CN102580071A - 仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种是用于预防仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位灭活疫苗的制备方法。本发明是用产类志贺氏毒素II型变异体(stx2e毒素)的大肠埃希氏菌，接种于适宜培养基培养，提取stx2e毒素亚单位抗原，灭活后与油佐剂混合乳化制成。用于预防仔猪水肿病。本发明所涉及的仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位灭活疫苗使用剂量小，免疫效力高，安全性好，对仔猪的生长没有任何不良影响，为防治仔猪水肿病奠定了坚实的基础。

Description

仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的生产方法，属于生物技术领域，特别是属于兽用生物制品行业。 

背景技术

仔猪水肿病是严重阻碍着养猪业发展的常见疾病之一，其发病急，死亡快，死亡率极高，发病后往往来不及治疗就死亡，常造成养殖业主较大经济损失。经过几十年的深入研究，人们对水肿病的发病机理有了比较详细的了解，明确了仔猪水肿病的发生与产类志贺氏毒素II型变异体(stx2e毒素)的大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的两个致病因子-F18ab菌毛和stx2e毒素密切相关(Imberechts H，De Greve，Schlicker C，et al.Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli st rain F107/86[J].Microb Pat hog Sep，1996，21(3)：183-192.)。F18ab菌毛为黏附因子，可黏附于小肠绒毛膜上从而使细菌得以定居，并大量分泌stx2e毒素，该毒素是仔猪水肿病的直接致病因子，该病的临床症状和病理变化均由其引发。stx2e毒素是一种蛋白外毒素，不但具有很高致病性，也具有很强的免疫原性，用其制备灭活疫苗可以有效预防仔猪水肿病的发生(Wieler L H，Franke S，Menge C，et al.Investigations on the immunoresponse during edema disease of piglet s after weaning by using a recombinant B subunit of shiga2like toxin II e.Dtsch Tierarztl Wochenschr，1995，102：40-43.)。 

stx2e毒素是一种高致病性毒素，临床分离株往往只需分泌少量的毒素就足以对仔猪致病，甚至致死，因此临床分离株在人工培养条件下往往很难大量培养出该毒素。我们对原用于产志贺氏菌菌素的培养基进行改进，对培养基的组份和成分含量进行优化，大大提高了培养基产stx2e毒素的产量和产毒效率，所生产的stx2e毒素毒性高，灭活后免疫原性强，这为制备高效的预防仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位疫苗奠定了坚实的基础。 

在此基础上，我们进行了仔猪水肿病毒素亚单位疫苗的研制工作。研制结果表明，我们研制的亚单位疫苗使用剂量小，免疫效力高，安全性好，对仔猪的生长没有任何不良影响，为防治仔猪水肿病奠定了坚实的基础。 

发明内容

一、生产用菌株 

1.菌株来源 

制造和检验用仔猪水肿病的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株由本申请人分离、鉴定、保存和供应，该菌株已于2011年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5484。 

2.菌株特点 

(1)形态和生化特性本菌株为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，大小为0.4～0.7um×2～3um；能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖，产酸产气，IMViC试验(吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验)反应为-、+、-、-。 

(2)培养特性菌种在SB固体培养基上，36～37℃培养20小时，菌落光滑、圆整、湿润，直径1～2mm。在SB液体培养基中，36～37℃培养20小时，呈均匀一致混浊。 

(3)血清学特性用O抗原定型血清进行血清型鉴定，应为O139。 

(4)stx2e毒素毒力鉴定以本菌所提取的stx2e毒素，静脉注射25～40日龄仔猪，0.03mg/头，或腹腔注射体重20g左右昆明小鼠，0.01mg/只，可使所有试验仔猪或小鼠发生以后肢瘫痪、共济失调为特征的神经症状，甚至死亡。 

二、stx2e毒素亚单位疫苗的制备方法： 

1 生产用种子制备将大肠埃希氏菌EDQD株(由青岛易邦生物工程有限公司分离、鉴定、保存)冻干的菌种接种改良SB液体培养基(见附件1)，接种固体琼脂平板，挑取典型菌落若干，经PCR鉴定毒素基因合格后(见附件3)，即可用于接种。 

2 菌液培养采用发酵培养法对大肠埃希氏菌EDQD株进行培养，发酵培养基为改良SB培养基。 

3 毒素提取采用不同饱和度硫酸铵沉淀方法进行毒素提取。提取毒素重悬与原菌液体积1/20，经Bradford法(见附注2)测定蛋白含量，以灭活毒素蛋白含量≥48mg/ml为合格。经戊二醛溶液灭活后，置2～8℃保存备用。 

4 水相配制取灭活检验合格的stx2e毒素液，调整蛋白浓度至48mg/ml，按4％终浓度加入灭菌的吐温-80，加入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。 

5 油相制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30分钟，冷却后，导入贮油罐中备用。 

6 疫苗乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份， 再以4000r/min搅拌40分钟。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复搅拌1次。 

具体实施方式

本发明的实施例进行具体说明： 

1 生产用种子制备 

1.1 一级种子繁殖与鉴定将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株(CGMCC No.5484)冻干菌种接种于SB固体培养基(见附件1)，37℃培养18小时，挑取光滑圆整的单个菌落，接种于SB液体培养基中，37℃振荡(摇床转速150r/min左右)培养15小时左右。无菌取少量菌液进行stx2e毒素基因的PCR鉴定，如可扩增出特异性基因片段且纯检合格，则向菌液中按15％终浓度加入甘油，混匀后小量分装，作为一级种子。在-20℃以下保存，使用期不超过6个月。 

1.2 二级种子繁殖取一级种子融化后，按1％比例接种于SB培养基中，37℃振荡(摇床转速150rpm左右)培养15小时左右。无菌取少量菌液进行stx2e毒素基因的PCR鉴定，如可扩增出特异性基因片段且纯检合格，即可用于扩大培养。在2～8℃保存，应不超过7天。 

2 制苗用stx2e毒素的制备 

2.1 细菌培养按以下条件进行发酵培养：二级种子接种量为3％、通气流量为200L/分、搅拌速度为150r/min培养时间为5～7小时、培养温度为36～37℃、消泡剂为0.1％花生油。 

2.2 stx2e毒素的提取收获的菌液经连续流离心机离心，菌泥按0.1克/ml比例重新悬浮于生理盐水中，于冰裕条件下在超声波破碎仪上作用至90％以上菌体破碎。破碎菌液经连续流离心机离心，取上清于4℃搅拌条件下，缓慢加入将固体硫酸铵直至达到40％硫酸铵饱和度，继续搅拌2小时，于4℃经连续流离心机离心，弃去沉淀物，于上清中继续加入固体硫酸铵至达到60％硫酸铵饱和度，继续搅拌2小时，于4℃经连续流离心机离心，沉淀重悬与原菌液体积1/20，经戊二醛溶液灭活后，置2～8℃保存备用。 

2.3 stx2e毒素提取物毒力试验以本菌所提取的stx2e毒素，腹腔注射体重20g左右昆明小鼠，0.01mg/只，可使所有试验仔猪或小鼠发生以后肢瘫痪、共济失调为特征的神经症状，甚至死亡。 

3 stx2e毒素的灭活取制备的毒素液，按0.1％的终浓度加入分析纯戊二醛，于4℃灭活120小时，其间每隔12小时摇振1次。4℃保存供配苗用。 

4 半成品检验 

4.1 无菌检验按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社，2011，)进行，应无菌生长。 

4.2 stx2e毒素的灭活检验将灭活的stx2e毒素腹腔注射体重30g左右昆明小鼠4只，0.2ml/只，观察7日，以小鼠全部存活为stx2e毒素的灭活合格。 

4.3 灭活毒素蛋白含量测定采用Bradford(见附件2)法进行，以每毫升灭活毒素蛋白含量≥48mg为合格。 

5 疫苗制备 

5.1水相配制取灭菌的吐温-80 4份、灭活检验合格的水肿毒素液96份，加入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。 

5.2 油乳制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，152℃加热30分钟，冷却后，导入贮油罐中备用。 

5.3乳化取油相3份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3500r/min搅拌35分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.01％。乳化后，取样3～5ml，以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复搅拌1次。 

6分装定量分装，加盖密封。 

本发明所涉及微生物： 

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株菌已于2011年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5484。 

本发明的积极意义 

本发明涉及一种是用于预防仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位灭活疫苗的制备方法。本发明是用产类志贺氏毒素II型变异体(stx2e毒素)的大肠埃希氏菌，接种于适宜培养基培养，提取stx2e毒素亚单位抗原，灭活后与油佐剂混合乳化制成。用于预防仔猪水肿病。本发明所涉及的仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位灭活疫苗使用剂量小，免疫效力高，安全性好，对仔猪的生长没有任何不良影响，为防治仔猪水肿病奠定了坚实的基础。 

附图说明

图1分离株stx2e毒素基因扩增结果。 

图2stx2e毒素引起小鼠后肢麻痹和小鼠死亡。 

实施例1 

1 生产用种子制备 

(1)一级种子繁殖与鉴定将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株冻干菌种接种SB固体培养基，37℃培养18小时，挑取光滑圆整的单个菌落1个，接种于50ml SB液体培养基中，37℃振荡培养15小时左右。取少量菌液进行纯粹检验，纯检合格后按15％终浓度向菌液中加入甘油，混匀后小量分装，作为一级种子。在-20℃以下保存。 

(2)二级种子繁殖及鉴定取一级种子接种SB固体培养基，37℃培养18小时，挑取光滑圆整的单个菌落1个，接种于50ml SB液体培养基中，37℃振荡培养15小时左右。取此培养物3.6ml，接种于360ml SB培养基中，37℃振荡培养15小时左右。无菌取少量菌液染色镜检，如无杂菌，即可用于扩大培养。 

2 培养基SB液体培养基。 

3 制苗用菌液制备 

(1)菌液培养采用发酵培养法对菌株进行培养：向C15-2型发酵罐中加入12000ml培养基，同时加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至36～37℃，加入360ml二级种子，调节培养温度至37℃，调节溶氧浓度为35％，发酵培养6～7小时。 

(2)纯粹性检验按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部，中国农业出版社，2011，本发明以下简称《中国兽药典》)进行。 

(3)毒素提取收获的菌液经连续流离心机离心，菌泥用0.01M pH7.4的PBS重悬成250mg/ml的菌液，于冰浴条件下在超声波破碎仪上作用至90％以上菌体破碎。破碎菌液经连续流离心机离心，取上清于2～8℃搅拌条件下，缓慢加入固体硫酸铵直至达到40％硫酸铵饱和度，继续搅拌2小时，于2～8℃经连续流离心机离心，弃去沉淀物，于上清中继续加入固体硫酸铵至达到60％硫酸铵饱和度，继续搅拌2小时，于2～8℃经连续流离心机离心，离心后所得沉淀以0.01M pH7.4的PBS溶解即为stx2e毒素粗提物，置-20℃冻存备用。 

(4)毒素效价测定 

1)stx2e毒素粗提物蛋白含量的测定测定方法见附注2。 

2)stx2e毒素粗提物毒力试验将stx2e毒素提取物稀释至1mg/ml，10倍稀释后，腹腔注射昆明小鼠4只，0.2ml/只，观察7日。 

(5)灭活按终浓度为0.1％(体积百分比)的将分析纯戊二醛加到以上制备的stx2e毒素粗提物中，于2～8℃灭活72小时，其间每隔12小时摇振1次制备成stx2e毒素，于2～8℃保存供配苗用。 

4 半成品检验将灭活后的stx2e毒素经腹腔注射体重20g左右昆明小鼠4只，0.2ml/ 只，观察7日。 

5 疫苗制备 

(1)水相制备取灭活检验合格的stx2e毒素，调整蛋白浓度至48mg/ml，按4％(体积百分比)终浓度加入灭菌的吐温-80，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。 

(2)油相由易邦公司白油制备车间提供。 

(3)乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以4000r/min搅拌40min。乳化后，取样3～5ml，以3000r/min离心15min，若有分层现象，应重复搅拌1次。 

(4)分装定量分装，加盖密封后成为仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗。 

6成品检验 

(1)性状 

外观观察疫苗颜色和性状。 

剂型取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，观察扩散情况以判定疫苗剂型。 

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000转/分钟离心15分钟，观察管底析出的水相量。 

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间。 

(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，观察结果。 

(3)安全检验取14～16日龄左右健康仔猪4头，每头颈部肌肉注射2ml，观察10日。 

(4)效力检验取体重18～25g昆明小鼠(清洁级)8只，每只皮下或肌肉注射疫苗0.1ml，另设非免疫对照小鼠8只。免疫后21天，连同非免疫对照一起，试验小鼠均用以上制备的未经灭活的stx2e毒素粗提物腹腔注射2×MLD剂量，观察10日。 

(5)醛类残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行。 

实施例2 

1 生产用菌种生产、鉴定结果利用大肠埃希氏菌EDQD株基础种子生产一级种子50ml(加入10％甘油后按5ml/瓶分装，-20℃保存)，纯净检验结果表明，所制备的种子液均无其它细菌、霉菌污染。生产二级种子360ml，二级种子也无其它细菌、霉菌污染。用以上种子批制备了200901批仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗，疫苗的制备量是1335ml。 

2 批生产及灭活检验结果仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗实验室产品批生产记录及灭活检验汇总表，详见表1。 

3 成品检验结果仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗实验室产品成品检验汇总表，详见表2。 

表1仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗批生产及灭活检验汇总表 

项目	200901批
		生产菌株	EDQD
基础种子代次	第六代(E6)
		培养基	SB
一级种子	50ml
		二级种子	360ml
发酵量	12000ml
		发酵日期	2009.3.04
菌泥量	105g
		毒素液提取量	402ml
毒素液蛋白浓度	51mg/ml
		灭活日期	2009.3.05
灭活检验	合格
		水相制备量	445ml
油相量	890ml
		疫苗量	1335ml
分装规格	20ml/瓶
		分装量(瓶数)	66瓶

[0079] 表2仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗200901批成品检验结果汇总表 

附件1 

SB培养基液体配方(W/V)如下： 

调pH 8.0～8.5，121℃蒸汽灭菌20分钟。 

注：如需固体培养基，则在下面配方基础上添加1.3％的琼脂粉。 

附件2 

考马斯亮蓝显色法(Bradford法)测定蛋白质浓度 

1 试验材料 

1.1 考马斯亮蓝G-250 Sigma产品。 

1.2 标准蛋白质结晶牛血清白蛋白，Sigma产品。 

1.3 紫外可见分光光度计UV2102 PC型，美国优尼科产品。 

2 试验方法 

2.1 考马斯亮蓝溶液配制取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％乙醇中，加入100ml 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤，4℃保存备用。 

2.2 标准蛋白溶液配制将结晶牛血清白蛋白经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度用0.15mol/L的NaCl配制成1mg/ml标准蛋白溶液。 

2.3 制定标准曲线 

2.3.1 从冰箱取出考马斯亮蓝液，平衡至室温并混匀，紫外可见分光光度计预热20分钟。 

2.3.2 绘制标准曲线  取8支洁净小管，标记为管1～管8，分别加入0、1、2、4、8、12、16、20μl的标准蛋白溶液(1mg/ml)，再分别加入100、99、98、96、92、88、84、80μl的0.15mol/L的NaCl溶液，混匀后各管均再加入考马斯亮蓝溶液100μl。振荡混匀，室温放置5～10分钟后，用紫外可见分光光度计测定OD595值，以OD595为横轴，以标准蛋白含量为纵轴，绘制标准曲线。详见下表和图3。 

试管号	1	2	3	4	5	6	7	8
									1mg/ml标准蛋白溶液(ul)	0	1	2	4	8	12	16	20
0.15mol/L的NaCl溶液(ul)	100	99	98	96	92	88	84	80
									考马斯亮蓝溶液(ul)	100	100	100	100	100	100	100	100
各管对应标准蛋白浓度(ug/ml)	0	10	20	40	80	120	160	200
									OD595	0	0.015	0.107	0.329	0.718	1.103	1.493	1.896

2.4测定待检样品的蛋白质含量测定方法同上，取合适的待检样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的OD595值，带入公式(y＝102.87x+5.9588，y为蛋白浓度，x为测得的OD595值)，从而计算出待检样品的蛋白质浓度(如样品已稀释，再乘以溶液稀释度)。 

附件3 

stx2e毒素基因的PCR鉴定 

取适量24h细菌培养物离心，沉淀用灭菌超纯水悬浮，使细菌浓度约为3×10⁹CFU/ mL，100℃水浴10min，置于冰浴中冷却，4℃7000g离心10min，取上清2μL作为PCR模板。采用50uL体系(超纯水30μL，10×Reaction buffer 5μL，MgCl₂、dNTPs(1.25mmoL)各4μL，上游(5’GAATGAAGAAGATGTTTATAGCGG 3’)和下游(5’TTTTATGGAACGTAGGTATTACC 3’)引物(25pmol/L)各2μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1μL)。PCR反应条件为95℃预变性5min，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。取5μL PCR扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶进行电泳，扩增片段大小为454bp。 

Claims (1)

1.一种预防仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位疫苗的制备方法，其特征在于主要包括一下几个步骤：

(1)生产用种子制备将冻干的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株菌种接种SB液体培养基，接种固体琼脂平板，挑取典型菌落若干，经PCR鉴定毒素基因合格后，即可用于接种，该菌株已于2011年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.5484；

(2)菌液培养采用发酵培养法培养菌液，菌液经管式离心机离心，菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中；

(3)毒素提取对重悬菌液进行超声波裂解，加入40％饱和度硫酸铵，经连续流离心机离心，弃沉淀，上清中继续加入度硫酸铵至60％饱和度，经连续流离心机离心，沉淀重悬与原菌液体积1/20，经戊二醛溶液灭活后，置2～8℃保存备用；

(4)按常规矿物油佐剂灭活疫苗的方法配制成矿物油佐剂亚单位疫苗。

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