CN108059685B - 猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用。本发明以猪IgG的Fc为骨架，结合我国猪A型口蹄疫流行现状和防控需求，利用反向疫苗学、生物信息学和生物化学结等多种技术筛选、设计猪口蹄疫A型不同拓扑型毒株的表位抗原基因，利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，研制得到了适合我国流行现状和防控需求的猪口蹄疫A型Fc多肽疫苗。并通过筛选原核表达系统，优化表达条件，实现了融合蛋白的可溶性表达，最大程度展示了抗原表位。实验证明，本发明的一种猪口蹄疫A型Fc多肽疫苗具有更强的免疫功效，经过加强免疫后能够诱导机体产生更高的的保护性抗体；免疫动物抗体水平差异较小，免疫猪经强毒攻击后，100％获得保护。

Description

猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种猪口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，影响恶劣。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国将其列为一类动物传染病。为了净化和消灭口蹄疫，我国制定了《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》和《国家口蹄疫防控计划(2016-2020)》，FMD被列为优先解决的动物疫病之一。要实现此目标，必须要有安全、高效、可鉴别诊断的疫苗，而灭活疫苗始终存在病毒逃逸的生物安全隐患，加之多次免疫后难以区分免疫动物和感染动物，不利于口蹄疫净化，也不利于我国活畜及其产品出口。

采用分子生物学技术研制安全、高效的FMD基因工程新型疫苗是实现国家口蹄疫防治规划的技术保障和物质基础，也是提高我国口蹄疫防控能力，保障我国畜牧业健康可持续发展，推动农业产业结构调整，促进农民增收，提高活畜及产品的出口能力，提升我国的政治声誉等的重要途径，符合国家兴农富国的战略需求。

近年来，两起输入性A型口蹄疫疫情使得我国本不乐观的口蹄疫防控形势变得更为复杂、严峻。主要是A型口蹄疫病毒不仅流行范围广、毒株复杂(遗传谱系多)，相对于其他血清型毒株其致病性和抗原变异能力更强。此外，两次输入性流行毒株属于不同的遗传谱系，即2009属于Sea-97G1毒株谱系，2013年则为Sea-97G2毒株谱系，也与我国历史毒株没有直接进化关系，这也意味着目前要同时针对两个谱系的毒株进行疫苗防控；再者2个毒株的致病性亦不相同，2009分离毒株对牛为强毒，对猪为弱毒；2013年分离的毒株则对牛和猪均是强毒，这说明病毒的宿主谱在不断拓宽，传播和生存空间不断扩大，防控难度和压力增大。因此，如何快速有效防控A型口蹄疫的流行，压缩其不断进化的生态空间，切断病毒在不同宿主间的循环，降低毒株进一步进化的风险，完全净化病毒毒株的流行是摆在口蹄疫防疫策略面前亟待解决的课题。灭活疫苗虽然免疫效果好，但是其研制周期长、操作活毒具有潜在的散毒风险，多次免疫难以区分感染与免疫动物都给A型口蹄疫净化带来了一系列问题。

利用反向疫苗学技术研制口蹄疫表位疫苗已成为可能，本实验室已经利用该技术研制出了多种口蹄疫表位疫苗均具有较好的免疫效果。为了快速研制出防控新传入口蹄疫病毒的新型疫苗，克服传统灭活疫苗研制周期长，产品滞后性问题，同时进一步提升表位疫苗的免疫效果，减小与灭活疫苗的差距。本发明对抗原表位进行了重新的设计和/或改进，改进了表位抗原的展示方式。尤其是充分利用了宿主动物免疫球蛋白(IgG)Fc能与免疫细胞表面的Fc受体结合或补体受体的细胞结合，激发免疫细胞产生免疫效应的免疫学功能，来提升表位疫苗的免疫效果。如Fc能与许多细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、中性粒了细胞和血小板等)表面Fc受体结合，发挥调理作用，增强巨噬细胞的吞噬作用；其次，Fc与细胞表面Fc受体结合后能够活化细胞，发挥细胞毒作用。

基于IgG的Fc良好的免疫学功效，本发明以猪IgG的Fc为骨架，结合我国猪A型口蹄疫流行现状和防控需求，利用反向疫苗学、生物信息学和生物化学结等多种技术筛选、设计猪口蹄疫A型不同拓扑型毒株的抗原表位基因，利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，研制猪口蹄疫A型Fc多肽疫苗。为了充分发挥表位抗原和Fc的免疫学功能，最大程度确保融合蛋白的天然形式，本发明还通过筛选原核表达系统，优化表达条件，确保融合蛋白以可溶性形式表达。将其与MontanideISA 206佐剂配伍制备疫苗，采用加强免疫方式免疫猪，通过特异性抗体效价和攻毒保护实验评价疫苗对猪的免疫效力。结果显示，经过重新设计抗原表位，筛选表达系统，优化表达条件，实现了Fc展示抗原表位重组蛋白的可溶性表达，最大程度展示了抗原表位。试制疫苗免疫猪效力结果显示，该疫苗经过两次免疫后，能够诱导机体产生高水平的特异性抗体；加强免疫14天后，按照国家标准对免疫猪进行同源强度攻击，5/5保护，即保护率为100％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种猪口蹄疫病毒A型Fc多肽，是通过将猪口蹄疫病毒A型的3个拓扑型毒株的主要抗原表位进行串联，并与猪IgG的Fc片段连接后得到，其中所述的3个拓扑型毒株的主要抗原表位之间通过间隔子序列进行连接。

其中，优选的，所述的猪口蹄疫病毒A型的3个拓扑型毒株的主要抗原表位包括猪口蹄疫病毒A型AF/72，A/HB/WH/09，A/GDMM/2013的VP1基因编码区140-160氨基酸序列和200-213氨基酸序列。

其中，优选的，所述的间隔子序列为GGSSGG、GPLS或GGGS。

在本发明的一个具体实施例中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，本发明还提出了编码所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更进一步的，本发明还提出了所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽在制备预防猪口蹄疫药物中的用途。

其中，优选的，所述的药物为疫苗。

一种猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗，其含有本发明所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及佐剂。

其中，优选的，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗是按照猪口蹄疫病毒A型Fc多肽与佐剂质量比为1:1的比例加入油佐剂Montanide ISA206乳化而成，每头份1ml，其中含猪口蹄疫病毒A型Fc多肽200μg。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明以猪IgG的Fc为骨架，结合我国猪A型口蹄疫流行现状和防控需求，利用反向疫苗学、生物信息学和生物化学结等多种技术筛选、设计猪口蹄疫A型不同拓扑型毒株的表位抗原基因，利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，研制得到了适合我国流行现状和防控需求的猪口蹄疫A型Fc多肽疫苗。

2、为了充分发挥表位抗原和Fc的免疫学功能，最大程度确保融合蛋白的天然形式，本发明还通过筛选原核表达系统，优化表达条件，确保融合蛋白以可溶性形式表达，最大程度展示了抗原表位。

3、实验证明，本发明的一种猪口蹄疫A型Fc多肽疫苗具有更强的免疫功效，经过加强免疫后能够诱导机体产生更高的的保护性抗体；免疫动物抗体水平差异较小，免疫猪经强毒攻击后，100％保护。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的设计与合成

1、猪口蹄疫病毒A型多表位基因的设计

根据猪口蹄疫病毒A型3个拓扑型毒株(AF/72，A/HB/WH/09，A/GDMM/2013)的主要抗原基因，选择VP1基因编码区140-160氨基酸序列和200-213氨基酸序列作为抗原表位，然后将其按照合适的顺序进行串联，即140-160(A/GDMM/2013)-GGSSGG-140-160(A/HBWH/09)-GPLS-140-160(AF/72)-GGGS-200-213(A/GDMM/2013)，为了防止串联表位后形成新的表位，在相邻表位间引入间隔子序列以保证表位的独立性，间隔子分别为GGSSGG、GPLS和GGGS。得到的猪口蹄疫病毒A型多表位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、基因克隆及其蛋白表达，纯化

将口蹄疫病毒A型多表位基因与猪IgG的Fc基因串联为融合基因，融合后的基因序列如SEQ ID NO.2所示。为了保证新合成基因的定向插入，在融合基因的5′-端和3′-端引入特异性酶切位点BamHI和XhoI，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。将合成的融合基因和原核表达载体pET-28a(+)分别用BamHI和XhoI酶切，纯化回收后插入用相应酶线性化pET-28a(+)，构建重组表达质粒pMEA-Fc，转化JM109感受态进行阳性筛选，通过BamHI和XhoI双酶切和序列测定确定阳性重组子，-20℃保存备用。

3、重组蛋白的表达及其生物活性鉴定

将阳性重组表达质粒转化BL21(DE3)pLysS(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养液(Kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模表达重组蛋白，即从LAB平板挑单克隆接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于30℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4-0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG后于30℃诱导表达4-6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，超声破碎(冰浴，30min)，20000g离心20min收集上清(4℃)，弃沉淀。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白MEA-Fc大小与预期相符，能与FMDV(A型)灭活疫苗免疫牛阳性血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG发生免疫反应，说明表达的重组蛋白，即猪口蹄疫病毒A型Fc多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，具有生物活性。

实施例2、猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗制备

将实施例1制备得到的纯化后的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度，按照1:1(w/w)的比例加入油佐剂Montanide ISA206(Seppic，France)乳化成疫苗制剂(W/O/W)，每头份1ml，含可溶性猪口蹄疫病毒A型Fc多肽200μg。

实施例3、免疫效力试验

实验用猪为体重40kg左右，A型口蹄疫病毒抗体<1:4(液相阻断ELISA结果)，3ABC蛋白抗体阴性(3ABC抗体化学发光试剂盒结果)。用本发明的Fc多肽疫苗(实施例2制备)按每头份1ml经肌肉途径接种5头猪(含200μg可溶性抗原)。初免21天后，所有猪用同等剂量的疫苗加强免疫1次。加强免疫后14天，测定每头猪的抗体效价，连同条件相等3头对照猪在中国农业科学院兰州兽医研究所ABSL-3实验室，按照国家标准用A型口蹄疫病毒(A/GDMM/2013毒株)对猪进行攻击，连续观察10天。结果显示，Fc多肽疫苗免疫猪后能够诱导高水平的口蹄疫特异性抗体和保护性中和抗体(表1)。根据试剂盒评判标准，当≥1:64时，99％保护。Fc多肽疫苗加强免疫猪后，血清特异性抗体水平均不低于1:128；攻毒后5/5保护；每头份疫苗对猪有13.59个PD₅₀。

表1疫苗免疫猪体效力实验结果

此外，疫苗免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，证实疫苗非常安全。

总之，本发明实现了猪口蹄疫A型多表位Fc重组蛋白的可溶性表达，保证了抗原表位和Fc的天然形式和免疫学功能。本发明的Fc多肽疫苗不仅具有良好的免疫功效，而且十分安全，是一种具有广阔前景的新型疫苗，将对我国猪A型口蹄疫防控提供物质储备和技术支撑，将产生巨大的经济效益和重要的社会效益。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗及其制备方法和应用

<130> KLPI171088

<160> 3

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 318

<212> DNA

<213> Foot and Mouth Disease Virus

<400> 1

aagtactccg cacctcaaaa ccggcgaggt gactcgggtc ctctcgcggc gagactcgct 60

gcacagctcc ctgcctccgg tggttctagc ggcggtaagt actctgcgcc tgcaacacgg 120

cgaggtgact tggggtctct cgcggcgagg ctcgccgcac agcttcctgc ctccggcccg 180

ctgagcaagt actccacagg taatgcaggc agacggggtg atctagggtc tcttgcggcg 240

agggtcgccg cacagcttcc cgctggcggt ggcagcagac acaagcagaa aattattgcc 300

cctgcaaagc agctcctg 318

<210> 2

<211> 975

<212> DNA

<213> Foot and Mouth Disease Virus/swine

<400> 2

aagtactccg cacctcaaaa ccggcgaggt gactcgggtc ctctcgcggc gagactcgct 60

gcacagctcc ctgcctccgg tggttctagc ggcggtaagt actctgcgcc tgcaacacgg 120

cgaggtgact tggggtctct cgcggcgagg ctcgccgcac agcttcctgc ctccggcccg 180

ctgagcaagt actccacagg taatgcaggc agacggggtg atctagggtc tcttgcggcg 240

agggtcgccg cacagcttcc cgctggcggt ggcagcagac acaagcagaa aattattgcc 300

cctgcaaagc agctcctggg tggctctagc ggcggtgggc cctcggtctt catcttccct 360

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cagacccccg aggtcacgtg cgtggtggtg 420

gacgtcagca aggagcacgc cgaggtccag ttctcctggt acgtggacgg cgtagaggtg 480

cacacggccg agacgagacc aaaggaggag cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagc 540

gtcctgccca tccagcacca ggactggctg aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac 600

aacgtagacc tcccagcccc catcacgagg accatctcca aggctatagg gcagagccgg 660

gagccgcagg tgtacaccct gcccccaccc gccgaggagc tgtccaggag caaagtcacc 720

gtaacctgcc tggtcattgg cttctaccca cctgacatcc atgttgagtg gaagagcaac 780

ggacagccgg agccagaggg caattaccgc accaccccgc cccagcagga cgtggacggg 840

accttcttcc tgtacagcaa gctcgcggtg gacaaggcaa gatgggacca tagagaaaca 900

tttgagtgtg cggtgatgca cgaggctctg cacaaccact acacccagaa gtccatctcc 960

aagactccgg gtaaa 975

<210> 3

<211> 325

<212> PRT

<213> Foot and Mouth Disease Virus/swine

<400> 3

Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg Gly Asp Ser Gly Pro Leu 15

Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Gly Gly Ser Ser 30

Gly Gly Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu Gly 45

Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Gly Pro 60

Leu Ser Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu 75

Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Gly Gly 90

Gly Ser Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu 105

Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 120

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val 135

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln 150

Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr 165

Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 180

Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe 195

Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg 210

Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr 225

Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr 240

Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val 255

Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg 270

Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr 285

Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Arg Glu Thr 300

Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 315

Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys 325

Claims (7)

1.猪口蹄疫病毒A型Fc多肽，其特征在于，所述的多肽是通过将猪口蹄疫病毒A型的3个拓扑型毒株的主要抗原表位进行串联，并与猪IgG的Fc片段连接后得到，其中所述的3个拓扑型毒株的主要抗原表位之间通过间隔子序列进行连接，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽在制备预防猪口蹄疫药物中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物为疫苗。

6.一种猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及佐剂。

7.如权利要求6所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽疫苗，其特征在于，按照猪口蹄疫病毒A型Fc多肽与佐剂质量比为1:1的比例加入油佐剂Montanide ISA206乳化成疫苗制剂，每头份1ml，其中含猪口蹄疫病毒A型Fc多肽200μg。