CN105012948B - 一种疫苗组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪支原体肺炎疫苗组合物，所述疫苗组合物包括P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白和兽医学上可接受的佐剂，且不含P36蛋白；所述疫苗组合物还可包括P97R1和/或P102蛋白。本发明还公开了含所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；并且该疫苗组合物中多免疫原性蛋白片段的组合可诱导产生协同的免疫效果。

Description

一种疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及猪支原体肺炎疫苗组合物及其应用。

背景技术

猪支原体肺炎（Mycoplasmalpneumonia of swine,MPS）又称猪喘气病（李彦明,张映.猪肺炎支原体生物学研究进展,动物医学进展,2003,24(3):25-27）或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）所引起的一种猪接触性慢性呼吸道疾病，分布十分广泛，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或大理石样病变。

衣阿华大学Ross研究发现：Mhp感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T细胞的活动增强，导致呼吸道免疫力减弱，抗病力下降，从而使其他病原体更容易侵入，可继发感染猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环等，从而导致多种疫苗接种失败。Mhp可经空气传播，易与其他细菌性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发（王茂文,猪肺炎支原体病的特点及其防制措施.畜禽业,2008(2):16-17;Dee S,Otake S,Oliveira S,et al.Evidence of long distance airbornetransport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus andMycoplasma hyopneumoniae.Veterinary research,2009,40(4):39），对养猪业造成重大的经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。

猪支原体肺炎亚单位疫苗不含全菌疫苗的核酸，不仅不存在灭活不彻底造成的安全隐患，而且由于其不含全菌的所有抗原，有利于疾病的净化。但目前猪支原体肺炎亚单位疫苗免疫效果不佳，不能给猪提供完全的保护（Fagan PK,Djordievic SP.Chin J,etal.Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroAexpressing a recombinant Mycoplasma hyopeumoniae antigen(NrdF).Inffction andimmunity,1997,65:2502-2507）。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪支原体肺炎疫苗组合物。

本发明的主要目的在于提供一种猪支原体肺炎疫苗组合物，所述疫苗组合物含有P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白和兽医学上可接受的佐剂，其特征在于，所述疫苗组合物不含P36蛋白。

本发明所用术语“猪支原体肺炎”在临床上的症状包括（但不限于）：呼吸症状（严重急性临床肺炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸速迫）、发热、高度传染性、高发病率、低死亡率、坏死性细胞支气管炎及继发性细菌性呼吸道感染增加。

本发明所用术语“猪支原体肺炎疫苗组合物”是指能够用于预防和/或治疗由猪肺炎支原体感染所知病症或疾病的疫苗，该疫苗组合物可包括任何能够有效预防和/或治疗猪受猪肺炎支原体感染的疫苗，能够用于猪支原体肺炎疫苗组合物包括（但不限于）完全或部分猪支原体肺炎细胞制剂、灭活或改良活体疫苗、亚单位疫苗。

本发明所述的猪支原体肺炎疫苗组合物优选为亚单位疫苗，所述“亚单位疫苗”包含一个或多个猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段，或编码所述一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质免疫原性片段的一个或多个猪肺炎支原体基因或核酸，且所述基因或核酸能在猪体内进行表达。猪肺炎支原体多肽、蛋白质、所述多肽和蛋白质的免疫原性片段、或猪肺炎支原体基因或核酸可用于本领域公知技术合成或重组制备。

本发明所用术语“预防和/或治疗”在涉及猪肺炎支原体感染时是指抑制猪肺炎支原体细菌的复制、抑制猪肺炎支原体的传播或防止猪肺炎支原体在其宿主体内定居，以及减轻猪肺炎支原体感染所之疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科（Suidae）成员的动物，如猪。

本发明所用术语“P46蛋白”属于Mhp的细胞膜表面抗原蛋白，引起早期免疫反应；该蛋白分子量达46kD，为含1257bp（编码419AA）的ORFs（Open reading frames，即开放阅读框）；该蛋白种内高度保守，且其基因序列中有3个编码色氨酸（Trp）的密码子TGA（Futo S,Seto Y,Mitsuse S,et al.Molecular cloning of a46-kilodalton surface antigen(p46)gene from mycoplasma hyopneumoniae:direct evidence of cgg codon usagefor arginine,J Bacteriol,1995,177(7):1915-1917）。

优选地，所述P46蛋白为SEQ ID No.2或SEQ ID No.4编码的一种或两种蛋白混合物。

所述P46蛋白的核苷酸序列可为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3。

本发明所用术语“P65蛋白”是一种解脂酶（lipoiytic enzyme），是Mhp主要的具有免疫原性的细胞膜表面脂蛋白之一，属于热休克Hsp70家族；该蛋白分子量达65kD，为含1803bp（编码600AA）的ORFs,且基因序列中含1个编码色氨酸（Trp）的密码子TGA（Kim SW,Kim MF.Major membrane surface proteins of Mycoplasma hyopneumoniaeselectively modified by covalently bound lipid.Journal of bacteriology,1987,169:5546-5555;Kim MF,Heidari MB,Stull SJ,et al.Identification and mapping ofan immunogenic region of Mycoplasma hyopneumoniae p65surface lipoproteinexpressed in Escherichia coli from a cloned genomic fragment.Infection andimmunity,1990,58:2637-2643）。

优选地，所述P65蛋白为SEQ ID No.6或SEQ ID No.8编码的一种或两种蛋白混合物。

所述P65蛋白的核苷酸序列可为SEQ ID No.5、SEQ ID No.7。

本发明所用术语“NrdF蛋白”是核苷酸还原酶，含96AA（以TAA终止）（Fagan PK,Djordjevic SP,Eamens GJ,et al.Molecular characterization of a ribonucleotidereductase(NrdF)gene fragment of Mycoplasma hyopneumoniae and assessment ofthe recombinant product as an experimental vaccine for enzooticpneumonia.Infection and immunity,1996,64:1060-1064）。

优选地，所述NrdF蛋白为SEQ ID No.10编码的蛋白。

所述NrdF蛋白的核苷酸序列可为SEQ ID No.9。

在本发明的一种实施方式中，所述疫苗组合物含有P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白和兽医学上可接受的佐剂。

本发明所用术语“P97R1蛋白”是Mhp纤毛粘附因子P97蛋白编码的C端的两个重复序列区域之一，由15个连续的5AA（AAKPV/E）基元构成（Hus T,Artiushin S,MinionFC.Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene ofMycoplasma hyoneumoniae.Journal of Bacteriology,1997,179(4):1317-1323）。

优选地，所述P97R1蛋白为SEQ ID No.12编码的蛋白。

所述P97R1蛋白的核苷酸序列可为SEQ ID No.11。

在本发明的另一种实施方式中，所述疫苗组合物含有P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P102蛋白和兽医学上可接受的佐剂。

本发明所用术语“P102蛋白”为P102全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段。其中，所述P102全蛋白位于P97蛋白下游，并与P97蛋白相邻，且具有细胞粘附作用或辅助P97蛋白的细胞粘附作用；该蛋白分子量为102.3kD，由2700bp左右编码而成（Hus T,Artiushin S,Minion FC.Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesiongene of Mycoplasma hyoneumoniae.Journal of Bacteriology,1997,179(4):1317-1323;Djordievic SP,Cordwell SJ,Djordjecic MA,et al.Proteolytic processing ofthe Mycoplasma hyopneumoniae cilium adhesin.Infection and immunity,2004,72(5):2791-2802）。

优选地，所述P102蛋白为SEQ ID No.14编码的蛋白。

所述P102蛋白的核苷酸序列可为SEQ ID No.13。

在本发明的一种优选实施方式中，所述疫苗组合物含有P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白、P102蛋白和兽医学上可接受的佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物：

由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白和兽医学上可接受的佐剂组成；或

由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白和兽医学上可接受的佐剂组成；或

由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P102蛋白和兽医学上可接受的佐剂组成；或

由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白、P102蛋白和兽医学上可接受的佐剂组成。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物中的P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白可以串联表达。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物中的P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白可以串联表达。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物中的P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P102蛋白可以串联表达。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物中的P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白、P102蛋白可以串联表达。

本发明所用术语“猪肺炎支原体”与“Mhp”在本发明中可互换使用。

本发明所用术语“开放阅读框”或“ORF”是指编码不含插入的终止密码子的特定Mhp蛋白质所需的最小核苷酸序列。

本发明所用缩略语为：AA，氨基酸；bp，碱基对；kD，千道尔顿。

本发明所用术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷（saponin），如Quil A、QS-21（Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA）、GPI-0100（GalenicaPharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL）；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl）衍生物的共聚物选出的化合物。

本发明所用术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油（European Pharmacopea类型）；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油（isoprenoid oil），如角鲨烷（squalane）或角鲨烯油（squalene oil），尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-（辛酸酯/葵酸酯）、甘油三-（辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇（mannide）的酯（如无水甘露醇油酸酯）、脂肪族二元醇（glycol）的酯、聚甘油（polyglycerol）的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》（Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94）和Todd等编写的《Vaccine》（1997,15:564-570）。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》（PlenumPress,1995）第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

本发明所用术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖（sugar）的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆（Carbomer，商品名Carbopol）（Phameuropa,1996,8(2)）。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基（aliphatic radical）取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团（ethylenically unsaturated group）。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，（BF Goodrich,Ohio,USA）特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol）交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

本发明所用术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA（Monsanto），这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

本发明所用术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统（Ribi Incorporation）、Block co-polymer（CytRx,Atlanta GA）、SAF-M（Chiron,Emeryville CA）、单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A）、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素（重组或其它）、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。

优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl）衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

更优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5%-30%。

本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括所述猪肺炎支原体疫苗组合物和其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。优选地，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

本发明再一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。

本发明具有以下突出的优点：

（1）疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；

（2）猪支原体肺炎疫苗组合物中多免疫原性蛋白片段的组合可诱导产生协同的免疫效果。

序列表中：

序列1为P46蛋白的核苷酸序列；

序列2为P46蛋白的氨基酸序列；

序列3为P46蛋白的核苷酸序列；

序列4为P46蛋白的氨基酸序列；

序列5为P65蛋白的核苷酸序列；

序列6为P65蛋白的氨基酸序列；

序列7为P65蛋白的核苷酸序列；

序列8为P65蛋白的氨基酸序列；

序列9为NrdF蛋白的核苷酸序列；

序列10为NrdF蛋白的氨基酸序列；

序列11为P97R1蛋白的核苷酸序列；

序列12为P97R1蛋白的氨基酸序列；

序列13为P102蛋白的核苷酸序列；

序列14为P102蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用的猪肺炎支原体P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白、P102蛋白的序列，来源于已报道的国际标准株J株，在NCBI中的登录号为AE017243.1。

本发明实施例中，以大肠杆菌表达载体为例进行表达，通过基因工程手段获得猪肺炎支原体P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白、P102蛋白，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例以Montanide^TMGel01（法国SCIPPIC公司）作为佐剂，并以体积比为10%的佐剂，制备猪支原体肺炎疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中所采用的攻毒毒株为猪肺炎支原体CVCC354株，该毒株的保藏号为CVCC354，保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变，对发病程度进行量化判定，包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现的实质样病变，如“肉样变”、“胰样变”。肺炎病变评分标准为：2个尖叶、2个心叶、2个膈叶、1个中间叶共计7个肺叶，每个肺叶满分为4分，共计28分。根据发生实质病变的肺叶面积所占该叶的比例，分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为0分；病变面积比例为1%-25%，记为1分；病变面积比例26%-50%，记为2分；病变面积比例为51%-75%，记为3分；病变面积比例为76%-100%，记为4分。如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对照组猪进行记分后，按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率：

本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。

本发明中所用的pH7.2PBS液配方为：1000mL蒸馏水中加入NaCl9g、Na₂HPO₄·12H₂O6g、NaH₂PO₄·2H₂O0.4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1猪肺炎支原体蛋白的表达、鉴定与纯化

1.1P46重组载体的构建及蛋白的表达、鉴定与纯化

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的猪肺炎支原体J株（登录号：AE017243.1）中的P46蛋白核苷酸序列（见SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3），用Primer Premier5软件设计P46蛋白的引物及定点突变用引物序列，详情见表1。

表1P46蛋白引物序列表

按马丰英（马丰英，姚睿玉，邹浩勇等.猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答.中国兽医学报，2012,32(4):529-533）等建立的方法，构建P46原核表达载体，并转化入大肠杆菌，表达猪肺炎支原体P46蛋白。

结果：PCR扩增产物经电泳后，分别在1260bp左右、1152bp左右出现目的条带，与预期大小相符；将PCR产物回收后，连接至原核表达载体并测序，测序结果表明，重组质粒已经完全突变正确。将重组质粒导入大肠杆菌进行表达，将表达后的P46蛋白使用亲和层析柱进行纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳，目的蛋白片段与预期大小相符。将纯化蛋白透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量不低于600μg/mL，并保存于4℃。

1.2P65重组载体的构建及蛋白的表达、鉴定与纯化

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的猪肺炎支原体J株（登录号：AE017243.1）中的P65蛋白核苷酸序列（见SEQ ID No.5、SEQ ID No.7），用Primer Premier5软件设计P65蛋白的引物及定点突变用引物序列，详情见表2。

表2P65蛋白引物序列表

按马丰英（马丰英，姚睿玉，邹浩勇等.猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答.中国兽医学报，2012,32(4):529-533）等建立的方法，构建P65原核表达载体，并转化入大肠杆菌，表达猪肺炎支原体P65蛋白。

结果：PCR扩增产物经电泳后，分别在1803bp左右、1200bp左右出现目的条带，与预期大小相符；将PCR产物回收后，连接至原核表达载体并测序，测序结果表明，重组质粒已经完全突变正确。将重组质粒导入大肠杆菌进行表达，将表达后的P65蛋白使用亲和层析柱进行纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳，目的蛋白片段与预期大小相符。将纯化蛋白透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量不低于600μg/mL，并保存于4℃。

1.3NrdF重组表达载体的构建及蛋白的表达、鉴定与纯化

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的猪肺炎支原体J株（登录号：AE017243.1）中的NrdF蛋白核苷酸序列（见SEQ ID No.9），用Primer Premier5软件设计NrdF蛋白的引物序列，并在上下游引物分别添加BamHI、HindIII酶切位点，详情如下：

上游引物：5'-CGGGATCCTTAAAACTCCCAATCTT-3'

下游引物：5'-CCCAAGCTTGATCTATTATATAAACTAAT-3'

按Chen（Chen AY,Fry SR,Forbes-Faulkner J,et al.Comparativeimmunogenicity of M.hyopneumoniae NrdF encoded in different expressionsystems delivered orally via attenuated S.tyhimurium aroA in mice.Veterinarymicrobiology,2006,114:252-259）等建立的方法，构建NrdF原核表达载体，并转化入大肠杆菌，表达猪肺炎支原体NrdF蛋白。

结果：PCR扩增产物经电泳后，分别在291bp左右出现目的条带，与预期大小相符；将PCR产物回收后，连接至原核表达载体并测序，测序结果表明，重组质粒构建正确。将重组质粒导入大肠杆菌进行表达，将表达后的NrdF蛋白使用亲和层析柱进行纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳，目的蛋白片段与预期大小相符。将纯化蛋白透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量不低于600μg/mL，并保存于4℃。

1.4P97R1重组表达载体的构建及蛋白的表达、鉴定与纯化

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的猪肺炎支原体J株（登录号：AE017243.1）中的P97R1蛋白核苷酸序列（见SEQ ID No.11），用Primer Premier5软件设计P97R1蛋白的引物序列，并在上下游引物分别添加EcoRI、HindIII酶切位点，详情如下：

上游引物：5'-CCGAATTCGGTATATTACCTCAGCCCCCA-3'

下游引物：5'-GCGAAGCTTTTCCGGTGTTTTTAGGCTTAA-3'

按刘茂军等（刘茂军，邵国青，张映等.猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达，江苏农业学报，2005，21(3):207-211）建立的方法，构建P97R1原核表达载体，并转化入大肠杆菌，表达猪肺炎支原体P97R1蛋白。

结果：PCR扩增产物经电泳后，分别在285bp左右出现目的条带，与预期大小相符；将PCR产物回收后，连接至原核表达载体并测序，测序结果表明，重组质粒构建正确。将重组质粒导入大肠杆菌进行表达，将表达后的P97R1蛋白使用亲和层析柱进行纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳，目的蛋白片段与预期大小相符。将纯化蛋白透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量不低于600μg/mL，并保存于4℃。

1.5P102重组表达载体的构建及蛋白的表达、鉴定与纯化

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的猪肺炎支原体J株（登录号：AE017243.1）中的P102蛋白核苷酸序列（见SEQ ID No.13），用Primer Premier5软件设计P102蛋白的引物序列，并在上下游引物分别添加BamHI、Sal I酶切位点，详情如下：上游引物：5'-CGGGATCCGCAGAAGAAGGCAAGAGT-3'，

下游引物：5'-GCGTCGACTAGCTCTAAACCTTGATCAGTT-3'。

按郭丹（郭丹，陈红漫，李媛等.猪肺炎支原体P102基因C末端序列的克隆及原核表达.黑龙江畜牧兽医科学版.2009,3:11-13）等建立的方法，构建P102原核表达载体，并转化入大肠杆菌，表达猪肺炎支原体P102蛋白。

结果：PCR扩增产物经电泳后，分别在492bp左右出现目的条带，与预期大小相符；将PCR产物回收后，连接至原核表达载体并测序，测序结果表明，重组质粒构建正确。将重组质粒导入大肠杆菌进行表达，将表达后的P102蛋白使用亲和层析柱进行纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳，目的蛋白片段与预期大小相符。将纯化蛋白透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量不低于600μg/mL，并保存于4℃。

实施例2猪支原体肺炎疫苗组合物的制备

将实施例1制备的猪肺炎支原体蛋白，使用pH7.2PBS溶液稀释，将稀释后的各蛋白溶液与Montanide^TMGel01佐剂按表3中猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分及比例混合在一起，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，在终止搅拌前加入1％（体积比）硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀，分装后2-8℃保存备用。

表3猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分及比例

注：疫苗I中的P36蛋白参照胡茂志等在文献（胡茂志，焦新安，张小荣等.猪肺炎支原体特异性蛋白P36基因的克隆与表达.中国预防兽医学报，2004,26(3):188-191）中所描述的方法，并以NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的猪肺炎支原体J株（登录号：AE017243.1）的第169238-170185位核苷酸序列为模板，制备P36蛋白。

实施例3不同组分的猪支原体肺炎疫苗组合物效力试验

将实施例2所制备的疫苗组合物，分别免疫选14-21日龄仔猪60头（排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟），共12组，5头/组，2mL/头，同时设置J株参考疫苗对照。首免疫后14天，按照相同剂量和途径进行二免，二免后28日，对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株，100MID50/头，观察28天后解剖，并观察肺部病变，按照28分法对肺部病变进行评分。攻毒前后，分别对试验组仔猪进行称重，并计算平均日增重。

攻毒后大约10天左右，空白对照组猪只（其中3只）陆续出现咳嗽、气喘等症状，皮毛不光滑；疫苗9组、疫苗11组各有一头猪出现了咳嗽的症状；其他组别没有猪只出现气喘病的类似症状。攻毒前后，各试验组猪只的肺炎病变平均得分和平均日增重结果见表4。

表4猪支原体肺炎疫苗组合物效力试验结果

注1：第10组为灭活疫苗对照组，所选用的疫苗为现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗（J株），即安百克（M+PAC）；第11组为现有技术对照组，所免疫组分为P36、P46、P65、P97R1-NrdF组合物，参照马丰英等在文献（马丰英，姚睿玉，邹浩勇等.猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答.中国兽医学报，2012,32(4):529-533）中描述的方法制备而成。

注2：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（p＜0.05）。

由表4可知：

（1）第1-2组（即免疫疫苗A-B组）分别使用三种蛋白（即P46I、P65I、NrdF）的不同含量的疫苗组合物免疫后进行攻毒，发现三种蛋白的终浓度不论是30μg/mL还是60μg/mL，免疫猪只的肺炎病变减少率均＞60%、平均日增重为0.0374-0.0427kg，与第10组（即灭活疫苗对照组）相比，差异不显著（p＞0.05）；但与第11猪（现有技术对照组）比较，差异显著（p＜0.05）；与第12猪（空白对照组）相比，差异显著（p＜0.05）。并且，三种蛋白的终浓度为60μg/mL的免疫组（第2组）免疫的效果优于三种蛋白的终浓度为30μg/mL的免疫组（第1组）。

（2）第2-5组（即免疫疫苗B-E组）分别使用不同序列编码的P46蛋白或P65蛋白，将其按表3组成，分别与NrdF蛋白混合（三种蛋白的终浓度均为60μg/mL）后作为免疫原，免疫后攻毒结果显示：各疫苗组免疫后，试验猪只肺炎病变减少率均不低于60%，平均日增重不低于0.042kg，各试验组间差异不显著（p＞0.05）。与第10组相比，免疫效果相当，差异也不显著（p＞0.05）；但与第11猪（现有技术对照组）比较，差异显著（p＜0.05）；与第12猪（空白对照组）相比，差异显著（p＜0.05）。

（3）第6-8组（即免疫疫苗F-H组）按照表3所示进行各蛋白成分混合，免疫猪只后，攻毒，结果显示：各疫苗组免疫后，肺炎病变减少率均不低于69%，平均日增重不低于0.0460kg，其中第8组的效果最优，且均优于疫苗A-E组，第6-8组与第1-5组各试验组相比差异均不显著（p＞0.05）。与第10组相比，差异也不显著（p＞0.05）；但与第11猪（现有技术对照组）比较，差异显著（p＜0.05）；与第12猪（空白对照组）相比，差异显著（p＜0.05）。

（4）第9组（即免疫疫苗I组），免疫猪只后的攻毒结果显示：该疫苗组免疫后，肺炎病变减少率为51.28%，平均日增重为0.0305kg，低于第1-8组，且与第1-8组差异均显著（p＜0.05）；与第10-11组分别进行比较后发现，与第10组差异显著（p＜0.05）。与第11猪差异不显著（p＞0.05）；与第12猪（空白对照组）相比，差异显著（p＜0.05）。

综上所述：

（1）含30μg/mL三种免疫原性蛋白（即P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白）的猪支原体肺炎疫苗组合物（即疫苗A）免疫猪只后即可获得免疫保护，优于含60μg/mL四种免疫原性蛋白（即P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P36蛋白）的猪支原体肺炎疫苗组合物（即疫苗I）的免疫效果，也优于现有技术对照组中所提到的猪支原体肺炎疫苗组合物（即P36、P46、P65、P97R1-NrdF组合物）的免疫效果；

（2）含60μg/mL三种免疫原性蛋白（即P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白）的猪支原体肺炎疫苗组合物（即疫苗B-E）免疫猪只后可获得优于疫苗A、疫苗I、现有技术对照组的免疫保护；

（3）含60μg/mL四种免疫原性蛋白（即P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白或P102蛋白）的猪支原体肺炎疫苗组合物（即疫苗F-G）免疫猪只后可获得优于疫苗A-E、疫苗I、现有技术对照组的免疫保护，且与现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗（J株）的免疫效果相当；

（4）含60μg/mL五种免疫原性蛋白（即P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白和P102蛋白）的猪支原体肺炎疫苗组合物（即疫苗H）免疫猪只后可获得优于疫苗A-G、疫苗I、现有技术对照组的免疫保护，且略优于现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗（J株）的免疫效果。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种猪支原体肺炎疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物抗原由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白组成，所述疫苗组合物含有兽医学上可接受的佐剂；其中，所述P46蛋白为SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4编码的一种或两种蛋白混合物，所述P65蛋白为SEQ ID No.6或SEQ IDNo.8编码的一种或两种蛋白混合物，所述NrdF蛋白为SEQ ID No.10编码的蛋白。

2.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物抗原由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白和P97R1蛋白组成，所述疫苗组合物含有兽医学上可接受的佐剂；其中，所述P46蛋白为SEQID No.2或SEQ ID No.4编码的一种或两种蛋白混合物，所述P65蛋白为SEQ ID No.6或SEQID No.8编码的一种或两种蛋白混合物，所述NrdF蛋白为SEQ ID No.10编码的蛋白，所述P97R1蛋白为SEQ ID No.12编码的蛋白。

3.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物抗原由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白和P102蛋白组成，所述疫苗组合物含有兽医学上可接受的佐剂；其中，所述P46蛋白为SEQID No.2或SEQ ID No.4编码的一种或两种蛋白混合物，所述P65蛋白为SEQ ID No.6或SEQID No.8编码的一种或两种蛋白混合物，所述NrdF蛋白为SEQ ID No.10编码的蛋白，所述P102蛋白为SEQ ID No.14编码的蛋白。

4.一种猪支原体肺炎疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物由P46蛋白、P65蛋白、NrdF蛋白、P97R1蛋白、P102蛋白和兽医学上可接受的佐剂组成；其中，所述P46蛋白为SEQID No.2或SEQ ID No.4编码的一种或两种蛋白混合物，所述P65蛋白为SEQ ID No.6或SEQID No.8编码的一种或两种蛋白混合物，所述NrdF蛋白为SEQ ID No.10编码的蛋白，所述P97R1蛋白为SEQ ID No.12编码的蛋白，所述P102蛋白为SEQ ID No.14编码的蛋白。

5.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为Gel佐剂。

7.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括权利要求1-5任一项所述的疫苗组合物和其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

9.权利要求1-7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。