器的发酵罐“BIOSTAT B”制备主要物质。此培养容器装有4L标准I营养肉汤+0.01％氨苄青霉素，并作为一单元在121℃下高压灭菌25分钟。
将预培养物1放入此培养基中，并在下列条件下培养6小时：
温度：37℃
pH＝7.0-7.1
搅拌速度：100-150rpm
空气导入量：2升/分钟
pH的控制通过自动加入无菌的10％NaOH溶液来保证。
诱导在培养6小时之后通过添加0.25mM IPIG溶液(异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)进行，pH从7.1跃至7.5.诱导时间约为3.5小时。
然后将培养物泵入10升收集容器中并在一离心机中以2500xg离心。除去上清液体，粒状沉淀放入200ml 8M尿素缓冲液中并在冷室(4-8℃)放置约15小时.然后对所得重悬沉淀进行超声处理(4×15分钟，190赫兹，0.3秒脉冲)，接着以10000xg离心。上清液体小心取出并进一步处理，丢弃此步骤得到的沉淀。
接着将此溶液籍助超滤(“Pellicon XL”)从200ml浓缩至80ml。
这样得到的80ml蛋白质溶液然后籍助亲和层析(FPLC“ktaexplorer”)进一步处理。
对所得含重组目的蛋白质的材料分份，每份3ml，并送入一装有金属螯合物基质(NI-NTA，Qiagen)的柱(容积：8ml)中。
这种基质专门结合重组蛋白质的His-标记物。
目的蛋白质被金属滞留并在变性的条件下(8M尿素，0.1M Na2HPO4，10mMTris/HCl，pH8)洗涤。
去除污染蛋白质之后，重组蛋白质通过pH跳跃(8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mMTris/HCL，pH3)从亲合基质上脱附并在柱出口被收集。
纯化后的蛋白质籍助交叉流过滤(Cross-Flow-Filtration)(孔尺寸5kDa)浓缩。经过纯化和收率检验之后(通过SDS凝胶电泳，Western印迹，Elisa，蛋白质测定)将尿素缓冲液与一种生理缓冲溶液(PBS，PH7.2)进行交换，交换籍助交叉流过滤(孔尺寸5kDa)实现。
重组蛋白质的浓度为300μg/ml。
重组融合蛋白的描述
目的蛋白质由基因片段Stx2eB编码。Stx2eB亚单位亚基因片段的大小为228bp。
对重组蛋白质的下列性质进行检验：
1.分子量大小
从SDS凝胶电泳得出目的蛋白质的分子量约为7.5kDa.
2.在免疫印迹中用患病仔猪血清检查重组蛋白
对纯化后的抗原用患有水肿病的仔猪血清在免疫印迹进行研究。动物用的是养猪场的仔猪，其中出现明白无误的Stx2e-大肠杆菌菌株的临床症状。这种血清的90％以上与重组蛋白质呈阳性反应。为了排除错误的阳性结果，曾用偶联在Schistosoma japonicum谷胱甘肽S转移酶上的B-亚单位确证了该研究。
3.用抗Stx2eB单克隆抗体检查重组蛋白质。
为了确定重组B-亚单位的结构是否与野生型蛋白质相近，曾用斑点印迹方法对重组Stx2eB进行了研究。为此采用了单克隆抗体BC5BB12，该抗体特异识别Stx2的B-亚单位并与Stx2eB亚单位发生交叉反应。作为阳性检验，引入Stx2e全毒素。作为阴性检验采用一种Stx1的粗毒素制剂。
单克隆抗体BC5BB12既与Stx2e全毒素反应又与重组Stx2eB蛋白质反应，但不与Stx1反应。
4.在Vero细胞试验中检验重组蛋白质的细胞毒性
重组蛋白的细胞毒性在对Vero细胞，Hela细胞以及MDBK细胞的毒性试验中进行了研究。为此目的，应用了浓度为0.3μg/ml-100μg/ml的重组Stx2eB。即使在最低的稀释阶段也未能在被研究的细胞系中发现与阴性实验(无重组蛋白质的缓冲液)有显著的差别。结果征实，重组的Stx2eB本身不带细胞毒性。
5.家兔试验证明重组Stx2eB的免疫性。
使两只品种为“Weiβe Neuseel鋘der”，兔龄约为12个月的雄家兔接受重组Stx2eB免疫。第一次接种时，皮下注射添加有不完全弗氏佐剂(iFA)的100μg抗原。六星期之后皮下注射50μg重组Stx2eB加强免疫，同样添加iFA。对接种前后得到的血清在免疫印迹上进行试验。
在两只兔子中皆证明有特异的血清转换。
疫苗制剂制备的描述(实施例)
1.W/O/W疫苗制剂的制备
在无菌条件下将抗原作为水相(温度22℃)在搅拌下(速度＜2000rpm)连续加入佐剂(例如Montanide ISA206)，然后乳液在约2000rpm下匀化10分钟。
在8℃下放置24小时之后将疫苗制剂重新匀化。用显微镜和染色试验检验相位(Phasenlage)。
2.W/O疫苗制剂的制备。
在无菌条件下将抗原作为水相(温度22℃)在搅拌下(速度＜2000rpm)连续加入佐剂(例如不完全弗氏佐剂)并进行乳化。
用显微镜和染色试验检验相位。
3.水相悬浮物的制备。
在无菌条件下将水性抗原在搅拌下(例如磁力搅拌器)连续加入水性佐剂(例如氢氧化铝)并进行搅拌。
疫苗根据参数pH和渗涨度(tonizitt)检验。
4.O/W-悬浮物的制备。
在无菌条件下将水相抗原连续加入佐剂并进行乳化。
用显微镜和染色试验检验相位。
疫苗制剂制成之后直至进一步应用之前皆在+4℃-+8℃的温度下置于冰箱中存放。
应用不同疫苗制剂证明重组Stx2eB对目标动物猪的免疫原性作用的例子
试验目的
研究的问题：基因工程方法制备的重组Stx2eB蛋白质(应用不同佐剂的条件下)能否在两次肌肉注射之后在仔猪体内诱导免疫反应？
为进行此试验用了8只年龄为6周的仔猪。
用疫苗制剂处理6只动物，2只动物给予一种安慰剂。
接种，间隔3周施用疫苗2次。
从每只动物采集下列血样：
1.第1次免疫之前
2.第1次免疫之后14天
3.直接在第2次免疫之前(第1次免疫之后21天)
4.第2次免疫之后14天
5.第2次免疫之后21天
血清用Elisa检查重组Stx2eB的特异性抗体的存在。此外还评价了疫苗的相容性和安全性值。一般的试验数据动物动物种类：猪动物类别：Absetzer年龄：6周(第1次免疫时)性别：混杂试验开始时动物的免疫状况：Stx2eB抗体阴性饲养方式：分组饲养喂养方案：随意水供应：由自来水管随意供应饲料添加剂的应用：无疫苗接种参数施用方法：注射施用途径：肌内两次免疫注射的间隔：3周所用疫苗的预处理：无试验动物的预处理：无被免疫动物数目：8对照动物：2研究方案：随机化，盲试接种剂量，动物特征，疫苗使用具体试验计划列于表l。关键佐剂佐剂A-ISA206佐剂B-iFA佐剂C-Montanide试验进程副反应的出现：在第1次免疫后-一般状况和进食有轻微影响，动物7和8体温稍增+轻微腹泻。
在第2次免疫后-除动物8体温增高外无其它副反应。
在试验过程中被淘汰的动物数：
仔猪2，原因：大肠杆菌引起的胃和肠炎
与接种无关的疾病的出现：
除仔猪2的疾病外，无
用其它药剂治疗：无
结果
疫苗制剂的相容性和安全性：
总体评估，疫苗制剂是相容的和安全的，虽然在第1次免疫之后动物7和8的一般状况稍有干绕，进食受到短时间不利影响，体温增高及轻微腹泻。第2次免疫未出现临床症状。只有动物8对再次注射疫苗出现体温升高的反应。
局部组织反应—触诊发现轻微水肿-仅动物5和6在第1次免疫后在注射处出现。
在仔猪宰杀之后，除动物1和3之外皆在注射通道(Strichkanal)周围发现宏观可识别的炎症，全部动物的炎症处皆被坏死材料塞满。对仔猪1和3的组织学研究能发现，只有结缔组织轻微增生(成血管细胞渗有淋巴细胞和组织细胞)，而所有其它仔猪被坏死材料填满的注射通道皆被一种结缔组织的被膜包围。在结缔组织的被膜上可观察到带淋巴细胞和组织细胞渗入的炎症。
疫苗制剂的有效性
这组试验表明，重组Stx2eB在年龄6周的仔猪肌内注射后，可被动物免疫系统识别并诱发免疫反应，产生特异性的免疫球蛋白。
可籍助Elisa和免疫印迹证明这种抗体的存在。
免疫反应的强度似乎取决于所采用的疫苗制剂选取。
在所选的试验条件下，W/O乳剂(例如在采用iFA的条件下)可达到最佳效果。表2列出了详细结果。
表1：被测样本、动物体重和注射的疫苗量
| 动物编号 | 名称 | 组成 | 有效组份含量 | 猪的数目/VM | 体重(kg) | 注射疫苗量(ml) |
| 1 | Stx2eB疫苗G27V27 | PBS佐剂A | - | 2 | 12，5 | 2，2 |
| 3 | 01安慰剂 | Thiomersal | 12，5 | 2，2 | ||
| 2 | Stx2eB疫苗 | rStx2eB佐剂A | 0，167mg/ml | 2 | 15 | 2，7 |
| 4 | G97V27-02 | Thiomersal | 13 | 2，3 | ||
| 5 | Stx2eB疫苗 | rStx2eB佐剂B | 0，167mg/ml | 2 | 16 | 2，9 |
| 6 | G97V27-03 | Thiomersal | 12，5 | 2，2 | ||
| 7 | Stx2eB疫苗 | rStx2Eb佐剂C | 0，250mg/ml | 2 | 14 | 2，5 |
| 8 | G97V27-04 | Thiomersal | 14 | 2，5 |
表2：免疫试验得出的猪血清试样的抗-Stx-B2e的血清检验结果
| 注射物 | 免疫印迹结果/ELISA(ELISA单位) | ||||||||||||||
| 27.1.1998 | 10.2.1998 | 17.2.1998 | 3.3.1998 | 10.3.1998 | |||||||||||
| 编号 | IB | ELISA | 编号 | IB | ELISA | 编号 | IB | ELISA | 编号 | IB | ELISA | 编号 | IB | ELISA | |
| 安慰剂佐剂A | l | - | -(236)* | 9 | - | -(357，6) | 17 | - | -(359，6) | 25 | - | -(258，3) | 33 | - | -(398) |
| 3 | - | +(403) | 11 | - | -(356，3) | 19 | - | -(328) | 27 | - | ？(1130) | 35 | - | -(380，3) | |
| rStx2eB佐剂A | 2 | - | -(231) | 10 | / | / | 18 | / | / | / | / | / | / | / | / |
| 4 | - | -(221) | 12 | - | -(350，3) | 20 | - | +(436) | 28 | - | +(432，3) | 36 | - | -(345) | |
| rStx2eB佐剂B | 5 | - | (+)357 | 13 | ++ | +++(1133，3) | 21 | ++ | +++(1849，6) | 29 | ++ | +++(2767) | 37 | ++ | +++(2908) |
| 6 | - | -(281，3) | 14 | (+) | +(432，6) | 22 | + | ++(691，3) | 30 | ++ | +++(819，3) | 38 | + | +++(1095，3) | |
| rStx2EB辅剂C | 7 | - | -(233，6) | 15 | - | +(474，6) | 23 | (+) | +(539，3) | 31 | + | +(473，6) | 39 | - | +(411) |
| 8 | - | -(241) | 16 | - | +(425) | 24 | (+) | +(473) | 32 | - | +(411，6) | 40 | - | -(389，3) | |
+阳性检验+++(808)；阴性检验-(187，3)
保藏的微生物
大肠杆菌菌株Cux-Stx2eB以原始名称：Cux-SLT-IIe-B，保藏在
德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Brauschweig)。
该保藏单位指定的该微生物保藏号为DSM 12721。
| 申请人案卷号 | 国际申请号 |
关于保藏的微生物的说明
(PCT实施细则第13条之二)
PCT/RO/134表
| A.以下所作的说明涉及说明书第12页第2-5行所指的微生物。 | |
| B.保藏物标识 更多的保藏物标识见附页口 | |
| 保藏单位名称：DSMZ-德意志微生物保藏中心 | |
| 保藏单位地址(包括邮政编码和国家)：Mascheroder Weg 1bD-38124 Braunschweig/DE | |
| 保藏日期：1999年03月09日 | 保藏编号：DSM 12721 |
| C.其它说明(如果不适用则留空) 该信息续在附页上口 | |
| 微生物的科学名称、特征，接收处发布的保藏证明和存活证明见下列文件：申请人在1999年3月5/8日第一次保藏期间所作的声明，及附件(附件1)；1999年3月11日DSMZ第一次保藏期间发布的保藏证明(附件2)；1999年3月11日DSMZ发布的存活证明(附件3) | |
| D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国) | |
| E.单独提交的说明(如果不适用则留空) | |
| 以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”) | |
| 本栏由受理局填写 |
| 口本页和国际申请一起收到 |
| 核准人签字 |
| 本栏由国际局填写 |
| 口国际局于以下日期收到本页：年 月 日 |
| 核准人签字 |
Claims (31)
1.重组融合蛋白，其包括与末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)亚基因Stx2e片段，此末端标记物的大小约相当于该片段或该片段一部分的大小。
2.根据权利要求1的重组融合蛋白，其中该亚基因Stx2e片段是2e志贺菌毒素的B亚单位(Stx2eB)。
3.根据权利要求1或2的重组融合蛋白，其中末端标记物的大小最大为1kDa。
4.根据权利要求1-3之任一项的重组融合蛋白，其带有氨基末端His标记物。
5.根据权利要求1-4之任一项的重组融合蛋白，其具有许多交联的融合蛋白质。
6.用于与动物，尤其是哺乳动物，具体地是猪的水肿病有关的各种应用的(疫苗)组合物，该组合物具有与末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)亚基因片段，此末端标记物的大小约相当于该片段或该片段一部分的大小。
7.根据权利要求6的(疫苗)组合物，其中该亚基因Stx2e片段是2e志贺菌毒素的B亚单位(Stx2eB)。
8.根据权利要求6或7的(疫苗)细合物，其中末端标记物的大小为1kDa。
9.根据权利要求6-8之任一项的(疫苗)组合物，其带有氨基末端His标记物。
10.根据权利要求6-9之任一项的(疫苗)细合物，其具有许多交联的融合蛋白。
11.根据权利要求6-10之任一项的(疫苗)组合物，其还包含一种外加抗原或多种外加抗原。
12根据权利要求11的(疫苗)组合物，其中所述一种外加抗原或多种外加抗原选自含有与细胞结合的类毒素的多杀巴斯德氏菌菌苗，支气管炎博德特氏菌菌苗，猪红斑丹毒丝菌抗原，D型多杀巴斯德氏菌和/或大肠杆菌和/或产气荚膜梭菌的一种或多种可溶性非细胞类毒素，A型或D型多杀巴斯德氏菌的灭活全细胞，大叶性肺炎放线杆菌、副猪嗜血菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、以及猪生殖和呼吸综合征病毒、流感病毒、假狂犬病病毒和猪环状病毒I和II的培养物。
13.根据权利要求6-12之任一项的(疫苗)组合物，其包含与末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)亚基因Stx-IIe片段和/或包含至少一种外加抗原，每一种的量为免疫原性量，用于接种猪以防治猪的水肿病或防治猪的水肿病及其它病毒和/或细菌感染。
14.根据权利要求6-13之任一项的(疫苗)组合物，其组成和数量能使它们在先后和/或同时接种猪后对猪的水肿病或猪的水肿病及其它病毒和/或细菌感染产生免疫。
15.具有与末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)亚基因Stx2e片段的，尤其是根据权利要求6-12之任一项的(疫苗)细合物，该组合物是一种W/O/W乳剂，一种O/W乳剂，一种W/O乳剂或一种水性悬浮液。
16.根据权利要求15的(疫苗)组合物，其含有不完全弗氏佐剂(iFA)。
17.质粒，其含有编码权利要求1-6之任一项的融合蛋白质的DNA。
18.用权利要求17的质粒转化的大肠杆菌菌株。
19.权利要求18的大肠杆菌菌株，其保藏在DSMZ-德意志微生物保藏中心，保藏编号为DSM 12721。
20.与末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)亚基因片段的重组制备方法，其中将Stx2e操纵子的亚单位克隆到适宜的载体系统中，将产生的重组质粒转化至一种大肠杆菌菌株中，诱导所产生的表达系统，表达和纯化该融合蛋白。
21.根据权利要求20的方法，其中该亚基因片段是2e志贺菌毒素的B亚单位。
22.根据权利要求20或21的方法，其中末端标记物的大小最大为1kDa。
23.根据权利要求20-22之任一项的方法，其中该末端标记物是氨基末端His标记物。
24.根据权利要求20-23之任一项的方法，其中将该表达培养物进行裂解缓冲液处理。
25.根据权利要求20-24之任一项的方法，其中将该表达培养物在弗氏压碎器中处理或籍助超声处理。
26.根据权利要求20-25之任一项的方法，其中该表达培养物在用弗氏压碎器或超声和/或用裂解缓冲液处理之后进行亲和层析纯化。
27.根据权利要求26的方法，其中纯化籍助FPLC进行。
28.根据权利要求20-27之任一项的方法，其中对该被纯化的融合蛋白进行交联。
29.根据权利要求20-28之任一项的方法，其中将用重组融合蛋白免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合以产生用于制备抗Stx2eB免疫球蛋白的杂交瘤克隆。
30.根据权利要求29的方法，其中通过杂交瘤克隆产生的抗体用于在生产过程中控制重组融合蛋白的生产。
31.根据权利要求29或30的方法，其中由杂交瘤克隆产生的抗体用于Stx2e全毒素的免疫亲和层析纯化方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99110759.0 | 1999-06-04 | ||
| EP99110759A EP1057895A1 (de) | 1999-06-04 | 1999-06-04 | Fusionsprotein das das Fragment B des Shigatoxins enthält, dieses enthaltende (Impf-)Stoffzusammensetzung und Verfahren zu dessen Herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1357047A true CN1357047A (zh) | 2002-07-03 |
| CN1264857C CN1264857C (zh) | 2006-07-19 |
Family
ID=8238289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN00808467.XA Expired - Fee Related CN1264857C (zh) | 1999-06-04 | 2000-06-05 | 重组融合蛋白,含该重组融合蛋白的(疫苗)组合物及其制备方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1057895A1 (zh) |
| CN (1) | CN1264857C (zh) |
| AU (1) | AU5075200A (zh) |
| WO (1) | WO2000075345A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102580071A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-18 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的制备方法 |
| CN103389380A (zh) * | 2013-07-15 | 2013-11-13 | 江苏省农业科学院 | 一种鹅fsh的双抗体夹心elisa检测方法 |
| CN103483431A (zh) * | 2005-09-02 | 2014-01-01 | 蒙特利尔大学 | 猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸以及它们在疫苗和诊断中的应用 |
| CN105779320A (zh) * | 2016-03-25 | 2016-07-20 | 广州智特奇生物科技股份有限公司 | 一种预防猪圆环病毒病的酵母工程菌 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE504312T1 (de) * | 2003-07-21 | 2011-04-15 | Intervet Int Bv | Hybrid-toxine mit shiga-artigen toxin- untereinheiten, verbunden mit escherichia coli wärmeinstabilen enterotoxin-untereinheiten und vakzine daraus |
| JP5279089B2 (ja) | 2007-07-03 | 2013-09-04 | 出光興産株式会社 | ブタ浮腫病ワクチン |
| CN101948546B (zh) * | 2010-09-25 | 2012-11-07 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 融合蛋白SAmB及其编码基因与应用 |
| EP2708240B1 (de) | 2012-09-12 | 2017-04-26 | Friedhelm Jaeger | Behandlung von Schwanznekrosen |
| PL2910634T3 (pl) * | 2012-10-22 | 2019-05-31 | Jectas Innovators Company Ltd | Szczepionka do zapobiegania chorobie obrzękowej świń |
| JP6523966B2 (ja) * | 2013-11-26 | 2019-06-05 | 出光興産株式会社 | 大腸菌性下痢症の予防 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4219696A1 (de) * | 1992-02-17 | 1993-08-19 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Hybrid-dna, plasmide, oligohybridpeptid und impfstoff |
| EP1041149B8 (en) * | 1994-10-24 | 2007-10-03 | Allergan, Inc. | Vaccine and antitoxin for treatment and prevention of C. difficile disease |
| WO1996030043A1 (en) * | 1995-03-24 | 1996-10-03 | Ophidian Pharmaceuticals | Treatment for verotoxin-producing escherichia coli |
| US5800981A (en) * | 1996-02-22 | 1998-09-01 | University Of Limburg | Human cytomegalovirus antigen and its use |
| AU4184597A (en) * | 1996-09-10 | 1998-04-02 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Histidine-tagged shiga toxins, toxoids, and protein fusions with such toxins and toxoids, methods for the purification and preparation thereof |
| FR2766193B1 (fr) * | 1997-07-18 | 2001-09-14 | Inst Curie | Polypeptide chimerique comprenant le fragment b de la toxine shiga et des peptides d'interet therapeutique |
-
1999
- 1999-06-04 EP EP99110759A patent/EP1057895A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-06-05 CN CN00808467.XA patent/CN1264857C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-05 AU AU50752/00A patent/AU5075200A/en not_active Abandoned
- 2000-06-05 WO PCT/EP2000/005127 patent/WO2000075345A1/de not_active Application Discontinuation
- 2000-06-05 EP EP00935169A patent/EP1183374A1/de not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103483431A (zh) * | 2005-09-02 | 2014-01-01 | 蒙特利尔大学 | 猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸以及它们在疫苗和诊断中的应用 |
| CN103483431B (zh) * | 2005-09-02 | 2017-12-15 | 增值研究合伙有限公司 | 猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸以及它们在疫苗和诊断中的应用 |
| CN102580071A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-18 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的制备方法 |
| CN103389380A (zh) * | 2013-07-15 | 2013-11-13 | 江苏省农业科学院 | 一种鹅fsh的双抗体夹心elisa检测方法 |
| CN103389380B (zh) * | 2013-07-15 | 2015-10-28 | 江苏省农业科学院 | 一种鹅fsh的双抗体夹心elisa检测方法 |
| CN105779320A (zh) * | 2016-03-25 | 2016-07-20 | 广州智特奇生物科技股份有限公司 | 一种预防猪圆环病毒病的酵母工程菌 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000075345A1 (de) | 2000-12-14 |
| EP1057895A1 (de) | 2000-12-06 |
| AU5075200A (en) | 2000-12-28 |
| EP1183374A1 (de) | 2002-03-06 |
| CN1264857C (zh) | 2006-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5322718B2 (ja) | 腸管出血性大腸菌ワクチン | |
| CN1551781A (zh) | 单剂量猪肺炎支原体疫苗 | |
| CN1062605C (zh) | 大肠杆菌疫苗的制备方法 | |
| CN101062410A (zh) | 一种肠出血性大肠杆菌o157:h7基因工程疫苗及其制备方法 | |
| CN1357047A (zh) | 重组融合蛋白,含该重组融合蛋白的(疫苗)组合物及其制备方法 | |
| CN101880647B (zh) | 重组猪霍乱沙门氏菌及二价基因工程疫苗与应用 | |
| CN112870341A (zh) | 一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN1215729A (zh) | 产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗 | |
| CN105012948B (zh) | 一种疫苗组合物及其应用 | |
| CN1218962C (zh) | 生长抑素卵黄抗体及其制备 | |
| CN1287858C (zh) | 一种口蹄疫基因工程多肽疫苗及其制备方法 | |
| CN1047531A (zh) | 猪瘟病毒疫苗和诊断 | |
| CN1117862C (zh) | 活的减毒的产rtx巴斯德氏菌科细菌 | |
| CN108904791A (zh) | 一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN111138553B (zh) | 一种融合蛋白及一种弓形虫亚单位疫苗及其疫苗组合物 | |
| CN111840533B (zh) | A型口蹄疫病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用 | |
| CN1194008C (zh) | 鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN1279978C (zh) | 博代氏杆菌所产皮肤坏死毒素和类毒素的纯化方法 | |
| CN107502616B (zh) | 一种可溶性重组蛋白cta-cd154及其制备方法和应用 | |
| CN1380422A (zh) | 确定参与粘附的分子的方法及含有以此方法鉴别的致免疫肽的疫苗 | |
| CN1831009A (zh) | 一种对虾白斑综合症病毒（wssv）膜蛋白及其抗体 | |
| CN100398150C (zh) | 弓形虫代谢分泌抗原疫苗及其制备方法 | |
| CN1883704A (zh) | 甲型肝炎－戊型肝炎联合疫苗及其制备方法 | |
| JP2721218B2 (ja) | ブタ赤痢ワクチン | |
| CN104497148B (zh) | 一种重组泛素化蓝耳病疫苗的制备 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |